CONTRIBUTION À L’ÉTUDE DE LA PHARMACOCINÉTIQUE ET DE … vetagro sup campus veterinaire de lyon année 2017 - thèse n° 045 contribution À l’Étude de la pharmacocinÉtique

VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2017 - Thèse n° 045

CONTRIBUTION À L’ÉTUDE DE LA PHARMACOCINÉTIQUE ET DE LA TOLÉRANCE DE LA DOXORUBICINE CHEZ LE

CHIEN

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 13 octobre 2017 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

CHAVALLE Thomas Né le 12 mai 1992

à Marcq-en-Barœul (59)

VETAGRO SUP

CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2017 - Thèse n° 045

CONTRIBUTION À L’ÉTUDE DE LA PHARMACOCINÉTIQUE ET DE LA TOLÉRANCE DE LA DOXORUBICINE CHEZ LE

CHIEN

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 13 octobre 2017 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

CHAVALLE Thomas Né le 12 mai 1992

à Marcq-en-Barœul (59)

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LISTE DES ENSEIGNANTS DU CAMPUS VÉTÉRINAIRE DE LYON Mise à jour le 13 avril 2017

4

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RemerciementsRemerciementsRemerciementsRemerciements

Au jury de thèse,

A Monsieur le Professeur Serge LEBECQUE,

De la Faculté de Médecine de Lyon Sud, Pour m’avoir fait l’honneur d’accepter la présidence de mon jury de thèse, Pour l’intérêt porté à mon travail, Hommages respectueux. A Monsieur le Professeur Philippe BERNY,

Du campus Vétérinaire de Lyon, VetAgro Sup, Pour son importante contribution à ce travail de thèse mais aussi du master 2, Pour avoir su être toujours à mon écoute, et ce à tout moment, Un immense merci. A Madame le Professeur Frédérique PONCE,

Du campus Vétérinaire de Lyon, VetAgro Sup, Pour avoir participé à la conception et au développement de cette thèse, Pour votre gentillesse et vos conseils dans mes choix d’orientations Très sincères remerciements.

6

7

Aux personnes ayant contribué à la réalisation de ce travail,

A l’équipe du service de toxicologie-pharmacologie de VetAgro Sup, sous la responsabilité de Monsieur le Professeur Philippe BERNY, et tout particulièrement à Danièle VEY et Bernadette ESPAÑA, Pour leur patience et leur aide dans la réalisation de cette étude, Pour le financement de la phase analytique de notre étude. A l’équipe du service de cancérologie clinique de VetAgro Sup, sous la responsabilité de Madame le Professeur Frédérique PONCE, et notamment Gabriel CHAMEL et Pauline DENOEUX, Pour leur aide précieuse dans la réalisation des prélèvements et pour tout ce qu’ils m’ont transmis. A toutes les personnes m’ayant assistées dans la réalisation des prélèvements, dont Sandrine FRANCHEQUIN, Eglantine NOBLET, Léa PU, Romain MALLET, Boris DEPRÉ, Pour avoir toujours répondu présents malgré la nuit, la fatigue et mes blagues. A Rita, Alba, Alma, Cléo, Sam, Cooki, Ibie, Baya et à leurs propriétaires, Pour leurs participations toujours enthousiastes à notre étude.

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Table des matièresTable des matièresTable des matièresTable des matières

TABLE DES ANNEXES................................................................................................. 13

TABLE DES FIGURES ..................................................................................... 15

TABLE DES TABLEAUX ................................................................................. 17

LISTE DES ABRÉVIATIONS ........................................................................... 19

INTRODUCTION ........................................................................................... 21

PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE DE LA DOXORUBICINE EN MEDECINE VETERINAIRE ................................................................................................. 23

I. LA DOXORUBICINE, PHARMACIE CHIMIQUE .......................................................................... 25

A. Historique, formule chimique et synthèse.............................................................. 25

1. Historique .................................................................................................................... 25

2. Structure chimique de la doxorubicine .......................................................................... 26

3. Synthèse de la doxorubicine ......................................................................................... 27

B. Principales propriétés physico-chimiques et stabilité de la doxorubicine ................ 30

1. Principales caractéristiques physico-chimiques de la doxorubicine ................................. 30

2. Stabilité de la doxorubicine en solution ......................................................................... 31

C. Principales méthodes d’analyse de la doxorubicine ............................................... 31

1. La spectrophotométrie infrarouge ................................................................................. 31

2. La spectrophotométrie ultraviolet et visible .................................................................. 32

3. La spectrofluorimétrie .................................................................................................. 33

4. La spectrométrie de masse ........................................................................................... 33

II. PHARMACOCINETIQUE DE LA DOXORUBICINE ................................................................ 34

A. Voie d’administration et absorption ...................................................................... 34

B. Distribution .......................................................................................................... 34

C. Métabolisme ........................................................................................................ 35

1. Le doxorubicinol ........................................................................................................... 36

10

2. Le dérivé semi-quinone ................................................................................................. 36 3. Les dérivés aglycones .................................................................................................... 36

D. Elimination ........................................................................................................... 37

III. PHARMACODYNAMIE DE LA DOXORUBICINE ................................................................. 42

A. Interactions directes de la doxorubicine avec l’ADN et sa dynamique .................... 42

1. Transport nucléaire de la doxorubicine ......................................................................... 42

2. Inhibition de l’ADN topoisomérase de type II ................................................................ 43 a. La structure topologique de la molécule d’ADN chez les eucaryotes ............................ 43

b. Les ADN topoisomérases ........................................................................................... 45

c. Action de la doxorubicine sur les ADN topoisomérases de type II ................................ 49

3. Intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule d’ADN ...................................... 50

a. Mécanisme d’intercalation de la doxorubicine ........................................................... 51

b. Conséquences de l’intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule d’ADN ...... 51

B. Réactivité chimique de la doxorubicine et interaction avec les composés

cellulaires ................................................................................................................. 53

1. Doxorubicine et réactions d’oxydo-réduction ................................................................ 53 a. Formation de ROS par réduction à un électron de la doxorubicine .............................. 53

b. Formation d‘espèces alkylantes par réduction de la doxorubicine .............................. 54

c. Formation de complexes doxorubicine-métal ............................................................. 55

2. Le stress oxydatif, une conséquence de la réduction de la doxorubicine ......................... 58

a. Le concept de stress oxydatif ..................................................................................... 58

b. L’inhibition de la thiorédoxine réductase par la doxorubicine ..................................... 59

c. Perturbation de la chaîne mitochondriale de transport d’électrons par la doxorubicine60

d. Les conséquences du stress oxydatif sur les composés cellulaires ............................... 61

e. Importance du stress oxydatif dans la cytotoxicité tumorale de la doxorubicine ......... 64

3. La formation d’adduits, conséquence de la réactivité de la doxorubicine ....................... 65

a. Adduit à l’ADN par chélation directe de la doxorubicine ............................................. 66

b. Adduits à l’ADN par formation d’agents alkylants ...................................................... 68

C. Effets de la doxorubicine sur les membranes plasmiques ....................................... 71

1. Rappel sur la structure des membranes plasmiques ....................................................... 71

2. Effets de la doxorubicine sur les membranes plasmiques ............................................... 72 a. Perturbation de la fluidité et de la perméabilité membranaires par la doxorubicine .... 72

b. Modifications de la voie de signalisation des céramides ............................................. 73

D. Les différents mécanismes de mort cellulaire doxorubicine-induits ........................ 75

1. L’apoptose cellulaire ..................................................................................................... 75

11

2. L'autophagie cellulaire .................................................................................................. 77 a. Rôle de l’inhibition de mTOR dans la régulation de l’autophagie cellulaire .................. 77

b. Rôle de l’activation de la c-Jun N-terminal kinase (JNK) dans l’autophagie cellulaire ... 78

3. La sénescence cellulaire ................................................................................................ 79

4. La nécrose cellulaire ..................................................................................................... 80

E. Les mécanismes de résistance des cellules tumorales à la doxorubicine ................. 82

1. La résistance à la doxorubicine par augmentation de son efflux cellulaire ...................... 84

2. La résistance à la doxorubicine associée aux ADN topoisomérases de type II .................. 85 a. Résistance par altération de la concentration en ADN topoisomérase de type II .......... 86

b. Résistance altération de la sensibilité de l’ADN topoisomérase de type II à la

doxorubicine ................................................................................................................. 86

3. La résistance associée à une modulation des processus enzymatiques ........................... 87

a. Altération du métabolisme de la doxorubicine ........................................................... 87

b. Résistance par stimulation des mécanismes de détoxification cellulaire ..................... 87

4. La résistance par réparation des dommages à l’ADN ...................................................... 88

5. Résistance par inhibition de l’apoptose ......................................................................... 89

IV. LA DOXORUBICINE EN MEDECINE VETERINAIRE ............................................................. 91

A. Principales indications de la doxorubicine en médecine vétérinaire ....................... 91

B. Les principales interactions médicamenteuses avec la doxorubicine ...................... 92

C. Toxicité et effets indésirables de la doxorubicine ................................................... 93

1. Le choc histaminique .................................................................................................... 94

2. La toxicité gastro-intestinale ......................................................................................... 94

3. Toxicité hématologique ................................................................................................ 96

4. Toxicité cutanée lors d’extravasation ............................................................................ 97

5. L’alopécie cutanée ........................................................................................................ 98

6. La toxicité cardiaque ..................................................................................................... 98 a. Epidémiologie et symptomatologie de la cardiotoxicité doxorubicine-induite ............................................. 99 b. Mécanismes à l’origine de la cardiotoxicité doxorubicine-induite .............................................................. 100 c. Diagnostic de la cardiotoxicité doxorubicine-induite .................................................................................. 108 d. Traitement et prévention de la cardiotoxicité doxorubicine-induite .......................................................... 109

7. Principales contre-indications de la doxorubicine en médecine vétérinaire ................... 109

8. Mutation et toxicité ..................................................................................................... 110

12

PARTIE II : ETUDE EXPERIMENTALE DE LA PHARMACOCINETIQUE ET DE LA TOXICITE DE LA DOXORUBICINE EN MEDECINE VETERINAIRE ...................... 115

I. MISE AU POINT D’UNE METHODE ANALYTIQUE DE DOSAGE DE LA DOXORUBICINE PLASMATIQUE

PAR HPLC-FLUORESCENCE ..........................................................................................117

A. Mise au point de la méthode analytique .............................................................. 117

1. Description des conditions d’analyse par chromatographie ........................................... 117

2. Préparation des solutions ............................................................................................ 117

3. Préparation des échantillons de plasma ....................................................................... 118

4. Vérification de la méthode de dosage .......................................................................... 119

B. Discussion ............................................................................................................ 126

II. APPROCHE NON COMPARTIMENTALE DE LA PHARMACOCINETIQUE ET DE LA TOLERANCE DE LA

DOXORUBICINE CHEZ LE CHIEN......................................................................................128

A. Matériels et méthodes ......................................................................................... 128

1. Recrutement des cas .................................................................................................... 128

2. Echantillonnage ........................................................................................................... 128

3. Analyse des échantillons .............................................................................................. 129

B. Résultats ............................................................................................................. 129

1. Population d’étude et suivi clinique et biologique des animaux .................................... 129

2. Pharmacocinétique ...................................................................................................... 132

3. Discussion ................................................................................................................... 133 a. Pharmacocinétique et ses implications ..................................................................... 133

b. Limitations du protocole d’étude .............................................................................. 135

c. Perspectives de l’étude ............................................................................................. 136

CONCLUSION ............................................................................................... 141

BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................... 141

ANNEXES ..................................................................................................... 165

13

TABLE DES TABLE DES TABLE DES TABLE DES ANNEXESANNEXESANNEXESANNEXES

Annexe 1 : Classification VCOG-CTCAE (Veterinary cooperative oncology group –

common terminology criteria for adverse events) version 1.1 ............................................. 167

Annexe 2 : Accord par le Comité d’éthique en expérimentation animale de VetAgro Sup

(n°1648) .................................................................................................................................. 175

Annexe 3 : Questionnaire présenté au propriétaire permettant d’évaluer les effets

secondaires de l’administration de doxorubicine. ................................................................. 177

Annexe 4 : Numération-formule sanguine et biochimie sanguine lors de l’admission

des cas dans l’étude et au cours des suivis à une semaine et trois semaines. ...................... 179

14

15

TABLE DES FIGURESTABLE DES FIGURESTABLE DES FIGURESTABLE DES FIGURES

Figure 1 : Formule semi-développée de la doxorubicine ......................................................... 27

Figure 2 : Isolement du chlorhydrate de doxorubicine à partir de la souche Streptomyces

peucetius var. caesisus ............................................................................................................. 27 Figure 3 : Mécanismes biochimiques de formation de la ε -rhodomycinone ......................... 28 Figure 4 : Mécanismes biochimiques de formation de la (TDP)-ι-daunosamine ..................... 28 Figure 5 : Mécanismes biochimiques de formation de la doxorubicine .................................. 29 Figure 6 : Schématisation de la formation de la doxorubicine à partir de la daunorubicine .. 29 Figure 7 : Spectre d'absorption infrarouge de la doxorubicine dans une solution de bromure de potassium 0,6% .................................................................................................... 32 Figure 8 : Spectre d'absorption ultraviolet et visible de la doxorubicine dans du méthanol .. 32 Figure 9 : Spectre d’émission (en rouge) et d’excitation (en noir) de fluorescence de la doxorubicine ............................................................................................................................. 33 Figure 10 : Spectre de masse de la doxorubicine..................................................................... 33 Figure 11 : Schéma des voies métaboliques de la doxorubicine ............................................. 39 Figure 12 : Schématisation des modèles de pharmacocinétique bi-compartimental et tri-compartimental de la doxorubicine .................................................................................... 40 Figure 13 : Schéma ADME de la doxorubicine (Absorption, Distribution, Métabolisme, Elimination), détaillant les transporteurs cellulaires ............................................................... 41 Figure 14 : Modalités d’action du complexe protéasome-doxorubicine ................................. 43 Figure 15 : Caténanes au cours de la réplication (à gauche) et nœuds d’ADN (à droite)........ 44 Figure 16 : La réaction de transestérification caractérisant l’activité des topoisomérases .... 45 Figure 17 : Mécanisme de la relaxation du surenroulement par les ADN topoisomérases de type I .................................................................................................................................... 46 Figure 18 : Cycle de topo-isomérisation par une ADN topoisomérase de type II .................... 48 Figure 19 : Modèles cinétiques d’intercalation de la doxorubicine au sein de l’ADN. (A) Modèle à 3 étapes. (B) Modèle à cinq étapes.......................................................................... 51 Figure 20 : Formation de ROS par réduction à un électron de la doxorubicine ...................... 54 Figure 21 : Formation de radicaux alkylants par réduction de la doxorubicine ...................... 55 Figure 22 : Formation de ROS par formation du complexe doxorubicine-fer(III) .................... 56 Figure 23 : Libération de fer à partir de l’aconitase cytoplasmique et formation de ROS ...... 57 Figure 24 : Régulation de l’homéostasie ferrique et implication du doxorubicinol ................ 58 Figure 25 : Les systèmes antioxydants enzymatiques ............................................................. 59 Figure 26 : Mécanisme de peroxydation des lipides ................................................................ 62 Figure 27 : Oxydation des protéines porteuses d’un groupement thiol .................................. 64 Figure 28 : Structure du complexe doxorubicine-ADN par liaison covalente (en rouge) ........ 66 Figure 29 : Formation du composé intermédiaire DOXform, hydrolyse en un métabolite actif, et mécanismes de formation d’adduits doxorubicine-ADN .................................................... 67 Figure 30 : Adduits à l’ADN formé par alkylation monofonctionnelle à partir du radical méthide quinone ...................................................................................................................... 68 Figure 31 : Rôle de la réactivité chimique de la doxorubicine à l’origine de sa cytotoxicité cellulaire ................................................................................................................................... 69 Figure 32 : Organisation de la membrane plasmatique et notion de radeaux lipidiques ....... 71 Figure 33 : Métabolisme des céramides et effets de la doxorubicine ..................................... 74 Figure 34 : Rôle de la doxorubicine dans l’activation des voies extrinsèque et intrinsèque de l’apoptose cellulaire ............................................................................................................ 76 Figure 35 : Rôle de la doxorubicine dans l’induction de l’autophagie cellulaire ..................... 78

16

Figure 36 : Rôle de la doxorubicine dans l’induction de la sénescence prématurée .............. 80 Figure 37 : Rôle de la doxorubicine dans la nécrose cellulaire ................................................ 81 Figure 38 : Les différents mécanismes de réparation de l’ADN selon le mécanisme de cytotoxicité doxorubicine-induit .............................................................................................. 88 Figure 39 : Les différents mécanismes de résistance à la doxorubicine .................................. 90 Figure 40 : Nécrose cutanée due à l’extravasation de doxorubicine chez une chienne de 12 ans, deux semaines après l’injection de doxorubicine ....................................................... 97 Figure 41 : Signalisation β-adrénergique cardiaque et doxorubicine .................................... 105 Figure 42: Principaux mécanismes de cardiotoxicité de la doxorubicine .............................. 113 Figure 43 : (A) Chromatogramme de plasma blanc. (B) Chromatogramme de plasma supplémenté en doxorubicine (DOX) et daunorubicine (DNR) à 0,1 µg/mL. ...................... 119 Figure 44 : Courbes d’étalonnage moyenne évaluant la linéarité de la méthode analytique ............................................................................................................................... 121 Figure 45 : Chromatogramme de plasma supplémenté en doxorubicinol, doxorubicine et daunorubicine à 1 µg/mL. .................................................................................................. 125 Figure 46 : Evolution du comptage des polynucléaires neutrophiles au cours des suivis chez quatre chiens ................................................................................................................. 130 Figure 47 : Courbes de pharmacocinétique ........................................................................... 133

17

TABLE DES TABLEAUXTABLE DES TABLEAUXTABLE DES TABLEAUXTABLE DES TABLEAUX

Tableau I : Principales propriétés physico-chimiques de la doxorubicine ............................... 30

Tableau II : Principales bande d'absorption infrarouge de la doxorubicine dans une

solution de KBr 0,6% ................................................................................................................ 32

Tableau III : Principales indications de la chimiothérapie à base de doxorubicine ................. 91

Tableau IV : Principales interactions médicamenteuses de la doxorubicine ........................... 93

Tableau V : Effets indésirables de la doxorubicine à court-terme ........................................... 93

Tableau VI : Fréquence de l’allèle mdr1 mutée et des génotypes ........................................ 110

Tableau VII : Gradient d’élution utilisée lors de la chromatographie par HPLC .................... 117

Tableau VIII : Méthode de préparation de la série d’étalonnage .......................................... 118

Tableau IX : Validation des critères de linéarité de la méthode analytique .......................... 121

Tableau X : Résultats de l’étude de précision et d’exactitude de la méthode analytique .... 123

Tableau XI : Résultats de l’étude de rendement d’extraction de la méthode analytique ..... 124

Tableau XII : Résultats de l’étude de stabilité de la doxorubicine dans du plasma ............... 125

Tableau XIII : Méthodes d’analyses par HPLC de détermination de la concentration en

doxorubicine dans des liquides biologiques et des tissus. ..................................................... 126

Tableau XIV : Description des cas inclus dans notre étude .................................................... 131

Tableau XV : Effets secondaires observés suite à la séance de chimiothérapie et

thérapeutiques mises en place .............................................................................................. 132

Tableau XVI : Paramètres pharmacocinétiques calculés pour chaque individu de l’étude ... 132

Tableau XVII : Comparatif des paramètres pharmacocinétiques des différentes études

portant sur des animaux non sains ........................................................................................ 134

18

19

LISTE DES ABRÉVIATIONSLISTE DES ABRÉVIATIONSLISTE DES ABRÉVIATIONSLISTE DES ABRÉVIATIONS

°C : Degrés Celsius

ADN : Acide désoxyribonucléique

ARN : Acide ribonucléique

ATP : Adénosine-Triphosphate

AUC : Aire sous la courbe (Area under the curve)

BCRP : Breast cancer resistance protein

CV : Coefficient de variation

DNR : Daunorubicine

DOX : Doxorubicine

DOXol : Doxorubicinol

EMA : Agence européenne du médicament (European Medecine Agency)

IV : Intra-veineuse

IL-2 : Interleukine-2

IRE : Iron responsive elements

Kapp : Coefficient d’affinité

MDR : Multidrug resistance

MRP : Multidrug resistance related-protein

NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

P-gp : Glycoprotéine-P

PO : Per os ou voie orale

ROS : Dérivés réactifs de l’oxygène (Reactive oxygen species)

SD : Ecart-type

TfR : Récepteur à la transferrine

Trr : Thiorédoxine réductase

VCOG-CTCAE : Veterinary cooperative oncology group – common terminology criteria for

adverse events

20

21

INTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTION

La doxorubicine est un antibiotique anticancéreux apparu dans les années 1960 et qui

s’est illustré comme outil thérapeutique essentiel dans le traitement de nombreuses

tumeurs chez l’Homme, notamment dans le cadre de la thérapeutique des carcinomes

mammaires, ovariens ou vésicaux, des ostéosarcomes et des sarcomes des tissus mous, des

lymphomes hodgkiniens ou non, des tumeurs solides chez l’enfant, des cancers du poumon

et des leucémies aiguës et chroniques.

Son utilisation en médecine vétérinaire est actée depuis de nombreuses années pour le

traitement des lymphomes et de diverses tumeurs solides, mais malgré cela, il n’existe que

peu d’études sur sa pharmacocinétique et sa pharmacodynamie chez le chien sain comme

chez le chien non sain et la posologie proposée (en mg/kg ou mg/m² selon la taille du chien)

ne repose que sur des données anciennes et non validées. Les protocoles analytiques utilisés

lors de ces études sont basés sur des protocoles développés chez l’Homme ou dans l’espèce

murine. Une méthode de dosage de la doxorubicine validée chez le chien serait donc

intéressante à mettre en place, afin d’être appliquée à des études de pharmacocinétique de

la doxorubicine dans cette espèce.

De plus, il existe de nombreuses études sur l’efficacité ainsi que sur la toxicité à plus ou

moins long terme de la doxorubicine chez le chien, sans qu’aucun lien ne soit fait avec le

schéma posologique proposé ni la pharmacocinétique au sein de cette espèce. L’approche

de la relation pharmacocinétique/pharmacodynamie et pharmacocinétique/toxicité pourrait

permettre la mise en place d’une thérapeutique personnalisée et non pas d’une

thérapeutique de groupe.

Dans une première partie, nous ferons un état des lieux des connaissances sur la

doxorubicine, en nous attachant à présenter particulièrement sa pharmacocinétique, ses

mécanismes d’action et son utilisation thérapeutique en médecine vétérinaire. La mise en

place de notre protocole expérimental et son application à une étude de pharmacocinétique

seront développées dans une seconde partie, pour aboutir sur les différentes perspectives

que notre étude permet d’envisager.

22

23

Partie IPartie IPartie IPartie I : Etude bibliographique de la : Etude bibliographique de la : Etude bibliographique de la : Etude bibliographique de la

doxorubicine en médecine vétérinairedoxorubicine en médecine vétérinairedoxorubicine en médecine vétérinairedoxorubicine en médecine vétérinaire

24

25

I. La doxorubicine, pharmacie chimiqueI. La doxorubicine, pharmacie chimiqueI. La doxorubicine, pharmacie chimiqueI. La doxorubicine, pharmacie chimique

La doxorubicine, ou adriamycine, fait partie de la famille des anthracyclines, médicaments

anti-cancéreux d’origine naturelle et possédant des propriétés antibactériennes. Les

anthracyclines ont été isolées à partir de bactéries Gram positive du genre Streptomyces sp

(Lown, 1993).

A. Historique, formule chimique et synthèseA. Historique, formule chimique et synthèseA. Historique, formule chimique et synthèseA. Historique, formule chimique et synthèse

1. Historique1. Historique1. Historique1. Historique

Le premier antibiotique à activité antitumorale, l’actinomycine A, produite par Actinomyces

antibioticus, fut découvert par Waksman et Woodruff en 1940. Suite à cette découverte, une

entreprise de recherche italienne, Farmitalia Research Laboratories, commence à investir

dans la recherche de composés anti-cancéreux issus de bactéries à partir du début des

années 50. La première anthracycline, la β-rhodomycine II ou rhodomycine A, est isolée en

1950 par Brockmann et Bauer à partir d’une souche de l’espèce Streptomyces purpurascens

(Morrison, 2010). Par la suite, à la fin des années 50, un pigment glycosidique rouge, la

rhodomycine B, est isolé à partir de Streptomyces sp au niveau d’un échantillon de sol indien

par Frederico Arcamone. Malgré l’activité antibactérienne importante de cette molécule, sa

forte toxicité, notamment une paralysie de la motilité intestinale découverte lors d’études

sur des souris, empêche son utilisation en tant qu’agent antitumoral. Cette première

découverte entraîne des études poussées sur les pigments glycosidiques issus de la bactérie

du genre Streptomyces sp (Lown, 1993).

En 1963, une équipe de recherche italienne du laboratoire Farmitalia découvre une nouvelle

molécule issue d’une souche de Streptomyces peucetius qu’elle nomme daunomycine, du

nom des Dauni, une tribu préromaine qui occupait la région où cette souche a été mise en

évidence. A la même période, une équipe française du laboratoire Rhône-Poulenc découvre

une molécule issue d’une souche de Streptomyces caeruleorubidus qu’elle nomme

rubidomycine, en référence à la couleur du composé. Ces deux molécules se révèleront être

une seule et unique molécule, alors renommée daunorubicine en 1968 (Morrison, 2010). Des

essais cliniques sur des souris ont lieu dans le cadre d’un traitement de carcinomes d’Ehrlich

et de sarcomes 180 et montrent une inhibition de la croissance tumorale et une

augmentation de la durée de survie des animaux. Les premiers essais thérapeutiques en

médecine humaine se déroulent en 1964 et montrent une efficacité en tant que traitement

anti-cancéreux, notamment contre les leucémies aigues. Malgré cela, des effets indésirables

majeurs tels qu’une aplasie médullaire sévère, une immunosuppression et une cardiotoxicité

à dose cumulative, empêchent son utilisation en tant que traitement anti-cancéreux en

phase d’entretien. Après comparaison des propriétés physicochimiques et biologiques de la

rhodomycine B et de la daunorubicine, il semblerait qu’une faible modification de la

structure des anthracyclines soit à l’origine d’une amélioration remarquable des propriétés

pharmacologiques. Ces découvertes orientent alors la recherche vers de nouveaux

analogues biosynthétiques, dérivés de Streptomyces peucetius (Di Marco et al., 1981).

26

En 1967, la doxorubicine (ou adriamycine), un analogue 14-hydroxy de la daunorubicine, est isolée à partir de la culture d’une des variétés dérivées de la souche originale de Streptomyces peucetius ATCC29050, obtenue par mutation après utilisation du N-nitroso-N-méthyl uréthane. La nouvelle souche est nommée Streptomyces peucetius var. caesius

ATCC27952. Le professeur A.DiMarco est le premier à mettre en évidence les propriétés anti-cancéreuses de la doxorubicine sur différentes tumeurs expérimentales chez la souris et le rat, qu’il présente lors du symposium sur l’adriamycine à Milan en 1971 (Carter et al., 1972). La doxorubicine est à l’origine d’une inhibition de la croissance tumorale et d’une augmentation de la durée de survie avec une meilleure activité antitumorale que la daunorubicine contre les tumeurs murines, notamment les tumeurs solides, et un index thérapeutique plus élevé (1,21 contre 0,67 pour la daunorubicine). Cependant, de nombreux effets indésirables dont la toxicité cardiaque dose-cumulative sont toujours présents (Arcamone et al., 1969).

La première utilisation de la doxorubicine chez le chien remonte à 1976 lors d’une étude sur

les effets systémiques, mettant en évidence les effets indésirables de celle-ci sur l’organisme

(Smith, Kirk, 1976).

Depuis les années 70, plus de 2000 analogues de la famille des anthracyclines ont été

développés au cours d’études in vitro et in vivo. Parmi les analogues testés dans des études

pré-cliniques, beaucoup se sont avérés décevants en phase I et II d’essais cliniques avec une

toxicité élevée et une activité antitumorale inférieure ou égale à celle de la doxorubicine

(Muggia, Green, 1991). Parmi ceux ayant montré un intérêt médical dans le domaine

vétérinaire, on peut citer :

� L’épirubicine, un dérivé semi-synthétique de la doxorubicine avec un index

thérapeutique plus élevé, une dose-cumulative plus importante permise par une

clairance plus rapide et un temps de demi-vie plus court et ce, pour une activité

antitumorale identique et une cardiotoxicité moindre. Son spectre d’activité et

similaire à celui de la doxorubicine. Cependant, peu d’études sont disponibles

chez le chien et l’épirubicine semble présenter une toxicité gastro-intestinale plus

importante.

� L’idarubicine, un analogue de la daunorubicine avec une efficacité thérapeutique

supérieure ou égale à celle-ci mais avec une cardiotoxicité encore mal

caractérisée. De plus, l’idarubicine présente une meilleure biodisponibilité

gastrique, permettant son usage per os. Elle présente cependant un spectre

d’activité plus réduit, limité au lymphome, et peu d’études sont disponibles sur

son intérêt dans le domaine vétérinaire.

2. Structure chimique de la doxorubicine2. Structure chimique de la doxorubicine2. Structure chimique de la doxorubicine2. Structure chimique de la doxorubicine La doxorubicine ou (8S,10S)-10-{[(2R,4S,5S,6S)-4-Amino-5-hydroxy-6-methyltetrahydro-2H-

pyran-2-yl]oxy}-8-glycoloyl-6,8,11-trihydroxy-1-methoxy-7,8,9,10-tetrahydro-5,12 tetracène-

dione (C27H29O11N), est un membre de la famille des anthracyclines.

27

Figure 1 : Formule semi-développée de la doxorubicine

Elle possède une structure poly-aromatique plane (Figure 1). Elle est composée d’une

fraction sucre, la daunosamine ou 3-amino-2.3.6-trideoxy-L-fucosyl, liée par une liaison

glycosique à une fraction chromophore aglycone, l’adriamycinone (ou 14-

hydroxydaunomycine), tétracycle avec des groupements adjacents quinone-hydroquinone,

un substituant méthoxy et une chaîne courte avec un groupement carbonyl se terminant par

un alcool primaire (Bakker et al., 1995).

3. Synthèse de la doxorubicine3. Synthèse de la doxorubicine3. Synthèse de la doxorubicine3. Synthèse de la doxorubicine

On distingue 2 méthodes empiriques de synthèse de la doxorubicine :

� La synthèse microbiologique

A partir de la fermentation de Streptomyces peucetius var. caesius ATCC2795, seule souche

capable de produire de la doxorubicine, suivi de son extraction et sa purification par

chromatographie à partition (Figure 2)(Malla et al., 2010).

Figure 2 : Isolement du chlorhydrate de doxorubicine à partir de la souche Streptomyces

peucetius var. caesisus Traduit et adapté de l’anglais d’après Arcamone et al. (1981).

28

D’un point de vue biochimique, on distingue 3 étapes à la formation de la doxorubicine au

sein de la souche Streptomyces peucetius var. caesius, toutes dépendantes de gènes

spécifiques (Arcamone et al., 1969).

1/ Formation de la ε-rhodomycinone (partie aglycone) à partir d’un propionyl-coenzyme A et

de 9 précurseurs malonyl-coenzyme A (Figure 3).

Figure 3 : Mécanismes biochimiques de formation de la ε -rhodomycinone

Traduit et adapté de l’anglais d’après Malla et al. (2009) AAME : acide aclanonique méthyl ester ; dnrC : acide-O-méthyltransférase ; dnrD : AAME cyclase ;

dnrE : aclavicétone réductase ; dnrF : aclavinone-11-hydroxylase ; dnrG : C-12 oxygénase ; dpsA : transférase ;

dpsB and dpsC : cétosynthases ; dpsD : acyltransférase ; dpsE : 9-cétoréductase ; dpsF : aromatase ; dpsG :

protéine porteuse d’acyl ; dpsY : cyclase ; SAM : S-adénosyl méthionine.

2/ Formation de la thymidine diphosphate (TDP)-ι-daunosamine (partie glycosamine) à partir

du glucose-1-phosphate (Figure 4).

Figure 4 : Mécanismes biochimiques de formation de la (TDP)-ι-daunosamine

Traduit et adapté de l’anglais d’après Malla et al. (2009). dnmJ : 3-aminotransférase ; dnmL : glucose-1-phosphate thymidylyltransférase ; dnmM : TDP-D-glucose 4,6-

déshydratase ; dnmT : 2,3-déshydratase ; dnmU : 3,5-épimérase ; dnmV : 4-cétoréductase.

29

3/ Glycosylation et modifications par méthylation, décarboxylation et hydroxylation de la

partie aglycone, aboutissant à la formation de doxorubicine (Figure 5).

Figure 5 : Mécanismes biochimiques de formation de la doxorubicine

Traduit et adapté de l’anglais d’après Malla et al. (2009). dnrK : S-adénosyl-L-méthionine-dépendante 4-O-méthyltransférase ; dnrP : rhodomycine D méthylestérase ;

dnrQ et dnrS : glycosyltransférases ; doxA : cytochrome P450 hydroxylase.

� La synthèse chimique

La doxorubicine est formée par semi-synthèse à partir de la daunorubicine, obtenue par

fermentation de différentes souches de Streptomyces sp. Une première réaction entre le

chlorhydrate de daunorubicine dans un solvant équimolaire méthanol/dioxane et une

solution chloroformique de dibrome est à l’origine de la formation du 14-bromo-

daunorubicine. S’en suit une hydrolyse par une solution aqueuse de formiate de sodium. Le

mélange est acidifié jusqu’à pH 3 avec extraction par du dichlorométhane. La phase aqueuse

est amenée à un pH 8,6 et extraite avec du dichlorométhane. La phase organique est alors

récupérée et séchée avec du sulfate de sodium anhydre puis traitée avec de l’acide

chlorhydrique et enfin diluée dans de l’éther. Le précipité formé correspond alors au

chlorhydrate de doxorubicine, purifié par cristallisation dans un mélange équimolaire de

méthanol et de 1-propanol. Cette méthode de synthèse présente un rendement de 36%

(Horton et al., 1988).

Figure 6 : Schématisation de la formation de la doxorubicine à partir de la daunorubicine

Traduit et adapté de l’anglais, d’après Horton et al. (1988).

30

Depuis, avec le développement de la génomique, de nouvelles méthodes de synthèse ont

été proposées, notamment à partir d’un transfert du gène doxA. Le gène doxA est cloné sur

un plasmide qui est ensuite introduit au sein du micro-organisme hôte. Ce gène permet

l’acquisition de la capacité de convertir la daunorubicine en doxorubicine. En effet, le gène

doxA code une enzyme cytochrome P450 hydroxylase qui catalyse l’hydroxylation de la

daunorubicine au niveau du carbone 14. On réalise ensuite l’extraction de la doxorubicine

des cultures de micro-organismes hôtes. Cette méthode de synthèse présente un rendement

d’environ 80%, selon les souches hôtes utilisées (Dickens, Strohl, 1996).

B. Principales propriétés physicoB. Principales propriétés physicoB. Principales propriétés physicoB. Principales propriétés physico----chimiques et stabilité de la doxorubicinechimiques et stabilité de la doxorubicinechimiques et stabilité de la doxorubicinechimiques et stabilité de la doxorubicine

1. Principales caractéristiques physico1. Principales caractéristiques physico1. Principales caractéristiques physico1. Principales caractéristiques physico----chimchimchimchimiques de la doxorubicineiques de la doxorubicineiques de la doxorubicineiques de la doxorubicine

Les principales caractéristiques physico-chimiques sont décrites dans le Tableau I.

Tableau I : Principales propriétés physico-chimiques de la doxorubicine

Caractéristiques

Aspect macroscopique Poudre cristallisée rouge

Poids moléculaire 543,52 Dalton

Constantes d’acidité logarithmiques pKa 1 (amine) = 8,15 pKa 2 (phénol en C11) = 10,16 pKa 3 (phénol en C6) = 13,2

Solubilité 10mg/mL dans l’eau 10 mg/mL dans DMSO Soluble dans les solutions alcooliques Modérément soluble dans le méthanol Non soluble dans solvants organiques non polaires

Température de fusion 230°C

Pression de vaporisation 8,99.10-25 mmHg

Pouvoir rotatoire spécifique + 248° à 20°C (0,1% dans le méthanol)

Coefficient de partage octanol/eau Log Ko/w = 1,27

Surface polaire topologique (TPSA) 206,07 Å²

Avec une température de fusion de 230°C, la doxorubicine se présente sous forme de

poudre cristallisée rouge à l’état pur. Celle-ci est soluble dans l’eau (10 mg/mL) et la plupart

des solutions alcooliques, modérément soluble dans le méthanol et non soluble dans les

solutions organiques polaires.

Cette base faible, de 543,52 Daltons, possède trois pKa, pKa1 (amine) = 8,15, pKa2 (phénol

en C11) = 10,16 et pKa3 (phénol en C6) = 13,2 et est donc chargée positivement à pH sanguin

(Bouma et al., 1986). Etant donné les différentes constantes d’acidité, la doxorubicine est

instable en milieu acide, expliquant son absence d’administration par voie orale. De plus, elle

présente des propriétés caustiques, contre-indiquant son administration par voie intra-

musculaire ou sous-cutanée (Gallois et al., 1996).

31

Etant donné son coefficient de partage octanol/eau légèrement supérieur à un, la

doxorubicine présente un caractère peu lipophile, à l’origine d’une faible absorption par voie

orale et de l’absence de passage de la barrière hémato-méningée. De plus, sa surface polaire

topologique supérieure à 140 Å² montre sa capacité naturelle faible à traverser les

membranes (Fernandes, Gattass, 2009).

2. Stabilité de la doxorubicine en solution2. Stabilité de la doxorubicine en solution2. Stabilité de la doxorubicine en solution2. Stabilité de la doxorubicine en solution

En ce qui concerne la stabilité de la doxorubicine, plusieurs caractéristiques sont à prendre en compte :

� La doxorubicine est une molécule photo-labile. Sa photo-dégradation est

supérieure à 20% après exposition à une source lumineuse pendant 3 jours pour

des concentrations inférieures à 100 µg/mL (Tavoloni et al., 1980). Sa dégradation

à la lumière est inversement proportionnelle à la concentration de la solution et

est accélérée lors d’une augmentation du pH. Cependant, les concentrations

utilisées en chimiothérapie étant élevées (au minimum 500 µg/mL), il n’y pas de

précautions particulières à prendre (Wood et al., 1990).

� La doxorubicine est également une molécule thermosensible. En solution saline à

pH 6,1, celle-ci se dégrade de 10% en quatorze jours à 37°C (Bosanquet, 1986).

Cependant, en solution à 2 mg/mL, aucune dégradation significative n’est

observée à 4°C pendant six mois ou à -20°C pendant un mois. Elle peut également

subir jusqu’à 7 cycles de congélation/décongélation à -20°C sans dégradation

significative, à condition que la décongélation soit réalisée à température

ambiante (Hoffman et al., 1979).

� Pour la stabilité pH-dépendante, la doxorubicine est considérée comme stable

dans des solutions entre pH 3 et 6,5, avec une dégradation proportionnelle à

l’augmentation du pH. La stabilité maximale en solution est observée pour un pH

égal à 4, avec absence de dégradation de la doxorubicine après 60 jours. Lors du

passage à une solution basique et donc à une stabilité moindre, on observe un

changement de couleur, du rouge-orangé pour le bleu-violet (Janssen et al.,

1985).

C. Principales méthodes d’analyse de la doxorubicine C. Principales méthodes d’analyse de la doxorubicine C. Principales méthodes d’analyse de la doxorubicine C. Principales méthodes d’analyse de la doxorubicine

1. La spectrophotométrie infrarouge1. La spectrophotométrie infrarouge1. La spectrophotométrie infrarouge1. La spectrophotométrie infrarouge

Cette méthode est basée sur la différence d’excitation des molécules sous la lumière

infrarouge, permettant de mettre en évidence les différentes liaisons chimiques présentes

dans la molécule. Les principales bandes d’absorption infrarouge de la doxorubicine sont

décrites ci-dessous (Figure 7 et Tableau II)(Bouma et al., 1986).

32

Figure 7 : Spectre d'absorption infrarouge de la doxorubicine dans une solution de bromure

de potassium 0,6%

Tableau II : Principales bande d'absorption infrarouge de la doxorubicine dans une solution de KBr 0,6%

Traduit et adapté de l’anglais d’après Bouma et al. (1986). Fréquences des bandes d’absorption infrarouge (en

cm-1) Interprétation

1008 Liaison alcool primaire C-OH 1071 Liaison alcool secondaire C-OH 1115 Liaison alcool tertiaire C-OH 1282 Liaison éther C-O-C

1580 et 1613 Liaison quinone C = O 1724 Liaison cétone C = O

2300 à 3160 Liaison amine primaire N-H 3160 à 3560 Liaison O-H (alcool lié)

2. La spectrophotométrie ultraviolet et visible2. La spectrophotométrie ultraviolet et visible2. La spectrophotométrie ultraviolet et visible2. La spectrophotométrie ultraviolet et visible

Cette méthode est basée sur la capacité d’une molécule à subir une ou plusieurs transitions

électroniques suite à un rayonnement électromagnétique dont le spectre d’ondes recouvre

les domaines de l’ultraviolet (100 à 400 nm) et du visible (400 à 750 nm).

Les principaux pics d’absorption de la doxorubicine en solution dans du méthanol sont 233,

252, 288, 479, 496 et 529 nm (Figure 8)(Abraham et al., 2005).

Figure 8 : Spectre d'absorption ultraviolet et visible de la doxorubicine dans du méthanol

D’après Abraham et al. (2005).

33

3. 3. 3. 3. La spectrofluorimétrieLa spectrofluorimétrieLa spectrofluorimétrieLa spectrofluorimétrie

Cette méthode est basée sur l’excitation des électrons des atomes de certains composés par

une source d’excitation lumineuse. Ces électrons vont alors émettre une lumière de plus

basse énergie, captée par un détecteur.

L’analyse par spectrofluorimétrie de la doxorubicine est permise par la structure

polycyclique aromatique avec un groupe chromophore, porteur de la propriété de

fluorescence de la doxorubicine. La doxorubicine présente un maximum d’excitation et

d’émission pour des longueurs d’onde respectives de 470 nm et 580 nm (Figure 9)(Han et al.,

2016).

Figure 9 : Spectre d’émission (en rouge) et d’excitation (en noir) de fluorescence de la

doxorubicine D’après Han et al. (2016)

4. La spectrométrie4. La spectrométrie4. La spectrométrie4. La spectrométrie de massede massede massede masse

Cette méthode est fondée sur la séparation en phase gazeuse de molécules chargées en

fonction de leur rapport masse/charge masse. Elle permet d’identifier une molécule

d’intérêt par mesure de sa masse et de caractériser sa structure chimique.

Le spectre de masse de la doxorubicine présente des fragments caractéristiques avec un

rapport masse/charge (m/z) de 544,18 pour le fragment majeur et 397,08 pour le fragment

mineur (Figure 10)(Katzenmeyer et al., 2010).

Figure 10 : Spectre de masse de la doxorubicine

D’après Katzenmeyer et al. (2010).

34

II. Pharmacocinétique de la doxorubicineII. Pharmacocinétique de la doxorubicineII. Pharmacocinétique de la doxorubicineII. Pharmacocinétique de la doxorubicine

La pharmacocinétique permet d’étudier le comportement de la molécule d’intérêt et son

devenir dans l’organisme, afin de déterminer son schéma posologique optimal et

éventuellement la fenêtre thérapeutique. Pour cela, on étudie quatre paramètres :

l’absorption, la distribution dans l’organisme, le métabolisme et l’élimination.

Dans le cas de la doxorubicine chez le chien, il existe peu d’études de pharmacocinétique.

A. Voie d’administration et absorption A. Voie d’administration et absorption A. Voie d’administration et absorption A. Voie d’administration et absorption

La structure de la doxorubicine, une base faible, ionisée à pH acide et neutre, lui confère une

liposolubilité très limitée. De plus, du fait de son instabilité en milieu acide, la

biodisponibilité de la doxorubicine par voie orale est inférieure à 5 % (Kim et al., 2013). La

doxorubicine n’est donc pas utilisée per os chez le chien. La doxorubicine présente

également des propriétés caustiques, interdisant son administration par voie sous-cutanée

ou intra-musculaire. L’administration de la doxorubicine se réalise donc par voie

intraveineuse stricte, l’injection péri-veineuse étant à l’origine d’une nécrose tissulaire

importante (Venable et al., 2012).

B. DistributionB. DistributionB. DistributionB. Distribution

La phase de distribution correspond à la répartition plasmatique et à l’incorporation

tissulaire et cellulaire de la doxorubicine.

Dans le sang, 50 à 85% de la doxorubicine est lié aux protéines plasmatiques,

particulièrement à l’albumine et à l’α1-glycoprotéine (Speth et al., 1988). De nombreuses

études montrent qu’après administration de la doxorubicine, celle-ci est rapidement et

largement distribuée à la plupart des tissus de l’organisme, hormis le cerveau.

La doxorubicine a, chez le chien, un volume de distribution variant de 17,8 à 76 L/kg selon

les études et la concentration utilisée, et un temps de demi-vie de distribution de l’ordre de

quelques minutes, correspondant à un profil de distribution intracellulaire très rapide de la

molécule, malgré ce que laissent supposer ses caractéristiques physico-chimiques

(Oosterbaan et al., 1984)(Gustafson, Thamm, 2010). Cela peut être expliqué par la méthode

de calcul du coefficient de partage octanol-eau.

La répartition de la doxorubicine au sein des tissus semble être en corrélation avec la

concentration en ADN des tissus (Terasaki et al., 1984) et avec la concentration en lipides

anioniques, et plus particulièrement en cardiolipides (Nicolay et al., 1984). Cela est expliqué

par la forte affinité de la doxorubicine pour le cardiolipide (Kapp = 1,6.106) et l’ADN (Kapp =

2,2.106). Le cardiolipide est un glycérophospholipide double représentant environ 20 % des

molécules constituant la membrane interne de la mitochondrie et qui est impliqué dans le

métabolisme énergétique de la mitochondrie (Schlame et al., 1993).

35

L’entrée de la doxorubicine dans les cellules résulte de la diffusion passive de celle-ci sous

forme non ionisée, sous contrôle du pH et du gradient de concentration en doxorubicine. Le

pH intracellulaire étant légèrement plus faible que le pH sanguin et extracellulaire, et la

doxorubicine étant une base faible, celle-ci est plus ionisée en intracellulaire, ce qui est à

l’origine d’une diffusion passive vers le milieu intracellulaire et d’un piégeage ionique

intracellulaire. De plus, la doxorubicine diffuse selon un gradient de concentration. En effet,

même si la doxorubicine s’accumule fortement en milieu intracellulaire, elle se lie à l’ADN et

aux membranes plasmiques. Elle est donc très peu présente sous forme libre au niveau

cytoplasmique, ce qui permet le maintien d’un gradient entre l’extérieur et l’intérieur de la

cellule (Gallois et al., 1996). L’entrée de la doxorubicine au sein de la cellule peut être

influencée par le potentiel de membrane, le gradient de pH, la composition de la membrane

lipidique et la fluidité membranaire (Frézard, Garnier-Suillerot, 1998).

Plus précisément, la doxorubicine traverserait la membrane cellulaire par un mouvement de

« flip-flop » passif. Il y aurait une liaison massive et rapide de la doxorubicine à la membrane

cellulaire par des interactions électrostatiques avec la partie « tête » hydrophile des

phospholipides. Cette liaison serait suivie d’un long temps de résidence à la surface

membranaire suivi d’un mouvement de « flip-flop » à travers la membrane et d’un équilibre

rapide avec le milieu intracellulaire (Regev, Eytan, 1997).

Un flux de la doxorubicine par un transport facilité a également été mis en évidence chez

l’homme au niveau de certaines lignées cellulaires tumorales et de la moelle osseuse. Ce

transport serait permis par le solute carrier family 22 member 16 ou SLC22A16, transporteur

de la carnitine, de la bétaïne mais aussi de certaines molécules organiques telles que la

bléomycine ou la doxorubicine (Okabe et al., 2005). Ce transporteur est également présent

dans certaines lignées cellulaires tumorales canines et au niveau de la moelle osseuse mais

aucune étude n’a montré son implication dans le flux cellulaire de la doxorubicine.

Après entrée dans la cellule, la doxorubicine est prise en charge par le complexe protéasome

et s’accumule dans le noyau cellulaire (cf partie III.A.1) (Kiyomiya et al., 2001). Finalement, la

concentration nucléaire en doxorubicine est environ cinquante fois plus importante que la

concentration cytoplasmique. La doxorubicine cytoplasmique est distribuée équitablement

entre les organites dont les membranes sont constituées de lipides anioniques : les

mitochondries, l’appareil de Golgi et les lysosomes (Tacar et al., 2013).

C. MétabolismeC. MétabolismeC. MétabolismeC. Métabolisme

La doxorubicine présente un métabolisme principalement hépatique, avec des réactions de

phase I et de phase II, et constitué de trois voies métaboliques, à l’origine de la production

de divers métabolites (Figure 11)(Thorn et al., 2011).

36

1. Le doxorubicinol1. Le doxorubicinol1. Le doxorubicinol1. Le doxorubicinol

La doxorubicine subit une réduction à deux électrons, stéréospécifique, de la fonction

cétone de la chaîne latérale, à l’origine de la synthèse de son principal métabolite, le

doxorubicinol. Cette réaction est catalysée par la NADPH-dépendante carbonyle réductase

et dans une moindre mesure par des aldo-céto réductases (Sturgill et al., 2000). Cette voie

métabolique correspond à la voie principale de métabolisation de la doxorubicine.

Le doxorubicinol est un métabolite hydrophile, se liant également aux protéines

plasmatiques et avec une clairance plasmatique (19,6 mL/min/kg) et un volume de

distribution (0,464 L/kg) moindres par rapport à la doxorubicine (Gilbert et al., 2006). Il

présente une activité antitumorale environ dix fois moindre par rapport au composé parent,

avec une action d’agent alkylant de l’ADN. C’est un des acteurs de la cardiotoxicité et de la

myélotoxicité de la doxorubicine, celui-ci pouvant lui aussi former un radical semi-quinone

(Schaupp et al., 2015).

2. Le dérivé semi2. Le dérivé semi2. Le dérivé semi2. Le dérivé semi----quinonequinonequinonequinone

La doxorubicine peut également subir une réduction à un électron, pour former un radical

doxorubicine semi-quinone. Cette réaction est catalysée par différentes enzymes

oxydoréductases, selon le compartiment concerné. Ces enzymes incluent les NADH-

déshydrogénases mitochondriales, cytoplasmique ou sarcoplasmique, la xanthine oxydase

ou l’oxyde nitrique synthase (Bates, Winterbourn, 1982).

En milieu aérobie, la ré-oxydation du radical semi-quinone en doxorubicine est à l’origine de

la production de dérivés réactifs de l’oxygène, plus communément appelés reactive oxygene

species (ROS). Ces ROS jouent un rôle dans la cytotoxicité tumorale de la doxorubicine, mais

également dans sa toxicité (Riddick et al., 2005). En milieu anaérobie, le radical semi-

quinone présente une stabilité plus importante, permettant son auto-oxydation en un

radical semi-quinone centré en C7 (Airley, 2009).

3. Les dérivés aglycones3. Les dérivés aglycones3. Les dérivés aglycones3. Les dérivés aglycones

Une dernière voie, minoritaire, a été décrite, basée sur la déglycosidation de la doxorubicine, ou de son principal métabolite, le doxorubicinol. Elle ne représente que 1 à 2% du métabolisme de la doxorubicine (Thorn et al., 2011). Deux formes de dérivés aglycones sont décrites. L’une, issue de la déglycosidation par

hydrolyse catalysée par la glycoside hydrolase, est à l’origine de composés 7-hydroxy-

aglycones. L’autre est issue de la déglycosidation réductrice par la NADPH-cytochrome c

réductase, menant à la formation de composés 7-déoxy-aglycones. Le dérivé aglycone 7-

déoxydoxorubicinol peut également subir une déméthylation par un cytochrome P450. Ces

dérivés aglycones ne sont pas décelables chez tous les patients mais pourraient être eux-

aussi à l’origine de la toxicité cardiaque de la doxorubicine (Gewirtz, Yanovich, 1987).

37

La doxorubicine et ses métabolites subissent ensuite des réactions de phase II de type

sulfatation ou glucurono-conjugaison afin d’être sous forme conjuguée pour être excrétés

(Sturgill et al., 2000).

D. EliminationD. EliminationD. EliminationD. Elimination

La concentration en doxorubicine diminue rapidement après son administration. Son

élimination est principalement biliaire (environ 90 % de la dose administrée) et, dans une

moindre mesure, rénale. Elle est excrétée sous forme inchangée par élimination biliaire à

hauteur de 40 à 50 % et par élimination rénale à hauteur d’environ 5%. La clairance

plasmatique totale moyenne de la doxorubicine varie de 28,5 à 57,8 mL/min/kg. Des temps

de demi-vie plasmatique moyens de 3,2 minutes, 24 minutes et 11,14 heures ont été décrits

en utilisant un modèle tri-compartimental (Gustafson, Thamm, 2010). La première phase de

demi-vie serait due à la distribution tissulaire de la molécule, la deuxième phase au

métabolisme hépatique de la molécule et la troisième phase à la libération du médicament à

partir des sites de liaison dans les tissus (Tannock, Hill, 1987).

Le doxorubicinol présente un comportement similaire à son composé parent avec une demi-

vie de 48 minutes avec 12% du doxorubicinol excrété sous forme inchangée par voie urinaire

en deux heures et une clairance rénale équivalent à environ 9 à 17% de la clairance

plasmatique totale (Gilbert et al., 2006).

En ce qui concerne les résidus, la doxorubicine est détectable dans le sérum jusqu’à 7 jours

post-injection pour une dose de 30 mg/m² administrée sur 30 minutes (Knobloch et al.,

2010a). Dans les urines, la doxorubicine reste détectable pendant 21 jours, avec une valeur

inférieure à 10 % à la valeur de base après une semaine et inférieure à 1 % à la valeur de

base après deux semaines. (Knobloch et al., 2010b).

L’efflux cellulaire de la doxorubicine, contrairement à l’influx, se fait contre son gradient de

concentration et nécessite donc un transport actif de la molécule contre celui-ci. Il existe

différentes classes de transporteurs, les principaux appartenant à la famille des

transporteurs ATP-binding cassette (ou transporteurs ABC). Ces transporteurs sont impliqués

dans la translocation contre un gradient de concentration d’un large panel de substrats tels

que des ions, des peptides, des hormones stéroïdiennes, des phospholipides et certains

médicaments, dont la doxorubicine. Cet efflux est un mécanisme ATP-dépendant (Li et al.,

2008).

38

Parmi ces transporteurs ABC, la doxorubicine et ses métabolites sont majoritairement pris

en charge par :

� La glycoprotéine-P (ou P-gp), aussi appelée protéine MDR1 ou ABCB1. Premier

transporteur décrit de la famille des transporteurs ABC, c’est une protéine d’efflux de

170 kDa codée par le gène mdr1. Ce transporteur présente une grande variété de

substrats, la plupart neutres ou cationiques à pH physiologique, liposolubles,

organiques avec parfois des cycles aromatiques, et pour un poids moléculaire de 200

à 1900 Da. La P-gp est hautement conservée entre les espèces, avec 93 %

d’homologie entre le chien et l’Homme (Steingold et al., 1998). Ce transporteur est

fortement exprimé au pôle canaliculaire des hépatocytes, dans l’épithélium du tubule

proximal des reins, au niveau des voies biliaires et pancréatiques et les cellules

endothéliales des vaisseaux de l’encéphale (Ginn, 1996). Il présente donc un rôle

dans l’absorption intestinale, la sécrétion biliaire, la sécrétion tubulaire rénale et

dans la prévention du passage de la barrière hémato-méningée. Il est responsable à

lui seul d’environ 90 % de l’élimination de la doxorubicine et de ses métabolites (van

Asperen et al., 2000).

� La multidrug resistance related-protein 1 (MRP1) ou ABCC1. C’est un transporteur de

190 kDa, présent au niveau de la membrane cellulaire mais également au sein de la

membrane de certains organites. Elle prend en charge des substrats anioniques

organiques dont certains anti-cancéreux, conjugués ou non, comme la doxorubicine

et ses métabolites. Elle présente un haut degré d’homologie entre les espèces mais

l’expression tissulaire peut fortement varier (Li et al., 2008). Chez le chien, elle est

fortement exprimée au niveau de la barrière hémato-encéphalique, des reins, du foie

et des testicules (Conrad et al., 2001). Elle présente un rôle dans la sécrétion biliaire

et rénale.

� La breast cancer resistance protein (BCRP) ou ABCG2. C’est un transporteur de 72 kDa

prenant en charge des xénobiotiques et des contaminants environnementaux. Chez

l’Homme, seuls les mutants de la protéine BCRP peuvent prendre en charge la

doxorubicine, par modification de spécificité de substrat (Honjo et al., 2001). Chez le

chien, il semblerait que la protéine BCRP non mutée joue un rôle dans le transport de

la doxorubicine (Honscha et al., 2009). BCRP est fortement exprimée au niveau des

cellules tubulaires du rein, au pôle caniculaire des hépatocytes et au pôle luminal des

cellules endothéliales des capillaires de l’encéphale (Li et al., 2008). Elle serait

responsable d’un blocage de l’absorption au niveau intestinal et cérébral et d’une

sécrétion rénale et hépatique.

Ces transporteurs sont également impliqués dans le phénomène de résistance à la

doxorubicine des cellules tumorales (cf partie III.E.1) (Withrow, Page, 2013).

Figure 11 : Schéma des voies métaboliques de la doxorubicine Par souci de lisibilité, les cofacteurs permettant les différentes réactions du métabolisme n’ont pas été précisés.

39

40

En plus de ces transporteurs ABC, d’autres transporteurs, accessoires, sont responsable de

l’efflux et de l’élimination de la doxorubicine et de ses métabolites chez l’Homme : la RalA-

binding protein 1 (RALBP1) ou la lung resistance protein (LRP). Même si leur présence est

attestée, il n’existe aucune donnée sur le rôle de ces transporteurs chez le chien (Zandvliet,

Teske, 2015).

Chez le chien, on utilise la plupart du temps des modèles bi-compartimental ou tri-

compartimental pour décrire la pharmacocinétique de la doxorubicine (Figure 12). Le

modèle tri-compartimental correspond à un compartiment central et deux compartiments

périphériques, selon la vitesse d’équilibration rapide (les organes splanchniques et le tissu

musculaire) ou lente (le tissu adipeux). Celui-ci est la plupart du temps simplifié en modèle

bi-compartimental, menant à une approximation des données mais d’une plus grande

simplicité d’interprétation.

Figure 12 : Schématisation des modèles de pharmacocinétique bi-compartimental et tri-

compartimental de la doxorubicine kélim : constante d’élimination, kxy : constante de transfert entre les compartiments x et y.

Figure 13 : Schéma ADME de la doxorubicine (Absorption, Distribution, Métabolisme, Elimination), détaillant les transporteurs cellulaires

ALB : albumine ; DOX : doxorubicine ; DOXol : doxorubicinol

41

42

III. Pharmacodynamie de la doxorubicineIII. Pharmacodynamie de la doxorubicineIII. Pharmacodynamie de la doxorubicineIII. Pharmacodynamie de la doxorubicine

Suite à sa diffusion passive au sein des cellules, la doxorubicine va pouvoir atteindre les différents sites potentiels de son action cytotoxique : le noyau, les mitochondries et les membranes cellulaires

A. Interactions directes de la doxorubicine avec l’ADN et sa dynamiqueA. Interactions directes de la doxorubicine avec l’ADN et sa dynamiqueA. Interactions directes de la doxorubicine avec l’ADN et sa dynamiqueA. Interactions directes de la doxorubicine avec l’ADN et sa dynamique

1. Transport nucléaire de la doxorubicine1. Transport nucléaire de la doxorubicine1. Transport nucléaire de la doxorubicine1. Transport nucléaire de la doxorubicine

Une fois le cytoplasme atteint, la majeure partie de la doxorubicine s’accumule dans le

noyau des cellules tumorales. En effet, par quantification par marquage radioactif sur

différentes lignées cellulaires tumorales, une distribution non équitable est mise en évidence

avec une forte accumulation au niveau nucléaire (Merlin et al., 1995).

Ce processus d’accumulation nucléaire est permis par le protéasome 28S. Les protéasomes

sont des complexes protéiques intracellulaires impliqués dans des processus non

lysosomiques de dégradation des protéines. Parmi les protéasomes, le protéasome 26S est

essentiel dans le turnover normal des protéines cytosoliques et nucléaires, et joue un rôle

dans le traitement et la dégradation des protéines régulatrices de la croissance cellulaire et

du métabolisme. Il est constitué de trois sous-unités, un cœur catalytique, le

protéasome 20S, et deux complexes régulateurs 19S, de chaque côté du protéasome 20S

(Adams, 2003).

Après diffusion passive de la doxorubicine dans le cytoplasme de la cellule, un complexe

protéasome-doxorubicine est formé, grâce à la forte affinité de la doxorubicine pour le

protéasome. Une fois le complexe formé, celui-ci subit une translocation du cytoplasme vers

le noyau, via les pores nucléaires, le protéasome présentant des signaux de localisation

nucléaire. La doxorubicine présentant une affinité pour l’ADN supérieure à celle pour le

protéasome, celle-ci se dissocie de ce dernier pour rentrer en interaction avec l’ADN

(Figure 14) (Kiyomiya et al., 2001).

De plus, la doxorubicine se lie à un site allostérique de l’activité protéase chymotrypsine-like

de la sous-unité catalytique 20S, agissant alors comme un inhibiteur réversible non

compétitif de l’activité protéase (Figueiredo-Pereira et al., 1996).

Le complexe protéasome-doxorubicine présente donc deux types d’avantages. Tout d’abord,

il permet une augmentation de l’accumulation de doxorubicine dans le noyau, à l’origine

d’un de ses principaux modes d’action. De plus, cela permet l’accumulation de protéines non

dégradées, à l’origine d’un signal de l’apoptose cellulaire (Minotti et al., 2004).

43

Figure 14 : Modalités d’action du complexe protéasome-doxorubicine

Une fois dans le noyau, la doxorubicine peut interagir avec la molécule d’ADN et les

différents acteurs intervenant dans la dynamique de l’ADN.

2. Inhibition de l’ADN topoisomérase de type II2. Inhibition de l’ADN topoisomérase de type II2. Inhibition de l’ADN topoisomérase de type II2. Inhibition de l’ADN topoisomérase de type II

a. La structure topologique de la molécule d’ADN chez les eucaryotesa. La structure topologique de la molécule d’ADN chez les eucaryotesa. La structure topologique de la molécule d’ADN chez les eucaryotesa. La structure topologique de la molécule d’ADN chez les eucaryotes

L’ADN est une macromolécule polynucléotide double brin linéaire dont les nucléotides sont

formés d’un phosphate, d’un sucre et d’une base purique ou pyrimidique. Dans un état

relaxé idéal de moindre énergie, l’ADN suit une conformation de type B, c’est-à-dire une

structure en double-hélice dextrogyre avec un diamètre de 20 Å, un pas de 3,4 Å et avec 10

paires de bases par tour d’hélice. Cependant, la molécule d’ADN étant très longue, celle-ci se

condense grâce à la formation d’une structure mixte d’ADN et de protéines, appelée

nucléosome. Ces nucléosomes sont à l’origine d’une modification de la structure

topologique (ou structure tertiaire) de l’ADN (Charvin, 2004).

La topologie de l’ADN, c’est-à-dire la configuration tridimensionnelle complexe de la

molécule d’ADN au sein de la cellule, est définie par ses principales figures topologiques : les

surenroulements, les nœuds et les caténanes (Watt, Hickson, 1994).

� Les surenroulements ou supertours

Les surenroulements (ou supertours) correspondent aux torsions ou aux contraintes

appliquées à l’ADN, qui modifient les rapports géométriques dans l’hélice et sont à l’origine

d’une surtension. Le surenroulement est défini par différents éléments :

• Le nombre d’enlacements Lk, c’est à dire le nombre de fois où les deux

brins d’ADN sont liés.

44

• Le nombre de vrilles Wr, c’est-à-dire le nombre de fois où l’axe central de

la double hélice tourne autour de lui-même.

• Le nombre de torsades Tw, c’est-à-dire le nombre de tours qu’effectue un

simple brin d’ADN autour de l’autre brin simple d’ADN.

L’équation de White ΔLk = ΔWr + ΔTw relie la variation du nombre d’enlacements à celles

du nombre de vrilles et de torsades (White, 1969). Cette formule permet de définir la

distribution des contraintes au sein de la molécule d’ADN. Dans une molécule d’ADN seule

qui se déforme continuellement, le nombre d’enlacement reste constant tandis que les

changements de Wr et de Tw sont couplés.

Dans une cellule, les extrémités de l’ADN linéaire étant fixées à la membrane nucléaire, le

nombre d’enlacements n’est pas stable et provoque un surenroulement de l’ADN. On pourra

différencier les surenroulements positifs (dans le sens de torsion de la double hélice d’ADN),

des surenroulements négatifs (dans le sens inverse de torsion de la double hélice d’ADN).

Le surenroulement de l’ADN intervient lors de la réplication et de la transcription en ARN. Il

résulte du déroulement de la double hélice par l’ADN ou l’ARN polymérase, déroulement qui

induit des supertours positifs en amont et négatifs en aval.

� Les nœuds et caténanes

Les nœuds correspondent à des extrémités de la molécule d’ADN liées l’une à l’autre (Figure

15). Les nœuds fragilisent l’ADN et bloquent certains processus cellulaires tels que la mitose

ou la méiose, en empêchant la séparation des deux brins d’ADN (Sumners, 1995).

Lors d’une concentration importante en ADN, il y a une forte probabilité d’obtenir des

molécules d’ADN liées entre elles, nommées caténanes (Figure 15). En pratique, les

caténanes apparaissent lors de la réplication de l’ADN, où les molécules d’ADN nouvellement

synthétisées s’enroulent l’une autour de l’autre. Les caténanes empêchent la séparation et

la ségrégation des chromosomes au cours des divisions cellulaires (Sumners, 1995).

Figure 15 : Caténanes au cours de la réplication (à gauche) et nœuds d’ADN (à droite)

D’après Sumners et al. (1995).

45

L’ADN présente donc plusieurs figures topologiques, les surenroulements, à l’origine d’une

topologie désirable permettant à l’ADN d’être compacté et qui jouent un rôle au cours de la

réplication et de la transcription, et les nœuds et caténanes, à l’origine d’une topologie

indésirable et qui doivent être supprimés pour permettre le déroulement des processus

biologiques.

Pour que les processus biologiques cellulaires de réplication, de transcription et de division

puissent avoir lieu, l’hélicité de l’ADN doit être maintenue et les contraintes de torsions

régulées, en fonction de la phase du cycle cellulaire et de l’activité transcriptionnelle. De

plus, dans tous les cas, les nœuds et caténanes doivent être supprimés. Cela nécessite un

clivage simple ou double brin de l’ADN, opérations réalisées par les ADN topoisomérases

(Champoux, 2001).

b. Les ADN topoisomérases b. Les ADN topoisomérases b. Les ADN topoisomérases b. Les ADN topoisomérases

En 1971, Wang et al mettent en évidence, chez une bactérie Escherichia Coli, une nouvelle

classe d’enzyme ayant la capacité de modifier la topologie de la molécule d’ADN : les ADN

topoisomérases (Wang, 1971). Ces enzymes ubiquitaires et fortement conservées dans

toutes les espèces, sont capables de générer des clivages transitoires de l’ADN et de

catalyser le passage de segments d’ADN au travers de ces zones de clivage avant de les

refermer (Lodish et al., 2000). Elles sont essentielles pour de nombreux processus de la vie

cellulaire, incluant la transcription, la réplication, la séparation des chromosomes lors de la

mitose et de la méiose, etc (Nitiss, 2009a).

� Mécanisme d’action général des ADN topoisomérases

Pour prévenir et corriger la topologie de la double hélice d’ADN, les ADN topoisomérases

réalisent une réaction de transestérification réversible catalysée pour le groupement

hydroxyle d’une tyrosine appartenant à son site actif (Figure 16). Ce groupement réagit avec

la liaison phosphodiester de l’ADN et provoque une coupure de brin d’ADN et la formation

d’un intermédiaire covalent entre la tyrosine de l’enzyme et une des extrémités du brin

d’ADN. La réaction inverse reforme la liaison phosphodiester et libère la tyrosine. Ainsi, la

réaction de coupure/religation ne nécessite pas d’apport d’énergie (Duguet, Riou, 1994).

Figure 16 : La réaction de transestérification caractérisant l’activité des topoisomérases

D’après Duguet et Riou (1994). ENZ : enzyme ; Tyr : tyrosine.

46

� Classification des ADN topoisomérases

En fonction du nombre de brins d’ADN concernés par le clivage transitoire, on distingue deux

classes de topoisomérases :

• Les ADN topoisomérases de type I, quasi-exclusivement monomériques.

Ces enzymes clivent un seul des deux brins de la double hélice d’ADN,

permettant soit le passage du brin d’ADN non clivé au niveau de la cassure

simple brin (enzyme de type IA), soit la libre rotation du brin clivé autour

de l’autre simple brin (enzyme de type IB)(Dekker et al., 2002). Le brin

clivé est ensuite réparé, formant une structure identique à celle avant

clivage, mais avec un ΔLk = ± 1 (Figure 17). La plupart de ces enzymes,

exceptée la réverse gyrase, ne nécessite pas la présence d’un cofacteur

énergétique ATP, l’énergie conduisant la réaction étant apportée par le

surenroulement de la molécule d’ADN (Charvin, 2004).

Figure 17 : Mécanisme de la relaxation du surenroulement par les ADN topoisomérases de

type I Traduit et adapté de l’anglais, d’après Dekker et al. (2002).

En haut : l’ADN topoisomérase de type IA s’insère dans la double hélice en la faisant « fondre » localement. Elle

opère ensuite une cassure simple-brin et fait passer l’autre brin à travers. En bas : l’ADN topoisomérase de type

IB se fixe sur le brin d’ADN et réalise une cassure simple brin, permettant la libre rotation de l’ADN autour du

squelette sucre-phosphate.

• Les ADN topoisomérases de type II eucaryotes sont des homodimères. Ces

enzymes présentent la capacité de cliver les deux brins de la double hélice

d’ADN afin de permettre le passage d’une autre portion de la double

hélice d’ADN au sein de la zone de cassure. Les brins clivés sont ensuite

réparés par un mécanisme nécessitant l’hydrolyse de deux molécules

d’ATP. Les ADN topoisomérases de type II seront à l’origine d’un ΔLk = ± 2.

Les ADN topoisomérases de type II sont aussi à l’origine de la décaténation

des chromosomes au cours de la réplication. On distingue les ADN

topoisomérases de type IIα, exprimée dans les cellules prolifératrices et

47

impliquée dans la réplication et la ségrégation chromosomique, des ADN

topoisomérases de type IIβ, impliquées dans la transcription et la

différenciation cellulaire (Drake et al., 1989). Les ADN topoisomérases de

type IIα sont dépendantes du cycle cellulaire. Leur expression et leur

activité catalytique augmente au cours de la phase S pour être maximales

lors de la phase G2 et décroître ensuite au cours de la phase G1.

L’augmentation de l’activité catalytique semble être contrôlée par la

phosphorylation de résidus sérine au cours du cycle cellulaire (Larsen et

al., 1996).

Dans la suite, nous nous intéresserons principalement aux topoisomérases eucaryotes de

type II, celles-ci étant inhibées par la doxorubicine.

� Structure des ADN topoisomérases eucaryotes de type II

Toutes les sous-classes d’ADN topoisomérases de type II présentent des domaines communs

au sein de leur structure (Corbett, Berger, 2004) :

• Un domaine 5Y-CAP (Catabolite Activator Protein), portant l’acide aminé

catalytique tyrosine qui se lie de façon covalente à l’extrémité 5’ du brin

d’ADN après attaque nucléophilique du pont phosphodiester. Un acide

aminé arginine conservé proche de la tyrosine permettrait de positionner

la molécule d’ADN et de stabiliser l’état de transition pentavalent au cours

de la réaction.

• Un domaine Toprim (Topoisomérase-primase), constitué d’une centaine

d’acide aminés et présentant deux motifs conservés : l’un centré autour

d’un acide aminé glutamate et présentant un rôle dans la religation du

brin d’ADN, l’autre centré autour de deux acides aminés aspartate et

permettant la liaison avec Mg2+, cofacteur requis pour la fonction

catalytique (Aravind et al., 1998).

• Un domaine GHKL ATPase qui se dimérise après fixation de l’ATP pour

former une « porte » à travers laquelle les duplex d’ADN passent.

• Un domaine de transduction, essentiel pour l’hydrolyse de l’ATP,

notamment grâce à un acide aminé lysine qui se projette sur le site actif

du domaine GHKL et stabilise l’état de transition de l’ATP au cours de son

hydrolyse.

� Mécanisme d’action de l’ADN topoisomérase de type II

Au cours d’un cycle de topo-isomérisation, chaque sous-unité de l’enzyme dimérique clive

un brin de l’ADN. Cette réaction nécessite la fixation et l’hydrolyse de l’ATP. Les

intermédiaires clivés, aussi nommés « complexes de clivage » ont normalement une durée

de vie très courte, le temps de passage de l’ADN à travers cette coupure.

48

Figure 18 : Cycle de topo-isomérisation par une ADN topoisomérase de type II

D’après Duguet et Riou (1994).

Les différentes étapes du cycle de l’ADN topoisomérase de type II sont les suivantes (Figure 18) (Duguet, Riou, 1994) :

(1) Etape de fixation : l’ADN topoisomérase de type II (en rouge), constituée d’un

homodimère, se fixe en 5’ du brin d’ADN et forme un complexe covalent au niveau d’un

croisement de deux doubles brins d’ADN, dont l’un (en gris) porte une séquence consensus

dégénérée.

(2) Etape de clivage : les deux brins de ce dernier sont clivés respectivement par

chacune des deux sous-unités de l’ADN topoisomérase de type II, grâce à des réactions de

transestérification, produisant l’intermédiaire clivé a. Cette étape est catalysée par un

cofacteur Mg2+, indispensable.

(3) Etape de modifications topologiques : le double brin d’ADN intact passe au travers

de la brèche, sans doute grâce à un changement conformationnel de l’enzyme qui a fixé

deux molécules d’ATP, formant l’intermédiaire clivé b.

(4) Etape de religation : l’intermédiaire clivé b reforme les liaisons phosphodiesters

mais l’ADN topoisomérase de type II reste fixée sur l’ADN sous forme d’un complexe non

covalent.

(5) Etape de régénération de l’enzyme : l’ATP est hydrolysée, régénérant la forme

active de l’enzyme qui se dissocie de l’ADN.

49

Chaque cycle catalytique modifie d’une valeur de deux le nombre de liens topologiques

d’une molécule d’ADN.

Ces enzymes sont des cibles pharmacologiquement importantes d’un certain nombre

d’agents anticancéreux. Parmi ceux-ci, la famille des anthracyclines, et plus particulièrement

la doxorubicine, sont responsables de l’inhibition de l’ADN topoisomérase de type II

(Chabner, Longo, 2011).

c. Action de la doxorubicine sur les ADN topoisomérases de type IIc. Action de la doxorubicine sur les ADN topoisomérases de type IIc. Action de la doxorubicine sur les ADN topoisomérases de type IIc. Action de la doxorubicine sur les ADN topoisomérases de type II

En 1981, Ross et al décrivent l’induction d’une rupture des brins d’ADN dans des cellules

murines leucémiques L1210 par la doxorubicine pour des concentrations allant de 0,4 à 5

µM (Ross, Bradley, 1981). Les cassures de brins d’ADN, simple ou doubles brins sont

lentement et incomplètement réparées après retrait de la doxorubicine des cellules. En

1984, Tewey et al. identifient l’ADN topoisomérase de type II comme cible de la

doxorubicine et démontrent que les sous-unités de l’enzyme restent bloquées sur

l’extrémité 5’ de la molécule d’ADN après avoir complété la réaction de clivage (Tewey et al.,

1984). La doxorubicine est donc un inhibiteur réversible de l’ADN topoisomérase de type II,

et plus exactement, elle stabilise l’intermédiaire clivé en se fixant à celui-ci, permettant la

formation d’un complexe ternaire de clivage doxorubicine/ADN/ADN topoisomérase de

type II (Wang, 1971).

La formation et la stabilité de ce complexe ternaire reposent sur des déterminants

structuraux définis et notamment sur la fraction sucre de la doxorubicine, déterminant

critique de l’action de la doxorubicine en tant qu’inhibiteur de l’ADN topoisomérase de type

(Minotti et al., 2004). La formation du complexe ternaire serait séquence-dépendante et

favorisée par la présence d’une base azotée adénine en -1 du site de cassure (Pommier et al.,

2010). Ce complexe ternaire de clivage bloque la transcription et la réplication cellulaire. De

plus, en stabilisant l’ADN topoisomérase de type II, la doxorubicine empêche la religation de

l’ADN et est à l’origine de lésions doubles brins de l’ADN. D’un point de vue mécanistique, on

peut imaginer un modèle d’interaction dans lequel la réaction de religation est inhibée par le

positionnement de l’agent au centre de la région où l’ADN topoisomérase de type II interagit

avec l’ADN et le clive. Le groupement hydroxyle de l’extrémité du brin clivé serait alors placé

dans une position trop éloignée du site actif pour que la réaction de religation puisse

s’effectuer.

Il est cependant difficile de relier le degré d’induction de cassures de brins d’ADN avec la

cytotoxicité de la doxorubicine, celle-ci ne produisant qu’une faible quantité de dommage à

l’ADN en comparaison avec d’autres inhibiteurs de l’ADN topoisomérase de type II (tels que

l’amsacrine ou les épipodophyllotoxines). On a donc un conflit entre le haut degré de

cytotoxicité de la doxorubicine et le faible taux de cassures de l’ADN. Une hypothèse serait

que le site de cassure est un facteur critique de l’action de la doxorubicine et que celle-ci

présente un site spécifique de clivage, différent des autres inhibiteurs de l’ADN

topoisomérase de type II (Gewirtz, 1999).

50

� Quelle est la part d’inhibition de l’ADN topoisomérase de type II dans la cytotoxicité de la

doxorubicine ?

Trois conditions inhibent l’ADN topoisomérase de type II : une température faible, des

concentrations en sels importantes et des concentrations en doxorubicine excédant une

valeur critique entre 0,5 et 2,5 µM. Pour ces trois conditions, il a été mis en évidence une

inhibition de la cytotoxicité de la doxorubicine, en faveur d’un rôle majeur de l’ADN

topoisomérase de type II dans cette cytotoxicité (Keizer et al., 1990). On observe qu’à

faible concentration, la doxorubicine est à l’origine d’une induction de la formation de

complexes de clivage mais qu’à forte concentration, elle permet l’inhibition de la fixation

de l’ADN topoisomérase de type II à l’ADN, sans former de complexe ternaire (Chabner,

Longo, 2011).

� Comment l’action de la doxorubicine concernant la topoisomérase de type II conduit-elle

à la cytotoxicité de la doxorubicine ?

La cytotoxicité est liée à l’accumulation de complexes de clivage stables dans lesquels l’ADN

est clivé : plus il y a d’ADN topoisomérase de type II au voisinage de l’ADN, plus ces

complexes de clivage se forment en grand nombre sur l’ADN et plus grande est la

cytotoxicité (Duguet, Riou, 1994). C’est également cela qui explique la relative sélectivité de

la doxorubicine vis-à-vis des cellules tumorales. En effet, celles-ci présentent une

concentration plus élevée en ADN topoisomérase de type II que les cellules non tumorales.

La réplication, la transcription et d’autres processus comme la recombinaison pourraient

transformer les complexes de clivage initiaux en lésions secondaires de l’ADN. Ces lésions

secondaires peuvent être la conséquence directe (par recombinaison de brins) ou indirecte

(par réparation anarchique) de la présence de complexes de clivage. A ce stade, deux

possibilités se présentent, soit l’ADN est réparé, soit la lésion persiste. La persistance de

cette lésion mène à un blocage du cycle cellulaire, préférentiellement entre la phase G2 et la

phase M, préférence due à la plus forte activité de l’ADN topoisomérase de type IIα à cette

phase du cycle cellulaire. La cellule rentre ensuite dans l’un des processus de mort cellulaire

(Swift et al., 2006).

3. Intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule d’ADN3. Intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule d’ADN3. Intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule d’ADN3. Intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule d’ADN

La doxorubicine est un agent mono-intercalant de l’ADN, c’est à dire une molécule

organique de petite taille dont une partie est plane, et qui s’intercale entre les paires de

bases de l’ADN. Au sein de la molécule de doxorubicine, les cycles B, C et D de la partie

chromophore aglycone constituent la partie intercalante de la molécule (Figure 1). Cette

intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule d’ADN aurait lieu pour des

concentrations allant de 0,01 à 4 µM, selon les études (Minotti et al., 2004).

51

a. Mécanisa. Mécanisa. Mécanisa. Mécanisme d’intercalation de la doxome d’intercalation de la doxome d’intercalation de la doxome d’intercalation de la doxorubrubrubrubicineicineicineicine

L’intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule d’ADN est un processus avec

plusieurs étapes, présentant des évènements non spécifiques montrant une forte affinité

(Kapp = 2,2.106) pour des séquences spécifiques riches en motifs guanine-cytosine et des

régions transcriptionnellement actives de l’ADN. Le complexe doxorubicine-ADN est stabilisé

par au moins trois forces de liaisons : des interactions hydrophobes, des liaisons hydrogènes

au squelette phosphaté de l’ADN avec la chaine latérale et le cycle d, et l’insertion du

groupement amino-sucre au sein du petit sillon de l’ADN. Cela donne lieu à un temps de

séjour long qui semble être un facteur critique pour différencier un agent intercalant avec

une activité antitumorale ou non (Cummings, Anderson, et al., 1991).

Le mécanisme d’intercalation, étudié par cristallographie, se déroule en trois étapes selon

Chaires et al : une interaction extérieure rapide type liaison faible suivi d’une intercalation

de la doxorubicine et enfin d’un ajustement conformationnel lent du complexe ADN-

doxorubicine (Chaires et al., 1985). D’autres auteurs suggèrent l’existence d’un modèle

cinétique à 5 étapes (Rizzo et al., 1989). Celui-ci inclurait une disposition en parallèle des

étapes 1 et 2 (étapes d’interaction type liaison faible), suivie par une étape d’intercalation de

la doxorubicine et d’une nouvelle disposition en parallèle des étapes 4 et 5, étapes de

réarrangement conformationnel du complexe doxorubicine-ADN et de redistribution des

liaisons à des sites privilégiés, sans dissociation. B5 correspond au complexe final

doxorubicine-ADN (Figure 19)(Lei et al., 2012).

Figure 19 : Modèles cinétiques d’intercalation de la doxorubicine au sein de l’ADN. (A)

Modèle à 3 étapes. (B) Modèle à cinq étapes

D’après Chaires et al. (1985) et Rizzo et al. (1989).

b. Conséquences de l’intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule b. Conséquences de l’intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule b. Conséquences de l’intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule b. Conséquences de l’intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule d’ADNd’ADNd’ADNd’ADN

L’intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule d’ADN présente des effets directs

sur la chromatine, à l’origine de la mort des cellules cancéreuses. En effet, la doxorubicine va

venir s’intercaler préférentiellement entre les deux brins de l’ADN, dans des sites adjacents

aux paires de bases guanine-cytosine à cause de la formation de liaisons hydrogènes

spécifiques entre la doxorubicine et la guanine. On observe alors un écartement des paires

de bases supérieure et inférieure, l’espace entre deux paires de bases passant de 3,4 Å

52

à environ 6,8 Å (Yang et al., 2014). Cet écartement permet l’intercalation de la doxorubicine

et de ce fait, empêche la fixation de certaines enzymes impliquées dans des processus

cellulaires, dont les ADN polymérases et les hélicases (Chabner, Longo, 2011). Les hélicases

sont des enzymes permettant la séparation des deux brins de l’ADN par hydrolyse des

liaisons hydrogènes entre ceux-ci (Matson, Kaiser-Rogers, 1990). La séparation des brins

d’ADN est une étape indispensable aux processus de réplication, de transcription et de

réparation de l’ADN. La doxorubicine inhibe donc la fixation des hélicases sur l’ADN et la

séparation des deux brins d’ADN. De plus, tout comme avec les ADN topoisomérases de type

II, la doxorubicine formerait des complexes ternaires irréversibles doxorubicine/ADN/ADN

hélicases (Bachur et al., 1992).

De plus, dans une molécule d’ADN de conformation B, chaque paire de bases présente une

rotation d’environ -36° avec la paire de bases suivante. L’introduction d’une seule molécule

de doxorubicine est à l’origine d’une modification de la périodicité de la molécule d’ADN

avec une modification de la rotation de -27° entre les deux paires de bases adjacentes.

L’intercalation de la doxorubicine est aussi à l’origine d’une augmentation de la longueur de

l’ADN ainsi que de sa viscosité (Mukherjee, Sasikala, 2013). On observe alors une altération

de la structure topologique de l’ADN avec induction des torsions positives compensatrices,

pouvant être à l’origine de la modification de nombreux mécanismes cellulaires tels que la

réplication de l’ADN ou sa transcription.

L’inhibition des processus de réplication, transcription et réparation de l’ADN mène à

l’inhibition de la synthèse de macromolécules essentielles au fonctionnement cellulaire et

donc à la mort cellulaire (Cummings, Anderson, et al., 1991).

En raison de sa forte affinité pour l’ADN, la doxorubicine s’accumule dans le noyau et

réagit avec l’ADN. Ces interactions expliquent certains des mécanismes d’action de la

doxorubicine à l’origine de sa cytotoxicité :

� L’inhibition de l’ADN topoisomérase de type II, enzyme responsable de la

topologie de la molécule d’ADN au cours du cycle cellulaire. Cette inhibition est

soit directe, soit indirecte par la formation d’un complexe ternaire

doxorubicine/ADN/ADN topoisomérase de type II. L’inhibition résulte en la

formation de cassures double-brins de l’ADN, de cross-links et en l’inhibition des

processus cellulaires de réplication et de transcription.

� L’intercalation de la doxorubicine au sein de la molécule d’ADN. Ce mécanisme

est à l’origine de l’inhibition des processus cellulaires de réplication, transcription

et réparation de l’ADN par modification des caractéristiques de la molécule

d’ADN.

53

B. Réactivité chimique de la doxorubicine et interaction aveB. Réactivité chimique de la doxorubicine et interaction aveB. Réactivité chimique de la doxorubicine et interaction aveB. Réactivité chimique de la doxorubicine et interaction avec les composés c les composés c les composés c les composés cellulairescellulairescellulairescellulaires

Durant l’intercalation ou l’inhibition de l’ADN topoisomérase de type II, la doxorubicine agit

comme un composé inerte, son activité étant due à sa capacité à se lier à des

macromolécules clés et à modifier la structure tridimensionnelle de ses cibles. Cependant, la

doxorubicine est également capable d’agir en tant que réactif chimique. En effet, la

doxorubicine peut subir différentes réactions d’oxydoréduction, à l’origine d’effets variés sur

la cellule.

1. Doxorubicine et réact1. Doxorubicine et réact1. Doxorubicine et réact1. Doxorubicine et réactions d’oxydoions d’oxydoions d’oxydoions d’oxydo----réductionréductionréductionréduction

Le cycle d’oxydo-réduction de la doxorubicine est décrit pour la première fois lors de

l’observation d’une consommation de dioxygène en présence de NADPH, de la cytochrome

P450 réductase et de doxorubicine (Goodman, Hochstein, 1977).

La doxorubicine est capable de subir une réduction à un ou deux électrons, à l’origine de la

production de ROS et d’un radical semi-quinone. Ces composés réactifs peuvent causer de

larges dommages aux macromolécules intracellulaires et sont à l’origine de l’activité

antitumorale de la doxorubicine, mais aussi de sa cardiotoxicité (Doroshow, 1986) (Mizutani

et al., 2005). De plus, la doxorubicine peut également se complexer avec l’ion fer(III), et

mener à la formation de ROS. Au cours de son cycle d’oxydo-réduction, elle peut aussi

former des agents alkylants.

a. Formation de ROS par réduction à un électron de la doxorubicinea. Formation de ROS par réduction à un électron de la doxorubicinea. Formation de ROS par réduction à un électron de la doxorubicinea. Formation de ROS par réduction à un électron de la doxorubicine

La réduction à un électron de la doxorubicine peut se dérouler dans la plupart des

compartiments intracellulaires, incluant les mitochondries, le réticulum endoplasmique et le

cytoplasme. Cette réaction est catalysée par des déshydrogénases liées à la flavine ou des

réductases incluant la cytochrome P450 réductase, la NADH déshydrogénase (ou complexe I

de la chaine mitochondriale de transport d’électrons), la xanthine oxydase et la cytochrome

b5 réductase (Doroshow, 1986) (Vásquez-Vivar et al., 1997). De plus, plusieurs isoformes de

l’oxyde nitrique synthase sont capables de catalyser la réduction à un électron de la

doxorubicine avec la production subséquente de superoxyde et une diminution de l’oxyde

nitrique (Garner et al., 1999). Ces enzymes sont largement distribuées dans les tissus et la

formation de radicaux libres se déroule donc dans de nombreux organes et lignées

cellulaires tumorales.

L’addition d’un électron libre convertit le groupement quinone du cycle C de la doxorubicine

en un radical libre semi-quinone. Ce radical peut être à l’origine de dégâts oxydatifs directs,

résultant en un clivage ou à la dégradation de l’ADN ou des désoxyriboses (Bates,

Winterbourn, 1982). En conditions anoxiques, ce radical est relativement stable. En présence

de dioxygène, ce radical libre est rapidement oxydé et donne son électron au dioxygène

moléculaire pour former un anion superoxyde O2.-. Bien que peu toxique en lui-même, sa

dismutation spontanée est à l’origine de la formation de peroxyde d’hydrogène H2O2

54

(Wagner et al., 2005). L’anion superoxyde peut alors réagir avec le peroxyde d’hydrogène

selon la réaction de Haber-Weiss, formant ainsi le radical hydroxyle HO-. Cette réaction est

catalysée par l’ion fer(III). Ce radical hydroxyle est l’une des espèces chimiques les plus

réactives et peut être à l’origine de l’oxydation délétère de constituants cellulaires

(Kalyanaraman et al., 1991). L’anion superoxyde peut également réagir avec le monoxyde

d’azote pour produire l’anion peroxynitrite, agent oxydant très instable, menant à la

formation de radicaux hydroxyles (Figure 20) (Powis, 1987).

Figure 20 : Formation de ROS par réduction à un électron de la doxorubicine

b. Formation d‘espèces alkylantes par réductionb. Formation d‘espèces alkylantes par réductionb. Formation d‘espèces alkylantes par réductionb. Formation d‘espèces alkylantes par réduction de la doxorubicinede la doxorubicinede la doxorubicinede la doxorubicine

La doxorubicine peut également être à l’origine de la formation d’espèces alkylantes par

réduction à un ou deux électrons.

La doxorubicine peut subir une réaction de réduction à deux électrons, menant à la

formation d’une quinone méthide instable, de demi-vie très courte (23 secondes). Cette

réaction est catalysée par la NAD(P)H oxydoréductase en présence de réducteurs forts

(Powis, 1987). Ce dérivé quinone méthide subit ensuite une série de réaction menant à la

formation d’un métabolite 7-déoxy-aglycone (Figure 21)(Moore, 1977). Ce dérivé quinone

méthide instable présenterait un rôle d’agent alkylant monofonctionnel de l’ADN et des

protéines, mais avec une cytotoxicité moindre que le composé parent. Même si l’implication

de cette quinone méthide concernant la cytotoxicité de la doxorubicine n’est pas certaine,

55

cette réduction à deux électrons de la doxorubicine présente une application thérapeutique.

En effet, l’utilisation de réducteurs forts lors d’extravasation sanguine permettrait de

diminuer les dégâts tissulaires en formant des dérivés 7-déoxy-aglycones, moins toxiques

que le composé parent (Chabner, Longo, 2011).

La doxorubicine peut également subir une réduction à un électron, menant à la formation du

radical semi-quinone. En présence de dioxygène moléculaire, la semi-quinone réagit

rapidement avec ce dernier, à l’origine de la production de ROS (Figure 20). En milieu hypo-

aérobie ou anaérobie, le radical semi-quinone présente une stabilité bien plus importante,

donnant lieu à son auto-oxydation de la liaison entre le cycle A et la fraction daunosamine,

et résultant en la formation d’un radical libre semi-quinone centré en C7. Ce radical serait

ensuite transformé en métabolite 7-déoxy-aglycone (Figure 21) (Airley, 2009). Ce radical

présente lui aussi un rôle d’agent alkylant monofonctionnel de l’ADN.

Figure 21 : Formation de radicaux alkylants par réduction de la doxorubicine

Le radical libre semi-quinone centré en C7 et le radical quinone-méthide vont pouvoir alkyler

la molécule d’ADN afin de former des adduits à l’ADN.

c. Formation de complexes doxorubicinec. Formation de complexes doxorubicinec. Formation de complexes doxorubicinec. Formation de complexes doxorubicine----métalmétalmétalmétal

Certaines études ont montré que la peroxydation de lipides par la doxorubicine nécessitait la

présence de fer dans le milieu réactionnel (Sterrenberg et al., 1985). De plus, bien que les

ROS semblent être à l’origine de la cardiotoxicité de la doxorubicine, les anti-radicalaires se

sont révélés inefficaces comme cardio-protecteur. Ces résultats indiquent l’implication d’une

autre variable : l’interaction de la doxorubicine avec le fer.

56

� Formation de complexe Fe(III)-doxorubicine et production de ROS

Comme vu précédemment, l’ion fer(III) peut catalyser la réaction de Haber-Weiss à l’origine

de la formation de radicaux hydroxyles (Figure 20). Alternativement, une interaction directe

entre l’ion fer(III) et la doxorubicine pourrait être impliquée, formant un complexe fort entre

l’ion et trois molécules de doxorubicine, de constante de stabilité d’environ 1030 (Fiallo et al.,

1999). La chélation de l’ion fer(III) rend la doxorubicine plus électrophile, permettant son

auto-réduction en un complexe radical doxorubicine semi-quinone-fer(II), par transfert

intramoléculaire d’électron (Gianni et al., 1985). Cette réaction peut également être

catalysée par le système cytochrome P450. Phénomène normalement lent, la réduction du

complexe avec le fer(III) est accélérée en présence de résidus thiols. En présence de

dioxygène moléculaire, le fer(II) est rapidement oxydé en fer(III), avec la formation de

radicaux superoxydes (Figure 22)(Powis, 1987).

Contrairement à la réduction de la doxorubicine menant à la formation de dérivés 7-déoxy-

aglycones, la réduction du complexe avec le fer(III) n’est pas associée à une perte de

doxorubicine ou à la formation de métabolites aglycones.

D’autres ions métalliques tels que le cuivre Cu(II) ou le magnésium Mg(II) peuvent se

substituer au fer(III) pour former un complexe avec la doxorubicine et mener à la formation

de ROS. De plus, des ions métalliques réduits tels que le fer (II) ou le cuivre (I) peuvent

également cliver le peroxyde d’hydrogène afin de former des radicaux hydroxyles (Powis,

1987).

Figure 22 : Formation de ROS par formation du complexe doxorubicine-fer(III)

57

A cause de sa réactivité, les concentrations en fer libre sont très limitées (10-13 mol/L) alors

que sa concentration totale est d’environ 10-4 à 10-5 mol/L. La plupart du fer est stocké sous

forme liée à la ferritine mais la doxorubicine induit une perturbation de l’homéostasie

ferrique (Keizer et al., 1990).

� Homéostasie ferrique et doxorubicine

La formation du complexe fer(III) avec la doxorubicine est un phénomène auto-entretenu.

Etant donnée la faible quantité de fer libre intracellulaire disponible pour catalyser les

réactions de formation des radicaux libres, il devrait y avoir une forte dérégulation de

l’homéostasie ferrique, avec un relargage de fer intracellulaire (Cairo et al., 2002).

Tout d’abord, des études in vitro suggèrent que la formation de radicaux libres à partir de la

semi-quinone est accompagnée par le relargage du fer par la ferritine, protéine de stockage

du fer la plus importante. L’anion superoxyde présente des facteurs stérique et

pharmacodynamique autorisant le relargage du fer (Minotti, Aust, 1992).

Le fer peut également provenir de l’aconitase cytoplasmique, une enzyme qui isomérise le

citrate en isocitrate grâce à son site catalytique [4Fe-4S]. Le quatrième atome de fer de

l’aconitase est facilement détachable par les ROS produit lors du cycle d’oxydo-réduction de

la doxorubicine (Gardner et al., 1995). Il en résulte la formation d’une protéine avec un site

[3Fe-4S], sans activité aconitase et la libération d’un ion fer (III). De plus, le doxorubicinol,

métabolite alcool secondaire de la doxorubicine, permet également le relargage de quatre

ions fer(III) à partir de l’aconitase cytoplasmique, à l’origine de sa conversion en protéine

régulatrice du fer, l’IRP-1 (Figure 23) (Minotti et al., 1999) (Kalyanaraman et al., 2002).

Figure 23 : Libération de fer à partir de l’aconitase cytoplasmique et formation de ROS

D’après Minotti et al. (2004)

58

L’IRP-1 ainsi formée intervient dans la modulation de l’expression du récepteur à la

transferrine (TfR) et de la ferritine. En effet, celle-ci se lie avec une haute affinité à des iron-

conserved elements (IRE) dans des régions non transcrites de l’ARNm du TfR et de la

ferritine, augmentant la stabilité du premier et bloquant la transcription du second. Il en

résulte une augmentation de l’expression du récepteur à la transferrine et une accumulation

d’ions ferriques dans la cellule, sous forme non liée, pouvant de nouveau complexer trois

molécules de doxorubicine et produire des ROS. La conversion de l’aconitase facilite donc

l’absorption sur la séquestration du fer (Figure 24). Ce processus est spontané dans des

cellules en déplétion ferrique et sert de mécanisme adaptatif pour restaurer les fonctions

métaboliques nécessitant du fer (Cairo et al., 2002). Ce même processus est toxique dans

des cellules avec suffisamment de fer, comme lorsque la conversion de l’aconitase en IRP-1

est induite par la doxorubicine (Minotti et al., 2004).

Figure 24 : Régulation de l’homéostasie ferrique et implication du doxorubicinol

D’après Minotti et al. (2004).

2. Le stress oxydatif, une conséquence de la réduction de la 2. Le stress oxydatif, une conséquence de la réduction de la 2. Le stress oxydatif, une conséquence de la réduction de la 2. Le stress oxydatif, une conséquence de la réduction de la doxorubicinedoxorubicinedoxorubicinedoxorubicine

a. Le concept de stress oxydatif a. Le concept de stress oxydatif a. Le concept de stress oxydatif a. Le concept de stress oxydatif

L’utilisation de dioxygène moléculaire par un organisme mène inévitablement à la formation

de ROS qui, quand ils sont laissés actifs, sont à l’origine d’effets délétères oxydatifs sur les

principaux constituants cellulaires : les acides nucléiques, les protéines et les lipides

(Nordberg, Arnér, 2001). Etant donné que la formation de ces dérivés réactifs peut se

dérouler lors de processus métaboliques biologiques, incluant la respiration mitochondriale,

et qu’elle est un mécanisme d’action commun de plusieurs toxines naturelles, la plupart des

cellules ont élaboré des mécanismes de défense contre ces radicaux (Muggia, Green, 1991).

La superoxyde dismutase, la catalase et la glutathion peroxydase agissent de concert pour

59

réduire les ROS ainsi que les lipides hydro-peroxydés (Figure 25). Il existe également des

systèmes antioxydants non enzymatiques tels que les oligoéléments, cofacteurs des

enzymes antioxydantes, le glutathion réduit, les vitamines C et E, les ubiquinones, le

cytochrome c, … De plus, il existe des systèmes de réparation spécifique des dommages

oxydatifs à l’ADN (Breimer, 1991). Cependant, l’activité des enzymes capables d’activer la

doxorubicine ainsi que les défenses anti-oxydantes ne sont pas équitablement réparties dans

les différents tissus et types cellulaires, expliquant les différences de toxicité et d’action

antitumorale (Chabner, Longo, 2011).

Figure 25 : Les systèmes antioxydants enzymatiques

Le terme de stress oxydatif se réfère à une situation au cours de laquelle la formation de

ROS submerge la capacité de détoxification du système antioxydant, provoquant une

accumulation de ces dérivés réactifs oxygénés. Cela est à l’origine de conséquences

préjudiciables pour la cellule, allant du dysfonctionnement à la mort cellulaire lors d’un

stress oxydatif majeur (Li et al., 2016). Les conditions de stress oxydatif peuvent être causées

par une augmentation de la formation de dérivés réactifs oxygénés, une diminution de

l’activité anti-oxydante, voir une combinaison des deux.

Le stress oxydatif médié par la doxorubicine résulte de plusieurs mécanismes (Zhu et al.,

2016):

� La production de ROS par un cycle d’oxydoréduction, principal mécanisme de stress

oxydatif doxorubicine-induit (Figure 20).

� Une diminution des défenses cellulaires anti-oxydantes, principalement par inhibition

de la thiorédoxine réductase.

� La perturbation de la chaîne mitochondriale de transport d’électrons, à l’origine

d’une perte d’électrons captés pour augmenter la formation de ROS mitochondriaux.

Cette perturbation peut être directe, ou indirecte par modification du génome

mitochondrial.

b. L’inhibition de la thiorédoxine réductase par la doxorubicineb. L’inhibition de la thiorédoxine réductase par la doxorubicineb. L’inhibition de la thiorédoxine réductase par la doxorubicineb. L’inhibition de la thiorédoxine réductase par la doxorubicine La thiorédoxine réductase (Trr) est une flavo-enzyme présente dans la quasi-totalité des

cellules de l’organisme. Elle présente trois iso-enzymes, la forme cytosolique Trr1, la forme

mitochondriale Trr2, et la forme Trr3 localisée principalement dans les testicules.

60

Ces enzymes sont des sélénoprotéines avec un résidu sélénocystéine présent dans un motif

rédox C-terminal contenant la séquence d’acides aminés -Gly-Cys-Sec-Gly-COOH. Ce résidu

est essentiel pour l’activité catalytique de l’enzyme. Trr1 présente un rôle prédominant pour

l’homéostasie oxydo-réductrice, les défenses antioxydantes et la régulation rédox de

nombreux processus intracellulaires (Koedrith, Seo, 2011).

Cette enzyme est la seule à pouvoir prendre en charge la protéine thiorédoxine, gardée sous

forme réduite par l’enzyme, en présence du cofacteur NADPH. La thiorédoxine est une

protéine d’oxydo-réduction, composée de deux résidus cystine en son centre actif. Elle

existe sous forme dithiol-réduite ou sous forme disulfure oxydée. La forme oxydée est

réduite par l’enzyme Trr1, donnant la forme réduite qui participe à de nombreux processus

cellulaires. Il peut agit en tant que donneur d’électron pour de nombreuses enzymes, telles

que la ribonucléotide réductase, la vitamine K époxyde réductase, et la disulfure isomérase.

Il intervient également comme fixateur de radicaux libres et comme facteur endogène

activateur des récepteurs cytosoliques aux glucocorticoïdes (Mau, Powis, 1992a).

L’ensemble enzyme-substrat forme le système thiorédoxine, source importante

d’équivalents réducteurs, permettant le piégeage des radicaux libres (Mustacich, Powis,

2000).

La doxorubicine est un inhibiteur irréversible, temps-dépendant, de la thiorédoxine

réductase, avec une inhibition maximale à 24 heures. Elle mène à la diminution de la

production d’équivalents réducteurs et donc des défenses anti-oxydantes de la cellule. De

plus, étant donné que ce système thiorédoxine permet le fonctionnement de la

ribonucléotide réductase, seule enzyme catalysant la première étape de synthèse de l’ADN,

son inhibition conduit à l’arrêt de la croissance cellulaire (Mau, Powis, 1992b).

cccc. Perturbation de la chaîne mitochondriale de transport d’électrons par la . Perturbation de la chaîne mitochondriale de transport d’électrons par la . Perturbation de la chaîne mitochondriale de transport d’électrons par la . Perturbation de la chaîne mitochondriale de transport d’électrons par la doxorubicinedoxorubicinedoxorubicinedoxorubicine

La doxorubicine peut être à l’origine de la perturbation, directe ou indirecte, de la chaîne

mitochondriale de transport d’électrons.

� Effet direct

La doxorubicine présente une forte affinité pour les cardiolipides, molécules essentielles au

fonctionnement des complexes I, III et IV de la chaîne mitochondriale (Fry, Green, 1981).

L’inhibition des enzymes NADH-oxydase et succinate-oxydase pourrait donc être due à la

séquestration des cardiolipides par la doxorubicine, inhibant alors le transfert d’électrons au

sein de la chaîne respiratoire (Gilliam et al., 2013). De plus, la modification de l’activité

enzymatique de la chaîne mitochondriale pourrait être due à l’effet chaotropique de la

doxorubicine sur la membrane interne de la mitochondrie, à l’origine de l’inactivation des

enzymes succinate déshydrogénase et cytochrome c oxydase (Marcillat et al., 1989).

61

� Effet indirect

La doxorubicine peut également être à l’origine d’une perturbation indirecte de la chaîne

mitochondriale par modification du génome mitochondrial. En effet, l’intercalation au sein

de la double hélice d’ADN mitochondrial empêche la réplication et la transcription,

processus nécessaires à la synthèse des enzymes (Lebrecht et al., 2003).

Suite aux effets de la doxorubicine, la chaîne mitochondriale est non-fonctionnelle. Les

électrons sont alors détournés de leur but premier pour former des radicaux superoxydes à

partir du dioxygène moléculaire (Gilliam et al., 2013).

d. Les conséquences du stress oxydatif sur les composés cellulairesd. Les conséquences du stress oxydatif sur les composés cellulairesd. Les conséquences du stress oxydatif sur les composés cellulairesd. Les conséquences du stress oxydatif sur les composés cellulaires

La formation importante de ROS, dépassant les défenses anti-oxydantes de la cellule, est à

l’origine de dommages sur les différents constituants cellulaires. Cependant, ces ROS

n’auront qu’une action sur leur lieu de synthèse, ceux-ci étant très peu mobiles dans la

cellules (Halliwell, Gutteridge, 1984).

� La peroxydation lipidique

Au niveau membranaire, les ROS, notamment les plus toxiques, les radicaux hydroxyles, sont

à l’origine de la peroxydation des lipides. Les lipides peroxydés se forment selon un

mécanisme de réactions en chaîne (Benchekroun, Robert, 1992). Cette peroxydation

lipidique affecte le plus souvent les acides gras polyinsaturés, ceux-ci contenant plusieurs

doubles liaisons entre lesquels se trouvent des ponts méthylènes (-CH2-) présentant des

atomes d’hydrogènes fortement réactifs. La réaction consiste en trois étapes : l’initiation, la

propagation et la terminaison (Figure 26) (Ayala et al., 2014).

L’initiation est l’étape au cours de laquelle le radical acide gras est produit par réaction entre

un acide gras et des ROS.

Lors de la propagation, le radical acide gras est instable et réagit directement avec le

dioxygène moléculaire pour former un radical peroxyl-acide gras. Ce radical est également

instable et réagit avec un acide gras libre, produisant un radical acide gras différent et un

lipide hydroperoxyde, ou un peroxyde cyclique si le radical acide gras réagit avec lui-même.

Le nouveau radical acide gras réagit de même, ce qui est à l’origine d’une réaction en chaîne.

La phase de terminaison a lieu lorsque deux radicaux acides gras réagissent entre eux et

produisent une espèce non radical libre. Cela se produit lorsque la concentration en radicaux

est assez élevée pour qu’il y ait une forte probabilité de rencontre de deux radicaux. Les

antioxydants tels que la vitamine E peuvent également donner un atome d’hydrogène au

radical acide gras, formant un radical vitamine E qui va réagir avec un autre radical acide

gras, formant un produit non-radical.

62

Figure 26 : Mécanisme de peroxydation des lipides

1 : Phase d’initiation ; 2 : Phase de propagation ; 3 : Phase de terminaison par réaction de deux radicaux acide

gras ; 3’ : Phase de terminaison par réaction d’un radical acide gras et d’un radical peroxyl-acide gras ; 3’’ :

Phase de terminaison par réaction de deux radicaux peroxyl-acide gras.

Les principaux produits primaires de la peroxydation lipidique sont les lipides

hydroperoxydes. Ces lipides peuvent être la cible de réactions de réduction, à l’origine de

l’inhibition ou de l’induction de dégâts peroxydatifs, pouvant mener à la perte de l’intégrité

membranaire par altération de sa fluidité. De plus, contrairement aux ROS, les lipides

hydroperoxydes peuvent diffuser à travers les membranes et se lier aux lipides cellulaires du

cytoplasme et du noyau (Negre-Salvayre et al., 2008).

Parmi les nombreux dérivés carbonylés formés, les aldéhydes sont les produits secondaires

de la peroxydation lipidique les plus nombreux. Le malondialdéhyde (MDA) et le 4-

hydroxynonenal (4-HNE) ont été largement étudiés, le premier pour son effet mutagène et

le second pour sa forte toxicité cellulaire (Esterbauer, Cheeseman, 1990). Le MDA peut

former en l’absence de réparation, des adduits à l’ADN, à l’origine de mutations, de cassures

de brins, de l’arrêt du cycle cellulaire et de l’apoptose cellulaire (Marnett, 1999). Le 4-HNE

est quant à lui un messager cellulaire à l’origine de l’activation des différents processus de

mort cellulaire : apoptose, autophagie, nécrose et sénescence cellulaire.

En absence d’agents réducteurs, cette réaction de peroxydation peut aussi être médiée par

le complexe doxorubicine-fer(III). Le mécanisme est mal connu mais semble impliquer la

réduction du fer par la chaîne latérale de la doxorubicine. En effet, lors de l’utilisation de la

daunorubicine, analogue de la doxorubicine ne possédant pas de chaîne latérale oxydable, la

peroxydation lipidique est bien moindre que lors de l’utilisation de doxorubicine (Keizer et

al., 1990).

63

� Les dommages à l’ADN médiés par les ROS

Les agressions radicalaires créées au sein de la molécule d’ADN peuvent entraîner des

ruptures de brins, des modifications de bases azotées, de désoxyriboses et de groupements

phosphates ainsi qu’à la mise en place de cross-links ou d’adduits à l’ADN (Evans et al.,

2004). Ces effets entraînent alors une instabilité génétique et des mutations ponctuelles, qui

peuvent avoir de fortes conséquences sur la synthèse de protéines, la transmission de

l’intégrité du patrimoine génétique et la survie cellulaire (Vergely, Rochette, 2003). Par

exemple, la doxorubicine peut réduire l’expression des gènes gclc et gss codant pour le

glutathion, protéine impliquée dans la détoxification des ROS, et donc améliorer son action

cytotoxique (Leonel et al., 2014).

Cela nécessite la production de ROS au sein du noyau ou de la mitochondrie. Concernant la

mitochondrie, les dérivés réactifs sont produits à proximité de l’ADN. Pour le noyau, la

plupart des flavo-enzymes responsables de la réduction de la doxorubicine en semi-quinone

sont situées à l’extérieur de celui-ci et la semi-quinone n’est pas suffisamment stable pour

atteindre le noyau (Kalyanaraman, Baker, 1990). Les ROS ne diffusent pas non plus au sein

de la cellule, avec un rayon d’action effectif d’environ 30 Å pour les radicaux superoxydes et

hydroxyles. Il est donc nécessaire que les ROS soient formés à proximité de l’ADN. Il a été

suggéré que la formation de ROS par cycle d’oxydo-réduction de la doxorubicine puisse être

à l’origine de dommages sélectifs de l’ADN (Lown et al., 1982). Cependant, l’intercalation de

la doxorubicine au sein de la double-hélice d’ADN prévient sa réduction enzymatique et

diminue la production de ROS à proximité de l’ADN (Peters et al., 1986). Il se pourrait que la

doxorubicine intercalée puisse être réduite par une espèce réductrice diffusible de petite

taille telle que le peroxyde d’hydrogène. De même, il est également possible que la

production de ROS soit due à l’activation d’adduits à l’ADN de doxorubicine, dont la partie

chromophore est plus disponible que lorsque la doxorubicine s’intercale (Youngman, Elstner,

1984).

� Oxydation et inactivation des protéines

L’électron non apparié des ROS peut s’attaquer à la structure de certaines protéines, en

particulier les protéines porteuses d’un groupement thiol (-SH). C’est le cas de nombreuses

enzymes cellulaires et de protéines de transport qui vont ainsi être oxydées et pour

lesquelles on observe la formation de ponts disulfures intra- et intermoléculaire, ou une

dénaturation (Figure 27). Ces réactions peuvent altérer de façon marquée le métabolisme

cellulaire en modifiant la conformation et/ou l’activité biologique de ces protéines (Vergely,

Rochette, 2003).

Le stress oxydatif peut également être à l’origine de la carbonylation des protéines par

oxydation. Outre leur formation indirecte lors de la peroxydation lipidique, les dérivés

carbonylés peuvent être formés directement par oxydation des chaînes latérales des acides

aminés par des métaux ou le peroxyde d’hydrogène (Grimsrud et al., 2008). Les résidus

lysine, arginine et proline sont particulièrement concernés (Stadtman, Oliver, 1991).

64

Figure 27 : Oxydation des protéines porteuses d’un groupement thiol

L’oxydation des protéines est à l’origine de la modification de la structure et de la fonction

de la membrane, de la modification de récepteurs protéiques et des jonctions gap ainsi que

la stimulation ou de l’inhibition de l’activité enzymatique. Toutes ces modifications sont

susceptibles de déclencher les différents mécanismes de mort cellulaire (Suzuki et al., 2010).

e. Importance du stress oxydatif dans la cytotoxicité tumorale de la doxorubicinee. Importance du stress oxydatif dans la cytotoxicité tumorale de la doxorubicinee. Importance du stress oxydatif dans la cytotoxicité tumorale de la doxorubicinee. Importance du stress oxydatif dans la cytotoxicité tumorale de la doxorubicine Le stress oxydatif présente-t-il réellement un rôle dans la cytotoxicité tumorale de la

doxorubicine ? Son rôle exact est difficile à déterminer étant donné le nombre d’études

s’intéressant au sujet et présentant des résultats contradictoires.

Il subsiste des doutes sur la réalité du rôle des ROS dans la mort cellulaire des cellules

tumorales. Certaines études démontrent que la formation de radicaux hydroxyles résulte de

concentrations non pertinentes cliniquement en doxorubicine (Minotti et al., 2004). De plus,

la plupart des tumeurs solides contre lesquelles la doxorubicine présente une bonne

efficacité, sont clairement hypoxiques, remettant en cause la faisabilité de la chimie oxydo-

réductrice. Cependant, sous pression partielle faible en dioxygène, la peroxydation lipidique

médiée par le fer et les dommages à l’ADN par la semi-quinone sont effectivement

renforcés. Enfin, une supposition commune a été que les effets des ROS sur l’ADN sont peu

probables car les molécules intercalées ne pourraient pas être réduites. Cependant, la

doxorubicine liée de façon covalente aux oligonucléotides peut tout de même être

accessible aux dérivés réactifs (Peters et al., 1986).

65

Néanmoins, plusieurs faits viennent étayer le rôle du stress oxydatif. Premièrement,

certaines études montrent la présence de ROS intracellulaire lors du traitement avec de la

doxorubicine de cultures de cellules tumorales. De plus, la formation des ROS a été détectée

dans de nombreuses lignées tumorales, en intra- comme en extra-cellulaire (Ubezio, Civoli,

1994). Certaines lignées cellulaires résistantes à la doxorubicine montrent également une

augmentation des systèmes de défense contre le stress oxydatif, incluant une augmentation

du glutathion, molécule anti-oxydante, et cette résistance peut être diminuée par des agents

diminuant la concentration en glutathion (Dusre et al., 1989). Une augmentation d’un

rapport de quatre de la surexpression de la superoxyde dismutase dans certaines lignées

tumorales est à l’origine d’une augmentation de la résistance à la doxorubicine de 250 %,

tandis que l’inhibition de la superoxyde dismutase augmente sa cytotoxicité (Chabner,

Longo, 2011). Finalement, des bases oxydées de l’ADN par les produits du cycle

d’oxydoréduction sont présentes dans les urines et les cellules mononuclées du sang

périphérique chez des patients recevant de la doxorubicine (Doroshow et al., 2001).

Il y a donc bien un cycle redox dans les cellules après traitement par de la doxorubicine.

Cependant on ne sait pas si cela a lieu dans tous les types tumoraux et son importance réelle

dans les mécanismes d’action divers de la doxorubicine reste méconnue.

3333. La formation d’adduits, conséquence de la réactivité de la doxorubicine. La formation d’adduits, conséquence de la réactivité de la doxorubicine. La formation d’adduits, conséquence de la réactivité de la doxorubicine. La formation d’adduits, conséquence de la réactivité de la doxorubicine

En génétique moléculaire, les adduits à l’ADN résultent de la fixation d’une molécule à un

site nucléophile de l’ADN par liaison covalente. Ces adduits peuvent modifier l’expression de

gènes et participer à la cancérogénèse (Hemminki, 1993).

La doxorubicine peut être à l’origine de la formation d’adduits à l’ADN par différents

mécanismes :

� Par chélation directe de la molécule de doxorubicine avec l’ADN, médiée par la

formation de formaldéhyde.

� Par réduction à un ou deux électrons de la doxorubicine, à l’origine de la formation

d’agents alkylants.

L’apparition des adduits à l’ADN induit principalement des cross-links au sein de l’ADN à

l’origine de cassures double-brins et de l’inhibition des processus de transcription et de

réplication, à l’origine d’un arrêt du cycle cellulaire, principalement en phase S. Cela stimule

également les mécanismes de réparation de l’ADN et les voies de signalisation responsables

de l’induction de l’apoptose et de la nécrose cellulaire (Cutts et al., 2005). Cependant, cette

formation d’adduits ne semble pas être le mécanisme d’action majeur de la doxorubicine

étant donné que les doses cliniques résultent en la formation de seulement 4,4 +/- 1 adduits

pour 107 paires de bases (Yang et al., 2014).

66

a. Adduit à l’ADN par chélation directe de la doxorubicinea. Adduit à l’ADN par chélation directe de la doxorubicinea. Adduit à l’ADN par chélation directe de la doxorubicinea. Adduit à l’ADN par chélation directe de la doxorubicine

Il a longtemps été pensé que toutes les molécules de doxorubicine présentes dans le noyau

s’intercalaient au sein de l’ADN. Des études de microscopie par fluorescence sur des cellules

tumorales traitées par de la doxorubicine ont révélé la présence d’un intense noyau

fluorescent, interprété à l’époque comme une mesure de l’intercalation de la doxorubicine

au sein de l’ADN. Or, il a été démontré depuis que ce n’est pas l’augmentation de la

fluorescence mais sa diminution qui signe l’intercalation au sein de l’ADN. La fluorescence

serait probablement due à une liaison de la doxorubicine à des composants nucléaires par

un mécanisme non-intercalant. En réalité, la doxorubicine forme des adduits à l’ADN, sous

des conditions favorisant la chimie oxydo-réductrice fer-dépendante (Chabner, Longo, 2011).

Ce mécanisme aurait lieu pour des concentrations entre 50 µM et 1 mM (Cummings, et al.,

1991).

Lors de la formation d’adduits à l’ADN, la doxorubicine se lie par une liaison covalente à la

guanine d’un des brins d’ADN et par des liaisons hydrogènes à une guanine de l’autre brin de

la double hélice d’ADN (Figure 28) (Yang et al., 2014).

Figure 28 : Structure du complexe doxorubicine-ADN par liaison covalente (en rouge)

Plus précisément, une étude de footprinting à l’ADN in vitro en 1990 révèle l’existence de

sites spécifiques où ces adduits se forment sur l’ADN (Cullinane, Phillips, 1990). En présence

de séquences 5’-GCN-3’, le chromophore de la doxorubicine s’intercale entre les bases

azotées C et N de la séquence. La doxorubicine est liée à l’ADN par une liaison covalente

unique, se formant entre la fonction amine en 3’ de la partie daunosamine de la

doxorubicine et la fonction amine exo-cyclique en 2 de la base azotée guanine. Cette liaison

covalente nécessite la présence de formaldéhyde, lequel réagit avec la fonction amine de la

doxorubicine pour former un composé intermédiaire correspondant à deux molécules de

doxorubicine liées entre elles par trois groupements méthylènes, et appelé DOXform (Yang

et al., 2014).Cet intermédiaire est ensuite hydrolysé pour former une base de Schiff réactive,

métabolite actif se liant alors à l’ADN (Figure 29) (Minotti et al., 2004). L’adduit alors formé

est stabilisé par des liaisons hydrogènes avec le second brin de la double hélice d’ADN.

67

Ce composé intermédiaire DOXform présente une absorption accélérée par les cellules, avec

un temps de rétention nucléaire et une cytotoxicité plus importants. Ce composé est 200

fois plus cytotoxique que la doxorubicine seule et est particulièrement cytotoxique pour les

cellules cancéreuses résistantes à la doxorubicine (Swift et al., 2006).

Figure 29 : Formation du composé intermédiaire DOXform, hydrolyse en un métabolite actif,

et mécanismes de formation d’adduits doxorubicine-ADN D’après Minotti et al. (2004).

68

Les conditions optimales de formation in vitro et in vivo de ces adduits ne sont pas encore

connues en détail mais la formation optimale se déroulerait à pH 7 et nécessite la présence

d’ADN double-brins et de formaldéhyde. Le formaldéhyde provient de l’oxydo-réduction

médiée par le fer d’une source cellulaire de carbone (lipides, spermine), formant des

radicaux libres (Taatjes et al., 1996). Le formaldéhyde peut également provenir de

l’oxydation de la doxorubicine. D’importants niveaux en formaldéhyde ont été décelé dans

les cellules tumorales, en comparaison avec des cellules normales, suggérant la formation de

plus d’adduits au niveau des cellules tumorales, en addition de la sélectivité primaire offerte

par la vitesse de réplication des cellules tumorales (Cutts et al., 2005).

Ces adduits présentent une labilité à la chaleur et dans les milieux alcalins. La liaison

covalente est instable avec une demi-vie entre 5 et 40 heures à 37°C, dépendant de la

séquence d’ADN concernée, de la longueur du fragment et de la méthode d’analyse. Celle-ci

peut être maintenue à basse température (Cutts et al., 2003).

Chez l’homme, des pro-drogues à l’origine d’un relargage de formaldéhyde, tel que le

pivaloyloxymethyl butyrate, peuvent être utilisés pour améliorer la concentration

intracellulaire en formaldéhyde. Le formaldéhyde réagit avec la doxorubicine et induit la

formation d’adduits doxorubicine-ADN et une réponse cytotoxique synergique des cellules

tumorales (Swift et al., 2006).

b. Adduits à l’ADN par formation d’agents alkylantsb. Adduits à l’ADN par formation d’agents alkylantsb. Adduits à l’ADN par formation d’agents alkylantsb. Adduits à l’ADN par formation d’agents alkylants La réduction à un ou deux électrons de la doxorubicine est à l’origine de la formation de

composés radicaux libres, le radical quinone méthode et le radical libre semi-quinone en C7.

Ces deux espèces réactives peuvent agir en tant qu’agent alkylant monofonctionnel de l’ADN

et former des adduits à l’ADN en réagissant avec l’un des deux brins de la double hélice

d’ADN (Figure 30) (Powis, 1987).

Figure 30 : Adduits à l’ADN formé par alkylation monofonctionnelle à partir du radical

méthide quinone

Figure 31 : Rôle de la réactivité chimique de la doxorubicine à l’origine de sa cytotoxicité cellulaire

69

70

La doxorubicine est une espèce chimique réactive, subissant diverses réactions

(Figure 31) :

� Une réduction à un électron

• En milieu aérobie, à l’origine de la formation d’un radical semi-quinone

très réactif, menant à la formation de ROS, dont le radical hydroxyle,

composé cellulaire hautement réactif.

• En milieu anaérobie, à l’origine de la formation d’un radical libre en C7

mono-alkylant après auto-oxydation du radical semi-quinone.

� Une réduction à deux électrons, à l’origine de la formation d’une quinone

méthide instable, agent mono-alkylant.

� Une complexation avec le fer (III) intracellulaire, à l’origine de la formation de

ROS.

Cette réactivité de la doxorubicine présente plusieurs conséquences :

� Un stress oxydatif, dû aux ROS, à une diminution des défenses anti-oxydantes

de la cellule ou à une perturbation de la chaine mitochondriale. Ce stress

cellulaire présente de nombreux effets à l’origine de la cytotoxicité de la

doxorubicine et de la mort cellulaire :

→ La peroxydation lipidique, principalement due aux ROS. Elle est à

l’origine d’une perturbation des membranes cellulaires et à la formation

de seconds messagers déclenchants les différentes voies de mort

cellulaire.

→ Les dommages à l’ADN médiés par les ROS.

→ L’oxydation et l’inactivation des protéines cellulaires, principalement

thiols. Ce phénomène est à l’origine de la perturbation de nombreuses

réactions enzymatiques et voies de communications intracellulaires.

� La formation d’adduits à l’ADN, soit directement par la doxorubcine, soit par les

dérivés mono-alkylants formés lors de la réduction à un ou deux électrons de la

doxorubicine.

71

C. Effets de la doxorubicine sur les membranes plasmiquesC. Effets de la doxorubicine sur les membranes plasmiquesC. Effets de la doxorubicine sur les membranes plasmiquesC. Effets de la doxorubicine sur les membranes plasmiques

1. Rappel sur la structure des membranes plasmiques1. Rappel sur la structure des membranes plasmiques1. Rappel sur la structure des membranes plasmiques1. Rappel sur la structure des membranes plasmiques

La membrane plasmique correspond à une enveloppe limitant la cellule ou différents

organites cellulaires. Elle est constituée d’une double couche de phospholipides dans

laquelle se trouvent insérées de nombreuses molécules (protéines, glycoprotéines et glyco-

phospholipides). L’ensemble constitue une « mosaïque fluide » (Singer, Nicolson, 1972).

Dans les membranes, les lipides sont distribués de manière hétérogène au niveau de

microdomaines dynamiques. Les domaines enrichis en cholestérol, en sphingolipides et en

lipides saturés formeraient une phase dite « solide », et appelée radeaux lipidiques. Ces

radeaux lipidiques sont des structures d’environ 70 nm et représentant 10 à 30 % de la

surface membranaire. Ils sont insérés au sein d’une matrice membranaire moins ordonnée,

dite phase « fluide » (Figure 32) (Gerlier et al., 2004). La fonction de plusieurs protéines

membranaires serait fortement dépendante de leur association avec ces domaines, comme

par exemple la glycoprotéine P (Eckford, Sharom, 2008).

Figure 32 : Organisation de la membrane plasmatique et notion de radeaux lipidiques

D’après Gerlier et al. (2004).

La membrane plasmique présente de nombreux rôles. Elle sépare deux milieux tout en

maintenant la communication et les échanges entre ces deux milieux. Elle assure la

reconnaissance de signaux et de molécules provenant du milieu extérieur grâce à des

récepteurs moléculaires spécifiques. Elle régule également les flux membranaires d’ions et

de molécules. Ces différentes fonctions sont permises par la fluidité membranaire,

dépendante de facteurs externes tels que la température, et de facteurs internes :

composition en acides gras, proportion de cholestérol, proportion de protéines (Kraft, 2013).

Une altération de cette fluidité membranaire est à l’origine d’un dysfonctionnement de la

membrane et donc à une perte de ses principales fonctions.

72

2. Effets de la doxorubicine sur les membranes plasmiques2. Effets de la doxorubicine sur les membranes plasmiques2. Effets de la doxorubicine sur les membranes plasmiques2. Effets de la doxorubicine sur les membranes plasmiques

La membrane plasmique présente plusieurs avantages en tant que cible de l’action des

anticancéreux (Tritton, Hickman, 1985). En effet, celle-ci correspond à la première structure

cellulaire rencontrée par la molécule. De plus, la surface membranaire est intimement

impliquée dans la régulation des fonctions biologiques et dans les voies de signalisation

intracellulaires, la perturbation de celle-ci peut donc être cytotoxique. Enfin, les surfaces

membranaires de cellules tumorales incluent des substrats pour produits oncogènes,

absents au niveau des cellules non tumorales (Amini, Kaji, 1983). Cette différence peut être

exploitée par les molécules anti-cancéreuses.

L’action de la doxorubicine au niveau des membranes lipidiques est de plus renforcée par

une forte affinité pour les lipides membranaires chargés négativement, et notamment les

cardiolipides, constituant majeur de la membrane interne mitochondriale (Goormaghtigh et

al., 1980). Les principaux effets de la doxorubicine au niveau des membranes plasmiques

sont une perturbation de la fluidité et de la perméabilité membranaire ainsi qu’une

modification de certaines voies de signalisation intracellulaires.

a. Perturbation de la fluidité et de la perméabilité membranairea. Perturbation de la fluidité et de la perméabilité membranairea. Perturbation de la fluidité et de la perméabilité membranairea. Perturbation de la fluidité et de la perméabilité membranairessss par la par la par la par la doxorubicinedoxorubicinedoxorubicinedoxorubicine

La perturbation de la fluidité membranaire représenterait le mode d’action principal de la

doxorubicine au niveau de la membrane plasmique. Il est cependant difficile d’interpréter ce

phénomène étant donné que de nombreuses molécules non anticancéreuses influencent la

fluidité membranaire par des interactions non spécifiques (Jain et al., 1975). Cette

perturbation de la fluidité membranaire est liée à plusieurs mécanismes, dont les plus

importants sont la peroxydation lipidique et l’intercalation de la doxorubicine au sein de la

bicouche lipidique.

� La peroxydation lipidique

Une des actions de la doxorubicine sur la fluidité membranaire est la peroxydation lipidique

par production de ROS (cf partie III.B). Ces espèces réactives augmentent les teneurs en

acides gras présentant un groupement acyle, résultant en un réarrangement de l’état

physique de la membrane, diminuant alors la fluidité membranaire. D’autres modifications

par les ROS peuvent être à l’origine d’une variation de la fluidité membranaire : des

changements conformationnels des protéines membranaires, une agrégation des protéines

du cytosquelette ou bien des modifications entre les différents constituants de la membrane

(Peetla et al., 2010).

� L’intercalation de la doxorubicine au sein de la bicouche lipidique

La doxorubicine s’intercale dans la partie hydrocarbonée de la bicouche lipidique, avec une

meilleure pénétration dans la phase fluide que dans la phase solide. Cela augmenterait la

rigidité de la membrane, indépendamment de la concentration de doxorubicine (Speelmans

et al., 1997). Plus précisément, on observe deux comportements de la doxorubicine selon

73

les différentes régions membranaires. La doxorubicine augmente la fluidité membranaire

des chaînes acyl des phospholipides dans la phase dite « solide », et diminue la micro-

viscosité dans la phase « fluide » de la bicouche lipidique. En parallèle, la doxorubicine

diminue la micro-viscosité des têtes de phospholipides. L’ensemble de ces modifications

résultent en une diminution de la fluidité membranaire (Alves et al., 2017).

La doxorubicine est également à l’origine d’une modification de la perméabilité

membranaire par altération de la fluidité membranaire. Celle-ci modifie les interactions des

lipides entre eux et avec les autres constituants membranaires, à l’origine d’une

modification des caractéristiques physico-chimiques de la membrane, influençant alors de la

diffusion passive de certaines molécules (Oth et al., 1987).

b. Modifications de la voie de signalisation des céramidesb. Modifications de la voie de signalisation des céramidesb. Modifications de la voie de signalisation des céramidesb. Modifications de la voie de signalisation des céramides

La doxorubicine est à l’origine d’une modification de certaines voies de signalisation

intracellulaires par modification de structures membranaires, dont celle des céramides.

Un céramide est un sphingolipide, résultant de la combinaison d’une base à longue chaîne

(sphingosine ou dihydrosphingosine) et d’un acide gras lié par une liaison amide. Ces

molécules sont présentes dans les membranes cellulaires, où elles entrent dans la

constitution des sphingomyélines. En plus de jouer un rôle structurel dans les membranes

biologiques, elles peuvent intervenir dans la signalisation lipidique (Kitatani et al., 2008).

L’accumulation de céramides peut induire la différenciation, l’apoptose ou bien la

sénescence cellulaire. Dans tous les cas, la modification de la concentration intracellulaire en

céramides précède ces effets cellulaires lors d’un stress. Différents agents exogènes peuvent

être à l’origine de ce stress cellulaire : le TNF-α, l’interleukine-1, l’acide rétinoïque, les

prostaglandines, les radiations ionisantes et certains agents de chimiothérapie dont la

doxorubicine (Hannun, 1996).

Il existe différentes sources d’accumulation de céramides en réponse à ces stimuli, par

modulation des enzymes impliquées dans leur synthèse ou leur métabolisme (Figure 33) :

� L’induction de la sphingomyélinase neutre : la sphingomyéline, lipide membranaire,

est considérée comme le précurseur majeur de production des céramides. La

sphingomyélinase neutre est l’enzyme principale de production des céramides à

partir de la sphingomyéline.

� L’activation de la céramide synthase : située dans le réticulum endoplasmique, la

céramide synthase permet la production de céramides à partir de la sphinganine.

� La modification du métabolisme des céramides : la production de céramide peut

également être accrue par l’inhibition de la céramidase, ou par l’activation de la

céramide synthase.

74

Figure 33 : Métabolisme des céramides et effets de la doxorubicine

Deux théories s’affrontent concernant l’origine de l’augmentation de la concentration en

céramides intracellulaires lors de l’utilisation de doxorubicine. D’une part, les céramides

s’accumuleraient selon une cinétique d’apparition biphasique transitoire, dans les minutes

suivant l’exposition à la doxorubicine. Cela impliquerait une augmentation modeste de

l’accumulation de céramide, de l’ordre de 1,5 fois. Cette augmentation résulterait de

l’activation de la sphingomyélinase neutre (Jaffrézou et al., 1996). D’autre part, les

céramides s’accumuleraient selon une cinétique d’apparition progressive durant plusieurs

heures, pour une augmentation de trois à cinq fois la concentration initiale. Cette

augmentation résulterait principalement de l’activation de la céramide synthase, mais

n’exclut pas l’intervention de l’induction de sphingomyélinases dans une phase initiale (Lucci

et al., 1999) (Liu et al., 2001).

L’accumulation de céramides en intracellulaire est à l’origine du déclenchement de

l’apoptose cellulaire même si le mécanisme précis n’est pas connu. Il semblerait que les

céramides puissent activer l’apoptose en stimulant à la fois la voie intrinsèque et la voie

extrinsèque. Les céramides seraient à l’origine d’une régulation positive du ligand FasL,

stimulant alors les récepteurs de mort cellulaire et la voie extrinsèque. De plus, ils seraient à

l’origine du relargage du cytochrome c de la membrane mitochondriale, stimulant la voie

intrinsèque de l’apoptose (cf partie III.D.1) (Delpy et al., 1999).

La doxorubicine interagit également avec la membrane cellulaire, à l’origine d’une

perturbation de la fluidité et de la perméabilité membranaire, soit à cause de la

peroxydation lipidique, provoquant des modifications de la composition et des

interactions entre composants de la membrane, soit par intercalation directe au sein de

la bicouche lipidique.

La doxorubicine est également à l’origine d’une modification de voies de signalisation

intracellulaires, dont celle des céramides. Elle augmente la concentration intracellulaire

de céramides, stimulant ainsi l’apoptose.

75

D. Les différents mécanismes de mort cellulaire doxorubicineD. Les différents mécanismes de mort cellulaire doxorubicineD. Les différents mécanismes de mort cellulaire doxorubicineD. Les différents mécanismes de mort cellulaire doxorubicine----induitsinduitsinduitsinduits

Plusieurs études ont suggéré que les mécanismes d’action moléculaire décrits

précédemment tels que l’inhibition de la synthèse d’ADN par intercalation de la

doxorubicine au sein de la molécule d’ADN, l’inhibition des ADN topoisomérases de type II

ou la production de ROS, seraient à l’origine de la mort ou de l’arrêt de la croissance

cellulaire (Gewirtz, 1999). Outre l’apoptose, d’autres mécanismes cellulaires cellulaire ont

été décrits : l’autophagie cellulaire, la sénescence cellulaire et la nécrose cellulaire (Di et al.,

2009).

1. L’apoptose cellulaire1. L’apoptose cellulaire1. L’apoptose cellulaire1. L’apoptose cellulaire

Aussi appelée mort cellulaire programmée, l’apoptose cellulaire est un processus

physiologique d’autodestruction cellulaire sous l’impulsion d’un signal, permettant

l’élimination de cellules dites « inutiles » pour l’organisme. C’est un processus biologique

naturel impliqué dans la croissance normale et le développement de l’organisme. Elle est

habituellement considérée comme une forme de défense de l’organisme. Elle est activée en

réponse à des dommages ou des altérations de l’ADN, tuant la cellule afin de prévenir la

réplication et l’apparition d’autres mutants (Edinger, Thompson, 2004). La cellule

apoptotique est caractérisée par la condensation et la fragmentation nucléaires avec la

formation de corps apoptotiques, identifiés et éliminés par les phagocytes. Au cours du

processus apoptotique, les membranes sont conservées, évitant ainsi toute réaction

inflammatoire.

La plupart, si ce ne sont toutes les cellules, contiennent des facteurs nécessaires au

déclenchement de l’apoptose. Cependant, ces facteurs, tels que les caspases, sont à l’état

inactif dans la cellule. La mort cellulaire provient alors de l’activation de ces facteurs, initiée

par une large variété de conditions qui sont considérées comme imparfaites par la cellule.

L’apoptose cellulaire se déroule principalement via des voies caspases-dépendantes, celles-ci

pouvant être extrinsèque ou intrinsèque.

La voie extrinsèque est initiée par des ligands extra-cellulaires divers tels que le Fas ligand

(FasL), le Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) ou le TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand

(TRAIL). Ceux-ci se lient à des récepteurs de mort pro-apoptotiques situés au niveau de la

membrane cellulaire. Ces récepteurs de mort sont couplés à la procaspase-8 par une

protéine transmembranaire associée, nommée Fas-Associated Death Domain (FADD). La

liaison d’un ligand au niveau du récepteur induit la formation d’un complexe de haut poids

moléculaire appelé Death Inducing Signal Complex (DISC). Ce complexe est constitué de la

protéine FADD et de la procaspase-8, à l’origine de l’auto-clivage de celle-ci en caspase-8

initiatrice, activant à son tour les caspases effectrices -3, -6 et -7. Celles-ci sont à l’origine de

l’apoptose par activation du système de DNases activées par les caspases Figure 34(Tacar et

al., 2013). La doxorubicine joue le rôle d’inducteur de la voie extrinsèque, via la régulation

de Fas. Plusieurs hypothèses existent sur le rôle exact de la doxorubicine dans l’induction de

la voie extrinsèque. Son action pourrait se faire via la régulation négative de l’expression de

Fas soluble, un inhibiteur de FasL (Zhang et al., 2009). Une autre possibilité serait l’activation

76

par la doxorubicine de la voie calcium/calcineurine, à l’origine de l’activation du Nuclear

Factor Activated T-cell 4 (NFATc4), lui-même à l’origine d’une régulation positive de FasL

(Kalivendi et al., 2005). La doxorubicine est également à l’origine de l’activation du Nuclear

Factor-kappa B (NF-κB) via la production de ROS, menant à la régulation positive de

plusieurs gènes pro-apoptotiques tels que fas, myc ou p53 (Wang et al., 2002).

Figure 34 : Rôle de la doxorubicine dans l’activation des voies extrinsèque et intrinsèque de

l’apoptose cellulaire Traduit et adapté de l’anglais d’après Meredith et al (2016).

AMPK : AMP-activated protein kinase ; Apaf-1 : apoptotic protease-activating factor-1 ; Bax : Bcl-2-associated X

; Bcl-2 : B-cell leukaemia/lymphoma 2 ; FADD : Fas-associated death domain ; FasL : Fas ligand ; JNK : c-Jun N-

terminal kinase ; mTORC1 : mammalian target for rapamycin complex 1 ; TNF-a : tumour necrosis factor alpha ;

and TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand.

La voie intrinsèque est quant à elle médiée par la famille de protéines anti-apoptotiques de

la famille B-cell leukaemia/lymphoma 2 (Bcl-2), dont les membres sont présents à la surface

membranaire des mitochondries. La doxorubicine initie la mort cellulaire par apoptose en

induisant l’activation de l’AMP kinase (AMPK), activant à son tour p53 et la c-Jun N-terminal

kinase (JNK), et inactivant la mammalian target for rapamycin complex 1 (mTORC1).

L’augmentation d’expression du gène p53 induit une régulation négative de la protéine anti-

apoptotique Bcl-2 et une régulation positive de la protéine pro-apoptotique Bcl-2-associated

X (Bax). La doxorubicine est donc à l’origine d’une altération du ratio Bcl-2/Bax, facteur clé

du devenir de la cellule (Chen et al., 2011). Cette altération mène à la libération du

cytochrome c et d’autres facteurs mitochondriaux de la membrane interne mitochondriale

tels que l’apoptosis inducing factor (AIF). Le cytochrome c forme alors un complexe de

l’apoptosome avec l’apoptotic protease-activating factor-1 (Apaf-1) et la procaspase-9,

permettant l’activation de cette dernière en caspase-9, initiatrice de l’apoptose. Une fois

activée, celle-ci quitte le complexe de l’apoptosome et active les caspases effectrices -3, -6

et -7, à l’origine de l’apoptose cellulaire (Figure 34) (Meredith, Dass, 2016).

77

Bien que les voies extrinsèque et intrinsèque présentent un fonctionnement indépendant, le

chevauchement des deux voies à parfois lieu. En effet, il semblerait par exemple que la

protéine p53 puisse réguler positivement certains récepteurs pro-apoptotiques de la voie

extrinsèque ou que la caspase-8 puisse augmenter l’expression du gène codant pour la

protéine Bax, déclenchant alors la voie intrinsèque de l’apoptose (Ashkenazi, Herbst, 2008).

2. L'autophagie cellulaire2. L'autophagie cellulaire2. L'autophagie cellulaire2. L'autophagie cellulaire

L’autophagie cellulaire, ou autophagocytose, correspond à la dégradation d’une partie du

cytoplasme de la cellule par ses propres lysosomes (Lockshin, Zakeri, 2004). C’est un

processus biologique catabolique naturel impliqué dans le maintien de l’homéostasie

cellulaire, communément impliqué dans le turn-over des organites et des protéines longue

vie, ainsi que dans la dégradation des organites non fonctionnels et des agrégats protéiques

(Lee et al., 2012). Au cours de ce processus, les macromolécules et les organites sont

dégradés par les lysosomes et recyclés en énergie et nutriments. Selon les conditions de vie

cellulaire, l’autophagie peut être cytotoxique ou cytoprotectrice. Lors des stades précoces de

développement tumoral, l’autophagie permettrait l’élimination des protéines non

fonctionnelles qui pourrait concourir à la transformation d’une cellule saine en cellule

tumorale (Karantza-Wadsworth et al., 2007). Cependant, lors du développement tumoral,

l’autophagie permettrait la survie des cellules tumorales en les protégeant des ROS et en

supprimant les organites et protéines non fonctionnels (Hart et al., 2012).

La doxorubicine peut induire le processus d’autophagie via le stress oxydatif résultant de la

production de ROS au niveau de la mitochondrie. Ces dérivés provoquent un

dysfonctionnement de la chaîne respiratoire de la mitochondrie et une perturbation de la

production d’énergie, à l’origine d’un état de faible énergie cellulaire et de l’augmentation

du ratio AMP/ATP. On observe alors une activation de la kinase calmoduline-dépendante et

de l’AMPK, responsable de l’activation de la JNK et de l’inhibition de mTOR.

a. Rôle de l’inhibition de mTOR dans la régulation de l’autophagie cellulairea. Rôle de l’inhibition de mTOR dans la régulation de l’autophagie cellulairea. Rôle de l’inhibition de mTOR dans la régulation de l’autophagie cellulairea. Rôle de l’inhibition de mTOR dans la régulation de l’autophagie cellulaire

La régulation de l’autophagie est réalisée par une famille de gènes, appelés Autophagy-

related genes (Atg), via des interactions avec des complexes protéiques formés durant le

processus d’autophagie. L’activation ou l’inhibition de l’autophagie cellulaire est dépendante

de la protéine mTOR, normalement responsable de la phosphorylation des protéines Atg13

et Unc-like-51 kinase 1 (Ulk 1). Durant la privation en mTOR, la dissociation de celui-ci avec le

complexe Atg13-FIP200-Ulk1 résulte en la déphosphorylation d’Atg13 et d’Ulk1. Cela active

Ulk1 qui phosphoryle à son tour Atg13 et la focal adhesion kinase family interacting protein

of 200 kDa (FIP200), aboutissant à la formation d’une membrane pré-autophagosomale

(Figure 35).

78

b. Rôle de l’activation de la cb. Rôle de l’activation de la cb. Rôle de l’activation de la cb. Rôle de l’activation de la c----Jun NJun NJun NJun N----terminal kinase (JNK) dans l’autophagie terminal kinase (JNK) dans l’autophagie terminal kinase (JNK) dans l’autophagie terminal kinase (JNK) dans l’autophagie cellulairecellulairecellulairecellulaire

La suite du processus nécessite la maturation de l’autophagosome, sous contrôle de la

vacuolar-sorting protein 34 (Vps34), aussi connue sous le nom de phosphoinositide 3-kinase

de classe III (PI3K). La protéine Vps34 est activée en formant un complexe protéique avec

beclin-1, Vps15 et est renforcée par le Bax-interacting factor-1 (Bif-1) et le gène associé à la

résistance aux radiations UV (UVRAG). Vps34 interagit alors avec la protéine Atg1 pour

former l’autophagosome (Figure 35). La formation de ce complexe protéique est régulée par

la dissociation de Bcl-2 avec beclin-1 par JNK, stoppant l’inhibition de beclin-1 par Bcl-2 et

permettant sa complexation avec Vps34.

Figure 35 : Rôle de la doxorubicine dans l’induction de l’autophagie cellulaire

Traduit et adapté de l’anglais d’après Meredith et al (2016). AMP : adenosine monophosphate ; AMPK :AMP-activated protein kinase ; Atg : AuTophaGy-related ; ATP :

adenosine triphosphate ; Bcl-2 : B-cell leukaemia/lymphoma 2 ; Bif-1 : Bax interacting factor-1 ; FIP200 : focal

adhesion kinase family interacting protein of 200kDa ; JNK : c-Jun N-terminal kinase ; mTOR : mammalian target

for rapamycin ; PARP-1 : poly(ADP-ribose) polymerase-1 ; Ulk-1 : Unc-like-51 kinase 1 ; UVRAG : ultraviolet

radiation resistance-associated gene ; and Vps : vacuolar-sorting protein.

79

Une voie alternative de stimulation de l’autophagie cellulaire par la doxorubicine est

possible par l’activation de la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1), responsable de

l’inhibition de mTOR durant des périodes de stress cellulaire dues à une carence en

nutriments (Rodríguez-Vargas et al., 2012).

Il a été suggéré qu’un faible niveau d’autophagie promeut la survie cellulaire en prévenant

l’apoptose cellulaire, tandis qu’une augmentation significative de l’autophagie est à l’origine

de la mort cellulaire par dégradation excessive des organites et des macromolécules,

modifiant l’homéostasie cellulaire. La présence ou non de caspases semble également être

un facteur important dans le mécanisme cellulaire de cytotoxicité, l’absence ou l’inhibition

de ces protéines pouvant donner lieu au passage d’un processus d’apoptose à celui

d’autophagie (Edinger, Thompson, 2004).

3. La sénescence cellula3. La sénescence cellula3. La sénescence cellula3. La sénescence cellulaireireireire

La sénescence cellulaire est un état cellulaire dans lequel la cellule ne peut plus se diviser

mais reste métaboliquement active. En pratique, cela correspond à un blocage du cycle

cellulaire entre la phase G2 et la phase M et entre la phase G1 et la phase S. Deux types de

sénescence cellulaire sont classiquement décrites. La sénescence réplicative, ou

télomérique, impliquant un arrêt de la croissance due à un raccourcissement télomérique

après un nombre prédéterminé de divisions cellulaires dans des cellules non modifiées

(Gewirtz, 2014). La sénescence prématurée, aussi appelée sénescence accélérée ou induite

par le stress, pouvant se produire en présence d’oncogènes afin de tenter d’empêcher ou

bien de reporter la transformation cellulaire ou lors d’utilisation d’agents de chimiothérapie

(Gewirtz et al., 2008). Lors du développement tumoral, la sénescence prématurée présente

une dualité de fonction. Celle-ci permet un arrêt de croissance prolongée des cellules

tumorales mais elle peut aussi refléter une forme de dormance pour les cellules tumorales

qui pourrait être annulée par des stimuli exogènes (Di et al., 2009).

L’induction de la sénescence prématurée présente des similarités avec l’apoptose et d’autres

voies inhibant la croissance cellulaire. L’administration de doxorubicine induit la synthèse de

la protéine p53, laquelle régule positivement la protéine p21, à l’origine de l’arrêt du cycle

entre les phases G1 et S, et négativement la cyclin-dependant kinase-1 (cdk1), aussi appelée

cell-division cycle-2 (cdc2), à l’origine de l’arrêt du cycle entre les phases G2 et M (Figure 36).

Ce processus cellulaire a lieu en l’absence de la protéine p53, indiquant que p21 et cdk1 ont

un rôle vital dans l’induction de la sénescence alors que la protéine p53 ne semble pas jouer

un rôle critique.

La sénescence prématurée ne semble pas être le mécanisme d’action cellulaire principal de

la doxorubicine mais plutôt être un mécanisme alternatif utilisé dans les cellules où

l’apoptose est inhibée (Rebbaa et al., 2003).

80

Figure 36 : Rôle de la doxorubicine dans l’induction de la sénescence prématurée

Traduit et adapté de l’anglais d’après Meredith et al (2016). Cdc2 : cell-division cycle 2 ; and cdk1 : cyclin-dependent kinase-1

4. La nécrose cellul4. La nécrose cellul4. La nécrose cellul4. La nécrose cellulaireaireaireaire

La nécrose cellulaire est un processus passif résultant de la diminution de production d’ATP à

un niveau rendant la survie cellulaire impossible, menant à une catastrophe bio-énergétique

et à la mort cellulaire prématurée et non programmée. Cela pourrait être dû à des

dommages physiques ou toxiques, suggérant que les activités cytotoxiques de la

doxorubicine, incluant les dommages à l’ADN et le stress oxydatif, pourraient mener à une

nécrose cellulaire (Edinger, Thompson, 2004).

Lors d’un déficit en protéine p53 ou en protéines de la famille Bcl-2, notamment la protéine

Bax, le mécanisme d’apoptose est altéré. Le processus de nécrose cellulaire autorise à la

doxorubicine de rester active, indépendamment de p53 ou de Bax.

La doxorubicine induit la nécrose cellulaire par deux voies distinctes (Figure 37) :

� La doxorubicine est à l’origine de la synthèse de ROS et d’une perturbation de

l’homéostasie calcique, menant à l’ouverture cyclophiline D-dépendante des

pores de transition de perméabilité membranaire et à un œdème

mitochondrial. Cela perturbe la production d’énergie mitochondriale et

diminue le pool d’ATP cellulaire, déclenchant la nécrose cellulaire (Wallace,

2007).

� Par ses différents mécanismes d’action moléculaire, la doxorubicine

endommage l’ADN. Cela est à l’origine de l’activation de PARP-1 et du H2A

histone family member X (H2AX). PARP-1 est une protéine réparatrice de

l’ADN qui initie le processus de nécrose cellulaire (Feoktistova, Leverkus,

2015). Son activation excessive est à l’origine d’une déplétion cellulaire en

nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) et de l’inhibition de la glycolyse

(Ying, Padanilam, 2016). Cela perturbe la production d’énergie et diminue le

pool d’ATP cellulaire. Les cellules végétatives non-proliférantes seront plus

sujettes à la réparation de l’ADN qu’à la nécrose cellulaire, la production

d’énergie cellulaire étant principalement due à la phosphorylation oxydative

81

et au catabolisme des acides aminés et des lipides au niveau des

mitochondries. Au contraire, les cellules proliférantes, telles que les cellules

tumorales, sont dépendantes de la glycolyse pour la production d’ATP, ces

cellules utilisant les acides aminés et les lipides pour la synthèse de protéines

et de membranes.

Une autre voie de nécrose programmée est initiée par l’activation de TRAIL ou de TNF et

l’inhibition de la caspase-8. Cependant, le rôle de la doxorubicine au sein de cette voie n’est

pas clairement défini (Meredith, Dass, 2016).

Etant donné que de nombreuses cellules tumorales proviennent de mutations inhibant

l’apoptose et/ou autorisant les cellules à passer les check-points du cycle cellulaire, cette

voie alternative de nécrose cellulaire pourrait expliquer pourquoi les anticancéreux tels que

la doxorubicine induisent tout de même la mort cellulaire, malgré le blocage des autres voies

(Edinger, Thompson, 2004).

Figure 37 : Rôle de la doxorubicine dans la nécrose cellulaire

Traduit et adapté de l’anglais d’après Meredith et al (2016). ATP : adenosine triphosphate ; H2AX : H2A histone family member X ; MLKL : mixed-lineage kinase domain-like

protein ; MPT : mitochondrial permeability transition ; NAD : nicotinamide adenine dinucleotide ; PARP-1 : poly

(ADP-ribose) polymerase-1 ; RIPK : receptor-interacting serine/threonine protein kinase ; TNF : tumour necrosis

factor ; and TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand.

Etant donné la palette de mécanismes d’action de la doxorubicine, il est possible que la cible

cellulaire varie selon le type tumoral, et ainsi, l’importance de chaque mécanisme serait

individu-dépendant. Cependant, la concentration intracellulaire en doxorubicine semble être

le facteur déclenchant, avec une concentration importante nécessaire à la mort cellulaire

(Tacar et al., 2013). Cela nécessite cependant des études supplémentaires pour déterminer

la concentration la plus à même de tuer tout type de cellules cancéreuses afin d’obtenir un

traitement efficace mais présentant également une toxicité moindre (Jackson, 2003).

82

De plus, même si l’apoptose semble être le mécanisme cellulaire prédominant lors de

l’utilisation de la doxorubicine, cela reste soumis aux différents mécanismes de résistance

mis en place par les cellules tumorales.

E. Les mécanismesE. Les mécanismesE. Les mécanismesE. Les mécanismes de résistance des cellules tumorales à la doxorubicinede résistance des cellules tumorales à la doxorubicinede résistance des cellules tumorales à la doxorubicinede résistance des cellules tumorales à la doxorubicine

La résistance aux agents de chimiothérapie anticancéreuse est définie comme l’impossibilité

d’obtenir ou de maintenir le résultat thérapeutique escompté et constitue une des causes

principales des échecs de la chimiothérapie anticancéreuse.

On peut définir deux types de résistance :

� La résistance intrinsèque, due aux caractéristiques de la tumeur, à sa vascularisation

et à sa cinétique de croissance. La tumeur est d’emblée résistante ou peu sensible

aux médicaments, ou présente une capacité de réparation supérieure à celle des

tissus sains. Cette résistance est préalable à tout traitement.

� La résistance acquise, c’est-à-dire exprimée après le traitement, par échappement.

Les agents anticancéreux ne sont plus actifs par émergence de cellules tumorales

mutées résistantes.

La doxorubicine agit sur différents mécanismes de mort cellulaire dont :

� L’apoptose cellulaire :

• Par la voie intrinsèque en activant p53, menant à l’activation de la

caspase-9 initiatrice.

• Par la voie extrinsèque en activant les récepteurs de mort, menant à

l’activation de la caspase-8 initiatrice.

Ces deux voies aboutissent à l’activation des caspases-3, -6 et -7 effectrices,

permettant l’activation de DNases et l’apoptose cellulaire.

� L’autophagie cellulaire :

• Par le stress oxydatif, à l’origine de l’activation de l’AMPK, responsable

de la formation et de la maturation de l’autophagosome.

• Par les dommages à l’ADN, menant à l’activation de PARP-1 et donc à

l’inhibition de mTORC1 et à la formation de la membrane pré-

autophagosomale.

� La sénescence cellulaire, par régulation positive de p21 et régulation

négative de cdk1, à l’origine d’un arrêt de la croissance cellulaire.

� La nécrose cellulaire, par diminution de la production d’énergie ATP, due au

stress oxydatif ou aux dommages à l’ADN.

83

Bien que ces deux types de résistance représentent deux entités cliniques distinctes, les

mécanismes sous-jacents à ces situations sont probablement similaires (Zandvliet, Teske,

2015).

Certains mécanismes de résistance à la chimiothérapie ont été identifiés à différents

niveaux, anatomophysiologique, cellulaire et/ou moléculaire. La plupart de ces mécanismes

de résistance sont issues de recherches in vitro, par le développement de lignées cellulaires

présentant un phénotype de résistance, mais leurs rôles in vivo restent encore parfois

controversés.

Il est possible de distinguer deux types de résistance cellulaire (Housman et al., 2014) :

� La résistance cellulaire spécifique à une molécule ou une classe de molécules, qui

s’appuie sur une altération du transport spécifique, une modification du métabolisme

ou une altération des cibles intracellulaires.

� La résistance cellulaire pléiotrope, c’est-à-dire une résistance à plusieurs molécules

ou classes de molécules, souvent appelée multidrug resistance, ou MDR. Elle peut

résulter de l’induction d’un seul mécanisme de résistance capable d’influencer

plusieurs molécules mais peut aussi découler d’une seule molécule qui va déclencher

de multiples mécanismes de résistance. Elle prend en compte les modifications de

l’expression de gènes et de protéines, l’activation de mécanisme de réparation ou de

détoxification et l’altération de certaines protéines de transport.

Les informations disponibles sur la résistance aux anticancéreux chez le chien sont limitées.

Cependant, contrairement à la pharmacocinétique à l’origine de la résistance, qui varie entre

les espèces à cause des différences de métabolisme, les mécanismes cellulaires semblent

être similaires à ceux présent chez l’Homme, étant donnée la conservation inter-espèces des

voies impliquées.

Cinq mécanismes de résistance peuvent être identifiés concernant la doxorubicine (Thorn et

al., 2011) :

� La résistance due à une diminution de la concentration intracellulaire de la

doxorubicine par augmentation de l’efflux. C’est le mécanisme de résistance le plus

étudié dans l’espèce canine.

� La résistance due à l’altération quantitative et/ou qualitative d’une des protéines

cibles, l’ADN topoisomérase de type II.

� La résistance due à une modulation des processus enzymatiques impliqués dans le

métabolisme de la doxorubicine.

� La résistance due à l’activation des systèmes de réparation de l’ADN.

� La résistance due à l’inactivation de l’apoptose.

84

1. La 1. La 1. La 1. La résistance à la doxorubicine par augmentation de son efflux cellulairerésistance à la doxorubicine par augmentation de son efflux cellulairerésistance à la doxorubicine par augmentation de son efflux cellulairerésistance à la doxorubicine par augmentation de son efflux cellulaire

Le phénotype MDR implique une diminution de la concentration intracellulaire en

doxorubicine. Ce phénomène se traduit par un efflux actif de celle-ci hors de la cellule,

associé ou non à une altération de sa distribution subcellulaire par la séquestration

cytoplasmique.

L’efflux cellulaire est souvent considéré comme la phase III du métabolisme de la

doxorubicine. Celui-ci est permis par une grande variété de transporteurs, dont les plus

importants appartiennent à la superfamille des ATP-binding cassette (ABC). Ce sont des

transporteurs membranaires impliqués dans la translocation de la doxorubicine contre son

gradient, par un mécanisme ATP-dépendant. Parmi ces transporteurs, on peut citer la

glycoprotéine-P (P-gp) et les protéines MRP1 et BCRP (cf partie II.D).

Les cellules tumorales qui expriment initialement à un haut niveau les transporteurs à la

doxorubicine peuvent être intrinsèquement résistantes à celle-ci. Alternativement, la

sélection de la résistance en présence de la doxorubicine peut résulter en une élévation de

l’expression des transporteurs, le plus souvent par amplification du gène codant pour le

transporteur.

Dans la suite, nous nous attarderons à décrire le rôle potentiel des différents transporteurs

dans la résistance des cellules tumorales à la doxorubicine chez le chien.

� La glycoprotéine-P

La P-gp est exprimée dans certaines lignées de cellules tumorales canines, incluant les

leucémies lymphoïdes, les mastocytomes et les ostéosarcomes (Page et al., 2000), ainsi que

dans des tumeurs in vivo, incluant certains carcinomes (Petterino et al., 2006), les

mastocytomes et les lymphomes malins (Bergman et al., 1996). L’expression de la P-gp a été

associée à la résistance cellulaire à la doxorubicine pour des lignées cellulaires de lymphome

B canins (Uozurmi et al., 2005). Cependant, même si la concentration en ARNm est en

corrélation avec la sensibilité à la doxorubicine in vitro, cette corrélation n’est pas retrouvée

in vivo (Steingold et al., 1998).

Le mécanisme génétique derrière l’augmentation de l’expression du gène mdr1 dans les

lignées cellulaires résistantes in vitro est variable. Les cellules faiblement résistantes

présentent une activation importante de la transcription et de la traduction. Pour les cellules

hautement résistantes, on observe également une amplification génique, soit sous forme

libre (DM, double minute chromosome fragment), soit intégré de façon linéaire sur le

chromosome au locus originel ou à un autre locus (HSR, homogeneous staining region)

(Storlazzi et al., 2010).

85

� La protéine MRP1

Dans l’espèce canine, la protéine MRP1 est exprimée au niveau de certains lymphomes B

multicentriques (Tomiyasu et al., 2010), de mastocytomes cutanés (Miyoshi et al., 2002) et

de certains carcinomes (Lee et al., 2007) (Honscha et al., 2009).

Chez l’homme, le mécanisme d’apparition du phénotype MDR impliquant MRP1 n’est pas

encore totalement déterminé. Des amplifications géniques ont été relevées dans divers

modèles cellulaires mais il est possible que des mutations d’éléments cis-régulateur ou de

facteurs de trans-activation augmentent la transcription du gène mrp1. Dans l’espèce

canine, le gène mrp1 ne semble pas être associé à une résistance à la doxorubicine (Ma et

al., 2002).

� La protéine BCRP

Chez le chien, la protéine BCRP est exprimée au niveau de certaines tumeurs mammaires,

son niveau d’expression augmentant avec le grade de la tumeur (Honscha et al., 2009)

(Nowak et al., 2009). Celle-ci est aussi exprimée dans le cas de lymphomes B et T (Zandvliet

et al., 2015).

Chez l’homme, seule la protéine BCRP mutée transporte la doxorubicine. Dans l’espèce

canine, certaines études montrent qu’une résistance médiée par BCRP est possible par

augmentation de son expression, sans mutation de cette dernière (Honscha et al., 2009). Il

existe cependant peu d’études sur l’implication de BCRP dans la résistance des cellules

tumorales à la doxorubicine.

Bien que ces transporteurs ABC soient typiquement localisés au niveau de la membrane

cellulaire, ils peuvent aussi être présents au sein des membranes des différents organites

intracellulaires tels que le réticulum endoplasmique, les mitochondries et le peroxysome,

permettant alors une séquestration de la doxorubicine. Celle-ci est alors transportée du

cytoplasme au réticulum endoplasmique et n’exerce plus son action cytotoxique, menant

alors à la résistance de la cellule à la doxorubicine (Arancia et al., 1998). L’expression de la

transport associated with antigen processing (TAP), ou ABCB2, a été associée à une faible

résistance des cellules tumorales à la doxorubicine (Izquierdo et al., 1996) (Zandvliet et al.,

2015).

2. La résistance à la doxorubicine associée aux ADN 2. La résistance à la doxorubicine associée aux ADN 2. La résistance à la doxorubicine associée aux ADN 2. La résistance à la doxorubicine associée aux ADN topoisomérases detopoisomérases detopoisomérases detopoisomérases de type IItype IItype IItype II

Bien que la synthèse de l’ADN topoisomérase de type II soit dépendante du cycle cellulaire

(cf partie III.A.2), des altérations quantitatives et/ou qualitatives de cette enzyme nucléaire

ont pu être observées, pouvant expliquer la résistance de certaines cellules tumorales à la

doxorubicine. La résistance résulterait d’une diminution de l’expression de l’ADN

topoisomérase de type II ou du développement de mutations de cette dernière (Pommier et

al., 2010).

86

a. Résistance par altération de la concentration ea. Résistance par altération de la concentration ea. Résistance par altération de la concentration ea. Résistance par altération de la concentration en ADN topoisomérase de typen ADN topoisomérase de typen ADN topoisomérase de typen ADN topoisomérase de type IIIIIIII

Les niveaux d’expression des isoformes des ADN topoisomérases de type II présentent

d’importantes variations dans les cellules tumorales et non-tumorales. Des études sur

lignées cellulaires ont montré qu’un haut niveau d’expression de l’isoforme α conférerait

une sensibilité accrue à la doxorubicine, et serait un marqueur de prolifération (Booser,

Hortobagyi, 1994). L’un des mécanismes généraux de résistance à la doxorubicine

correspondrait donc à la présence en plus faible concentration d’ADN topoisomérase de

type II nucléaire, à l’origine d’une diminution de la cytotoxicité de la doxorubicine.

La concentration en ADN topoisomérase de type II peut être réduite par diminution de la

transcription. Alors que l’expression d’au moins une des deux isoformes est nécessaire pour

la viabilité cellulaire, la cellule peut réduire drastiquement l’expression de l’une de ces deux

isoformes, avec peu d’effets sur la croissance. Pour la doxorubicine, il semblerait que la

résistance soit inversement proportionnelle à l’expression de l’ADN topoisomérase de type

IIβ (Brown et al., 1995). Cependant, certaines études sont contradictoires et ne montrent

pas de corrélation entre la résistance à la doxorubicine et le niveau d’expression des

isoformes, cela pouvant être due à la multitude de mécanismes d’action de la doxorubicine

(Houlbrook et al., 1995). Plusieurs facteurs influencent le niveau d’expression de ces

isoenzymes. Une diminution de la transcription du gène top2α est associée à un niveau élevé

en Sp3, un facteur de transcription pouvant activer ou réprimer l’expression de certains

gènes (Harris, Hochhauser, 1992). Le mode d’action de l’ADN topoisomérase de type II

repose sur la formation d’un complexe ternaire avec la doxorubicine et l’ADN. Sa localisation

se doit donc d’être nucléaire. Certaines lignées cellulaires tumorales résistantes à la

doxorubicine présente une localisation cytoplasmique de l’ADN topoisomérase de type IIα

(Harker et al., 1995). La localisation nucléaire de l’ADN topoisomérase de type IIα nécessite

des signaux de localisation nucléaire, présents à son extrémité C-terminale. La mutation de

cette portion inhibe alors sa translocation nucléaire. Cependant, la cellule ne présente pas

d’anomalies de croissance en l’absence de l’ADN topoisomérase de type IIα à localisation

nucléaire (Walker, Nitiss, 2002).

b. Résistance altération de la sensibilité de l’ADN topoisomérase de type II à la b. Résistance altération de la sensibilité de l’ADN topoisomérase de type II à la b. Résistance altération de la sensibilité de l’ADN topoisomérase de type II à la b. Résistance altération de la sensibilité de l’ADN topoisomérase de type II à la doxorubicinedoxorubicinedoxorubicinedoxorubicine

Les modifications décrites précédemment induisent une diminution de la concentration en

ADN topoisomérase de type II mais pas d’altération de sa sensibilité vis-à-vis de la

doxorubicine. Pourtant, certaines mutations peuvent conduire à cette absence de sensibilité,

avec une concentration normale en ADN topoisomérase de type II (Bergman, 2003). Il existe

plusieurs mécanismes par lesquels les mutations de l’ADN topoisomérase de type II mènent

à la résistance des cellules tumorales à la doxorubicine. L’une d’entre elle correspond aux

modifications du site de liaison entre la doxorubicine et l’enzyme, prévenant l’inhibition de

cette dernière ou la formation du complexe ternaire. Une autre possibilité réside dans

l’altération du site actif de l’enzyme, à l’origine d’une réduction de l’activité enzymatique

(Nitiss, 2009b).

87

La mutation dans le gène top2 conférant la résistance à la doxorubicine est récessive au type

sauvage. Autrement dit, si une cellule est hétérozygote, la cellule sera toujours sensible à

l’anti-cancéreux. En effet, la réintroduction du gène sauvage dans une cellule résistante

restaure la sensibilité de cette dernière (Eder et al., 1993). Il est possible d’avoir une

résistance par dominance partielle. Etant donné que l’ADN topoisomérase de type II est un

dimère, il est possible que l’une des deux sous-unités soit résistante et que l’autre soit

sensible à la doxorubicine. Dans cette situation, le niveau total en enzymes sensibles sera

réduit (Nitiss et al., 1994).

Il existe de nombreuses études sur les mutations du gène top2α, l’analyse de celles-ci ne

révélant pas de locus particulier menant à la résistance des cellules tumorales à la

doxorubicine (Walker, Nitiss, 2002).

L’état de phosphorylation semble également être impliqué dans la résistance à la

doxorubicine. Puisque la phosphorylation de l’ADN topoisomérase de type II durant le cycle

cellulaire régule l’activité de l’enzyme, son rôle dans la résistance des cellules tumorales à la

doxorubicine a été étudié (Kohno et al., 1991). L’hyperphosphorylation de l’ADN

topoisomérase de type II semble être à l’origine de la résistance des cellules. Puisque la

phosphorylation est essentielle aux évènements catalytiques de décaténation,

l’hyperphosphorylation de l’enzyme est à l’origine d’une moindre sensibilité de celle-ci à la

doxorubicine (Ganapathi, Ganapathi, 2013).

3. La résistance associée à3. La résistance associée à3. La résistance associée à3. La résistance associée à une modulation des processus enzymatiques une modulation des processus enzymatiques une modulation des processus enzymatiques une modulation des processus enzymatiques

Les enzymes impliquées dans le métabolisme sont des déterminants importants de la

concentration intracellulaire et systémique de la doxorubicine. Les réactions d’oxydation, de

réduction et d’hydrolyse (réactions de phase I), ainsi que les réactions de conjugaison

(réactions de phase II), jouent un rôle crucial dans la protection des cellules contre les

toxines cellulaires. Ces mêmes réactions peuvent mener à la résistance cellulaire à la

doxorubicine dans les cellules tumorales, par diminution de son métabolisme ou par

détoxification de certains de ses métabolites (Zandvliet, Teske, 2015).

a. Altération du métabolisme de la doxorubicinea. Altération du métabolisme de la doxorubicinea. Altération du métabolisme de la doxorubicinea. Altération du métabolisme de la doxorubicine

Une diminution de l’activité enzymatique du système cytochrome P450 et de la flavine

réductase est à l’origine d’une diminution de la formation du radical semi-quinone dans les

cellules tumorales. Cette diminution est à l’origine d’une moindre production de ROS et

donc d’une cytotoxicité moindre (Walker, Nitiss, 2002). De même, certaines cellules

tumorales surexpriment l’enzyme de glucurono-conjugaison UDP-glucuronyl transférase qui

est associée à l’inactivation des métabolites de la doxorubicine (Zandvliet, Teske, 2015).

b. Résistance par stimulation des mécanismes de détoxification cellulaireb. Résistance par stimulation des mécanismes de détoxification cellulaireb. Résistance par stimulation des mécanismes de détoxification cellulaireb. Résistance par stimulation des mécanismes de détoxification cellulaire

L’acquisition de la résistance à la doxorubicine par les cellules tumorales peut également

provenir d’une augmentation de l’activité des enzymes impliquées dans la détoxification

cellulaire (Kumaraguruparan et al., 2006). Les principaux systèmes enzymatiques concernés

88

sont les système glutathion, ainsi que les enzymes d’élimination des radicaux libres : la

superoxyde dismutase, la catalase et la glutathion peroxydase.

Le système glutathion cellulaire est responsable de la métabolisation et de la détoxification

de certains agents nocifs pour la cellule tels que les ROS. Certaines cellules tumorales vont

présenter une expression plus importante des gènes codant pour ces enzymes, intrinsèque

ou acquise. Cette plus forte expression va être à l’origine d’une moindre sensibilité aux ROS

et donc d’une moindre cytotoxicité de la doxorubicine envers ces cellules (Leonel, Gelaleti,

2014).

Le système glutathion est composé d’une famille d’iso-enzymes, les glutathion-S-

transférases, et du glutathion. Le glutathion (GSH) est un tripeptide (γ-glutamyl-cystéine-

glycine), jouant le rôle de nucléophile dans de nombreuses réactions de détoxification. Le

maintien du taux intracellulaire constant s’effectue par une synthèse de novo et un système

de réparation. Certaines cellules tumorales résistantes à la doxorubicine présentent un taux

en glutathion plus élevé. Les glutathion-S-transférases (GSTs) sont quant à elle des

isoenzymes qui catalysent l’addition nucléophile du GSH réduit sur un composé électrophile.

Chaque isoenzyme est associée à un type de résistance. L’isoenzyme π, surexprimée dans

certaines cellules tumorales, est associée aux mécanismes de résistance à la doxorubicine

par conjugaison du radical semi-quinone (Tew, 1994).

4. La résistance par réparation des dommages à l’ADN4. La résistance par réparation des dommages à l’ADN4. La résistance par réparation des dommages à l’ADN4. La résistance par réparation des dommages à l’ADN

Il existe très peu d’études sur la résistance à la doxorubicine par activation des systèmes de

réparation au niveau de l’ADN cellulaire chez le chien. Cependant, il semblerait que ces

mécanismes soient similaires à ceux présents chez l’Homme.

Les cellules ont développé des mécanismes de réparation de l’ADN. L’augmentation de ces

mécanismes de réparation de l’ADN dans certaines lignées tumorales est liée à la résistance

à la doxorubicine. Les mécanismes de réparation incluent l’excision de nucléotide, l’excision

de base et la recombinaison homologue ou non homologue par jonction des extrémités

(Figure 38) (Slupphaug et al., 2003). En fonction du mécanisme de cytotoxicité impliqué, les

dommages à l’ADN et donc les mécanismes de réparation seront différents.

Figure 38 : Les différents mécanismes de réparation de l’ADN selon le mécanisme de

cytotoxicité doxorubicine-induit Traduit et adapté d’après Slupphaug et al. (2003).

89

L’inhibition de l’ADN topoisomérase de type II est à l’origine de cassures double-brins et de

cross-links. La réparation des dommages à l’ADN causés par ce mécanisme d’action doit

accomplir plusieurs tâches. Tout d’abord, le système de réparation doit reconnaître le

complexe ternaire formé comme un dommage à l’ADN et non pas comme une enzyme

active pouvant se dissocier de l’ADN. La détection du complexe covalent comme lésion de

l’ADN a sans doute lieu car ce complexe covalent correspond à un blocage de la transcription

et de la réplication. Cependant, ce complexe ternaire est réversible jusqu’à ce que certains

processus interviennent. Tant que la reconnaissance et la réparation ne sont pas initiées, la

formation du complexe covalent peut s’inverser sans effet délétère. Une fois ces processus

enclenchés, le complexe est irréversible et mène soit vers une réparation des lésions à

l’ADN, soit vers la mort cellulaire. La réparation nécessite ensuite le retrait de l’enzyme.

Celui-ci peut être réalisé soit par l’excision endonucléolytique des adduits protéiques, soit

par dégradation de l’ADN topoisomérase de type II par protéolyse. La cellule répare ensuite

les lésions à l’ADN (Nitiss, 2009b).

Les ROS synthétisés à partir de la doxorubcine sont quant à eux à l’origine de cassures

simple ou double-brins, de modifications de bases azotées, de désoxyriboses et de

groupements phosphates ainsi qu’à la mise en place de cross-links ou d’adduits à l’ADN

(Evans et al., 2004).

5. Résistance par inhibition de l’apoptose5. Résistance par inhibition de l’apoptose5. Résistance par inhibition de l’apoptose5. Résistance par inhibition de l’apoptose

De nombreux mécanismes cellulaires peuvent être à l’origine d’une résistance des cellules

tumorales par inhibition de l’apoptose et des autres processus de mort cellulaire. Nous ne

traiterons ici que des mécanismes les plus souvent rencontrés lors de résistance à la

doxorubicine.

Dans de nombreux types tumoraux, la famille de protéine Bcl-2, Akt et d’autres facteurs anti-

apoptotiques sont présents en forte concentration, ce qui est à l’origine d’une résistance à la

doxorubicine (Housman et al., 2014). Cette élévation de facteurs anti-apoptotiques peut être

due à des mutations, une amplification, une translocation ou une surexpression des gènes

codants pour ces facteurs (Holohan et al., 2013). De plus, ces gènes sont des cibles pour des

facteurs de transcription tels que NF-κB, activés par des mutations oncogéniques lors de la

tumorigénèse.

L’inhibition de l’apoptose peut également être due à une mutation du gène codant pour la

protéine p53, à l’origine d’une perte de ses capacités antiprolifératives et pro-apoptotiques

(Walker, Nitiss, 2002).

90

Figure 39 : Les différents mécanismes de résistance à la doxorubicine

Il existe de nombreux mécanismes de résistance à la doxorubicine chez l’animal, la

plupart des mécanismes ayant été extrapolé depuis l’Homme (Figure 39) :

1- L’augmentation de l’efflux de la doxorubicine par différents transporteurs

membranaires, à l’origine d’une diminution de sa concentration cellulaire. Ces

transporteurs sont également à l’origine d’une altération (1’) de la distribution

subcellulaire de doxorubicine.

2- L’altération des ADN topoisomérases de type II, cible de la doxorubicine. Cette

altération peut être quantitative et/ou qualitative, soit par diminution de son

expression ou de sa localisation nucléaire, soit par diminution de sa sensibilité.

3- La modulation des processus enzymatiques, impliqués dans le métabolisme de la

doxorubicine. Cela résulte en une moindre production de ROS ou en une

détoxification de ces derniers.

4- La réparation des dommages à l’ADN, dépendant des mécanismes cytotoxiques

impliqués.

5- L’inhibition de l’apoptose, mécanisme de résistance commun à de nombreux anti-

cancéreux. Cette inhibition est principalement due à l’augmentation des facteurs pro-

apoptotiques et aux mutations du gène p53.

91

IV.IV.IV.IV. La doxorubicine en La doxorubicine en La doxorubicine en La doxorubicine en médecinemédecinemédecinemédecine vétérinairevétérinairevétérinairevétérinaire

La première utilisation thérapeutique de la doxorubicine chez le chien remonte à la fin des

années 70. Depuis, elle est couramment utilisée au sein de différents protocoles de

chimiothérapie et ce malgré certains de ses effets indésirables.

A. A. A. A. PrincipalesPrincipalesPrincipalesPrincipales iiiindicationndicationndicationndicationssss de la doxorubicine en médecine vétérinaire de la doxorubicine en médecine vétérinaire de la doxorubicine en médecine vétérinaire de la doxorubicine en médecine vétérinaire

La doxorubicine est disponible en France sous forme de chlorhydrate de doxorubicine, nom

déposé ADRIBLASTINE®. Elle est utilisée, à une dose initiale de 30 mg/m² chez les chiens

pesant plus de 10 kg et à 1 mg/kg chez les chiens pesant moins de 10 kg. Cette différence de

posologie est basée sur une étude de 1993 montrant une toxicité plus importe chez les

chiens de petites races (< 10kg) lors de l’utilisation de doxorubicine à une dose de 30 mg/m²

(Arrington et al., 1994). Elle est administrée par voie intra-veineuse en perfusion lente, sur

au minimum 20 minutes, à 3 semaines d’intervalle. La dose cumulée maximale varie entre

180 et 240 mg/m² selon les auteurs.

Tableau III : Principales indications de la chimiothérapie à base de doxorubicine

Indications Protocole Études cliniques

Lymphome L-CHOP (PC) (Myers et al., 1997) 68 cas

Lymphome multicentrique Doxorubicine (MC) + CPV (PC) (Valerius et al., 1997) 121 cas

Lymphome Doxorubicine (MC en récidive) (Ponce et al., 2004) 57 cas

Lymphome multicentrique CHOP-M (PC) (Daters et al., 2010) 65 cas

Lymphome B ou T Doxorubicine (MC) (Beaver et al., 2010) 41 cas

Lymphome CHOP (PC) (Flory et al., 2011) 95 cas

Lymphome T multicentrique

CHOP (PC) (Rebhun et al., 2011) 24 cas

Lymphome multicentrique CHOP/CMOP (PC) (Wang et al., 2016) 44 cas

Ostéosarcome appendiculaire

Doxorubicine/Carboplatine (PC) (Selmic et al., 2014) 470 cas

Doxorubicine (MC) (Selting et al., 2004) 31 cas

Doxorubicine/Cisplatine (PC) (Chun et al., 2005) 35 cas

Doxorubicine/Carboplatine (PC) (Lane et al., 2012) 33 cas

Doxorubicine/Carboplatine (PC) (Frimberger et al., 2016) 38 cas

Hémangiosarcome splénique

VAC (PC) (Hammer et al., 1991) 15 cas

Doxorubicine/Cyclophosphamide (PC) (Sorenmo et al., 2000) 18 cas

Doxorubicine (MC ou PC) (Wendelburg et al., 2015) 54 cas

Sarcome des tissus mous Doxorubicine (MC) (Selting et al., 2005) 39 cas

Adénocarcinome mammaire

Doxorubicine/Docetaxel (PC) (Simon et al., 2006) 31 cas

Carcinome transitionnel de la vessie

Doxorubicine/Piroxicam (Robat et al., 2013) 34 cas

A : adriamycine (doxorubicine) ; C : cyclophosphamide ; H : hydroxyadriamycine ; M : mitoxantrone ;

MC : mono-chimiothérapie ; O : Onconvin® (vincristine) ; P : prednisolone ; PC : polychimiothérapie ;

V : vincristine.

92

Les principales indications d’une chimiothérapie à base de doxorubicine sont présentées

dans le Tableau III, accompagnées de références d’études cliniques illustrant chacune des

indications.

La doxorubicine est principalement employée dans le cadre de protocoles de

polychimiothérapie pour le traitement de lymphomes, ou en alternance avec des dérivés de

platine (cisplatine ou carboplatine) dans la prise en charge des ostéosarcomes

appendiculaires. Elle est aussi utilisée en monochimiothérapie ou polychimiothérapie

adjuvante à la chirurgie lors d’adénocarcinomes mammaires avec emboles ou lors

d’envahissement métastatique des ganglions loco-régionaux. Elle peut également être

utilisée dans la cadre du traitement des hémangiosarcomes spléniques, des sarcomes des

tissus mous très indifférenciés, des carcinomes thyroïdiens avec emboles ou d’autres

carcinomes.

Cette liste n’est pas exhaustive et ne prend pas en compte les associations en cours

d’évaluation dans le cadre d’essais cliniques. Elle permet néanmoins de prendre conscience

de l’ampleur de l’utilisation de la doxorubicine en pratique médicale vétérinaire.

La doxorubicine existe également sous forme encapsulée dans des liposomes encapsulés et

pégylés (DOXIL®), permettant une réduction de la cardiotoxicité. En effet, l’encapsulation

permet une moindre distribution aux tissus tels que le cœur et le tractus gastro-intestinal et

un ciblage des cellules tumorales grâce à l’enhanced permeability and retention effect.

Cependant cette forme n’est pas disponible en France et ses indications thérapeutiques

restent à définir chez le chien. Il n’existe que peu d’études cliniques sur l’efficacité et

l’innocuité de la forme liposomale chez le chien, mettant en avant une cardiotoxicité plus

faible mais à l’origine d’une toxicité cutanée plus importante : l’érythrodysesthésie palmo-

plantaire (Sorenmo et al., 2007) (Teske et al., 2011).

BBBB.... Les principales interactions médicamenteuses avec la doxorubicineLes principales interactions médicamenteuses avec la doxorubicineLes principales interactions médicamenteuses avec la doxorubicineLes principales interactions médicamenteuses avec la doxorubicine

Les principales interactions médicamenteuses de la doxorubicine et leurs effets sont décrits

dans le Tableau IV.

93

Tableau IV : Principales interactions médicamenteuses de la doxorubicine

Molécules Effets Mécanismes suspectés

Barbituriques (phénobarbital)

Diminution modérée possible des effets

pharmacologiques de la doxorubicine

Augmentation du métabolisme de la doxorubicine par induction du

système cytochrome P450

Bevacizumab Augmentation possible de la cardiotoxicité

Inconnu

Inhibiteurs calciques (amlodipine, diltiazem,

vérapamil)

Augmentation possible de la cardiotoxicité

Toxicité additive

Cyclophosphamide Augmentation possible de la cardiotoxicité

Toxicité additive

Ciclosporine Augmentation des effets pharmacologiques de la

doxorubicine

Diminution du métabolisme de la doxorubicine par compétition pour le

système cytochrome P450 ou l’inhibition de la P-gp

Digoxine Diminution modérée possible des effets

pharmacologiques de la digoxine

Diminution de l’absorption par altération de la muqueuse intestinale

Paclitaxel Augmentation des effets pharmacologiques de la

doxorubicine

Diminution de la clairance de la doxorubicine par compétition pour le système cytochrome P450 ou la P-gp

Quinolones Diminution possible de l’action antimicrobienne

Diminution de l’absorption par altération de la muqueuse intestinale

Trastuzumab Augmentation possible de la cardiotoxicité

Inconnu

C. Toxicité et effets indésirables C. Toxicité et effets indésirables C. Toxicité et effets indésirables C. Toxicité et effets indésirables de la doxorubicinede la doxorubicinede la doxorubicinede la doxorubicine

Comme tous les agents de chimiothérapie, la doxorubicine ne présente pas une cytotoxicité

spécifique aux cellules tumorales, mais a également une certaine toxicité pour les cellules

non tumorales, à l’origine d’effets secondaires délétères. Ces effets secondaires peuvent

être non spécifiques et à mettre en lien avec la cytotoxicité sur les cellules des tissus à

renouvellement rapide, ou spécifiques, en lien avec une particularité métabolique ou une

concentration préférentielle dans certains tissus (Barranco, 1984).

Tableau V : Effets indésirables de la doxorubicine à court-terme D’après Ogilvie et al. (1989).

Effets indésirables Nombre de chiens

Vomissements 26/185 (14 %)

Diarrhée 19/185 (10,3 %)

Colite 11/185 (5,9 %)

Anorexie 7/185 (3,8 %)

Prurit 6/185 (3,2 %)

Alopécie 2/185 (1,1 %)

Sepsis secondaire à la myélosuppression

2/185 (1,1 %)

94

Il existe peu d’études de grande ampleur concernant les effets secondaires de la

doxorubicine chez le chien, la plus complète portant sur les effets à court-terme sur 185

chiens (Tableau V) (Ogilvie, Richardson, et al., 1989).

Ces effets secondaires devront être évalués au cours du suivi de l’animal, pour permettre

une adaptation du traitement et l’ajout d’agents thérapeutiques supplémentaires au besoin.

Les différents effets secondaires sont gradés selon la classification VCOG-CTCAE (Veterinary

cooperative oncology group – common terminology criteria for adverse events) (Annexe 1).

Les différents effets secondaires seront présentés par ordre chronologique d’apparition

après injection chez le chien.

1111. Le choc histaminique. Le choc histaminique. Le choc histaminique. Le choc histaminique

Toxicité spécifique mais rare de la doxorubicine et d’apparition suraiguë, le choc

histaminique est lié à une injection trop rapide de la doxorubicine. L’injection provoque une

réaction anaphylactoïde qui résulte de la libération immédiate d’histamine et d’autres

substances vaso-actives par les polynucléaires basophiles, mais qui, à la différence de la

réaction anaphylactique, n’implique pas de réaction immunologique (Moore, Frimberger,

2009).

Les symptômes sont l’hypersalivation, des tremblements, des nausées et vomissements, une

hyperhémie cutanée, la présence de plaques urticaires et dans les cas les plus graves, une

hypotension sévère.

� Traitement

Le traitement repose sur l’arrêt immédiat de l’injection de doxorubicine et l’utilisation de

méthylprednisolone ou de dexaméthasone (1 à 2 mg/kg IV), voire d’adrénaline lors d’un

choc hypotensif sévère (0,01 mg/kg IV). On pourra également utiliser des antihistaminiques

(diphenhydramine 0,5 à 1 mg/kg en IV lente ou 1 à 4 mg/kg IM) même si leur effet en phase

clinique n’est pas certain (Eschalier et al., 1988).

� Prévention

Il est possible de prémédiquer l’animal avec de la diphenhydramine à 2 mg/kg en sous-

cutané et/ou de la dexaméthasone à 0,2 mg/kg en intraveineux, 15 à 20 minutes avant

administration de la doxorubicine. Le meilleur moyen de prévention du choc histaminique

reste la réalisation d’une perfusion lente de doxorubicine sur 20 minutes au minimum.

2222. La toxicité gastro. La toxicité gastro. La toxicité gastro. La toxicité gastro----intestinaleintestinaleintestinaleintestinale

La toxicité gastro-intestinale est une toxicité non spécifique de la doxorubicine, et qui reste

modérée chez 80 à 90 % des animaux traités. Celle-ci peut être la conséquence de la

cytotoxicité directe de la doxorubicine sur les cellules des cryptes intestinales, ou bien de la

stimulation de la trigger zone par la sérotonine et la substance P. Les vomissements par

stimulation de la trigger zone sont des phénomènes aigus, apparaissant dans les 24 heures

95

suivant l’administration de la doxorubicine. L’anorexie, les nausées, les vomissements et la

diarrhée dus à la toxicité affectant les entérocytes immatures apparaissent quant à eux un à

cinq jours après administration de la doxorubicine (Tageja, Groninger, 2014).

La présence de diarrhée induite par la chimiothérapie est plus rare que les vomissements,

son apparition signe alors des lésions étendues de la muqueuse intestinale. Il existe deux

formes de diarrhées chimio-induites. Une diarrhée de l’intestin grêle, banale, ou une colite,

touchant 10 à 15 % des animaux traités. La colite se traduit par une diarrhée importante,

plus ou moins hémorragique avec une déshydratation rapide en absence de traitement.

La sévérité des effets secondaires gastro-intestinaux est gradée de 1 à 4 selon le système

VCOG-CTCAE (Annexe 1).

� Traitement

L’anorexie peut être compensée par l’effet orexigène des corticoïdes lors d’une

administration conjointe au sein du protocole de chimiothérapie. En cas de persistance de

l’anorexie, il est possible d’utiliser des stimulants de la prise alimentaire comme la

cyproheptadine (0,2 mg/kg PO, SID à BID) ou de la mirtazapine (0,5 mg/kg PO SID).

Pour des vomissements faibles, inférieurs à trois épisodes par 24 heures, une diète hydrique

d’une journée peut suffire. Pour des vomissements modérés, un traitement peut être mis en

place (Rau et al., 2010) :

� Le citrate de maropitant (1 mg/kg IV ou SC SID, ou 2 mg/kg PO SID) : c’est un

antiémétique central, par inhibition des récepteurs centraux à la neurokinine (NK1).

� Le métoclopramide (0,3-0,5 mg/kg IV ou PO, BID à TID) : c’est un antiémétique à

action centrale et périphérique. Il présente également un effet gastrokinétique.

� Les « setrons », antagonistes sélectifs de la sérotonine à effet antiémétique central.

Parmi eux, on utilise principalement l’ondansetron (0,1 à 0,2 mg/kg IV BID).

On pourra également ajouter des antiacides (oméprazole 0,5 à 1 mg/kg PO SID) qui, même

s’ils n’ont pas d’effet antiémétique propre, peuvent être bénéfiques. En cas de

vomissements sévères avec déshydratation, une hospitalisation de l’animal peut être

nécessaire.

En cas de diarrhée légère, une diète hydrique de 24 heures puis le passage à un aliment

hyper-digestible peut permettre une amélioration. En cas de diarrhée modérée, un

traitement à base de pansements digestifs et de lopéramide (0,1 mg/kg PO BID, si le chien

est porteur du gène mdr1 non muté) peut être mis en place. En cas de diarrhée importante

avec déshydratation, une hospitalisation de l’animal peut être nécessaire.

De plus, en cas de neutropénie concomitante, la mise en place d’une antibiothérapie peut se

justifier. On utilise le plus souvent du triméthoprime-sulfamide (12,5 mg/kg PO BID), associé

à du métronidazole (10 à 15 mg/kg PO BID) dans les cas les plus graves.

96

� Prévention

En prévention, la chimiothérapie est pratiquée à jeun. Il est également possible

d’administrer un antiémétique 30 minutes avant la séance de chimiothérapie ainsi qu’un

pansement gastrique à base de phosphate d’alumine de la veille à quatre jours post-

chimiothérapie. Lors d’effets indésirables gastro-intestinaux modérés à sévères, il est

également possible de diminuer la dose de chimiothérapie de 10 à 20 % ou de modifier le

protocole (Moore, Frimberger, 2009).

3333. Toxicité hématologique. Toxicité hématologique. Toxicité hématologique. Toxicité hématologique

La doxorubicine présente une myélotoxicité dite forte, par rapport à d’autres agents

anticancéreux. Celle-ci est due à sa cytotoxicité envers les cellules avec un index prolifératif

élevé. La toxicité hématologique apparait après un temps de latence, correspondant au

temps de demi-vie des différentes cellules sanguines. De plus, cette toxicité est dose-

dépendante. Ceci explique que la toxicité hématologique de la doxorubicine concerne

principalement la lignée granulocytaire, à l’origine d’une neutropénie et d’une

thrombocytopénie. Plus rarement, elle pourra donner lieu à une anémie régénérative,

même si celle-ci est rarement objectivée étant donné la durée de vie des érythrocytes et la

dose nécessaire pour inhiber la lignée érythroïde (Reagan et al., 1993). Le nadir de la

neutropénie et de la thrombopénie est de sept à dix jours, avec une récupération d’environ

trois semaines.

La sévérité des cytopénies est gradée de 1 à 4 selon le système VCOG-CTCAE (Annexe 1).

Une numération formule sanguine est réalisée avec chaque administration. On considère

généralement qu’une molécule potentiellement myélotoxique ne doit pas être administrée

si les neutrophiles sont inférieurs à 2000 cellules/mm3 ou si les plaquettes sont inférieures à

75000 cellules/mm3. Dans ce cas, la séance de chimiothérapie doit être reportée de deux à

sept jours, et une numération-formule sanguine doit de nouveau être réalisée.

� Traitement

La mise en place d’un traitement lors de neutropénie sans signe clinique n’est pas forcément

conseillée et dépend des auteurs. Une antibioprophylaxie par voie orale peut être mise en

place en utilisant un antibiotique large spectre tel que le triméthoprime-sulfamide (15 à 20

mg/kg PO BID), l’amoxicilline-acide clavulanique (20 mg/kg PO BID) ou la céfalexine (15 à 30

mg/kg PO BID). Lors d’une neutropénie accompagnée de signes cliniques (fièvre, léthargie,

anorexie), il est conseillé par certains auteurs de réaliser un traitement en hospitalisation

avec une antibiothérapie par voie intraveineuse et avec une fluidothérapie.

Lors de thrombocytopénie, aucun traitement n’est conseillé, les signes cliniques étant

rarement observés pour un comptage supérieur à 25000 plaquettes/mm3. En cas de

thrombocytopénie majeure, l’animal doit être placé sous surveillance accrue pour prévenir

les ecchymoses, les pétéchies et les saignements (saignements gastro-intestinaux, gingivaux,

épistaxis) (Sorenmo et al., 2010).

97

� Prévention

La prévention de la toxicité hématologique de la doxorubicine repose sur le respect des

posologies avec une réévaluation de la posologie avant chaque séance, un respect du

rythme d’administration et un contrôle de la numération-formule sanguine avant chaque

injection. Lors d’une neutropénie sévère (< 1000 cellules/mm3), il est également possible de

diminuer la dose de chimiothérapie de 10 à 20 % ou de modifier le protocole (Moore,

Frimberger, 2009).

4444. Toxicité cutanée lors d’extravasation. Toxicité cutanée lors d’extravasation. Toxicité cutanée lors d’extravasation. Toxicité cutanée lors d’extravasation

C’est une toxicité spécifique des agents vésicants tels que la doxorubicine. L’extravasation

est définie comme une fuite par inadvertance d’une molécule à partir de l’espace vasculaire,

se répandant alors dans les tissus environnants. Lors de cette extravasation, les dommages

locaux sont la plupart du temps minimes. Lors de l’utilisation d’agents anticancéreux

vésicants, tels que la doxorubicine, l’extravasation est à l’origine de dommages plus

importants apparaissant comme une irritation et évoluant vers la cellulite et la nécrose

cutanée sévère. Les signes cliniques apparaissent sous sept à dix jours, avec une extension

de la nécrose pendant plusieurs semaines, sans cicatrisation spontanée (Figure 40) (Venable

et al., 2012). Ces signes cliniques sont dus aux mécanismes de cytotoxicité de la

doxorubicine sur les cellules cutanées.

Figure 40 : Nécrose cutanée due à l’extravasation de doxorubicine chez une chienne de 12

ans, deux semaines après l’injection de doxorubicine D’après Venable et al. (2012).

Lors d’une extravasation constatée au cours de la chimiothérapie, le praticien doit arrêter

l’administration puis essayer d’aspirer le maximum de liquide extravasé par le cathéter avant

de retirer celui-ci. Une application de glace 30 minutes, quatre fois par jour pendant 72

heures est conseillée.

� Traitement

Lors de l’installation de lésions, le traitement repose principalement sur un parage

chirurgical en tissu sain accompagné si nécessaire d’une chirurgie reconstructrice.

Le dexrazoxane est le seul traitement médical recommandé en humaine lors de

l’extravasation de doxorubicine, mais son utilité reste contestée. Le dexrazoxane est un

chélateur fort d’ions métalliques qui protège contre le stress oxydatif.

98

C’est un inhibiteur réversible du cycle catalytique de l’ADN topoisomérase de type II,

protégeant les cellules des cassures double-brins létales de l’ADN. Il est également utilisé en

humaine comme cardioprotecteur lors de l’utilisation d’anthracyclines (Kane et al., 2008). Il

n’existe cependant que peu de données sur l’utilisation de dexrazoxane chez le chien, la

plupart issues de cas cliniques ou de recommandations pour l’utilisation en médecine

humaine. En médecine vétérinaire, les doses sont variables, de 300 (ou dix fois la dose de

doxorubicine) à 1000 mg/m² par voie intraveineuse. L’utilisation de dexrazoxane dans les six

heures suivant l’extravasation semble être un facteur pronostic positif (Kassner, 2000). En

médecine, il est recommandé de réitérer le traitement après 24 et 48 heures.

L’utilisation de diméthyl-sulfoxyde (DMSO) est communément suggérée lors de

l’extravasation de doxorubicine. Le DMSO est un réducteur de ROS et son application locale

pourrait diminuer les dommages locaux. Il est également vasodilatateur et présente des

propriétés anti-inflammatoires et analgésiques. Cependant, aucune étude chez le chien n’a

été menée et le DMSO semble réduire l’effet du dexrazoxane (Reeves, 2007).

L’utilisation de hyaluronidase en intra-lésionnel a également été décrite chez six chiens,

permettant le maintien de la fonction locomotrice du membre malgré le développement de

fibrose au site d’extravasation (Spugnini, 2002).

� Prévention

La prévention de l’extravasation repose sur une administration intraveineuse stricte, avec

l’utilisation systématique d’un cathéter et d’une perfusion, sur une veine non abimée dans la

mesure du possible, afin d’éviter le risque de fuite vasculaire en amont et en aval. Les prises

de sang autres devront être réalisées au niveau des veines jugulaires. Un contrôle du

cathéter sera réalisé juste avant l’injection, et la doxorubicine est injectée diluée dans la

tubulure de la perfusion sur 15 à 20 minutes. A la fin de la chimiothérapie, la tubulure et le

cathéter sont abondamment rincés avec du NaCl 0,9%, avant son retrait. Un pansement

légèrement compressif est mis en place après retrait du cathéter afin d’éviter une

extravasation modérée et une sclérose veineuse ultérieure (Villalobos, 2006).

5555. L’alopécie cutanée. L’alopécie cutanée. L’alopécie cutanée. L’alopécie cutanée

Toxicité non spécifique de la doxorubicine, elle est due à la mise au repos des follicules

pileux et est réversible à l’arrêt du traitement, avec repousse des poils en un à deux mois. La

doxorubicine peut entraîner une chute importante de poils après une seule injection.

Cependant, cet effet secondaire de la doxorubicine est beaucoup moins fréquent chez le

chien que chez l’homme (5% contre 80%). L’alopécie est plus fréquente chez les races à poils

longs ou laineux (Caniche, Bobtail, Bearded Collie, etc …) et plus rare chez les races à poils

courts ou durs (Boxer, Fox Terrier, Schnauzer, etc …) (Morrison, 2002).

6666. La toxicité cardiaque. La toxicité cardiaque. La toxicité cardiaque. La toxicité cardiaque

La toxicité cardiaque est une toxicité spécifique de la doxorubicine et des anthracyclines,

largement étudiée étant donné son implication dans le devenir du patient.

99

Cette spécificité est expliquée par plusieurs caractéristiques. Premièrement, les cellules

cardiaques sont caractérisées par un déficit relatif des défenses anti-oxydantes, avec une

activité enzymatique plus faible de la superoxyde dismutase et de la catalase ainsi qu’un

niveau constitutif plus faible en glutathion (Quiles et al., 2002). De plus, les cardiomyocytes

présentent une teneur constitutive plus importante en enzymes réductases et

déshydrogénases, responsables de la production de ROS (Green, Leeuwenburgh, 2002).

Cette formation de ROS est également augmentée par la forte concentration en fer. Enfin, le

tissu cardiaque est riche en mitochondries et la doxorubicine présente une forte affinité

pour les cardiolipides, constituants majeurs de la membrane interne des mitochondries.

Cette affinité provoque des lésions site-spécifiques de la mitochondrie (Nicolay et al., 1984).

La doxorubicine est à l’origine d’une cardiotoxicité de type I, c’est-à-dire irréversible par

mort de la cellule cardiaque par apoptose ou nécrose cellulaire. En médecine, elle est définie

soit par une diminution de plus de 20 % de la fraction d’éjection systolique gauche pour une

valeur initiale supérieure à 50 %, ou de plus de 10 % pour une valeur initiale inférieure à 50

%, soit par la présence de signes cliniques d’insuffisance cardiaque congestive : tachycardie,

intolérance à l’effort, toux, etc … (Rahman et al., 2007).

La sévérité des effets secondaires cardiaque est gradée de 1 à 4 selon le système VCOG-CTCAE (Annexe 1).

aaaa. Epidémiologie et symptomatologie de la cardiotoxicité doxorubicine. Epidémiologie et symptomatologie de la cardiotoxicité doxorubicine. Epidémiologie et symptomatologie de la cardiotoxicité doxorubicine. Epidémiologie et symptomatologie de la cardiotoxicité doxorubicine----induiteinduiteinduiteinduite

Chez le chien, on distingue la cardiotoxicité aiguë de la cardiotoxicité chronique (Ratterree et

al., 2012) :

� La cardiotoxicité aiguë, au cours de l’injection et jusqu’à une semaine post-

chimiothérapie. Cette forme est la plupart du temps asymptomatique et auto-

résolutive en quelques heures à quelques jours, avec un très bon pronostic vital. Elle

se manifeste par des anomalies non spécifiques de l’échocardiogramme telles qu’une

augmentation du segment ST, une diminution du voltage de l’onde QRS, un

allongement de l’intervalle QT, un bloc atrio-ventriculaire, une tachycardie sinusale

ou des extrasystoles supra-ventriculaires ou ventriculaires.

� La cardiotoxicité chronique dose-dépendante, caractérisée par cardiomyopathie

dilatée avec une diminution de l’épaisseur de la paroi libre du ventricule gauche, de

la masse myocardique et de la compliance ventriculaire. Celle-ci évolue vers une

insuffisance cardiaque congestive irréversible. Les animaux présentent un tonus

sympathique plus élevé et un dysfonctionnement diastolique précoce, suivi d’un

dysfonctionnement systolique plus tardif. Cliniquement, la cardiotoxicité chronique

est caractérisée par de la toux, une intolérance à l’effort, de la fatigue et une

tachycardie, accompagnée par une diminution du voltage de l’onde QRS à

l’électrocardiogramme. Aucune étude chez le chien n’a permis de déterminer les

facteurs de risque de la cardiotoxicité chronique, même si certains sont extrapolés

depuis des études réalisées en médecine humaine : un pic plasmatique important,

100

une dose cumulative supérieure à 240 mg/m² et l’utilisation de la doxorubicine lors

d’une polychimiothérapie (Gillings et al., 2009).

Trois études permettent d’établir l’incidence d’effets secondaires cardiaques à l’administration de doxorubicine chez le chien et révèlent des modifications de l’électrocardiogramme dans 7,4 à 17,7 % des cas, et l’apparition d’une insuffisance cardiaque congestive dans 2,1 à 4 % des cas (Mauldin et al., 1992) (Gillings et al., 2009) (Ratterree et

al.,2012).

bbbb. Mécanismes à l’origine de la cardiotoxicité doxorubicine. Mécanismes à l’origine de la cardiotoxicité doxorubicine. Mécanismes à l’origine de la cardiotoxicité doxorubicine. Mécanismes à l’origine de la cardiotoxicité doxorubicine----induiteinduiteinduiteinduite

La toxicité cardiaque de la doxorubicine repose sur un ensemble de mécanismes cellulaires,

parfois communs avec les mécanismes de cytotoxicité de la doxorubicine envers les cellules

tumorales (Figure 42).

b1b1b1b1. Le stress oxydatif . Le stress oxydatif . Le stress oxydatif . Le stress oxydatif

Bien que les mécanismes mis en jeu lors de la cardiotoxicité ne soient pas totalement

élucidés, il est maintenant admis qu’ils reposent essentiellement sur une majoration d’un

processus oxydatif mettant en jeu la production de ROS. Cette production s’opère via

différents mécanismes (cf partie III.B) :

� La réduction de la doxorubicine en radical semi-quinone, qui en présence de

dioxygène moléculaire est à l’origine de la formation de radicaux superoxydes. Ces

radicaux forment ensuite des radicaux hydroxyles, sous la dépendance d’un cofacteur

Fe (III).

� La complexation du fer (III) avec la doxorubicine et l’oxydation du complexe par auto-

oxydation ou par le système cytochrome P450 en radical semi-quinone et fer (II) qui,

au contact de dioxygène moléculaire, réagit pour former des ROS. Ce phénomène

s’auto-entretient par dérégulation de l’homéostasie ferrique.

Cette surproduction de ROS induit au niveau de toutes les structures cellulaires du

cardiomyocyte, une augmentation de la peroxydation lipidique, aboutissant à des altérations

membranaires. Ces anomalies de la perméabilité membranaire ont de multiples

conséquences sur l’homéostasie ionique. Les perturbations du flux calcique qui en découlent

altèrent la contractilité myocardique. De plus, les lésions mitochondriales induites

participent à l’initiation de processus apoptotiques par libération, à partir de la

mitochondrie, du cytochrome c qui active les caspases pro-apoptotiques. Par ailleurs, la

majoration du stress oxydatif participe à la modulation de différentes voies de signalisation

intracellulaires dont :

� L’activation des voies des mitogen-activated protein kinases (MAPK) et des stress-

activated protein kinases (SAPK), dont certaines, comme celle de JNK, à l’origine de

l’activation de facteurs pro-apoptotiques (Bax, Bad) et de l’inactivation de facteurs

anti-apoptotiques de la famille des Bcl-2 (Sordet et al., 2003).

101

� L’activation de la voie du facteur de transcription nuclear factor-kappa B (NF-κB), à

l’origine de la transcription de gènes de la réponse inflammatoire (cytokines,

chémokines), mais également des gènes codant pour de protéines modulant

l’apoptose telles que Bcl-XL et FasL (Wang et al., 2002).

Le processus oxydatif se poursuit bien après l’arrêt du traitement, expliquant l’apparition

retardée de la cardiomyopathie induite par la doxorubicine.

On observe également une augmentation de l’expression de l’enzyme monoxyde d’azote

synthase inductible (iNOS) ainsi que de son ARNm au niveau du myocarde (Delemasure et

al., 2006) (Li et al., 2006). Le monoxyde d’azote formé diffuse facilement au travers des

membranes et des différents compartiments cellulaires, ce qui permet son interaction avec

l’anion superoxyde, produisant en grande quantité du peroxynitrite, qui potentialise les

altérations initialement induites par les ROS : peroxydation lipidique, inactivation d’enzymes

et de protéines intervenant dans la contractilité cardiaque ou dans la chaîne respiratoire

mitochondriale.

Il se pourrait également que les métabolites aglycones de la doxorubicine interviennent dans

le stress oxydatif au sein des cardiomyocytes. En effet, comme ils ne possèdent plus de

groupe daunosamine, ils sont plus liposolubles et diffusent donc mieux au sein des

compartiments cellulaires que le composé parent. Il se peut que ceux-ci soient à l’origine de

la production de ROS, notamment au niveau des mitochondries. Ce mécanisme est un des

mécanismes suspectés expliquant la cardiotoxicité aiguë de la doxorubicine (Sokolove,

1994).

L’échec thérapeutique de l’utilisation de certains antioxydants laisse penser que la

production de ROS n’est pas le seul mécanisme à l’origine de la cardiotoxicité de la

doxorubicine. On observe alors l’émergence d’hypothèses alternatives et/ou

complémentaires.

b2b2b2b2. L’inhibition de la topoisomérase de type II. L’inhibition de la topoisomérase de type II. L’inhibition de la topoisomérase de type II. L’inhibition de la topoisomérase de type IIββββ

Contrairement aux cellules tumorales proliférantes, riches en ADN topoisomérase de type

IIα, les cellules cardiaques contiennent principalement l’isomère β (Vavrova et al., 2013).

L’inhibition de l’ADN topoisomérase de type IIβ par la doxorubicine conduit à la répression

des gènes de facteurs de transcription impliqués dans la survie cellulaire et dans la synthèse

de protéines du sarcomère telles que l’actine-α, les troponines ou la chaîne légère

régulatrice de la myosine. De plus, cette interaction avec l’isomère β pourrait être à l’origine

d’une diminution de l’expression génique de la pompe Ca2+-ATPase du réticulum

sarcoplasmique (SERCA), conduisant à des perturbations des flux calciques, à l’origine d’une

perturbation de la contractilité cardiaque (Appel et al., 2007).

102

b3b3b3b3. Le rôle du métabolite doxorubicinol dans la cardiotoxicité. Le rôle du métabolite doxorubicinol dans la cardiotoxicité. Le rôle du métabolite doxorubicinol dans la cardiotoxicité. Le rôle du métabolite doxorubicinol dans la cardiotoxicité

Le métabolite alcool secondaire de la doxorubicine, le doxorubicinol, semble avoir un rôle

prépondérant dans la cardiotoxicité de la doxorubicine. En effet, l’analyse post-mortem

montre que le doxorubicinol est le métabolite le plus abondant retenu au sein des

cardiomyocytes (Stewart et al., 1993). La formation prépondérante de ce métabolite au sein

des cellules cardiaques s’expliquerait par l’induction par le peroxyde d’hydrogène de

certaines aldo-céto réductases cardiaques, similaires à celles réduisant la chaîne latérale de

la doxorubicine. Cette conversion facilitée pourrait être accompagnée par une diminution de

la formation de ROS, expliquant la réduction de la concentration en ROS au sein des cellules

cardiaques et de la sensibilité aux antioxydants au cours de l’installation de la

cardiomyopathie (Gervasi et al., 1986) (Licata et al., 2000).

Des études sur des modèles murins montrent l’implication du doxorubicinol dans la

cardiomyopathie. En effet, une augmentation de la susceptibilité à la cardiomyopathie est

corrélée avec une conversion plus importante de la doxorubicine en son métabolite (Lanza

et al., 1989). De plus, les anthracyclines ne présentant pas de chaîne latérale carbonylée, ou

avec une affinité moindre pour les réductases induisent une cardiomyopathie moins sévère

et plus progressive (Cirillo et al., 2000).

Le doxorubicinol semble pouvoir induire une cardiotoxicité par des mécanismes pouvant

impliquer ou non le fer intracellulaire.

Concernant les mécanismes fer-indépendants, des études montrent que le doxorubicinol est

plus apte que la doxorubicine à inhiber la SERCA, l’échangeur sodium/calcium de la

membrane plasmique et le récepteur à la ryanodine 2 (RyR2), perturbant le cycle

excitation/contraction des myocytes. Le doxorubicinol est également à l’origine de la

suppression de certains gènes, anciennement attribuée à la doxorubicine (Olson, Mushlin,

1990).

Concernant les mécanismes fer-dépendants, le doxorubicinol convertit l’aconitase

cytoplasmique en IRP-1, permettant la libération de fer et la production de ROS (cf partie

III.B.1.c). Cependant, la conversion chronique de la doxorubicine en doxorubicinol perturbe

le mécanisme de conversion de l’aconitase en IRP-1, qu’il convertit en une protéine non

fonctionnelle, dénuée d’activité de liaison avec l’ARNm et incapable de retrouver l’activité

aconitase. Ces modifications sont attribuées aux modifications oxydatives des résidus

cystéines (Minotti et al., 1998) (Brazzolotto et al., 2003).

La protéine non fonctionnelle sera incapable de jouer le rôle de senseur du niveau de fer et

d’adapter les processus cellulaires de séquestration et/ou relargage du fer aux besoins de la

cellule. En effet, en plus de ne plus moduler l’expression de la ferritine et du TfR (cf partie

III.B.1.c), IRP-1 ne régule plus l’expression d’autres enzymes reliées à l’utilisation (erythroid

aminolevulinate synthase), l’absorption (DMT1/Nramp2) et le relargage (ferroportin

1/IREG1/MTP1) du fer.

103

De plus, l’inactivation permanente de l’aconitase cytoplasmique réduit l’apport en substrat

de la forme cytoplasmique de l’isocitrate déshydrogénase, diminue la formation de NADH

par cette enzyme et contribue à l’altération de la balance oxydo-réductrice et métabolique

de la cellule (Narahari et al., 2000).

b4b4b4b4. Altérations des mitochondries et du métabolisme énergétique. Altérations des mitochondries et du métabolisme énergétique. Altérations des mitochondries et du métabolisme énergétique. Altérations des mitochondries et du métabolisme énergétique

Les mitochondries, qui représentent entre 20 et 40 % du volume des cardiomyocytes, sont

une des cibles préférentielles de la doxorubicine, en raison d’une forte affinité pour le

cardiolipide, présent en quantité importante dans la membrane interne des mitochondries.

Elles sont aussi la source la plus importante de ROS cellulaires en conditions

physiopathologiques.

La doxorubicine est donc fortement concentrée dans la mitochondrie et plus

particulièrement au niveau des protéines associées au cardiolipide dont la NADH

déshydrogénase et le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale (Goormaghtigh et

al., 1990). Les complexes III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale sont également

altérés par la doxorubicine, ce qui conduit à la réduction du gradient électrochimique de

protons et donc à une diminution de la synthèse d’ATP par l’ATP synthase (Tokarska-

Schlattner et al., 2006) (Berthiaume, Wallace, 2007).

L’altération du métabolisme énergétique conduit à une baisse des réserves énergétiques des

cellules cardiaques. En plus de la diminution de production d’ATP par la chaîne respiratoire,

la doxorubicine est à l’origine d’une diminution de l’utilisation des acides gras par inhibition

de la carnitine O-palmitoyltransférase. On observe également une diminution de

l’expression et de l’activité de l’AMP-activated protein kinase (AMPK), senseur du

métabolisme énergétique et du peroxisome proliferator-activated receptor gamma

coactivator 1-α (PGC1-α), régulateur de la biogénèse mitochondriale d’énergie. Cela aboutit

à l’arrêt des imports mitochondriaux de sources d’énergie et à l’inhibition de la β-oxydation

des acides gras (Tokarska-Schlattner et al., 2002). Enfin, la doxorubicine régule également de

manière négative la glycolyse par l’inhibition de la phosphofructokinase, diminuant la

capacité compensatrice de la cellule par le shift glucidique.

Les ROS conduisent à l’augmentation de la perméabilité de la membrane interne de la

mitochondrie par peroxydation lipidique, à l’origine du dysfonctionnement de la

mitochondrie et donc de la diminution de la production d’énergie cellulaire.

b5b5b5b5. Le dysfonctionnement de la voie β. Le dysfonctionnement de la voie β. Le dysfonctionnement de la voie β. Le dysfonctionnement de la voie β----adrénergiqueadrénergiqueadrénergiqueadrénergique

Le système nerveux sympathique joue un rôle déterminant dans le contrôle de la fonction

cardiaque, notamment par une réponse β-adrénergique, médiée par trois récepteurs β-

adrénergique (β-AR).

104

� Les récepteurs β1-adrénergiques (β1-ARs)

Les β1-ARs sont majoritaires au sein des cellules cardiaques. Ils sont couplés à une protéine

G stimulatrice (Gs) à l’origine de l’activation de l’adénylate cyclase (AC). Celle-ci est à

l’origine de la production du second messager AMPc, qui va activer la protéine kinase A

(PKA). Sa sous-unité catalytique phosphoryle de nombreux effecteurs, à l’origine d’un effet

inotrope et lusitrope positifs. La stimulation de la voie Gs/AMPc/PKA conduit également à

l’activation de la glycogène synthase kinase 3β (GSK3β), intervenant dans le métabolisme du

glycogène et des protéines, et pouvant activer la protéine Bax pro-apoptotique. Lors d’une

stimulation soutenue des β1-ARs, ceux-ci se découplent de Gs, au profit de l’activation de la

protéine kinase calcium/calmoduline-dépendante II (CaMKII), principal effecteur des effets

pro-apoptotiques récepteurs β1-dépendants (Bernstein et al., 2011).

La stimulation de β1-AR est donc à l’origine d’un effet inotrope positif mais est également

pro-apoptotique.

� Les récepteurs β2-adrénergiques (β2-ARs)

Les β2-ARs sont couplés à la protéine Gs, mais également à la protéine G inhibitrice (Gi). L’activation de Gi conduit à l’inhibition de la voie Gs/AC/AMPc mais également au recrutement d’autres voies de signalisation dont la voie anti-apoptotique PI3K/Akt, à l’origine de la phosphorylation de GSK3β, de l’inhibition de la caspase 9 et de l’activation de Bcl. L’activation de Gi induit également la voie des phospholipases A2 cytosoliques (PLA2c), présentant un rôle dans l’inflammation cellulaire. Les β2-ARs peuvent également activer la NADPH oxydase ce qui conduit à l'activation de la voie MAPK (Mitogen-activated protein

kinase) et à la production de ROS pouvant être responsables de l'induction des voies apoptotiques (Di Lisa et al., 2011). Les β2-ARs contribuent donc à la modulation des voies de l’apoptose, principalement par activation via la voie Gs/AMPc/PKA ou inhibition via la voie Gi/PI3K/Akt (Zhu et al., 2001).

� Les récepteurs β3-adrénergiques (β3-AR)

Les β3-ARs sont peu exprimés dans un cœur sain, leur impact sur la contraction cardiaque

est donc minoritaire. Ils sont couplés aux protéines Gi et induisent l’activation de la voie du

monoxyde d’azote (NO) qui conduit à la production de la guanylyl cyclase (GC) par

l’activation de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS). La GC permet ensuite la

production de GMPc, activant la protéine kinase G (PKG) et à l’origine d’un effet inotrope

négatif (Gauthier et al., 1998) (Birenbaum et al., 2008).

La doxorubicine est à l’origine d’une dysfonction β-adrénergique en agissant de façon

chronique sur les différents récepteurs. On observe une augmentation de la noradrénaline

circulante avec une régulation négative de l’expression des β1-ARs et de la protéine Gs ainsi

qu’une régulation positive des β3-ARs et de la protéine Gi (Figure 41). On observe alors une

inversion du ratio d’expression entre β1-AR et β3-AR, qui limite l’effet inotrope positif. La

stimulation prolongée des β1-Ars provoque leur découplage de la protéine Gs. L’expression

des β2-ARs est peu modifiée, permettant le maintien d’une activité anti-apoptotique

(Fajardo et al., 2006).

105

Figure 41 : Signalisation β-adrénergique cardiaque et doxorubicine

AA : acide arachidonique ; Akt : protéine kinase B ; AC : adénylate cyclase ; AMPc : adénosine monophosphate

cyclique ; Bax : Bcl-2 associated X protein ; CaMKIIδC : protéine kinase calcium/calmoduline-dépendante II δC ;

eNOS : oxyde nitrique synthase endothéliale ; GC : guanylate cyclase ; Gi : protéine G inhibitrice ; GMPc :

guanosine monophosphate cyclique ; Gs : protéine G stimulatrice ; GSK3β : glycogène synthase kinase 3β ;

PI3K : phosphoinositide-3 kinase ; PKA : protéine kinase A ; PKG : protéine kinase G ; PLA2c : phospholipases A2

cytosoliques

b6b6b6b6. L’altération de l’homéostasie calcique. L’altération de l’homéostasie calcique. L’altération de l’homéostasie calcique. L’altération de l’homéostasie calcique

Au cours d’un cycle cardiaque, la dépolarisation de la membrane des cardiomyocytes

pendant le potentiel d’action permet l’ouverture des canaux calciques de type L. L’entrée de

calcium par ces canaux et donc l’élévation locale du calcium induit l’activation des

récepteurs RyR2, entraînant une sortie massive de calcium du réticulum sarcoplasmique. Le

calcium ainsi libéré se fixe à la troponine C, ce qui entraine l’interaction des myofilaments

d’actine et de myosine et le raccourcissement des sarcomères, responsable de la contraction

cardiaque (Bers, 2002).

La calséquestrine est une protéine de stockage du calcium, présente dans le réticulum

sarcoplasmique. Elle peut interagir directement ou indirectement avec le récepteur RyR2 et

joue un rôle dans la régulation de son activité (Gaburjakova et al., 2013).

Pour permettre la relaxation cardiaque, la concentration en calcium cytosolique doit

diminuer rapidement. Le calcium est libéré par la troponine C et capté majoritairement par

la SERCA dans le réticulum sarcoplasmique, ou extrudé de la cellule par l’échangeur

sodium/calcium présent au niveau de la membrane plasmique. L’ensemble de ce processus

est nommé couplage excitation-contraction.

La doxorubicine peut induire une altération de l’homéostasie calcique conduisant à un

dysfonctionnement cardiaque diastolique, puis systolique au cours de l’évolution de la

cardiomyopathie.

106

L’expression de tous les acteurs de l’homéostasie calcique et notamment de la SERCA, de

l’échangeur sodium/calcium et du RyR2 est diminuée, hormis celle du canal calcique de

type L. De plus, la doxorubicine et surtout son métabolite principal, le doxorubicinol, se

fixent au récepteur RyR2 et à la calséquestrine, induisant une désynchronisation des

ouvertures et fermetures du canal calcique et une libération plus importante de calcium en

intracytoplasmique. L’ouverture du canal récepteur RyR2 est due à une action directe par

fixation, ou indirecte par oxydation de ses résidus thiols par les ROS. La fonction de

recapture du calcium par la SERCA est également inhibée, par oxydation de ses groupements

thiols (Gambliel et al., 2002).

Elle induit une augmentation de la concentration cytoplasmique de calcium par diminution

du captage de celui-ci par le réticulum sarcoplasmique tout en maintenant sa sortie. On

observe alors une altération de l’homéostasie calcique et de la relaxation cardiaque, ou

dysfonction diastolique. Secondairement, le stock de calcium mobilisable lors de la

contraction se réduit, ce qui peut expliquer une réduction de la contractilité cardiaque et

une dysfonction systolique (Appel et al., 2007).

L’altération du couplage excitation-contraction cardiaque implique également la

phosphorylation de la protéine kinase calcium/calmoduline dépendante, protéine

intervenant dans le maintien de l’homéostasie calcique.

Cette perturbation de l’homéostasie calcique peut être à l’origine de la cardiotoxicité aigue

de la doxorubicine. En effet¸ la doxorubicine conduit à une diminution de l’amplitude des

transitoires calciques et ralentit ainsi la contraction et la relaxation, et cela avant même la

modification d’expression des différents acteurs de l’homéostasie calcique. De plus, le

doxorubicinol inhibe le courant potassique sortant, responsable de la phase de

repolarisation du potentiel d’action cardiaque, ce qui se traduit par un allongement de la

durée du potentiel d’action et donc par un allongement de l’intervalle QT sur l’ECG (Wang et

al., 2001).

Les altérations de l’homéostasie calcique par la doxorubicine concernent toutes les

protéines impliquées dans le couplage excitation contraction, ce qui a pour conséquence

une altération de la contractilité et de la relaxation cardiaque. Cependant, les mécanismes à

long terme et le rôle de la signalisation calcique dans le développement de la cardiotoxicité

chronique restent à être caractérisés.

b7b7b7b7. Remodelage de la matrice extracellulaire. Remodelage de la matrice extracellulaire. Remodelage de la matrice extracellulaire. Remodelage de la matrice extracellulaire

L’altération dans la structure et la composition de la matrice extracellulaire contribue au

développement de l’insuffisance cardiaque (Spinale, 2007).

La doxorubicine augmente la transcription et la traduction des métalloprotéinases 2 et 9

(MMP-2, MMP-9). Les métalloprotéinases sont des enzymes protéolytiques qui dégradent

les composants de la matrice extracellulaire ainsi que des substrats non matriciels comme

certaines protéines cardiaques spécifiques (Octavia et al., 2012).

107

L’induction du stress oxydatif, du dysfonctionnement mitochondrial, de l’inhibition d’un

certain nombre de gènes codants pour des protéines cardiaques, de l’altération de

l’homéostasie calcique et de la signalisation β-adrénergique, contribuent à l’activation des

différentes voies de mort cellulaire des cardiomyocytes.

b8b8b8b8. La modulation des voie. La modulation des voie. La modulation des voie. La modulation des voies de mort cellulaire par la doxorubicines de mort cellulaire par la doxorubicines de mort cellulaire par la doxorubicines de mort cellulaire par la doxorubicine

La doxorubicine va principalement être à l’origine d’une stimulation de l’apoptose et de la

nécrose cellulaire. Des biopsies endomyocardiques lors de cardiomyopathie doxorubicine-

induite révèlent des altérations caractéristiques de la nécrose cellulaire telles que la

déformation du réticulum sarcoplasmique, la formation de vacuoles cytoplasmiques, des

distorsions myofibrillaires ou la raréfaction des myofibrilles. De plus, environ 1% des cellules

cardiaques sont concernées par l’apoptose cellulaire (Mauldin et al., 1992).

� L’apoptose cellulaire

Il va y avoir à la fois une altération de la voie extrinsèque et de la voie intrinsèque de la

doxorubicine :

� Concernant la voie intrinsèque, l’induction d’un stress oxydatif et l’altération de

l’homéostasie calcique cytosolique ont pour conséquence l’augmentation de la

concentration calcique dans les mitochondries. Celle-ci conduit à l’ouverture des

pores de transition de la perméabilité membranaire, responsable de la perte de

potentiel mitochondrial, du gonflement de la mitochondrie et de la rupture de la

membrane externe. On observe alors le relargage du cytochrome c et de

l’apoptosis inducing facteur (AIF) dans le cytoplasme, à l’origine de l’apoptose

cellulaire (Childs et al., 2002).

� Concernant la voie extrinsèque, les cardiomyocytes sont généralement résistants

à l’induction de l’apoptose via le récepteur de mort Fas. Cependant, plusieurs

études ont montré que l’apoptose des cardiomyocytes induite par la

doxorubicine peut se produire via la voie Fas. En effet, la voie calcineurine et plus

particulièrement le Nuclear Factor Activated T-cells (NFAT-4) ainsi que le facteur

de transcription NF-κB activé par les ROS conduisent à une surexpression de Fas

et à l’activation des gènes pro-apoptotiques (Kalivendi et al., 2005).

A la suite de l’activation de la voie extrinsèque et intrinsèque, l’activation des caspases mène

au clivage de protéines impliqués dans la réparation de l’ADN, dont PARP-1 (Pacher et al.,

2002). D’autres molécules comme la JNK, la p38 kinase (Zhu et al., 1999) ou les facteurs de

transcriptions NF-κB (Wang et al., 2002) et GATA-4 (Kim et al., 2003) sont activés lors de

l’apoptose des cardiomyocytes. A l’inverse, des molécules anti-apoptotiques comme Bcl-xL,

PI3K et Akt sont inhibées (Negoro et al., 2001).

108

� La nécrose cellulaire

La nécrose serait provoquée par l’induction du stress oxydatif et l’accumulation de calcium

dans les mitochondries, à l’origine d’une déplétion en énergie (Lebrecht, Walker, 2007). De

plus, la doxorubicine active les calpaines, enzymes responsables de la protéolyse calcium-

dépendante, responsables de la dégradation de la connectine, protéine du myofilament

impliquée dans le contrôle de l’assemblage des protéines sarcomériques et qui régule

l’élasticité du sarcomère. Ceci mène à l’accélération de la dégradation des myofilaments et à

la nécrose induite par la doxorubicine (Lim et al., 2004).

� L’autophagie cellulaire

Les résultats concernant le rôle de l’autophagie dans la cardiotoxicité de la doxorubicine

sont contradictoires. Sur quatre études in vivo sur des modèles murins, seule la moitié ont

montré une activation du processus d’autophagie par la doxorubicine (Dirks-Naylor, 2013)

(Sishi et al., 2013). Les études montrant une stimulation de l’autophagie associent cette

activation à une diminution de l’expression de Bcl-2 et du facteur de transcription GATA-4

(Kobayashi et al., 2010).

cccc. Diagnostic de la cardiotoxicité doxorubicine. Diagnostic de la cardiotoxicité doxorubicine. Diagnostic de la cardiotoxicité doxorubicine. Diagnostic de la cardiotoxicité doxorubicine----induiteinduiteinduiteinduite

Chez le chien, étant donné le coût et la disponibilité des différentes techniques, il existe peu

de méthodes diagnostiques de la cardiomyopathie.

Le gold standard du diagnostic de cardiomyopathie induite par la doxorubicine repose sur

la biopsie endomyocardique du ventricule droit. Cette technique est rarement utilisée étant

donné son caractère invasif (Gharib, Burnett, 2002).

La technique la plus couramment employée est l’échocardiographie, permettant l’évaluation

de la fonction systolique et diastolique. La mesure la plus utilisée sera celle de la fraction de

raccourcissement du ventricule gauche, dépendant des diamètres télésystolique et

télédiastolique du ventricule. On considère que l’animal présente un dysfonctionnement

cardiaque si on observe une fraction de raccourcissement inférieure à 25%, même si des

variations intraspécifiques existent. Cette mesure présente cependant une sensitivité limitée

pour la détection précoce de la cardiomyopathie doxorubicine-induite (Lotrionte et al.,

2013). Il est également possible de mesurer le volume d’éjection systolique gauche. Pour la

mesure de la fonction diastolique, on peut mesurer le temps de relaxation isovolumique

(IVRT) et le ratio vélocité de l’onde E/ vélocité de l’onde A, une diminution de celui-ci avec

une augmentation de l’IVRT montrant un dysfonctionnement diastolique. Cette méthode

présente une meilleure sensibilité de diagnostic précoce mais son aspect prédictif dans

l’évaluation de la cardiomyopathie nécessite d’autres études (Tater et al., 2017).

L’utilisation de biomarqueurs est encore peu courante chez le chien pour détecter une

cardiomyopathie induite par les anthracyclines. Les troponines sont des protéines

régulatrices impliquées dans la contraction cardiaque, présentes en concentration

importante et rapidement libérées dans le sang après la survenue des lésions cardiaques

109

(Langhorn, Willesen, 2016). D’après une étude menée sur 44 chiens, l’augmentation de la

troponine I est le marqueur biologique et clinique le plus précoce de l’insuffisance cardiaque

induite par la doxorubicine le chien (Selting et al., 2004). Le facteur natriurétique cardiaque

de type B (BNP) est un peptide sécrété par les cellules cardiaques ventriculaires lors d’une

augmentation du travail cardiaque. La fraction terminale de ce facteur, appelée NT-proBNP

est un biomarqueur utilisé pour détecter certaines cardiomyopathies dilatées. Une étude

portant sur 13 chiens recevant de la doxorubicine pendant 3 mois n’a pas révélé

d’augmentation plasmatique du marqueur NT-proBNP (Gallay-Lepoutre et al., 2016).

dddd. Traitement. Traitement. Traitement. Traitement et prévention de la cardiotoxicité doxorubicineet prévention de la cardiotoxicité doxorubicineet prévention de la cardiotoxicité doxorubicineet prévention de la cardiotoxicité doxorubicine----induiteinduiteinduiteinduite

Il n’existe pas de traitement spécifique de la cardiomyopathie induite par la doxorubicine. La

plupart du temps, les patients sont réfractaires aux traitements conventionnels : inhibiteurs

des enzymes de conversion de l’angiotensine (IECA), furosémide et pimobendane (Atkins et

al., 2009).

La prévention repose sur le respect d’une dose-cumulative maximale de de 180 mg/m², soit

six séances avec une dose de 30 mg/m², afin de limiter la cardiotoxicité (Mauldin et al.,

1992). Il convient également d’injecter lentement la doxorubicine (sur 20 à 30 minutes) afin

de diminuer le pic plasmatique responsable de la formation de radicaux libres.

Il est également possible d’administrer 30 minutes avant la doxorubicine un chélateur du fer,

le dexrazoxane, à une concentration égale à dix fois la dose de doxorubicine injectée, afin de

diminuer le risque de cardiotoxicité (FitzPatrick et al., 2010). Cette molécule est cependant

très peu utilisée en médecine vétérinaire étant donné son coût et sa non disponibilité en

officine. On réalise également un suivi par échocardiographie avant les première et

quatrième séances de chimiothérapie à base de doxorubicine.

L’utilisation de doxorubicine encapsulée permettrait d’augmenter les doses cumulées sans

cardiotoxicité, mais cette présentation n’est pas disponible en médecine vétérinaire et

nécessite des études supplémentaires autre que des essais pré-cliniques (Vail et al., 1997).

7777. Principales contre. Principales contre. Principales contre. Principales contre----indications de la doxorubicine en médecine indications de la doxorubicine en médecine indications de la doxorubicine en médecine indications de la doxorubicine en médecine vétérinairevétérinairevétérinairevétérinaire

Il existe plusieurs contre-indications à l’utilisation de la doxorubicine chez l’animal, liées à la

toxicité et aux effets indésirables de celle-ci :

� Une hypersensibilité connue à la doxorubicine, à d’autres anthracyclines ou aux

anthracènediones, dont l’épirubicine et la mitoxantrone.

� Une hypoplasie médullaire passagère ou persistante.

� Une insuffisance hépatique marquée.

110

� Une atteinte cardiaque, pouvant être une insuffisance myocardique grave, des

antécédents de cardiopathie grave ou la présence d’arythmies non sinusales.

� Des antécédents thérapeutiques comportant l’administration de doxorubicine ou

d’autres anthracyclines et anthracènediones, jusqu’à concurrence de la dose

cumulée maximale.

8888. Mutation et toxicité. Mutation et toxicité. Mutation et toxicité. Mutation et toxicité

Dans certaines races de chien, on observe une sensibilité plus importante à certaines

molécules, à l’origine d’une toxicité plus importante, notamment à la doxorubicine. Cela est

dû à une modification de l’expression des transporteurs d’efflux P-gp, à l’origine d’une

accumulation plus importante de la doxorubicine au sein des cellules. Cette sensibilité est

due à une mutation du gène mdr1 correspondant à une délétion de quatre paires de base

dans l’exon 4 et appelée mutation ABCB1-1Δ ou MDR1-1Δ. Cette mutation engendre

l’apparition de multiples codons stop prématurés, à l’origine de la production d’une protéine

P-gp tronquée et non fonctionnelle, avec seulement 10 % de la séquence d’acide aminés en

commun avec la protéine non mutée (Mealey et al., 2001).

Cette mutation touche en premier lieu les chiens de race, particulièrement les races

apparentées aux Colleys. On peut citer parmi les races les plus touchées par cette mutation

le Colley, le Border Collie, le Berger Australien, le Berger Australien miniature, le Berger

Anglais, le Whippet à poil long, le MacNab, le Berger Anglais ancestral, le Berger de Shetland,

le Silken Windhound et le Berger Blanc Suisse (Tableau VI) (Neff et al., 2004). Dans certaines

de ces races, les chiens porteurs de cette mutation représentent une part prédominante de

la population de cette race. En France, sur 83 colleys testés, 80% portent au moins un allèle

muté ABCB1-1Δ, dont 32 % sont hétérozygotes et 48 % sont homozygotes mutés (Hugnet et

al., 2004).

Tableau VI : Fréquence de l’allèle mdr1 mutée et des génotypes D’après l’étude de Neff et al. (2004).

Races Nombre de chiens

Allèle mutée (%)

-/- (%) -/+ (%) +/+ (%)

Berger australien 178 16,6 1,7 29,8 68,5

Berger australien miniature 56 25,9 3 ,6 44,6 51,8

Colley 263 54,6 31,2 46,8 22,0

Berger anglais 91 7,1 0 14,3 85,7

Whippet à poils longs 89 41,6 15,7 51,7 32,6

McNab 35 17,1 2,8 28,6 68,6

Bobtail 151 3,6 0 7,3 92,7

Shetland 190 8,4 1,1 14,7 84,2

Silken Windhound 84 17,9 1,2 33,3 65,5

111

Chez le chien, la mutation du gène mdr1 est à l’origine d’une augmentation de la toxicité de

la doxorubicine chez les individus porteurs. Cela est expliqué par une augmentation

d’environ 25 % de l’AUC de la doxorubicine plasmatique chez des chiens homozygotes

mutés. De plus, par extrapolation, il faudrait utiliser la dose de 10,7 +/- 5,9 mg/m² chez les

chiens homozygotes mutés pour obtenir une toxicité gastro-intestinale équivalente à celle

des chiens homozygotes non mutés traités à 30 mg/m² (Gustafson, Thamm, 2010).

La cytotoxicité de la doxorubicine et de son principal métabolite, le doxorubicinol, est à l’origine

de l’activation de nombreux mécanismes menant à différents effets indésirables, spécifiques ou

non, à court-terme ou à plus long terme. Ces effets indésirables doivent être gradés selon la

classification VCOG-CTCAE et pris en compte dans la réévaluation possible du protocole de

chimiothérapie.

Parmi ces effets indésirables, on peut citer :

� Le choc histaminique, toxicité spécifique d’apparition suraiguë et de gravité variable. Il

est lié à la dégranulation des mastocytes dans l’organisme.

� La toxicité gastro-intestinale, toxicité non spécifique liée soit à la stimulation de la

trigger zone et responsable de vomissements dans les 24 heures suivant l’injection, soit

à la cytotoxicité de la doxorubicine directement sur les entérocytes immatures, à

l’origine de vomissements, d’anorexie et de diarrhée dans les deux à cinq jours suivant

l’injection.

� La toxicité hématologique, toxicité non spécifique de la doxorubicine liée à la forte

prolifération des cellules souches des différentes lignées cellulaires sanguines. Elle est

principalement à l’origine d’une neutropénie et d’une thrombocytopénie transitoires,

avec un nadir entre sept et dix jours pour la neutropénie.

� La toxicité cutanée par extravasation de la doxorubicine, toxicité spécifique à l’origine

d’un érythème pouvant évoluer vers une nécrose à extension locale en plusieurs

semaines. Le traitement le plus efficace reste le parage chirurgical des zones nécrosées

afin d’éviter l’extension de celles-ci.

� L’alopécie, effet indésirable spécifique de la doxorubicine mais rare chez le chien, elle

peut survenir près une seule injection de doxorubicine.

112

� La toxicité cardiaque, toxicité spécifique de la doxorubicine. On distingue deux types de

toxicité cardiaque :

• Aiguë, elle survient au cours de l’injection ou dans les jours qui suivent. La

plupart du temps asymptomatique et auto-résolutive, elle est rarement

objectivée chez le chien. Son origine exacte reste indéterminée mais elle

pourrait être due à la formation de ROS via les métabolites aglycones de la

doxorubicine et/ou aux perturbations des flux calcique et potassique,

modifiant le couplage excitation-contraction des cardiomyocytes.

• Chronique et dose-cumulative, elle survient plusieurs mois après la fin

de la chimiothérapie. Elle est due à l’apparition d’une cardiomyopathie

dilatée par remodelage du cœur, via de nombreux mécanismes

cellulaires (Figure 42). Sa prévention repose principalement sur une

limitation de la dose cumulative à 180 mg/m².

Ces effets indésirables sont parfois exacerbés chez certains individus, notamment ceux

porteurs de la mutation du gène mdr1 codant pour la glycoprotéine G, à l’origine d’une

diminution de l’efflux de la doxorubicine en dehors des cellules.

Figure 42: Principaux mécanismes de cardiotoxicité de la doxorubicine

β-AR : récepteur β-adrénergique ; CalS : calséquestrine ; cTn : troponine cardiaque ; cyt c : cytochrome c ; DOX : doxorubicine ; DOX° : radical semi-quinone ;

DOXol : doxorubicinol ; MAPK : mitogen-activted protein kinase ; MLC-2 : chaîne légère régulatrice de la myosine ; NCX : échangeur calcium/sodium ; NF-κB :

nuclear factor-κB ; RyR2 : récepteur à la ryanodine 2 ; SERCA : pompe Ca2+

-ATPase du réticulum sarcoplasmique ; Top IIβ : ADN topoisomérase de type IIβ.

113

114

115

Partie IIPartie IIPartie IIPartie II : Etude expérimentale de la : Etude expérimentale de la : Etude expérimentale de la : Etude expérimentale de la

pharmacocinétique et de la toxicité de la pharmacocinétique et de la toxicité de la pharmacocinétique et de la toxicité de la pharmacocinétique et de la toxicité de la doxorubicine en médecine vétérinairedoxorubicine en médecine vétérinairedoxorubicine en médecine vétérinairedoxorubicine en médecine vétérinaire

116

La pharmacocinétique de la doxorubicine a été étudiée dans de nombreuses espèces

(Homme, chat, souris, rat, lapin, perroquet, etc.…) mais les études chez le chien restent

sporadiques. Malgré l’utilisation fréquente de la doxorubicine au sein de cette espèce, les

études de pharmacocinétique sur des chiens non sains sont rares (Gustafson et al., 2002)

(Selting et al., 2006). La plupart des données de pharmacocinétique sont principalement

issues d’études sur des chiens sains (Arrington et al., 1994) (Oosterbaan et al., 1984) (Timour

et al., 1988) ou se reposant sur des simulations de populations de chiens malades

(Gustafson, Thamm, 2010). La posologie (30 mg/m² ou 1 mg/kg) de la doxorubicine utilisée

chez le chien repose sur des études de 1989 et 1994, montrant une augmentation de la

toxicité chez les chiens de moins de dix kilogrammes lors de l’utilisation de la doxorubicine à

la dose standard de 30 mg/m² (Ogilvie, Reynolds, et al., 1989) (Arrington et al., 1994).

Depuis, aucune étude sur l’intérêt de cette distinction de posologie n’a été réalisée.

Plusieurs méthodes de quantification de la doxorubicine et de son métabolite principal, le

doxorubicinol, dans des liquides biologiques ou des tissus ont été mises au point. La plupart

du temps, ces méthodes reposent sur une technique de chromatographie en phase liquide

couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC/MS/MS), ou de chromatographie en

phase liquide à haute performance (HPLC) avec détection par ultraviolet ou fluorimétrie

(Tableau XIII). Malheureusement, certaines de ces études manquent de sensibilité et/ou de

spécificité et présentent des méthodes d’extraction complexes (Al-Abd et al., 2009). D’autres

méthodes sont plus rarement utilisées telles que le dosage radio-immunologique sur urine

ou plasma (Rahmani et al., 1983), la voltammétrie sur urine (Chaney, Baldwin, 1985), la

spectrofluorimétrie sur sérum ou l’électrophorèse capillaire (Gavenda et al., 2001).

Parmi les méthodes analytiques LC/MS/MS et HPLC, seules quelques-unes ont été testées

sur du plasma de chien et la plupart des méthodes utilisées dans les études de

pharmacocinétique chez le chien reposent sur des méthodes HPLC testées sur d’autres

espèces mais pas chez le chien.

Les différents objectifs de cette étude sont de :

� Valider une méthode d’analyse sensible en HPLC avec détection par fluorescence

pour déterminer la concentration de doxorubicine dans le plasma de chien.

� Appliquer cette méthode d’analyse à une étude de pharmacocinétique et de toxicité

de la doxorubicine chez une population de chiens non sains. Le choix de cette

population nous permettant de limiter le recours à l’expérimentation animale et

d’évaluer la pharmacocinétique dans des conditions réelles d’emploi de la

doxorubicine.

117

I. Mise au point d’une méthode analytique de dosage de la I. Mise au point d’une méthode analytique de dosage de la I. Mise au point d’une méthode analytique de dosage de la I. Mise au point d’une méthode analytique de dosage de la doxorubicine plasmatique par HPLCdoxorubicine plasmatique par HPLCdoxorubicine plasmatique par HPLCdoxorubicine plasmatique par HPLC----fluorescencefluorescencefluorescencefluorescence

A. Mise au point de la A. Mise au point de la A. Mise au point de la A. Mise au point de la méthode analytiqueméthode analytiqueméthode analytiqueméthode analytique

1. Description des conditions d’analyse par chromatographie1. Description des conditions d’analyse par chromatographie1. Description des conditions d’analyse par chromatographie1. Description des conditions d’analyse par chromatographie

Les analyses ont été réalisées par un système de chromatographie en phase liquide à haute

performance (HPLC, Elite Lachrom) équipé d’une colonne à chromatographie Merck

LiChrospher RP-18 Endcapped (4 mm x 250 mm, 5 µm) et avec une détection par

fluorescence. Les longueurs d’ondes d’excitation (470 nm) et d’émission (580 nm) ont été

déterminées à partir de l’analyse de spectrofluorimétrie de la doxorubicine (Figure 9).

Concernant la phase mobile, plusieurs solutions ont été envisagées. La plupart des méthodes

d’analyse basées sur la chromatographie en phase liquide utilise comme phase mobile un

mélange d’une solution tampon de phosphate de potassium KH2PO4 (0,06 mmol/L, pH 3)

avec de l’acétonitrile. Cependant, l’utilisation de cette phase mobile était à l’origine de

l’encrassement notre système d’HPLC par précipitation chimique de cristaux de potassium.

La phase mobile a alors été modifiée et il a été opté pour un mélange de tampon de

phosphate mono-ammonique (NH4)H2PO4 (0,05 mmol/L, pH 3) et d’acétonitrile (70 : 30, v/v),

délivrée à un débit constant de 1 mL/min et ce à température ambiante. Le volume injecté

était de 50 µL.

Une élution avec un mode de gradient isocratique avait d’abord été envisagée mais les

temps de rétention de la doxorubicine et de l’étalon interne étaient inférieurs à cinq minutes

avec une séparation des pics non satisfaisante. L’élution a donc été réalisée en mode

gradient sur 20 minutes selon le schéma décrit dans le Tableau VII, avec un mélange phase

mobile : acétonitrile.

Tableau VII : Gradient d’élution utilisée lors de la chromatographie par HPLC

Phase mobile (en %) Acétonitrile (en %)

0 minute 100 0

5 minutes 88,2 11,8

10 minutes 70,6 29,4

15 minutes 64,7 35,3

20 minutes 100 0

2. Préparation des solutions2. Préparation des solutions2. Préparation des solutions2. Préparation des solutions

La doxorubicine hydrochloride, la daunorubicine hydrochloride (Sigma Aldrich Chemie), le

trifluoroacétate de doxorubicinol (Alsachim) et les autres composés chimiques utilisés sont

de pureté analytique.

118

Des solutions-mères de doxorubicine à 100 µg/mL et de daunorubicine à 100 µg/mL ont été

préparées par dilution du composé d’intérêt dans de l’acétonitrile. Ces solutions ont été

stockées à l’abri de la lumière à -21°C.

De plus, des solutions de travail à base de doxorubicine ou de daunorubicine à 10 µg/mL ont

été préparées en diluant les solutions-mères dans la phase mobile. Une solution de

doxorubicinol à 10 µg/mL a également été préparée en diluant le trifluoroacétate de

doxorubicinol dans de l’acétonitrile. Toutes les solutions de travail ont été conservées à

l’abri de la lumière à 4°C.

La daunorubicine est utilisée comme étalon interne lors de notre étude.

On définit également trois concentrations témoins en doxorubicine, qui serviront de

contrôle au cours de la validation de la méthode analytique. On définit ainsi les solutions

basse concentration (LQC, 0,1 µg/mL), moyenne concentration (MQC, 0,5 µg/mL) et haute

concentration (HQC, 1,5 µg/mL).

3. Préparation des échantillons de plasma3. Préparation des échantillons de plasma3. Préparation des échantillons de plasma3. Préparation des échantillons de plasma

Les échantillons plasmatiques canins utilisés pour la validation de la méthode analytique ont

été récupérés à partir d’échantillons sanguins qui ont été centrifugés à 3000 tours/minute

pendant cinq minutes puis stockés à 4°C jusqu’à analyse.

Une série d’échantillons plasmatiques supplémentés en doxorubicine, de concentrations

finales allant de 0,01 µg/mL à 1,5 µg/mL, a été préparée afin de servir d’échantillons

d’étalonnage pour vérifier la linéarité de la méthode analytique. La préparation de ces

solutions est décrite dans le Tableau VIII.

Tableau VIII : Méthode de préparation de la série d’étalonnage

Volume

solution de

travail/mère

(µL)

Volume de

phase

mobile (µL)

Concentration

finale en

solution

(µg/mL)

Concentration

plasmatique

finale (µg/mL)

10 (10 µg/mL) 990 0,10 0,01

25 (10 µg/mL) 975 0,25 0,025

50 (10 µg/mL) 950 0,5 20 µL solution 0,05

100 (10 µg/mL) 900 1 0,1

250 (10 µg/mL) 750 2,5 + 180 µL plasma 0,25

250 (10 µg/mL) 250 5 0,5

500 (10 µg/mL) 0 10 1

150 (100 µg/mL) 850 15 1,5

119

L’extraction a ensuite été réalisée par précipitation des protéines. Pour cela, on a prélevé 190 µL du plasma d’intérêt auquel on a ajouté 10 µL de l’étalon interne à 10 µg/mL, 0,4 mL d’acétonitrile et 0,4 mL de la phase mobile. L’ensemble a été homogénéisé grâce à un agitateur puis le tube à essai a été centrifugé à 3000 tours par minute pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant a été filtré par un filtre de porosité 0,45 µm dans un vial pour analyseur HPLC.

4. Vérification de la méthode de dosage4. Vérification de la méthode de dosage4. Vérification de la méthode de dosage4. Vérification de la méthode de dosage

La validation de la méthode analytique a été réalisée selon les recommandations de l’Agence

Européenne du Médicament (EMA, 2011).

� Spécificité de la méthode analytique

Une méthode est dite spécifique lorsqu’elle permet de mesurer l’analyte avec la garantie

que le signal analytique ne provient que de l’analyte sans interférence avec des éléments de

la matrice ou des impuretés. Ce critère certifie que la procédure analytique donne de façon

précise la quantité d’analyte présente dans l’échantillon.

La spécificité de la méthode est évaluée par la recherche de l’effet matrice. En

chromatographie, elle est évaluée moyennant les temps de rétention.

Pour tester la spécificité de la méthode vis-à-vis de la doxorubicine et de l’étalon interne, six

échantillons plasmatiques ont été analysés, sans supplémentation en doxorubicine et en

étalon interne, puis avec supplémentation à 0,1 µg/mL.

Figure 43 : (A) Chromatogramme de plasma blanc. (B) Chromatogramme de plasma

supplémenté en doxorubicine (DOX) et daunorubicine (DNR) à 0,1 µg/mL.

La Figure 43 présente deux chromatogrammes, le premier correspondant à un échantillon

plasmatique non supplémenté et le second à un échantillon plasmatique supplémenté.

D’après les résultats obtenus, les pics des substances d’intérêts ne semblent pas en

interférence avec de possibles impuretés présentes dans le plasma. De plus, le temps de

rétention pour la doxorubicine est de 6,09 ± 0,16 minutes (CV = 1,64 %) et celui de la

daunorubicine de 9,04 ± 0,15 minutes (CV = 1,64 %). On peut donc conclure que notre

méthode est sélective.

120

� Sélectivité de la méthode analytique

La sélectivité est l’aptitude d’un système analytique à discerner un analyte donné dans un

mélange complexe. Ce critère permet de garantir que la réponse analytique n’est pas

affectée par d’autres substances. On cherche ici à vérifier l’écart entre le pic de doxorubicine

(DOX) et celui de l’étalon interne (DNR).

La sélectivité est évaluée par le degré de résolution (Rs), dépendant des temps de rétention

(tr) des deux pics chromatographiques et de la largeur des deux pics (W), selon la formule

suivante :

Pour considérer que deux pics ont un recouvrement inférieur ou égal à 2 %, le degré de

résolution doit être supérieur à 1. Et si le degré de résolution est supérieur à 1,5, on

considère que la séparation des pics est totale. Lors de notre étude, le degré de résolution

est évalué à 1,55. On peut donc conclure que notre méthode est sélective pour la

doxorubicine.

� Linéarité de la méthode analytique

La linéarité est la capacité d’une méthode analytique, à l’intérieur d’un certain intervalle, à

fournir une réponse instrumentale ou des résultats proportionnels à la quantité en analyte à

doser dans l’échantillon.

La linéarité de cette méthode de dosage de la doxorubicine a été évaluée pour des

concentrations allant de 0,01 à 1,5 µg/mL. Trois courbes d’étalonnage ont été réalisées sur

trois jours pour s’assurer de la linéarité de la méthode (Figure 44). Les étalons étaient

préparés chaque jour.

Afin de quantifier la doxorubicine dans les échantillons plasmatiques, on a utilisé le ratio de

l’aire du pic correspondant à la doxorubicine sur celle du pic de l’étalon interne, coefficient

de réponse relatif de la doxorubicine par rapport à l’étalon interne. Cette approche permet,

lorsque deux substances sont extraites de façon comparable, d’avoir un témoin de

l’extraction et de ne pas tenir compte du pourcentage d’extraction réel à chaque nouvelle

analyse. De plus, toute variation du système chromatographique entraîne une perturbation

du même ordre sur la réponse de la doxorubicine et de l’étalon interne, permettant une

meilleure estimation de la concentration en doxorubicine.

Pour valider la méthode, les concentrations calculées doivent être inférieures à plus ou

moins 15 % de la concentration nominale, exception pour la LOQ pour laquelle une valeur de

plus ou moins 20 % est acceptée. Au moins 75 % des étalons doivent remplir ces critères de

validation de la linéarité. De plus le coefficient de corrélation linéaire doit être supérieur

à 0,98.

121

Figure 44 : Courbes d’étalonnage moyenne évaluant la linéarité de la méthode analytique

Tableau IX : Validation des critères de linéarité de la méthode analytique

Ecart relatif entre la concentration calculée et la concentration

nominale (%)

Concentration

(µg/mL)

Courbe de

linéarité 1

Courbe de

linéarité 2

Courbe de

linéarité 3

0,01 15,32 14,72 13,05

0,025 15,47 16,97 8,98

0,05 20,69 14,71 16,40

0 ,1 19,33 12,87 15,57

0,25 13,30 6,67 9,98

0,5 3,88 3,50 10,03

1 12,88 13,89 13,14

1,5 12,27 13,93 14,79

122

La courbe d’étalonnage moyenne obtenue à partir des trois courbes d’étalonnage était

linéaire pour des concentrations allant de 0,01 à 1,5 µg/mL. L’équation de régression de la

courbe est la suivante :

Avec x la concentration en doxorubicine et y le ratio de l’aire du pic de doxorubicine sur celle

du pic de l’étalon interne. Le coefficient de corrélation linéaire est supérieur à 0,998 pour

toutes les courbes d’étalonnage. De plus, les critères de validation de la linéarité sont bien

respectés (Tableau IX).

La méthode développée est donc bien linéaire sur l’intervalle de concentration 0,01 à 1,5

µg/mL.

� Limite de détection (LOD)

La limite de détection est définie comme la plus faible quantité de doxorubicine pouvant

être détectée dans la matrice, ici le plasma, avec certitude. Pour les méthodes analytiques

chromatographiques, la limite de détection est établie soit en utilisant la proportion 3 :1

(signal : bruit), soit par méthode mathématique à partir de l’équation de linéarité.

Dans notre étude, la limite de détection a été calculée à 0,006 µg/mL.

� Limite de quantification (LOQ)

La limite de quantification est définie comme la plus faible quantité d’analyte pouvant être

quantifiée dans la matrice avec certitude. C’est la plus basse concentration sur la courbe

d’étalonnage. Dans les méthodes chromatographiques, la détermination de cette limite est

faite soit par rapport au bruit de fond, en utilisant la proportion 10 : 1 (signal : bruit), soit par

méthode mathématique à partir de l’équation de linéarité.

Dans notre étude, la limite de quantification a été calculée à 0,01 µg/mL.

� Précision et exactitude de la méthode analytique

La précision est définie par l’étroitesse de l’accord entre des mesures effectuées sur des

prises multiples d’un échantillon homogène. Elle exprime le degré de dispersion entre une

série de dosage provenant de multiples prises d’essai de l’échantillon dans des conditions

expérimentales bien précises.

Ce critère est évalué par la mesure de la répétabilité et de la reproductibilité et est exprimé

comme le coefficient de variation (CV) d’une série de mesure.

La répétabilité, ou précision des essais internes, est la mesure de la précision lorsqu’elle est

réalisé dans les même conditions et dans un court laps de temps.

123

Celle-ci est réalisée sur une série de quatre concentrations de doxorubicine (LOQ, LQC, MQC

et HQC), chaque concentration est réalisée en cinq extractions. Elle est exprimée par le

coefficient de variation (CV).

La reproductibilité exprime la précision inter-laboratoires et est la mesure de la précision

lorsque n’importe quelle condition opératoire change.

Elle est évaluée sur une série de quatre concentrations de doxorubicine (LOQ, LQC, MQC et

HQC), et analysée pendant trois jours différents. Chaque concentration est réalisée en cinq

extractions. Elle est exprimée par le coefficient de variation (CV).

L’exactitude (accuracy) est définie par l’étroitesse d’accord entre la valeur trouvée et la

valeur de référence. Elle correspond à l’écart entre la valeur obtenue et la valeur considérée

comme exacte.

Celle-ci est réalisée sur une série de quatre concentrations de doxorubicine (LOQ, LQC, MQC,

HQC), analysée pendant trois jours différents et chaque concentration est réalisée en cinq

extractions. Elle est exprimée par l’erreur relative (ER).

Pour valider la méthode, les coefficients de variation de répétabilité et de reproductibilité,

ainsi que les erreurs relatives doivent être inférieurs à 15 %, exception faite pour les

échantillons de concentration LOQ pour lesquelles les valeurs doivent être inférieures à

20 %.

Tableau X : Résultats de l’étude de précision et d’exactitude de la méthode analytique

Concentration

théorique

(µg/mL)

Concentration moyenne en doxorubicine (µg/mL)

Répétabilité (n=5) Reproductibilité (n=3)

Concentration

trouvée ± SD

CV (%) ER (%) Concentration

trouvée ± SD

CV (%) ER (%)

0,01 (LOQ) 0,0084 ± 0,0005 5,76 16,13 0,0082 ± 0,0004 4,77 18,22

0,1 (LQC) 0,1057 ± 0,0012 1,13 5,72 0,1124 ± 0,0058 5,13 12,39

0,5 (MQC) 0,5542 ± 0,0025 0,45 10,85 0,5658 ± 0,0184 3,25 13,16

1,5 (HQC) 1,4580 ± 0,0339 2,33 2,80 1,3878 ± 0,0835 6,02 7,48

Le coefficient de variation de la répétabilité varie entre 0,45 et 5,76 %, avec une erreur

relative variant de 2,80 à 16,13 %. Le coefficient de variation de la reproductibilité varie

entre 3,25 et 6,02 %, avec une erreur relative variant de 7,48 à 18, 22 % (Tableau X).

124

Notre méthode analytique remplit donc les critères de précision et d’exactitude requis par

l’EMA pour être validée.

� Rendement d’extraction de la méthode

La détermination du rendement d’extraction permet de connaitre le pourcentage de

doxorubicine et de daunorubicine récupéré et d’évaluer la reproductibilité de la méthode.

En chromatographie, le rendement d’extraction (R) exprimé en pourcentage s’obtient en

appliquant la formule suivante :

Le rendement d’extraction de la doxorubicine et de l’étalon interne ont été évalués en

comparant l’aire moyenne des pics de la doxorubicine et de la daunorubicine des solutions

LQC, MQC et HQC avec l’aire moyenne des pics de six solutions de références contenant la

même concentration en doxorubicine et en daunorubicine.

Tableau XI : Résultats de l’étude de rendement d’extraction de la méthode analytique

Molécule Concentration

(µg/mL)

Rendement ± SD (%) CV (%)

Doxorubicine 0,1 103,2 ± 1,3 1,21

0,5 98,9 ± 7,3 7,43

1,5 104,4 ± 4,6 4,44

Daunorubicine 0,1 97,1 ± 5,0 2,85

La méthode d’extraction par précipitation des protéines par un mélange d’acétonitrile et de

phase mobile permet d’obtenir un rendement de 97,1 % pour la daunorubicine et variant de

98,9 à 104,4 % pour la doxorubicine (Tableau XI). Ces valeurs sont supérieures ou égales à

celle d’autres méthodes analytiques de la doxorubicine (Tableau XIII).

� Stabilité de la doxorubicine

La stabilité d’un analyte en solution correspond à sa capacité à résister à la dégradation

lorsque la solution est soumise à différentes conditions. On considère qu’une molécule est

stable dans la matrice si la variation observée entre le début des conditions et la fin de

celles-ci est inférieure à 15 %.

La stabilité de la doxorubicine dans le plasma de chien a été étudiée en réalisant des lots de

six échantillons, trois contenant de la doxorubicine à 0,1 µg/mL (LQC) et trois à 1,5 µg/mL

(HQC). Chaque lot a ensuite été soumis à une condition différente pour pouvoir évaluer la

stabilité de la doxorubicine selon la température, et donc d’optimiser sa conservation.

125

Les différentes conditions de température sont :

� Exposition à trois cycles de congélation puis décongélation à température ambiante.

� Exposition à la température ambiante (20°C en moyenne) pendant 1 heure, 5 heures

et 24 heures.

� Exposition à une température de 4°C pendant 24 heures, mimant les conditions de

conservation dans un réfrigérateur.

� Exposition à une température de -21°C pendant 1 mois, mimant les conditions de

congélation des échantillons avant analyse.

Tableau XII : Résultats de l’étude de stabilité de la doxorubicine dans du plasma

Conditions

Rapport de la concentration sur la concentration initiale ± SD (%)

Doxorubicine Daunorubicine

1,5 µg/mL 0,1 µg/mL 1,5 µg/mL 0,1 µg/mL

Température ambiante (1h) 99,95 ± 0,32 99,42 ± 0,76 100,54 ± 0,70 99,54 ± 1,13

Température ambiante (5h) 96,36 ± 1,37 99,87 ± 0,11 98,90 ± 2,43 100,42 ± 0,18

Température ambiante

(24h)

94,45 ± 1,62 95,30 ± 1,12 92,64 ± 1,43 97,28 ± 1,05

4°C pendant 24 heures 97,70 ± 0,16 99,74 ± 1,81 99,81 ± 0,35 100,46 ± 0,62

3 cycles de congélation 100,81 ± 0,41 99,88 ± 1,13 99,13 ± 0,47 99,22 ± 0,46

-21°C pendant 1 mois 97,65 ± 0,65 94,13 ± 0,45 95,93 ± 0,92 91,87 ± 0,68

Les variations de concentrations de la doxorubicine et de la daunorubicine dans du plasma

canin n’excèdent pas 9% (Tableau XII). On considère donc que sous ces conditions, ces

molécules sont stables dans le plasma.

� Détection du principal métabolite de la doxorubicine, le doxorubicinol

Des plasmas canins supplémentés en doxorubicine, doxorubicinol et daunorubicine à la

concentration 1 µg/mL ont été préparées afin d’évaluer la sélectivité de la méthode

analytique lors de la présence de doxorubicinol dans le plasma, après métabolisation par le

foie.

Figure 45 : Chromatogramme de plasma supplémenté en doxorubicinol, doxorubicine et

daunorubicine à 1 µg/mL.

126

B. DiscussionB. DiscussionB. DiscussionB. Discussion

Plusieurs méthodes analytiques pour déterminer la concentration en doxorubicine dans un

échantillon de plasma ont été décrites. La plupart des méthodes utilisées dans des études de

pharmacocinétique de la doxorubicine sont décrites dans le Tableau XIII.

Tableau XIII : Méthodes d’analyses par HPLC de détermination de la concentration en doxorubicine dans des liquides biologiques et des tissus

Auteurs Méthode

de

détection

Matrice de

calibration

Matrice de

validation

LOQ Rendement

d’extraction

(van Asperen et al.,

2000)

FL Plasma humain Plasma de souris

Tissus de souris

1,3 ng/mL

96 ng/mg

86-99 %

(de Bruijn et al., 1999) FL Plasma humain Plasma humain 100 ng/mL 112 ± 8,6 %

(Alvarez-Cedrón et al.,

1999)

FL Plasma humain Plasma de rat

Tissus de rat

5 ng/mL

100 ng/mg

89,33-109,5 %

(Kümmerle et al., 2003) FL Plasma humain Plasma de rat

Tissus de rat

2 ng/mL

100 ng/mg

/

(Ricciarello et al., 1998) ECD Plasma humain Plasma humain 1 ng/mL 89-93 %

(Pérez-Blanco et al.,

2014)

FL Plasma humain Plasma humain 8 ng/mL 94,82-104,38 %

(Gilbert et al., 2005) FL Plasma

perroquet

Plasma perroquet 20 ng/mL 71-87 %

(de Jong et al., 1991) FL Tissus de souris / 25ng/mg 74,9-79,1 %

(Arnold et al., 2004) MS/MS Plasma de rat

Tissus de rat

Plasma de rat

Tissus de rat

0,2 ng/mL

0,15-15ng/mg

84-112 %

(Ahmed et al., 2009) CLD Plasma de souris Plasma de rat / 90,7-104 %

(Urva et al., 2009) FL Plasma de souris

Tissus de souris

Plasma de souris

Tissus de souris

/ 94,7-101 %

(Zhou, Chowbay, 2002) FL Plasma de rat Plasma de rat 10 ng/mL 89,6-94 %

(Al-Abd et al., 2009) FL Plasma de souris

Tissus de souris

Plasma de souris

Tissus de souris

25 ng/mL 52,4-95,2 %

(Dharmalingam et al.,

2014)

UV Plasma de rat / 1000 ng/mL 86,86-91,76 %

(Cox et al., 1991) FL Plasma canin

Tissus canins

/ 25 ng/mL

10 ng/mg

80-90 %

(Reddy et al., 2005) FL Sang total canin Sang total canin 12,38 ng/mL 95,7-100,4 %

Notre méthode FL Plasma canin Plasma canin 10 ng/mL 98,9-104,4 %

CLD = détection par chimiluminescence, ECD = détection électrochimique, FL = fluorescence, MS/MS =

spectrométrie de masse, U-HPLC = ultra-HPLC, UV = ultra-violet.

127

Notre méthode analytique développée est une des seules avec celle de Cox et al. (1991) à

utiliser du plasma de chien comme matrice pour validation. La plupart du temps, les études

de pharmacocinétique chez le chien sont basées sur des méthodes analytiques n’utilisant

pas de plasma canin pour leur calibration.

Plusieurs des méthodes présentées dans le Tableau XIII sont basées sur des méthodes

d’extraction en phase solide ou d’extraction liquide/liquide, utilisant des solvants organiques

non polaires comme le dichlorométhane ou le chloroforme.

La doxorubicine est une base faible et pour une meilleure extraction, le pH doit être ajusté à

un pH alcalin mais la doxorubicine est instable sous des conditions alcalines. De plus, utiliser

ces méthodes d’extraction pourrait constituer un risque d’extraction incomplète de la

molécule étant donné le nombre d’étapes et la haute volatilité des solvants utilisés. Notre

méthode utilise une technique simple et rapide de précipitation des protéines avec un

mélange d’acétonitrile et de phase mobile (v/v). La précipitation de protéines est considérée

comme la méthode d’extraction de choix à partir d’une matrice biologique (Loadman,

Calabrese, 2001). Notre méthode présente également un rendement d’extraction élevé

(98,9 à 104,4 %), similaire voire supérieur aux autres méthodes d’analyse. Cela indique

l’efficacité de la méthode d’extraction utilisée en plus de sa simplicité de mise en place de sa

rapidité et de son moindre coût.

Les coefficients de corrélation supérieurs à 0,998 pour des concentrations allant de 0,01 à

1,5 µg/mL indiquent une très bonne linéarité des courbes expérimentales. La limite de

quantification (0,01 µg/mL) de la méthode testée est similaire aux valeurs retrouvées dans la

littérature. Cependant, une meilleure sensitivité est obtenue pour des techniques de

détection basées sur la spectrométrie de masse et la détection électrochimique.

Plusieurs conditions de stabilité de la doxorubicine dans le plasma canin ont été testées et

sont similaires avec la littérature (Reddy, 2005). Malgré l’apparente stabilité de la

doxorubicine dans le plasma, les échantillons prélevés devraient tout de même être congelés

aussi vite que possible afin d’éviter des pertes et il est recommandé de réaliser leur analyse

dans les semaines suivants sa congélation.

La méthode d’analyse d’échantillons plasmatiques développée présente donc plusieurs

avantages, incluant la précision et l’exactitude des mesures réalisées. De plus, le matériel et

les infrastructures nécessaires pour réaliser cette méthode sont présents dans la plupart des

laboratoires de biologie et de chimie analytique et l’ensemble de la méthode peut être

réalisée en interne, sans nécessiter d’une formation supplémentaire.

Cette méthode d’analyse de la doxorubicine dans des échantillons plasmatiques une fois

développée peut être appliquée dans une étude de pharmacocinétique.

128

II. Approche non compartimentale de la pharmacocinétique et II. Approche non compartimentale de la pharmacocinétique et II. Approche non compartimentale de la pharmacocinétique et II. Approche non compartimentale de la pharmacocinétique et de la tolérance de la doxorubicine chez le chiende la tolérance de la doxorubicine chez le chiende la tolérance de la doxorubicine chez le chiende la tolérance de la doxorubicine chez le chien

A. Matériels et méthodesA. Matériels et méthodesA. Matériels et méthodesA. Matériels et méthodes

1. Recrutement des cas1. Recrutement des cas1. Recrutement des cas1. Recrutement des cas

Les échantillons plasmatiques proviennent d’animaux traités lors d’une séance de

chimiothérapie à base de doxorubicine à l’école vétérinaire de Lyon (VetAgro Sup, France).

Pour chaque chien, un consentement éclairé des propriétaires été obtenu. Ce projet

d’expérimentation clinique de pharmacocinétique a été approuvé par le Comité d’éthique en

expérimentation animale de VetAgro Sup (n°1648) (Annexe 2).

Un animal est inclus dans l’étude si celui-ci est traité par de la doxorubicine au cours de son

protocole de chimiothérapie. Pour chaque animal engagé dans l’étude, les données

suivantes issues de son dossier médical sont consignées : âge, poids, sexe, race, diagnostic

histologique de la tumeur et nombre total de séances de chimiothérapie à base de

doxorubicine. Une numération-formule sanguine, une analyse biochimique de base

(glycémie, urée, créatinine, phosphatase alcaline (PAl), alanine amino-transférase (AlAT),

protéines totales, albumine et globuline) et une échocardiographie sont réalisées avant la

séance de chimiothérapie.

Les animaux sont exclus de l’étude en cas d’insuffisance cardiaque (fraction de

raccourcissement inférieure à 25 %), rénale (présence d’une azotémie avec la créatinine >

180 µmol/L) ou hépatique (paramètres hépatiques augmentés avec AlAT > 210 UI/L et PAl >

600 UI/L) sévères.

Un suivi est réalisé à une semaine et trois semaines après la séance de chimiothérapie avec

un contrôle de la numération-formule sanguine. Dans les deux cas, un questionnaire sur

l’état de santé de l’animal ainsi que les éventuels effets indésirables (Annexe 3) est rempli

par le propriétaire et le clinicien.

2. Echantillonnage2. Echantillonnage2. Echantillonnage2. Echantillonnage

Les animaux sont traités par une perfusion de doxorubicine pendant environ 25 minutes, à

une dose de 30 mg/m² pour les chiens de plus de 10 kg et à une dose de 1 mg/m² pour les

chiens de moins de 10 kg.

Les échantillons sanguins sont collectés à 0, 5, 10, 30 minutes, 1, 2, 4, 8, 12, 16 et 24 heures

après le début de l’injection de la doxorubicine. A chaque temps d’échantillonnage, une

ponction de la veine jugulaire ou saphène externe est effectuée (site préalablement tondu et

désinfecté). Entre 2 et 3 mL de sang sont prélevés, à l’aide d’une seringue en plastique de 5

mL et d’une aiguille de 21 Gauges, et transférés dans un tube sous vide contenant de

l’héparinate de lithium. Les prélèvements sanguins sont ensuite centrifugés à

129

3000 tours/minute pendant 5 minutes puis le plasma est séparé par pipetage et transféré

dans un tube sec. Ces tubes sont identifiés et conservés par congélation à -21°C jusqu’à la

phase analytique.

Lors du suivi à une semaine, les chiens étaient de nouveau prélevés afin de déterminer la

présence éventuelle de résidus de doxorubicine.

3. Analyse des échantillons3. Analyse des échantillons3. Analyse des échantillons3. Analyse des échantillons

Les échantillons sont décongelés à température ambiante et analysés par HPLC-fluorescence

selon le protocole développé dans la partie I.

A partir des résultats obtenus, différents paramètres de pharmacocinétique ont été

déterminés selon les recommandations de l’Agence Européenne du Médicament (EMA,

2010) pour une étude non-compartimentale :

� La concentration plasmatique maximale (Cmax) de la doxorubicine dans le plasma.

� L’aire sous la courbe (AUC), calculée par intégration approchée grâce à la méthode

linéaire des trapèzes, L’AUC représente la biodisponibilité de la doxorubicine pour

un individu et une voie d’administration donnés.

� Le temps de demi-vie de distribution (T1/2), qui représente le temps nécessaire

pour que la concentration de doxorubicine du compartiment vasculaire diminue

de moitié, par distribution vers les autres compartiments de l’organisme.

� La clairance plasmatique (CL), qui correspond au volume plasmatique totalement

épuré de la doxorubicine par unité de temps au cours de la phase de distribution.

� Le volume de distribution du compartiment central (Vc), qui représente la capacité

de la doxorubicine à diffuser dans les différents tissus cibles.

B. RésultatsB. RésultatsB. RésultatsB. Résultats

1. Population d’étude et suivi clinique et biologique des animaux1. Population d’étude et suivi clinique et biologique des animaux1. Population d’étude et suivi clinique et biologique des animaux1. Population d’étude et suivi clinique et biologique des animaux

Huit chiens ont reçu une séance de chimiothérapie à base de doxorubicine pendant la

période de notre étude. Aucun d’entre eux ne présentaient de critères d’exclusion et ils ont

donc été inclus dans notre étude. L’ensemble des cas est référencé dans le Tableau XIV.

Les résultats des analyses effectuées lors de leur insertion dans le protocole d’étude ainsi

que le suivi hématologique des chiens sont présentés en Annexe 4.

Au cours du suivi des animaux, l’un d’entre eux décède avant le suivi à une semaine et l’un

d’entre eux est retiré de l’étude sur décision des propriétaires. De plus, deux d’entre eux ne

sont pas présent pour un suivi à une semaine.

130

Le suivi hématologique chez les quatre animaux restants montre la présence d’une

leucopénie sévère avec une neutropénie sévère de grade 3 et d’une légère

thrombocytopénie de grade 1 selon la classification VCOG-CTCAE chez l’un d’entre eux à une

semaine après la séance de chimiothérapie. Cet individu présentait déjà une leucopénie lors

de son admission dans l’étude et celle-ci est persistante au cours du suivi à trois semaines,

mais s’aggrave lors du contrôle à une semaine. Afin de limiter le risque de surinfection

bactérienne, une antibiothérapie à base d’amoxicilline et d’acide clavulanique (20 mg/kg PO

BID) pendant deux semaines est mis en place. De plus, l’un d’entre eux présente une

thrombocytopénie sévère de grade 3, et un autre une légère anémie de grade 1 selon la

classification VCOG-CTCAE une semaine après le traitement. L’ensemble de ces anomalies

est résolu à trois semaines post-chimiothérapie.

Figure 46 : Evolution du comptage des polynucléaires neutrophiles au cours des suivis chez

quatre chiens

Concernant les réponses aux questionnaires, certains effets secondaires à court-terme de la

doxorubicine ont été observés et sont présentés dans le Tableau XV, accompagnés des

mesures thérapeutiques mises en place.

Tableau XIV : Description des cas inclus dans notre étude

Nom Sexe Race Âge

(années) Poids (kg)

Surface

corporelle (m²) Diagnostic

Dose reçue

(mg)

Numéro de

séance à base de

doxorubicine

Thérapeutique

complémentaire

Rita Femelle non

stérilisée

Yorkshire

Terrier 12,1 4 0,25 Mésothéliome péricardique 4 1 Firocoxib

Alba Femelle non

stérilisée

Yorkshire

Terrier 11,9 4,6 0,27

Lymphome B diffus à

grandes cellules, variant

centroblastique

polymorphe

4,6 5 Prednisolone

Cooki Mâle entier Berger blanc

suisse 9,8 48,9 1,32

Hémangiosarcome

splénique 39,6 1 /

Ibie Femelle

stérilisée

Labrador

Retriever 3,7 22,8 0,8

Ostéosarcome

télangiectasique métastasé

de l’humérus droit

24 4 Firocoxib

Alma Femelle

stérilisée

Croisé

Berger

Allemand

11,9 30,4 0,96

Récidive de lymphome B

diffus à grandes cellules,

variant immunoblastique, de

stade initial IVa

28,8 1 Prednisolone

Cléo Femelle

stérilisée

Labrador

Retriever 13 31,9 0,99

Mélanome achromique

malin de la cavité orale de

stade T2N1M0

29,7 1 /

Sam Mâle castré Braque

hongrois 10,8 26,6 0,88

Récidive de lymphome B

diffus à grandes cellules,

variant immunoblastique, de

stade initial Va

26,4 1 /

Baya Femelle

stérilisée

Bouvier

Bernois 11,2 37,3 1,09

Carcinome épidermoïde

digital de stade T4N0M0 et

sarcome dermique de stade

T1N0M0

32,7 1 /

131

132

Tableau XV : Effets secondaires observés suite à la séance de chimiothérapie et thérapeutiques mises en place

2. Pharmacocinétique2. Pharmacocinétique2. Pharmacocinétique2. Pharmacocinétique

Après traitement des données brutes individuelles, les courbes pharmacocinétiques pour

chaque chien sont tracées, sans aucune modélisation (Figure 47).

Les différents paramètres pharmacocinétiques individuels sont alors calculés et présentés

dans le Tableau XVI.

Tableau XVI : Paramètres pharmacocinétiques calculés pour chaque individu de l’étude

Animal Posologie AUC

(nmol.h.L-1)

Cmax

(nmol.L-1)

T1/2

(min)

CL

(mL.min-1.kg-1)

Vc

(L.kg-1)

Rita 1 mg/kg 109,56 559,53 6,92 279,92 1,26

Alba 1 mg/kg 184,97 684,56 2,69 165,80 1,71

Cooki 30 mg/m² 141,40 424,21 6,46 175,62 1,70

Ibie 30 mg/m² 164,76 680,62 4,45 195,91 1,86

Alma 30 mg/m² 258,46 1097,17 5,26 112,40 1,12

Cléo 30 mg/m² 101,80 372,49 10,52 280,44 2,61

Sam 30 mg/m² 195,19 389,47 8,63 155,92 3,04

Baya 30 mg/m² 206,45 615,31 6,16 130,21 2,46

Moyenne 170,32 602,92 6,39 187,03 1,97

SD 52,32 235,92 2,42 62,99 0,67

CV 30,72 39,13 37,96 33,68 34,22

SD correspond à l’écart-type à la moyenne et CV est le coefficient de variation exprimé en pourcentage.

Effets secondaires Grade selon la

classification

VCOG-CTCAE

Nombre

d’occurrences

Thérapeutiques mises en place

Anorexie Grade 2 3/6 /

Léthargie Grade 1 1/6 /

Prurit sur zone

d’injection

Grade 1 1/6 /

Diarrhée Grade 1 1/6 Silicilate de magnésium et

d’aluminium Grade 2 1/6

Colite Grade 2 1/6 Silicilate de magnésium et

d’aluminium

Métronidazole 15 mg/kg PO BID

Vomissement Grade 1 1/6 Citrate de maropitant

2 mg/kg PO SID

133

Lors du suivi à une semaine, les quatre chiens présents ne présentaient pas de résidus

plasmatiques détectables de doxorubicine.

Figure 47 : Courbes de pharmacocinétique

3. Discussion 3. Discussion 3. Discussion 3. Discussion

a. Pharmacocinétique et ses implicationsa. Pharmacocinétique et ses implicationsa. Pharmacocinétique et ses implicationsa. Pharmacocinétique et ses implications

Cette étude réalisée chez des individus malades est une des seules de son genre. Les

paramètres pharmacocinétiques étudiés présentent une forte variabilité inter-individuelle

(entre 30,72 et 39,13 % de variabilité selon les paramètres), tout comme dans les autres

études sur des individus malades. Nos paramètres pharmacocinétiques sont du même ordre

de grandeur que ceux présentés par Gustafson et al., (2002) et par Selting et al., (2006)

134

même si notre concentration maximale Cmax est plus faible (Tableau XVII). Cela pourrait

être expliqué notamment par un temps de perfusion plus important. Cependant, de grandes

disparités subsistent entre les études, cette disparité pouvant être expliquée par l’important

volume de distribution (variant de 17,8 à 76 L/kg), signe d’une distribution très rapide au

sein des différents tissus de l’organisme. De plus, les différentes études, sur animal sain ou

malade, présentent un design différent en termes de dose administrée et de durée de la

perfusion (de dix à trente minutes). Une variation de la durée de perfusion influence la

concentration maximale atteinte, mais également l’AUC, pouvant alors expliquer une partie

des variations entre les études. La comparaison des études nécessite donc des précautions.

Tableau XVII : Comparatif des paramètres pharmacocinétiques des différentes études portant sur des animaux non sains

Notre étude

(n=8)

Gustafson et al., 2002

(n=4), lymphome

Selting et al., 2006

(n=9), lymphome

Dose administrée 30 mg/kg ou 1 mg/m² 30 mg/kg 30 mg/kg

Durée de la perfusion 25 minutes 20 minutes 20 minutes

AUC (nmol.h.L-1) 170,32 ± 52,32 66,7 ± 66,1 1103,20 ± 256,66

T1/2 (min) 6,39 ± 2,42 2,58 ± 0,78 /

Cmax (nmol.L-1) 602,92 ± 235,92 / 2135,01 ± 672,85

CL (mL.min-1.kg-1) 187,03 ± 62,99 51,66 ± 31,67 27,85 ± 4,68

Vc (L.kg-1) 1,97 ± 0,67 / /

Dans notre étude, la doxorubicine n’est plus dosable après la première heure, contrairement

aux autres études où la doxorubicine reste dosable jusqu’à 240 minutes. Cette différence

pourrait être due à une concentration plasmatique en doxorubicine proche de la limite de

détection et/ou de quantification, malgré une limite de détection comparable à celle des

autres méthodes de dosage de la doxorubicine. Il se pourrait également que la

concentration en doxorubicine soit influencée par les conditions de stockage des

échantillons plasmatiques, bien que pour certains échantillons, la durée de stockage n’ait

pas excédé les deux semaines et il semblerait donc que la dégradation de la doxorubicine

soit minime (cf partie I.A.4 étude de stabilité).

La diminution très rapide de la concentration en doxorubicine plasmatique nous empêche de

pouvoir observer avec évidence la phase d’élimination, et donc de calculer les paramètres

pharmacocinétiques inhérents à cette phase. Cette phase de distribution rapide permet tout

de même de confirmer l’intérêt d’une phase d’échantillonnage plus courte en se limitant à

une pharmacocinétique sur une heure chez le chien. Le coût et le refus par le propriétaire de

participer à une étude à cause de la procédure de prélèvement font partie des facteurs

restrictifs limitant les études sur de grandes populations en oncologie vétérinaire. Une étude

avec une phase de prélèvement limitée pourrait permettre, avec peu d’échantillons, de

prédire l’exposition globale à la doxorubicine et d’initier des études à grande échelle sur la

relation entre la pharmacocinétique et la pharmacodynamique (Wittenburg et al., 2014).

135

La dose de doxorubicine administrée ne semble pas influencer les paramètres

pharmacocinétiques de la doxorubicine. En effet, il n’y a pas de différence visible entre les

animaux recevant la dose de 1 mg/kg (AUCmoyen = 147,27 nmol.h.L-1, Cmax = 622,05 nmol.L-1)

et ceux traités à la dose de 30 mg/m² (soit une posologie entre 0,80 et 1 mg/m², AUCmoyen =

178,01 nmol.h.L-1, Cmax = 595,55 nmol.L-1). En médecine humaine, cette absence de

corrélation entre la dose de doxorubicine administrée et l’exposition (mesurée par l’AUC) est

également notée (Ackland et al., 1989).

Dans notre étude, les paramètres de pharmacocinétique calculés ne semblent pas être en

corrélation avec la toxicité observée. En effet, l’animal présentant la neutropénie au cours

du suivi présente une Cmax (389,47 nmol.L-1) plus faible que la moyenne des animaux de cette

étude et une exposition à la doxorubicine (AUC = 195,19 nmol.h.L-1) similaire ou inférieure à

celle d’autres animaux, ne présentant pas pour autant de signes de toxicité à court terme.

Cela va à l’encontre de certaines études en médecine humaine montrant une corrélation

entre l’exposition et la toxicité hématologique de la doxorubicine (Piscitelli et al., 1993).

Cependant, la relation entre exposition et toxicité à tendance à être remise en cause par des

études plus récentes (Joerger et al., 2007).

Le doxorubicinol, principal métabolite de la doxorubicine, n’est pas dosable dans notre

étude, malgré son extraction possible (cf partie I.A). Peu d’études discutent de la

pharmacocinétique du doxorubicinol et dans la plupart des cas, le doxorubicinol était

directement injecté à haute dose (30 mg/m²), donnant une concentration plasmatique bien

plus importante que lors de l’injection de doxorubicine et sa métabolisation (Gilbert et al.,

2005). Dans une étude plus ancienne, la concentration en doxorubicinol mesuré à cinq

minutes après injection de doxorubicine à 1,27 mg/kg (soit 28,4mg/m²) est de 10 ng/mL.

Cette valeur n’a pu être mesurée dans notre étude et n’est retrouvée que sporadiquement

chez le chien dans une étude (Cox et al., 1991).

b. Limitations du protob. Limitations du protob. Limitations du protob. Limitations du protocole d’étudecole d’étudecole d’étudecole d’étude

Tout protocole expérimental comporte des limites. Nous tenterons de souligner les points

qui nous semblent critiquables, permettant une meilleure interprétation de notre étude.

� Représentativité de l’échantillonnage

Notre étude repose sur une population de petite taille (huit individus), empêchant la

réalisation d’une analyse statistique et nous limitant à une analyse purement descriptive. De

plus, la population est très hétérogène avec un âge moyen de 10 ans et demi (allant de 3 ans

et 8 mois à 12 ans et 1 mois) pour un poids moyen de 25,8 kg (allant de 4 à 39,6 kg), de races

différentes et de types tumoraux différents. Cette très grande hétérogénéité est inhérente à

notre choix de travailler sur des animaux malades. Cela pourrait expliquer la grande

variabilité inter-individuelle.

136

L’hétérogénéité de type tumoral influence la distribution de la doxorubicine, dépendant de

la perfusion, de la vascularisation, de la concentration en protéines de liaison et en ADN

pourrait également expliquer partiellement la grande variabilité inter-individuelle

concernant les paramètres pharmacocinétiques.

� Design de l’étude

Notre protocole d’administration de la doxorubicine influence également les paramètres

pharmacocinétiques. Une durée d’administration plus longue résulte en une AUC plus

importante avec une Cmax plus faible (Gustafson et al., 2002). Dans notre étude, les chiens

étaient traités sur 25 minutes pour permettre la normalisation de l’échantillonnage. On

observe également une certaine variabilité pour les temps d’échantillonnage, dépendant des

différents patients et des cliniciens.

c. Perspectives de l’étudec. Perspectives de l’étudec. Perspectives de l’étudec. Perspectives de l’étude L’utilisation de la posologie en se basant sur la surface corporelle (mg/m²) remonte à des

études des années 50 montrant une normalisation de la dose maximale tolérée des agents

de chimiothérapie chez la souris, le rat, le chien et l’Homme (Pinkel, 1958). Cette posologie

calculée en utilisant la surface corporelle serait plus en corrélation avec les valeurs

physiologiques (vitesse de métabolisation, débit cardiaque, volume sanguin, clairance

plasmatique, etc…) que le poids de l’animal. En effet, le poids de l’animal représente un

facteur variant de 1 à 50 selon la race du chien, alors que sa surface corporelle passe d’un

facteur 1 à 15. Même si la surface corporelle présente une meilleure approche pour calculer

la dose, on constate chez le chien un manque de corrélation entre la posologie selon la

surface corporelle de la doxorubicine et l’efficacité ou la toxicité. Il est donc nécessaire

d’avoir une meilleure connaissance des causes de variabilité de la pharmacodynamique et la

relation avec la pharmacocinétique individu-dépendant. Cette approche utilisant la surface

corporelle est basée sur celle utilisée en médecine humaine pour le calcul de posologie.

Cependant, la surface corporelle est une mesure calculée, estimée et non mesurée et

dépendant de la formule employée. De plus, cette méthode ne tient pas compte des

particularités raciales et physiologiques, l’espèce canine présentant une large variation de

morphologie influençant la surface corporelle. Plusieurs facteurs contribuent à

l’augmentation de la concentration totale en doxorubicine, incluant la distribution aux

différents tissus, le métabolisme et l’excrétion. Tous ces processus devraient être corrélés à

la surface corporelle si l’on voulait que cette méthode de calcul de posologie soit normalisée

à la toxicité et à l’exposition à la doxorubicine dans tous les cas. Cependant, le métabolisme

contribue grandement à la variation de la toxicité de la doxorubicine lorsque la posologie se

base sur la surface corporelle. Par exemple, la doxorubicine est en partie métabolisée par

l’aldo-céto réductase pour former le doxorubicinol. Cette enzyme présente une affinité et un

taux d’activité maximal différents pour la doxorubicine selon l’espèce et les tissus (Loveless

et al., 1978). Le manque de corrélation entre le métabolisme de la doxorubicine et la surface

corporelle est illustré par le fait que l’affinité de la forme humaine est plus importante que

137

celle de la forme canine mais que le taux d’activité maximal est inférieur. Ainsi les fortes

disparités du métabolisme ne permettent pas d’envisager de prendre la surface corporelle

pour déterminer la posologie et il semble préférable de privilégier une posologie liée au

poids corporel. A cet égard, malgré la faible taille de l’échantillon, l’absence de différence

entre les petits et les grands chiens dans notre étude (qui reçoivent une posologie

comparable en mg/kg de poids corporel) confirme la validité de cette approche.

Dans ce cadre-là, le concept de dosage de la doxorubicine basé sur la pharmacocinétique

semble logique. Bien que cette approche ait démontré des améliorations par rapport à

l’usage de la surface corporelle chez l’homme dans certains cas, elle n’est que rarement

utilisée car la relation entre l’exposition du patient à la molécule et son effet n’est pas

élucidé pour toutes les molécules de chimiothérapie. De plus, cette relation est encore

moins développée en médecine vétérinaire. Bien que certaines études montrent une

corrélation entre la toxicité et le devenir du patient, notamment dans le cadre du lymphome

canin, aucune n’évalue l’exposition à la doxorubicine avec le devenir du patient (Sorenmo et

al., 2010). Ces études démontrent une survie prolongée chez les patients ayant développé

une neutropénie de grade III ou IV après la chimiothérapie, preuve d’une meilleure

exposition. Cependant, le critère utilisé en médecine vétérinaire pour le réajustement de la

dose est une réduction de la dose de 20 % lors d’une neutropénie de stade III ou plus, ces

réductions étant la plupart du temps instaurées en permanence pour éviter une future

toxicité (Vaughan et al., 2007). A l’inverse, il est rare d’effectuer une augmentation de la

dose pour des patients ne présentant pas d’effets secondaires indésirables à la dose

standard. Certaines études suggèrent l’importance de la posologie dans les lymphomes

canins, mais avec un ajustement thérapeutique individuel basé sur la tolérance maximale

propre à chaque individu. Cependant, certaines limites à cette méthode existent concernant

la doxorubicine, notamment l’importante variabilité intra-individuelle des paramètres

pharmacocinétiques pour la doxorubicine, celle-ci variant de 6 à 59 % selon les études en

médecine humaine (Jacquet et al., 1990), ce que tend à confirmer notre étude. D’autres

études sont donc nécessaires mais il pourrait être intéressant de réaliser une adaptation

thérapeutique personnalisée à chaque patient, limitant la toxicité de la doxorubicine tout en

maintenant une efficacité thérapeutique maximale. L’utilisation de cette méthode pour

déterminer la posologie idéale de la doxorubicine pour chaque individu serait d’autant plus

intéressante dans le cas des chiens présentant une mutation du gène mdr1, ceux-ci

présentant une très grande sensibilité à la doxorubicine. Une étude de 2010 a déterminé

que la concentration idéale pour traiter un chien homozygote muté serait de 10,7 ± 5,9

mg/m² pour éviter la toxicité hématologique et gastro-intestinale (Gustafson, Thamm, 2010).

Le développement de l’étude de la pharmacocinétique pourrait donc permettre d’identifier

des facteurs de risque ou d’individualiser l’approche thérapeutique en médecine vétérinaire.

Une gestion améliorée de la posologie des agents anti-cancéreux pourrait aider à réduire la

toxicité de ces derniers. Dans ce sens, notre étude décrit certains paramètres de la

pharmacocinétique de la doxorubicine administrée par voie intraveineuse chez les chiens

138

non-sains et peut être une base pour un travail futur sur l’amélioration des stratégies

thérapeutiques en cancérologie, incluant, par exemple, le développement des formes

liposomales et des nanoparticules en médecine vétérinaire.

Plusieurs articles évoquent le sujet et suggèrent une meilleure diffusion, avec une bonne

tolérance des particules. C’est notamment le cas des nano-particules de chitosane greffé

avec du glycol ou des folates (Alavi et al., 2017) (Motiei, Kashanian, 2017). Le

développement de cette technologie permet une réduction des doses de doxorubicine tout

en ayant une meilleure diffusion, et une moindre exposition du propriétaire et de

l’environnement. On observe une concentration en doxorubicine accrue dans les cellules,

voire un ciblage des cellules tumorales grâce à l’enhanced permeability and retention effect

ou au greffage de groupements de type folate (Wu et al., 2017). Il y a également une

amélioration de la persistance dans les cellules tumorales en comparaison avec les autres

types cellulaires, avec une modification de l’AUC (Ren et al., 2016). L’association avec des

complexes moléculaires au sein de ces particules peut également augmenter l’efficacité

combinée et donc permettre de réduire les doses et les effets toxiques, comme lors de la

complexation avec l’IL-2 (Wu et al., 2017). Il est également possible que l’utilisation de ces

liposomes pegylés permettent de dépasser certaines résistances tumorales, notamment

celle due à la glycoprotéine P.

L’étude de ces nouvelles technologies nécessite cependant une connaissance de la

pharmacocinétique de la doxorubicine chez le chien malade afin de comparer l’efficacité et

l’innocuité de ces nouvelles formes de délivrance avec la forme non encapsulée de la

doxorubicine. En ce sens, notre étude apporte des éléments sur la cinétique de la forme non

encapsulée et fournit ainsi une base de comparaison pour le développement de projets

ultérieurs.

139

ConclusionConclusionConclusionConclusion

La doxorubicine est un agent anticancéreux employé depuis des décennies en oncologie

humaine et vétérinaire dans le cadre du traitement de divers types tumoraux.

Le plus souvent classée comme inhibiteur des ADN topoisomérases de type II ou comme

agent intercalant, la doxorubicine présente également une réactivité chimique avec le

dioxygène cellulaire, à l’origine de la synthèse de dérivés réactifs de l’oxygène. Ces dérivés

provoquent un stress oxydatif cellulaire, causant la peroxydation des lipides constituant les

membranes cellulaires, des dommages à l’ADN ainsi l’oxydation de nombreuses protéines

cytoplasmiques. Tous ces mécanismes activent les différentes voies de mort cellulaire :

l’apoptose, l’autophagie, la sénescence et la nécrose cellulaire. L’orientation vers l’une ou

l’autre de ces voies semble dépendre de la concentration cellulaire en doxorubicine et donc

de sa pharmacocinétique.

Certaines cellules tumorales peuvent échapper aux différents mécanismes de cytotoxicité

de la doxorubicine, ce qui est à l’origine d’une résistance de la tumeur à la chimiothérapie.

Cette résistance passe parfois également par une modification de la pharmacocinétique de

la doxorubicine en augmentant son efflux cellulaire par surexpression de la glycoprotéine-P.

Hormis son implication dans la cytotoxicité des cellules tumorales, la pharmacocinétique

de la doxorubicine permet également d’expliquer une partie de sa toxicité concernant les

cellules non tumorales, et principalement sa toxicité cardiaque dose-dépendante par une

distribution importante de la doxorubicine dans le tissu cardiaque, expliquée par sa forte

affinité pour les cardiolipides.

Pour autant, il existe peu d’études sur la pharmacocinétique de la doxorubicine chez le

chien sain ou malade permettant d’adapter la posologie aux besoins thérapeutiques de

l’animal.

Notre étude permet de dessiner une vue d’ensemble de la pharmacocinétique de la

doxorubicine chez l’animal malade. Ceci a été réalisé grâce à la mise en place d’une méthode

analytique validée de dosage de la doxorubicine plasmatique chez le chien et à son

application sur une population de patients non sains. Tout comme chez l’homme, la

variabilité inter-individuelle est importante et la corrélation entre la pharmacocinétique et la

toxicité générale à court terme de la doxorubicine ne semble pas être établie.

140

La poursuite de cette étude en impliquant une population plus importante est nécessaire

pour déterminer d’éventuels paramètres pharmacocinétiques pouvant servir de facteur de

prédiction des effets indésirables de la doxorubicine chez les patients et d’ajuster au mieux

la posologie au patient. Thèse de M CHAVALLE Thomas Le Professeur responsable Le Directeur général VetAgro Sup campus vétérinaire VetAgro Sup Philippe BERNY

Le Président de la thèse

Professeur Serge Lebecque

Vu et permis d’imprimer Lyon, le Pour Le Président de l’Université, Le Président du Comité de Coordination des Etudes Médicales Professeur Pierre COCHAT

141

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167

ANNEXESANNEXESANNEXESANNEXES

166

Annexe 1 : Classification VCOG-CTCAE (Veterinary cooperative oncology group – common terminology criteria for adverse events) version 1.1, des effets indésirables secondaires à la chimiothérapie (VCOG, 2001). Ne sont présentes que les parties concernant la toxicité liée à l’injection, la toxicité gastro-intestinale, la myélotoxicité, la toxicité cutanée et la toxicité cardiaque, correspondants aux effets indésirables de la doxorubicine.

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Annexe 2 : Accord par le Comité d’éthique en expérimentation animale de VetAgro-Sup (n°1648).

176

179

Annexe 3 : Questionnaire présenté au propriétaire permettant d’évaluer les effets secondaires de l’administration de doxorubicine.

178

Annexe 4 : Numération-formule sanguine et biochimie sanguine lors de l’admission des cas dans l’étude et au cours des suivis à une semaine et trois semaines. Les valeurs en rouge correspondent aux valeurs significativement différentes de l’intervalle de référence.

179

180

183

CHAVALLE Thomas

CONTRIBUTION À L’ÉTUDE DE LA PHARMACOCINÉTIQUE ET D E LA TOLÉRANCE DE LA DOXORUBICINE CHEZ LE CHIEN Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, le 13 octobre 2017

RESUME : La doxorubicine est un anti-cancéreux communément utilisé en médecine vétérinaire pour le traitement des lymphomes et de diverses tumeurs solides. Les mécanismes d’action sont présentés de façon détaillée, ainsi que les éléments de pharmacocinétique chez les rongeurs et l’Homme. Cependant, malgré son utilisation répandue, il n’existe que très peu d’études sur la pharmacocinétique de cet anticancéreux chez le chien non sain. Les protocoles analytiques utilisés lors de ces études sont basés sur des protocoles développés chez l’Homme et dans l’espèce murine. Le développement d’une méthode analytique chez le chien permet son application à des études de pharmacocinétique de la doxorubicine dans l’espèce cible. Cette étude expérimentale permet une première description de la pharmacocinétique de la doxorubicine chez le chien non sain et les éventuelles relations entre sa pharmacocinétique et sa toxicité. C’est une étude préliminaire pour un travail futur sur l’améliorati on des stratégies thérapeutiques en cancérologie.

MOTS CLES : - Doxorubicine - Toxicité - Chimiothérapie - Chien - Pharmacocinétique

JURY : Président : Monsieur le Professeur Serge LEBECQUE 1er Assesseur : Monsieur le Professeur Philippe BERNY 2ème Assesseur : Madame le Professeur Frédérique PONCE

DATE DE SOUTENANCE : 13 octobre 2017

ADRESSE DE L’AUTEUR : 245 chemin des Marronniers

69280 Marcy l’étoile

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CONTRIBUTION À L’ÉTUDE DE LA PHARMACOCINÉTIQUE ET DE … vetagro sup campus veterinaire de lyon année 2017 - thèse n° 045 contribution À l’Étude de la pharmacocinÉtique