1

Dissémination viralede cellule à cellule

Igakura 2003

2 Voies d’infection virale

Voie « classique »

Voie « alternative »

Virions libres qui diffusent dans le milieu ext

Virions qui passent directement d’une celluleà une autre

2

Pourquoi le passage de cellule à cellule?

Echappement à la réponse immunitaire

Passage des barrières tissulaires « étanches »

Rapidité

muqueuses

Efficacité de transmission dans l’individu infecté

Ac neutralisants, complément

Multiplication dans les tissus où contacts cellulaires étroits

Système nerveux, organes lymphoïdes, surfaces épithéliales

Quelques exemples de virus enveloppés

•1ère partie: les Rétrovirus: HTLV-I et HIV-1

La notion de synapse virologique

• 2e partie: les Herpèsvirus:

HSV-1, PRV Passage de neurones à neurones ou de neurones à cellule épithéliale

MDV Un herpèsvirus atypique?

3

1ère partie:HTLV-I et HIV

La synapse virologique

Rappels sur lesétapes tardives ducycle de réplication

des RétrovirusARNm env

épissé

Glycoprotéinesd’enveloppe

Ψ

ARNm génomiquenon épissé

Ψ+

PrécurseursGag et

Gag-Pol

Maturation

Golgi

Assemblage

Transportdes ARN

Transcription / épissage

Bourgeonnement

RE

Traduction

Noyau

_

SUgp120/gp46TMgp41/gp21

Prot d’enveloppe env

Prot de capside gag

MAp17/p19P6CAp24NCp7

PRp12

Prot enzymatiques pol

INp32RTp66

2 copies d ’ARNsimple-brin positif

?

HIV-1/HTLV-I

4

Exemple du virus HTLV-I

L’infection par le virus HTLV-I

- Leucémie T de l’adulte (ATL)1-2% des individus infectés HTLV-Iindividus agés 40-60 ans (incubation xs 10e d ’années)facteur de risque: infection périnatale, sexetumeur généralement monoclonale (provirus intégré dans un seul site)

- Myélopathie Associée à HTLV-I (HAM) ou Paraparésie Spastique Tropicale (TSP) 2-3% des individus infectées HTLV-ISyndrome inflammatoire

Isolé par R ". Gallo aux U.S.A. à partir des lymphocytes T du sang périphérique d ’unpatient atteint d ’un lymphome cutané (Poiesz 1980 PNAS vol77 P7415)

2 TYPES DE PATHOLOGIE

ENDEMIQUE Japon, Caraïbes, Amérique latine, Mélanésie, Afrique centrale

5

Transmission du virus HTLV-I chez l’homme

Mode de transmission

- Périnatale par l’allaitement (lymphocytes du lait)- Sexuelle (lymphocytes du sperme)- Transfusion sanguine (lymphocytes du sang) Dépistage obligatoire depuis 1991- Aiguilles contaminées (lymphocytes du sang ) (toxicomanes++)

TOUJOURS ASSOCIE A DES CELLULES

==> PréventionEx: Transfusion sans cellules

Transmission du virus HTLV-I en culture cellulaire

Une transmission efficace du virus nécessite un contact cellulaireMécanisme?

Infection par co-culture

Production de particules virales libres

- Lymphocytes T naturellement infectées ne produisent pas de virions- Cellules productrices:

cellules transfectées et certaines lignées T chroniquement infectées 1 virion infectieux / 105-106 (Fan et al. 1992; Derse et al. 2001)

A partir de:- Lymphocytes T naturellement infectées- Certaines lignées T chroniquement infectées- cellules transfectées par le génome proviral

6

Polarisation des protéines viralesdans la zone de contact cellulaire

Lymphocytes T i HTLV-ILymphocytes T non i

Contact40 min

en suspension

Attachement des cellules sur lamelle

Recherche de « Conjugés »et

Examen parMicroscopie confocale

(Env, Gag MAp19 ou NCp15, talin)

Igakura et al. Science 2003 , 299: 1713-1716

Gagp19 Env gp46

Au niveau de la jonction cellulaire:- Polarisation de Gag et Env- Gag et la taline s’accumulent dans des régions différentes

Cellules fraîches de patients HAM/TSP

Gagp15 Talin

Passage de matériel génétique viraldans la cellule initialement non infectée

Igakura et al. Science 2003 , 299: 1713-1716

Lymphocytes T i HTLV-ILymphocytes T non i

Contact40 min

Cellules fraiches de patients HAM/TSP Genome HTLV-I

5µm

Contact120 min

Cellules fraiches de patients HAM/TSP

+ CFDA-SE

Cellules T CD4+non i

Recherche de « Conjugés » et FISH et Examen parMicroscopie classique ou confocale (genome HTLV-I)

* *

*

Le génome HTLV-I s’accumule à la jonction cellulaire, puis est transféré dans la cellule cible

7

Réorientation du MTOC dans les cellules infectéesHTLV-I vers la jonction cellulaire

Igakura et al. Science 2003 , 299: 1713-1716

Lymphocytes T i HTLV-I Lymphocytes T non i

Contact40-120min

en suspension

Attachement des cellules sur lamelle

Recherche de « Conjugés »et

Examen parMicroscopie confocale

(Gag p19 et tubulin)

Cellules fraiches de patients HAM/TSP

Gag p19 Tubuline

De plus…

Le Nocodazole inhibe l’accumulation de Gag à la jonction cellulaire. Le transport de Gag à la jonction cellulaire est donc dépendant des MTs. Igakura et al. Science 2003 , 299: 1713-1716

La réorientation du MTOC est associé à un contact cellule-celluleengageant ICAMI/LFA1 . Elle est associée à l’infection HTLV-I etpotentialisée à TaxNejmeddine et al. JBC 2005 , 280: 29653-29660

8

La notion de synapse virologique (VS)

- Analogie avec la synapse immunologique

- Interaction cellulaire étroite entre lacellule infectée et la cellule cible

- Dépendante du cytosquelette (actine etMTs)

- Formée en réponse à l’infection virale

- Engage des molécules virales et desmolécules cellulaires (ex: protéinesvirales de surface et ligands cellulaires)-Réorganisation en « Microdomaines ».

- Permet un transfert rapide deséléments viraux de la cellule infectée à lacellule réceptrice

Résumé du passage trans-cellulaire de HTLV-IIgakura et al. Science 2003 , 299: 1713-1716

9

Comment le génome viral HTLV-Iva-t-il être transféré? 2 hypothèses.

Dustin Nature Cell Biol. 2003 , 5: 271-72

Passage direct des cores nucléoprotéiques non enveloppé

Récepteur(s)

Molécules d’adhérence

EnvGag

Passage par bourgeonnement des particules enveloppées dans l’espace synaptique

HIV-1 et synapse virale

10

Protéines virales et cellulaires impliquéesdans l’entrée du VIH-1

« T-tropic » « Dual-tropic » « M-tropic »

CD4+CXCR4+

CD4+CXCR4+CCR5

CD4+CCR5+

Lignée T Cellule T primaire Macrophage

SouchesHIV-1

CellulesciblesProtéines cellulaires

Protéines virales

HIV-1 se transmet également au seind’une synapse virologique

Jolly et al. J. Exp. Med. 2004, 199: 283-293

Polarisation des récepteurs (CD4 et CXCR4) et de Env Lymphocytes T Jurkatt LAI= cellules effectrices

Lymphocytes T CD4 primaires = cellules cibles

Contact30min

en suspension

CD4 Env gp41

Recrutement de Taline et de LFA-1 à la jonction cellulaire

Taline Env gp41 LFA-1 Env gp41

Concentration de Gag à la jonction cellulaire

10µm

11

Pour HIV-1, la formation de lasynapse virologique nécessite Env

Env nécessaire pour la polarisation des récepteurs viraux

Ac; bloque interaction CD4-gp120Ac; bloque interaction gp120-CXCR4 (pas CD4)Petite mol; bloque interaction gp120-CXCR4

Jolly et al. J. Exp. Med. 2004, 199: 283-293

Pour HIV-1, la formation de lasynapse virologique est dépendante de l’actine

Le recrutement des récepteurs et des molécules d’adhésion dans la synapseimmunologique est un processus dépendant de l’actineDustin et Cooper Nature Immunology. 2000, vol1: 23-29

Jolly et al. J. Exp. Med. 2004, 199: 283-293

La polarisation de Env et de CD4 est dépendante du remodelage de l’actineCD4-Env

% conjugués polarisation Env-CD4

Cytochalasine

Latrunculine

Jasplakinolide

- (réduit); 0 (blocage); + (inchangé)

-

0

+

-

0

0

La polarisation de Env et de CD4 est un processus rapide (en 10min dans40% des conjugués).

12

Le passage des éléments HIV-1 d’une cellule à l’autre.

Bourgeonnement dans l’espace « synaptique » ? Jolly et Sattentau Traffic 2004 , 5: 643-50

2ème partie:Les Herpèsvirus

13

Herpèsviridae:Maladies et tropisme cellulaire

Gammaherpesvirus- Epstein-Barr virus (EBV)

Betaherpesvirus- Cytomegalovirus humain (hCMV)

Alphaherpesvirus

-Herpes simplex virus type 1 (HSV-1)

-Varicella-zoster virus (VZV)

- Virus de la pseudorage (PRV)

- Virus de la maladie de Marek (MDV)

Virus

Malformations congénitalesmaladie opportuniste chezles immuno-déprimés

Hô

Lymphocytes BMononucléose infectieuse,divers lymphomesHô

Cellules épithéliales,neuronesLeucocytes, neurones

Cellules épithéliales,neurones

Lymphocytes T, B

Lésions muqueuses(Peau, yeux),encéphaliteVaricelle (vésicules),encéphalite

Encéphalites (porcelet)

Lymphomes T

Hô

Hô

Porc

Poulet

TropismeMaladieHôte

Quelques évidences du passage privilégié desherpesvirus de cellule à cellule

- Virus très associés aux cellules (VZV, MDV > HSV-1, PRV)

- Accumulation de particules dans le cytoplasme et à la surface des cellules

- Réplication essentiellement dans des cellules fortement polarisées ou ayantde forts contacts cellulaires: épithéliums, neurones, lymphocytes.

- Faible efficacité des Ac vis-à-vis de la progression de l’infection (in vitro etin vivo )

14

Physio-pathologie de l’infection naturelle

muqueuse

Primo-infection

Entréeen

latence

Réactivation

Ganglions nerveux

Neurones sensitifs

Primo-infection:InapparenteBénigneGrave

Système nerveux périphérique

Système nerveux central(encéphalite)

Rare (+++ porcelet à la mamelle)

ggl trigéminé et dans les ggl sensoriels

Ex: PRV chez le porc

Différentes voies de passage dans les conditionsnaturelles

« Principles of virology », Flint et al., 2nd ed.

- Passage de cellule épithéliale à cellule épithéliale

- Passage de cellule épithéliale à neurone (sensitif)

- Passage de neurone à neurone (SNP--> SNC)

- Passage de neurone (sensitif) à cellule épithéliale

ex: HSV1 et PRV

15

Modèles d’étude du neurotropisme de PRV et HSV-1

Virus Hôte Naturel Tropisme d’Hôte ModèleHSV-1 Homme Etroit souris (intracérébral, œil)

PRV Porc Large (zoonose) œil de ratinfection IN de sourisflanc (peau)infection IN de porc

Nombreux systèmes d’étude pour le PRV

Exemple du modèle d’infection de la sourispar voie intranasale avec le PRV

(ganglion cervical supérieur)(EN: Sup cervical ggl neurons)Situé dans le cou

GG: Ganglion de GasserSSN: noyau salivaire supérieurSp5: noyau spinal trigéminalPG: ganglion ptérygopalatinIML: noyau inetrmédiolatéralSystème nerveux autonome: sympatique et parasympatique

Flamand et al. Virologie 1998 , vol2: 52-66

Présence du PRV dans les tissus nerveux(peu avant la mort); en 50h avec WT

Ggl de Gasser Ggl Cerv Sup

Coupe de cerveauau niveau Sp5 (flèche)

Coupe de la MEau niveau IML (flèche)

(flèche)

100µm

InfectionMassive12-18hpi

Infection Très localisée30hpiCulture primaires de neurones

périphériques à partir d’embryons derat ou de souris de 15 jours

PRV chez la souris: passage trans-neuronal

entre neurones connectés

INOCULATION

16

Passage du PRV duneurone à la cellule épithéliale

Système in vitro permettant l’étude du passageneurone-cellule épithéliale

Chambre de Campenot:3 compartiments isolés Corps cellulaire axone Neurite / cellules réceptrices

non-neuronales

Methylcellulose

Soma M Neurite

INFECTION

antérograde

rétrograde

Ch’ng et Enquist JVI 2005 vol.79 p10875-89

Neurones primaires de rat du ganglion cervical supérieur

17

Validation du système pour l’étude du passage decellule à cellule du PRV

S M NINFECTIONForte moiPRV Becker

Ch’ng et Enquist JVI 2005 vol.79 p10875-89

S M NINFECTIONJ2 Forte moi

+ CellulesRéceptrices

J1

Pas de relargage de particulesinfectieuses au niveau des axonestardivement après infection

Titrage du surnageant à ≠ t

Titrage du surnageant à ≠ t

Titrage du Surnageant48h pi

Titrage du Surnageant48h pi

Mise en évidence du passage du PRVde neurone à cellule non neuronale

Eléments essentiels et non essentiels pour le passagede PRV de neurones à cellules non neuronales (1)

Axone nécessaire au transport

gD non essentielle

Indirecte

directeINFECTIONavec virions gD nulproduit dans une lignéetranscomplémentante

RECHERCHE 24h pi:-virions libres (titrage)- PK15 infectées

PK15

Ch’ng et Enquist JVI 2005 vol.79 p10875-89

Les particules virales libres ne seraient pas nécessaire pour ce passage trans-cellulaire

18

Le virus mutant Bartha, un mutant essentielpour l’étude des bases moléculaires

de la dissémination du PrV de cellule à cellule

- Réplication efficace dans les lignées cellulaires

- Vaccin vivant atténué, utilisé en médecine vétérinaire

- Délétion unique dans le génome (gE, gI et US9)

- Tue les animaux de laboratoire mais plus lentement que WT

- Ne se dissemine dans les neurones que dans le sens rétrograde

Sens de dissémination p/r à celui de l’influx nerveux:Antérograde: pré => post-synaptiqueRétrograde: post => pré-synaptique

- gE, gI et US9 affecte la dissémination dans les neurones et entre neurones, uniquement dans le sens antérograde en culture- Gènes viraux impliqués dans la dissémination dans le sens rétrograde ?

Eléments essentiels et non essentiels pour le passagede PRV de neurones à cellules non neuronales (2)

Sche Bartha (gE-gI-US9) vs délétion de gE, gI ou US9

- Les mutants gE, gI et US9 sont seulement partiellement défectif pour ce passage trans-cellulaire- Bartha (sche vaccinale) ne se dissémine pas des neurones aux cellules épithéliales

Réduction

Ch’ng et Enquist JVI 2005 vol.79 p10875-89

19

Modèle de la dissémination antérogradedu PRV dans l’axone de neurones en culture

Enquist JID 2002 , vol186: S209-214

US9 gE et gI(partie terminale)

gE/ gI et US9 agiraient à différents niveaux dans la sortie des virions de l’axone

Secteur proximal de l’axone très riche en cytosquelette

Rôle US9: sorte d’adaptateurpour la sortie dans l’axone

US9

Sortie dans l’axone

US9-dépendant(stimulée par gE/gI)

Sortie dans le corps

du neurone

US9-indépendant(peut-être stimulée par gE/gI)

20

Nature des particules qui passent du neurone auxcellules non neuronales

?

100nm

La jonction cellulaireCh’ng et Enquist JVI 2005 vol.79 p10875-89

Nature de la jonction

Visualisation

?

21

Exemple du virus de la maladie de Marek

Un autre cas étonnant d’herpèsvirus,le virus de la maladie de Marek

« Virions libres extracellulaires » in vivo Follicules plumeux

Virions associés aux cellules in vivo Tout tissu sauf follicule plumeuxin vitro Tous les systèmes de culture

- Agent pathogène majeur du poulet- Maladie lympho-proliférative- Pertes économiques importantes malgré existence de vaccins- Virus très contagieux (transmission directe et indirecte)

Particularité

Question irrésolue:- Mécanisme de passage du virus d ’une cellule à une autre, hors follicule plumeux

22

Principe d’identification d’un gène essentiel à ladissémination virale en culture cellulaire:

exemple du gène UL49 codant VP22Dorange et al. 2002 J.Virol, 76: 1959-70.

Bac20 Bac20ΔUL49

CESC

a bVP5

TRANSFECTIONbacmide BAC20delUL49

Recherche protéine de capside VP5par immunofluorescence

MDV est le seul herpèsvirus connu pour lequel VP22 est essentiel (avec VZV depuis 2007)

Clonage du génome viral dansun BACMIDE

(souche atténuée 584Ap80c)Génome complet US2-

Délétion du gène par recombinaisonhomologue dans E. coli

Gènes identifiés comme essentiels dans ladissémination virale en culture cellulaire

CESC; QM7

CEF, QM7

CEF, QM7

CEF, QM7

CEF, QM7

Systèmecellulaire

VP22

gE

gI

gM

gN

Protéine

UL49

US8

US7

UL10

UL49.5

gène

Dorange et al. 2002

Schumacher et al. 2001

Schumacher et al.2001

Tischer et al. 2002

Tischer et al. 2002

Bac20

Bac20

Bac20

Bac20

Bac20

RéférenceBac

Rq:- Pas de gène homologue de US9- Pas de gène gD exprimé

23

Un très grand nombre de questions irrésoluespour ce virus….

Nature des particules transmises

Nature des jonctions cellule-cellule: synapse virologique?

Parcours du virus et types cellulaires infectés in vivo

Passage de cellule à cellule, le seul mode de transfert du virus?

Très peu de particules virales enveloppéesdans le cytoplasme

Cellules en culture cellulaire: fibroblastes, myoblastes …Projections cellulaires viro-induites?

CONCLUSIONS

- Virus profitent de voies de communications cellulaires naturelleset les détournent à leur profit.

- Tous ces mécanismes de dissémination de virus de cellulerestent mal connus. Domaine en pleine expansion. Grand essoravec les techniques nouvelles d’imagerie.

- La Virologie bénéficie des découvertes de la biologie cellulaireet inversement (découverte de nouvelles voies de communicationcellulaire).