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O

OH

COOH

TAB 50ème volée

Travail de diplôme Avril 2010

Développement et création d’une méthode permettant une interprétation

plus précise des résultats de THC et THCCOOH

Travail réalisé au Centre Universitaire Romand de Médecine Légal (CURML) Unité de toxicologie et chimie forensiques (UTCF) Par Mary-Claire MEYER Sous la supervision de Vincent VARLET et Catherine MEYLAN

Travail de diplôme – avril 2011 ii

Sommaire

En suisse, la conduite sous influence du cannabis est illégale et sanctionnée. D’une simple amende au retrait de permis d’une durée indéterminée, les pénalités varient selon les cas. En outre, le conducteur dont le permis a été retiré, doit prouver sa capacité à s’abstenir de toute consommation de cannabis pour une durée de trois semaines. Afin de déterminer s’il y a dépendance ou non, trois prélèvements d’urine sont effectués à une semaine d’intervalle chacun. Actuellement, afin de décider s’il y a eu consommation ou non, le THCCOOH, métabolite du THC le plus abondant dans l’urine, est extrait puis dosé par GC-MS. La durée d’excrétion de ce métabolite n’étant pas égale chez chaque individu, il est difficile, dans certains cas, de se prononcer sur une éventuelle consommation durant la période préposée d’abstinence. Le travail suivant consiste à la mise au point d’une méthode permettant la quantification dans les urines du protocole des trois semaines (urines UMPT), en plus du THCCOOH, le THC et un autre métabolite, le 11-OH-THC. Ceci afin d’obtenir une réponse plus claire sur la consommation ou l’abstinence de l’individu concerné. La méthode consiste en une hydrolyse enzymatique avec une β-glucuronidase suivie d’une hydrolyse basique, d’une extraction liquide/liquide avec du chlorobutane puis d’une dérivatisation avec MSTFA et finalement un dosage par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse. Le taux de créatinine urinaire est également quantifié avec un automate (Dimension) sur un principe immunologique. Les concentrations du THC et de ses métabolites sont normalisées en les divisant par le taux de créatinine urinaire mesuré. Du faite que le THC ainsi que ces deux métabolites soient principalement excrétés sous forme conjugués à un glucuronide (sucre), l’hydrolyse est une partie essentielle de la préparation de l’échantillon et c’est pourquoi deux β-glucuronidases d’origine différente (E.coli et H.pomatia) ont été testées et comparées. Finalement, la méthode a été validée puis des échantillons provenant du protocole des trois semaines (urines UMPT) ont été encore dosées afin de vérifier cette méthode.

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Abstract

In Switzerland, driving under cannabis influence is illegal and punished. A simple fine, or the driving license revocation for a indeterminate period, penalties change according to the cases. Besides, the driver who was removed of his licence, has to prove his capacity to refrain from any consumption of cannabis for three weeks. To determine if there is dependance or not, three urine samples are obtained from the driver, in one interval week each. Presently, to decide if there was consumption or not, THCCOOH, metabolite of THC the most found in the urine is extracted and measured by GCMS. The excretion of this metabolite isn’t similar for everybody, for some cases, it’s difficult to say about a possible consumption during the abstinence period. The following work consists to developpe a method allowing to quantify in the three weeks protocol’s urines, besides THCCOOH, THC and another metabolite, 11-OH-THC. This in order to obtain a clearer answer on the consumption or the abstinence of the concerned person. This method includes enzymatic hydrolysis with a β-glucuronidases, base hydrolysis, liquid/liquid extraction with chlorobutane, derivatization with MSTFA an finally a GCMS quantification. Concentration of urine creatinine is also quantified using automated clinical analyzer (Dimension) on an immunological principe. Creatinine-normalized THC and metabolites concentration are obtained by dividing THC and metabolites concentrations by the creatinine concentration. Because of THC and metabolite are mainly excreted, with glucuronide conjugate, hydrolysis is an essentiel part of sample preparation and this is why two different sources ß-glucuronidases (E.coli and H.pomatia) were tested and compared. Finally, the method was validated and samples resulting from the three weeks protocol (urine UMPT) were quantified to verify that method.

Travail de diplôme – avril 2011 iv

Table des matières Sommaire .................................................................................................................. ii Abstract......................................................................................................................iii Table des matières ................................................................................................... iv Développement et création d’une méthode permettant une interprétation plus

précise des résultats de THC et THCCOOH ..................................................... 1 1. Introduction ........................................................................................................ 1

1.1. Le cannabis ......................................................................................................................... 1 1.1.1. Généralités................................................................................................................. 1 1.1.2. Historique ................................................................................................................... 1 1.1.3. La convention unique sur les stupéfiants de 1961 ..................................................... 1 1.1.4. Statistiques................................................................................................................. 1 1.1.5. Les cannabinoïdes ..................................................................................................... 2 1.1.6. Effets recherchés et modes d’utilisation..................................................................... 2 1.1.7. Activité pharmacologique ........................................................................................... 3 1.1.8. Pharmacocinétique .................................................................................................... 3 1.1.9. Pharmacodynamique ................................................................................................. 6 1.1.10. Effets physiologiques ................................................................................................. 6 1.1.11. Dépendance et tolérance ........................................................................................... 6

1.2. Cannabis et la conduite....................................................................................................... 7 1.2.1. Généralités................................................................................................................. 7 1.2.2. Loi en Suisse.............................................................................................................. 7 1.2.3. Statistiques................................................................................................................. 8 1.2.4. Processus du contrôle................................................................................................ 8 1.2.5. Expertise des trois jours............................................................................................. 9 1.2.6. Différents modèles d’interprétation ............................................................................ 9 1.2.7. Méthode utilisée actuellement au laboratoire............................................................. 9 1.2.8. Proposition de dosage d’autres cannabinoïdes dans l’urine.................................... 10

2. Buts du travail .................................................................................................. 10 2.1. Méthode utilisée actuellement au laboratoire.................................................................... 10

3. Matériel ............................................................................................................ 10 3.1. Matériel biologique ............................................................................................................ 10

3.1.1. Urines....................................................................................................................... 10 3.1.2. Urines de l’UMPT ..................................................................................................... 10 3.1.3. Choix des contrôles de qualité internes (CQi).......................................................... 11

3.2. Instruments, matériel, solutions et réactifs ........................................................................ 11 3.2.1. Instruments .............................................................................................................. 11 3.2.2. Matériel de laboratoire ............................................................................................. 12 3.2.3. Solutions et réactifs.................................................................................................. 13

4. Méthode........................................................................................................... 16 4.1. Méthode initiale ................................................................................................................. 16 4.2. Essais de la méthode ........................................................................................................ 17

4.2.1. Test n°1.................................................................................................................... 17 4.2.2. Test n°2.................................................................................................................... 19 4.2.3. Test n°3.................................................................................................................... 20 4.2.4. Résolution des problèmes........................................................................................ 20 4.2.5. Conclusion ............................................................................................................... 21

4.3. Préparation des échantillons ............................................................................................. 21 4.3.1. Standard interne....................................................................................................... 21 4.3.2. Droite de calibration ................................................................................................. 21 4.3.3. Echantillons.............................................................................................................. 22 4.3.4. Extraction liquide/liquide .......................................................................................... 22

4.4. Marche à suivre................................................................................................................. 23 4.5. La chromatographie gazeuse et la spectrométrie de masse : aspects généraux ............. 24

Travail de diplôme – avril 2011 v

4.5.1. Principe d’analyse d’un échantillon contenant du THC, THCCOOH (et 11-OH-THC) par GCMS ................................................................................................................ 25

4.6. Utilisation du GCMS .......................................................................................................... 26 4.6.1. Nettoyage et préparation de l’appareil ..................................................................... 26 4.6.2. Autotune et injection du mélange............................................................................. 26 4.6.3. Séquence d’injection ................................................................................................ 26

4.7. Traitement des résultats.................................................................................................... 27 4.8. Droite standard.................................................................................................................. 28 4.9. Calcul des résultats des CQi et des échantillons .............................................................. 29

5. Validation ......................................................................................................... 29 5.1. But ..................................................................................................................................... 29 5.2. Processus de validation .................................................................................................... 29 5.3. Les critères de validations selon l’ICH............................................................................... 29 5.4. Traitement des résultats selon les critères de validations de l’ICH ................................... 31

5.4.1. THC.......................................................................................................................... 31 5.4.2. THCCOOH............................................................................................................... 38

5.5. Compte-rendu de la validation .......................................................................................... 47 5.5.1. THC.......................................................................................................................... 47 5.5.2. THCCOOH............................................................................................................... 47

6. Dosages sur les échantillons UMPT sélectionnés et comparaison des résultats47 6.1. Comparaison entre les concentrations de THCCOOH urinaires normalisées obtenues

avec la méthode de la routine dosage de THCCOOH dans l’urine et la nouvelle méthode48 6.2. Interprétation selon modèle II de Huestis.......................................................................... 48 6.3. Interprétation en comparant les résultats du THC et THCCOOH et le modèle selon

Huestis .............................................................................................................................. 48 6.3.1. Interprétations des résultats..................................................................................... 51

7. Discussion ....................................................................................................... 57 7.1. Développement et validation ............................................................................................. 57

7.1.1. Résumé du but......................................................................................................... 57 7.1.2. Discussion................................................................................................................ 57

7.2. Analyse de 150 échantillons d’urine UMPT....................................................................... 58 7.2.1. Résumé du but......................................................................................................... 58 7.2.2. Discussion................................................................................................................ 58

7.3. Interprétation des résultats avec la nouvelle méthode ...................................................... 59 7.3.1. Résumé du but......................................................................................................... 59 7.3.2. Discussion................................................................................................................ 59

8. Conclusion ....................................................................................................... 59 8.1.1. Remarques et conclusion personnelle ..................................................................... 60

9. Références bibliographiques ........................................................................... 61 10. Annexes........................................................................................................... 64 11. Lexique ............................................................................................................ 64

11.1. Termes spéciaux ............................................................................................................... 64 11.2. Abréviations....................................................................................................................... 65

Travail de diplôme – TAB 50ème volée Mary-Claire Meyer

Travail de diplôme – avril 2011 1

Développement et création d’une méthode permettant une interprétation plus précise des

résultats de THC et THCCOOH 1. Introduction

1.1. Le cannabis

1.1.1. Généralités Marijuana, haschich, beuh, shit, chanvre, etc sont tous des termes désignant des produits provenant du cannabis. Le cannabis est issu d’une plante – le cannabis sativa – originaire d’Asie centrale. Actuellement, l’intérêt porté à ce végétal réside surtout sur les effets psychotropes qu’induisent certains de ses composants, comme le THC (delta-9-tétrahydrocannabinol). Ces substances contenues dans la plante appartiennent au groupe des cannabinoïdes. [4, 13]

1.1.2. Historique Le cannabis est utilisé par l’homme depuis des millénaires. En Extrême et Moyen-Orient, le chanvre était cultivé pour ses fibres destinées à la fabrication de cordages, papier et tissus. Sa résine était utilisée comme médicament pour soulager les spasmes, troubles du sommeil et les douleurs. C’est au début du XIXème siècle que le cannabis a été introduit en Europe par les soldats de Bonaparte et des médecins anglais, de retour des Indes, qui lui prêtaient des vertus thérapeutiques. Depuis, la culture du cannabis s’est répandue sous toutes les latitudes et l’intérêt porté à cette plante s’est modifié. En effet, ce n’est plus pour sa fibre que le chanvre cultivé mais ses propriétés psychotropes. Pour cette raison, son utilisation a été peu à peu interdite ou fortement réglementée au cours du XXème siècle. En Suisse, le cannabis est considéré comme une drogue et sa consommation est punie par la loi. Elle reste néanmoins la drogue la plus consommée en Suisse comme dans le reste du monde. [1, 4, 9]

1.1.3. La convention unique sur les stupéfiants de 1961 Le cannabis fait partie des stupéfiants listés dans la Convention unique sur les stupéfiants de 1961. Cette convention est dite unique parce qu’elle remplace plusieurs conventions internationales. Son objectif est de limiter la production et le commerce de substances interdites en établissant une liste de ces substances, qualifiées de stupéfiants. La convention unique sur les stupéfiants a été convoquée par l’ONU et fut ratifiée le 30 mars 1961 à New York. Elle est entrée en vigueur en 1964, puis modifiée par le protocole du 25 mars 1972. [14]

1.1.4. Statistiques En Suisse, le cannabis est la substance illégale la plus fréquemment consommée selon l’OFS (office suisse des statistiques). Sa consommation a nettement



augmenté au cours des années 90 et touche surtout les jeunes entre 15 et 24 ans. Depuis 2002, elle est restée stable. Lors de l’enquête suisse sur la santé en 2002, 20% des 15 – 64 ans ont indiqué avoir déjà consommé une fois dans leur vie des produits du cannabis, ce qui équivaut à 950 000 personnes. Durant cette même année 225 000 personnes entre 15 et 64 ans, soit 5% de la population suisse, ont consommé des produits du cannabis, la moitié d’entre eux consomme une fois par semaine ou plus. [15]

1.1.5. Les cannabinoïdes Les cannabinoïdes sont les composants chimiques du cannabis. A ce jour, une soixantaine de cannabinoïdes qui ont été identifiés. L’acide cannabigérolique serait à la base de la biosynthèse des cannabinoïdes dans la plante. Suite à des biotransformations successives, la plante va produire différents cannabinoïdes, dont l’acide tétrahydrocannabinolique (THCA-A), précurseur direct du THC (delta-9-tétrahydrocannabinol). [13] Isolé en 1964, le THC est le cannabinoïde le plus important, il peut représenter jusqu’à 90% des cannabinoïdes présents dans la plante. On le trouve surtout dans la résine, les feuilles, la tige et les sommités fleuries. Cette substance chimique est à l’origine des propriétés psychotropes du cannabis. Le cannabidiol (CBD) est un autre cannabinoïde ayant des effets sédatifs, analgésiques et antibiotiques. Son interaction avec le THC potentialise ses effets dépresseurs et limite les effets euphoriques, tout en allongeant la durée d’action des effets psychoactifs. [6, 10]

1.1.6. Effets recherchés et modes d’utilisation La consommation du cannabis en tant que drogue s’effectue sous différentes formes. La plus courante étant l’inhalation en fumant les feuilles et sommités fleuries séchées (marijuana), la résine (haschich ou shit) ou sous sa forme huileuse (extraction de l’huile à partir de la résine à l’aide d’alcool) mélangée avec du tabac. Il s’agit de la voie d’action la plus rapide. La résine peut également être préparée avec des aliments. [1-2, 4] Le THC et les autres cannabinoïdes peuvent être aussi inhalés sous forme de vapeur en chauffant légèrement la plante à une température précise. En effet, c’est lors de la pyrolyse se déroulant en fumant un joint ou lorsque la substance est chauffée, que les précurseurs du THC vont se transformer et devenir une substance psychoactive. Notons que dans la plante, ce sont d’autres biotransformations régulées par des gènes spécifiques qui aboutiront à la formation de THC. [4, 13] Les cannabinoïdes n’étant pas solubles dans l’eau, ils ne peuvent être injectés dans le sang. [3] L’usage médical du cannabis est autorisé dans certains pays. Les médicaments à base de cannabis sont surtout administrés chez des personnes sous traitements lourds ; chimiothérapie ou trithérapie par exemple, afin de réduire les effets secondaires, comme les vomissements, la perte d’appétit ou les douleurs. Ils le sont aussi chez les patients atteints de maladies incurables, auto-immunes, dégénératives et inflammatoires ; sclérose en plaques, maladie d’Alzheimer, syndrome de la Tourette, etc. Le cannabis peut réduire les spasmes,



les troubles du mouvement, il peut aussi avoir un effet anti-asthmatique. [1,5-6, 11]

1.1.7. Activité pharmacologique Les composants pharmacologiquement actifs dans le Cannabis sont le THC, le CBN et le CBD. Le THC étant le composé responsable de la quasi-totalité de l’activité pharmacologique et psychoactive du Cannabis sativa. CBN et CBD sont présents en plus petite quantité et ne provoquent pas d’effet psychoactif. [3, 6]

1.1.8. Pharmacocinétique Après l’inhalation de la fumée du cannabis, la courbe de concentration du THC dans le plasma comprends trois phases : une phase d’absorption rapide avec une demi-vie de 50 secondes, une phase plus lente de distribution dans les tissus avec une demi-vie de 40 à 80 minutes, et une phase beaucoup plus lente d’élimination par le métabolisme, avec une demi-vie qui varie entre deux ou trois jours. [9]

Absorption Après inhalation THC est déjà détectable dans le plasma quelques minutes après la première bouffée et le pic plasmatique apparaît après 7-8 minutes, les concentrations plasmatiques sont alors de l’ordre de 8 à 10 ng/ml pour une consommation isolée et de 50 à 200 ng/ml chez un utilisateur régulier. Par ce mode de consommation seuls 15 à 50% du THC de la cigarette est absorbé et atteint la circulation systémique. Cet écart s’explique en grande partie par les différences dans la façon d’inhaler la fumée, soit la quantité de fumée inhalée, la profondeur de l’inhalation dans les poumons et la durée de rétention de la fumée dans les alvéoles. [3, 9,14] Lors de consommation par ingestion, l’absorption est plus lente et irrégulière ; le pic de concentration plasmatique en THC est de l’ordre de 6 ng/ml et est atteint 1 à 3 heures après la consommation, cette différence est due au métabolisme du foie qui présente des variations entre les individus. Aussi, l’absorption est fortement accélérée si le THC a été ingéré avec un aliment gras, dans ce cas elle est quasi complète.

Distribution Le THC inhalé pénètre profondément dans les poumons et traverse les membranes alvéolaires rapidement pour aller dans le sang par les capillaires pulmonaires. Une fois dans le compartiment vasculaire, le THC se lie quasi complètement aux protéines plasmatiques, en majorité aux lipoprotéines (60%), à l’albumine et aux globules rouges (10%). Seuls 3% de THC libre se retrouve dans le sang. Très lipophile, le THC quitte rapidement le secteur vasculaire pour aller se fixer dans le cerveau et les autres tissus de l’organisme riches en lipides. Cette forte lipophilie se traduit par un large volume de distribution dans l’organisme ; 4 à 14 l/kg pour le THC. Le THC accumulé dans les tissus graisseux sera redistribué dans les autres compartiments au cours du temps. La formation d’acides gras stables conjugués au THC ou à ses métabolites, dans les tissus graisseux, a aussi été rapportée, d’où une demi-vie d’élimination du THC et de ses métabolites très variable entre les individus. 20% de la quantité fixée dans les tissus possède une demi-vie d’environ 2 à 3 mois. [3, 7-8, 16]



Métabolisation La métabolisation des cannabinoïdes est très complexe. Le THC est principalement métabolisé dans le foie par les enzymes du cytochrome P450. Etant donné que chaque individu possède un profil d’isoenzymes du cytochrome P450 différent, des variations intra-individuelles dans la métabolisation du THC sont observées. Tout d’abord, le cytochrome P 2C9 catalyse la formation du 11-OH-THC, un métabolite actif dont la demi-vie est brève et qui sera plus tard oxydé et transformé en un métabolite inactif, le THCCOOH. La dernière partie de la métabolisation, avant l’excrétion urinaire, est l’addition d’un acide glucuronique sur le C11 du groupement carboxyl du métabolite. Sur les 100 métabolites du THC identifiés, les principaux sont le 11-OH-THC et le THCCOOH. [3, 6-8, 14]

Excrétion L’élimination complète d’une simple dose de cannabis peut prendre jusqu’à 5 semaines. Environ 70% de la dose initiale de THC est excrétée en 72h ; 30% par l’urine et 40% par les fèces. Seules des petites quantités de THC sont éliminées dans les urines, probablement à cause d’une réabsorption tubulaire. Le métabolite dominant dans l’urine est le THCCOOH-glucuronide avec 50% d’excrétion le premier jour après administration. Sa présence dans l’urine plusieurs semaines après la dernière prise de cannabis est due à la redistribution du THC et THCCOOH par les tissus gras, ce qui confère à ces substances une demi-vie d’élimination de 1 à 3 jours, selon la personne. [7-8]



Figure 1 : Métabolisme des cannabinoïdes



1.1.9. Pharmacodynamique Les mécanismes de la pharmacodynamique des cannabinoïdesne sont pas encore tous bien connus. Deux récepteurs aux cannabinoïdes on été identifiés ; CB1 et CB2. CB1 corrèle les effets psychoactifs du cannabis. Il est hautement exprimé à la surface des neurones, dans le cerveau, les cordes spinales et le système nerveux périphérique. Par ces emplacements, le système des cannabinoïdes affecte le contrôle du système moteur, le processus de mémorisation et la modulation de la douleur. CB2 est présent à la surface des globules blancs, des lymphocytes B et T. Par cette localisation, les agonistes du récepteurs CB2 ont fait l’objet de plusieurs recherches dans le cadre de l’utilisation des cannabinoïdes dans un but thérapeutique, à cause de ses actions analgésiques et anti-inflammatoires. Après la découverte des récepteurs cannabinoïdes, apparaît la découverte des ligands endogènes comme l’anandamide, petit acide gras produit par le cerveau qui se lie au récepteur CB1 et induit la plupart des actions du cannabis puis plus tard, un autre lipide est isolé, le 2-arachidonoyglycérol (2-AG). Ces deux composés sont les principaux endocannabinoïdes. Le cannabis ressemble suffisamment aux endocannabinoïdes pour activer leurs récepteurs. [3, 6, 9-10]

1.1.10. Effets physiologiques Les effets varient en intensité et en durée selon le mode de consommation, la teneur du produit en THC ainsi que selon l’état physique et psychique du consommateur. Ces effets peuvent durer entre quelques minutes (inhalation) et quelques heures (ingestion). Ci-dessous certains effets favorables et défavorables engendrés par la consommation de cannabis:

• Humeur : bien-être, euphorie, sentiment d’apaisement. Paranoïa, psychose, angoisse très forte, étouffement, dépression.

• Perceptions : couleurs plus brillantes, musiques plus vives, émotions plus intenses, hallucinations possibles.

• Effets cognitifs et psychomoteurs : temps de coordination ralenti, mauvaise coordination, perte de la mémoire à court terme, difficulté à se concentrer, somnolence, tremblements et vomissements.

• Effets systémiques : tachycardie, vasodilatation, bronchiodilatation, chute de la température corporelle.

• Tractus gastro-intestinal : hyposalivation, ralentissement de la mobilité gastro- intestinale.

• Œil : sécheresse et rougeur de la conjonctive, mydriase. • Autres : Effets immunosuppresseurs, risque de malformation et mauvais

développement fœtal, retard de croissance. [1, 3, 5-6, 9-10, 15]

1.1.11. Dépendance et tolérance La dépendance au cannabis n’est pas égale selon les individus. Plusieurs facteurs entrent en jeu. Certains consommateurs réguliers, en raison de leurs habitudes, de leur personnalité, de leur histoire personnelle, de leur environnement, auront



plus de mal que d'autres à diminuer ou arrêter leur consommation, et sont donc plus vulnérables à la dépendance. Il n’y a généralement pas de dépendance physique, le sevrage pouvant, dans certains cas, s’accompagner d’anxiété, d’irritabilité avec agitation, d’anorexie, d’insomnie, voire de tremblements et de sueurs. Il s’agit surtout d’une dépendance psychique avec possibilité de consommation quotidienne de quantités importantes. Ce serait plutôt la fréquence des prises que leur quantité qui augmente, ce qui implique l’existence d’un certain degré de tolérance. En effet, des études expérimentales menées sur des animaux ont mis en évidence le développement d’une tolérance aux cannabinoïdes pour la plupart des effets observés. Chez l’homme le développement de tolérance a aussi était observé, mais son mécanisme n’est pas bien connu. Suite à plusieurs observations, il a été démontré que lors de consommation régulière de cannabis, le nombre de récepteurs CB1 présents à la surface des cellules nerveuses diminue, avec pour conséquence une augmentation de la dose pour l’obtention du même résultat. [1-2, 5, 10, 13]

1.2. Cannabis et la conduite

1.2.1. Généralités Endormissement, modification de la perception, de l’espace et du temps, diminution des capacités de mémoire immédiate et de concentration, réduction de la vivacité d’esprit, perturbations sensorielles, etc. Certains effets liés à la consommation de cannabis sont incompatibles avec les performances requises pour la conduite. Parmi les risques encourus suite à la consommation de cannabis, figurent les risques routiers. Dans ce cas, la consommation du produit peut affecter non seulement l’individu lui-même mais également les autres usagers de la route. C’est pourquoi des règles ont été définies afin de sanctionner et réduire la conduite sous emprise de cannabis ou autre(s) psychotrope(s). [1, 9, 13]

1.2.2. Loi en Suisse La loi Suisse est basée sur la Convention unique sur les stupéfiants de 1961. Conduire sous l’emprise de stupéfiant est toujours interdit en Suisse. Dans tous les cas de figure, un conducteur est évalué inapte à conduire si l’on décèle du THC dans son sang (même sans preuve d’une réelle altération à la conduite). Passible de poursuites judiciaires, l’individu peut être puni d’une peine privative de liberté allant jusqu’à trois ans ou d’une amende (art. 91, al. 2, LCR), avec un retrait de permis durant au moins un mois. Selon article 31 alinéa 2 du LCR (loi sur la circulation routière), loi en vigueur depuis le 1er février 1991.

« Toute personne qui n’a pas les capacités physiques et psychiques nécessaires pour conduire un véhicule parce qu’elle est sous l’influence de l’alcool, de stupéfiants, de médicaments ou pour d’autres raisons, est réputée incapable de conduire pendant cette période et doit s’en abstenir ».



Selon l’article 2 alinéa 1 du OCR (ordonnance sur les règles de la circulation routière), loi en vigueur depuis le 1er janvier 1980. « Est tenu de s’abstenir de conduire quiconque n’en est pas capable parce qu’il est surmené, sous l’effet de l’alcool, d’un médicament, d’un stupéfiant ou pour toute autre raison ».

1.2.3. Statistiques La fréquence de consommation du cannabis augmente. Parallèlement le nombre de personnes conduisant un véhicule à moteur sous l’emprise du cannabis a également augmenté selon l’OFSP. D’après les chiffres publiés par l’institut de médecine légale de Zürich, le nombre de personnes sanctionnées pour cause de conduite sous l’emprise de drogues et/ou de médicaments a quasi quadruplé entre 2003 et 2006. La proportion de tests urinaires et sanguins positifs au cannabis est restée stable et représente environ 50% des tests de dépistage de drogue positifs. En revanche, le nombre d’accidents survenus sous l’influence du cannabis a triplé, il est passé de 63 à 185 accidents. Il a aussi été constaté que de plus en plus de personnes consomment du cannabis peu avant de prendre le volant, voir en conduisant. En 2001, c’était le cas de 64% des personnes dont le test sanguin de dépistage THC était positif.

1.2.4. Processus du contrôle La police effectue des contrôles par sondages. Lorsqu’il existe des indices laissant supposer que le conducteur a consommé de l’alcool ou d’autres substances illicites, tel que le cannabis, et serait dans ce cas jugé incapable de conduire, la police est en droit de procéder à un test préliminaire permettant de détecter la présence d’alcool (alcootest) ou la présence de stupéfiants/médicaments, notamment dans les urines, la salive ou la sueur. [Réf : art. 55 al. 2 du LCR du 19 décembre 1958 et Art. 9 de l’OCCR (l’ordonnance sur le contrôle de la circulation routière) du 13 février 1962] Si le test préliminaire révèle la présence de drogue(s) ou s’il existe des indices permettant de croire qu’une personne est incapable de conduire suite à une consommation autre que l’alcool, la police procède à un prélèvement urinaire et sanguin. [Réf : art. 16 de l’OCCR] Finalement, lorsque ces prélèvements contiennent une (des) substance(s) autre(s) que l’alcool, les résultats de l’analyse sont soumis à l’appréciation d’experts reconnus. En outre la police est autorisée à retirer le permis du conducteur ayant consommé des stupéfiants, sur-le-champ et de dénoncer le conducteur en infraction SAN (service des automobiles et de la navigation). [Réf : art 31 OCCR] Lorsqu’il y a présomption d’inaptitude pour raison médicale, psychologique ou psychiatrique, l’UMPT (unité de médecine et psychologie du trafic qui est spécialisée dans l’évaluation de l’aptitude à la conduite des véhicules automobiles) est mandatée pour une expertise. En fonction du mandat, différentes investigations sont menées et en cas d’inaptitude confirmée, les experts proposent les conditions que l’usager doit remplir avant de pouvoir être remis au bénéfice du droit de conduire. [12]



1.2.5. Expertise des trois jours Les conducteurs dénoncés par la police pour consommation de stupéfiant(s), sont soumis à une première évaluation. Un contrôle d’urine durant trois lundis de suite. Ce test vise à évaluer si le conducteur est apte ou non à stopper sa consommation. La semaine précédant et durant le test, le conducteur doit s’abstenir de toute consommation de drogue, dont le cannabis. Pendant le protocole, trois échantillons d’urine sont prélevés aux jours 0, 7 et 14 (U1, U2 et U3). La créatinine, le pH et les oxydants sont mesurés et une détection des différentes drogues, dont le cannabis, est effectuée à l’aide d’un automate (Dimension®) qui offre une réponse de type qualitative grâce à une réaction immunologique. Si la présence de drogue(s) n’est pas détectée dans les trois échantillons, il est conclu que le conducteur ne présente pas d’addiction. Dans ce cas, le protocole s’arrête. Au contraire, si les résultats des tests sont positifs, il y a alors expertise médicale visant à évaluer le niveau de dépendance et la capacité à la conduite. Etant donné que chaque individu continue à excréter de façon différente du THCCOOH plusieurs jours après le début de l’abstinence, son temps de demi-vie étant de 1 à 3 jours, l’identification d’une nouvelle consommation de cannabis n’est pas simple. La présence de THCCOOH dans les échantillons 2 et 3 (jours 7 et 14) n’est pas suffisante pour conclure à une nouvelle consommation pendant le protocole. Pour cette raison, la présence de THCCOOH dans l’urine est confirmée par dosage par GCMS et les concentrations obtenues, normalisées au taux de créatinine, aux jours 0, 7 et 14 sont comparées. [l’article]

1.2.6. Différents modèles d’interprétation Différents modèles de comparaison et d’interprétation des résultats sont proposés :

• Modèle I (Manno [19]) : une nouvelle consommation est indiquée lorsque U2(3)/U1(2) > 1.5

• Modèle II (Huestis [20]) : une nouvelle consommation est indiquée lorsque U2(3)/U1(2) > 0.5 et que la quantité de THCCOOH est ≥ 14 ng/ml

• Modèle III (demi-vie de quatre jours, Westin [21]) : une nouvelle consommation est indiquée par t½ THCCOOH > 4 jours.

• Modèle IVa (Smith and Huestis [22]) : une nouvelle consommation est indiquée par U1(2)/U2(3) dépendant d’un intervalle de temps (valeurs maximum, en tenant compte de la concentration en THCCOOH ≥ 6ng/ml

• Modèle IVb (Smith and Huestis [22]) : une nouvelle consommation est indiquée par U2(3)/U1(2) dépendant de l’intervalle de temps (95%) en tenant compte de la concentration en THCCOOH ≥ 6ng/ml

1.2.7. Méthode utilisée actuellement au laboratoire Actuellement, la méthode utilisée dans le laboratoire permet de doser que le métabolite le plus abondant dans l’urine, soit le THCCOOH. Une autre méthode dose simultanément le THC, le 11-OH-THC et le THCCOOH, mais dans le sang et elle est délicate.



La méthode de dosage du THCCOOH urinaire utilisée en routine débute par une hydrolyse enzymatique, suivie d’une extraction liquide/liquide en milieu acide, puis d’une dérivatisation. Le dosage se fait aussi sur GCMS. (Annexe 13) Son domaine d’application se situe entre 5 et 100 ng/ml.

1.2.8. Proposition de dosage d’autres cannabinoïdes dans l’urine Le dosage d’autres cannabinoïdes avec une demi-vie plus courte comme le THC et le 11-OH-THC a été proposé comme nouveaux marqueurs d’une consommation récente de cannabis, afin d’améliorer l’interprétation dans l’expertise des trois jours. Cette nouvelle méthode viserait à remplacer ou compléter la méthode utilisée en routine.

2. Buts du travail • Développer et valider une méthode analytique, selon un article, permettant le

dosage simultané du THC, THCCOOH et 11-OH-THC dans l’urine afin de pouvoir interpréter de façon plus précise les résultats des dosages des urines UMPT et pourvoir utiliser cette nouvelle méthode en routine à la place de l’actuelle qui ne dose que le THCCOOH. Ce développement inclut une comparaison de l’activité enzymatique de deux enzymes.

• Analyser entre 100 et 300 échantillons d’urines UMPT avec cette nouvelle méthode afin de s’assurer du bon fonctionnement de celle-ci en comparant les résultats obtenus avec les deux méthodes.

• S’assurer que les résultats obtenus sur les échantillons UMPT permettent une meilleure interprétation d’une consommation récente de cannabis.

2.1. Méthode utilisée actuellement au laboratoire

3. Matériel

3.1. Matériel biologique

3.1.1. Urines Les urines sélectionnées pour tester la méthode, lors de son développement, sont des échantillons récents, de la routine, dont on connaît les concentrations urinaires en THCCOOH, obtenues par GC-MS.

3.1.2. Urines de l’UMPT Les urines sélectionnées pour tester la méthode après son développement et sa validation sont les urines de l’UMPT. Elles proviennent du test des trois lundis, d’environ 100 individus, soit environ 300 échantillons (3 urines par patient). Ces échantillons ont été récoltés entre 2007 à 2010. Les concentrations urinaires en THCCOOH normalisées avec le taux de créatinine sont connues. Par contre les concentrations urinaires en THC sont inconnues, étant donné qu’aucune méthode ne dose actuellement le THC dans l’urine. A l’UMPT, les urines sont récoltées sous contrôle strict, afin d’éviter les adultérations, dans un flacon en plastique de 100 ml. Une fois acheminées au



laboratoire de toxicologie (UTCF) du CURML, 10 ml sont prélevés dans des monovettes et le tout est conservé au réfrigérateur, à 5°C, en attendant l’analyse. Puis vient le test d’orientation, afin de déterminer qualitativement si l’échantillon est positif ou non au cannabis ainsi qu’à d’autres xénobiotiques. Cette analyse permet aussi de contrôler le pH, la créatinine et les oxydants qui servent à vérifier la qualité de l’urine, si elle a est adultérée et/ou diluée. Si le résultat montre la présence de drogue ou médicament, l’échantillon sera systématiquement dosé par GC-MS, afin d’obtenir un résultat quantitatif précis. [11-12] Après analyse, les récipients de 100 ml sont jetés et les monovettes de 10 ml sont conservées dans la chambre froide à -21°C pendant 10 ans. Les urines conservées dans ces conditions sont normalement stables.

3.1.3. Choix des contrôles de qualité internes (CQi) Les CQ internes utilisés pour cette méthode sont les CQi employés pour plusieurs analyses urinaires, dont des dosages. Ces contrôles possèdent seulement une valeur de référence pour le THCCOOH, mais pas de valeur pour le THC ni pour le 11-OH-THC. Aussi le troisième point de la droite est dosé à double, faisant ainsi office de CQi. Un contrôle THCCOOH-glucuronide a été dans un premier temps utilisé afin de vérifier le bon fonctionnement des hydrolyses enzymatiques et basiques, mais les résultats n’étant pas satisfaisants, le THCCOOH-glucuronide n’étant pas stable, il a été jugé inutile, car. (voir chapitre 4. Méthode)

3.2. Instruments, matériel, solutions et réactifs

3.2.1. Instruments • Bain-marie avec agitation

Modèle : GFL 1083 Fabricant : GLF N° de série : 116394084 N° UTCF : IN 24 06

• Agitateur horizontal Modèle : SM 30 Control Fabricant : Edmund Bühler N° de série : inconnu N° UTCF : IN 25 54

• Centrifugeuse Modèle : MULTIFUGE 3s Fabricant : Heraeus



N° de série : 40307429 N° UTCF : IN 22 06

• Chromatographe en phase gazeuse et spectromètre de masse (GC-MS)

Modèle GC : 6890 Series GC System Modèle MS : 5973Network Mass Selective Detector Fabricant : Agilent N° de série : US 94906656 N° UTCF : IN 10 02 Type de colonne : DB-XLB, Durabond, longueur = 30 m, I.D = 0.250 mm et épaisseur du film = 0.25 µm.

• Etuve Modèle : Art. N°9010-0096 ED 115 Fabricant : BINDER N° de série : 06-96382 N° UTCF : IN 26 03

• Evaporateurs à azote chauffant Modèle : TurboVapLV Fabricant : Caliper LifeScience N° de série : TV0707N13581 N° UTCF : IN 23 03

• Vortex Modèle : VORTEX-GENIE 2 Fabricant : Scientific Industries N° de série : 2-140401 N° UTCF : IN 25 08

3.2.2. Matériel de laboratoire • Tubes en verre pyrex 10 ml avec bouchons et téflons

• Seringues Hamilton de 10, 50, 100, 250, 500, 1000 µl

• Micropipettes RAININ de 2000 µl avec embouts adaptés

• Multipipette 411 Socorex avec embouts adaptés

• Dispenser Socorex



• Pipette Pasteur en verre avec poire adaptée

• Transferpettor 20-100 l

• Microvials infocromia de 100 µl

• Microvial Agilent de 2 l

• Bouchons à sertir pour microvial

• Verrerie diverse

3.2.3. Solutions et réactifs • Standards (droite de calibration)

o Solution de THC à 1 µg/ml dans du méthanol

N° UTCF : ST28.1 Fait à partir de : Ampoule de 1ml de THC à 1 mg/ml

Fournisseur : Cerilliant N° lot : FE021710-01 N° UTF : aT28a

o Solution de THCCOOH à 1 µg/ml dans du méthanol N° UTCF : SC51.1 Fait à partir de : Ampoule de 1ml de THCCOOH à 1 mg/ml Fournisseur : Cerilliant N° lot : FE052109-05 N° UTCF : aC51qq

• Standards internes

o Solution de THC-D3, THCCOOH-D9 à 1 µg/ml dans du méthanol N° UTCF : SMEL37 Fait à partir de : Ampoule de 1ml de THC-D3 à 100 µg/ml Fournisseur : Cerilliant N° lot : FE090507-02 N° UTCF : aT30q

Ampoule de 1 ml de THCCOOH-D9 à 100 µg/ml Fournisseur : Cerilliant N° lot : FE093008-03 N° UTCF : aC59d

• Contrôles de qualité internes :

o Solutions de THCCOOH-glucuronidé à 10 et 75 ng/ml dans du méthanol N° UTCF : pas utilisé en routine Fait à partir de : Ampoule de 1 ml de THCCOOH-glucuronide à ????



Fournisseur : Cerilliant N° lot : N° UTCF :

o Liquichek Urine Toxicology Control Level C3 Fournisseur : BIORAD Lot : 68370 Exp : 30.09.11 Concentration en THCCOOH : 19.1 ng/ml

o Liquichek Urine Toxicology Control Level C4 Fournisseur : BIORAD Lot : 68760 Exp : 30.11.11 Concentration en THCCOOH : 145 ng/ml

• Urine négative (droite de calibration, blanc sans standard interne) : L’urine négative utilisée a été testée sur l’appareil Dimension® (test immunologique) afin de s’assurer de sa négativité. Il s’agit de ma propre urine. Sa péremption est de un mois après la miction. N°UTCF : U110120, U110216 et U110216

• Enzymes d’extraction : β-glucuronidase issue d’E.coli Fournisseur : ROCHE Lot : 11858726 Exp : 04.2012 N° UCTF : IG3 β-glucuronidase/Arylsulfatase issue de H.pomatia Fournisseur : ROCHE Lot : 70315221 Exp : 11.2011 N° UCTF : IG2

• Tampon phosphate 0.8M pH7 (utilisé avec β-glucuronidase issue de E.coli) N° UCTF : Pas utilisé en routine Recette : o 12.373 g de Na2HPO4 (heptahydrate) + 4.669 g de NaH2PO4 (monohydrate)

dissous dans 100ml d’eau distillée. Mesurer le pH. Na2HPO4 * 7H2O

Fournisseur : SIGMA-ALDRICH Lot : SZBA2460 N° UCTF : IIs17 NaH2PO4 * H2O

Fournisseur : SIGMA-ALDRICH Lot : 0001413031 N° UCTF : IIs18



• Tampon phosphate 1M pH4.7 (utilisé avec β-glucuronidase/Arylsulfatase issue de H.pomatia)

N° UCTF : Pas utilisé en routine Recette : o 0.182 g de Na2HPO4 (heptahydrate) + 13.71 g de NaH2PO4 (monohydrate)

dissous dans 100ml d’eau distillée. Mesurer le pH. Na2HPO4 * 7H2O

Fournisseur : SIGMA-ALDRICH Lot : SZBA2460 Pratique : N° UCTF : IIs17 NaH2PO4 * H2O

Fournisseur : SIGMA-ALDRICH Lot : 0001413031 N° UCTF : IIs18

• KOH 11,8 N N° UCTF : IVb3 Recette : o 165.3 g de KOH dissout dans 250 ml d’eau bidistillée

KOH Fournisseur : MERCK Lot : B0337933905 N° UCTF : IIH6

• Acide acétique glacial Fournisseur : FLUCKA Lot : SZB93300 N° UCTF : IIIA1b

• 1-Chlorobutane Fournisseur : SIGMA-ALDRICH Lot : 0001430474 N° UCTF : IC1a

• MSTFA (N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) Fournisseur : MACHEREY-NAGEL Lot : 1001-3 N° UCTF : RD20

• TBH (Tetrabutylsulfoxide) Fournisseur : SIGMA-ALDRICH Lot : N° UCTF : RD47

• DMSO (Dimethylsulfoxide)

Fournisseur : SIGMA-ALDRICH Lot : N° UCTF : ID8b



• Méthanol Fournisseur : SIGMA-ALDRICH Lot : BCBC8305V/BCBC8746V N° UCTF : IM1a

4. Méthode

4.1. Méthode initiale La méthode d’analyse comporte trois étapes : la préparation de l’échantillon comprenant les hydrolyses enzymatique et basique, l’extraction liquide/liquide et la dérivatisation. Puis l’analyse par GC-MS et finalement le traitement des résultats. Les différentes étapes de la préparation de l’échantillon vont permettre de purifier et concentrer l’analyte afin que l’analyse par GC-MS soit optimale. Initialement, deux méthodes ont été testées en parallèle, la seule différence entre les deux, est l’extraction enzymatique. Dans la première, la β-glucuronidase provient d’E.coli (annexe 1) alors que dans la seconde elle provient de H.pomatia (annexe 2). L’échantillon est ensuite analysé par GC-MS selon deux méthodes créées et programmées spécifiquement pour cette analyse. La première méthode, THCms (annexe 3), est une méthode en SCAN. Ce mode effectue un balayage de chaque ion afin d’identifier les substances recherchées soit le THC, le THCCOOH et le 11-OH-THC. La deuxième méthode, THCm (annexe 4), est une méthode en SIM. Ce mode est plus sensible car il analyse que les ions spécifiques aux substances d’intérêt, sélectionnés auparavant et le fait plusieurs fois. Les ions sélectionnés pour le dosage des différentes substances sont :

• THC : 386 – 371

• THC-D3 : 389 – 374

• THCCOOH : 371 – 473

• THCCOOH-D9 : 374 – 479

• 11-OH-THC : 459 – 371

• 11-OH-THC-D3 : 568 – 538 Tout d’abord trois ions par molécules ont été testés. Le premier ion est l’ion de base, soit l’ion le plus abondant. Le second est l’ion moléculaire, soit l’ion dont le poids moléculaire est proche, voir égale à la masse moléculaire de la substance d’intérêt. Le troisième était l’ion le plus abondant après l’ion de base et l’ion moléculaire. Au final, deux seuls ions par molécule ont été conservés, il s’agit des ions avec lesquelles les meilleurs résultats étaient obtenus soit le ion moléculaire et le ion de base. Une fois analysés, les échantillons sont traités informatiquement par un programme, la macro (annexe 5), qui est spécifique à cette analyse et qui peut être modifiée afin de permettre une lecture des résultats plus aisée. La macro va définir l’aire des pics obtenus pour chaque ion au temps de rétention spécifique des molécules d’intérêt. Les concentrations sont calculées



à l’aide de l’aire des pics qui sont comparés avec l’aire des pics correspondant aux différentes concentrations de la droite standard. La version finale de la méthode (méthode déterminée après les différents essais) est expliquée plus en détail à partir du point 4.3.

4.2. Essais de la méthode Avant de décider d’un protocole final, la méthode en son entier, différentes étapes de celle-ci et différents produits et réactifs ont été testés afin de connaître leur réelle efficacité. Pour chaque test, deux courbes standards ont été déterminées. Chaque ion possède sa propre courbe réalisée avec les résultats obtenus après les dosages des échantillons standards. C’est l’aire sous le pic correspondant à la substance qui sera pris en compte lors des calculs des résultats.

4.2.1. Test n°1 Buts :

Le premier essai avait pour but de déterminer quelle β-glucuronidase est la plus efficace pour l’extraction enzymatique. Par la même occasion, tester le bon fonctionnement de la méthode pour le dosage du THC, 11-OH-THC et THCCOOH ainsi que pour les différentes concentrations choisies pour la courbe standard.

Pratique : Deux méthodes similaires (annexes 1 et 2) ont ainsi été effectuées en parallèle avec chacune une enzyme β-glucuronidase d’origine différente et son tampon associé. Les enzymes sont deux β-glucuronidase ; la première provient d’E.coli et doit être utilisée avec un tampon phosphate 0.8M à pH7 (spectre pH d’activité de l’enzyme ; 6.8 – 7.2) et la seconde provient de H.pomatia et doit être utilisée avec un tampon phosphate 1M, pH4.7 (spectre pH d’activité de l’enzyme ; 4.5 – 5). Ces deux méthodes ont été testées sur 8 échantillons (MDV) dont un ordre de grandeur des concentrations urinaires en THCCOOH est connu (concentrations hors limite de linéarité, mais échantillons tous positifs) et les concentrations sanguines en THC, THCCOOH et 11-OH-THC sont aussi connues, afin de pouvoir comparer ces résultats avec ceux obtenus à l’aide de cette nouvelle méthode. Une courbe standard est aussi effectuée pour chaque substance à extraire. Deux CQi, dont la concentration en THCCOOH est définie (C3 ; 19.1 ng/ml de THCCOOH, C4 ; 145 ng/ml) et deux contrôles THCCOOH-glucuronide à 10 ng/ml et 75 ng/ml sont aussi extraits et dosés. Les deux protocoles ont été réalisés en parallèle et injectés à la suite. Les urines ne sont pas diluées et chaque échantillon est fait à simple, car le but à ce moment est de vérifier que la méthode fonctionne correctement. Les échantillons n’ont pas pu être injectés en temps voulu, à cause d’un problème analytique. Ils ont dû alors être congelés deux jours avant de pouvoir être injectés.



Synthèse des résultats (annexes 6 et 7) :

Les courbes standard du THC avec hydrolyse par la β-glucuronidase d’E.coli ont une bonne linéarité (0.999 et 0.998). Ce n’est pas le cas pour les courbes standard du THC extrait par la β-glucuronidase de H.pomatia (0.996 et 0.426). A ce stade, on peut penser que la β-glucuronidase de E.coli est plus efficace pour l’hydrolyse du THC que la β-glucuronidase de H.pomatia. Toutes les courbes standard obtenues après hydrolyse par les deux enzymes et dosage du THCCOOH ont une bonne linéarité. 0.997 et 0.998 après hydrolyse par l’enzyme de E.coli et 0.999, pour les deux courbes du THCCOOH avec hydrolyse par l’enzyme de H.pomatia Les enzymes sont donc toutes deux efficaces pour l’extraction du THCCOOH. Par contre les courbes du 11-HO-THC sont toutes ininterprétables donc inexploitables. Le 11-OH-THC se métabolise rapidement en THCCOOH, ce qui expliquerait le faite qu’il soit si peu détecté. Les valeurs obtenues après extraction et dosage des contrôles THCCOOH-glucuronide à 10 ng/ml et 75 ng/ml sont diminuées. Ce contrôle reflète la qualité des hydrolyses enzymatiques et basiques. L’hypothèse d’un manque d’efficacité est peu probable car l’hydrolyse basique qui suit l’hydrolyse enzymatique est très puissante et devrait casser les dernières liaisons entre la molécule et le glucuronide. Le problème vient du fait qu’une fois l’ampoule de THCCOOH-glucuronide est ouverte, la molécule s’hydrolyse. Les concentrations en THCCOOH dosées pour les échantillons sont toutes, comme pour les CQi, le double de celles attendues. Etant donné qu’il s’agit de concentrations en dehors de la limite de linéarité, il est possible que les résultats puissent varier, mais cette explication n’est pas convaincante puisque les valeurs des CQi sont dans la limite de linéarité et sont quand même doublées. Dans tous les cas, les échantillons sont toujours considérés comme positifs. Les valeurs acquises après dosage du THC dans les mêmes échantillons sont très différentes selon que l’extraction ait été effectuée par une β-glucuronidase provenant d’E.coli ou H.pomatia. Les concentrations obtenues après hydrolyse par une β-glucuronidase d’E.coli sont systématiquement plus élevées par rapport à celles obtenues avec l’enzyme de H.pomatia. Ces différences sont dues à la mauvaise linéarité de la droite de standard pour la méthode avec extraction par une β-glucuronidase provenant de H.pomatia. Ou peut-être que l’enzyme provenant d’E.coli est plus efficace. Les concentrations obtenues pour le 11-OH-THC ne sont pas interprétables vu la mauvaise linéarité de la courbe de standard.

Conclusion : Etant donné que les échantillons n’ont pas pu être injectés directement après la dérivatisation, il est possible que certaines substances se soient dégradées, ce qui expliquerait les mauvaises linéarités de certaines courbes et les mauvais résultats pour les deux contrôles glucuronidés. Par contre, pas d’explication pour les concentrations doublées des CQi.



Au final, il a été décidé de refaire un test, à nouveau en utilisant les deux méthodes, mais cette fois-ci sans échantillon patient, seulement les solutions standards pour effectuer la courbe, les CQi et les contrôles glucuronidés. Cette fois-ci, les échantillons sont directement injectés après la dérivatisation.

4.2.2. Test n°2 But :

Cette deuxième analyse a pour but, d’une part de définir si la congélation et/ou l’attente avant l’injection ont eu une influence sur les résultats des dosages (dégradation des substances d’intérêt) et d’autre part d’avoir un deuxième avis sur le bon ou mauvais fonctionnement de la méthode, pour peut-être comprendre et/ou résoudre certaines interrogations restées en suspend après la première analyse.

Pratique : Répéter le même procédé qu’au test n°1, cette fois-ci seulement sur les courbes de standard, toujours en utilisant les deux méthodes (2 enzymes différentes) (annexes 1 et 2) en parallèle. Les contrôles internes et glucuronidés sont aussi extraits et dosés.

Synthèse des résultats (annexes 8 et 9): Les courbes standards du THC obtenues après extraction par β-glucuronidase d’E.coli donne des coefficients de corrélation correctes (0.998 et 0.996). Idem pour les courbes obtenues après extraction par β-glucuronidase de H.pomatia (0.995 et 0.994). Les trois premiers points (les plus basses concentrations) de la courbe de THC ne sont pas détectés. La méthode n’est-t-elle pas assez sensible ? Les courbes standards du THCCOOH montrent une bonne linéarité après extraction avec E.coli (0.998 et 0.998) et après extraction avec H.pomatia (0.999 et 1.000). Pour le 11-OH-THC, les concentrations les plus basses n’ont pas été détectées et les concentrations détectées présentent un très mauvais double entre les ions. Ces résultats ne peuvent pas être pris en compte. Les CQi présentent toujours des concentrations doublées alors que les contrôles glucuronidés ont des concentrations toujours trop basses. Mais aucune solution n’a été trouvée aux problèmes de concentrations deux fois plus élevées des deux CQi.

Conclusion : A la fin de ce deuxième test, on observe que la congélation et/ou l’attente d’injection n’ont pas eu d’influence sur les résultats des dosages. Aussi, il est décidé que le dosage du 11-OH-THC est mis de côté vu les mauvais résultats obtenus lors des essais (métabolisation rapide du 11-OH-THC en THCCOOH). Seuls le THC et le THCCOOH seront donc dosés. La courbe standard est augmentée par trois concentrations en plus, soit 250, 500 et 1000 ng/ml pour le THCCOOH. Ceci a été jugé nécessaire, car la limite de linéarité n’est pas atteinte avec les concentrations testées les plus élevées et



aussi car certains échantillons présente une concentration en THCCOOH très haute. Ceci permet d’élargir la zone de référence dans le domaine de linéarité. Finalement, seule la méthode de dosage avec l’enzyme provenant d’E.coli est conservée. Malgré que les deux enzymes semblent toutes deux autant efficaces, ce choix a été pris car d’autres méthodes internes au laboratoire nécessitent une β-glucuronidase d’E.coli alors que ce n’est pas le cas pour l’enzyme de H.pomatia. La décision a été faite pour une raison pratique. Au final, il est décidé de changer une partie de la méthode ; pour la dérivatisation, c’est la dérivatisation de la méthode de l’extraction THC dans le sang qui est employée, afin de savoir si l’origine du problème des concentrations trop élevées vient de cette étape.

4.2.3. Test n°3 But :

Tester un autre dérivé ainsi qu’une autre méthode de dérivatisation afin de connaître si le problème provient de cette étape.

Pratique : Là aussi seules les courbes standards du THC et THCCOOH, les CQi et les deux contrôles glucuronidés sont extraits et dosés. Seule l’enzyme de E.coli est testée. Utilisation du TBAH/DMSO au lieu du MSTFA pour la dérivatisation ainsi que la méthode de dérivatisation de la méthode de dosage du THC et métabolites dans le sang, utilisée en routine (Annexe 11).

Synthèse des résultats (annexe 10) : Les courbes de standard du THC ont des linéarités de 0.971 et 0.999, les courbes du THCCOOH ont chacune des linéarités de 1.000. Toujours le même problème pour les CQi qui présentent des concentrations doublées alors que les contrôles glucuronidés ont une concentration trop basse.

Conclusions : Pas de changement notable avec cette autre dérivatisation. On décide de conserver le dérivé et le mode de dérivatisation initial, soit le MSTFA.

4.2.4. Résolution des problèmes Après plusieurs hypothèses peu plausibles sur la cause des concentrations doublées des CQi C3 et C4, une réponse a enfin été trouvée. Il s’agissait en fait d’une erreur de calcul des quantités de solution standards, ajoutées à chaque échantillon de la courbe standard. En effet, les quantités de solution standard avaient été calculées pour un volume de 1 ml d’urine, alors que dans la méthode, ce sont 2 ml d’urine qui sont ajoutés. Au final les concentrations étaient deux fois plus petites que celles voulues, ce qui a modifié l’équation de la droite standard, utilisée pour le calcul des concentrations des échantillons et contrôles, raison pour laquelle les concentrations obtenues pour ces échantillons étaient le double des valeurs attendues. Une fois les valeurs corrigées, les CQi sont dans l’intervalle de référence. Par rapport aux deux contrôles de THCCOOH-glucuronide, plusieurs hypothèses ont été émises. Premièrement le fait que la substance se dégrade



très facilement et aussi, que le THCCOOH-glucuronide de synthèse in vitro présente plusieurs isomères alors que, dans la substance synthétisée in vivo, un seul type d’isomère est présent et l’enzyme n’agit que sur les isomères synthétisés in vivo. Ces deux hypothèses peuvent justifier le fait que les concentrations obtenues après dosage des substances soient plus basses que celles attendues.

4.2.5. Conclusion Au final, il a été décidé d’utiliser la méthode d’extraction initiale en modifiant les quantités de solution standard dans les échantillons de la courbe de concentration, d’utiliser la β-glucuronidase d’E.coli et son tampon associé, de laisser tomber le dosage du 11-OH-THC et l’utilisation des contrôles THCCOOH-glucuronide. (Annexe 4)

4.3. Préparation des échantillons Entre parenthèses, les étapes éliminées suite aux les tests de la méthode. Il s’agit des étapes concernant le 11-OH-THC et l’enzyme H.pomatia.

4.3.1. Standard interne Un standard interne (SI) de concentration connue est ajouté, au début de l’analyse, à chaque échantillon, sauf le blanc de contrôle qui sert à vérifier qu’il n’y ait pas de contamination lors de l’analyse. Un bon choix du standard interne est important lors de méthode de quantification. Il est recommandé que cette substance ait les mêmes propriétés physico-chimiques que celles de la substance à quantifier. Ici ce sont les deutérés des substances d’intérêt qui ont été choisis comme standards internes, soit THC-D3, THCCOOH-D9 (et le 11-OH-THC-D3). Les substances deutérées ont leurs atomes d’hydrogène remplacés par des atomes de deutérium. Le deutérium est un atome d’hydrogène qui contient un proton et un neutron (isotope), sa masse est donc le double de celle de l’hydrogène. Le deutéré va se comporter de façon similaire à la substance d’intérêt, c’est son temps de rétention qui sera légèrement différent du temps de rétention de la substance. Le SI est un contrôle du bon déroulement de l’analyse dans son entier. Aussi lors des différentes étapes de l’extraction des substances d’intérêt, il y a forcément des pertes de produit (rendement d’extraction), mais aussi des pertes équivalentes de SI. Etant donné que la concentration initiale du SI est connue, il est facile de retrouver la concentration juste de la substance dans l’échantillon urinaire testé, en divisant l’aire de la substance par l’aire de sont SI deutéré, ce rapport n’étant pas modifié par la perte de produit.

4.3.2. Droite de calibration La droite de calibration est réalisée dans l’urine négative et contient 9 points, concentration 0 comprise pour le THCCOOH, 7 points pour le THC (et 7 points pour le 11-OH-THC). Chaque point correspond à une concentration. Chaque standard est pipeté dans un tube après l’autre à des concentrations croissantes afin d’établir une droite de calibration.



Pour la droite du THCCOOH, les points seront à 0, 5, 10, 25 (2x), 75, 150, 250, 500, 1000 ng/ml. Pour la droite du THC (et du 11-OH-THC), les points seront à 0, 1, 2, 5 (2x), 15, 30, 75 ng/ml Le point 0 n’est pas le contrôle négatif, il contient le standard interne. Il s’agit du point 0 de la droite. Le point N°3 (THCCOOH= 25 ng/ml, THC= 5 ng/ml (11-OH-THC= 5 ng/ml)) est dosé à double et sert de contrôle interne.

4.3.3. Echantillons La droite de calibration et le contrôle négatif (blanc sans standard interne) sont effectués dans l’urine négative. Les échantillons d’urines sont dosés à simple car il s’agit d’échantillons homogènes et la méthode d’analyse est assez précise pour ne pas devoir les doser à double. Les urines ne sont pas diluées, car très souvent le THC est en quantité très faible et il ne serait plus détecté s’ils subissaient une dilution.

4.3.4. Extraction liquide/liquide La préparation de l’échantillon comporte 4 étapes :

• Hydrolyse enzymatique Effectuée à l’aide de la β-glucuronidase issue de (H.pomatia) et E.coli. Cette étape permet de casser la liaison entre la molécule et le glucuronide dans des conditions contrôlées. Pour se faire, une incubation d’au moins 16 heures à 37°C et un pH7 pour E.coli (et à pH4.7 pour H.pomatia) est nécessaire afin d’optimiser l’activité enzymatique. Les températures et les pH sont adaptés à chaque enzyme afin de permettre des conditions adéquates pour une activité enzymatique optimale.

• Hydrolyse basique Effectué avec du KOH 11.8N Les liaisons molécule-glucuronide qui n’ont pas été cassées pendant la première hydrolyse, le seront durant celle-ci. Une incubation de 15 minutes à 60°C permet de catalyser la réaction.

• Extraction basique Juste avant cette étape, de l’acide acétique glacial est ajouté afin d’acidifier le milieu et permettre l’extraction des substances basiques et acides, nos substances d’intérêt étant acides. Puis le solvant organique est ajouté. Les molécules d’intérêt vont passer dans la phase organique durant l’agitation. Après centrifugation, cette phase est prélevée, mise dans un tube en verre propre et évaporée. Il ne restera alors dans le tube que les substances d’intérêt.

• Dérivatisation Les molécules d’intérêt seront dérivées avec du MSTFA.



Pendant cette étape, des groupes silyl seront ajoutés aux molécules d’intérêts (silylation). Ceci permet de stabiliser les molécules lors de l’analyse par GC-MS et d’augmenter leur spécificité lors de la détection. Cette étape est importante ; l’ajout d’un groupe silyl augmente le poids moléculaire des substances d’intérêt, les fragments obtenus après que la substance ait été ionisée dans le spectromètre de masse auront une masse plus élevées et seront donc plus spécifiques (plus la masse est petite, plus elle se rapproche du bruit de fond), ce qui permet d’augmenter leur détection. De plus, elle permet d’augmenter la volatilité des composés peu ou pas volatils, lors de l’étape de vaporisation qui se déroule à l’entrée du GC-MS dans le liner. La dérivatisation est accélérée en chauffant les tubes à 90°C pendant 15 minutes après avoir ajouté le dérivé.

Figure 2 : Ajout de deux groupements tms (silyl) au THCCOOH lors de la dérivatisation

4.4. Marche à suivre La marche à suivre a été modifiée suite aux essais effectués pour tester la méthode. Ce qui est entre parenthèses a été supprimé suite à ces tests.

• Pipeter 100 µl de SI dans chaque tube sauf le contrôle négatif (blanc – SI) avec la seringue

• Evaporer sous azote à T°C ambiante • Pipeter la solution de THC à 1 µg/ml à 0, 2, 4, 10 (2x), 30, 60, 150 µl avec les

seringues adéquates • Pipeter la solution de THCCOOH à 1 µg/ml à 0, 10, 20, 50 (2x), 150, 300,

500, 1000, 2000 µl avec les seringues adéquates • (Pipeter la solution de 11-OH-THC à 1 µg/ml à 0, 2, 4, 10 (2x), 30, 60, 150 µl

avec les seringues adéquates) • Evaporer sous azote à T°C ambiante • Ajouter 2 ml d’échantillon/ de contrôle interne/ d’urine négative selon le tube • Pipeter 50 µl de β-glucuronidase de E.coli (ou β-glucuronidase de H.pomatia)

à l’aide de la multipipette. • Ajouter 800 µl de tampon phosphate 0.8 M pH7 (ou de tampon phosphate

1M à pH 4.7) • Vortexer • Incuber minimum 16 heures à 37°C • Laisser revenir température ambiante • Ajouter 180 µl KOH 11.8N • Incuber 15 minutes environ à 60°C dans le bain marie sous agitation



• Laisser refroidir • Ajouter 500 µl d’acide acétique glacial • Vortexer • Ajouter 4 ml de 1-Chlorobutane • Agiter 10 minutes • Centrifuger 10 minutes à 2500 rpm • Reprendre la phase organique (supérieure) • Evaporer sous azote à T°C ambiante. • Ajouter 100 µl de MSTFA à l’aide du transferpettor • Chauffer 15 minutes à 90°C à l’étuve • Refroidir • Transférer dans les microvials • Analyser au GC-MS, 2 µl par injection.

4.5. La chromatographie gazeuse et la spectrométrie de masse : aspects généraux

La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse est une méthode d’analyse qui combine les performances de deux procédés afin d’identifier précisément de nombreuses substances. Elle permet également la quantification de substances. La chromatographie est une méthode de séparation et de quantification de composés présents dans une phase homogène liquide ou gazeuse. Dans le premier cas de figure, les composés sont susceptibles d’être vaporisés par chauffage sans se décomposer et dans le deuxième cas de figure, les composés sont sous forme gazeuse. Le principe est basé sur les équilibres successifs des composés présents dans deux phases ; la phase stationnaire, recouvrant la paroi interne de la colonne et la phase mobile qui se déplace en entraînant les substances. Les substances auront une affinité plus ou moins forte pour la phase stationnaire. Lors de forte affinité, des liaisons vont se créer entre les substances et la phase stationnaire ce qui va ralentir ces molécules et augmenter leur temps de rétention. Au contraire, les substances possédant moins d’affinité auront moins tendance à créer des liaisons avec la phase stationnaire, leur temps de rétention sera plus faible. Dans ce cas la phase mobile est un gaz porteur ou gaz vecteur, ici il s’agit de l’hélium. Les solutés doivent pouvoir être entraînés au sein de ce gaz. Le chromatogramme permet d’obtenir des informations qualitatives (temps de rétention d’un composé) et quantitative (surface ou hauteur du pic chromatographique). La spectrométrie de masse permet de recueillir des informations sur la nature, la composition et la structure des espèces présentes dans l’échantillon analysé. Cette méthode repose sur la détermination des masses des espèces atomiques ou moléculaires individuelles. Le spectre de masse représente sous forme graphique, l’abondance des ions sur la base de leur apport masse/charge. [16]



4.5.1. Principe d’analyse d’un échantillon contenant du THC, THCCOOH (et 11-OH-THC) par GCMS

L’échantillon est injecté sous forme liquide, à l’aide d’une seringue, dans linjecteur. La température élevée permet une vaporisation rapide de l’échantillon. L’échantillon arrive en tête de la colonne où il sera reconcentré du fait de la température plus basse. Les molécules avancent poussées par le gaz vecteur dans la colonne où la température est augmentée suivant un gradient. La migration varie selon la température, la pression, la taille et l’affinité de la molécule pour la phase fixe. Les molécules arrivent à l’interface. Cette pièce est nécessaire entre le GC et le MS à cause de la différence de pression entre les deux appareils. Elle permet aux molécules à analyser de passer de la pression atmosphérique (GC) à une pression très basse (le MS est sous vide « 10-4 Pa »). Les molécules arrivent ensuite au niveau de la source où elles seront bombardées d’électrons émis par le filament de métal chauffé électroniquement. Les molécules vont se fragmenter en ions, de façon similaire pour chaque même molécule, lorsque les conditions d’ionisation sont identiques. Les ions ainsi formés arrivent dans le quadrupôle et seront séparés selon leur masse et leur charge. Puis chaque ion arrive au multiplicateur qui va multiplier le signal, de sorte qu’il soit assez important pour être détecté. Les ions séparés sont représentés sous forme d’un spectre de masse. Exemples de spectre de masse du THC dérivé et son SI, le THC-D3 dérivé :

Figure 3 : Spectre de masse du THC dérivé

Figure 4 : Spectre de masse du THC-D3 dérivé



Les pics représentent les ions produits après que la molécule ait été bombardée d’électrons et fragmentées, lors de son passage dans le spectromètre de masse. Le pic surmonté de symbole M+ est le pic moléculaire. Le pic le plus élevé correspond à l’ion le plus abondant, c’est l’ion de base.

4.6. Utilisation du GCMS

4.6.1. Nettoyage et préparation de l’appareil Avant chaque série d’injection, certaines pièces de l’appareil doivent être nettoyées ou changées au niveau de l’injecteur. Dans un premier temps l’appareil est refroidi. Puis l’injecteur est ouvert, le liner est enlevé et jeté ainsi que le joint autour de celui-ci. Ceci permet d’éviter les possibles contaminations des échantillons de la série suivante, étant donné que c’est dans le liner que l’échantillon va se vaporiser. Le gold seal est nettoyé ou changé selon son état. Puisque le gold seal fait le lien entre le liner et la colonne, là aussi des contaminations seraient possibles. La colonne est coupée si son extrémité est abîmée et la férule remplacée. Pour terminer, la pression au niveau du merlin est vérifiée.

4.6.2. Autotune et injection du mélange Les deux systèmes sont testés séparément à l’aide de deux contrôles. Tout d’abord un autotune est lancé afin de vérifier le bon fonctionnement des différentes parties du spectromètre de masse. L’appareil se calibre à l’aide de PFTBA (perfluorotributylamine). Puis un mélange de contrôle méthalonique est injecté, afin de contrôler le bon fonctionnement du GC, sa sensibilité, la couverture de tous les temps de rétention et la détection des différentes familles de substances.

4.6.3. Séquence d’injection • Solvant de rinçage • Standard contenant les molécules à doser injecté en mode SCAN • Solvant de rinçage • Blanc – SI • Droite de calibration dans l’ordre croissant des concentrations en mode

SIM • Solvant de rinçage • Les différents contrôles internes séparés par des solvants de rinçage en

mode SIM • Solvant de rinçage • Les échantillons séparés par des solvants de rinçage en mode SIM • Solvant de rinçage • Les contrôles internes séparés par des solvants de rinçage en mode SIM • Solvant de rinçage.

L’acétonitrile comme solvant de rinçage a été choisi car le MSTFA, servant à la dérivatisation, est conservé dans de l’acétonitrile.



Par rapport aux modes d’analyse, tout d’abord, un point de la droite est analysé avec la méthode en « SCAN » (annexe 3). Ce mode effectue un balayage de chaque ion (de 0 à 7 minutes scan des ions de masse 10 à 400 puis de scan des ions de masse 50 à 600) afin d’identifier les substances recherchées, soit le THC, le THCCOOH (et le 11-OH-THC). Puis c’est la méthode en « SIM » (annexe 4) qui est utilisé pour la quantification du THC, THCCOOH (et 11-OH-THC) dans les échantillons de la droite, les échantillons patient et les CQi. Ce mode est plus sensible que le mode SCAN, car il analyse que les ions spécifiques aux substances d’intérêt, sélectionnés auparavant et le fait plusieurs fois. Pour rappel, les ions sélectionnés pour le dosage sont :

• THC : 386 – 371

• THC-D3 : 389 – 374

• THCCOOH : 371 – 473

• THCCOOH-D9 : 374 – 479

• (11-OH-THC : 459 – 371)

• (11-OH-THC-D3 : 568 – 538) Ces ions correspondent à l’ion de base et l’ion moléculaire. L’ion de base est l’ion le plus abondant et l’ion moléculaire est l’ion qui a une masse égale à la masse moléculaire de la substance d’intérêt.

4.7. Traitement des résultats Une fois l’analyse complète terminée, le temps de rétention de chaque substance est identifié sur l’échantillon analysé en mode SCAN en sélectionnant les ions correspondants à la substance. Une fois les temps de rétention identifiés, la macro est modifiée afin d’aligner les pics des substances au centre des graphes correspondants et de connaître leurs aires. Une macro est un programme informatique spécifique à chaque méthode. Elle permet le traitement des résultats comme de définir l’aire sous le pic correspondant à la substance identifiée après avoir introduit le RT relatif à la substance. Si le pic n’est pas intégré correctement ou pas du tout intégré, il est possible de le faire manuellement.



Exemples de chromatographe du THC dérivé et son SI, le THC-D3 dérivé :

Figure 5 : Chromatographe du THC correspondant à l’ion 386 (ion moléculaire)

Figure 6 : Chromatographe du THC-D3 correspondant à l’ion 389 (ion moléculaire)

L’axe de x correspond au temps de rétention (RT) et l’axe des y correspond à l’abondance.

4.8. Droite standard Les surfaces des pics correspondant aux échantillons de la courbe standard et à leur SI sont introduites dans un tableau Excel. Il s’agit du même tableau utilisé habituellement pour le dosage du THCCOOH urinaire et modifié pour cette nouvelle méthode. Ce tableau est programmé pour diviser l’aire du pic de l’échantillon par l’aire du pic correspondant à son SI. Le tout est reporté sous forme graphique avec en x, les rapports des aires et en y les concentrations théoriques des échantillons. Au final une droite est obtenue, son équation permet le calcul des concentrations des échantillons et des CQi. Deux droites sont calculées par molécule à doser, soit une par ion.



Pour le THC, une droite pour le rapport des ions 386/389 et une droite pour le rapport des ions 371/374. Pour le THCCOOH, une droite pour le rapport des ions 371/374 et une droite pour le rapport des ion 474/479. (Pour le 11-OH-THC, une droite pour le rapport des ions 459/568 et une droite pour le rapport des ions 371/538.)

4.9. Calcul des résultats des CQi et des échantillons Les surfaces des pics sont introduites dans un tableau Excel. Le rapport de l’aire du pic correspondant aux échantillons et de l’aire du pic correspondant à son SI est calculé. Le rapport obtenu est comparé à la courbe standard et va permettre de définir une concentration pour cet échantillon. L’utilisation d’une droite de calibration pour calculer la concentration des échantillons et des CQi permet et d’aplanir les différences d’analyse d’un tube à l’autre.

5. Validation

5.1. But La validation sert à démontrer, à travers plusieurs critères, que la méthode analytique mise au point est fiable. Si cette méthode n’est pas correcte, les conséquences pourraient s’avérer graves. Par exemple dans le contexte de l’expertise des trois lundis, les échantillons déterminés comme positifs par erreur, les faux-positifs, aboutiraient à un retrait de permis pour une personne ayant pourtant stoppé sa consommation pendant la durée déterminée.

5.2. Processus de validation Il s’agit d’une validation du type validation sur trois jours. Ce sont chaque fois les mêmes solutions, réactifs et produits de mêmes lots, et le même appareil qui ont été utilisés durant toute la validation. Les trois séries regroupaient exactement les mêmes échantillons, chaque échantillon est extrait et dosé à triple dans chaque série. Il s’agit ; des 9 points de la courbe pour le THCCOOH et des 7 points pour le THC, dont un est dosé à double servant de contrôle interne. Des deux contrôles internes C3 et C4 et de trois échantillons patient avec des concentrations en THCCOOH connues et différentes les unes de autres. Les résultats sont traités selon le guide pour validation de méthode de L’ICH (The international Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) qui est une méthode de validation utilisée en Europe, aux USA et au Japon.

5.3. Les critères de validations selon l’ICH • Linéarité

La linéarité d’une procédure analytique est sa capacité, à l’intérieur de l’intervalle de dosage, à fournir des résultats directement proportionnels à la concentration (quantité) en substance présente dans l’échantillon. La linéarité permet de définir les courbes de calibration des diverses substances.



• Limite de détection (LOD)

Il s’agit de la concentration la plus basse à laquelle la substance peut encore être détectée, mais pas forcément quantifiée. Elle est déterminée à la concentration pour laquelle le signal de l’analyte devient trois fois supérieur au bruit de fond environnant. Cette limite est déterminée à l’aide de la courbe standard où des concentrations décroissantes de substances sont ajoutées. Trois échantillons de chaque concentration choisie sont préparés séparément chaque jour de la validation.

• Limite quantification (LOQ) Il s’agit de la concentration la plus faible à laquelle la substance peut être quantifiée dans un échantillon avec une exactitude (justesse + fidélité) définie. La LOQ est définie à l’aide de la droite standard.

• Intervalle de mesure Il s’agit de l’intervalle (limites inférieure et supérieure comprises) de concentration (quantité) de la substance à analyser (dans l’échantillon) sur lequel il a été démontré que la procédure possède une fidélité, une exactitude et une linéarité appropriée.

• Fidélité La fidélité d’une procédure analytique exprime l’étroitesse de l’accord (mesure de la dispersion) entre une série de mesures obtenue à partir de plusieurs prises d’essai d’un même échantillon homogène, dans les conditions prescrites. La fidélité fourni une indication sur les possibles erreurs aléatoires.

• Répétabilité = variance Conditions où les résultats d’essai indépendants sont obtenus par la même méthode sur des individus d’essai identiques dans le même laboratoire, par le même opérateur, utilisant le même équipement et pendant un court intervalle de temps.

• Exactitude L’exactitude d’une procédure analytique exprime l’étroitesse de l’accord entre la valeur acceptée comme conventionnellement vraie, ou comme valeur de référence, et la valeur trouvée (= valeur moyenne obtenue en appliquant la procédure d’analyse un certain nombre de fois.) L’exactitude fourni une indication sur les possibles erreurs systématiques.

• Justesse La justesse exprime l’étroitesse de l’accord entre la valeur moyenne obtenue à partir d’une série de résultats d’essais et une valeur qui est acceptée soit comme une valeur conventionnellement vraie, soit comme



une valeur de référence acceptée (ex : standard international, standard d’une pharmacopée). La justesse permet de fournir une indication sur les erreurs systématiques.

5.4. Traitement des résultats selon les critères de validations de l’ICH Les résultats ont été introduits dans un tableau Excel programmé suivant la validation de l’ICH (The international Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use).

5.4.1. THC • Linéarité

La linéarité des résultats de chaque jour est représentée sous forme graphique.

Figure 7 : Représentation de la linéarité du dosage du THC au jour n°1







L’axe des x représente les concentrations des échantillons dosés, l’axe des y représente le rapport entre l’aire du standard/l’aire du standard interne. Pour les jours 1 et 3, les linéarités de 0.99 sont jugées comme étant bonnes. Pour le jour 2, la linéarité de 0.98 est une peu moins bonne, mais tout de même acceptée. Ce résultat est dû à la dispersion entre une des trois valeurs correspondant à la concentration 75 ng/ml de la courbe standard. La linéarité reflète la qualité du travail manuel effectué lors de l’analyse, plus précisément, la précision lors de l’ajout des standards de concentrations différentes et du standard interne.

• Limite de détection (LOD) Les premières valeurs ont été détectées pour les échantillons à 2 ng/ml. Il s’agit donc de la limite de détection de la méthode de dosage pour le THC.

• Limite de quantification (LOQ) La limite de quantification est déterminée en observant le tableau représentant le profil d’exactitude (relatif). Il s’agit de la concentration correspondant au point où la courbe représentant la borne supérieure



(bleu foncé) ou la borne inférieure (bleu clair) coupe la limite lui correspondant (traitillés verts), l’une des deux courbes ayant déjà coupé cette limite. La zone délimitée par les traitillés verts représente +/- 30% de la valeur cible qui est représentée par 100%.

Figure 10 : Représentation de la limite de quantification de la méthode pour le dosage du THC

L’axe des x représente les concentrations testées, l’axe des y l’éventeil de pourcentage, 100% étant la valeur cible. La courbe représentant la borne supérieure ne coupe pas la limite supérieure, on ne peut donc pas déterminer la LOQ avec les concentrations testées. Pour connaître la limite de quantification il aurait fallu tester d’autres concentrations, supérieures à celles testées, mais étant donné, que notre but est de quantifier des valeurs faibles, il ne nous est pas utile de connaître cette limite.

• Intervalle de mesure Ne peut pas être déterminée puisque la limite de quantification n’est pas connue.

• Répétabilité et variance Afin d’évaluer la répétabilité de la méthode pour le THC, plusieurs résultats de l’aire du standard de même concentration divisé par l’aire du standard interne ont été mis sous forme graphique et comparés.



Premièrement 18 résultats d’injection du standard de concentration 1ng/ml ont été comparés sous forme graphique, ceci également pour son standard interne associé. Puis le rapport standard/standard interne a été représenté graphiquement. Le même procédé a été suivi pour 26 résultats d’injection du standard 5 ng/ml et de son standard interne et 17 résultats d’injection du standard 30 ng/ml et son standard interne. Le nombre d’injection différent entre les concentrations vient du fait qu’un autre programme de validation devait être utilisé initialement et le nombre d’injections avait été déterminé par rapport aux valeurs demandées par ce programme. Au final, un mode de validation différent a été employé. Etant donné que la partie pratique de la validation était finie, les valeurs obtenues ont quand même été employées pour cette autre méthode de validation, d’où ces variations plutôt surprenantes du nombre de résultats. Etant donné que le standard 1 ng/ml n’a été détecté que deux fois, aucun renseignement n’a pu être obtenu sur la répétabilité de la méthode à ce niveau-là et c’est pour cette raison que le graphique n’est pas représenté. Par contre pour les deux autres concentrations testées, une bonne répétabilité a pu être démontrée, les résultats étant très proches les uns des autres.

Figure 11 : Représentation de la répétabilité de la méthode de dosage pour le THC avec résultats des

injections du standard 5/SI



Figure 12 : Représentation de la répétabilité de la méthode de dosage pour le THC avec résultats des

injections du standard 30/SI

L’axe des x représente les injections d’échantillon. L’axe des y représente le rapport des aires du standard/SI. Le fait d’avoir représenté graphiquement le rapport standard/SI a permis de mettre en évidence, l’utilité majeure de l’ajout d’un SI dont la concentration est connue. Ceci permet de normaliser les résultats afin d’évaluer correctement la répétabilité de la méthode. Ce tableau permet également l’évaluation de la variance entre les résultats pour une même concentration. Dans ce cas, elle est faible.

0.000E+00

1.000E+05

2.000E+05

3.000E+05

4.000E+05

5.000E+05

6.000E+05

7.000E+05

8.000E+05

9.000E+05

0 5 10 15 20 25 30 35 40

thc 5

thc‐d3

Figure 13 et 14: comparaison de la répétabilité de la méthode de dosage pour le THC avec résultats des injections du standard 5 et du SI séparemment (fig. 13) et de les résultats standard 5/SI (fig. 14)



rapport std 5/SI

0.0200.0700.1200.1700.2200.2700.3200.3700.4200.470

0 5 10 15 20 25 30

rapport std5/si

Figure 13 et 14: comparaison de la répétabilité de la méthode de dosage pour le THC avec résultats des injections du standard 5 et du SI séparemment (fig. 13) et de les résultats standard 5/SI (fig. 14)

Les deux graphiques ci-dessus démontrent la nécessité d’utilisation du SI afin de normaliser les résultats. Sur le premier graphe, les points bleus représentent les aires des pics correspondant au THC à 5 ng/ml et les points rouges correspondent aux aires des pics correspondant au THC-D3. Les résultats entre eux ont une très grande variance, alors qu’une fois standardisés (std/SI) cette variance diminue considérablement.

• Justesse et exactitude Sur le graphe ci-dessous, la courbe rouge traduit la justesse et les deux courbes bleues traduisent l’exactitude Sur la courbe rouge (justesse), chaque point représente la moyenne des différences des résultats obtenus par rapport à la valeur cible, qui est représentée par 100%, mesurée trois fois sur trois jours différents. Trois concentrations, 1, 5, 30 ng/ml, ont été testées, donc trois points sont représentés sur le graphe. Les limites inférieure et supérieure ont été positionnées à +/- 30% de la valeur cible, 100%.



Figure 15 : Représentation de la justesse (courbe rouge) pour les injections des standards à 1, 5 et 30

ng/ml

La courbe rouge se situe dans la zone délimitée, ce qui permet d’évaluer la justesse comme étant bonne. Etant donné que la concentration du standard à 1 ng/ml n’a pas toujours été détectée, le point représentant ces valeurs (le premier point de la droite) ne devrait pas être pris en compte. L’exactitude est représentée par la borne inférieure (bleu foncé) et la borne inférieure (bleu clair). La courbe rouge reflète la dispersion des résultats. En observant le graphe complet, nous constatons que la méthode possède une bonne justesse mais que son exactitude est mauvaise. Les valeurs obtenues sont trop éloignées des valeurs cibles ; grande dispersion, mais la moyenne de ces valeurs est proche de la valeur cible. La méthode de dosage pour le THC est donc juste, mais non précise.

5.4.2. THCCOOH • Linéarité

La linéarité des résultats de chaque jour est représentée sous forme graphique.



Figure 16 : Représentation de la linéarité du dosage au THCCOOH au jour n°1



Figure 17 : Représentation de la linéarité du dosage du THCCOOH au jour n°2



Figure 18 : Représentation de la linéarité du dosage du THCCOOH au jour n°3

L’axe des x représente les concentrations des échantillons dosés, l’axe des y représente le rapport entre l’aire du standard et l’aire du standard interne. Pour les jours 1 et 2, les linéarités de 0.99 sont jugées comme étant bonnes. Pour le jour 3, la linéarité de 0.98 est un peu moins bonne, mais tout de même acceptée. Cette valeur est dûe aux résultats dispersés les uns par rapport aux autres. La linéarité reflète la qualité du travail manuel effectué lors de l’analyse, plus précisément, la précision lors de l’ajout des standards de concentrations différentes et du standard interne.

• Limite de détection (LOD) Les premières valeurs ont été détectées pour les échantillons à 5 ng/ml. Il s’agit donc de la limite de détection de la méthode de dosage pour le THCCOOH.

• Limite de quantification (LOQ) La limite de quantification est déterminée en observant le tableau représentant le profil d’exactitude (relatif). Il s’agit de la concentration correspondant au point où la courbe représentant la borne supérieure (bleu foncé) ou la borne inférieure (bleu clair) coupe la limite lui



correspondant (traitillés verts), l’une des deux courbes ayant déjà coupé cette limite. La zone délimitée par les traitillés verts représente +/- 30% de la valeur cible, 100%.

Profil d'exactitude (relatif)

0.0%

20.0%

40.0%

60.0%

80.0%

100.0%

120.0%

140.0%

160.0%

180.0%

‐50 50 150 250 350 450 550

Justesse

borne inf

borne sup

limite inf

l imite sup

Figure 19 : Représentation de la limite de quantificationpour la méthode de dosage du THCCOOH

Les courbes représentant la borne supérieure et la borne inférieure se situent entièrement dans la zone fixée par la limite inférieure et la limite supérieure. Etant donné que la plus petite valeur testée est 5 ng/ml, on ne peut pas savoir ce qui se passe en-dessous de cette limite. La LOQ est donc fixée à 5 ng/ml.

• Intervalle de mesure Toutes les concentrations testées se situent dans la zone marquée par les limites inférieure et supérieure et sont donc toutes en dessous de la limite de linéarité. Selon les différentes concentrations testées, l’intervalle de mesure se situe donc entre une valeur inférieure à 5 ng/ml et une valeur supérieure à 500 ng/ml, puisqu’il n’y a pas eu de dosage de concentrations inférieures à 5 ng/ml et de concentrations supérieures à 500 ng/ml et qu’en dehors de ces concentrations, la méthode semble toujours être linéaire.

• Répétabilité et variance Afin d’évaluer la répétabilité de la méthode pour le THCCOOH, plusieurs résultats d’aire du standard de même concentration divisé par l’aire du standard interne ont été mis sous forme graphique et comparés.



Premièrement 18 résultats d’injection du standard de concentration 10 ng/ml ont été comparés sous forme graphique, ceci également pour son standard interne associé. Puis le rapport standard/standard interne a été représenté graphiquement. Le même procédé a été suivi pour 18 résultats d’injection du standard 150 ng/ml et de son standard interne et 18 résultats d’injection du standard 500 ng/ml et son standard interne. Pour le THCCOOH, le nombre d’injection est identique pour les trois concentrations, ce qui est un hasard étant donné que le nombre d’injection avait été déterminé en fonction d’un autre programme de validation et qu’au final, une mode de validation différent a été employé. Les trois concentrations différentes de standard injectées ont chaque fois été détectées. Pour ces trois concentrations, une bonne répétabilité a pu être démontrée, les résultats étant très proches les uns des autres.

Figure 20 : Représentation de la répétabilité de la méthode de dosage pour le THCCOOH avec

résultats des injections du standard 10/SI







L’axe des x correspond aux injections d’échantillon. L’axe des y représente le rapport des aires du standard/SI. Le fait d’avoir représenté graphiquement le rapport standard/SI a permis de mettre en évidence, l’utilité majeure de l’ajout d’un SI dont la concentration est connue. Ceci permet de normaliser les résultats afin



d’évaluer correctement la répétabilité de la méthode. Ce tableau permet aussi l’évaluation de la variance entre les résultats pour une même concentration. Dans ce cas, elle est faible.

Figure 23 et 24: comparaison de la répétabilité de la méthode de dosage pour le THCCOOH avec résultats des injections du standard 500 et du SI séparemment (fig. 23) et de les résultats standard

500/SI (fig. 24)

Figure 23 et 24: comparaison de la répétabilité de la méthode de dosage pour le THCCOOH avec résultats des injections du standard 500 et du SI séparemment (fig. 23) et de les résultats standard

500/SI (fig. 24)



Les deux graphiques ci-dessus démontrent la nécessité d’utilisation du SI afin de normaliser les résultats. Sur le premier graphe, les points bleus représentent les aires des pics correspondant au THCCOOH à 500 ng/ml et les points rouges correspondent aux aires des pics correspondant au THCCOOH-D9. Les résultats entre eux ont une très grande variance, alors qu’une fois normalisés (std/SI) cette variance diminue considérablement.

• Justesse et exactitude Sur le graphe ci-dessous, la courbe rouge traduit la justesse et les deux courbes bleues traduisent l’exactitude Sur la courbe rouge (justesse), chaque point représente la moyenne des différences des résultats obtenus par rapport à la valeur cible, qui représente 100%, mesurée trois fois et sur trois jours différents. Trois concentrations, 10, 150, 500 ng/ml, ont été testées, donc trois points sont représentés sur le graphe. Les limites inférieure et supérieure ont été positionnées à +/- 30% de la valeur cible représentée par 100%.

Figure 25 : Représentation de la justesse (courbe rouge) pour les injections des standards à 10, 150

et 500 ng/ml

La courbe rouge se situe dans la zone délimitée, ce qui permet d’évaluer la justesse comme étant bonne. L’exactitude est représentée par les courbes marquant la borne inférieure (bleu foncé) et la borne inférieure (bleu claire). La courbe rouge reflète la dispersion des résultats. En observant le graphe complet, nous constatons que la méthode possède une bonne justesse et une bonne exactitude. Les valeurs obtenues sont toutes dans la zone de linéarité et la moyenne de ces valeurs est proche de la valeur cible.



La méthode de dosage pour le THCCOOH est donc juste et précise.

5.5. Compte-rendu de la validation

5.5.1. THC Au terme de la validation de la méthode pour le dosage du THC, aucune limite de quantification n’a pu être identifiée ce qui n’a pas permis de déterminer un intervalle de mesure. Une mauvaise précision a aussi été mise en avant. Ceci engendre la non validation de la méthode pour le dosage du THC. Les autres critères tels que la linéarité, la variance et la répétabilité ne peuvent pas être prises en compte. Notons toute fois que la limite de détection est de 5 ng/ml, puisqu’il s’agit de la concentration la plus basse détectée par la méthode.

5.5.2. THCCOOH Au terme de la validation de la méthode pour le dosage du THCCOOH, la méthode testée sur trois jours présente une bonne linéarité. La limite détection est de 5 ng/ml et l’intervalle de mesure se situe entre une valeur inférieure à celle testée (5 ng/ml) et une valeur supérieure à celle testée (500 ng/ml). La répétabilité est bonne et la variance faible. La méthode de dosage pour de THCCOOH obtient de bons résultats, elle peut être validée.

6. Dosages sur les échantillons UMPT sélectionnés et comparaison des résultats

Malgré que la méthode ne soit pas validée pour le dosage du THC, 147 échantillons d’urine UMPT ont été analysés avec cette nouvelle méthode afin de vérifier si les concentrations en THC obtenues ne peuvent quand même pas être exploitées comme indication supplémentaires à l’interprétation des résultats. En effet, la présence de THC urinaire mettrait en évidence une consommation récente, puisque le THC se métabolise rapidement. En même temps, la littérature reste très vague sur le temps de demi-vie d’élimination du THC car elle est très variable selon les personnes. Les échantillons sont par trois, soit un prélèvement trois lundis de suite pour un individu. Les concentrations en THCCOOH urinaire normalisées par le taux de créatinine sont connues puisqu’elles ont été dosées préalablement par GC-MS avec la méthode THCurinaire utilisée en routine (annexe 13). Le taux de créatinine est dosé par méthode immunologique à l’aide d’un automate, le Dimension®. Le taux de THC urinaire n’est pas connu. Tout d’abord, les résultats des concentrations en THCCOOH urinaire obtenus avec la nouvelle méthode sont comparés avec les résultats trouvés avec la méthode utilisée en routine. (Annexe 14) Puis pour l’interprétation des résultats par rapport au THCCOOH, c’est le modèle II selon Huestis [20] qui a été suivi, soit : Modèle II (Huestis[20]) : une nouvelle consommation est indiquée lorsque U2(3)/U1(2) > 0.5 et que la quantité de THCCOOH est ≥ 14 ng/ml. (Annexe 15) Puis finalement, les rapports des concentrations en THCCOOH et les concentrations en THC ont été mis en commun sous forme graphique pour une interprétation finale. (Annexe 16)



6.1. Comparaison entre les concentrations de THCCOOH urinaires normalisées obtenues avec la méthode de la routine dosage de THCCOOH dans l’urine et la nouvelle méthode

Dans l’ensemble, quelques variations ont été observées entre les résultats obtenus avec les deux méthodes. Dans la plus part des cas, lorsqu’il y a augmentation des concentrations entre deux prises, les deux méthodes montrent cette augmentation, pareil lorsqu’il y diminution. Pour cinq échantillons, les résultats ne vont pas dans le même sens. Il s’agit des individus 10, 34, 36, 46 et 47. Pour l’individu 10, la nouvelle méthode montre une augmentation de la concentration entre la prise U1 et U2 alors qu’avec la méthode routine il y avait diminution. Cette différence est la même pour les individus 34 et 36. Au contraire, pour les individus 46 et 47, la nouvelle méthode a démontré une diminution de la concentration entre U2 et U3, alors que l’ancienne méthode présentait une augmentation de la concentration. Ces variations sont difficiles à expliquer, peut-être que les échantillons se sont altérés ou est-ce des fautes aléatoires ? Annexe 14 : Comparaison entre les résultats des deux méthodes

6.2. Interprétation selon modèle II de Huestis Les interprétations divergent selon que la nouvelle méthode ou l’ancienne ait été utilisée, ce qui ne devrait pas être le cas. Etant donné qu’il y a des différences de résultats entre les deux méthodes de dosage, cela interfère dans l’interprétation selon le modèle II de Huestis. Annexe 15 : Comparaison avec interprétation selon modèle II de Huestis

6.3. Interprétation en comparant les résultats du THC et THCCOOH et le modèle selon Huestis

La méthode de dosage n’est pas validée pour le THC et les concentrations obtenues pour le THC, à l’exception de 25 sur 98, sont en-dessous de la limite de détection de 2 ng/ml. Malgré ça, les résultats sont quand même exploités à titre indicatif. Les échantillons dont les concentrations en THC étaient inférieures à 1 ng/ml ont été déterminés comme négatifs (non détecté ND). Les résultats de dosage du THC et du THCCOOH on été introduit dans des tableaux dans le but de les interpréter.



Ci-dessous le modèle de tableau exploité pour l’interprétation :

THC U2 ou U3

OUI NON

OUI

THCC

OOH/créat

U2/U1>0.5 ou

U3/U2>0.5

NON

Entrée sur le côté (THCCOOH/créat. U2/U1>0.5 ou U3/U2>0.5): Lorsque le rapport de la concentration en THCCOOH/créat. dosé dans l’urine N°2 et la concentration en THCCOOH/créat dosé dans l’urine N°1 est supérieure à 0.5 (U2/U1>0.5), la consommation entre les prise d’urine est interprétée comme positive, la case OUI est alors hachurée. Idem lorsque le rapport U3/U2 est supérieur à 0.5 (U3/U2>0.5). Lorsque ces rapports de concentrations sont inférieurs à 0.5, ils sont interprétés comme n’ayant pas eu de consommation entre deux prises d’urine, dans ce cas de figure, c’est la case NON qui est hachurée.

Entrée supérieure (THC U2 ou U3) : Lorsqu’une concentration en THC égale ou supérieure à 1 ng/ml est détectée dans les échantillons U2 ou U3, cela indique une consommation récente, la case OUI est hachurée. Lorsque rien n’a été détecté, c’est la case NON qui est hachurée, il n’y a pas eu de consommation récente.

Ci-dessous, les différents cas de figure et leur interprétation générale selon le modèle II de Huestis et mes connaissances sur le métabolisme du cannabis. Bien entendu, l’interprétation des résultats UMPT sera accomplie cas par cas. Pour chaque individu, l’interprétation sera différente puisque pour chaque cas il faudra prendre en compte, les concentrations en THCCOOH et en THC de chacun des trois échantillons et des échantillons entre eux en plus de l’interprétation du tableau.

THC U2 ou U3 Possibilité N°1. Interprétation : Consommation

OUI NON

OUI

THCC

OOH/créat

U2/U1>0.5 ou

U3/U2 > 0.5

NON

Ce graphe indique un rapport entre les concentrations urinaires en THCCOOH/créat. de deux échantillons, supérieur à 0.5 ; U2/U3>0.5 ou U3/U2>0.5, donc une consommation entre deux prises d’urine positive. Il indique aussi une détection de THC urinaire dans l’urine 2 ou l’urine 3, soit une consommation récente. En résumé, le graphe montre de manière nette une consommation de cannabis entre deux prises d’urine.



THC U2 ou U3 Possibilité N°2. Interprétation : Abstinence

OUI NON

OUI

THCC

OOH/créat

U2/U1>0.5 ou

U3/U2>0.5

NON

Ce graphe indique un rapport entre les concentrations urinaires en THCCOOH/créat. de deux échantillons, inférieur à 0.5 ; U2/U3<0.5 ou U3/U2<0.5, soit pas de consommation entre deux prises d’urine. Il indique aussi aucune détection de THC urinaire dans l’urine 2 ou l’urine 3, soit pas de consommation récente. En résumé, le graphe montre de manière nette une abstinence durant le protocole des trois jours.

THC U2 ou U3 Possibilité N°3. Interprétation : Pas d’interprétation, regarder les concentrations des échantillons

OUI NON

OUI

THCC

OOH/créat

U2/U1>0.5 ou

U3/U2 > 0.5

NON

Ce graphe indique un rapport entre les concentrations urinaires en THCCOOH/créat. de deux échantillons, inférieur à 0.5 ; soit pas de consommation entre deux prises d’urine. Il indique aussi une détection de THC urinaire dans l’urine 2 ou l’urine 3, soit une consommation récente. Ce cas de figure signifierait que la personne vient de consommé étant donné qu’un taux de THC a été détecté, mais que le THC ne s’est pas encore métabolisé en THCCOOH ?

Dans ce cas précis, il est nécessaire d’observer les concentrations en THC et THCCOOH de chaque échantillon et des échantillons entre eux pour une meilleure interprétation.



Annexe 16 : Interprétation avec mise en commun des résultats obtenus avec la nouvelle méthode

6.3.1. Interprétations des résultats • Individu 1 : Les tableaux indiquent une consommation de cannabis entre

la première et la seconde prise d’urine et pas d’interprétation entre la deuxième et la troisième prise d’urine. Si on observe les concentrations de THCCOOH et de THC, elles diminuent toutes les deux. Malgré ça, selon Huestis il y aurait quand même une consommation entre la première prise et la seconde. Dans cette direction, du THC a été détecté dans la deuxième prise d’urine. Mais comme le métabolise du THC varie d’une personne à l’autre, il reste difficile de se prononcer pour ce cas. La présence du THC ferait pencher sur une consommation,mais sans aucune certitude.

• Individu 2 : Les tableaux montrent une abstinence entre la première et la seconde prise d’urine et une consommation entre la deuxième et la troisième. Les variations de concentration en THCCOOH et THC vont dans le même sens ainsi que l’interprétation selon Huestis. Dans ce cas-là, il y a bien eu consommation entre la deuxième et la troisième prise d’urine.

• Individu 3 : Les deux tableaux indiquent une abstinence. La concentration en THCCOOH urinaire diminue pour passé en dessous des 14 ng/ml dès la deuxième prise urinaire. Pas de THC détecté. L’interprétation selon Huestis va dans le même sens, il y aurait abstinence durant le protocole des trois lundis.

• Individu 4 : Les tableaux montrent une consommation entre U1 et U2 et une abstinence entre U2 et U3, les concentrations urinaires en THC et THCCOOH vont dans le même sens ainsi que l’interprétation selon

THC U2 ou U3 Possibilité N°4. Interprétation : Pas d’interprétation, regarder les concentrations des échantillons

OUI NON

OUI

THCC

OOH/créat

U3/U2>0.5 ou

U3/U2 > 0.5

NON

Ce graphe indique un rapport entre les concentrations urinaires en THCCOOH/créat. de deux échantillons, supérieur à 0.5 ; U2/U3>0.5 ou U3/U2>0.5 donc une consommation entre deux prises d’urine positive selon le modèle II de Huestis. Il indique aussi aucune détection de THC urinaire dans l’urine 2 ou l’urine 3, soit pas de consommation récente. Dans ce cas de figure, il serait possible que la personne métabolise et/ou excrète lentement le THCCOOH. Il n’y a pas de

consommation récente, pas de THC détecté, mais par contre la concentration en THCCOOH entre deux prises n’a pas beaucoup diminué.



Huestis. Dans ce cas-là, on peut dire qu’il y eu consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 5 : Les tableaux indiquent une consommation entre la première prise urinaire et la seconde puis une abstinence entre la seconde et la troisième. L’interprétation selon Huestis va dans le même sens, malgré que les concentrations en THCCOOH et THC diminuent. Difficile de se prononcer sur ce cas.

• Individu 6 : Les tableaux montrent une abstinence entre la première et la seconde prise urinaire puis pas d’interprétation. Si on observe les concentrations en THCCOOH, il y a une augmentation entre U2 et U3 malgré qu’aucun taux de THC ne soit détecté. L’interprétaion selon Huestis va dans la même direction. Difficile de se prononcer sur ce cas.

• Individu 7 : Les tableaux ne renseignent pas sur l’interprétation de ce cas. Les concentrations en THCCOOH diminue mais très peu et pas de THC détecté. Par contre selon Huestis, il y aurait consommation entre chaque prise urinaire. Difficile de se prononcer sur ce cas.

• Individu 8 : Les tableaux indiquent une abstinence entre la première et la deuxième prise urinaire puis une consommation entre la deuxième et la troisième. Les concentrations en THCCOOH diminuent alors que les concentrations en THC diminuent entre la première et la deuxième prise puis augment entre la seconde et la troisième. L’interprétation selon Huestis va dans le même sens. De nouveau, il est difficile de se prononcer sur ce cas.

• Individu 9 : Les tableaux ne fournissent aucune interprétation pour ce cas. Les concentrations en THCCOOH et THC urinaires diminuent. Selon Huestis, il y aurait consommation entre la prise deux et la prise trois. Difficile de se prononcer sur ce cas.

• Individu 10 : Pas d’interprétation pour le premier tableau et le seconde montre une consommation de cannabis entre la deuxième et la troisième prise urinaire. L’augmentation du THCCOOH et du THC urinaire entre les prise deux et trois vont dans le même sens. Par contre selon Huestis, il y aurait eu consommation entre chaque prise urinaire. Difficile de se prononcer sur ce cas.

• Individu 11 : Les tableaux indiquent une consommation entre chaque prise. Même interprétation selon Huestis, Les concentrations en THC augmentent aussi, par contre les concentrations en THCCOOH diminuent, mais faiblement et restent chaque fois supérieures à 100 ng/ml. Ici on peut affirmer qu’il y a eu consommation.

• Individu 12 : Le premier tableau ne donne pas d’interprétation alors que le second montre une abstinence. Diminution des concentrations en THCCOOH et THC et abstinence selon Huestis. Dans ce cas on pourrait penser qu’il y a bien eu abstinence durant le protocole des trois lundis.

• Individu 13 : Le premier tableau n’indique pas d’interprétation alors que le second montre une abstinence. Les concentrations en THCCOOH et THC diminuent, mais selon Huestis, il y aurait consommation entre la



première prise urinaire et la seconde. Difficile de se prononcer sur ce cas.

• Individu 14 : Le premier tableau ne donne pas d’interprétation et le second montre une consommation. La concentration en THCCOOH diminue puis augmente et la concentration en THC augmente puis diminue, les augmentations seraient signe d’une consommation. Selon Huestis il y aurait consommation entre la deuxième et la troisième prise urinaire. Dans ce cas, on pourrait dire qu’il y a consommation de cannabis durant le protocole des trois lundis.

• Individu 15 : Les deux tableaux montrent une consommation. L’augmentation du THCCOOH et du THC vont dans le même sens ainsi que l’interprétation selon Huestis. Ici, il a consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 16 : Les deux tableaux indiquent une consommation. L’augmentation puis stabilisation du THCCOOH et augmentation du THC vont dans le même sens ainsi que l’interprétation selon Huestis. Ici, il a consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 17 : Le premier tableau ne donne pas d’interprétation et le second montre une consommation. La très forte augmentation du THCCOOH et l’augmentation du THC entre les urines 2 et 3 indique une consommation, l’interprétation selon Huestis va dans le même sens. Dans ce cas-là, on peut dire qu’il y a eu consommation.

• Individu 18 : Les deux tableaux indiquent une consommation. L’augmentation du THCCOOH et augmentation du THC vont dans le même sens ainsi que l’interprétation selon Huestis. Ici, il a consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 19 : Le premier tableau montre une abstinence et le second ne donne pas d’interprétation. Les concentrations en THCCOOH et THC diminuent, mais selon Huestis, il y a consommation entre la seconde et la troisième prise urinaire. Difficile de se prononcer dans ce cas.

• Individu 20 : Le premier tableau ne donne pas d’interprétation alors que le second montre une consommation. Diminution de la concentration en THCCOOH, mais augmentation du THC. Selon Huestis, il y a eu consommation entre la deuxième et la troisième prise urinaire. Difficile de se prononcer dans ce cas.

• Individu 21 : Le premier tableau n’indique pas d’interprétation et le second montre une consommation. Les concentrations en THCCOOH et THC diminuent entre la première et la seconde prise alors qu’elles augmentent entre la seconde et la troisième. Selon Huestis, il y a consommation entre l’urine deux et l’urine trois. Toutes les interprétations vont dans le même sens, il y a eu consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 22 : Les deux tableaux ne donnent pas d’interprétation. La concentration en THCCOOH diminue entre la première et la seconde prise urinaire et augmente entre la deuxième et la troisième prise. Pas de THC détecté. Selon Huestis, il y a consommation entre chaque prise.



Suite à l’augmentation en THCCOOH et à l’interprétation selon Huestis, on peut penser qu’il y a eu consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 23 : Les deux tableaux montrent une consommation. L’augmentation des concentrations en THCCOOH et THC ainsi que l’interprétation selon Huestis vont dans le même sens. Dans ce cas-là, on peut dire qu’il y a eu consommation pendant le protocole des trois lundis.

• Individu 24 : Les tableaux montrent tout deux une abstinence. Les concentrations en THCCOOH sont toutes inférieures à 14 ng/ml, pas de THC détecté. Selon Huestis, étant donné que les valeurs sont < 14 ng/ml, il y a abstinence durant le protocole des trois jours.

• Individu 25 : Le premier tableau ne montre pas d’interprétation et le second montre une abstinence. Les nettes diminutions des concentrations en THCCOOH et THC urinaires montrent une abstinence, l’interprétation selon Huetis va dans le même sens.

• Individu 26 : Les deux tableaux indiquent une abstinence, la diminution des concentrations en THCCOOH et THC ainsi que l’interprétation selon Huestis vont dans le même sens. Dans ce cas, il y a eu abstinence durant le protocole des trois lundis.

• Individu 27 : Les deux tableaux ne donnent pas d’interprétation. Les concentrations en THCCOOH restent stables, pas de THC détecté. Pas contre l’interprétation selon Huestis montre une consommation entre chaque prise urinaire. Dans ce cas, il est difficile de se prononcer.

• Individu 28 : Les deux tableaux indiquent une consommation. La concentration en THCCOOH diminue entre la première et la seconde prise puis augmente entre la seconde et la troisième prise. La concentration en THC augmente. Selon Huestis il y a consommation entre chaque prise urinaire. Dans ce cas, on peut dire qu’il y a eu consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 29 : Le premier tableau ne nous donne pas d’interprétation et le second indique une consommation. La concentration en THCCOOH diminue alors que le THC augmente entre la seconde et la troisième prise urinaire. Selon Huestis, il y a consommation entre chaque prise. Dans ce cas, on pourrait penser qu’il y a eu consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 30 : Les deux tableaux indiquent une consommation. Les concentrations en THCCOOH et THC diminuent entre la première et la deuxième prise puis diminuent entre la deuxième et la troisième prise. Selon Huestis, il y a consommation entre chaque prise. Même si les concentrations en THCCOOH diminuent, elles restent élevées. Pour ce cas, on peut penser qu’il y a eu consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 31 : Le premier tableau montre une abstinence et le second ne donne pas d’interprétation. La concentration en THCCOOH diminue, le THC n’est pas détecté. Selon Huestis, il y a consommation entre la



deuxième et la troisième prise urinaire. Les différentes interprétations ne vont pas toutes dans le même sens, difficile de se prononcer dans ce cas.

• Individu 32 : Les deux tableaux ne donnent pas d’information sur l’interprétation. La concentration en THCCOOH diminue entre la première et la seconde prise puis augmente entre la seconde et la troisième. Du THC n’est détecté que dans la première urine. Selon Huestis, il y a consommation entre chaque prise urinaire. Dans ce cas, il est difficile de se prononcer sur une interprétation finale, mais étant donnée l’interprétation selon Huestis l’augmentation du THCCOOH, on pourrait penser qu’il y a eu consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 33 : Le premier tableau indique une abstinence et le second ne donne pas d’interprétation. La concentration en THCCOOH diminue, pas THC détecté. Selon Huestis, il y a consommation entre la deuxième et la troisième prise urinaire. Dans ce cas, difficile de se prononcer exactement sur la consommation ou l’abstinence de l’individu.

• Individu 34 : Les deux tableaux montrent une consommation. La concentration en THCCOOH entre la première et la deuxième prise urinaire augmente alors qu’elle diminue entre la seconde et la troisième prise urinaire, mais reste quand même élevée (>100 ng/ml). Du THC est détecté dans la deuxième et la troisième urine. Selon Huestis, il y a consommation entre chaque prélèvement. Même s’il y a une diminution de la concentration du THCCOOH, celle-ci reste élevée. Dans ce cas, on pourrait penser qu’il y a eu consommation durant le protocole, mais sans certitude.

• Individu 35 : Le premier tableau ne donne pas d’interprétation et le second indique une consommation. Les concentrations en THCCOOH et THC diminuent entre la première et la seconde prise urinaire, puis augmente entre la deuxième et la troisième. L’interprétation selon Huestis va dans le même sens, consommation entre le deuxième et le troisième échantillon. Dans ce cas, on peut pense qu’il y eu consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 36 : Le premier tableau montre une abstinence et le deuxième ne donne pas d’interprétation. La concentration en THCCOOH diminue entre la première et la seconde prise urinaire, puis augmente entre la deuxième et la troisième. Le THC n’est pas détecté. Selon Huestis, il y a consommation entre la deuxième et la troisième prise urinaire. Difficile de se prononcer sur ce cas.

• Individu 37 : Le premier tableau montre une abstinence et le deuxième ne donne pas d’interprétation. La concentration en THCCOOH diminue, le THC n’est pas détecté. L’interprétation selon Huestis indique une consommation de cannabis en la seconde et la troisième prise urinaire. Dans ce cas, difficile de se prononcer.

• Individu 38 : Les deux tableaux ne donnent pas d’interprétation. Les concentrations en THCCOOH et THC diminuent et selon Huestis il a



abstinence. Mais étant donné la présence de THC, difficile de se prononcer sur ce cas.

• Individu 39 : Le premier tableau montre une consommation et le second une abstinence. Les concentrations en THCCOOH et THC vont dans ce sens et montrent une augmentation entre la première et la deuxième prise urinaire puis une diminution entre la deuxième et la troisième. L’interprétation selon Huestis indique une consommation entre la première et la deuxième prise urinaire. Dans ce cas, on peut dire qu’il y a eu consommation de cannabis durant le protocole des trois lundis.

• Individu 40 : Le premier tableau montre une consommation et le second ne donne pas d’interprétation. La concentration en THCCOOH augmente entre chaque prise urinaire et la concentration en THC augmente entre la première et la deuxième prise puis diminue entre la seconde et la troisième prise. Selon Huestis, il y a consommation entre chaque prise. Dans ce cas, même s’il n’y a pas de THC dans la dernière urine, on peut penser qu’il y a eu consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 41 : Les deux tableaux indiquent une consommation. Les concentrations en THCCOOH et THC diminuent, mais selon Huestis, il y eu consommation entre chaque prise urinaire. Difficile de se prononcer sur ce cas.

• Individu 42 : Les deux tableaux ne donnent pas d’interprétation. La concentration en THCCOOH diminue entre la première prise urinaire et la seconde puis augmente entre la seconde et la troisième prise. Du THC n’est détecté que dans la première urine. Selon Huestis il y a consommation entre chaque prise urinaire. Dans ce cas, les concentrations de THCCOOH varient mais restent élevées (>100 ng/ml). On peut penser qu’il y a eu consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 43 : Les deux tableaux montrent une consommation. La concentration en THCCOOH augmente, la concentration en THC augmente entre la première et la deuxième prise urinaire puis diminue entre la seconde et la troisième. Selon Huestis, il y a consommation entre chaque prise. Ici difficile de se prononcer sur une consommation ou non.

• Individu 44 : Le premier tableau indiquee une consommation et le second ne montre pas d’interprétation. Les concentrations en THCCOOH et THC urinaires augmentent entre la première et la seconde prise puis diminuent entre la seconde et la troisième prise urinaire. Selon Huestis, il y a consommation entre la première et la seconde prise urinaire. Dans ce cas, on peut penser qu’il y a eu consommation durant le protocole des trois lundis.

• Individu 45 : Les deux tableaux ne donnent pas d’interprétation. Les concentrations en THCCOOH augmentent, le THC n’est pas détecté. Selon Huestis il y a consommation entre chaque prise urinaire. Dans ce cas, vu l’augmentation du THCCOOH et l’interprétation selon Huestis, on peut pense qu’il y a eu consommation durant le protocole des trois lundis.



• Individu 46 : Les deux tableaux ne montrent pas d’interprétation. La concentration du THCCOOH diminue entre chaque prise, le THC n’est pas détecté. Selon Huestis, il y consommation entre chaque prise urinaire. Dans ce cas, il est difficile de se prononcer.

• Individu 47 : Le premier tableau ne montre pas d’interprétation et le second indique une abstinence. Les concentrations en THCCOOH et THC diminuent fortement. Selon Huestis il y a abstinence entre chaque prise. En observant ce cas, on peut penser qu’il y a eu abstinence lors du protocole des trois lundis.

• Individu 48 : Les deux tableaux n’indiquent aucune interprétation. La concentration en THCCOOH diminue et le THC n’est pas détecté. Selon Huestis, il y a consommation de cannabis entre chaque prise urinaire. Dans ce cas, difficile de se prononcer.

• Individu 49 : Les deux tableaux ne donnent aucune interprétation. La concentration en THCCOOH diminue et le THC n’est pas détecté. Selon Huestis, il y a consommation de cannabis entre chaque prise urinaire. Dans ce cas, difficile de se prononcer.

7. Discussion

7.1. Développement et validation

7.1.1. Résumé du but Le but de cette première partie du travail qui est la plus volumineuse, est de développer et valider une méthode analytique selon un article permettant le dosage simultané du THC, THCCOOH et 11-OH-THC dans l’urine afin de pouvoir interpréter de façon plus précise les résultats des dosages des urines UMPT et pouvoir utiliser cette méthode en routine à la place de l’actuelle qui ne dose que le THCCOOH. Ce développement inclut une comparaison de l’activité enzymatique de deux β-glucuronidase provenant d’E.coli et de H.pomatia.

7.1.2. Discussion Suite aux tests réalisés initialement, l’enzyme provenant d’E.coli a été choisie malgré que l’enzyme de H.pomatia soit tout autant efficace. Ce choix a été effectué pour une raison pratique, plusieurs analyses internes au laboratoire nécessitent l’utilisation de cette enzyme. Les tests ont aussi permis de déterminer que la méthode n’était pas assez sensible pour la détection du 11-OH-THC, cette analyse a été écartée. Aussi les contrôles THCCOOH-glucuronide ont été éliminés, puisqu’une fois l’ampoule ouverte, la solution se dégrade rapidement, ce qui engendrait de mauvais résultats. Par ces tests, une erreur dans les calculs de la courbe standard a été identifiée et corrigée. Au final, la méthode fonctionnait et a pu passer à l’étape suivante, la validation. La partie pratique de la validation était chargée. La préparation des échantillons était longue, puis le traitement des données après analyse sur GC-MS était fastidieux, car la plupart des pics correspondant au THC et THCCOOH devaient



être intégrés manuellement. Finalement tout s’est déroulé correctement. Par contre au moment de traiter les résultats obtenus, le logiciel qui devait être utilisé ne fonctionnait pas, c’est pourquoi la validation a été faite différemment. Malheureusement le choix du nombre d’échantillons et des concentrations analysées dans la partie pratique ne correspondait pas tout à fait aux informations demandées par le programme de validation. Mais finalement le tout a pu être adapté afin de pouvoir obtenir une validation. L’interprétation de la validation a permis de démontrer que la méthode de dosage fonctionnait très bien pour le THCCOOH et pouvait être validée pour ce métabolite. Par contre, la méthode n’est pas assez sensible pour le dosage du THC ; la limite de quantification et de ce fait l’intervalle de mesure n’ont pas pu être déterminés. Seule une limite de détection de 2 ng/ml a été identifiée. Mais les résultats du THC seront quand même exploités pour l’interprétation des dosages urinaires de l’UMPT.

7.2. Analyse de 150 échantillons d’urine UMPT

7.2.1. Résumé du but Le but de cette seconde partie de travail est d’analyser entre 100 et 300 échantillons d’urine UMPT avec cette nouvelle méthode afin de pouvoir comparer les résultats obtenus avec les deux méthodes.

7.2.2. Discussion Initialement 300 échantillons devaient être analysés. Au final, seul 147 l’ont été, ceci étant dû au fait que la nouvelle méthode est très longue, environ 5 jours, pour préparer les échantillons, les analyser puis traiter les données. Aussi seuls 50 échantillons pouvaient être analysés par série. Avec d’autres éléments perturbateurs, comme les pannes du GC-MS ou les mises à jour informatiques, 6 semaines ont été nécessaires pour obtenir 147 résultats, soit 3 échantillons par individu. La préparation des échantillons s’est chaque fois correctement déroulée. Par rapport à l’analyse, certains échantillons ont dû être analysés sur GC-MS une deuxième fois, car le chromatographe présentait une mauvaise abondance. Au niveau du traitement des résultats, très souvent les pics correspondant au THC devaient être intégrés manuellement car ceux-ci se différenciaient difficilement du bruit de fond. Ces résultats n’auraient pas du être pris en compte, puisque normalement un pic devrait atteindre une hauteur trois fois supérieure à celle du bruit de fond pour être exploitée. Comme la plupart des pics correspondant au THC ne suivaient pas cette règle, j’ai quand même intégré les petits pics pour obtenir des résultats. Après avoir comparé les séries de 3 résultats obtenus pour le THCCOOH pour les mêmes échantillons avec la méthode de routine et la nouvelle méthode, la plupart d’entre eux sont plus ou moins similaires, à part pour 5 individus. Mais il est difficile de se prononcer sur les différences rencontrées.



7.3. Interprétation des résultats avec la nouvelle méthode

7.3.1. Résumé du but Le but de cette dernière étape est de s’assurer que les résultats obtenus sur les échantillons UMPT permettent une meilleure interprétation d’une consommation récente de cannabis.

7.3.2. Discussion Les résultats ont été représentés sous forme graphique avec comme entrées l’interprétation selon le modèle II de Huestis et le taux de THC/créat. détecté. La méthode selon Huestis est sévère et parfois me semble pas correcte par rapport à l’observation des trois concentrations obtenues. Difficile de se fier aux concentrations en THC obtenues, lorsqu’on sait que bien souvent c’est du bruit de fond qui a été intégré pour obtenir un résultat, et que la méthode n’est pas validée. Au final, certains résultats restent difficilement interprétables.

8. Conclusion Ce travail a comporté trois buts :

• Développer et valider une méthode analytique permettant le dosage simultané du THC, THCCOOH et 11-OH-THC, dans le but d’utiliser cette nouvelle méthode en routine. Ce développement inclut une comparaison de l’activité enzymatique de deux enzymes.

• Analyser entre 100 et 300 échantillons d’urines UMPT avec cette nouvelle méthode.

• S’assurer que les résultats obtenus sur ces échantillons permettent une meilleure interprétation d’une consommation récente de cannabis.

A la fin de ce travail, nous réalisons qu’aucun des buts énoncés ci-dessus n’a été entièrement atteint. L’étape de la comparaison enzymatique a pu déterminer que la β-glucuronidase d’E.coli était plus efficace que celle de H.pomatia. Par contre la méthode mise en place n’est pas assez sensible, elle ne détecte pas le 11-OH-THC qui a été écarté, mais aussi elle n’est pas validée pour le dosage du THC. Seul le THCCOOH peut être dosé de façon sûre, ce que la méthode employée en routine fait également. L’un des gros points négatifs mis en évidence est le fait que cette méthode est très longue à réaliser. La préparation des échantillons prend deux jours, l’analyse dure deux jours et deux nuits puis le traitement des résultats est fastidieux et nécessite également deux jours. Etant donné que la plupart des données pour le THC ont été obtenues en intégrant des pics confondus avec le bruit de fond, ces résultats sont peu précis, surtout que la méthode n’est pas validée pour le dosage du THC. Pour les résultats des échantillons UMPT, la méthode devait être initialement testée sur 300 échantillons. Comme la méthode est longue, 147 échantillons ont pu être testés. Les concentrations urinaires en THCCOOH étaient plus ou moins celles attendues, en comparaison avec les valeurs trouvées par la méthode de routine. Par contre, étant donné qu’il n’y avait pas de valeurs de



référence pour le THC, que les résultats ne sont pas précis et hors limite de détection et quantification pour la plus part, il est difficile de se fier à ceux-ci. Après exploitation des différents résultats, il est toujours difficile d’interpréter dans certains cas, s’il y a eu abstinence ou consommation. Il est aussi difficile de se fier aux résultats obtenus avec une méthode non validées pour le THC et cette information supplémentaire n’aide pas vraiment à une meilleure interprétation.

8.1.1. Remarques et conclusion personnelle Le sujet et le but final de ce travail, le faite de développer une méthode de A à Z m’ont tout suite plu et beaucoup intéressé, du faite qu’il s’agissait d’un domaine entièrement nouveau dans lequel je n’avais très peu voir aucune connaissance et tout à apprendre. Aussi car cette méthode développée pouvait avoir une grande influence dans toute cette expertise qu’est le protocole des urines des trois semaines. Cette méthode m’a été présentée comme une méthode révolutionnaire. Malgré ça je ne pensais pas que ce travail allait être autant chargé et plus j’avançais et plus je me rendais compte que la méthode n’était pas si exceptionnelle qu’imaginée. Au moment de la validation, de conclure que seule le dosage du THCCOOH était validé et que pour le THC il ne l’était pas m’a déçu, étant donné tout le travail que j’avais fourni. J’ai quand même dû tester la méthode avec des échantillons urinaires sélectionnés, afin de déterminer si les résultats du THC pouvaient quand même être exploités pour l’interprétation. A mon avis cette partie n’était pas vraiment utile puisqu’il est difficile d’exploiter des résultats dont ont n’est pas sûr du tout. Je pense qu’il aurait été plus utile d’essayer de trouver des alternatives, afin d’améliorer la méthode en faisant des recherches et peut-être des tests pratiques. Pour ma part, je pense que la partie préparation des échantillons est trop longue et qu’il serait possible déjà de la raccourcir en diminuant le temps d’incubation. Puis lors de l’analyse sur GC-MS, introduire une méthode « solvant » afin de raccourcir le temps que l’appareil passe sur chaque solvant qui sépare chaque échantillon. Peut-être essayer un autre appareil plus sensible, par exemple le GC-MSMS. A mon avis, cette méthode n’est actuellement pas utilisable. Même si elle semble bien fonctionner pour le dosage du THCCOOH, la méthode utilisée en routine reste meilleure, puisqu’elle est plus facile à entreprendre et surtout beaucoup plus courte à réaliser. Mais j’espère vraiment que quelqu’un un jour se repenchera sur cette méthode afin de l’améliorer et la rendre fiable et utilisable. Je fini par remercier toutes les personnes qui m’ont soutenues, aidées et sur qui j’ai pu compter, que ce soit au labo de toxicologie, ma famille, mes amis et camarades de la TAB50 et toutes les personnes de mon entourage.



9. Références bibliographiques [1] Institut national de la prévention et de l’éducation pour la santé. (s.d). Drogues et dépendances, [Page Web]. Accès : http://www.drogues-dependance.fr/cannabis_et_dependance.html (page consultée en févier 2011)

[2] Dr Bertschy, G. (1992), ToXicomanie, Recueil à l’usage du médecin (Programme de prévention et de perfectionnement des médecins dans le domaine de la toxicologie (PPMT)), Lausanne : ISPA-PRESSE Dr Gilles Bertschy (livre)

[3]Hesby Nessa, A. (may 2010). Detection and quantification of selected of selected cannabinoids in doping control. Project fort he degree Master of Pharmacy, Department of pharmacy, Faculty of health science, University of Tromsø/ Seibersdorf Labor GmbH, Chemical Analytics, Doping Control Laboratory, Seibersdorf, Austria.

[4] Carcel, J-P (février 2000). CAAT: Conseils, Aide et Action contre la Toxicomanie [Page web]. Accès: http://www.caat.online.fr/drogues/cannabis1.htm (page consultée en février 2011)

[5] Fürst, A (22 juillet 1998). Chanvre info [Page web]. Accès: http://www.chanvre-info.ch/info/fr/Quelle-est-la-dangerosite-du.html (page consultée en février 2011)

[6] Harif, S et Berrais, S (s.d). Le cannabis: une plante réparatrice ou destructice? Une plante différente des autres [Page web]. Accès: http://canna-lvh.e-monsite.com/ (page consultée en février 2011)

[7] Donzé, N et Augsburger, M (avril 2010). Le suivi de la consommation de cannabis: un défi pour le laboratoire [Page web]. Accès: http://www.hopitalvs.ch/fr/ichv/DocumentationDoc/C2010-04_Logo_Tox%20Cannabis_F.pdf (page consultée en février 2011)

[8] Santé Canada, (11.01.2011). Marihuana (marijuana, cannabis) plante séchée pour administration par ingestion ou par d'autres moyens

[Page web]. Accès: http://www.hc-sc.gc.ca/dhp-mps/marihuana/how-comment/medpract/infoprof/index-fra.php#a2_1 (page consultée en janvier 2011)

[9] Harold Kalant, M.D., Ph.D (s.d.). Utilisation du cannabis en médecine [Page web]. Accès: http://membres.multimania.fr/cannastreetbis/info/usage%20medical%201.htm (page consultée en février 2011)

[10] Grotenhermen, F (30 janvier 2004). Pharmacology of Cannabinoids [Page web]. Accès: http://www.greenbridgemed.com/docs/grotenhermen.pdf (page consultée en février 2011)

[11] De Montauzon, E et Me Ros, M (23 octobre 1995). Juris conseil Junior [Page web]. Accès: http://www.jcj.ch/www/index.php/themes/conduite (page consultée en février 2011)



[12] Centre universitaire romand de médecine légale (03.01.2011). Unité de médecine et psychologie du trafic (UMPT) [Page web]. Accès: http://www.curml.ch/curml_home/curml-qui-sommes-nous/curml-umpt.htm (page consultée en février 2011)

[13] Donzé, N et Augsburger, M (2008). Cannabis, haschich & Cie Un enjeu pour l’individu, la famille et la société. Saint-Maurice : éditions Saint-Augustin

[14] Donzé, N et Küffer, H (octobre 2003). Cannabis [Page web]. Accès : http://www.rsv-gnw.ch/fr/ichv/documentation/Pages/Caduceuspardate.aspx (page consultée en mars 2011)

[15] International association for cannabinoid medicines (s.d) [Page web]. Accès: http://www.cannabis-med.org/index.php?tpl=page&id=35&lng=fr (page consultée en 2011)

Documentation interne au laboratoire :

[16] Chromatographie et spectrométrie de masse. Version 1. Ecrit par MD le 08.01.2008.

[17] Cours sur la validation : Données Validation CCCTA, QS-2f et QS-1f. Donné par Serge Rudaz. Cours suivi par MD le 19 et 20.03.10. Figures :

• Page de titre : cannafarmer.blogspot.com (2009). [Page web]. Accès : http://cannafarmer.blogspot.com/2010/07/cannabis-au-volant-la-loi-est-dans-le.html (page consultée en avril 2011)

• Figures 1 et 2 : shémas tiré de : Hesby Nessa, A. (may 2010). Detection and quantification of selected of selected cannabinoids in doping control. Project fort he degree Master of Pharmacy, Department of pharmacy, Faculty of health science, University of Tromsø/ Seibersdorf Labor GmbH, Chemical Analytics, Doping Control Laboratory, Seibersdorf, Austria.

• Figures 3 – 25 : graphes personnels, obtenus avec Excel Articles :

• [18] J.E Manno, K.E. Ferslew, and B.R. Manno. Urine excretion paterns of cannabinoids and the clinical application of the EMIT-d.a.u. cannabinoid urine assay for substance abuse treatment. In : The Cannabinoids : Chemical, Pharmacologic, and Therapeutic Aspects, S. Agurell, W.L Dewey, and R.E. Willette, Eds. Acaademic Press, New York, NY (1984) pp 281-290

• [19] M.A Huestis and E.J. Cone, Differentiating new marijuana use from residual drug excretion in occasional marijuana users. Journal of Anaytica Toxicoogy, vol 22, 445-454 (1998)

• [20] A.A Westin, M.A Huestis, K. Aarstad an dO. Spigset. Urinary excretion o 11-nor-9-carboxy-D9-tetrahydrocannabinol in a pregnant woman following heavy, chronic cannabis use. Journal of Anaytica Toxicoogy, vol 33, 610-614 (2009)



• [21] M.L. Smith, A.J. Barnes and M.A. Huestis, Identifying new cannabis use with urine creatinie-normalized THCCOOH concentrations and time intervals between specimens collections. Journal of Anaytica Toxicoogy, vol 33, 185-189 (2009)



Liens :

• La Convention Unique sur les stupéfiants de 1961 : http://www.incb.org/pdf/f/conv/convention_1961_fr.pdf

• Office fédérale des statistiques (OFS) : http://www.bfs.admin.ch/bfs/portal/fr/index.html

• Ordonnance sur le contrôle routier (OCCR) : http://www.admin.ch/ch/f/gg/pc/documents/1328/Beilage01_SKV_f.pdf

• International conference on harmonisation (ICH) : http://www.ich.org/home.html

• Office fédérale de la santé public (OFSP) : http://www.bag.admin.ch/org/index.html?lang=fr

10. Annexes Annexe 1 : Dosage de THC et métabolites dans l’urine (Hydrolyse avec β-glucuronidase d’Escherichia coli) Annexe 2 : Dosage de THC et métabolites dans l’urine (Hydrolyse avec β-glucuronidase d’Helix pomatia) Annexe 3 : Méthode THCMS201 Annexe 4 : Méthode THCM201 Annexe 5 : Macro Annexe 6 : Résultats du test N°1, avec β-glucuronidase de E.coli Annexe 7 : Résultats du test N°1, avec β-glucuronidase de H.pomatia Annexe 8 : Résultats du test N°2, avec β-glucuronidase de E.coli Annexe 9 : Résultats du test N°2, avec β-glucuronidase de H.pomatia Annexe 10 : Résultats du test N°3, avec β-glucuronidase de E.coli Annexe 11 : Dosage de THC et métabolites dans le sang Annexe 12 : Protocole modifié dosage de THC et métabolites dans l’urine (Hydrolyse avec β-glucuronidase d’Escherichia coli) modifiée Annexe 13 : Dosage de THCCOOH dans l’urine

Annexe 14 : Comparaison entre les résultats des deux méthodes Annexe 15 : Comparaison avec interprétation selon modèle II de Huestis Annexe 16 : Interprétation avec mise en commun des résultats obtenus avec la nouvelle méthode

11. Lexique

11.1. Termes spéciaux Adultération : Pratique frauduleuse consistant en l’ajout d’un produit dans l'intention de modifier les résultats du test.



Cannabinoïde : Composant chimique du cannabis. Cytochrome P450 : Groupe d’enzymes du métabolisme des xénobiotiques, présentes essentiellement dans le foie. Dépendance physique : Etat d’adaptation qui se manifeste par des troubles physiques intenses quand l’administration d’un médicament, d’une drogue, du tabac ou de l’alcool est suspendue. Dépendance psychique : Etat dans lequel une subsatnce produit un sentiment de satisfaction et une pulsion exigeant la prise de la substance pour provoquer le plaisir ou éviter le malaise. Elle comporte un besois compulsif de reprendre la substance. Hydrolyse enzymatique/ basique : Le fait de casser la liaison entre la molécule et le glucuronide (sucre) à l’aide d’une enzyme/ base. Extraction liquide/liquide : Extraction des molécules d’intérêt d’un liquide à l’aide d’un autre liquide (phase organique). Psychoactif : Qui est actif sur le système nerveux. Psychotrope : Qui possède une ou des propriétés dont l’action se fait principalement sur l’activité cérébrale. Stupéfiant : Toute substance toxique, naturelle ou synthétique, agissant sur le système nerveux et dont l’usage plus ou moins prolongé détermine des perturbations graves de la personnalité, une détérioration progressive physique et psychique avec accoutumance et toxicomanie Tolérance : Phénomène d'insensibilisation à une drogue et, plus généralement, aptitude à supporter les effets d'un agent extérieur ou à s'y adapter. Xénobiotique : Substance étrangère à l’organisme vivant.

11.2. Abréviations 11-OH-THC : 11-hydroxy-THC

CB1/CB2 : Récepteur cannabinoïde 1/ récepteur cannabinoïdes 2 CBN : Cannabinole CBD : Cannabidiole Conc. : Concentration CQi : contrôle de qualité interne CURML : Centre Universitaire Romand de Médecine Légale



CYP : Cytochrome P 450 DMSO : Dimethylsulfoxide E.coli : Escherichia coli GC : Chromatographie en phase gazeuse (Gas chromatography) H.pomatia : Helix pomatia LCR : Loi sur la circulation routière LOD : Limite de détection (limit of detection) LOQ : Limite de quantification (limit of quantification) MDV : médicaments et drogues au volant Ml : Millilitre MS : Spectromètre de masse (Mass spectrometry) MTBE : Metyl-tert-butylether ?? MSTFA : N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid Mw : Poids moléculaire (molecular weight) m/z : rapport entre la masse et la charge Ng : nanogramme OCCR : Ordonnance sur le contrôle de la circulation routière OCR : Ordonnance sur les règles de la circulation routière OFS : Office suisse des statistiques OFSP : Office fédérale de la santé publique ONU : Organisation des Nations Unies Rpm : Rotation par minute RT : temps de rétention (retention time) SI : standard interne

SIM : Single ion monitoring

THCA-A : acide tétrahydrocannabinolique

THC : Δ9-tetrahydrocannabinol

THCCOOH : 11-nor-9-carboxy-Δ9-tetrahydrocannabinol

TMS : Trimethylsilyl

UMPT : unité de médecine et psychologie du trafic U1 : première prise urinaire lors de l’expertise des trois jours

U2 : deuxième prise urinaire lors de l’expertise des trois jours

U3 : troisième prise urinaire lors de l’expertise des trois jours

UTCF : Unité de toxicologie et de chimie forensiques

O

OH

COOH

Institut universitaire de Médecine légale

Laboratoire de Toxicologie et de Chimie forensiques

DOSAGE DE THC ET METABOLITES DANS L’URINE (Hydrolyse avec β-

glucuronidase d’Escherichia coli) FA 32

Modifié par : VV, le Autorisé par : MPA, le 20.05.2007 Version : 4

Imprimé le 28.4.2011 Page 1 de 2

Date/ Visa : ___________

ETAPES INFORMATIONS VISA

Droites : Std à 0, 1, 2, 5 (2x), 15, 30 ng/ml de THC/11-OH-

THC, et respectivement à 0, 5, 10, 25 (2x), 75, 150 ng/ml de

THCCOOH.

Pipeter : 0, 1, 2, 5 (2x), 15, 30 μl THC/11-OH-THC [sol. à 1

μg/ml] (S MEL 18);

Pipeter : 0, 5, 10, 25 (2x), 75, 150 μl THCCOOH [sol. à 1

μg/ml] (S C51.1)

Préparées le

-« Blanc-SI » AVEC Urine NEGATIVE

- Droites AVEC Urine NEGATIVE

Sol. THC & 11-OH-THC : _________

Sol. COOH-THC : ________________

100 μl solution THC-D3, 11-OH-THC-D3, THCCOOH-D9

[sol. à 1 μg/ml] (S MEL 32) Préparée le

Evaporer sous azote à T°C ambiante

Ajouter 2 ml urine

Ajouter 50 µl de β-glucuronidase issue d’E. coli

Ajouter 0.8 ml de tampon phosphate 0.8 M pH 7

Incuber à 37°C pendant la nuit puis laisser

refroidir à température ambiante

Ajouter 180 μl KOH 11,8 N (IV b3) Préparé le

Incuber environ 15 min à environ 60° C (bain-

marie sous agitation), laisser refroidir

Ajouter 500 μl acide acétique glacial (III A1b),

vortexer

Lot N°

Ajouter 4 ml de 1-Chlorobutane (I C1a) Lot N°

Agiter environ 10 minutes

Centrifuger environ 10 minutes à 2500 t/minutes

Reprendre la phase organique (=supérieure)


Ajouter 100 μl MSTFA (RD 20) Lot N°

Chauffer environ 15 min à env. 90° C, refroidir

O

OH

COOH







Transférer dans des microvials ou équivalent

Analysé le :_________________ Instrument :

Contrôle du « tune » et du mélange GC-MS

Lecture des résultats

Date :

Remarque(s) :

Préparation Tampon Phosphate à 1 M, pH 4.7 :

12.373 g de Na2HPO4 (heptahydrate) + 4.669 g de NaH2PO4 (monohydrate) dissous dans 100 ml d’eau distillée

O

OH

COOH




glucuronidase d’Helix pomatia) FA 32



Date/ Visa : ___________


Droites : Std à 0, 1, 2, 5 (2x), 15, 30 ng/ml de THC/11-OH-

THC, et respectivement à 0, 5, 10, 25 (2x), 75, 150 ng/ml de

THCCOOH.

Pipeter : 0, 1, 2, 5 (2x), 15, 30 μl THC/11-OH-THC [sol. à 1

μg/ml] (S MEL 18);

Pipeter : 0, 5, 10, 25 (2x), 75, 150 μl THCCOOH [sol. à 1

μg/ml] (S C51.1)

Préparées le



Sol. THC & 11-OH-THC : _________

Sol. COOH-THC : ________________




Ajouter 2 ml urine

Ajouter 50 µl de β-glucuronidase issue d’Helix

pomatia

Ajouter 1 ml de tampon phosphate 1 M pH 4.7

Incuber à 37°C pendant 16 hrs puis laisser






vortexer

Lot N°








O

OH

COOH




glucuronidase d’Helix pomatia) FA 32







Date :

Remarque(s) :



Courbes standard

Coefficients de corrélations

r=0.999 r=0.998 r=0.997 r=0.998 r=0.679 r=0.884

Représentation graphique

THC ion m/z 386 THCCOOH ion m/z 371 11-OH-THC i on m/z 459

THC ion m/z 371 THCCOOH ion m/z 473 11-OH-THC ion m/z 371

0.0

0.2

0.4

0.00 5.00 10.00 15.00

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

313/3

16

Concentrations standards [µg/L]

0.0

1.0

0.00 20.00 40.00 60.00 80.00

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

313/3

22


0.0

0.1

0.00 5.00 10.00 15.00

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

313/3

16


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

0.00 10.00 20.00 30.00

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

328/3

31


0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

0.00 50.00 100.00 150.00

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

357/3

63


0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

0.00 10.00 20.00 30.00

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

358/3

61


Courbes standard


r=0.996 r=0.426 r=0.999 r=0.999 r=0.345 r=0.944




0.0

0.3

0.5

0.00 5.00 10.00 15.00

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

313/3

16


0.0

1.0

0.00 50.00R

ap

po

rt d

es s

urf

aces :

313/3

22


0.0

0.1

0.2

0.00 5.00 10.00 15.00

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

313/3

16


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

0.00 10.00 20.00 30.00

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

328/3

31


0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

0.00 50.00 100.00 150.00

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

357/3

63


0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0.00 10.00 20.00 30.00

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

358/3

61


Courbes standard


r=0.998 r=0.996 r=0.998 r=0.998 r=0.977 r=0.985




0.0

0.3

0.5

0.8

1.0

0 10 20 30

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

386/3

89


0.0

1.0

2.0

0 50 100 150

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

371/3

80


0.0

0.5

1.0

0 10 20 30

Rap

po

rt d

es s

urf

aces 4

59/5

68


0.0

0.2

0.4

0 10 20 30

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

371/3

74


0.0

1.0

2.0

0 50 100 150

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

473/4

79


0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0 10 20 30

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

371/5

38


Courbes standard


r=0.995 r=0.994 r=0.999 r=0.100 r=0.947 r=0.988




0.0

0.3

0.5

0 10 20 30

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

386/3

89


0.0

1.0

2.0

0 50 100 150

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

371/3

80


0.0

1.0

0 10 20 30

Rap

po

rt d

es s

urf

aces 4

59/5

68


0.0

0.2

0.4

0 10 20 30Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

371/3

74


0.0

1.0

2.0

3.0

0 50 100 150Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

473/4

79


0.0

1.0

2.0

3.0

0 10 20 30Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

371/5

38


Courbes standard


r=0.971 r=0.999 r=1.000 r=0.100


THC ion m/z 386 THCCOOH ion m/z 371

THC ion m/z 371 THCCOOH ion m/z 473

0.0

0.3

0.5

0.8

1.0

0 10 20 30

Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

313/3

16


0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

0 100 200 300 400 500 600 700 800 9001000Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

313/3

22


0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

0 100 200 300 400 500 600 700 800 9001000Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

357/3

63


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 10 20 30Rap

po

rt d

es s

urf

aces :

328/3

31


O

OH

COOH

Centre Universitaire Romand de Médecine légale Unité de Toxicologie et de Chimie forensiques

Site de Lausanne

DOSAGE DU THC ET DE SES METABOLITES DANS LE SANG FA 32 204

Modifié par : MD, le 28.02.2011 Autorisé par : CM, le 28.02.2011 Version : 10.1


Date: ___________ Visa : ___________


Prendre les tubes spécialement réservés à cette analyse !

Droites : Std à 0, 0.4, 1, 2, 5 (2x) 10, 20 ng/ml de THC/11-OH-

THC, et respectivement à 0, 2, 5, 10, 25 (2x) 50, 100 ng/ml de

THCCOOH.

Pipeter : 0, 0.4, 1, 2, 5 (2x) 10, 20 μl THC/11-OH-THC [sol. à 1

μg/ml] (S MEL 18);

Pipeter : 0, 2, 5, 10, 25 (2x) 50, 100 μl THCCOOH [sol. à 1

μg/ml] (S C51.1)

Préparées le

Sol. THC & 11-OH-THC : _________

Sol. COOH-THC : ________________

100 μl solution THC-D3, 11-OH-THC-D3, THCCOOH-D9 [sol.

à 0.1 μg/ml pour THC-D3/11-OH-THC D3 et .05 μg/ml pour

THC-COOH-D 9] (S MEL 68)

Préparée le


Ajouter 1 ml sang (échantillons et « Blanc-SI »)

Ajouter 1 ml d’H2O dans la droite

! Peser le sang des échantillons !

Ajouter 200 μl acide acétique 10% H2O (IV a 4) Préparé le

Ajouter 5 ml hexane-acétate d’éthyle (9 :1 v/v) (IV s 10) Préparé le

Vortexer, agiter au maximum 10 min.

Centrifuger 10 min. à 4350 t/min.

Prélever le surnageant


DERIVATISATION

Ajouter 50 μl de MSTFA et 50 μl de ACN anhydre Multipipette OK MSTFA lot n°:

ACN anhydre lot n°:

Vortexer, incuber 20 min à 90°C (étuve ou bloc chauffant)

Laisser refroidir

Transférer dans des microvials ou équivalents

Contrôle du « tune » et du mélange THC Mél THC (20 μl mel 18 + 100 μl mel 68+ 100 μl SC51.1, évaporer

et dérivé avec le MSTF)

Analysé le :_________________ Instrument : IN ___________

Contrôle des « blancs », de la droite et CQ internes.


Date :

Remarques:

O

OH

COOH







Date/ Visa : ___________


Droites : Std à 0, 1, 2, 5 (2x), 15, 30, 75 ng/ml de THC, et

respectivement à 0, 5, 10, 25 (2x), 75, 150, 250, 500, 1000

ng/ml de THCCOOH.

Pipeter : 0, 2, 4, 10 (2x), 30, 60, 150 μl THC/11-OH-THC

[sol. à 1 μg/ml] (S MEL 18);

Pipeter : 0, 10, 20, 50 (2x), 150, 300, 500, 1000, 2000 μl

THCCOOH [sol. à 1 μg/ml] (S C51.1)

Préparées le



Sol. THC & 11-OH-THC : _________

Sol. COOH-THC : ________________




Ajouter 2 ml urine

Ajouter 50 µl de β-glucuronidase issue d’E. coli

Ajouter 0.8 ml de tampon phosphate 0.8 M pH 7

Incuber à 37°C pendant la nuit puis laisser






vortexer

Lot N°








O

OH

COOH











Date :

Remarque(s) :



O

OH

COOH



DOSAGE DE THCCOOH DANS L’URINE FA 32 205

Modifié par : CM, le 15.05.2007 Autorisé par : MPA, le 20.05.2007 Version : 4


Date/ Visa : ___________


200 μl THCCOOH-D9 [sol. à 1 μg/ml] (S C59.1)

=> 100 ng/ml de THCCOOH-D9

Préparé le

Droite : 0, 5, 50 (2x), 100 ng/ml THCCOOH

Pipeter : 0, 10, 100 (2x), 200 μl THCCOOH [sol.

à 1 μg/ml] (S C51.1)

Préparé le


Ajouter 2 ml urine Dilution U/5 et U/1 pour UMTR, à simple





vortexer

Lot N°












Date :

Remarque(s) :

Conc. THCCOOH [ng/ml] Nouvelle méthode U1



Conc. THCCOOH [ng/ml] Méthode de routine U1



Individu 1 43109 43208 43305 326.9 202.6 22.3 674.2 333.6 71.2

Individu 2 42744 42838 42997 63.5 24.2 35.0 88.2 26.2 46.0

Individu 3 43212 43308 43428 72.5 5.8 5.6 ND 7.5 3.6

Individu 4 43118 43214 43316 16.3 20.7 8.7 31.1 19.8 10.3

Individu 5 43429 43531 43619 110.6 71.1 ND 100.0 24.1 6.5

Individu 6 57866 57974 58117 596.5 24.6 27.2 438.3 49.4 24.2

Individu 7 55759 55895 56026 54.0 45.9 36.7 82.1 21.5 ND

Individu 8 54831 54967 55070 127.5 20.9 15.0 902.6 117.2 69.6

Individu 9 52827 52935 53053 627.0 181.4 161.8 752.5 234.3 208.5

Individu 10 49887 49969 50059 20.2 16.0 43.4 25.4 15.9 8.8

Individu 11 50161 50260 50387 137.1 114.5 111.5 140.1 115.9 110.1

Individu 12 58376 58512 58655 289.4 25.7 10.3 314.8 27.9 10.7

Individu 13 45191 45294 45402 38.2 24.1 9.2 44.1 22.5 8.3

Individu 14 56480 56611 56757 37.4 17.1 18.5 37.3 ND ND

Individu 15 45043 45101 45206 20.6 48.4 57.0 20.6 49.2 68.0

Individu 16 53620 53711 53835 29.4 48.1 47.1 ND 45.2 56.3

Individu 17 52697 52832 52939 23.0 8.4 290.9 22.5 22.8 252.2

Individu 18 45514 45624 45718 51.5 568.8 870.9 146.2 647.1 1118.2

Individu 19 55161 55276 55402 101.8 49.5 42.1 123.3 43.0 26.2

Individu 20 57363 57508 57639 265.1 45.9 24.4 358.5 46.9 41.0

Individu 21 57751 57875 57984 512.0 225.5 367.5 759.4 356.3 617.9

Individu 22 46299 46394 46516 78.9 41.2 120.3 48.1 19.7 101.4

Individu 23 48128 48247 48431 94.8 80.3 52.5 105.9 77.8 38.1

Individu 24 56900 57059 57168 11.1 9.0 8.9 10.2 7.4 6.0

Individu 25 43930 44057 44133 1736.0 117.2 ND 1390.9 332.9 182.8

Individu 26 46732 46842 46970 158.0 51.6 24.1 164.8 51.0 26.5

Individu 27 44814 44947 45042 40.6 44.1 38.5 42.0 51.5 44.3

Individu 28 52711 52849 52957 199.4 139.7 290.0 194.4 152.6 282.6

Individu 29 57748 57874 57983 45.2 38.0 28.9 44.6 36.9 26.2

Individu 30 58386 58520 58670 887.6 511.4 647.1 864.2 557.1 764.9

Individu 31 45518 45622 45720 320.9 97.5 66.4 366.9 107.2 110.9

Individu 32 51332 51550 51688 58.2 43.9 81.2 89.8 36.7 78.8

Individu 33 47698 47817 47940 83.6 30.6 18.1 117.2 30.9 12.0

Individu 34 45921 46038 46164 596.5 687.6 365.1 752.0 745.5 427.6

Individu 35 53821 53951 54060 747.5 287.6 498.9 577.2 258.2 508.1

Individu 36 51164 51334 51553 101.8 37.3 45.7 101.5 36.5 24.1

Individu 37 52316 52459 52578 59.2 20.6 15.5 54.5 18.0 12.8

Individu 38 52074 52208 52334 204.0 65.8 32.0 236.1 65.2 29.7

Individu 39 47689 47816 47930 613.8 862.5 44.1 721.5 822.2 42.4

Individu 40 57503 57632 57745 50.9 51.4 156.0 41.3 43.7 120.6

Individu 41 52699 52833 52942 68.3 44.2 31.6 53.7 34.1 29.0

Individu 42 57494 57622 57737 197.3 125.2 252.1 290.9 153.8 277.8

Individu 43 49551 49657 49786 93.0 58.2 47.6 102.6 53.3 52.8

Individu 44 46507 46657 46746 50.4 125.5 38.6 47.8 110.1 35.2

Individu 45 45627 45725 45822 40.9 50.9 253.8 45.3 52.0 288.9

Individu 46 44800 44932 45031 47.1 29.6 21.6 59.3 34.6 36.0

Individu 47 56889 57051 57161 11398.5 688.5 39.1 687.0 653.8 737.9

Individu 48 48429 48544 48603 106.7 71.5 56.7 151.1 96.2 69.2

Individu 49 56887 57047 57160 55.2 34.8 29.2 56.1 37.8 29.4

nouvelle méthode

U2/U1

Si U2/U1>0.5 = consommation

nouvelle méthode

U2/U3


ancienne méthode

U2/U1


ancienne méthode

U3/U2


Individu 1 0.62 consommation 0.11 0.49 0.21

Individu 2 0.38 1.45 consommation 0.30 1.76 consommation

Individu 3 0.08 - ND 0.48

Individu 4 1.27 consommation 0.42 0.64 consommation 0.52 consommation

Individu 5 0.64 consommation 0.00 0.24 0.27

Individu 6 0.04 1.11 consommation 0.11 0.49

Individu 7 0.85 consommation 0.80 consommation 0.26 ND



Individu 10 0.79 consommation 2.71 consommation 0.63 consommation 0.55

Individu 11 0.84 consommation 0.97 consommation 0.83 consommation 0.95 consommation

Individu 12 0.09 0.40 0.09 0.38

Individu 13 0.63 consommation 0.38 0.51 consommation 0.37

Individu 14 0.46 1.08 consommation ND ND


Individu 16 1.64 consommation 0.98 consommation ND 1.25 consommation

Individu 17 0.37 34.63 consommation 1.01 consommation 11.06 consommation





Individu 22 0.52 consommation 2.92 consommation 0.41 5.15 consommation

Individu 23 0.85 consommation 0.65 consommation 0.73 consommation 0.49

Individu 24 0.81 - 0.73 0.81

Individu 25 0.07 ND 0.24 0.55 consommation

Individu 26 0.33 0.47 0.31 0.52 consommation






Individu 32 0.75 consommation 1.85 consommation 0.41 2.15 consommation






Individu 38 0.32 0.49 0.28 0.46









Individu 47 0.06 0.06 0.95 consommation 1.13 consommation



Annexe 16 Interprétation avec mise en commun des résultats obtenus avec la nouvelle méthode

Individu 1 THC > LOD

Interprétation générale:

U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 326.9 202.6 22.3 0.62 0.11

THC/créat 3.5 2.7 ND

N°1: Consommation N°3: pas d'interprétation

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NONTHC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

THC U2

OUI NON

OUI

NON

Individu 2


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 63.5 24.2 35 0.38 1.45

THC/créat 1.2 ND 1.3

N°2: Abstinence N°1: Consommation

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 3


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 72.5 5.8 (< 14) 5.6 (< 14) 0.08 < 14 ng/ml

THC/créat ND ND ND

N°2: Abstinence N°2: Abstinence

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 4


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 16.3 20.7 8.7 (<14) 1.27 0.42

THC/créat ND 1 ND

N°1: Consommation N°2: Abstinence

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 5


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 110.6 71.1 ND 0.64 ND



THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 6


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 596.5 (h.l.l) 24.6 27.2 0.04 1.11

THC/créat 2.4 ND ND

N°2: Abstinence N°4: pas d'interprétation

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 7


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 54 45.9 36.7 0.85 0.8

THC/créat ND ND ND

THC U3

OUI NON

OUI

NON

N°4: pas d'interprétation

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON


Individu 8


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 127.5 20.9 15 0.16 0.72


N°2: Abstinence N°1: Consommation

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 627 (h.l.l) 181.4 161.8 0.29 0.89


N°3: pas d'interprétation N°4: pas d'interprétation

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U3THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 10


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 20.2 16 43.4 0.79 2.71

THC/créat ND ND 1

N°4: pas d'interprétation N°1: Consommation

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 11 THC > LOD THC > LOD


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 137.1 114.5 111.5 0.84 0.97

THC/créat 3.1 3.2 4.3

N°1: Consommation N°1: Consommation

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 12


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 289.4 25.7 10.3 (< 14) 0.09 0.4


N°3: pas d'interprétation N°2: abstinence

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 13


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 38.2 24.1 9.2 (<14) 0.63 0.38

THC/créat 1 ND ND

N°4: pas d'interprétation N°2: abstinence

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 37.4 17.1 18.5 0.46 1.08

THC/créat 1.4 3.4 1.2


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 20.6 48.4 57 2.35 1.18

THC/créat 2 3 3.1


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 29.4 48.1 47.1 1.64 0.98

THC/créat ND 1.6 3.5


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 23 8.4 (<14) 290.9 0.37 34.63

THC/créat 2.3 1.7 6.1


THC U3

OUI

NON

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 51.5 568.8 (h.l.l) 870.9 (h.l.l) 11.04 1.53

THC/créat ND 9.4 10


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 19


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 101.8 49.5 42.1 0.49 0.85



THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 265.1 45.9 24.4 0.17 0.53

THC/créat 3.1 1.3 2.2


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 512 (h.l.l) 225.5 367.5 0.44 1.63

THC/créat 7.9 6 9.7


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 22


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 78.9 41.2 120.3 0.52 2.92

THC/créat ND ND ND


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 94.8 80.3 52.5 0.85 0.65

THC/créat 1.7 3.2 3.2


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 24


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 11.1 (< 14) 9 (<14) 8.9 (<14) <14 gn/ml <14 gn/ml

THC/créat ND ND ND

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

N°2: Abstinence

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

N°2: Abstinence



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 1736 (h.l.l) 117.2 ND 0.07 ND

THC/créat 9.4 4 ND

N°3: pas d'interprétation N°2: Abstinence

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 26


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 158 51.6 24.1 0.33 0.47

THC/créat 2 ND ND

N°2: Abstinence N°2: Abstinence

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 27


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 40.6 44.1 38.5 1.09 0.87

THC/créat ND ND ND


OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U3THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 199.4 139.7 290 0.7 2.08



THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 45.2 38 28.9 0.84 0.76



THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 887.6 (h.l.l) 511.4 (h.l.l) 647.1 (h.l.l) 0.58 1.27

THC/créat 5.7 5.2 3.4


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 31


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 320.9 97.5 66.4 0.3 0.68

THC/créat ND ND ND


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 32


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 58.2 43.9 81.2 0.75 1.85



THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 33


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 83.6 30.6 18.1 0.37 0.59

THC/créat ND ND ND


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 34


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 596.5 (h.l.l) 687.6 (h.l.l) 365.1 1.15 0.53



THC U3

OUI

NON

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 747.5 (h.l.l) 287.6 498.9 0.38 1.73

THC/créat 5 3.3 7


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 36


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 101.8 37.3 45.7 0.37 1.23

THC/créat ND ND ND

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON


THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

N°2: Abstinence

Individu 37


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 59.2 20.6 15.5 0.35 0.75

THC/créat ND ND ND


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 38


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 204 65.8 32 0.32 0.49

THC/créat 2.6 1.6 1.2


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 613.8 (h.l.l) 862.5 (h.l.l) 44.1 1.41 0.05



THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 40


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 50.9 51.4 156 1.01 3.04



THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 68.3 44.2 31.6 0.65 0.71

THC/créat 2.6 2.3 1.7


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 42


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 197.3 125.2 252.1 0.63 2.01



THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 93 58.2 47.6 0.63 0.82

THC/créat 2.5 3.6 1.7


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 44


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 50.4 125.5 38.6 2.49 0.31

THC/créat ND 1.8 ND


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 45


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 40.9 50.9 253.8 1.24 4.99

THC/créat ND ND ND


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 46


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 47.1 29.6 21.6 0.63 0.73

THC/créat ND ND ND


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON



U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat

11398.5

(h.l.l)688.5 (h.l.l) 39.1 0.06 0.06


N°3: pas d'interprétation N°2: Abstinence

NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U3

OUI

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

Individu 48


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 106.7 71.5 56.7 0.67 0.79

THC/créat ND ND ND

THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON


THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON


Individu 49


U1 U2 U3 U2/U1 U3/U2

THCCOOH/créat 55.2 34.8 29.2 0.63 0.84

THC/créat ND ND ND


THC U3

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U3

/U2

>0.5

OUI

NON

THC U2

OUI NON

THC

CO

OH

/cré

at

U2

/U1

>0.5

OUI

NON

(h.l.l)

< 14

THC > LOD

hors limite suppérieure de linéarité, mais considéré comme positif

THCCOOH dosé à une concnetration inférieure à 14 ng/ml, soit négatif selon Huestis

Valeur de THC supérieure à la limite de quantification qui est de 2 ng/ml

Documents

Développement et création d’une méthode permettant … · dérivatisation avec MSTFA et finalement un dosage par chromatographie en phase ... protocol’s urines, besides THCCOOH,