CXCR4 et Gab1 coopèrent pour contrôler le développement des cellules progénitrices des muscles...
44
CXCR4 et Gab1 coopèrent CXCR4 et Gab1 coopèrent pour contrôler le pour contrôler le développement des développement des cellules progénitrices cellules progénitrices des muscles migrantes des muscles migrantes Elena Vasyutina Accepté le 13 juillet 2005
CXCR4 et Gab1 coopèrent pour contrôler le développement des cellules progénitrices des muscles migrantes Elena Vasyutina Accepté le 13 juillet 2005
CXCR4 et Gab1 cooprent pour contrler le dveloppement des
cellules prognitrices des muscles migrantes Elena Vasyutina Accept
le 13 juillet 2005
Page 2
Bibliographie Dermomyotome = origine des muscles squelettiques
dembryon de vertbrs. Cellules ventrales du dermomyotome => perte
morphologie pithliale => dlamination => migration. Formation
cellules prognitrices => muscles hypaxial des extrmits, la
langue et le diaphragme. Nombreux gnes essentiels pour le
dveloppement des progniteurs migrants hypaxial : Pax3 requis pour
ltablissement correct dun pool de progniteurs dans le dermomyotome
ventral. Rcepteurs tyrosine kinase c-Met + ligands essentiels pour
dlamination des progniteurs qui sont destins migrer. Gab1 code pour
une molcule adaptatrice qui transmet le signal c-Met. Lbx1 code
pour un facteur de transcription homdomaine, qui est exprim
exclusivement dans les progniteurs migrants qui forment les muscles
hypaxial. Inactivation de Lbx1 altrent la migration des progniteurs
en migration tandis que les autres populations de cellules
musculaires trouvent leur cible. => Les diffrents sous
populations de cellules prognitrices de muscles rencontrent et
rpondent des slections distinctes durant la migration.
Page 3
Bibliographie (2) Cellules qui ont trouv leur cible =>
prolifration => expression des facteurs rgulateurs myogniques
(MyoD, Myf5, la myognine et MRF4) => programme de
diffrenciation. Rcepteurs aux chimiokines + ligands rgulent la
migration des cellules. SDF1 = ligand du rcepteur CXCR4. Mutants
CXCR4 ou SDF1 de souris => Problme migration des cellules. Sites
prfrentiels dans la mtastase du cancer du sein de la femme corrls
avec lexpression de CXCR4 dans les cellules tumorales et avec
lexpression de SDF1 dans les organes envahit par les cellules
mtastases. => Fonction possible de CXCR4/SDF1 dans les cellules
musculaires.
Page 4
But => Dtermination des gnes impliqus dans la migration des
cellules prognitrices des muscles, lors du dveloppement chez
lembryon de poussin et souris. Expriences ralises : Dtermination du
profil dexpression des gnes Lbx1, CXCR4 et SDF1 dans des embryons
de poulet et de souris, diffrents stades de dveloppement. Effets de
SDF1 sur les cellules progntrices de muscles. Distribution spatiale
de CXCR4 dans les bourgeons musculaires.
Page 5
Rsultats
Page 6
Lallle Lbx1 GFP permet le tri des cellules prognitrices de
muscles par le profil dexpression des gnes. Cration du mutant Lbx1
GFP : Lbx1 exprim durant le dveloppement dune large gamme des
cellules migrantes hypaxial, mais non dans les autres types de
cellules prognitrices de muscles. Pour isoler des progniteurs de
muscles par tri de cellules => gnration dun mutant de lallle
Lbx1 fusionn la GFP par recombinaison homologue dans des cellules
ES (Fig A). Slection des cellules Lbx1 GFP => Southern blot (Fig
B).
Page 7
Lallle Lbx1 GFP permet le tri des cellules prognitrices de
muscles par le profil dexpression des gnes (2). Protine GFP
produite par lallle Lbx1 GFP localise dans les cellules migrantes
prognitrices du muscle au niveau dorsale et ventral des membres
(Fig C). Anti-Lbx1 en rouge. Anti-GFP en vert.
Page 8
Lallle Lbx1 GFP permet le tri des cellules prognitrices de
muscles par le profil dexpression des gnes (3). Profil dexpression
des gnes dans les cellules Lbx1 GFP : Des cellules prognitrices de
muscles GFP+ ont t isol au niveau de bourgeons de membres. Membres
antrieurs dembryon de stade 10.5 jours ont t dissqu, les cellules
ont t dissoci, et les cellules GFP+ ont t isol par cytomtrie de
flux. Sondes gnres par de lARN obtenu de ces cellules et utilises
pour lhybridation Affymetrix GeneChips. Technique Affymetrix
GeneChips Utilisation de micropuces sur lesquelles on dpose des
squence dADN qui vont reprsenter lensemble du gnome des cellules
que lon tudie. Les sondes gnres permettront de voir directement sur
les puces les gnes qui sont actifs ou rprims dans le type
cellulaire tudi.
Page 9
Lallle Lbx1 GFP permet le tri des cellules prognitrices de
muscles par le profil dexpression des gnes (3). Profil dexpression
des gnes dans les cellules Lbx1 GFP : Des cellules prognitrices de
muscles GFP+ ont t isol au niveau de bourgeons de membres. Membres
antrieurs dembryon de stade 10.5 jours ont t dissqu, les cellules
ont t dissoci, et les cellules GFP+ ont t isol par cytomtrie de
flux. Sondes gnres par de lARN obtenu de ces cellules et utilises
pour lhybridation Affymetrix GeneChips. Technique Affymetrix
GeneChips Utilisation de micropuces sur lesquelles on dpose des
squence dADN qui vont reprsenter lensemble du gnome des cellules
que lon tudie. Les sondes gnres permettront de voir directement sur
les puces les gnes qui sont actifs ou rprims dans le type
cellulaire tudi.
Page 10
Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin.
Expriences ralises des techniques dhybridation in situ et
dimmunohistochimie. CXCR4 exprim dans les bourgeons des membres
(Fig A,C,E). Distribution de lexpression de CXCR4 similaire celle
de Pax3 ou de Lbx1 mais non identique dans les cellules
prognitrices des muscles. Jet de cellules CXCR4+ observ le long de
la chorde hypoglossal et dans larc primaire branchial, le long de
la route et au niveau de la cible des cellules prognitrices
migrantes des muscles qui gnrent le muscle intrinsque de la langue
(Fig G). Anti CXCR4 en rouge Anti Lbx1 en vert
Page 11
Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (2).
Lexpression de SDF1 peut tre dtect dans les membres en bourgeon du
msenchyme, et le schma dexpression est identique au cours du
dveloppement (Fig B,D, F). Quand les cellules prognitrices des
muscles se dlaminent => SDF1 exprim dans le bourgeon proximal
des membres (Fig B,D). Aprs que les cellules soient entres dans les
membres, lexpression de SDF1 est aussi observe plus tale dans le
msenchyme (Fig F) => Les cellules migrantes prognitrices de
muscles, dans les muscles, sont trouves la proximit des cellules
exprimant SDF1. Comparaison dun contrle et dembryons Lbx1 -/- =>
schmas dexpression similaire pour SDF1 => progniteurs de muscles
nexpriment pas SDF1.
Page 12
Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (3).
Analyse de la distribution de Lbx1 et CXCR4 par immunohistochimie,
pour identifier si CXCR4 et Lbx1 sont exprims dans les mmes
populations de cellules. Cellules CXCR4+ dans les masses de pr-
muscles des membres, sont aussi Lbx1+ => CXCR4 est prsent dans
les cellules migrantes prognitrices (Fig D). Cependant, pas toutes
les cellules Lbx1+ expriment CXCR4 !
Page 13
Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (4).
Lbx1 apparat dans les progniteurs prcdant leur dlamination du
dermomyotome ventral (Fig A). CXCR4 et Lbx1 co-exprims aprs que les
cellules migrantes prognitrices aient migr en dehors du
dermomyotome (Fig A). Protine CXCR4 prsente dans les cellules qui
sont dj entr dans le membre antrieur au stade 10.0 10.25 jours,
mais localise seulement dans une sous-population de cellules Lbx1+
qui sont localises prs de lectoderme (Fig A,B,C). Entre les stades
10.25 et 11, le nombre de cellules CXCR4+ augmentent, mais un
nombre signifiant de cellules Lbx1+ restent ngatives pour CXCR4
(Fig B,C).
Page 14
Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (5).
Toutes les cellules Pax3+ dans les membres co-expriment Lbx1. Des
cellules Pax3+/CXCR4+ et Pax3+/CXCR4- existent dans les membres.
Schmas de lhybridation in situ de CXCR4 et Pax3 similaires mais non
identiques => toutes les cellules Pax3+ nexpriment pas
CXCR4.
Page 15
Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (6).
Examination de CXCR4 et MyoD par immunohistologie => populations
de cellules CXCR4+ et MyoD+ distinctes (Fig E,F). Cellules
MyoD+/Lbx1+ ou MyoD+/Pax3+ sont frquemment dtectes. Dans membres
dvelopps, cellules CXCR4+ places plus prs de lectoderme que les
cellules MyoD+. =>Les progniteurs migrants des muscles
nexpriment pas CXCR4 au moment o ils sont dans le dermomyotome.
Cellules CXCR4+ co-expriment Lbx1 et Pax3, cest dire, les protines
connues pour tre exprimes dans les progniteurs migrants, mais non
le facteur de diffrenciation musculaire MyoD. => Ainsi, CXCR4
est rgul ngativement dans les progniteurs de muscle primaires pour
leur diffrenciation (Fig 3G).
Page 16
Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (7).
Reprsentation de lexpression des gnes dans les cellules
prognitrices des muscles durant le dveloppement
Page 17
Les cellules CXCR4 rpondent-elles SDF1? Western blot Vrifie que
les protines SDF1 ont t exprim par le plasmide et non par la
cellule Cos1
Page 18
Accumulation de CXCR4 prs de limplant Application de SDF1 aux
positions ectopiques dans le membre de poussin Rvlation par
hybridation in situ
Page 19
Par hybridation in situ avec une sonde Pax3 Redistribution
substantielle des cellules prognitrices des muscles
Page 20
Redistribution plus prononce de CXCR4 par rapport Pax3
Certaines cellules de Pax3 nont pas rpondu SDF1 SDF1 attire les
cellules CXCR4
Page 21
Effet de SDF1 sur la diffrenciation Signaux dhybridation
infrieur
Page 22
conclusion SDF1 attire seulement des cellules CXCR4, cellules
prognitrices des muscles. SDF1 supprime leur diffrenciation
Page 23
Distribution des cellules hypaxiales Les outils ncessaires: -un
allle mut de CXCR4, not CXCR4-/- et Gab1, not Gab1-/- -Anticorps
anti-Lbx1 et anti-MyoD ( pour visualiser les populations de
cellules)
Page 24
contrle Diminution de Lbx1 et MyoD Hypoglossal cord
Page 25
Le nombre de Lbx1, MyoD est infrieur du contrle Lbx1, MyoD ne
sont pas discernable Dans les cellules doubles mutants, les
cellules Lbx1 natteignent pas leur cibles
Page 26
Il est impossible de compter des cellules quantification
Membres diviser en 4 domaines : I = domaine dorsal proximal II =
domaine dorsal distal III = domaine ventral proximal IV = domaine
ventral distal
Page 27
Diminution de nombre de Lbx1 Diminution du nombre de MyoD plus
importante dans le domaine dorsal distal par rapport au domaine
dorsal proximal
Page 28
Ils ont compt tous les noyaux apoptotique Augmentation
significative dapoptosis dans le domaine dorsal proximal dans les
cellules mutants Les cellules prognitrices des muscles ne sont pas
correctement distribues et leur survie est altre dans le domaine I
dans les embryons muts
Page 29
Analyse de leffet de CXCR4 mutant dans Gab1 Les cellules Lbx1
et de MyoD ont diminu
Page 30
Analyse de la mort cellulaire Le nombre de cellules apoptotique
augmentent dans le domaine I
Page 31
La gnration dun muscle Comparaison du muscle de la langue et du
membre de contrle Anticorps anti-myosine et anti-MyoD Muscle
intrinsque Muscle extrinsque
Page 32
Muscle intrinsque Partie proximal Drive du msenchyme Partie
distal Drive des somites occipital
Page 33
Aucune diffrence
Page 34
diffrence Le muscle intrinsque est petit mais observable -Un
fragment du muscle intrinsque dans le domaine proximal -la taille
globale est petite
Page 35
conclusion Simple mutant CXCR4 Cellules Lbx1 et MyoD Diminution
modre Aucune diffrence dans le dveloppement de la langue Double
mutant Diminution importante des cellules Lbx1 et MyoD Un fragment
du muscle intrinsque et une langue petite
Page 36
La rduction modre des cellules Lbx1, aux tapes dvloppementales
prliminaires a t plus tard compense et na pas affect la taille
finale de la langue (CXCR4-/-) La rduction importante du nombre de
cellules Lbx1 a affect le dveloppement du muscle de la langue Les
mcanismes compensateurs fonctionnent seulement pour un seuil de
cellule Lbx1 atteint
Page 37
Discussion La protine CXCR4 est prsente aprs dlamination du
dermomyotome et elles sont observ une fois que les cellules ont
atteint le membre antrieur Expression de CXCR4 est observ aprs
lexpression de Pax3 et de Lbx1
Page 38
Souris mutant Lbx1 pas expression de CXCR4 au niveau des
membres Lbx1 pourrait participe au contrle dexpression de CXCR4
CXCR4 est exclusivement exprim dans les cellules nexprimant pas
MyoD CXCR4 est exprim pendant la migration cellulaire
Page 39
Lapplication ectopique de SDF1 dmontr que les cellules Pax3+ et
de CXCR4+ migrent vers la source de SDF1 (redistribution de CXCR4 +
importante que Pax3) Mutation de CXCR4 montre un changement de la
distribution des cellules avec une de Lbx1 dans le membre distal
alors que dans le membre proximal, les cellules apoptotique sont +
importante (membre distal pas dtectable) Hyp: il faudrait plusieurs
facteurs simple pour guider la migration
Page 40
Souris simple mutante Gab1, le nombre de cellules prognitrices
des muscles est rduit / WT mais atteignent la 1er vote branchial et
le membre antrieur Souris double mutante, les cellules natteignent
pas la 1er vote bronchial Consquence: dficit grave du muscle de la
langue Souris simple mutante CXCR4, pas de changement reproductible
de la langue Simple mutant, la rduction est compense dans les tapes
suivantes
Page 41
Les mcanismes compensatoires pourraient prolonger la phase de
prolifration des cellules prognitrices aux tapes suivantes La
compensation est possible seulement pour un seuil de cellules
atteint Le nombre critique correspondrait environ la moiti du
nombre de cellules prognitrices des muscles prsent dans le membre
WT
Page 42
Les rcepteurs tyrosine kinase et chemokine sont des molcules
importante dans la migration des cellules et peuvent affecter la
mort cellulaire Les deux mutations affectent la distribution et la
survie des cellules prognitrices des muscles, avec un degr diffrent
On parle dinteraction gntique entre les deux ligne
Page 43
La signalisation de Gab1 et de CXCR4 contrle la polymrisation
dactine et lattachement la matrice La phosphorylation des tyrosines
sur Gab1 voie de signalisation qui rgulent la mobilit, la
prolifration et la survie des cellules Les rcepteurs chemokine
emploient la protine G pour transmettre des signaux Stimulation des
cascades de phosphorylation des tyrosines +
Page 44
Linteraction gntique que nous observons pour Gab1 et CXCR4
pourrait reflter le fait que les cascades de transduction de signal
utilis par ces molcules convergent sur des effecteurs identiques la
migration de contrle et la survie des cellules prognitrices de
muscles