Cours Principes géné PCR [Mode de compatibilité]

Principe de la PCR (1)

Base sur la capacit de lADN polymrase synthtiser le brin complmentaire dun ADN servant de matrice.

PRINCIPES GENERAUX DE LA PCR

Initiation du processus : un segment dADN servant damorce Amorce (Primer) = oligonuclotide (17-30 bases), squences complmentaire celle du brin amplifier Association lADN cible suivie dune longation par lADN polymrase

Dr. EKAZA Euloge Unit de Microbiologie Molculaire Dpartement de Bactriologie-Virologie Institut Pasteur de Cte dIvoire

Synthse dun double brin

Dr EKAZA Euloge/IPCI/Cours Rgional sur l'Antibiogramme (20-30 Avril 2009) Abidjan

PCR=Polymerase Chain Reaction (PCR) = amplification gnique dADNBut amplifier correctement lADN dun organisme donn, la squence ADN de cet organisme doit tre connue . Technique dcrite par KARY MULLIS en 1983 et publie en 1985

PCR Polymerase Chain Reaction 3 tapes dans chaque cycle de PCRZone amplifier

ADN + amorces + dNTP + DNA polymerase Dnaturation 95C Hybridation 60C des amorces en 3 De chaque simple brin(amorce =primer =oligonuclotide)

Pourquoi la PCR?Matriel gntique = ADN ou ARN = unique et spcifique aux espces (bactries, virus, parasites, hommes, animaux) Quest ce que la PCR ? mthode utilise pour amplifier des squences spcifiques dADN provenant dun mlange complexe dADN (bactries, virus, parasites, hommes etc.) une amorce est ncessaire. Quest-ce qune amorce? petite squence dacides nucliques qui sert de point de dpart la rplication de lADN.Dr EKAZA Euloge/IPCI/Cours Rgional sur l'Antibiogramme (20-30 Avril 2009) Abidjan

Synthse de chaque brin Complmentaire par la DNA Polymrase (Thermus Aquaticus)Dr EKAZA Euloge/IPCI/Cours Rgional sur l'Antibiogramme (20-30 Avril 2009) Abidjan

RappelsADN = Acide Dsoxyribonuclique = chelle tordue avec barreaux dinuclotides

4 bases azots : 2 bases puriques = Adnine (A) et Guanine (G) 2 bases pyrimidiques = Thymine (T) et Cytosine (C) Uracile (U) la place de (T) dans lARN Appariement des bases : A::T et G:::C Liaison = liaisons hydrognes

Sparation de lADN bicatnaire en simple brin sous leffet de la chaleur (90-95C) = Dnaturation Aprs chauffage, le refroidissement lent entraine recollement entre squences complmentaires = hybridation = amorage = annealing Dcouverte dune enzyme Taq polymrase partir de bactrie thermophile (Thermus aquaticus) = ADN polymrase (stable 70-75C).Dr EKAZA Euloge/IPCI/Cours Rgional sur l'Antibiogramme (20-30 Avril 2009) Abidjan Dr EKAZA Euloge/IPCI/Cours Rgional sur l'Antibiogramme (20-30 Avril 2009) Abidjan

Droulement de la PCRSquence 2 : Amplification (3) Ralisation PCR consiste en une succession de 3 squences

Squence 1 : Extraction de lADN ou ARN

Plusieurs techniques dextraction : Mcanique : Choc thermique Chimique

ImageDr EKAZA Euloge/IPCI/Cours Rgional sur l'Antibiogramme (20-30 Avril 2009) Abidjan Dr EKAZA Euloge/IPCI/Cours Rgional sur l'Antibiogramme (20-30 Avril 2009) Abidjan

Squence 2 : Amplification (1)

Prparation du mlange ractionnel et ajout de lADN Le milieu ractionnel tamponn constitu dlments indispensables : Prcurseurs trinuclotidiques (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) LADN polymrase Amorces Produits chimiques : optimisation de la PCR A ce milieu est ajout lADN extrait

4 types de thermocycleurs : un thermocycleur est bainMarie sec programmable (temprature et dure)



Squence 2 : Amplification (2)

Squence 3 : Dtection des produits de la PCR (1)

Dtection et analyse des produits PCR Un ou plusieurs fragments dADN (la ou les squences dintrt) Par lectrophorse sur gel dagarose (ou dacrylamide) Rvlation par coloration au bromure dthidium : produits visibles instantanment par transillumination aux UV (280-320 nm) Interprtation des profils dlectrophorse Suivant la taille des produits




Quelques avantages de la PCR pour le diagnostic La sensibilit La capacit a dtecter des infections latentes et/ou gnes de rsistance Seul un fragment dADN suffit pour lamplification La spcificit et la stabilit (amorces, Nested PCR) Plus rapides que la culture : rsultats en quelques heures par rapport aux cultures, mais remplace jamais la culture Un grand nombre dchantillons peuvent tre tudis en mme temps La comparaison entre espces Palier aux problmes de reproductibilits associs aux mthodes phnotypiques

gel dagarose aprs PCR et lectrophorse. Le gel est photographi sous lumire UV. Les signaux positifs apparaissent sous laspect de bandes claires nettes. Le rsultat n'est interprtable que s'il existe des tmoins positifs (la raction a fonctionn) et un tmoin ngatif (il n'existe pas de contamination).




Quelques inconvnients de lutilisation de la PCR comme outil diagnostic

Ncessit davoir des informations sur la squence dADN cible Faux ngatifs : prsence dinhibiteur Ncessit de disposer de plusieurs locaux et dutiliser du matriel usage unique pour viter les contaminations (faux positifs) : - les arosols : 1 mol ADN amplifi gnre au moins 1 million de copies0,1 l (vol) de contaminant = 106 copies = 100 % positivit rsultat faussement positif rendu

PCR en temps rel : Analyse automatique pendant la PCR

- Contamination par un ADN exogne : faux positifQualit de lchantillon analyser est cruciale



Principe de la RT-PCR

Contrle : validit du test

Pour chaque srie de PCR, il est indispensable deffectuer : - 1 contrle positif : ADN tmoin connu, nombre de copies raisonnablement faible pour la sensibilit de la mthode.

Inclusion dun contrle positif, ex : souche de rf. ou chantillon clinique artificiellement positiv par une quantit dADN cible.

- 1 ou plusieurs contrle ngatifs : tube contenant le mlange ractionnel et enzyme, mais : - sans ADN : vrifier que ractif et enzyme non contaminsLors de la prparation des chantillons pour lamplification, le contrle ngatif doit tre le dernier spcimen tre prpar avant le dbut de lamplification : dtection de toute contamination pendant le process.

- avec un ADN non amplifiable : vrifier la spcificit



Comment minimiser la contamination externe?

Equipement et ressources humaines au Labo PCR

Utiliser matriel et ractif garantis exempt dADN : Prcautions : - Aliquotage des ractifs et rejet de tout cas suspect - Strilisation des tampons, pointes de pipette, tubes - D Dcontamination des pipettes l t i ti d i tt leau d j de javel dil (HCl 1M l dilu usage dconseill sur pipettes) - Utilisation des pipettes dplacement positif ou des pointes filtres - Irradier la zones de travail 15 min en fin de manip. Si ncessaire, utilisation de ractifs pour rduire le risque. Ex : dUTP la place de dTTP permet la dgradation des produits parasites

Mises jour rgulires des procdures dinstallation , dutilisation et de maintenance du thermocycleur A chaque acquisition de nouveau quipement, comparer le nouveau protocole lexistant pour assurer les mmes performances Formation approprie et valuation de comptence dun nouveau personnel.



Que faut-il pour faire une PCR Dtection des inhibiteursRisque de rendre un rsultat faussement ngatif en raison de la prsence dun inhibiteur de lADN polymrase Agents responsables : - DMSO (>10%), Dnases, SDS, Hparine, bleu de bromophnol, phnol, etc. - Substances de nature pas toujours connue dans les LCR, urine. Solutions : - Diluer les chantillons dans leau strile (1/5 et 1/10) - Purifier lADN (Kit de purification commercialis) - Chauffer lchantillon 10 min 95C Echantillon: de lADN ou de lARN Appareil: Un thermocycleur, configur pour un protocole spcifique Ractifs: - Un mlange PCR (PCR Mix) : Des amorces (forward & reverse primers) Nuclotides; dNTPs (dATP, dCTP, dGTP and dTTP ) Une ADN polymrase thermostable (Taq polymerase) Thermus aquaticus Tampon MgCl2+ De leau qualit biologie molculaireDr EKAZA Euloge/IPCI/Cours Rgional sur l'Antibiogramme (20-30 Avril 2009) Abidjan Dr EKAZA Euloge/IPCI/Cours Rgional sur l'Antibiogramme (20-30 Avril 2009) Abidjan

Laboratoire de PCR

Exemple dutilisation de la PCR pour la dtection simultane des gnes qnrA, qnrB et qnrS dEntrobactries BLSE lIPCI

Ractions ralises dans un laboratoire PCR exclusivement ddi et totalement spar des autres activits Idalement, divis en trois parties squentielles et en sens unique : - PCR 1 : Rception des chantillons et extraction ADN/ARN - PCR 2 : Prparation du mlange ractionnel et ajout de lADN/ARN sous deux hottes distinctes - PCR 3 : Amplification et analyses des amplicons. Organisation stricte et irradiation des surfaces avec UV aprs chaque PCR

Taille en pb

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Photo gel CQ-qnrABS 2007 Site dAbidjan: lectrophorse en gel dagarose 1.5 % contenant du BET 0.5 g/ml des produits damplification pour la recherche des gnes qnr A-B-S par PCR multiplexe Piste M: marqueur de poids molculaire SmartLadder SF (Eurogentec); piste 1: souche Ref-qnr 001; piste 2: souche Ref-qnr 002; piste 3: souche U2A 2120; piste 4: souche CQ-qnr 001; piste 5: souche CQ-qnr 002; piste 6: souche CQqnr 003; piste 7: souche CQ-qnr 004; piste 8: souche CQ-qnr 005; piste 9: souche CQ-qnr 006 et piste 10: tmoin ngatif (eau pour prparation injectable)Dr EKAZA Euloge/IPCI/Cours Rgional sur l'Antibiogramme (20-30 Avril 2009) Abidjan Dr EKAZA Euloge/IPCI/Cours Rgional sur l'Antibiogramme (20-30 Avril 2009) Abidjan

Exemple dutilisation de la PCR pour la dtection du gne aac-6-1b dEntrobactries BLSE lIPCI M T (+) T () 1 2 3 4 5 6 M

600 pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb

600 pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb

Photo gel CQAAC 2007 Site dAbidjan: lectrophorse en gel dagarose 1.5 % contenant du BET 0.5 g/ml des produits damplification pour la recherche du gne aac par PCR. Pistes M: marqueur de poids molculaire SmartLadder SF (Eurogentec); piste T (+) : souche Refqnr 004; piste T (): tmoin ngatif (eau pour prparation injectable) ; piste 1: souche CQqnr 001; piste 2: souche CQqnr 002; piste 3: souche CQqnr 003; piste 4: souche CQqnr 004; piste 5: souche CQqnr 005 et piste 6: souche CQqnr 006.


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