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UE1 Bases moléculaires et cellulaires des pathologies Pr Hélène Cavé Mercredi 26/09/2018 de 15h30 à 17h30 Ronéotypeur : Inès BERNEAU Ronéoficheur : Raphaël PARIENTE

Cours 2 – UE1

Signalisation ou le métabolisme de l’information Partie 2

Le professeur a précisé qu’il ne relirait aucune ronéo et ne prendrait part à aucune questions ou informations concernant les ronéos. Cependant durant les cours quelques exercices types et les objectifs du cours nous sont donnés, vous les trouverez en fin de ronéo.


Sommaire :

I. Récepteurs-enzymes A) Récepteurs à activité enzymatique associée : voie JAK-STAT 1. JAK 2. STAT 3. SOCS 4. Etapes de la signalisation 5. Combinatoires JAK/STAT préférentiels B) Récepteurs à activité enzymatique intrinsèque : récepteurs Tyrosine Kinase

1. Généralités 2. Activation des récepteurs Tyrosine Kinase : Prototype EGFR 3. Effecteurs 4. Adaptateurs 5. Voie de MAPK 6. Voie de PI3K/AKT C) Mécanismes d’arrêt du signal II. Réseau de signalisation partagé : dialogue ou « cross-talk » entre voies de signalisation A) Interactions fonctionnelles B) Interférences C) Métabolisme de l’information/Métabolisme énergétique

III. Pathologies touchant les circuits de signalisation

A) Neurofibromatose de Type 1 (NF1) B) Mutations de gènes de la voie de RAS dans les tumeurs C) La lèpre


I. Récepteurs à activité enzymatique Les récepteurs à activité enzymatique possèdent pour la plupart une activité enzymatique kinase. Ils se décomposent en deux voies :

- Récepteurs dont l’activité enzymatique est associée : JAK/STAT (voie indirecte) - Récepteur dont l’activité enzymatique est intrinsèque : tyrosine kinase (ou Ser/Thr kinase, guanylate

cyclase)

A) Récepteurs à activité enzymatique associée : voie JAK/STAT

1. JAK (Janus Kinase) Son nom fait référence à Janus, dieu à deux têtes pour la kinase et la pseudo-kinase. C’est une famille de 4 facteurs de transcription (JAK1, 2, 3 et TYR2). JAK est une petite protéine avec 4 domaines :

- Un domaine kinase - Un domaine pseudo-kinase (un peu différent du domaine kinase, son évolution par duplication a provoqué

une perte d’acides aminés indispensables d’où une perte de la fonction kinase) à Ce domaine permet la régulation de l’activité du domaine kinase

- Un domaine FERM permet la liaison à la membrane et participe aussi à la régulation - Un domaine SH2 : motif récurrent des protéines (20 à 30 AA) décrit par homologie avec Src (petite kinase)

Domaines d’homologie à Src :

• SH1 : domaine enzymatique à activité tyrosine kinase • SH2 : domaine qui permet la liaison à d’autres protéines au niveau des tyrosines phosphorylées et possède

donc une fonction de reconnaissance. Sa spécificité est variable et son affinité très importante, ce qui signifie que même pour une faible concentration de protéine, la reconnaissance aura quand même lieu.

• SH3 : permet la reconnaissance de domaines protéiques riches en proline JAK peut donc se fixer à des protéines possédant des tyrosines phosphorylées grâce à SH2. Il existe également des domaines d’homologie à la pleckstrine (PH) permettant la liaison aux phospho-inositides

2. STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription)


C’est une famille de 7 facteurs de transcription (STAT1 à STAT7) possédant 4 domaines : - Un domaine de liaison à l’ADN comme tout facteur de transcription - Un domaine de dimérisation - Un domaine SH2 - Une tyrosine conservée (en C-ter) qui peut être phosphorylée. Elle peut être reconnue par SH2 et permettre

la formation d’homodimères.

3. SOCS (Suppressor of Cytokine Signaling) C’est une famille de 7 membres (SOCS1 à SOCS7), chacun composée de 3 domaines d’interaction protéine/protéine:

- Un domaine SH2 qui permet la fixation à une tyrosine phosphorylée - Un domaine KIR (Kinase inhibitory reigon) capable d’inhiber directement la fonction kinase de JAK - Une boîte SOCS : séquence protéique capable de recruter le complexe multi-protéique ubiquitine transférase

et d’induire ainsi l’adressage de la protéine au protéasome SOCS permet donc deux inhibitions : - Celle de l’activité enzymatique avec KIR - Celle de l’ensemble du complexe grâce à la boîte SOCS et son adressage au protéasome dans lequel le

complexe sera détruit

4. Etapes de la signalisation Contrairement aux récepteurs à sept domaines transmembranaires, la voie JAK-STAT concerne un nombre restreint de molécules. Ces ligans sont le plus souvent :

- Facteurs de croissance - Cytokines - Hormone de croissance (GH) - Leptine - Interferon (IFN)

C’est donc une voie importante mais non diversifiée. à La voie JAK-STAT comporte 8 étapes :

1) Dimérisation des récepteurs 2) Phosphorylation croisée des JAK permettant l’activation de la Tyrosine Kinase 3) Phosphorylation du récepteur 4) Phosphorylation de JAK par STAT 5) Liaison à l’ADN (facteur de transcription) 6) Expression des gènes codant les protéines effectrices de la réponse au ligand 7) Expression de SOCS (rétrocontrole négatif) 8) Dégradation de l’ensemble Récepteur/JAK/SOCS

à Déroulé des étapes : L’explication est donnée à partir de l’hormone de croissance GH A l’état inactif, JAK est lié au récepteur, ancré dans la membrane. JAK est porteuse de son activité enzymatique mais en nécessite l’activation.


1) Dimérisation rassemblée par fixation du ligand

à La fixation du ligand sur JAK permet la mise à proximité des JAK l’une de l’autre d’où le terme dimérisation. 2) Phosphorylation réciproque des JAK

à La mise à proximité des JAK entraîne une addition de leurs activités enzymatiques respectives et donc une phosphorylation l’une de l’autre. Cette phosphorylation permet l’activation de la fonction kinase de chaque JAK.

3) Phosphorylation du récepteur à La protéine JAK active va phosphoryler la partie intracytoplasmique du récepteur permettant l’ancrage d’une protéine STAT de chaque côté (via leur domaine SH2).

4) JAK phosphoryle STAT au niveau de la tyrosine conservée

5) Liaison à l’ADN à La phosphorylation de la tyrosine de STAT va permettre son décrochage et libération du complexe. Libres, les STAT vont se dimériser et libérer des facteurs de transcription capables d’entrer dans le noyau et de se fixer sur les sites de reconnaissance à l’ADN.

6) Expression des gènes codant les protéines de la réponse effectrice au ligand


7) Expression de SOCS (rétrocontrole négatif)

à JAK-STAT possède en son sein le scénario de l’inhibition de SOCS. La protéine SOCS est une des protéines de la réponse effectrice au ligand. Transcrite, elle est capable dans le cytoplasme de se fixer à la place de STAT à côté de JAK. Cela permet l’extinction de la signalisation en déplaçant les STAT désormais inaccessibles à JAK.

8) Dégradation de l’ensemble Récepteur/JAK/SOCS à Cette fixation a pour conséquence : le recrutement par SOCS d’une ubiquitine transférase qui conduit le complexe au protéasome induisant sa dégradation. C’est donc un effet négatif, le rétrocontrole est négatif.

5. Combinatoires Pour chaque récepteur, il existe un usage préférentiel d’un ou deux type de JAK.


à Par exemple le combinatoire JAK2/JAK2 sera utilisé préférentiellement par des gènes de croissance erythropoïétiques (EPO, TPO (plaquettes), IL-3 (souches hématopoïétiques)). De même il existe des combinatoires JAK-STAT préférentiels. à Par exemple, l’IFN g-R se liera préférentiellement à JAK1/JAK2 puis STAT1. L’IL4 ajoute un niveau de complexité supplémentaire selon le type de cellule (macrophage ou lymphocytes B/T). STAT5 lui se différenciera selon le type de lignées. Ces combinatoires permettent une adaptation à la cellule (avec un niveau de complexité plus ou moins important) et rendent compte de la variation de chaque combinaison selon le type de cellule. Exemple de l’IFN-g :

La voie JAK-STAT est utilisée par de nombreuses cytokines. L’IFN-g est produit par les lymphocytes T et les cellules NK pour répondre aux infections virales. La fixation de l’IFN sur son récepteur entraîne le rapprochement des deux sous-unités de son récepteur, la phosphorylation puis dimérisation de STAT1, enfin la transcription de séquences spécifiques dans le noyau. Selon la quantité de production les conséquences seront différentes : - Si la quantité est trop faible alors cela indique une susceptibilité à l’infection et donc un point de traitement. - Si la quantité est trop importante cela peut induire une maladie inflammatoire ou auto-immune. Avec ses 3 composantes (Récepteur, JAK, STAT), la voie JAK/STAT est relativement simple et très rapide mais elle est directe. Autrement dit, cette voie est réactive mais peu sensible, contrairement aux voies possédant de nombreux composants qui permettent les phénomènes d’amplification du signal.

B) Récepteurs à activité enzymatique intrinsèque : Récepteurs Tyrosine Kinase

1. Généralités


Attention : La plupart des facteurs de croissance tirent leur nom de leur contexte de découverte scientifique, mais beaucoup sont de faux-amis. Les facteurs de croissance ont deux activités principales :

- Favoriser la prolifération - Empêcher la mort cellulaire

Les récepteurs Tyrosine Kinase sont ancrés dans la membrane et possèdent une structure générale commune avec :

- Un domaine intracellulaire Tyrosine Kinase - Un domaine protéique caractéristique extracellulaire glycosylé et riche en Cystéine

En fonction de leurs différences structurales, on compte environ 60 familles ou classes de récepteurs répartis en 20 sous-familles.

à Par exemple, le récepteur de gauche sur le schéma est monomérique, celui du milieu est dimérique tandis que celui de droite possède un domaine Tyrosine Kinase en 2 parties.


2. Activation des récepteurs Tyrosine Kinase : prototype EGFR Au repos, les récepteurs TK sont ancrés dans la membrane et porte une fonction kinase inactive. Après fixation du ligand sur le récepteur, on assiste à la dimérisation de ce dernier avec rapprochement des parties intracytoplasmique de chaque monomère (fonctions kinases). Cette proximité favorise l’autophosphorylation. On assiste donc à l’autophosphorylation des tyrosines intracellulaires de chaque récepteur permettant :

- L’acquisition d’une nouvelle fonction enzymatique : tyrosine kinase - Des phosphorylations qui se font sur plusieurs sites du récepteur

3. Effecteurs Conséquence 1 : Les tyrosines phosporylées vont activer la modulation de l’activité enzymatique avec le recrutement d’une protéine SH2 (se fixant sur un domaine activé). Conséquence 2 : Transduction du signal : Le complexe active alors des effecteurs qui peuvent être de deux types :

• Soit l’acquisition d’une nouvelle fonction enzymatique (phospholipases, lipide kinases) qui permet la production de 2nds messagers (ex : PIP3 kinase)

• Soit une cascade de molécules (ex : protéines kinases) Dans les deux cas, les acteurs sont multiples ce qui permet une forte amplification du signal en fonction de la complexité des branchements.

Exemple du récepteur à l’EGF (EGFR) : Un récepteur à activité TK peut contenir plusieurs sites de liaison aux SH2 et activer plusieurs effecteurs. Au niveau moléculaire, la phosphorylation des tyrosines kinases permet l’activation de la fonction kinase et le recrutement de protéines possédant un domaine SH2 comme Grb2.

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4. Adaptateurs Grb2 est un adaptateur moléculaire, c’est une molécule possédant quasiment que des domaines récurrents dont l’activité catalytique n’est pas propre. Un adaptateur sert donc de lien protéine-protéine. Grb2 se lie aux récepteur via SH2 et recrute alors la protéine Sos (facteur d’échange ou commutateur moléculaire). Sos est un facteur d’échange capable de s’associer à Ras. Par association avec Ras, Sos va en modifier la conformation induisant l’ouverture de la poche de Ras à un nucléotide. Cette ouverture permet la libération d’un GDP et l’entrée d’un GTP induisant le cycle de Ras nécessaire à son activation.


Ras fait partie de la sous-famille des petites protéines G (à distinguer des protéines G trimériques). Une petite protéine G est une protéine monomérique ressemblant à la sous-unité a des protéines G trimériques. Ras est fixée aux membranes par des radicaux de type lipidique (modification post-traductionnelle) et possède la fonction GTPase nécessaire à l’hydrolyse du GTP. La fonction GTPase de Ras est activée par NF1 (neurofibromine) induisant le cycle des commutateurs moléculaires. NB : Ras ne possède pas de fonction de phosphorylation, il inactive les kinases. Le GTP est un nucléotide et non une protéine phosphorylée. Ras actif agit en se fixant sur des effecteurs. Ces effecteurs activent à leur tour des voies en aval de Ras provoquant des modifications des voies cellulaires. Deux voies sont connues et bien décrites :

- La voie MAPK agissant sur la prolifération - La voie PI3K agissant sur la survie cellulaire

5. Voie de MAPK/ERK

La voie MAPK suit le modèle d’une cascades de molécules, il s’agit dont d’un enchaînement d’interactions.

1) Le contact direct entre Ras et Sos induit le changement conformationnel de Ras 2) RAF est une molécule capable de se fixer sur Ras-GTP 3) RAF phosphoryle MEK (kinase) 4) MEK phosphorylée est active et peut à son tour phosphoryler ERK 5) ERK phosphorylée possède une action intracytoplasmique. Sa cible nucléaire est ELK.

Isoformes de Ras : protéines homologues

La famille Ras comprend 4 protéines codées seulement par 3 gènes très homologues (97% homologie au niveau des codons 12-13 et 61 qui sont les plus touchés par les mutations). La différence entre les protéines est visible en bout de chaîne C-ter, dans une région hypervariable rendant les modifications post-traductionnelles spécifiques de chaque protéine.


Modifications post-traductionnelles de Ras : Ras est une protéine hydrophile, les modifications post-traductionnelles visent à modifier cette propriété pour faciliter son ancrage à la membrane. NB : Le détail des modifications est donné à titre indicatif pour mieux comprendre la suite du cours Ras est à l’état natif cytosolique. Une des modifications post-traductionnelles est la prénylation : Cela consiste en la liaison à Ras d’un farnésyl diphosphate qui est une molécule d’acide gras (AG) isoprénoiïde. Cette liaison confère un caractère lipophile à Ras qui se transforme alors en :

- H-Ras avec un AG supplémentaire permettant un double ancrage à la membrane - Ou en K-Ras

Ces modifications confèrent à Ras la propriété d’ancrage à la membrane. Des recherches sur les inhibiteurs de Ras ont été menée. La première hypothèse était l’inhibition de la farnésyl transférase bloquant ainsi la farnésylation de Ras. L’étude menée sur H-Ras in vitro est un succès. Néanmoins les résultats in vivo soulève une nouvelle difficulté. K-Ras peut non seulement être farnésylée mais aussi géranylée. Les études sont alors menées en utilisant des statines (hypocholestérolémiant). Les statines bloquent la voie du mévalonate et empêchent donc la géranylation ainsi que la farnésylation. De plus, on observe des résultats pro-apoptotiques empêchant la formation de métastases. Les effets secondaires restent à démontrer car aucun test in vivo n’a encore été effectué.

6. Voie PI3K (Phosphatidyl inositol 3 kinase) La PI3K est une molécule possédant une fonction kinase, elle est donc capable de phosphoryler une autre molécule. PI3K est ici une molécule lipidique composée :

- D’un inositol - D’un glycérol (lipophile) présent au niveau de la membrane

PIP3 (3,4,5) triphosphate est obtenu à partir de PIP2 (4,5) diphosphate avec transformation d’un ATP en ADP. Structure de PI3K PI3K est une enzyme comportant 2 sous unités :

- Une sous-unité catalytique P110 composée elle même par : • Un domaine kinase • Un domaine de liaison à Ras • Un domaine de liaison à P85

- Une sous-unité régulatrice P85 composée par : • Un domaine de liaison à P110


• 2 SH2 Grâce à sa sous-unité régulatrice, PI3K est une protéine adaptatrice (SH2) et peut permettre la fixation de P110 à une autre molécule. C’est une voie directe. La phosphorylation par PI3K d’une autre molécule est faisable par 3 voies :

1) Une voie directe P110 se fixe sur un récepteur tyrosine kinase activé ce qui permet d’apporter P110 à la membrane (contenant PIP2) et ainsi former du PIP3.

2) Voie passant par un intermédiaire IRS (récepteur à l’insuline)

3) Voie passant par RAS Ici, Sos sert d’activateur pour Ras qui vient se lier à à la sous-unité P110 de la PI3K. La formation de PIP3 (lipophile) au niveau de la membrane permet une reconnaissance de celui-ci par des protéines à domaines plextrine (PH).

Le message est signalé par une variation de concentration du 2nd messager, ici de PIP3. Les cibles cellulaires de PIP3 sont : - PDK1 : phosphatidyl inositol dépendant activé par la fixation à PIP3 - PDK2 activé par fixation à PIP3 - AKT ou PKB activé par PDK1 et PDK2 possédant une action sur la voie de signalisation comme sur mdm2, mtor ou GSK3…

Ex 1 : Mdm2 est un inhibiteur de P53 Or P53 provoque un arrêt du cycle cellulaire et un envoie des cellules vers l’apoptose. Son inhibition participe donc bien à une voie de prolifération et de survie cellulaire : effet antiapoptotique et prolifératif


Ex 2 : AKT agissant sur mTOR provoque une croissance de la synthèse des protéines contribuant à la prolifération à traduction du signal en une activité particulière

C) Mécanismes d’arrêt du signal La terminaison du signal peut dans certains cas être effectuée par des phosphatases ou par endocytose du récepteur. Ici, c’est PTEN qui joue le rôle de transformer PIP3 en PIP2 inhibant ainsi les voies cellulaires. Exemple de pathologie : infection par la bactérie Listeria monocytogenes Cette bactérie est transmise la plupart du temps par voie orale et se localise particulièrement dans les pays industrialisés. Elle touche surtout les patients immunodéprimés comme les femmes enceintes provoquant chez celles-ci des avortements ou des accouchements prématurés. La bactérie Listeria est une protéine capable d’être reconnue comme ligand par certaines protéines kinases. Aussi, on assiste à un détournement d’une voie physiologique en voie pathologique provoquant ici une modification du cytosquelette ainsi qu’une internalisation de la bactérie.


II Réseau de signalisation partagés : dialogue ou « cross-talk » entre voies de signalisation PB/Comment apporter une réponse spécifique à un facteur donné ?

A) Interactions fonctionnelles Les interconnexions sont multiples dans la cellule. Il existe un noyau de processus conservés mais également des petites variations aboutissant à des conséquences différentes pour la cellules. Il existe des interférences positives qui passent par une réponse unifiée nécessitant l’intégration par la cellule de chacun des différentes messages. Les interactions fonctionnelles sont des convergences pouvant être :

- additives : A OU B Ex : en aval de l’IFN, JAK est capable d’activer PI3K qui active PKC permettant la phosphorylation de STAT1

- intégratives : A ET B à l’intégration des signaux est exclusive Ex : chez la drosophile Expression des gènes selon bandes de couleur, bleu ou rouge, seules les bandes violettes = superposition bleu et rouge peuvent émettre le 3e signal nécessaire pour l’action de transcription des gènes à double régulation

B) Les interférences

Il existe des risques négatifs de l’interaction qui peuvent cependant être contrés. La cellule doit évoluer de façon à se munir de plusieurs systèmes :

- Spécificité des voies qui agissent sur beaucoup de protéines avec une affinité différente pour chaque cible - Phosphatase : correction des mauvaises phosphorylations (mauvais site, mauvaise protéine) - Isolement spatial (organisation spatiale cellulaire) = la cellule est organisée en sous-domaines, en complexes

macro moléculaires distincts qui permettent d’isoler les voies de signalisation


Ex : compartimentation des PKA PKA est compartimenté par des protéines d’ancrage AKAP qui augmente : - L’efficacité de la réaction - La spécificité Cette compartimentation a pour conséquences : § La micro compartimentation cellulaire avec la mise en place de gradient de 2nds messagers § Une coordination des protéines kinases § Une meilleure efficacité

Ex de gradient : AMPc est diffusible mais selon son gradient, elle régule la réponse à des stimuli externes dans une région donné et une période donnée : mise en place d’un gradient spatio-temporel. En pathologie un disfonctionnement du signal peut donner lieu à un dérèglement du système de protection.

C) Métabolisme de l’information/Métabolisme énergétique Dans la signalisation il y a un équilibre entre les quantités de substrat et d’enzyme permettant une régulation de la signalisation. L’action des drogues sur les enzymes sera différente selon le métabolisme mis en jeu.

III Pathologies touchant les circuits de signalisation

A) Neurofibromatose de type 1 (NF1)

La neurofibromatose de type 1 est une maladie génique à transmission autosomique dominante touchant 1 naissance sur 3500 Le gène touché est NF1 induisant une production insuffisante de neurofibromine. La neurofibromine permet à Ras de retourner sous forme inactive. La neurofibromatose peut être compliquée par une haploinsuffisance (perte d’un allèle du gène NF1) ou des nodules de Lish (au niveau de l’œil). L’haploinsuffisance favorise l’inactivation bi-allélique pouvant atteindre une cellule somatique. Aussi dans cette cellule, Ras sera constamment activée ce qui favorisera la prolifération cellulaire, facteur de cancer.


B) Mutations de gènes de la voie Ras dans les tumeurs

Ras est au centre des maladies cancéreuses, en effet dans 1/3 des tumeurs, Ras est muté. La mutation de Ras lui confère une inactivation de sa fonction GTPase et donc une incapacité a retrouvé sa forme inactive. De nombreux inhibiteurs de Ras sont utilisés en soin de thérapeutique ciblé dans les tumeurs. Comme cité précédemment les statines sont aujourd’hui l’objet de nombreuses recherches. Cela nécessité une parfaite connaissance du gène et donc un

séquençage. On parle alors de théranostic.

C) La lèpre (Mycobacterium leprae)

La lèpre est une maladie infectieuse chronique touchant les nerfs périphériques de la peau et des muqueuses particulièrement en Asie et Afrique. On compte encore aujourd’hui 15 millions de lépreux ce qui constitue un véritable problème de Santé Publique. Mycobacterium Leprae prolifère dans les cellules de Schwann (qui entourent les axones) induisant une signalisation sur ErBL (classe 1 de tyrosine kinase) jusqu’à ERK phosphorylée induisant la démyélinisation. La progression de la lèpre peut être bloquée par : - UO126 qui inhibe MEK et donc la phosphorylation de ERK - Herceptine (anticorps) utilisé dans le cancer du sein qui agit au niveau du récepteur

On voit ici que pour deux maladies dont les symptômes et les causes sont différentes, un même traitement peut-être utilisé : ici l’Herceptine est utilisée pour traiter les cancers du sein et la lèpre.


Problème : Mutations de JAK2 V617F (domaine pseudo-kinase) (80% des patients atteints de polycythémie vraie)

• Conséquences moléculaires de la mutation? • Conséquences cellulaires? • Quelle conséquence clinico-biologique imaginez-vous?

La correction vous sera indiquée dans la ronéo suivante. Objectifs de fin de cours : A la fin de ce cours vous devez être capables de répondre de façon synthétique aux questions suivantes :

- Qu’est-ce qu’un adaptateur moléculaire ? - Quels sont les principaux domaines récurrents des protéines ? - Comment fonctionne la signalisation JAK-STAT ? - Comment fonctionne un RTK ? - Connaitre le cycle de RAS - Connaitre les principales voies en aval : RAS/MAPK, PI3K/AKT - Vous devrez avoir compris :

Þ L’importance et les modalités : de compartimentation cellulaire de la signalisation Þ de dialogue entre voies de signalisation

EtudedelaphosphorylationdeJAK2etSTAT5parWesternblotdansdescellulesBaF/3sauvages,exprimantJAK2sauvageouJAK2V617F.+/-erythropoiétine(EPO)

CellulesBaF/3encultureenprésencededosescroissantesd’EPO

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