C O N T R I B U T I O N A L']~TUDE D U M I C R O D O S A G E

L'URI~E D A N S LE SANG.

Par

P. WENGER, CH. CIMERMAN et A. MAULBETSCH.

Laboratoire de Chimie Analytique de l'Universit~ de Gen~ve.

(Ei~gelangt am 21. Juli 1933.)

DE

I. Etude bibliographique.

L e s m 6 t h o d e s d e d o s a g e d e l ' u r ~ e p a r le x a n t h y d r o l .

Le dosage de l'ur~e est tr~s important au point de vue clini- que, aussi a-t-il fair l'ob]et d'une foule de travaux. Les nom- breuses m~thodes qui en ont r~sult~ reposent sur les trois r~ac- tions suivantes:

a) D~composition de l'ur~e par l'hypobromite. b) D~.composition de l'ur~e par un ferment, l'ur~ase. c) Precipitation de l'ur~e par le xanthydrol.

Les m~thodes 5̀ l 'hypobromite et 5̀ l'ur~ase, qui pr~sentent de grands avantages pour les dosages cIiniques, ne sont pas aussi pr~cises que les proc~d~s au xanthydrol. C'est FossE, qui apr~s une longue s~rie de travaux 1, a 5tabli que le xanthydrol pr~cipite quantitativement et uniquemen£ l'ur~e dans les liquides biologi- ques additionn~s d'acide ac~tique. Le compos~ insoluble form4 est la dixanthylur~e ou ursine, de formule:

0 (C~tI,) ~Ctt - - NIt - - CO - - NH - - CH (C6H~)._,O

dent le poids mol@culaire est 7 lois plus @lev@ que celui de l'ur@e. Cette r@action est k la base de plusieurs proc~l@s de dosage gravi- m@triques, volum@triques et colorim@triques.

Les p r o c ~ d @ s g r a v i m @ t r i q u e s consistent 5, pr@cipiter

Contribution a l'~tude du microdosage de l'ur~e dans le sang. 133

l'urde par une solution ac6tique ou m~thylique de xanthydrol, darts le s6rum d~satbumin~ et additionn6 de son volume d'acide ac6tique glacial. La condensation dure de 1/2 heure k 3 heures suivant les quantit6s raises en jeu. Apr~s filtration, lavage et dessiccation, la dixanthylur6e est pes6e; son poids divis6 par 7 donne le poids de l'ur6e.

Le proc6d6 original de FOSSE 1, 16g~rement modifi6 par HUGOUNENQ et MOR~L, FREJACQUE 2 et LAUDAT ~ s'applique

10 cc. de s6rum ce qui exclut son emploi pour des dosages r6p6t6s. Aussi plusieurs auteurs ont-ils cherch6 £ le transformer en microm6thode applicable £ des quantit6s de s6rum beaucoup plus faibles. NICLOUX et WELTEI~ ~ op~rent sur 1, 0,5 ou m~me 0,3 cc. de s6rum qu'ils diluent 7 lois. Le tr~s faible pr6cipit6 d'ur6ine est filtr6 sur un microcreuset de NEUBAUER en platine et pes6 sur une microbalance; son poids donne le poids d'ur6e contenu dans lcc . de s6rum. GUILLEMET et Gonnz s effectuent la pr6cipitation directement dans un filtre d'J6na en verre. POI.ONOWSKI et AUGUSTE ~ ont signal6 qu'en dosant l'ur6e sur du sang fiuor6, on obtient des r~sultats trop forts; il faut 61iminer le fluorure par l 'ac~tate de calcium.

Pour 6viter l'emploi de la microbalance, quelques auteurs ont 6tabli des m 6 t h o d e s v o l u m 6 t r i q u e s dans lesquelles l'ur6ine, pr6cipit6e dans les mSmes conditions que pr6c6demment, est estim6e soit par oxydim6trie, soit par acidim6trie.

CORDEBARD ~ oxyde la dixanthylur6e par le m61ange sulfo- chromique dont il t i tre l'exc6s par une solution ferreuse, alors qu'ALLEN et LUCK s et CUNY ROBERT ~ utilisen~, les premiers,

t FossE, C. R. Acad. Sciences, 158, 1076, 1432 (1914); 157, 948 (1913). FRENKEL, Ann. Chim. anal., 234 (1920).

-~ HUGOUm~NQ et MOREL, Ann. Chim. anal., 68 (1914). FREJACQUE, Ann. Chim. anal., 69 (1914).

s LAUDAT, Ann. Chira. anal., 18 (1928). 4 NICLOUX et WELTER, Bull. Soc. Chim. biol., 4, 128 (1922).

GtrILLEMET et GOLAZ, C. R. Soc. Biol., 101, 726 (1929); Ann. Chim. anal., 106 (1930).

8 POLONOWSKI et AUCUSTE, C. R. Soc. Biol., 86, 1027 (1922). 7 CORDEBARD, Bull. Soc. Chim. biol., 10, 461 (1928). 8 ALLEN et LUCK, Journ. Biol. Chem., 82, 696 (1929). 8 CUNY ROBERT, Bull. Soc. Chim. biol., 12, 171 (1930).

134 P. Wenger, Ch. Cimerman et A. Maulbetsch:

le bichrom,ate de potassium en prdsence d'iodure de potassium, le second l'iodate de potassium, et t i t rent l'iode lib~r~ par l'hypo- sulfite de sodium. Un procdd~ plus rapide, mais peu precis, con- siste ~ d~colorer la solution d'ur~ine dans l'acide sulfurique par le permanganate '°.

BOIVIN xi dose l'azote du pr~cipit4 par u n miCrO-K]ELDAHL OU le carbone par la microm~thode de NIc [oux .

Dans les m ~ t h o d e s c o l o r i m ~ t r i q u e s , de BEATTIE ~'-' et de SHUNIDI la, on compare la coloration de la solution sul- furique de dixanthylur~e avec celle d'~talons.

Enfin si l'on fait agir le xanthydrol directement sur le s~rum non d~salbumin6, il se forme une suspension d'ur~ine qui con- vienb ~ un dosage n~ph61om~trique l'.

L'emploi du xanthydrol pour le dosage de l'ur~e, ~tudi~ par ~[ESTREZAT ~, fournit des r~sultats rigoureux, ~ condition d'op~rer sur du s~rum dent le taux en urSe ~ 5t6 amen~ h 0,50 gr.:litre environ et d'utiliser une quantit~ de solution "i 107,J de xanthydrol ~gale au dixiSme de la solution ac~to-urSique traiter. La prdcision des rSsultats d~pend aussi de la puret~ des r~actifs qui doivent ~tre soigneusement contrSl~s. L'inconv~nient de la m~thode r~side dans la difficult4 de se procurer du xan- thydrot frais; ce r~actif s 'oxydant facilement ne peut ~tre con- se~-¢~ plus de deux semaines.

II. Etude de quelques microm$thodes de dosage de l'urde clans le sang.

I n t r o d u c t i o n .

Les microm6thodes de dosage de l'ur6e sanguine au moyen du xanthydrol permettent d'obtenir des r6sultats tr~s pr6cis avec une tr~s faible quantit6 de s6rum et sent par 1£ appel6es i rendre do grands services dans t o u s l e s cas off l'on ne dispose que de

~o LUCK, Journ. Biol. Chem., 79, 211 (1928). 1~ BOlVlN, Bull. Soc. Chim. biol., 10, 684 (1928). t~ B~TTIE, Biochem. Journ., 22, 711 (1928). 13 SH~JNmI, C., 1930, II, 1894. t4 AUGUSTE, C. R. Soc. Biol., 89, 991 (1923); 9~, 639 (1925). 1~ MESTaEZAT JANET, Journ. Pharm. Chim., 22, 369 (1920).

Contribution a l'~tude du microdosage de t'ur~e dans le sang. 135

tr~s peu de sang pour effectuer ce dosage. Leur inconvenient est d'Stre assez longues et de n~cessiter des appareils souvent cofiteux. C'est sur ces deux points que nous avons apport6 quelques ame- liorations. Nous d~crirons tout d'abord rapidement le mat6riel de microanalyse que nous avons utilis~ dans nos recherches.

Pour la filtration, nous employons: a) Un microfiltre en porcelaine 1", 18 provenant de la Staat-

liche Porzellan Manufactur Berlin, compos6 d'un tube (diam~tre int. 1 mm., ext. 3 mm.) de 50 mm. de longueur et termin6 k une de ses extr6mit6s en forme de cupule off vient se placer une plaque de porcelaine poreuse (diam. 10 ram.). Ce filtre est tr~s r6sistant k la temp6rature eL peut ~tre chauff6 au rouge; son poids es inf6rieur k un gramme.

b) Un filtre en vei're 1G, ~9 compos6 d'un tube de verre 16g~rement conique (diam. int6rieur au sommet 1 ram., ~ la base 3 ram.) de 70mm. de longueur. A 5 ram. de la base, l 'ouverture int6rieure est 6[rangl6e et r6duite ~ un diam~tre de 0,1 ~ 0,2ram.; cela forme une petite cupule au fond de laquelle on place une couche d'amiante de 1 mm. environ d'6paisseur. L'amiante a 6t6 purifi6c au pr6alable par un traitement k l'acide chlorhydrique bouillant, puis lav6e ~usqu'k 61imination des ions chlore.

L'appareil k filtrer x9 comprend en outre un tube en U (diam. int6rieur 1 mm.): une extr6mit6 est reli6e au filtre de porcelaine ou de verre; l 'autre plonge k travers un bouchon de caoutchouc, dans un tube k essais muni'd'une tubulure lat6rale en communica-

\

tion a v e c l a trompe k eau. S'il s 'agit de recueillir le filtrat, ce tube 5 essai est remplac6 par un r6cipient cylindrique 1. de 150 cc. environ 6galement muni d'une tubulure lat6rale et k l'int6rieur duquel on place soit un pet i t cylindre, soit un microbecher off vient tomber goutte k goutte le filtrat que l'on peut recueillir ainsi int6gralement. Pour filtrer, il suffit de placer le becher con- tenant le pr6cipit6 au-dessous du filtre et d'aspirer avec la trompe. Ce dispositif permet de filtrer et de laver tr~s rapidemenb les pr6cipit6s tr~s fins.

1B HXlISLZR, Ztschr. analyt. Chem., 64, 361 (1924). '~ BENEDETTI-PICHLER, Ztschr. analyt. Chem., 64, 409 (1924). Is SCHWARZ-BERGKAMPF, Ztschr. analyt. Chem., 69, 321 (1926). '~ EMtCI~I. Mikrochemisches Praktikum, pages 63, 65, 66 (1931).

136 P. Wenger, Ch. Cimerman eL A. Maulbetsch:

Pour la prdcipitation, on utilise des microbechers en verre d'Idna de 15 mm. de diam~tre, 45 mm. de hauteur et 7--8 cc. de volume.

La dessiccation a lieu dams l'6tuve de BENEDETTI -P ICHLER ~

darts laquelle on fair passer un faible courant d'air sec et off l'on place ensemble le filtre et le becher qui a servi ~ la prdcipitation.

1. Dosage gravim6trique

E t u d e d u p r o c d d @ NICLOUX-WELT~.Rt

L'urde est prdcipitde par une solution m6thylique de xanthydrol dans le s6rum ddsalbumin& Le pr@cipitd de dixanthylurde est filtr~ sur un creuset de NEUBAUEa en platine et pes6 sur une micro- balance.

Nous avons apptiqu6 la technique longuement ddcrite par les auteurs ~ une solution d'urde ~ 0,5 gr./litre prSparde £ par t i r d'urde dessdchde dans le vide sur l'acide sulfurique, et dosde simul- tandment par la m acromdthode de FOSSE:

NICLOUX-WELTEP, FOSSE

0,52 gr./litre 0,501 gr./litre 0,53 0,505

La m6thode est exacte et pour rendre son emploi plus facile, surtout pour les dosages en s6rie, nous avons substitu6 au c reus~ de NEUBAUER le microfiltre en porcelaino ddcrit plus haut.

M o d i f i c a t i o n d u p r o c @ d d NICLOUX-WELTEFI.

Rdactifs n6cessaires:

1. Acide acdtique glacial exempt d'acides min6raux.

2. Rdactif de TANRET: HgC12 2,71 gr. | dans

KI 7,2 gr. j 100 cc. eau CH3C00H glacial 66,6 cc.

3. Solution £ 5~o dans l'alcool mdthylique, ~ preparer au mo- ment de l'emploi, de xanthydrol frais.

4. Solutions de lavage: a) Alcool dthylique k 950 satur6 do di- xanthylurde. b) Eau satur6e de dixanthylurde.

Contribution a l'~tude du microdosage de rur~e dans le sang. 137

M o d e o p ~ r a t o i r e :

Verser darts un tube k essais 1 cc. de s~rum, 5 cc. d'eau, 1 cc. de r~actif de TANRET; m~langer et filtrer au bout de 5 minutes. Pr~- lever 1 cc. du filtrat, le placer dans un microbecher avec 1 cc. d'aeide ac~tique glacial et 0,4 cc. de ]a solution de xanthydrol; m61anger avee une baguette de verre tr~s fine. La precipitation commence au bout de 3 minutes environ. Laisser reposer une heure en agitant de temps ~ autre pendant les dix premieres minutes. Filtrer ensuite avec le filtre en porcelaine; laver 2 lois avec 4--6 gouttes de a, 2 lois avec 3--4 gouttes de b, nouveau 2 fois avec 3--4 gouttes de a, 2 lois avee 3--4 gouttes de b e t ter- miner avec 2 gouttes d'eau pure. I1 faut avoir bien soin d'essorer entre les diff6rents lavages; en effet, l'eau dissout tr~s peu d'ur~ine et fait repr~cipiter celle-ci de sa solution alcoolique; si on m~- lange dans le microbecher les deux solutions, on introduit de la dixanthylur6e qui fausse les r~sultats.

Lorsque le lavage est termin~, on d~tache le filtre du tube en U, tout en le maintenant dans le microbecher et on le place avec celui-ci dans l'~tuve de BENEDETTI-PICHLER. On dess~che 105°--110 °. darts un faible courant d'air pendant 30 minutes. Le tube de l'~tuve est alors plac~ k c6t~ de la balance pendant 10 mi- nutes, apr~s lesquelles on retire le microbecher contenant le filtre, l'essuie avec une peau de daim et 1~/pose sur un petit bloc de nickel plac6 dans la cage de la balaflce; au bout de 10 minutes le refroidissement est complet et on p~se au centi~me de milligramme. Pendant routes ces operations, le becher n'est, man i6 qu'au moyen de pinces, ]amais avec les doigts.

n mgr. 7 ]000 ~--- mgr. d'ur~e / litre de s~rum. 7

n/7 : m g r . trouv~s en urge, n 7 . 7 ~ mgr. d'uree dans 1 cc. de s~rum, n / 7 . 7 . 1000 ~ mgr. d'ur6e par litre de s~rum,

de telle sorte que l'on peut simplifier l'expression et que n ~ gram- mes d'ur~e par litre de s~rum.

Avant chaque dosage, le filtre et le becher sont laves avec du m@lange sulfochromique chaud, rinc~s, s~ch~s et pes~s exactement

138 P. Wenger, Ch. Cimerman et A. Maulbetsch:

darts les m~mes conditions de temp6rature, dur6e, etc., que celles-de dosage.

Cette m6thode a donn6 les r6sultats suivants:

a) Dans une solution aqueuse h 0,50 gr. litre 0,48 gr./litre 0,50 0,50

b) Dans du s6rum 1. 0,68 gr. litre 0,67 0,68 2. 0,79 >> 0,80 0,82

c) Dans du s6rum h 0,80 gr./litre additionn6 de quantitSs va- riables d'une solution aqueuse d'ur6e ~ 0,50 gr./litre.

Trouv6 1. 1 cc. s6rum q- 0,52 cc. sol. aq. soit 1,06 gr./litre 1,07 gr. litre 2. 1 cc. >> ~0 ,78cc . >> 7> 7> 1,19 77 1,22 >7 3. 1 cc. >> q- 1,20cc. 77 77 77 1,40 >> L46 >> 4. 0,5cc. 77 -f-0,50cc. 77 7> :> 0,65 7> 0,62 7>

Le dosa,ce est aussi exact et rapide que dans le procdd5 de NICLOUX-WELTER.

2. Dosage volum6trique

M o d i f i c a t i o n d u p r o c 6 d 6 ALLEN-LUCK.

Pour 6viter l'emploi de la microbalance toujours d61icat, nous avons remplac6 l'estimation gravim6trique de la dixanthylur6e par un dosage volum6trique emprunt6 k la m6thode ALLEN-LUCK s. Dans ce proc6d6, la dixanthylur6e s6par6e du s6rum par centrifugation, est trait6e par le m61ange sulfochromique qui l'oxyde rapidement en acide carbonique, ammoniaque et eau suivant l'6quation:

3 CO (NI t . Ctt [C¢1:[,] 20)~ q- 58 K_~Cr..O, if- 235 tt_~SO, = ~--- 58 Cr.~(S003 + 58 K.,SQ + 3 (Ntt~).~80, + 235 H~O + 81 CO._,.

L'exc~s de bichromate est titr6 par l'hyposulfite de sodium en pr6- sen~ce d'iodure de potassium:

Cr20~-- q- 6 J - if- 14 H + ->- 3 J.~ if- 2 Cr+++ 4. 7 H..,O.

52 q- 2 8 2 0 , - - ~ 2 J - q- 8,0o

1 gramme d'ur6ine exige pour son oxydation 13,54 gr. de bichro- mate, 1 cc. de bichromate N/10 ~ 0,0518 mgr. d'ur6e.

Contribution a l'~tude du microdosage de l'ur~e dans le sang. 139

M o d e o p ~ r a t o i r e .

Solutions titrSes et r~aetifs: 1. Solution £ 5 ~ de xanthydrol dans l'alcool m5thylique pur. 2. R~aetif de TA:NRET. 3. Eau et aleool 6thylique ~ 950 satur6s de dixanthylur6e. ~i. Acide ac6tique glacial pur. 5. Solution de bichromate de potassium N. 6. Solution d'hyposulfite de sodium N/10. 7. Solution d'iodure de potassium £ 10~ . 8. Empois d'amidon. La d4f4cation, la precipitation et ]a filtration de la dixanthyl-

urge se font de la m6me mani~re que dans la m4thode pr4c4dente. Puts le microbecher contenant le filtre de porcelaine et ]e pr4cipit~, d'ur6ine est plae4 dans une 6tuve ordinaire pendant 15 minutes ou 5 minutes dans I'4tuve de BENEDETTI-PICHLER pour 4liminer com- pl~tement l'alcool. On verse ensuite dans ]e becher 1 cc. exactement mesur6 de la solution normale de bichromate et 1,5 cc. d'acide sulfurique concentl'6. On m4lange en se servant du filtre comme agitateur; l'616vation de temperature qui se produit facilite l'oxy- darien, qui est complete au bout de 2 "~ 3 minutes. On relic de nouveau le filtre ~t l'appareil h fittrer et aspire la solution sulfo- chromique ef~ la recueille dans un cylindre de 50 cc. grace au dis- positif d4crit dans l'introduction. On lave ]e bechcr et le filtre 3 lois avec 2 ce. d'eau. On dose l'excbs de bichromate directement darts le cyIindre: on dilue ~t 20 ce. avec de l'eau distil]Se, or~ a.loute 10 cc. d'iodure de potassium k 10z% et laisse eou]eur ]a solution d'hyposulfite N"10; lorsque la coloration brune a presque disparu, on a]oute quelques gouttes d'amidon et on termine ]e t i t rage .iusqu'k virage du bleu au vert clair.

Soit n le nombre de ec. d'hyposulfite employ6s.

(10-n) 0,0518.7 ~ (10-n) 0,3626 = Quantit6 d'ur6e en gr./litre de s~rum.

V 6 r i f i c a t i o n d e l a m g t h o d e .

a) Dans une solution aqueuse d'ur6e ~ 0,5 gr./litre, le ~itre trouv~ par la microm6thode a 6t6 de:

0,502 gr./litre 0,486 0,501

140 P. Wenger, Ch. Cimerman et A. Maulbetsch: Contribution a l '~tude etc.

b) Dans du s~rum dent le titre, d6termin6 par plusieurs dosages est de 0,38 gr. litre et additionn~ de quantit6s variables de la so- lution aqueuse d'ur~e ~ 0,5 gr./litre.

Trouv6 1. 1 cc. s~rum + 0,77 co. sol. aq. soit 0,765 gr./litre 0,76 gr. l i t re

0,76 2. lcc . )~ + 1,02cc. >> ~> ~> 0,89 ~> 0,90

0,91

R e m a r q u e : On peut substituer au filtre en porcelaine, le filtre en verre avec amiante d~crit plus haul; darts ce cas, il faut dess6cher beaucoup plus longtemps dans l'~tuve de BENEDE'FTI PlCm_ER, a~l moins 1/o heure ~ 3/~ heure, car l 'amiante adsorbe fortement l'alcool de lavage.

Cette m6thode qui s@are la dixanthylur~e par filtration au lieu de centrifugation, est beaucoup plus rapide que le proc~d6 d'ALLEN LUCK et les m6thodes gravim~triques, tout en 6tant aussi exacte.

Conclusion.

Les microm6thodes de dosage de l'ur6e sanguine, dites au xan- thydrol, sent int~ressantes, car elles permettent des dosages tr~s pr6cis sur de faibles quantit6s de s6rum; elles pr6sentent n~anmoins plusieurs inconv6nien~ts: longue dur6e, mat6riel cofiteux, etc. Les recherches faites ell vue de diminuer ou de supprimer ces d6savan- tages, ont conduit ~ modifer la technique des proc6d6s NICLOIIX- WELTER et ALLEN-LUCK: dans le proc6d~ gravim6trique de NICLOUX-WELTER, le creuset de NEUBAUER en platine est rem- plac6 par un microfiltre en porcelaine; dans le proc6d6 volum6trique d'ALI.EN-LucK, la centrifugatiqn du pr6cipit6 est remplac6e par la filtration au moyen de microfiltres.

Les deux m6thodes ~tablies, plus rapides et ne n6cessitant qu'un appareillage de microanalyse tr~s simple, sent applicables ~ 1 co,. de s6rum et donnent des r6sultats pr6cis.