Directeur de Thèse: Dr. Sabine CARPIN, LBLGC Université d’Orléans

Co-encadrement: Dr. Audrey OUDIN , BBV Université de Tours

Identification et caractérisation de facteurs de transcriptions appartenant à la famille des régulateurs de réponse de type B, impliqués dans la réponse à

la sécheresse chez le peuplier

Laboratoire de Biologie des Ligneux et des Grandes Cultures - UPRES EA 1207

par

Inès DJEGHDIR

Problématique de l’équipe d’accueil du LBLGC Equipe ARCHE 3 équipes dont l’équipe ARCHE: Arbres et Réponses aux

Contraintes Hydriques et Environnementales

Réponse des arbres aux contraintes environnementales:

Différentes approches:EcophysiologiqueÉpigénétiqueProtéomiqueSignalisation Voie commune aux végétaux et

aux levure: Phosphorelais Multiple

sécheressepeuplier

Le phosphorelais multiple

3 partenaires:

Récepteur ou Histidine-aspartate Kinase : HK

Protéines de relais de phosphate ou Histidine Phosphotransfer protein : HPt

Régulateurs de Réponse : RR RR

HPt

N

C

H

D

Partenaires du phosphorelais multiple chez Populus sp.

10 HPt

12 RR-B

Chefdor et al., 2006, Bertheau et al., 2012, Héricourt et al., 2013

Paroi cellulaire

Membrane plasmique

Noyau

N

C

H

HK1

D

N

C

N

C

H

HK1

D

N

C

Cytokinines

1 HK22 HK32 HK4

N

C

H

D

NH

C

D

Contrainte osmotique

Partenaires du phosphorelais multiple chez Populus sp.

RR-B

Paroi cellulaire

Membrane plasmique

Noyau

Contrainte osmotique

N

C

H

HK1

D

N

C

N

C

H

HK1

D

N

C

P

P

Chefdor et al., 2006, Bertheau et al., 2012, Héricourt et al., 2013

HPt

HPt P

HPt

Etat de l’Art au laboratoire

HK1 analogue de AHK1 d’Arabidopsis (Chefdor et al., 2006)

Récepteur HK1 isolé = osmosenseur potentiel (Chefdor et al., 2006)

capable de dimériser (Héricourt et al., 2013)

H

AHK1

D

N

C

H

HK1

D

N

C

65% d’identité

82% de similarités

Etat de l’Art au laboratoire 3 HPt sont les partenaires préférentiels de HK1 (Héricourt et al., 2013)

HPt 2, 7 et 9 sont les HPt majoritairement impliquées dans l’osmosensing

Etat de l’Art au laboratoire Les 8 RR-B isolés interagissent avec les 3 HPt précédentes (Bertheau et

al., 2012)

Ces RR sont-ils fonctionnels chez le Peuplier?

Stage de Master II Choix du RR13 :

Homologue Arabidopsis : rôle prépondérant dans le développement de la plante

Chez Peuplier : RR le plus fortement exprimé et présentant de fortes interactions avec les 3 HPt partenaires de HK1 (Bertheau et al., 2012)

importance probable de ce RR

Stratégie de recherche:

Evaluer la fonctionnalité du RR13 Fixation du GARP-RR13 sur l’ADN Activation de la transcription de gènes régulés par la contrainte

osmotique: HK1 et dhn1

Caractériser la régulation de l’expression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte osmotique

Stage de Master II Stratégie de recherche:

Evaluer la fonctionnalité du RR13 Fixation du GARP-RR13 sur l’ADN

CC

N N

Domaine receveur : Motif DDK

Domaine GARP, fixation à l’ADN : reconnaissance de boites spécifiques chez Arabidopsis (Sakai et al., 2000 ; Sakai et al., 2001)

Domaine de transactivation

Evaluer la fonctionalité du RR13Fixation du GARP-RR13 sur l’ADN

AV0+ -

AV0 GST-GARP : + -

ERF+ -

ERF + -

Fixation spécifique sur les sondes AVO et AV2 possédant des boites spécifiques

Evaluer la fonctionalité du RR13Activation de la transcription de gènes régulés par la contrainte osmotique: HK1 et dhn1

Test de transactivation d’un gène de RRA Arabidopsis (ARR6) par fixation du RR13 sur son promoteur (ARR2 (RR-B) d’ Arabidopsis utilisés en contrôle)

Augmentation de l’activité du promoteur ARR6 avec le même niveau d’efficacité que le contrôle positif (ARR2)

Le RR13 est un facteur de transcription fonctionnel

prom ARR6 35S-ARR2 35S-RR130

2

4

6

8

10

12

Acti

vité

rela

tive

Luc/

Gus p

ar m

g de

pro

téin

e

* *

Luc

ARR2 RR13

Promoteur ARR6

Caractériser la régulation de l’expression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte

osmotique

T0 T15

T30

T45

T65

T80

T95T1

10T1

30T1

45T1

60T1

75T1

90T2

05T2

20T2

35T2

50T2

65T2

80T2

95T3

10T3

25T3

40T3

550.0

100.0

200.0

300.0

400.0

500.0

600.0

700.0

Cond

ucta

nce

stom

atiqu

e(m

mol

es H

2O m

-2 s-1

)

Temps (min)

* **

***

*** ***

Diminution de la conductance stomatique = fermeture des stomates, perception de la contrainte et mise en place d’une réponse

Caractériser la régulation de l’expression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte

osmotique

T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T3600

0,5

1

1,5

2

2,5

Expression de HK1 dans les feuilles au cours du temps

**

** **

0

5

10

15

20

25

30

****

*****

** ****

**

T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T360

Expression de HK1 dans les racines au cours du temps

0

5

10

15

20

25

30

T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T360

Expression du RR13 dans les racines au cours du temps

**

*

***** **

*** * **

0

2

4

6

8

10

T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T360

*

***

****** *

* ***

Expression du RR13 dans les feuilles au cours du temps

Objectifs :

1. Identification des RR de type B spécifiquement impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique

2. Caractérisation de l’activité transcriptionnelle des RR de type B candidats

3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels

Projet de recherche

Identification des RR de type B spécifiquement impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique

Technique: qPCR sur les 8 RR-B sur des échantillons stressés

Projet de recherche

Caractérisation de l’activité transcriptionnelle des RR de type B candidats

Techniques: - Gel retard ou EMSA

- Délétion de promoteurs et mutagénèse des boites de fixation

Projet de recherche

+GARP

?

Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels

Techniques: Double hybride après criblage de banque ou interaction ciblée

Projet de recherche

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