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Archives Internationales de Phpiologie, 1938, Vol. XLVII, Fase. 3. 345
R e q u le I S octobre 193s.
CONTRIBUTION A L’kTUDE DES EFFETS DU VENIN DE (( NAJA TRIPUDIANS )) (COBRA)
SUR LA COAGULATION SANGUINE (( IN VITRO))
P A R
Charles-Joseph H A N UT (Labovatoire de Pliaririarody~iamie et de Tliirapeutique de I’Universiti de Brzrxelles).
I. -- Introduction
Les effets des venins de serpents sur la coagulation sanguine ont fait l’objet de nombreuses etudes depuis plus d’un siecle. Pour- tant bien des questions relatives a leur mkcanisme d’action font encore l’objet de controverses. Nous avons entrepris des recherches desti- nees a apporter des elements nouveaux et permettant peut-stre d ’elucider certains de ces problemes. Dans des communications anterieures nous nous sommes preoccupk des venins des Bothrops et plus particulierement du venin de Bothrops atrox (1) .
Nous envisagerons maintenant le venin de Nuju tripudiuns ou de Cobra. C’est un venin anticoagulant, mais le mecanisme de son action est discuti. Certains auteurs, comme ARTHUS (2)) admettent que ce venin retarde la transformation du serozyme en thrombine, tandis que d’autres, comme MORAWITZ (3), HOUSSAY et SORDELLI (4), RABINOVICH (5), BRAZIL et VELLARD (6), LINK (7) pensent que la destruction fermentaire du cytozyme par le venin explique son action anticoagulante. On admet en general que le venin de Cobra ne retarde pas la coagulation du fibrinogene par la thrombine. I1 est depourvu d’action antithrombinique, non seulement vis-a-vis de la thrombine sanguine, mais aussi vis-a-vis d’autres thrombines, comme les venins de Crotalus terrificus et de Bothrops Neuwiedi (ARTHUS). Pourtant HOUSSAY et SORDELLI decrivent un Fait etrange que n’a pas observe ARTHUS : le venin de Cobra, bien qu’il soit anticocgulant, accelererait l’action de la thrombine sur le fibrinogene et empscherait la disparition de la thrombine.
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11. - MatCriel et technique
Nous avons eu a notre disposition deux 6chantillons dc vetiin S L C clC Naja iripudians. L’un (echantillon I ) provcnait de I’liibtitut Pa.,tt.ur tl: Paris, I’autre (echantillon 11) de Kasauli (Indcs) (l). Ces cchantillons o.it et6 conserves a I’abri de la lumiere e t de I’humidite.
Les solutions de venin ont toujours etc preparees immtkiiatenient avant chaque experience. Le milieu de dissolution a ete, le plus souvent, I’eau physiologique (EP). Dans quelques experiences, nous avons eu recours au melange tampon de phosphates de Sorensen a p H 7.347 (4 parties de solution 1/15e moleculaire de phosphate bisodique + 1 partie de solution 1/15e moleculaire de phosphate monopotassique).
Les techniques employees pour I’etude du mecanisme de la coagulation ont i te , sauf indications speciales, celles de BORDET e t DELANGE (8).
Les differentes solutions utilisies au cours des essais ont etk preparies en par tant d’eau bidistillee e t de produits chimiques aussi purs que possible. Elles ont i t 6 conservees a la glacikre.
Pour etablir le temps nicessaire a la coagulation, on a eu recours a des tubes en Pyrex de 12 mm. de diametre e t de 60 mm. de hauteur. On a considere comme temps de coagulation le nonibre de minutes, mesure au moyen d’un chronometre a arr&t, necessaire pour obtenir u n caillot bien constitue, nettement reconnaissable en inclinant doucement le tube (abriviation : C. C.) sauf lorsqu’il est indique que le caillot est en vofle (abreviation: C. V.). La determination f u t faite en double, triple ou quadruple. Les donnees mentionnees a titre d’exemples dans les divers tableaux representent la moyenne de 2, 3 ou 3 risultats concordants. L‘ecart admis entre les resultats varie avec la grandeur du temps de coagulation rnesuri ; ainsi i l doit &tre inferieur a 2 minutes si la coagulation a lieu e n moins de 20 minutes tandis qu’il peut depasser Iigkrement ce chiffre pour une coagulation beaucoup plus lente.
111. - Action du venin de Cobra sur la coagulation du plasma oxalatb r e c a l c i f i b
Pour e tudier les effets du v e n i n de Nuju tripudians sur la coagula- t i o n globale in vifro, nous nous sommes servi de p lasma o x a l a t e tres limpide. Pour I’obtenir, nous avons pr i s des Lapins de 2 a 2.5 kilogr., maintenus a jeun d e p u i s la veille, a u x q u e l s nous avons preleve d u sang a la caro t ide , en ayant so in d e re je te r les premieres g o u t t e s q u i a u r a i e n t pu Ctre contaminees par du s u e de tissu. C e sang a ete recueilli dans un sixieme de son v o l u m e de solut ion oxalatke isoto-
(I) Nous tenons a remercier M. CESARI pour I’envoi de I’echantillon I et le Colonel S. TAYLOR pour celui de I’&hantillon 11.
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C
Echan-
de tion de la
de de venin “enin
Cobra .
I I : IOOOC I : IOOOOO 1 : 1 000 000
o
11 I : 111000
I : iooooo I : 1 OOC)OOO
0
nique (NaCI 650 mg., oxalate sodique 1 g., eau distillee 9.s.p. 100 cc.). Nous avons immediatement soumis ce samg oxalate a une centrifu- gation d’environ 20 minutes, a vitesse moyenne (3000 a 4000 tours a la minute). Nous avons ensuite decant6 le plasma et nous I’avons soumis a une deuxieme centrifugation de 20 a 30 minutes, a grande vitesse (7 000 a 9 000 tours a la minute), de manikre a eliminer la majeure partie des ClCments figurks encore en suspension, y compris les plaquettes.
Nous avons prepare des melanges contenant 0.2 cc. de plasma oxalatC tres limpide de Lapin normal et nous y avons ajoute soit 0.4 cc. de solution physiologique 011 EP (NaC1 8 g. 500 mg. par litre d’eau bidistillee), soit 0.2 cc. d ’EP et 0.2 cc. de la solution de venin de Cobra dans l’eau physiologique, soit 0.3 cc. de venin et 0.1 cc. d’EP. Nous avons ensuite complete le volume des divers melanges a 1 cc. en y introduisant 0.4 cc. d’eau physiologique calcifiee forte ou EPCa (NaCl 8 g. 500 mg., CaCI, 1 g. 50 mg. par litre d’eau bi- distillee). Le tableau I donne un exemple des rCsultats ainsi obtenus.
i
Mg. de R h l t a t s avec les venin inel ange s
omp position Lies melanges par cc. du me-
ne conte- nant pas Ian‘‘ contenant
coagu- du venin lable dtl venin
e n cc. : 0.2 plasma oxalate +
0.2 veninS0.2 E P I o . 4 EPCa 0.02 , C.V. 5 5 ’ - 0.2 venin+0.2 EP+0.4 EPCa 0.002 ’ C.C. 18’30” -
0.2 venin+0.2 EP-to.4 EPCa 0.0002 C.C. 9/20‘’ - 0.4 EP+0.4 EPCa 0 - C.C. 9’
0.1 veninfo.3 EP+0.4 EPCa 0.01 pasdecoa- -
0.1 venin+0.3 EP+o.4 EPCa 0.001 C.C.2h. -
0.1 venin+0.3 E P t o . 4 EPCa 0.0001 C.C. 37’ - 0.4 EP-tO.4 EPCa 0 - C.C. 12’10”
gulation
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I1 ressort nettement du tableau I que I’echantillon no I a des proprietes anticoagulantes moins hergiques que celles de I’echPn- tillon no 11. Inject6 a la dose de 0.02 mg. I’echantillon no I ne deter- mine qu’un retard considerable de la coagulation du plasma oxalatk recalcifie, tandis que, pour I’echantillon no 11, la moitie de cette quantite, c’est-a-dire 0.01 mg., s’oppose a toute gelification du melange coagulable et que celle-ci est dkja tres retardee par 0.001 mg.
Nous avons verifii qu’a la concentration de 1 p. 10000 le venin de Cobra n’a aucune action coagulante vis-a-vis du plasma oxalate non recalcifie, tout comme le venin de Viperu aspis et contrairement aux venins des Bothrops, de Crotalus terrificus, de Cerustes e t de Duboia.
Comme on le voit, nos experiences confirment I’action anticoagu- lante du venin de Naju tripudians. Par quel mecanisme cet effet peut-il s’expliquer. C’est ce que nous allons envisager en examinant successivement les trois phases principales de la coagulation d’apres la thiorie de BORDET et DELANGE (8).
IV. - Action du venin de Cobra sur la premihre phase de la coagulation
Les effets des venins sur la transformation du proserozyme en serozyme n’ont jamais ete envisages, a notre connaissznce. Cette lacune s’explique par le fait que les mkthodes d’etude de la premiere phase du processus corgulant sont d’origine relativement recente. Drns chacune d’elles, on prepare une solution de proserozyme en privant de fibrinogene le plasma oxalate. BORDET et DELANCE (8) le precipitent par le chlorure sodique (300 mg. par cc.), GRATIA (9) le coagule au moyen des staphylocoques puis defibrine, ZUNZ (10) arrive au mCme but, en se servant de la staphylocoEgulase et nous- mCme y sommes parvenu en utilisant des solutions diluies de venins de Bothrops. Les plasma dkfibrinogknes, prkp2res par les trois dernieres techniques, sont designes sous les noms de (( plasma de staphylocoques D, (( plasma de staphylocoagulxe 1) et (( plslsma de venins D. Nous nous sommes servi de la methode de ZUNZ et de la &re, pour I’etude de l’action du venin de Naja tripudians sur la coagulation.
DPns un premier groupe de recherches, nous Dvons prep3re du
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((plasma de staphylocoagulase 1) (l) prive de toute trace de fibri- nogkne. Nous nous en sommes assure en ajoutant, a un echantillon de ce liquide, une quantite double d’EPCa : ce melange doit rester fluide a 370 C. Nous avons introduit, dans des tubes en verre Pyrex, 0.3 cc. de ((plasma de staphylocoagulasen 0.2 cc. soit de solution de venin de Cobra (echantillon I ) , soit d’EP, et enfin 0.35 cc. d’EPCa. Nous avons attendu des laps de temps variables avant d’ajouter 0.05 cc. de suspension de cytozyme (z) puis, 2 minutes plus tard, 0.3 cc. de plasma dioxalatk dilue vieilli (servant de solution de fibrinogkne). Nous reproduisons dans le tableau 11, les rhultats d’une experience ainsi realisee.
T A B L E A U I I
Laps de temps ecoulC entre la prepa- ration du melange form6 par 0.3 cc. de plasma de staphylocoagulase, par 0.35 cc d’EPCa et par 0.2 cc. soit d’EP, soit de solution de venin de Cobra (echantillon I ) a I : 10 000 e t I’addition ii ce melange de 0.05 cc. de suspension de cytozyme, puis 2 minutes plus tard de 0 . 2 ~ ~ . de plasma dioxalate diluC vieilli
7 minutes 1 5 minutes 21 minutes 25 minutes 37 minutes 73 minutes 96 minutes
____
Temps de coagulation du melange total
sans venin
pas de ccqulation pas de coagulation
C. C. 1 1 ’4j” c. c. 3‘ C. C. 1’52”
-
~-
contenant du venin de Cohr:i
pas de coagulation pas de coagulation pas de coagulation pas de coagulation pas de coagulation pas de coagulation pas de coagulation
(1) La staphylocoagulase nous a etC aimablement fournie par M. le Professeur GENGOU et par M. le Docteur Willy MUTSAARS, ce dont nous tenons a les remercier.
( 8 ) C’est un extrait acetonique de muscles dessechks de Lapin dont on evapore l’acitone et qu’on remet en suspension dans un volume d’EP &gal au volume initial de I’extrait. Cette preparation a h. la fois une action cytozymique et un effet thromboplastique.
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Comme on le voit dans le tableau 11, le serozyme n’apparait p3.s dans le melange contenant du venin de Cobra, tandis qu’il commence a se former entre 15 et 21 minutes dans le melange temoin.
Dans un second groupe d’essais, nous nous sommes servi de (( plasma de venin )) de Bothrops atrox 1 :40 OOO 000 (1 1) . Apres elimination de tout le fibrinoghe, nous avons neutralisl le venin en additionnant le (( plasma de venin )) de 27L de serum antibothro- pique. Nous avons laisse s’ecouler 20 minutes puis nous avons ajoute, a 0.3 cc. de ce melange, 0.1 cc. soit d’EP, soit de venin de Cobra (echantillon I) a 1 :10 000, puis 0.3 cc. d’EPCa. Enfin, apres des laps de temps variables, nous avons 9ntroduit dans les tubes en Pyrex, 0.3 cc. de plasma dioxalate dilui, vieilli et phosphate (servant de solution de fibrinogene). Dans cette experience, nous n’avons pas employe la suspension de cytozyme. Son emploi n’est, en effet, nullement necessaire puisque le (( plasma de venin N, contient du cytozyme, comme d’ailleurs aussi le (( plasma de staphylocoa- gulase )) et le (( plasma de staphylocoques )). Le tableau 111 reproduit les resultats d ’une experience realisee suivant la technique que nous venom de decrire.
T A B L E A U I l l
Laps de temps CcoulC entre la prepa- ration du melange forme par 0.3 cc. du plasma de venin, par 0.1 cc. soit d’EP, soit de venin de Cobra (khan- tillon I ) a 1 : 10 OOO e t par 0.3 cc. d’EPCa e t I’addition a ce melange de
‘ 0.3 cc. de plasma dioxalate dilue phosphate
30 secondes 3 minutes 5 minutes
10 minutes 15 minutes 20 minutes 25 minutes 27 minutes 30 sec. 35 minutes 40 minutes 50 minutes
~ _ _ -
Temps de coagulation du melange total
sans venin de Cobra
pas de coagulation p;is de coagulation
C. V. 2 h. 30’ c. c. 10’25“ C. C. 5‘ C. C. 1’1 j”
c. c. 3’ 5”
c. c. 4’10” c . c. 3””
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;ivei venin de Cobra
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pas de coagulation pas de coagulation pas de coagulstion pas de coagulation pas de coagulation pas de coagul a t ‘ ion pas de coagulation
C. V. 3 h. 3u’ -
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On voit, dans le tableau 111, qu’en presence de venin de Cobra (Cchantillon I) le serozyme n’apparait qu’au bout de 25 a 35 minutes, tandis que dans l’essai temoin,. le proserozyme commence deja a se transformer en serozyme au bout de 3 a 5 minutes.
Une experience similaire, realisee avec I’echantillon I1 du venin de Nuju tripudiuns, a montre que le debut de l’evolution du prosero- zyme avait lieu entre 30 et 40 minutes dans le milieu contenant le venin et entre 5 et 10 minutes dans le melange temoin.
Nous pouvons donc conclure que le venin de Naja tripudians a une action inhibante manifeste sur la premiere phase de la coagu- lation, c’est-a-dire l’apparition du serozyme.
V. - Action du venin de Cobra sur la deuxi6me phasq de la coagulation
Nous envisagerons tout d’abord les effets du venin de Cobra sur la deuxieme phase proprement dite, c’est-a-dire la formation de la thrombine. Nous essaierons ensuite de nous rendre compte si ces effets portent plus particulierement sur le serozyme ou sur le cytozyme.
lo Action du venin de Cobra sur la deuxidm phase propremnt dite.
Pour etudier la deuxieme phase de la coagulation, c’est-a-dire la formation de la thrombine, il faut preparer une solution deserozyme, Celle-ci est constituee par le serum dilue tres limpide, obtenu suivant les indications de BORDET et DELANGE, et maintenu pendant environ 18 heures a 20-220 C. Nous avons eu soin de verifier, avant chaque expirience, que ce milieu ne contenait plus de thrombine. Remar. quons qu’il renferme toujours une petite quantite de cytozyme. Nous avons prepare des melanges de 0.3 cc. de serum dilue vieilli; de 0.05 cc. de suspension de cytozyme (constituant un apport sup- plementaire), de 0.2 cc. soit d’EP, soit de venin, et enfin de 0.4 cc. d’EPCa. Apres 25 minutes, nous avons ajoute 0.2 cc. de plasma dioxalate dilue vieilli (servant de solution de fibrinogene). On trou- Vera dans le tableau IV les resultats d’une experience ainsi realiske.
Comme on s’en rend compte, aux concentrations de 1:lO 000 et de 1 :lo0 000, le venin de Naja tripudiuns (khantillon I), en presence des substances thromboplastiques contenues dans la suspension de cytozyme d’origine musculaire et de l’exces de cytozyme, retarde la formation de la thrombine.
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352 CHARLES-JOSEPH HANUT
Substance etudiie
~ ~~~~
Temps de coagulation des m6lmges
Venin de Cobra (echantillon I ) 2 1 : I0000 a 1:1oooO0
EP (essai t h o i n )
c. c. 19‘20” c. c. 11’10”
C. C. 5/45’’
Nous avons repete ces experiences en utilisant un milieu beaucoup moins riche en cytozyme et surtout en substances thromboplastiques. Dans ce but, nous n’avons pas introduit de suspension de cytozyme dans le melange. Dens ces conditions le venin de Cobra (echantillons I et 11) empCche toujours completement la formation de la thrombine A la dilution de 1 :lOOOO. A la concentration de 1 :lo0 000 I’echantillon I retarde la coagulation de plusieurs heures et l’echantillon I I I’empCche.
2O Effets du venin de Cobra sur le serozyme et le cytozyme
L’action inhibitrice du venin de Cobra sur la deuxieme phase pourrait trouver son explication dans un effet inactivant sur le serozyme ou sur le cytozyme ou sur ces deux produits a la fois puisqu’ils sont necessaires a la formation de la thrombine. Malheu- reusement, il n’est pas encore actuellement possible d’obtenir du serozyme et du cytozyme purs. D’une part, le serum diluC vieilli, employe comme solution de serozyme, contient toujours une petite quantite de cytozyme. D’autre part, la suspension preparee en ppr- tant des muscles de Lapin, utilisee comme cytozyme, renferme, non seulement ce produit, mais aussi des substances thromboplas- tiques. I1 importe de tenir compte de ces faits pour etablir des conclusions ayant quelque valeur.
Dans un premier type d’essais, nous avons prepare des melanges de 0.3 cc. de serum dilue vieilli, de 0.2 cc. soit d’EP, soit de venin de Cobra (echantillon I ) a 1 :10 OOO et de 0.35 cc. d’EPCa. Ensuite, apr& des laps de temps variables (t du tableau V), nous avons ajoute 0.05 cc. de suspension de cytozyme, puis, deux minutes plus tard, 0.3 cc. de plasma dioxahte dilue vieilli (servant de solution de fibri- nogene). Si le venin de Cobra etait sans action sur le serozyme con- tenant une petite quantite de cytozyme, nous devrions constater
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C. C. 22‘45“
une coagulation du melange total, d’autant plus rapide que le laps de temps est plus considerable, puisque la quantit i de thrombine formee s’accroit en mCme temps que ce laps de temps.
T A B L E A U V .~ -.
I
t
Resultats avec les melanges
I contenant du venin s:tns venin (tenioin)
30 secondes 5 minutes
30 minutes 30 secondes
Or, le tableau V nous permet d’observer precisement le contra.ire. Plus le temps ( t ) qui s’ecoule entre la preparation du melange de serum diluC vieilli, de venin de Cobra et de sel calcique et l’addition de cytozyme est long, e t plus la coagulation est retardee. Ceci ne peut s’expliquer que par une action inactivante du venin de Cobra sur le serozyme contenant une petite quantite de cytozyme.
Dans un second groupe d’experiences, nous avons prepare des melanges de 0.05 cc. de suspension de cytozyme, de 0.2 cc. soit d’EP, soit de venin de Cobra (ichantillon I) a 1 :10 000 et enfin de 0.35 cc. d’EPCa. Apres un intervalle variable, design6 par tdans le tableau VI , nous avons ajoute 0.3 cc. de serum dilue vieilli et deux minutes plus tard 0:3 cc. de plasma dioxalate dilue vieilli (servant de solution de fibrinogkne). Le tableau VI reproduit les resultats d’une experience ainsi realisee.
T A B L E A U V I - ~ _ _ _ _ _ _ ~.
Resultats avec Ies melanges t
contenant du venin sans venin (temoin)
30 secondes 5 minutes
30 minutes 30 secondes
c. c. 50’ C . C . 7 5 ‘ c. c. 130’
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Conime on le voit, plus le contact de la suspension de cytozyme et du venin est prolonge, plus la coagulation du melange total est retardee. Le venin de Naja tripudians inactive donc le melange de cytozyme et de substances thromboplastiques que nous avons em ployk.
L’action inhibante du venin de Cobra sur la deuxieme phase de la coagulation s’explique, en grande partie, par une inactivation a la fois du serozyme et du cytozyme. Ceci ne parait toutefois pas Ctre la seule cause de l’entrave apportee par le venin de Cobra a l’appari- tion de la thrombine. En effet, comme le tableau VI le montre, si I’on ne maintient le contact entre le venin et la suspension de cytozyme que 30 secondes, tout en n’accordant a la formation de la thrombine qu’un temps relativement court (2 minutes), on constate neanmoins un effet anticoagulant tres manifeste.
VI. - Action du venin de Cobra sur la troisikme phase de la coagulation
La troisieme phase de la coagulation consiste en I’action de la thrombine sanguine sur le fibrinogene. Nous nous sommes assure tout d’abord que le venin de Cobra ne masquait pas, sous ses effets anticoagulants, une action thrombinique ; il ne coagule pas le plasma dioxalate diluk vieilli (servant de solution de fibrinogene) soit tel quel, soit debarrasse de ses dernieres traces de proserozyme et de cytozyme par adsorption a I’aide de phosphate tricalcique. Ces conclusions resultent d’experiences faites avec les deux echantillons de venin de Naja tripudians.
Nous examinerons i’action du venin en premier lieu sur la troi- sieme phase proprement dite puis sur la thrombine et sur le fibrino- gene envisages separement.
1. - Action du venin sur la troisieme phase proprement dite
Nous avons prepare de la thrombine en mettant en contact 0.2 cc. de serum dilue vieilli (= serozyme + cytozyme) et 0.4 cc. d’EPCa. Au bout de 15 minutes, nous avons ajouti 0.2 cc. d ’EP ou de venin et 0.2 cc. de plasma dioxalate dilue vieilli phosphate (servant de solution de fibrinogene). Le tableau VII montre les risultats ainsi obtenus.
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VENIN DE COBRA ET COAGULATION SANGUIN’ 355
T A B L E A U V I I
Produit e mploye lTr mps de coagulation du melange total
Venin de Cobra (echantillon I ) i 1 : l O O o o
Venin de Cobra (echantillon 1 1 ) A 1 : I O O o o E P (tenioin)
I
c. c. S’40”
c. c. 9’15”
C. C. 6‘55’
Lors de I’experience dont les resultats sont relates dans le ta- bleau VII , le venin de Cobra ne provoque qu’un retard minime de la troisieme phase. Lors d’autres experiences, cet effet a , d’ailleurs, ete absolument nul. Comme l’admettait ARTHUS (2), le venin de Naja lripudians n’est donc pas une antithrombine. I1 ne s’oppose ni a I’action coagulante de la thrombine sanguine ni a celle du venin de Bothrops atrox.
2. - Action du venin de Cobra sur la thrornbine.
Nous venom de constater que le venin de Cobra retarde parfois legerement l’action de la thrombine sur le fibrinogene. De plus, nous avons vu que ce venin ne coagule pas lefibrinogene, en I’absence d’addition de calcium. I1 importait de rechercher si le leger pouvoir inhibiteur quelquefois observe au cours de la troisieme phase de la coagulation est dQ a un effet sur le fibrinogene ou sur le thrombine.
Partons d’une solution de thrombine obtenue en ajoutant a 10 cc. de serum frais 10 cc. d’EPCa et 0.1 a 0.2 cc. de suspension de cyto- zyme et en maintenant ce melange a 20-220 C pendant 40 minutes. Apres ce laps de temps, preparons des melanges comprenant 0.2 cc. de cette solution de thrombine, 0.4 cc. d ’EP et 0.1 cc. soit de venin, soit d’EP. Partageons ces melanges en deux groupes. A chaque tube du premier groupe ajoutons immediatement 0.3 cc. de plasma dioxalate dilue (servant de solution de fibrinogene). N’effectuons cette addition qu’au bout de 20 minutes pour les tubes du deuxieme groupe. Repetons la mCme experience, mais en n’utilisant le serum dilue recalcifie (solution de thrombine) qu’au bout soit de I heure trois quart, soit de 2 heures et demie de sejour a 20-220 C.
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356 CHARLES-JOSEPH HANUT
Le tableau VI I I resume les resultats obtenus dans une experience de ce genre.
Laps de temps au bout duquel on utilise la
solution de thrombine a p r h sa priparxt ioii
40 minutes
2 h. 30 iniii.
TABLEAU V I I I ~~~
Produit ajoute a la thrombine
venin de Cobra I i 1 : 10 000
1 v ~ L ( t t ~ ~ o c i ~ L I i i : 10 ooo
[ )I )) I 1 il 1 : 10000
{ 11 11 I 1 a 1 :1oOOo EP (temoin) venin de Cobra I i 1 : 10000 i )I I1 I I i 1 : 10 000
[ EP (temoin)
remps de coagul a t ' ion lu melange de throm- )ine et soit dr venin, oit d'EP, quand on y ajoute le fibrinogbe (plasma dioxalatt!
dilui)
de suite
S'25" 9'35" S'2U"
9/25'' 9'1 5" S' jS' ' 9 ' j v " S '30 " S'15"
111 bout de 20 minutes
10'25" 11' 5 " S'45"
17'jg" 17'1 5" S'35"
47' 54'
S'5o"
I1 resulte nettement du tableau VIII que lorsqu'on ajoute le plasma dioxalate dilue (servant de solution de fibrinogene) immedia- tement aprks qu'on a prepare le melange de thrombine et de venin, on n'observe pas d'effet reel de ce dernier sur la coagulation qui s'effectue dans le meme laps de temps que dans les tubes temoins ne contenant pas de venin ou avec un retard insignifiant. Mais si l'on attend 20 minutes avant d'ajouter le fibrinogene au melange coagulant, le venin de Cobra provoque un retard net par rapport aux tubes temoins. Ce retard est d'autant plus accuse que la solution de thrombine a ete preparee depuis un laps de temps plus long, bien que dans I'experience dont le tableau VIII relate les resultats, la thrombine soit restee tout aussi active 2 heures et demie que 40 minutes apres sa preparation. I1 semble donc bien s'agir d'une inac- tivation de la thrombine par le venin de Cobra, phenomene qui ne se produit qu'au bout d'un certain temps e t qui s'accroit peu a peu.
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VENIN DE COBRA ET COAGULATION SANGUINE 357
Signalons que la solution de thrombine peut perdre de son activitk parfois deja au bout de 20 a 30 minutes, d'autres fois seulement plus tard. Dam ces circonstances l'effet retardateur du venin de Cobra s'accentue notablement. C'est ce qu'on voit, par exemple, dans l'experience dont les resultats sont rassembles dans le tableau IX
TABLEAU I X
Laps de temps au bout duquel
on utilise la solution de
thrombine apris sa priparation
20 minutes
2 heu1t.s
Produit ajoutC A 1;i thrombine
venin de Cobra I i 1 : 10000 venin de Cobra 11 i 1 : 10 000
venin de Cobra I A t : 10 c)00
venin de Cobra I I i 1 : 10 O(N)
I Ep ( t h o i n )
I
remps de coagulation Iu mdange de throm- jine et soit de venin, oit d'EP, quand on y ajoute le fibrinogbe
(plasma dioxalate dilui)
de suite
5'10" 5'30'' 5' 9'25"
9/41 1''
S ' j g "
RU bout de 30 minutes
7'1 5" 7'40" 6' 5''
entre 21l.i
rntre 2 ; ; e t 31. h.
S'K!"
et 3 ! 2 h.
3 . - Action du venin de Cobra sur le fibrinogdne.
On prepare une serie de tubes renfermant chacun 0.3 cc. de plasma dioxalate dilue (utilise comme solution de fibrinogene) et 0.1 cc. soit d 'EP, soit de venin de Cobra a 1 : l O 000. On y ajoute, ou bien de suite, ou bien apres 20 a 80 minutes, 0.6 cc. d'une solution de thrombine preparee en melangeant 10 cc. de serum frais de Lapin normal, 10 cc. d 'EP et 2 gouttes de suspension de cytozyme. Cette solution de thrombine est maintenue pendant 20 minutes a une heure a 20-220 C avant d'Ctre utilisee. On trouvera dans le tableau X les donnees ainsi recueillies dans deux experiences prises a titre d'exem- ples des deux especes de resultats obtenus a.u cows de ces essais.
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N o de I'ex- pCri- ence
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I
I 1
Laps dc temps
xu bout duquel on uti- lise la
solution de
throrn- bine
aprks sa pripa- ration
30 niin.
1 heure
20 min.
1 heure
CHARLES- J OSEPH HANUT
T A B L E A U X
Produit ajoute au plasma lioxalate dilut! (servant de solu.
tion de fibrinoghe)
venin de Cobra I i I : 10 000 venin de Cobra I I I : 10 000 EP ( t h o i n ) venin de Cobra I i I : 10 000 venin de Cobra 11 B I : 10 000 EP ( t h o i n )
venin de Cobra I i 1 : 10 QOO venin de Cobra 11 ?I 1 : 10 000 EP (timoin) venin de Cobra I B 1 : 10 000 venin de Cobra 1 I B 1 : 10 000 EP ( t h o i n )
Ttlrnps de coagulation y~i:iiid on ajoute la solution
de t hromb ine
imm& diate- inent
20 minutes
80 minutes
a p r h l'addition de venin ou d'EP au plasma dioxa- la t i dilui (fibrinoghe)
2'20" 2'10" 2'1 5 " S'15" 7'5"' S'l"'
4'30"
4'1 5 " 13'50" 16'10" 13'25"
4'50"
1'20" 2/20''
2'10" S'2U" S'35" S'15"
5'55"
5'35" 13/35' '
14'3 5 " 23/35 " 11'20"
Lors de l'experience I du tableau X, le venin de Cobra n'a pas retarde la coagulation, mCme quand la solution de thrombine avait perdu de son activiti par suite de sa conservation pendant 1 heure 6 220 c.
Lors de l'experience 11, il en a Cte de mCme pour l'echantillon no I de venin de Cobra. Au contraire l'echantillon no I 1 a exerce un effet inhibiteur net quand le venin est reste pendant 20 et surtour: pendant 80 minutes en contact avec la solution de fibrinogene avant l'addition de thrombine. Cet effet inhibiteur de l'echantillon I1 est relativement faible quand la solution de thrombine est ajoutee au melange de
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VENIN DE COBRA ET COAGULATION SANGUINE 359
venin et de solutiop de fibrinogene (plasma dioxalate dilue) immedia- tement apres sa preparation, et ceci seulement quand la solution de thrombine a perdu nettement de son activite par suite de sa conser- vation relativement longue (une heure) a 20-220 C.
I1 resulte de ce qui precede que tantbt (echantillon I ) le venin de Cobra n’exerce aucun effet inactivant vis-a-vis du fibrinogene, tandis que d’autres fois (echantillon 11) ce venin possede un certain pouvoir inhibjteur vis-a-vis du fibrinogene. Cette difference d’action doit peut-6tre s’expliquer par des variations dans la composition des divers echantillons de venin de Cobra.
Quoi qu’il en soit, la Iigkre action retardatrice du venin de Cobra sur la troisieme phase de la coagulation s’exerce surtout sur la thrombine, e t seulement a titre accessoire et de faSon irrkgulikre sur le f i b h o g h e .
Conclusions
1 . Le venin de Cobra est anticoagulant. I1 retarde beaucoup l’appa- rition du sirozyme et la transformation du serozyme en thrombine. 11 ne retarde que legerement la coagulation du fibrinogene par la t hrombine sanguine.
2. Le venin de Cobra inactive nettement les complexes serozyme- cytozyme et substances thromboplastiques-cytozyme, et aussi la thrombine. I I possede, en outre, parfois un leger pouvoir inactivant vis-a-vis du fibrinogene.
B IBLIOGRAP H I E
I. Ch. J. HANUT. - Mode d’action du venin de Bofhrops atrox sur In coagu- lation sanguine in vitro. Arch. internat. Phvsiol., 1937, XLIV, 329-350.
2. M. ARTHUS. - Actions coagulantes e t anticoagulantes des venins. Arch. internat. Physiol, 1919, XV, 203-219.
3. P. MORAWITZ. - Ueber die gerinnungshemmende Wirkung des Kobrngiftes. Deuts. Arch. f. klin. Med., 1904, LXXX, 340-355.
4. B. A. HOUSSAY et A. SORDELLI. - Action des venins de Serpents sur la coagulation sanguine. Journ. de Physiol. et de Pathol. gtn., 1919, XVIII, 781 -811. - Venins coagulants et anticoagulants. Arch. internut. Physiol.,
5. R. RABINOVICH. - Action des venins de Serpents sur la thrornbine et I’anti- thrombine. C. R. SOC. B i d , 1923, LXXXVIII, 369-370. - Action anti- antithrombine du venin de Cobra. fbid. , 1935, XCII, 833-834.
1920, xv, 378-382.
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360 CHARLES-JOSEPH HANUT
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