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THÉSE
en vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ DE TOULOUSE délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Ecole doctorale : science de la matière Spécialité : Chimie-Biologie-Santé
présentée et soutenue
par
Gabrielle CHATAIGNÉ
le 23 novembre 2007
Titre :
Détermination structurale des lipopolysaccharides de surface chez Sinorhizobium.
Directeur de thèse : Dr. Véréna POINSOT
JURY
M. F. COUDERC Professeur à l'Université Paul Sabatier de Toulouse Président M. J.-C. MICHALSKI Directeur de recherche Université des Sciences et Technologies de Lille Rapporteur Mme M.-C. RALET Chargée de recherche à l'unité BIA de l'INRA de Nantes Rapporteur M. G. PUZO Directeur de recherche à l'Université Paul Sabatier de Toulouse Examinateur V. POINSOT Chargée de recherche à l'université Paul Sabatier (IMRCP) Directeur de thèse
Recherches effectuées au Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivités Chimiques et Photochimiques
118 route de Narbonne 31062 Toulouse CEDEX 9
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UNIVERSITE PAUL SABATIER Thèse d'Université, spécialité Chimie-Biologie-Santé Date de soutenance Nom du candidat CHATAIGNÉ Gabrielle Titre en Français Détermination structurale des liposaccharides de surface de Sinorhizobium. Résumé en Français Pour survivre dans des sols pauvres en nutriments, les plantes de la famille des légumineuses sont capables d'entrer en symbiose avec des bactéries de la famille des rhizobiaceae. Les polysaccharides de surface de ces bactéries jouent un rôle crucial dans l'établissement du processus d'infection. Sinorhizobium meliloti 1021 porte à sa surface trois types de polysaccharide, les lipopolysaccharides (LPS), les polysaccharides capsulaires (KPS) et les exopolysaccharides (EPS). Ses KPS sont des polymères de Kdo de petite taille rattachés à une ancre lipidique. Nous avons étudié la structure des KPS d'un mutant de la souche Sm1021 déficient en exopolysaccharides et produisant des KPS de haute masse molaire. Son activité symbiotique a été déterminée. Les KPS et les LPS possèdent des propriétés physico-chimiques communes (même taille, même charge et même balance hydrophobe-hydrophile). Pour analyser les constituants de ce mélange sans purification préalable lourde et en utilisant un minimum d'échantillon, nous avons mis au point un couplage entre une chromatographie liquide à haute performance échangeuse d'anion (HPAEC), efficace dans la séparation des oligosaccharides, et un spectromètre de masse (ESI-Q-ToF). Nous avons ainsi pu déterminer la structure des KPS de haute masse molaire synthétisés par le mutant mais aussi démontrer que la présence d'une ancre lipidique est, sur les KPS, très commune chez les Sinorhizobia. Nous avons aussi recueilli de nouvelles données concernant la caractérisation structurale de l'oligosaccharide de cœur des LPS de Sm1021 et des lipides A de deux mutants AcpXL et LpxXL. Liste des mots clés : KPS, LPS, Sinorhizobium, HPAEC-PAD-MS, ESI-Q-ToF Nom et adresse du ou des laboratoires Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivités Chimiques et Photochimiques 118 route de Narbonne 31062 Toulouse CEDEX 9
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Titre en Anglais: Structural determination of surface liposaccharides of Sinorhizobium Abstract Soil bacteria belonging to the rhizobia are able - when the rhizosphere is starved in nitrogen - to infect legume roots and to establish a nitrogen-fixing symbiosis. Surface polysaccharide appeared to be essential to the symbiosis establishing. S. meliloti produces cell-surface polysaccharides including lipopolysaccharides (LPS), capsular polysaccharides (KPS) and exopolysaccharides (EPS). Sinorhizobium meliloti strain 1021 produces a low-molecular-mass capsular polysaccharide that is a Kdopolymer harboring a phospholipid anchor. Exopolysaccharide-deficient mutant of Sm1021 affected in the KPS size (increased of polymerization level) has been studied. we performed a structural analysis of the K polysaccharides using NMR, ESI-MS and GC-MS. LPS and KPS were impossible to separate (same size, charge and hydrophilic/lipophilic balance). To determine the complexity oligosaccharide composition of biological samples and to use the smallest possible quantity of the surface polysaccharide extract, we decided to develope on-line coupling of High performance anion exchange chromatography (HPAEC), well established technique for determining underivatized carbohydrates, and mass spectrometry. In this thesis are presented new data concerning the structure of LPS core oligasaccharide and lipidA of the Sinorhizobium meliloti strain 2011 and mutant AcpXL and LpxXL. Key words : KPS, LPS, Sinorhizobium, HPAEC-PAD-MS, ESI-Q-ToF Nom et adresse du ou des laboratoires Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivités Chimiques et Photochimiques 118 route de Narbonne 31062 Toulouse CEDEX 9
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Remerciements...
Les travaux présentés dans ce manuscrit de thèse ont été réalisés au laboratoire des Interactions
Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique (IMRCP) à l’Université Paul Sabatier de
Toulouse. Je tiens à remercier les deux directrices qui se sont succédé : Isabelle Rico-Lattes et
Monique Mauzac pour m’avoir accueillie dans ce laboratoire.
je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Monsieur François Couderc pour avoir accepté de
présider à ce jury de thèse mais aussi pour sa présence et ses conseils tout au long de ces trois années.
je remercie sincèrement Madame Marie-Christine Ralet, Monsieur Jean-claude Mishalsky d'avoir
accepté de consacrer du temps, en tant que rapporteur pour juger et aider à l'amélioration de ce
travail. Merci aussi à Monsieur Germain Puzo d'avoir participé à ce jury et pour ses conseils.
Je voudrais adresser toute ma reconnaissance à ma directrice de thèse, le Dr Véréna Poinsot. Merci
de m’avoir accueillie dans ton équipe et de m'avoir soutenue dans les périodes tempétueuses pour
moi, merci de m’avoir enseigné la pratique des sciences et la rigueur de la démarche expérimentale, de
m’avoir transmise ta capacité d’enthousiasme et ta force, merci de m’avoir offert cette grande liberté
de travail et de m’avoir accordée ta confiance. J’ai énormément appris de toi et je garderai
longtemps le souvenir de ton enseignement et de ton humanité.
Merci encore à celles qui n’ont été que de passage mais avec qui j’ai passé de réels bons moments au
coin d’une paillasse, d’une hotte vrombissante ou au détour d’un café, et plus particulièrement à
Delphine, que j’ai appris à connaître tout au long de ces années et qui m'a apportée sa bonne
humeur et ce quelque soit les circonstances. Pour tous nos bons moments, et les moins bons.
Enfin, merci à tous ceux qui partagent ma vie et qui m’accompagnent avec tant d’amour et de
tendresse. Merci à ma famille, à mes amis, vous mériteriez des lignes, des chapitres, des livres
entiers, il y a tant d’histoire, de rencontres, d’émotions partagées à raconter, mais vous connaissez
mes difficultés d'écriture alors merci de me laisser simplement vous serrer dans mes bras.
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aa, acide aminé Ac, acétyl Ac2O, anhydride acétique ASRS, suppresseur autorégénérant d’anions ATP, adenosine triphosphate BuOH, hydroxybutyryl Cn:x, n représente le nombre de carbone de la chaine carbonée de l’acide gras x représente le nombre d’insaturation CID, collisions avec un gaz rare induisant des dissociations DHB, acide 2,5-dihydroxybenzoique DNase, désoxyribonucléase DO, densité optique DOC, acide désoxycholique E., Escherichia
EDTA, acide éthylènediaminetétraacetique EPS, exopolysaccharides EPS-, déficience en exopolysaccharide ESI+, mode de détection /ionisation positif ESI-, mode de détection /ionisation négatif ESI/MS, ionisation électrospray couple à un spectromètre de masse EI, impact électronique FAO, Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture Fix-, phénotype dans lequel les symbiosomes fixent l’azote, si positif la plante est verte, sinon elle est jaune FT-ICR, résonance cyclotronique d'ions et à transformée de Fourier Gal, galactose GalA, acide galacturonique GC/MS, chromatographie en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse Glc, Glucose GlcA, acide glucuronique GlcN, glucosamine Hex, hexose HexA, acide uronique HFBA, anhydride heptafluorbutyrique HMBC, corrélation multiple liaison hétéronucléaire HMW, haute masse molaire HPAEC, chromatographie haute performance échangeuse d’anion HSQC, corrélation simple quantum hétéronucléaire Kdo, acide 2-ceto,3-désoxy-manno-octulosonique Kdx, acide 2-céto-3-désoxy-ulosonique KPS, polysaccharides capsulaires KPS-, déficient en polysaccharide capsulaire LA, lipides A LCO, lipooligomère de chitine LMW, faible masse molaire LOD, limite de détection LPS, lipopolysaccharide LysoPI, lysophosphatidylinositol MALDI, ionisation désorption sur matrice assistée par laser Man, mannose MeOH, méthanol
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MMW, masse molaire moyenne MS/MS, fragmentation d'un ion déterminé MW, masse moléculaire MWCO, Limite de séparation du poids moléculaire N., Neisseria
NAD(P), le P entre parenthèse signifie que le donneur d'électron est soit le NADH,H+ ou le NADPH,H+ NAD, nicotinamide adénine dinucléotide NADP, nicotinamide adénine dinucléotide phosphate NANA, acide N-acétyl neuraminique BuOH, hydroxy-butyryl PAD, détection à ampérométrie pulsée PAGE, électrophorèse sur gel de polyacrylamide PC, phosphatidylcholine PE, phosphatidyléthanolamine PI, phosphatidylinositol PMAA, acétate d’alditol partiellement méthylé Pse, acide pseudaminique Q-ToF, quadripôle- temps de vol R., Rhizobium
rARN, acide ribonucléique ribosomial Rha, rhamnose r-LPS, "rough" lipopolysaccharides RMN, résonnance magnétique nucléaire RNase, ribonucléase A S., Sinorhizobium
SEC, chromatographie exclusion stérique Sf, Sinorhizobium fredii
SIM, appel d'ion unique s-LPS, "smooth" lipopolysaccharides Sm, Sinorhizobium meliloti.
TEMED, Tétramethyl-èthyl éthylènediamine TFA, acide trifluoroacétique TIC, appel d'ions totaux TLC, chromatographie sur couche mince TRIS, tris(hydrxyméthyl)aminométhane UDP, 1-phosphate uridyl YEM, milieu aux extraits de levure 3OHCn, acide gras portant un hydroxyle en position 3 de sa chaîne carbonée n représente le nombre de carbone 27OHC28: acide 27-hydroxyoctacosanoique
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I Introduction......................................................................................................... 11 1 Généralités ................................................................................................................... 13 2 La formation du nodule .............................................................................................. 15 3 Les signaux symbiotiques ........................................................................................... 16
3.1 Facteurs Nod et reconnaissance entre les deux partenaires (étapes 1,2,3)........... 16 3.2 Rôle symbiotique des polysaccharides de surface (Etape 6) ................................. 17
3.2.1 Les exopolysaccharides (EPS) ........................................................................ 18 3.2.2 Les polysaccharides capsulaires (KPS)........................................................... 19 3.2.3 Les lipopolysaccharides (LPS)........................................................................ 20
4 Biosynthèse des polysaccharides de surface.............................................................. 22 4.1 Les exopolysaccharides.......................................................................................... 22 4.2 Les lipopolysaccharides ......................................................................................... 23 4.3 Les polysaccharides capsulaires ............................................................................ 27
5 Analyse des oligosaccharides par spectrométrie de masse. ..................................... 31 5.1 Les sources et modes d’ionisation.......................................................................... 31
5.1.1 Bombardement par des atomes rapides (FAB) ............................................... 31 5.1.2 Desorption/Ionisation Assistée par Laser (MALDI) ....................................... 32 5.1.3 Ionisation ElectroSpray (ESI) ......................................................................... 33 5.1.4 Désorption/ionisation par electrospray (DESI) ............................................... 34
5.2 Mode de fragmentation des oligosaccharides...............Erreur ! Signet non défini. 6 Mise en perspective des travaux de thèse .................................................................. 38
II-Résultats. ............................................................................................................... 39
Chapitre 1 : Caractérisation des KPS de haute masse
molaire, actifs dans la symbiose fixatrice d'azote : rôle de
rkpZ1 et rkpZ2 chez Sm1021. .................................................................. 41
CONTEXTE ..................................................................................................................... 411
RESULTATS ...................................................................................................................... 49 1 Choix de la mutation et effet du plasmide pMW23 sur la biosynthèse des KPS... 49 2 Analyse par spectrométrie de masse de l’extrait brut ........................................... 522 3 Analyse de la composition saccharidique des KPS en fonction de leur taille ...... 600 4- Détermination du mode d’enchaînement............................................................... 644 5- Mise en évidence de la présence d’une ancre lipidique ...................................... 6767 6- Structure de l'ancre lipidique du KPS ................................................................... 700 7- Activité symbiotique ................................................................................................ 833 8- Des paralogues de rkpZ dans la souche Sm1021 ................................................. 8486
BILAN ............................................................................................................................... 955
Chapitre 2: Analyse des polysaccharides bactériens par
couplage HPAEC-PAD-MS .....................................................99
CONTEXTE ....................................................................................................................... 99
RESULTATS .................................................................................................................. 1055 1 Couplage ESI-Q-ToF /HPAEC-PAD en ligne ...................................................... 1055
1.1 Choix du gradient............................................................................................... 1066 1.2 Choix du régénérant de dessalage .................................................................... 1077
8
1.3 Effet du dessaleur sur la résolution chromatographique................................... 1111 1.4 Choix du mode d'ionisation en MS..................................................................... 1122 1.5 Sensibilité respective des détecteurs PAD et MS ................................................ 114
2 Analyse des polysaccharides contenus dans les extraits bactériens...................... 116 2.1 Sm1021 ................................................................................................................ 118 2.2 S. fredii HH103 ................................................................................................. 1211 2.3 Sm41 exoB (AK631) .......................................................................................... 1222 2.4 S sp. NGR234 ................................................................................................... 12424
BILAN ............................................................................................................................. 1277
Chapitre 3 : Analyse structurale du cœur des LPS de
Sm1021. ........................................................................................1311
CONTEXTE ................................................................................................................... 1311
RESULTATS ................................................................................................................ 13939 1 Détermination de la masse molaire du cœur ...................................................... 13939
1.1 Masse et structure du lipide A.......................................................................... 13939 1.1.1 Sm1021.......................................................................................................... 139 1.1.2 AcpXL......................................................................................................... 1411 1.1.3 LpxXL ......................................................................................................... 1411
1.2 Masse molaire des LPS ...................................................................................... 1433 2 Analyse structurale de l’oligosaccharide de cœur ................................................ 1466
2.1 Composition saccharidique................................................................................ 1466 2.1.1 Analyse en GC-MS .................................................................................... 1466 2.1.2 Analyse en HPAEC-PAD............................................................................ 1511
2.2 Analyse du mode de jonction : méthode de Hakomori....................................... 1566 2.3 Analyse du cœur entier par HPAEC-PAD ......................................................... 1611
BILAN ............................................................................................................................. 1655
III Conclusions et perspectives....................................................... 1677
IV Matériels et Méthodes. .................................................................... 1755 1 Cultures bactériennes ............................................................................................. 1777 2 Test de Gram ......................................................................................................... 17878 3 Purification des Polysaccharides.......................................................................... 17979
3.1 Extraction au phénol à chaud .......................................................................... 17979 3.2 Digestion enzymatique ....................................................................................... 1800
3.2.1 RNase, DNase, Protéinase K....................................................................... 1800 3.2.2 Phospholipases ............................................................................................ 1800
4 Purifications des KPS et des LPS........................................................................... 1811 4.1 Par chromatographie d’exclusion stérique (S300) ........................................... 1811 4.2 Par chromatographie d’affinité (polymyxine B) ................................................ 1822
5 Caractérisations....................................................................................................... 1822 5.1 Gel DOC-PAGE ................................................................................................. 1822 5.2 Analyse par spectrométrie de masse des polysaccharides................................. 1855
5.2.1 ESI-MS des extraits bruts et lipides A ........................................................ 1855 5.2.2 MALDI-ToF des extraits bruts et des lipides A......................................... 1855
5.3 Analyse des ancres lipidiques par TLC préparative .......................................... 1866 5.3.1 Coloration à l’iode......................................................................................... 186
9
5.3.2 Coloration à l’acide sulfurique.................................................................... 1866 5.3.3 Coloration à l’anthrone.................................................................................. 186 5.3.4 Coloration à la primuline............................................................................. 1877 5.3.5 Coloration à l'acide phosphomolybdique ...................................................... 187 5.3.6 Coloration à l'azure A.................................................................................... 187 5.3.7 Coloration de Dragendorff ............................................................................ 187 5.3.8 Coloration à la ninhydrine............................................................................. 187 5.3.9 Élution des composés adsorbés sur silice...................................................... 187
6 Analyses structurales ............................................................................................ 18888 6.1 Hydrolyse douce ............................................................................................... 18888 6.2 Hydrolyse forte ................................................................................................. 18888 6.3 Analyse de l’ancre ................................................................................................ 189
6.3.1 Saponification............................................................................................ 18989 6.3.2 Acétylation ................................................................................................ 18989
6.4 Etude par HPAEC ................................................................................................ 189 6.4.1 HPAEC-PAD .............................................................................................. 1911 6.4.2 HPAEC-PAD-MS ....................................................................................... 1911
6.5 Etude par GC-MS............................................................................................... 1922 6.5.1 Dérivation par l’acide heptafluorobutyrique .............................................. 1933 6.5.2 Méthylation/acétylation : méthode Hakomori............................................. 1933
6.6 Etude par RMN................................................................................................... 1944
V Bibliographies. ............................................................................................. 1977
10
11
I Introduction.
12
13
1 Généralités
Il est aujourd’hui commun de dire que les symbioses sont sources de diversité et
d’adaptation. De nombreux exemples de symbioses existent dans le monde du vivant : elles
prennent des formes aussi diversifiées que les Lichens (union d’une algue et d’un
champignon), la microflore intestinale chez l'homme ou encore l'acacia comigera, qui survit
grâce aux colonies de fourmis. Dans le monde végétal, elles permettent, le plus souvent, la
survie de la plante dans un environnement défavorable qu’il soit sec ou carencé en nutriments.
Elles permettent ainsi l’implantation de nombreuses espèces dans des milieux hostiles en
enrichissant les sols.
Nos travaux concernent une association symbiotique particulière: la symbiose fixatrice
d’azote. L'azote, le phosphore, le calcium, et plus généralement les minéraux indispensables à
la croissance des végétaux sont prélevés dans le sol. Après la récolte, les éléments qui ont
servi à la croissance des plantes, doivent être restitués au sol, afin d'en conserver la fertilité.
Dans le système d’agriculture intensive que nous connaissons, la restitution se fait sous forme
d’engrais d'origine chimique (azote/phosphore/potasse), parfois appliqués en excès. Cette
pratique est une source de nuisances pour la santé humaine et l’environnement. Elle pollue les
eaux de surface et des nappes phréatiques, par lessivage des engrais, mais engendre aussi une
forte consommation d’énergie et une émission de gaz à effet de serre pour la production des
engrais azotés. Ces engrais purement minéraux amènent par ailleurs, un déséquilibre croissant
de la structure et de la composition des sols.
Parmi les éléments nutritifs essentiels, l’azote est très important puisqu’il est
nécessaire à la fois aux biosynthèses des acides aminés et au métabolisme des plantes. Bien
que l'azote représente 80% de l’air sous forme N2, sa forme combinée (NH4OH, NO3-) est
plus rare. Seul l'azote combiné sous forme de nitrate ou d’ammoniaque est assimilable par la
plante. Les sources naturelles d’azote combiné sont les éclairs (Dickerson et al., 1984), la
décomposition d’organismes vivants, les cyanobactéries présentes dans l’environnement
proche des plantes (Burris et al., 1974) et enfin, la plus importante des sources, les bactéries
de type Rhizobia qui entrent en symbiose avec les légumineuses. Le tonnage en ammoniaque
produit par cette dernière est proche de celui produit par l'industrie chimique,
approximativement 107 millions de tonnes (http://www.fertilizer.org). Cette symbiose est de
14
type mutualiste (E. Toby Kiers et al., 2004): la plante apporte les nutriments carbonés et un
environnement pauvre en oxygène et sans stress hydrique, tandis que la bactérie apporte
l’ammoniaque. La réduction de l’azote atmosphérique n’est rendu possible que par la mise en
commun du potentiel des deux partenaires. La bactérie sous forme de bactéroïde réduit l'azote
atmosphérique grâce à une enzyme, la nitrogénase (Figure 1). Cette transformation demande
un apport énergétique très important, puisque 1) 16 ATP sont nécessaires pour réaliser
chaque réduction et 2) la formation d'un nouvel organe racinaire dans lequel la pression de
l’oxygène est maintenue à un niveau assez bas dans l’environnement de l’enzyme, est
indispensable à la réduction de l’azote.
Figure 1: Transformation de l’azote en ammoniaque par le complexe réductase/nitrogénase via la ferrédoxine.
La symbiose légumineuse/rhizobium est le résultat d'une interaction hautement
spécifique entre la plante et la bactérie. L'établissement et le fonctionnement de la symbiose
sont sous le contrôle génétique des deux partenaires. La reconnaissance entre les deux
symbiotes est rendue possible par des échanges de signaux moléculaires. Ainsi, des composés
de types flavonoïdes sont exsudés par les racines de la plante et vont induire la transcription
des gènes de la nodulation nod et nol qui codent pour la production de composés de
lipooligomère de chitine (LCO), les facteurs Nod. Ces composés sont libérés dans la
rhizosphère et perçus en retour par le végétal. Seule une structure très précise de LCO
modulée par la présence ou non de certains substituants est reconnue par la plante hôte
(Broughton et al., 2000). Ces facteurs Nod, une fois reconnus, vont avoir une activité « à
distance » au niveau de la plante.
Une fois ce stade précoce passé, d’autres composés saccharidiques provenant de la
bactérie entrent en jeu. Ces polysaccharides d’origine bactérienne sont soit sécrétés dans le
milieu extérieur soit restent au contact de la bactérie.
15
Une communication complexe entre les deux symbiotes s’effectue ainsi tout au long
du processus d’infection. La compréhension, puis la maîtrise des processus permettant la mise
en place d’une telle symbiose, constituent un grand pas vers le développement d’une
agriculture moins polluante. La prédiction du département européen pour l'agriculture indique
que si aujourd'hui les engrais n'apportent que 43% des nutriments nécessaires à la plante, dans
un avenir proche, ce pourcentage sera de 84%, étant donné le modèle agricole actuel (FAO,
communiqué de juin 2003). Une utilisation de la symbiose fixatrice d'azote peut diminuer
l’apport d’engrais azoté chimique nécessaire aux cultures tout en structurant les sols en
réalisant des cycles légumineuses/céréales performants. L'optimisation de la symbiose
permettrait aussi une culture du soja et des autres légumineuses plus raisonnée.
2 La formation du nodule
Figure 2: Etapes de la formation d’un nodule dans une racine latérale
Les étapes de la mise en place de la symbiose peuvent être énumérées dans un ordre
chronologique : (1) la racine exsude des flavonoïdes ; (2) les Rhizobia, en réponse secrètent
des facteurs Nod ; (3) sous l’action des facteurs Nod, les cellules du cortex se mettent en
mitose pour former le primordium nodulaire dans le méristème ; (4) la bactérie s’attache à
l’épiderme du poil absorbant et le poil (par croissance polaire) se recourbe sur lui-même ; (5)
les cellules du péricycle près des pôles du xylème se mettent en mitose ; (6) il y a formation
du cordon d’infection amenant la bactérie au nodule primaire ; (7) les deux masses de cellules
fondent en un bloc unique tandis que le cordon d'infection continue à se développer ; (8) le
nodule se prolonge, le raccordement vasculaire avec le stèle de la racine est mis en place. Les
Facteurs Nod
Symbiosome
Flavonïdes
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bactéries sont acheminées dans les cellules du nodule et se différencient en bactéroïdes. Le
nodule et les bactéroïdes forment le symbiosome.
3 Les signaux symbiotiques
3.1 Facteurs Nod et reconnaissance entre les deux partenaires (étapes 1,2,3 de la Figure 2).
La plante étant par définition immobile, elle doit attendre que les Rhizobia entrent
dans sa rhizosphère. Toutefois la mobilité de la bactérie et le chemotactisme ne jouent qu’un
rôle restreint dans la reconnaissance (Fellay et al., 1995). Dans ce contexte il apparaît difficile
que les deux partenaires se rencontrent. C'est sans compter sur le fait que la plante exsude
dans son proche environnement une grande diversité de nutriments qui, par leur nature
(source de carbone, d’azote, etc...), attirent à elle des microorganismes symbiotiques et
pathogènes (Barbour et al., 1991). Pour réaliser une sélection dans cette flore, la plante
sécrète en continu des flavonoïdes. Lorsqu’un Rhizobium compatible pénètre dans sa
rhizosphère, la concentration en flavonoïde augmente. La bactérie reconnaît ce composé grâce
à une protéine NodD, il se forme un complexe qui active une séquence de gène (nod, nol et
noe). Ces gènes sont responsables de la biosynthèse des facteurs Nod (Schlaman et al., 1992).
Il s’ensuit un processus impliquant les facteurs Nod mais aussi les polysaccharides de la
surface des bactéries.
Les facteurs Nod sont des lipooligosaccharides composés de 3 à 5 β1-4N-
Acétylglucosamines portant sur leur sucre non réducteur un groupement acyle et sur leurs
deux extrémités des substituants divers (fucose, sulfate, acétyle, carbanoyle) dépendant de la
souche bactérienne (Figure 3). Ces lippochitooligomères sont sécrétés dans le milieu externe
et vont déclencher une série de modifications chez la plante. Ils sont impliqués dans les stades
les plus précoces de la reconnaissance entre les deux partenaires et induisent les modifications
du poil absorbant, débutant ainsi l'organogenèse du nodule.
17
Figure 3: Schéma structural d'un facteur Nod.
Si les facteurs Nod sont le point de départ d’une communication indispensable à la
mise en place spécifique de la symbiose fixatrice d’azote, ils ne sont pourtant pas impliqués
dans les étapes plus tardives. En effet, lorsque des racines sont mises en présence des seuls
facteurs Nod, les organes symbiotiques ne se forment pas ou sont incomplets. Seul le
recourbement du poil absorbant est visible. Il existe à la surface des bactéries d’autres
composés dont le rôle est de succéder aux facteurs Nod : les polysaccharides de surface.
De nombreux articles de revue sur le rôle de ces polysaccharides ont été réalisés au
cours des dernières années, dont les plus importantes ont été écrits par Fraysse et al. en 2004
ou encore par Niehaus et al. en 1998. L’exposé succinct du rôle de ces polysaccharides de
surface qui suit repose sur ces revues.
3.2 Rôle symbiotique des polysaccharides de surface (Etape 6)
Les bactéries de la famille des Rhizobia sont de type α-proteobacter, et possèdent donc
une physiologie classique de Gram négatif (Figure 4). Ainsi, leur paroi est composée de trois
parties : une bicouche phospholipidique, la frontière entre le milieu externe et le cytoplasme,
puis une couche de peptidoglycanes séparée par un espace périplasmique de la membrane
externe. Cette membrane externe asymétrique est constituée sur sa face interne de
18
phospholipides et de lipoprotéines et, sur sa couche externe, de lipopolysaccharides. Des ions
Ca2+ jouent un rôle primordial dans la cohésion de cette membrane externe. Au voisinage
proche de la membrane externe, une couche supplémentaire composée de polysaccharides
capsulaires entoure la bactérie. Son rôle est de protéger le microorganisme contre les
perturbations abiotiques telles que les stress hydriques et salins. Une troisième catégorie de
polysaccharides se trouve encore plus en surface des bactéries : les exopolysaccharides. Ils
sont continuellement secrétés dans la rhizosphère ou dans le canal d’infection, mais leur
production est stoppée une fois le nodule atteint. Dans les conditions de stress hydrique, ces
polysaccharides transforment leur environnement en gel afin de maintenir une couronne
humide autour de la bactérie.
Figure 4: Schéma de la surface d’une bactérie de type Gram négatif.
3.2.1 Les exopolysaccharides (EPS)
Ce sont les plus étudiés de tous les polysaccharides de surface. Un intérêt particulier à
été porté aux succinoglycanes présents à la fois chez Sinorhizobium meliloti et
Agrobacterium. Leur structure est constituée d’unités répétitives (8 à 12 mères), composées
en général d’hexoses (le plus souvent du glucose et du galactose) plus ou moins substitués par
19
des pyruvates, des succinates ou des acétates. Ils peuvent être linéaires ou ramifiés. Les sucres
sont reliés entre eux par une grande variété de liaisons (alpha ou béta, 1-2, 1-3 etc…) (Figure
5). Certaines bactéries telles que S. meliloti sont capables de produire un autre type d’EPS
appelés EPS II qui sont composés d’une unité répétitive disaccharidique de type hexose.
L’absence des exopolysaccharides bactériens provoque chez la plante la production excessive
de composés phénoliques qui colorent en brun les racines et provoquent une apoptose des
cellules infectées, ainsi que la mort des bactéries. De plus, le cordon d'infection ne progresse
pas et des aberrations (poches) apparaissent. Ainsi leur rôle dans la symbiose fixatrice d’azote
se situe dans l’inhibition des réactions de défenses des plantes et dans la progression du
cordon d’infection.
Figure 5 : Schéma de la structure de différents exopolysaccharides en fonction de la souche qui les produits (Skorupska,
2006).
3.2.2 Les polysaccharides capsulaires (KPS)
Au contact de la surface de la bactérie se trouvent les polysaccharides capsulaires.
Ceux de la famille des Rhizobia sont composés de sucres appartenant à la famille de l’acide 2-
céto-3-désoxy-ulosonique (Kdo), notés Kdx. Les premières structures élucidées ont été celles
20
des KPS des souches S. fredii USDA 205 et S. meliloti 41 (Reuhs et al., 1993). Ces
polysaccharides ont une structure analogue à celle de l’antigène KR5 de E. coli, c’est pour cela
que les initiales KPS leur ont été attribuées. Un motif consensus a pu être établi : il s’agit d’un
polymère de disaccharide composé d’un Kdx et d’un hexose ou d’un acide uronique (Tableau
1).
Tableau 1: Composition des unités répétitive des KPS en fonction de la souche (Reuhs et al., 1998).
Ces polymères peuvent atteindre 30 kDa (pour Sm41) mais leur masse molaire est en
moyenne de 7 à 12 kDa. Ils sont en général facilement identifiables sur un gel de
polyacrylamide car ils se colorent au bleu d’alcian (colorant cationique formant une paire
d’ions avec les Kdx). La nature particulière des Kdx les rend sensibles à l’hydrolyse acide.
C’est cette propriété chimique qui induit une grande disparité dans la taille observée des KPS,
qui n’est pas obligatoirement représentative des formes synthétisées in vivo.
Leur rôle dans la symbiose fixatrice d’azote est à ce jour inconnu. Peu d’études ont été
réalisées pour comprendre leurs modes d'action. Ils pourraient avoir un simple un rôle passif
de protection lors des changements brusques d’environnement (passage du sol à la plante) et
faces aux défenses de la plante (antibiotiques de nature peptidique) et au choc alcalin.
3.2.3 Les lipopolysaccharides (LPS)
Beaucoup de structures de LPS de Rhizobia sont partiellement décrites mais
relativement peu sont complètes à ce jour. Les LPS sont composés de trois parties : i) le lipide
A qui permet d’ancrer la molécule dans la bicouche phospholipidique, ii) un oligosaccharide
21
de cœur, iii) un antigène O. Les LPS se distinguent en deux classes suivant leurs tailles. Leur
nom provient de la forme qu’ils donnent aux colonies bactériennes. Lorsque les colonies
présentent un contour irrégulier, ils sont appelés r-LPS : r pour « rough ». Lorsque les
colonies présentent des contours réguliers les LPS sont dits s-LPS, s pour « smooth ». Les r-
LPS ne sont constitués que d'un lipide A et d'un oligosaccharide de cœur. Les s-LPS sont
quant à eux composés d'un lipide A, d'un oligosaccharide de cœur et des unités répétitives
formant l’antigène de type O (Figure 6).
Figure 6: Schéma structural des LPS.
Une analyse sur gel d'acrylamide permet de les identifier. La coloration en jaune, après
traitement au nitrate d’argent, est caractéristique de ces composés en partie lipidiques. Sur un
gel de polyacrylamide, les r-LPS, de petites tailles, migrent le plus rapidement que les s-LPS.
Leur rôle dans la symbiose fixatrice d’azote réside dans l’inhibition des réactions de
défenses de la plante dans les étapes plus tardives de l’infection, lorsque les EPS ne sont plus
synthétisés, en empêchant la mise en place du choc oxydant (Scheidle et al., 2005). Ils ont par
ailleurs un rôle dans la pénétration des bactéries dans les cellules nodulaires, lorsqu’elles sont
libérées du cordon d’infection. Les composés sont aussi des agents de cohésion membranaire.
Pour cette raison, les LPS semblent nécessaires à la survie de la bactérie lors de sa
transformation en bactéroïde (changement de forme et de taille).
monosaccharide
s-LPS
r-LPS
22
4 Biosynthèse des polysaccharides de surface 4.1 Les exopolysaccharides
Les gènes impliqués dans la biosynthèse des exopolysaccharides (exo/exs ou pss)
forment un grand groupe de gènes situé sur le megaplasmide symbiotique pSymB (Finan et
al., 2001). Les protéines synthétisées par ce groupe de gènes sont de quatre types : les
enzymes impliquées dans la biosynthèse des précurseurs de sucre, les transférases
responsables de l'assemblage de l'unité répétitive, les enzymes responsables des substitutions
non-sacharidiques et enfin celles permettant la polymérisation des unités répétitives entre
elles et l'export des EPS.
La biosynthèse des EPS représente un processus multi-étape et dépend d'un complexe
protéique localisé à la fois sur les membranes interne et externe. Elle débute par la formation
d'un précurseur, nucléotide de sucre diphosphorylé (par exemple UDP-glucose), transféré sur
un accepteur le undecaprenydiphosphate (UndP). L'unité répétitive est formée dans le
cytoplasme et sera ensuite transférée vers le périplasme dans lequel se déroule la
polymérisation. Le polysaccharide est acheminé vers la membrane externe par des
transporteurs de type ABC (Glucksmann et al., 1993).
Prenons plus en détail la biosynthèse des EPS I de Sinorhizobium meliloti qui sont les
EPS actifs dans la symbiose (Figure 7). Tout d'abord la biosynthèse débute par la formation
d'un nucléotide de sucre. exoC code pour une phosphoglucomutase qui transforme le glucose-
6-phosphate en glucose-1-phosphate qui est le précurseur de UDP-glucose (Uttaro et al.,
1995). Intervient ensuite le gène exoB qui code pour une UDP-glucose-4-épimérase qui
convertit UDP-glucose en UDP-galactose (Canter Cremers et al., 1990). La mutation des
gènes exoB ou exoC induit la non-production des EPS, mais affecte aussi la biosynthèse
d'autres polysaccharides tels que les LPS et les glycanes cycliques. L'assemblage de l'unité
répétitive des EPS est initié par ExoY qui est une galactosyltransférase (Müller et al., 1993).
exoF est le gène codant pour la protéine permettant la liaison entre le galactose et
l'undecaprenyl-diphosphate (Reuber et al., 1993). ExoA, ExoL, ExoM, ExoO, ExoU et ExoW
sont les glycosyltransférases qui vont ajouter séquentiellement les sucres de l'unité répétitive
tandis que ExoZ, ExoH, et ExoV vont introduire les motifs non-saccharidiques (Skorupska et
23
al., 2006). Les protéines ExoP, ExoQ, ExoT et ExsA sont responsables de la polymérisation
et de l'acheminement vers le milieu externe des EPS entiers.
Figure 7 Schéma représentant la biosynthèse de l'unité répétitive des EPS I de S. meliloti. En orange et en bleu sont indiquées
les protéines impliquées dans le transfert du précurseur (galactose) sur le transporteur lipidique (undecaprenol-diphosphate :
PP-prenol), en vert sont indiquées les protéines impliquées dans les modifications non-saccharidiques, en jaunes les protéines
permettant la polymérisation et l'export des EPS. (Skorupska et al., 2006)
4.2 Les lipopolysaccharides
Price et ses collaborateurs en 1994 ont démontré que R. leguminosarum et R. etli
possédés une activité enzymatique se recoupant avec celle des enzymes de E. coli impliquées
dans la synthèse du précurseur .
Ainsi, sur le précurseur UDP-N-acetylglucosamine deux acides gras sont liés en
position 2 et 3 par LpxACD. LpxH substitue la position 1 de l'entité obtenue précédemment.
LpxB va permettre la liaison entre une glucosamine diacylée et la glucosamine diacylé et
phosphatée. La position 4 de la glucosamine non réductrice est alors substituée par un
phosphate et KdtA ajoute enfin les deux Kdo sur la position 6 de celle-ci (Figure 8) (Raetz et
al., 2002).
C'est à ce stade qu'intervient la substitution alcoxy-acyl, par un acide gras normal chez
lez bactéries usuelles mais à très longue chaîne chez Rhizobiaceae ce qui représente la plus
24
grande spécificité de leurs lipides A . L’enzyme responsable de cette modification est LpxXL
qui associé à un donneur d'acide gras AcpXL permet de modifier par une chaîne grasse en
C28 ou C30 l'hydroxyle de l’acide gras porté par l’azote de la glucasomine.
Figure 8 schéma de la biosynthèse du Kdo2-lipideIVA de R.Leg.
O
UDP
NH
HOHO
OH
O
O
UDP
NH
OHO
OH
O
O
HO
O
UDP
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O
UDP
NH
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OH
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O O
P
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cyti dine CMP-Kdo
CMP-Kdo
CMP
CMP
O
O
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OH
OH
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O
O
O
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OHO
O
HO O
OH
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O
O
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O
O
NH
O
O
O
HO O
OH
O P
O
O
O
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OHOH
OH
OH
O
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OHO
O
HO O
OH
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O
O
NH
O
O
O
HO O
O P
O
O
O
O
OHOH
OH
O
O
OO
O
OMeO
3OHC16-ACP acétate3OHC18-ACP
UDP
ATPADP
LpxA LpxC LpxD LpxH
LpxB
KdtA
KdtA
AcpXL
27OHC28-ACP
LpxXL
Kdo2-lipideIVA
25
Une fois l'ancre lipidique du LPS synthétisée, la biosynthèse de l'oligosaccharide de
cœur peut débuter. Une seule étude a été réalisée pour déterminé les enzymes responsables de
la biosynthèse de l’oligosaccharide de cœur pour la famille des Rhizobiceae. Cette étude porte
sur la souche R. leguminosarum. Pour cette souche, le Kdo2-lipideIVA sert alors d’accepteur
pour la biosynthèse du cœur. Un mannose est fixé sur le Kdo interne grâce à la protéines
LpcC. Des glycosyltransférases (LpcA et LpcB) permettent ensuite l’élongation de
l’oligosaccharide de cœur (Kadrmas et al., 1998) (Figure 3).
Figure 9 schéma de la biosynthèse de l'oligosaccharide de cœur de R. Leg
Une fois l'oligosaccharide de cœur synthétisé l'entité cœur lipide A est alors transféré
vers le périplasme. Chez R. leg, le lipide A va alors perdre les deux phosphates (en 1 et 4')
grâce aux enzymes LpxE et LpxF. Après cette déphosphorylation, LpxQ va oxyder la position
1 pour donner le gluconate. La position 4', le mannose ainsi le Kdo externe du Kdo2-lipide
IVA que du cœur vont être substitué par les acides galacturoniques par les enzymes RgtABCD
(Kanjilal-Kolar et al., 2006 a et b).
Pour la souche Sinorhizobium meliloti dont le lipide A diffère de R. leg et dont le cœur
reste indéterminé, a la présence d’un homologue de lpcC nommé lpsB pu être démontrer.
L’analyse des séquences de gènes suivant cet homologue ont démontré une forte homologie
avec des glycosyltransférases et ont été nommés lpsCDE (Lagares et al., 2001).
Lipide A
Kdo (interne)Kdo (externe)
Man
Gal
Kdo
GalA
GalAGalA
Antigène O
LpcC
RgtC
LpcA
LpcB
RgtA et RgtB
KdtA
Lipide A
Kdo (interne)Kdo (externe)
Man
Gal
Kdo
GalA
GalAGalA
Antigène O
LpcC
RgtC
LpcA
LpcB
RgtA et RgtB
KdtA
26
Contrairement à l’oligosaccharide de cœur, la partie antigène O est synthétisée
séparément. Mais comme pour les autres constituants du LPS ils s'agit d'un processus
séquentiel qui se déroule en trois étapes i) synthèse de l'unité répétitive ii) polymérisation de
la chaîne iii) transport à travers les membranes plasmiques et liaison au complexe lipide cœur.
Il existe peu d'études sur la synthèse de la partie antigène O chez Rhizobia. Tandis que leur
biosynthèse chez les entérobactéries et en particulier E. coli, sont bien connues (Raetz et al.,
2002).
Le début de la synthèse de l'unité répétitive se fait sur un lipide porteur
l'undecaprenylphosphate (UndP) déjà utilisé dans la biosynthèse du peptidoglycane et des
exopolysaccharides. Cette unité répétitive est synthétisée à la surface interne de la membrane
cytoplasmique.
Le mode de polymérisation et sa localisation dépendent ensuite du mode de transfert
de la partie antigène O vers le périplasme. Dans le cas de E. coli, il existe deux mécanismes
principaux.
Le mécanisme dépendant de Wzy induit le transport des unités "UndP-unité répétitive"
vers la face périplasmique de la membrane cytoplasmique. Ce transfert est contrôlé par une
flipase (Wzx). Une fois dans le périplasme les unités répétitives vont pouvoir polymériser.
Pour cela une unité va être ajoutée à un complexe "UndP-unité répétitive". Ce dimère va
ensuite être attaché à un complexe "UndP-unité répétitive" et ainsi de suite jusqu'à atteindre la
taille adéquate. Ceci implique que au cours de la polymérisation (l'unité répétitive)n est
détaché du lipide porteur pour être lié à un complexe "UndP-unité répétitive" pour obtenir un
nouveau complexe UndP-(unité répétitive)n+1. Wzy et WaaL permettrons ensuite la liaison
entre l'antigène O et l'unité lipide A-cœur qui sera ensuite acheminé à la surface de la bactérie
(Figure 10A).
Le deuxième mécanisme implique des transporteurs de type ABC. Dans ce cas
l'élongation de la chaîne se situe dans le cytoplasme. La synthèse de l'antigène O ne nécessite
dans ce cas que 1 UndP puisque les sucres des unités répétitives sont ajoutés séquentiellement
jusqu'à atteindre la taille adéquate. l'antigène O est ensuite transféré vers le périplasme via un
complexe de transport de type ABC (ATP Binding Cassette ) (Figure 10B).
En 2001, Lerouge et ses collaborateurs ont mis en évidence la présence d'un
homologue des transporteurs de type ABC. La mutation du gène implique la formation
27
uniquement de r-LPS. R. etli utiliserai donc le mécanisme de biosynthèse impliquant les
transporteurs de type ABC.
Figure 10 schéma de la biosynthèse de l'antigène O A) biosynthèse impliquant l'enzyme Wzy : -a- formation de l'unité
répétitive -b- transfert vers l'espace périplasmique -c- polymérisation B) biosynthèse impliquant les transporteur de type ABC
: -d- synthése de la totalité de l'antigène O -e- transfert vers l'espace périplasmique (Szalo et al., 2006)
4.3 Les polysaccharides capsulaires
Il existe, là aussi, peu d’études sur le mécanisme de la biosynthèse des polysaccharides
capsulaires chez les Rhizobiaceae. Elles sont surtout basées sur la comparaison des gènes de
Sinorhizobium avec ceux d’autres bactéries pathogènes (Kiss et al., 2001). Il existe deux
mécanismes de biosynthèse et d’assemblage commun à de nombreuses bactéries pathogènes.
Ces deux mécanismes de biosynthèse sont présents chez E.coli. Or, E.coli a été scindé en
quatre groupes présentant des propriétés physiques et chimiques communes (Tableau 2).
Ainsi les KPS des groupes 1 et 4 ont un mécanisme de biosynthèse impliquant Wzy et
possèdent une ancre lipidique composée par un lipide A. Les groupes 2 et 3 impliquent les
transporteurs de type ABC et ont pour ancre lipidique un glycérophospholipide.
Tableau 2 récapitulatif des spécificités de chaque groupe de KPS de E. coli (Roberts, 1996)
Groupe Caractéristique
1 et 4 2 et 3
Thermostabilité oui Non
Structure de la partie lipidique Lipide A- noyau α-glycerophosphate
Système de polymérisation Dépendant de Wzy Transporteur ABC
Similitude avec la capsule de Klebsiella, Erwinia Neisseria, Haemophilus
28
Pour les groupes 1 et 4, le mode de biosynthèse de ces KPS est un processus
dépendant de Wzy, similairement à celui décrit pour la biosynthèse des antigènes O. Les
unités répétitives sont assemblées sur un récepteur lipidique (l'undecaprenyl-phosphate) à
l’interface entre la membrane cytoplasmique et le cytoplasme au moyen de l’enzyme WbaP.
Ces unités sont ensuite acheminées à travers la membrane interne par Wzx . Ces unités sont
ensuite accrochées à l’ancre lipidique des KPS (Lipide A-cœur) grâce à Wzy. La
polymérisation est ensuite réalisée dans l’espace périplasmique et nécessite la
transphosphorylation de Wzc et la déphosphorylation de Wzb. Une fois les KPS synthétisés,
ils sont acheminés vers la surface de la bactérie via Wza (Figure 11) (Whitfield, 2006).
Figure 11 schéma du processus de biosynthèse et de transfert impliquant l'enzyme Wzy (groupe 1 et 4 de E.coli) (Whitfield,
2006)
Pour les groupes 2 et 3, le processus de biosynthèse implique les transporteurs de type
ABC. Le polysaccharide est dans ce cas synthétisé en totalité dans le cytoplasme sur un
accepteur endogène inconnu. Le polysaccharide est ensuite transféré à l’ancre lipidique
(glycérophosphate pour E.coli) dans le cytoplasme. Il n’a pas été déterminé si ce transfert était
initié avant ou après la fin de la polymérisation. Le lipoKPS est ensuite exporté vers l’espace
périplasmique grâce à aux protéines KpsC et KpsT. D’autres protéines contenues dans le
groupe de gènes comprenant KpsS et KpsC ont été démontrées comme indispensables. Les
enzymes KpsF et KpsU participent à la biosynthèse mais leur rôle demeure inconnu. Le
transport à travers le périplasme et la membrane externe est réalisée par les protéines KpsE et
KpsD (Figure 12) (Whitfield, 2006).
29
Figure 12 : schéma du processus de biosynthèse et de transfert impliquant un transporteur de type ABC (groupes 2 et 3 de
E.coli) (Whitfield, 2006)
Des analogies de structure entre les polysaccharides capsulaires des Rhizobia et les
KPS du groupe II de E. coli ont été trouvées. Les premières structure des KPS de rhizobia ont
été rapportées pour Sinorhizobium fredii USDA205 et Sinorhizobium meliloti Rm41 par
Reuhs et ses collaborateurs (1993). Ces dernières années, des progrès significatifs ont été
accomplis dans l'analyse moléculaire et génétique de la biosynthèse des KPS de
Sinorhizobium meliloti 41. Ils se composent d'unités répétitives dissaccharidiques composées
d'acide glucuronique et pseudaminique substitué par butyrates et d'acétates (Reuhs et al.,
1993, 1998) (fig. 1b).
Trois groupes de gènes sont impliqués dans la production de ces KPS (Kereszt et
al., 1998 ; Putnoky et al., 1990).
La région chromosomique rkp-1 (ancien fix-23) semble déterminer la biosynthèse
d'un porteur lipidique spécifique, nécessaire à la biosynthèse des KPS (Kiss et al., 1997 ;
Petrovics et al., 1993). Des résultats récents, on mis en valeur l'importance des gènes
rkpABCDEF du groupe de gène rkp-1. Quand ils ont été identifiés dans Sm41, ces six gènes
ont été annotés comme gènes codant pour une acide gras synthase (Petrovics et al.,1993).
D'ailleurs, la fonction biochimique de RkpF comme protéine donneur d'acyle a été démontrée
(Epple et al.,1998). Cependant, les données actuellement disponibles permettent une
meilleure prévision de la fonction du produit des gènes codés par rkpABCDEF qui
ressemblent à une protéine multidomaines codant pour une polyketide synthase de type I.
La région chromosomique rkp-2 (codant pour lpsL et rkpK) est impliquée dans le
métabolisme des nucléotides de sucre. rkp-1 et rkp-2 sont en plus indispensables à la
30
production de LPS. Seul le gène rkpK est nécessaire à la seule synthèse de KPS (Kereszt et
al., 1998).
Le dernier groupe de gène rkp-3 située sur le mégaplasmide de pSymB comprend
10 gènes. Six de ces gènes, rkpLMNOPQ, sont impliqués dans la synthèse des précurseurs
spécifiques des sucres et déterminent la composition en saccharide des KPS (Kiss et al.,
2001).
Sinorhizobium meliloti 1021 contient également des groupes de gènes homologues
de rkp-1 et rkp-2, mais le groupe de gènes rkp-3 ne possède que peu de similitudes celui de
Sm41 (Kiss et al., 2001). Toutefois les gènes rkpRSTZ, qui sont peut-être impliqués dans
l'exportation et la polymérisation des KPS, sont des orthologues de ceux de Sm41. Par contre
il n'y a aucun homologue aux gènes biosynthétiques rkpLMNOPQ. Trois paralogues putatifs
du gène de rkpZ de Rm41 sont présents dans cette région du génome Sm1021, mais seulement
un de ces derniers semble coder pour une protéine dans son intégralité. Précédemment, aucun
homologue du gène rkpZ (autrefois noté lpsZ) n'avait pu être détecté par hybridations du type
Southern dans Sm1021 (Williams et al., 1990).
rkpABCDEF codant pour une protéine multidomaine, il n'est pas surprenant, dans Sm1021,
que ces gènes aient été réunis en un seul gène appelée rkpA, qui code pour un long
polypeptide de 2.504 acides aminés. La biosynthèse du lipide par l'intermédiaire des
polyketides-synthases est fondamentalement différente de la voie de synthèse des acides gras.
Bien que les polyketide synthases utilisent les mêmes réactions de base que les acide-gras-
synthases, les cycles de condensation et d'élongation sont souvent abrégés, produisant des
chaînes grasses fortement fonctionnalisées pouvant porter des cétones, des hydroxyles ou des
doubles liaisons (Wallis et al., 2002). Jusqu'ici, le paradigme de l'analogie de la biosynthèse
des KPS de rhizobia avec les entérobactéries a dominé. Par conséquent, il a semblé
embarrassant que S. meliloti utilise un lipide dérivé de polyketide synthase pour la production
des KPS. L'analyse du génome d'autres procaryotes a pourtant fait apparaître clairement que
l'utilisation des lipides dérivés de polyketides synthases, dans la production de KPS, n'est pas
un dispositif singulier de S. meliloti. Un orthologue de rkpA de Sm1021 a été identifié dans
Burkholderia mallei (DeShazer et al.2001) et Bordetella bronchiseptica (Parkhill et al.,
2003). Dans ces deux organismes, le gène orthologue est appelé wcbR et est situé dans le
groupe de gènes codant pour les KPS (DeShazer et al., 2001 ; Parkhill et al., 2003). Depuis
l'identification des gènes de rkpABCDEF dans Sm41 (Petrovics et al., 1993), il a été supposé
qu'un porteur ou du moins une ancre lipidique était exigé pour la biosynthèse des KPS.
Cependant, aucune partie lipidique n'a été détectée dans les KPS de grande taille de Sm41
31
(Reuhs et al., 1993). Des recherches récentes sur les KPS de petite taille de Sm1021 ont
indiqué la présence d'une ancre lipidique attachée aux polyKdo (Fraysse et al., 2005).
5 Analyse des oligosaccharides par spectrométrie de masse.
Les polysaccharides possèdent un intérêt biologique tout particulier, puisqu'ils interviennent
dans de nombreux processus biologiques (reconnaissance, adhésion, différenciation cellulaire
etc...). La compréhension de la relation liant leur structure et leur activité est donc un domaine
important d’investigation. La spectrométrie de masse est un outil de choix pour l'analyse
structurale des sucres. Elle offre des résultats précis, une polyvalence analytique et une
sensibilité élevée pour des composés de nature et de compositions diverses. Il existe quelques
revues récentes concernant l’analyse des sucres par spectrométrie de masse, desquelles est tiré
ce paragraphe (Zaia, 2004 ; Harvey, 1999 et 2006 ; Morelle et al., 2005). Nous présenterons
dans la suite l’intérêt que présentent différentes techniques d’ionisation ou d’analyses
spectrometriques de masse pour l’étude des saccharides.
5.1 Les sources et modes d’ionisation
5.1.1 Bombardement par des atomes rapides (FAB)
Cette méthode peut s’avérer être utile, bien qu’elle n’ait été commercialisée que sur un
période courte (10 ans), laissant la place belle à l’électrospray. Cette méthode utilise un
faisceau d'atomes neutres (Argon) de grande énergie cinétique pour l'ionisation de substances
non volatiles, ionisées ou non, présentes sous forme de solution dans une matrice de glycérol
ou thioglycérol. L'ionisation s'effectue à température ambiante et fournit en abondance des
ions pseudo-moléculaires ([M+H]+ ou [M+Na]+en mode positif ou [M-H]- en mode négatif).
L’analyse à partir d'une source d'ions de type FAB nécessite souvent une dérivation dont les
plus utilisées sont la perméthylation et le peracétylation en raison de l'accroissement de la
sensibilité présentée par ces dérivés qui est de 10 à 50 fois meilleure que celle d'échantillons
natifs. De plus l'analyse en FAB-MS des oligosaccharides perméthylés et peracétylés produit
des données concernant la séquence saccharidique, qui ne sont pas accessibles avec les
échantillons natifs. Les spectres de FAB-MS sont caractérisés par les ions moléculaires
abondants [M+H]+ et [M+Na]+ fournissant des informations sur leur composition. En outre,
pendant l'ionisation, l'énergie interne forte donnée aux molécules, produit la fragmentation
32
des liaisons labiles. En fait, les fragments produit sont des ions terminaux non-réducteurs
issus de la rupture intracyclique (ions type A) ou terminaux réducteurs de la jonction osidique
(ions de type Y). Quand les sucres aminés sont présents, la fragmentation de type Y se produit
du côté non-réducteur en formant un ion B, principalement dans les composés peracetylés et
exclusivement pour ceux perméthylés.
Souvent associées à des analyseurs de type magnétique, les sources FAB produisent des
spectres permettant de déduire grâce à la valeur précise des m/z des ions moléculaires ainsi
qu’à celles des masse perdues, des informations quant à la structure de ces oligosaccharides et
cela à des concentrations très faibles, de l'ordre du picomolaires.
5.1.2 Ionisation par Desorption Assistée par Laser (MALDI)
L’ionisation de type MALDI a été développée au milieu aux années 1980 pour l'analyse des
molécules ayant de grands poids moléculaires (protéines intactes jusqu’à 200kDa).
Cependant, il est devenu évident que beaucoup d'autres types de composés, y compris des
oligosaccharides, pourraient être analysés par cette technique à des concentrations
extrêmement faibles (femtomoles -picomoles). L’ionisation MALDI est 10 à 100 fois plus
sensible que la FAB pour l'analyse des glycoprotéines et des dérivés de N-glycanes. Dans une
expérience MALDI, l'échantillon est mélangé à une matrice de faible masse moléculaire (par
exemple l’acide 2,5-dihydroxybenzoique) absorbant dans l'ultraviolet à la longueur d'onde du
laser (337 nm pour le laser à azote habituellement utilisé). Le mélange est alors cristallisé par
évaporation du solvant (la technique "de gouttelette sèche") et l'ionisation est effectuée par un
laser pulsé. La matrice absorbe l'énergie de l'impulsion de laser qui est transférée à
l'échantillon, par des mécanismes qui jusqu'à ce jour sont inconnus. Le transfert d'énergie à la
matrice a comme conséquence la désorption de la matrice et de l'analyte de la surface de la
cible sur laquelle ils avaient été déposés. Les ions ainsi formés sont présents dans la phase
gazeuse, ils peuvent être électrostatiquement extraits, puis accélérés vers un analyseur de
masse à temps de vol. Il existe un grand nombre de matrices dont le choix dépend du type
d'oligosaccharide à étudier (l'acide 2,5-hydroxybenzoïque pour les oligosaccharides neutres et
la 6-Aza-2-thiothymine ou la 2,4,6-trihydroxyacetophenone pour les oligosaccharides acides
(Harvey, 1999)) .
33
Une ionisation de type MALDI permet la formation prédominante d'ions moléculaires
monochargés et produit très peu d'ions fragments. Habituellement, les oligosaccharides
donnent des espèces de type [M+Na]+ comme ion principal. Cet ion est souvent accompagné
d'un plus faible [M+K]+. La MALDI-MS est donc la technique prépondérante pour examiner
les ions moléculaires particulièrement quand une sensibilité élevée est exigée. Elle est
particulièrement adaptée aux mélanges oligosaccharidiques.
L'inconvénient majeur de cette technique pour l’analyse des sucres réside dans l'analyse des
sucres acides de type acide 2céto-3-desoxy ulosonique et uronique, qui possèdent une faible
ionisation, car il se forme à la fois des ions de type [M+Na]+ et [M-H]- ainsi qu’une multitude
de pics liés à des adduits de sodium ou potassium et à une dégradation aisée. Pour les acides
ulosoniques, l'énergie d'ionisation produit une fragmentation au niveau de l'hydroxyle
anomérique des acides ulosonique ou une décarboxylation. Les acides uroniques semblent
quant à eux stable dans les conditions d'analyse.
5.1.3 Ionisation par “ElectroSpray” (ESI)
La spectrométrie de masse à ionisation Electrospray est un outil puissant pour l'analyse de
molécules de grandes tailles et non-volatiles, notamment celles d'intérêt biologique, et a
contribué aux progrès en sciences de la vie. L'ESI a révolutionné l'analyse des biopolymères
labiles, avec des applications s'étendant de l'analyse des ADN, ARN, oligonucléotides,
protéines, glycoprotéines, sucres, lipides, glycolipides, et lipopolysaccharides. Dans ce mode
d'ionisation, une solution contenant les analytes est injectée à un débit de quelques
microlitres/min par un capillaire en métal, tenu au potentiel élevé. L'effet du champ électrique
élevé sur la solution produit la formation d'une nébulisation (spray) dont les gouttelettes sont
fortement chargées. Le gaz, la chaleur, ou l’association des deux, sont appliqués aux
gouttelettes fortement chargées, faisant évaporer le solvant. La taille des gouttelettes diminue
. Lorsque les gouttelettes atteignent la taille critique pour laquelle les forces coulombiennes de
surface surpassent les forces de tensions de surface, les gouttelettes explosent en de plus
petites gouttelettes. Ce processus continue jusqu'à ce que soit atteint le point où un ion
désorbe d'une gouttelette et se retrouve en phase gazeuse (le solvant est complètement
éliminé). Le mécanisme exact de la formation des ions est en discussion, et il est probable que
différents mécanismes s'appliquent en fonction de l'analyte et du solvant. Les composés ainsi
libérés peuvent alors porter plusieurs charges. La distribution de charge est proportionnelle au
34
nombre de groupements ionisables présents dans la molécule. Les ions sont accélérés vers un
analyseur de masse par une série de lentilles. L’electrospray possède deux intérêts majeurs
pour la caractérisation de biopolymères : une ionisation efficace et la capacité d'obtenir des
ions multichargés. La première permet de produire des faisceaux d'ions intenses tandis que la
seconde permet de transmettre des composés de masse molaire élevée. Le procédé
d'ionisation dans ESI-MS est très doux, ayant pour résultat peu ou pas de fragmentation. La
fragmentation peut être induite par la manipulation de la tension des lentilles de la source
d'ion, appelées cônes, ou par collision des ions dans une région choisie du spectromètre de
masse : le quadridôle de collision situé entre deux analyseurs de masse. La dernière approche
est habituellement préférable, puisqu'elle permet la sélection d'un ion précurseur par le
premier analyseur et un meilleur contrôle de la fragmentation dans la chambre de collision.
Pour cette raison, beaucoup d'analyseurs couplés à l'ESI sont des analyseurs dit en tandem qui
permettent la détection des ions fragments produits par la collision (dissociation induite par
collision (CID) des ions moléculaires. Cette analyse est appelée expérience MS-MS : l'ion
parent est choisi par le premier analyseur et les ions fragments sont étudiés par le deuxième
analyseur. Bien que les instruments triple-quadripôles soient le plus largement répandus,
l’ESI peut également être couplé avec des analyseurs « ion-trap », temps-de-vol (ToF)et des
analyseurs de masse hybrides. Avec des analyseurs « ion-trap », les analyses multi-étapes
(MSn) sont possibles et sont très utiles pour l’analyse des oligosaccharides car elles
permettent l'analyse des ramifications osidiques. La technique Q-TOF (spectromètre hybride
entre un quadripôle et un temps de vol) est également compatible avec l'ESI et a montré des
données analytiques extrêmement sensibles.
5.1.4 Ionisation par Désorption par electrospray (DESI)
Ces dernières années, la recherche s’est concentrée sur le développement de nouvelles
techniques d’ionisation. L’analyse de solides à pression atmosphérique est facilement mise en
application sur les sources d’ionisation existantes (ESI/APCI). Récemment, l'ionisation Par
désorption par electrospray (DESI) a été mise au point par une société américaine (Prosolia).
En DESI, des gouttelettes de solvant chargées sont accélérées par un gaz (azote) à haute
pression vers une surface sur laquelle les analytes ont été déposés. Après impact, des
gouttelettes secondaires contenant l’analyte sont formées et envoyées vers l’analyseur de
masse. L'analyse des espèces de haute masse (>20kDa) est une de ses limitations. Ceci peut
35
être partiellement expliqué par l'incapacité du jet de solvant à dissoudre des protéine (ou toute
autre molécule) de grande taille de la surface de la cible. De ce fait un problème de désorption
est créé et diminue la sensibilité globale de l'analyse pour des espèces de haute masse molaire.
En raison de sa sensibilité élevée pour de plus petites molécules, la DESI semble
particulièrement adaptée à l'étude des oligosaccharides (Bereman et al., 2007). La
comparaison des spectres de masse du même échantillon analysé par MALDI-FTICR et
DESI-FTICR sont presque identiques et ce, malgré les différents mécanismes d’ionisation (la
DESI étant réalisée à pression atmosphérique tandis que la MALDI est exécutée sous vide).
Bereman et ses collaborateurs ont observé plus de crêtes dans le spectre de masse obtenu en
DESI dues à des formes protonées et sodées des glycanes, tandis que dans le spectre obtenu
en mode d’ionisation MALDI, seuls les adduits au sodium sont présents. La similitude entre
les deux spectres démontre le potentiel de DESI-FT-ICR-MS pour les études
d’oligosaccharides dans des échantillons complexes.
5.2 Mode de fragmentations des oligosaccharides
La nature des monosaccharides, les ramifications, et éventuellement les modes de liaisons
peuvent être déterminés grâce à la fragmentation. La dissociation induite par Collision (CID)
des glycoconjugés a comme conséquence l'observation des ions qui correspondent à la
coupure de la partie oligosaccharide de la molécule. Typiquement, ces ions sont produits avec
une plus grande abondance pour cette partie que ceux produits pour la partie non-
oligosaccharide des glycoconjugés. La nomenclature utilisée en spectrométrie de masse pour
la fragmentation des oligosaccharides est montrée sur le Figure 13. Les ions fragments qui
contiennent la partie non-réductrice sont marqués avec les lettres majuscules du début de
l'alphabet (A, B, C), et ceux qui contiennent l'extrémité réductrice de l'oligosaccharide ou de
la partie non-oligosaccharide sont marqués avec des lettres de la fin de l'alphabet (X, Y, Z).
Les ions produis à partir de la rupture des résidus successifs sont marqués : Am, Bm, et Cm,
pour l'extrémité non-réductrice et le Xn, Yn, et Zn, pour l’extrémité réductrice. Notez qu’Y0
et Z0 se rapportent à la fragmentation de la partie non saccharidique. Les ions de type A et X
sont produits par la rupture intracyclique, et sont marqués en indiquant les liaisons impliquées
dans la coupure en partant de la liaison hémicétal intracyclique (0) et en augmentant l’indice
dans le sens des aiguilles d’une montre. La figure 13 montre l’exemple de deux ions
fragments obtenus par ce type de coupure (0,2A1 et1,5X1).
36
Figure 13 nomenclature des fragments obtenus en MSn (Zaia, 2004)
Pour la spectrométrie de masse en tandem des oligosaccharides, il y a plusieurs possibilités
concernant l'état de l'ion précurseur, dont le choix influencera nettement le modèle de
fragmentation, et ainsi l'information structurale produite. Pour les oligosaccharides natifs, les
possibilités incluent la présence d’ions protonés [M+nH]n+, les ions déprotonés [M-nH]n- et
les adduits sodium[M+Na]+. Ils sont monochargés en MALDI et multichargés en ESI. Les
principes de la fragmentation des oligosaccharides pour la MSn ont été étudiés avec
l'ionisation par bombardement rapide d'atome (FAB). Lorsque l’ionisation est de faible
énergie, on observe plus particulièrement les fragments de type Y et B. Lorsque l’énergie est
plus grande tous les fragments sont observés. La fragmentation impliquant une charge à
distance exige plus d'énergie que la fragmentation induite par une charge, et le degré avec
lequel la fragmentation se produit est proportionnel à la taille de cation impliqué.
L’utilisation de grandes énergies en CID augmente la teneur en information des spectres de
masse mais rend l’analyse des spectres plus délicate.
En plus de l’importance de l’énergie de collision pour l’obtention de fragments, la
nature des sucres et la linéarité des molécules influencent la production des fragments. Pour
les oligosaccharides protonés et cationisés, la présence des résidus de HexNAc place une
charge sur l'azote de l'amide. La proximité de cette charge de l'oxygène anomérique
prédispose à la rupture au niveau de l’HexNAc. Un modèle semblable est observé pour des
oligosaccharides deprotonés en mode négatif. La présence de sucres particuliers tels les acides
2-céto-3-désoxy-octuolosonique produit la présence prépondérante en négatif et en positif de
fragments obtenu après scission de la liaison glycosidique les impliquant. Les résultats
obtenus en MALDI-FTMS sur des oligosaccharides alcalino-cationisés ont montré une
corrélation entre le degré de ramification des oligosaccharides et le degré de fragmentation.
En effet plus un oligosaccharide est ramifié moins il produit de fragments (Zaia, 2004).
37
L’analyse par spectrométrie de masse des oligosaccharides a subit au cours de ces
dernières années de grands progrès. Malgré cela l’analyse des oligosaccharides ramifiés reste
difficile. De plus il est toujours nécessaire de coupler cette méthode analytique performante
avec d’autre méthodes afin de déterminer la composition saccharidique mais aussi de
déterminer le mode de liaison.
Dans le cadre de ce travail de thèse, l'instrument dont nous disposons au sein du
groupe spectrométrie de masse, fluorescence et bioanalytique du laboratoire des IMRCP est
un ESi-Q-Tof Ultima commercialisé par la société Waters. Cet instrument, au vu de la
littérature est bien adapté à notre problématique et devrait nous avancer dans l'analyse
structurale des polysaccharides de surface de rhizobia. Néanmoins, comme il sera signalé au
cours de ce travail, nous avons eu recours à des analyses complémentaires en MALDI-Tof
(Brücker Daltonic, Billerica, MA, USA) et FT-ICR (Thermo Fisher, San Jose, CA). Ce
dernier appareil étant localisé à l'Université de Borstel (Allemagne), il n'a pu être utilisé sur
tout son panel d'applications.
38
6 Mise en perspective des travaux de thèse
Les polysaccharides de surface des Rhizobia jouent un rôle important dans les
processus symbiotiques. Dans chaque interaction hôte/invité, différents polysaccharides
peuvent être impliqués. Ainsi, le rôle des signaux polysaccharidiques au niveau de la plante
est complexe. Deux composés peuvent induire la même réponse chez la plante, en empruntant
un chemin de transduction différent. De fait, un phénotype découlant d’une mutation que l’on
croit avoir identifié, de par la séquence du gène affecté, peut induire une modification
structurale au niveau d’un autre composé, qui est à l’origine du phénotype observé. De même,
l’absence de modification d’un phénotype par mutation peut-être dû à une compensation par
une autre molécule, qui rétablit le phénotype de la souche sauvage.
C’est dans le contexte compliqué des relations structure/activité que nous nous plaçons
pour considérer les polysaccharides de surface, et plus particulièrement les KPS de Sm1021.
Pour cela, nous avons étudié différents jeux de mutations, impliquant des modifications sur
les exopolysaccharides, mais aussi sur les KPS. Les répercussions structurales de ces
mutations sur les structures des KPS et leur effet sur le processus symbiotique font l’objet des
études menées au cours du premier chapitre. Pour mener à bien ces recherches, nous avons été
amenés à développer une technique nouvelle au laboratoire : le couplage HPAEC-PAD-MS
qui fait l'objet du chapitre 2. Enfin, dans un troisième chapitre, nous avons tenté d’élucider la
structure de l’oligosaccharide de cœur des LPS de Sm1021. Celui-ci, en effet, en raison de la
complexité des polysaccharides de faible taille, n’avait pas pu être caractérisé à ce jour.
39
II-Résultats.
40
41
Chapitre 1 : Caractérisation des KPS de haute masse
molaire, actifs dans la symbiose fixatrice d'azote : rôle de
rkpZ1 et rkpZ2 chez Sm1021.
CONTEXTE
La taxonomie des Rhizobiaceae a connu de profonds remaniements au cours des dix
dernières années, du fait de l'abandon du spectre d'hôte comme critère important pour la
définition des espèces, et de l'adoption des critères généraux de la classification bactérienne
(Vandamme et al., 1996). L'étude des gènes codant pour I'ARN ribosomique 16s a démontré
la proximité phylogénétique entre les genres Rhizobium et Agrobacterium d'une part, et entre
Bradyrhizobium, Rhodopseudomonas et Nitrobacter d'autre part. Ces relations
phylogénétiques ont été confirmées par d'autres techniques de taxonomie complémentaires,
permettant de caractériser les bactéries à différents niveaux de la cellule (taxonomie dite
"polyphasique"). Ce qui a permis d'aboutir à une classification plus précise (Young et al.,
1996). Ainsi, la classification actuelle des bactéries nodulants les légumineuses basées sur les
séquences de l’rARN 16S parait satisfaisante. Un arbre phylogénique a pu être construit
(Figure 1). Sur ce diagramme, Nous pouvons observer que des souches telles que
Sinorhizobium meliloti et Rhizobium leguminosarum appartenait précédemment au même
genre Rhizobium, malgré leur éloignement génétique. Par ailleurs, certaines branches
d'Agrobacterium se trouvent à présent mêlées avec des Rhizobium, engendrant une
classification nouvelle pour ces genres pour laquelle une nomenclature s'est imposée. La
nouvelle nomenclature a permis de classer les bactéries nodulants les légumineuses en 12
genres différents : Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Ochrobactrum, Allorhizobium,
Azorhizobium, Methylobacterium, Bradyrhizobium, Blastobacter, Devosia, Burkholderia et
Ralstonia (Zakhia et al., 2006). De ce fait les bactéries du genre Rhizobium meliloti (Rm) ont
été renommées Sinorhizobium meliloti (Sm).
42
Figure 1: Arbre phylogénique des Rhizobia et α-proteobacter basé sur le séquençage du rARN 16S. Cet arbre a été construit
en utilisant la méthode « neighbor joining » dans le logiciel ClusyalW. Le numéro accolé à l’espèce correspond à son numéro
d’accès dans Genebank (Terefework, 2002).
S. meliloti est capable de produire différents types de polysaccharides de surface
incluant les LPS, les KPS, les EPS (présents sous deux formes : les EPS I ou succinoglycanes,
et les EPS II), et les glycanes cycliques. À l'inverse des autres composants de la paroi
bactérienne, les KPS sont propres aux différentes souches (Reuhs et al., 1998). Comme nous
l’avons vu précédemment, les KPS de S meliloti et S. fredii sont composés d’une unité
répétitive à différents degrés de polymérisation. Cette unité est un dimère composé d'un
hexose et d’un acide 2-céto-3-désoxy-ulosonique (Figure 2) (Reuhs et al., 1998).
43
Figure 2: Modèle consensus structural des KPS établi par Reuhs et al. en 1998. Kdx représente les sucres de la famille des
acides 2-céto-3-désoxy-ulosonique dont les principaux représentants sont le Kdo, l'acide pseudaminique et l'acide
neuraminique.
À ce jour, le rôle des KPS dans la symbiose fixatrice d’azote n’a été étudié que pour la
souche Sinorhizobium meliloti 41 (Sm41) et son mutant exoB (AK631) (Kiss et al., 2001).
Pour cette souche, les KPS consistent en la répétition d’un disaccharide, composé d’un acide
glucuronique et d’un acide pseudaminique 5N-acétylé-7N-hydroxybutyrylé (Reuhs et al.,
1998). Ils sont facilement visualisables sur gel de polyacrylamide grâce à une coloration au
bleu d’alcian. Ces KPS possèdent une taille allant de 4 à 30 kDa.
En 2001, grâce à une série de mutations, Kiss et al. ont pu préciser le rôle de ces KPS
dans la symbiose fixatrice d’azote. Pour cela, une première mutation portant sur les
exopolysaccharides (exoB) a été réalisée. Ce mutant ne peut pas produire d’EPS, mais est
toujours capable de synthétiser des KPS. Toutefois, cette mutation est susceptible d’affecter la
biosynthèse des LPS, qui demeurent synthétisés, mais dont la conservation de structure n’a
pas été démontrée. Auparavant, il a été prouvé (Becker et al., 2006) que les EPS I sont
indispensables au processus d’infection et donc à la mise en place du phénotype fixateur de
l’azote. Or, le mutant ExoB (au contact de Medicago sativa) induit la formation de nodules
roses, capables de fixer l’azote, chez la plante hôte. Cela signifie que les LPS ou les KPS
44
peuvent pallier cette délétion. Pour déterminer lequel des deux polysaccharides de surface est
capable de se substituer aux EPS, un double mutant a été construit. Ainsi, la délétion du gène
rkpZ produit, avec exoB, un mutant symbiotiquement déficient. Les auteurs ont pu constater
que la délétion de ce gène rkpZ chez la souche Sm41 déficiente en exopolysaccharides
(AK631) entraîne un phénotype Fix- (la souche n’est plus capable d’entrer en symbiose avec
sa plante hôte) et une altération dans sa sensibilité aux phages. Ce mutant est toujours
incapable de synthétiser les EPS et produit en plus des KPS de taille modifiée. En effet, un gel
de polyacrylamide a été réalisé, dans lequel il a été observé que les KPS ainsi produits ont de
très hautes masses molaires (25-30 kDa). Il est important de signaler que seule la distribution
de la taille des KPS est affectée (William et al., 1990; Reuhs et al., 1995). Le gène rkpZ est
ainsi considéré comme codant pour une protéine déterminant la longueur de la chaîne des
KPS. Grâce à ces expériences, les auteurs ont pu déduire que les KPS de taille moyenne
étaient capables de remplacer les EPS de taille similaire (les succinoglycanes EPS I) dans la
symbiose fixatrice d’azote.
Cette étude quant au rôle des KPS est restée très isolée. Or, puisqu’il a été montré que
la structure des KPS est fonction de la souche (et non plus de la famille ou du genre), il est
important de voir si cette étude peut-être étendue à d’autres souches. Sinorhizobium meliloti
1021 a été choisie, il y a environ une dizaine d’années, en tant que modèle européen pour
l’étude des mécanismes de la mise en place de la symbiose fixatrice d’azote avec sa plante
hôte Medicago truncatula. Son génome a été totalement séquencé (Galibert et al., 2001). Ce
n’est que récemment que les polysaccharides de surface de cette souche ont été étudiés. Or,
cette souche, Sm1021, est de ce point de vue très différente des autres souches de S. meliloti
déjà étudiées. Ainsi les polysaccharides de surface de celle-ci ne sont présents que sous forme
de composés de basse masse molaire. Récemment, il a été démontré que les KPS de cette
souche étaient des homopolymères constitués uniquement de Kdo. En dehors de la nature
particulière de l’enchaînement saccharidique, qui sort du modèle consensus (un acide
ulosonique et un hexose), ces KPS possèdent en plus une ancre lipidique (Fraysse et al.,
2005). Leur taille est proche de celle des LPS, soit environ 4000 Da, ce qui correspond à un
degré de polymérisation de l’ordre de 15 à 20 Kdo.
Bien avant d’avoir déterminé la structure de ces KPS, une étude quant à leur activité
symbiotique avait été menée. A titre de comparaison avec la souche voisine Sm41, une
mutation du gène exoB, induisant une déficience en exopolysaccharides, avait été effectuée. A
45
contrario de ce qui avait été obtenu dans le cas de la souche Sm41, le mutant de Sm1021 était
incapable d’entrer en symbiose avec sa plante hôte, la luzerne (Niehaus et al., 1998). La
déficience symbiotique de Sm1021 exoB peut être levée par l’insertion dans ce mutant du
plasmide pMW23 issu de Sm41 (William et al., 1990; Reuhs et al., 1995). Le plasmide
pMW23 obtenu à partir de la souche Sm41 contient les gènes impliqués dans la biosynthèse
des KPS (rkpS-Z), avec le gène rkpZ en multicopie. Ce gène est absent chez Sm1021
(William et al., 1990). Tout comme pour la souche Sm41, le gène rkpZ induit en plus d’une
modification de la taille, une altération de la sensibilité au phage. En effet, les KPS ainsi
synthétisés par Sm1021 exoB pMW23 ont une réactivité à l’encontre du sérum polyclonal
obtenu à partir des KPS de Sm41 (Reuhs et al., 1995). Ceci semblerait indiquer que
l’introduction du plasmide pMW23 résulterait en la synthèse des KPS de Sm41 en lieu et
place des KPS de Sm1201.
Dans ce chapitre, nous allons nous intéresser à la caractérisation structurale des KPS
produits par Sm1021 exoB pMW23, mais aussi à la structure et au rôle de l’ancre lipidique
des KPS de Sm1021, dont la présence a été récemment démontrée (Fraysse et al., 2005). La
présence d’une ancre sur les KPS n’est pas courante dans la famille des Rhizobia. Sm1021 est
même la seule souche pour laquelle la présence d’une ancre à été démontrée (Fraysse et al.,
2005). Toutefois, cette particularité chez les Rhizobia est fréquente chez les bactéries
pathogènes à Gram négatif telles que Nesseria meningitis (Tzeng et al., 2005), Escherichia
Coli (Withfield et al., 2006), Campylobacter jejuni (Corcoran et al., 2006), Salmonella
enteridis (Snyders et al., 2006), Haemophilus influenzae (Kuo et al., 1985), Enterobacter
aerogenes (Troy et al., 1971), et même parmi certaines pathogènes à Gram positif comme
Mycobacterium kansasii (Maes et al., 2007) et Streptococcus pneumoniae (Forsee et al.,
2006). Pour ces bactéries, le rôle et la structure de l’ancre sont connus. Pour E. Coli, il existe
deux types d’ancres dépendant du type de polysaccharide capsulaire. Pour les types 1 et 4,
l’ancre possède la structure du lipide A des LPS. Pour les types 2 et 3, il s’agit d’un
phospholipide de type phosphatidylglycérol portant deux acides gras sur le glycérol. Il en est
de même chez N. meningitis et S. pneumoniae. Dans ces différents cas, le sucre cétoacide est
lié au phosphate du phospholipide. Pour M. kansasii il s’agit d’un phosphatidylmyoinositol.
La partie saccharidique est alors attachée à l’ancre grâce au myoinositol. Dans ces différentes
souches les acides gras présents estérifient toujours le glycérol et sont de type classique, c’est
à dire à 16 ou 18 atomes de carbone, saturés ou monoinsaturés (dans la majorité des cas il
s’agit d’un palmytoyl). Toutefois, des exceptions existent, puisque pour la souche E.
46
aerogenes, l’ancre est composée d’un undecaisoprenyldiphosphate (Figure 3). Pour les
souches de bactérie de type Gram négatif, l’ancre permet le transfert des KPS vers la
membrane externe et de l’y ancrer ou « attacher ». Toutefois, à ce jour, leur rôle dans le
processus d’infection demeure peu étudié.
Figure 3 : Structures des différentes ancres de KPS issus de bactéries pathogènes de types Gram négatif.
Dans le cas des bactéries de type Gram positif, en plus de son action antiphagocytique,
l’ancrage du KPS dans la paroi cellulaire est requis dans le processus d’invasion (Morona et
al., 2006). Pour les souches de type Gram négatif, deux études principales ont été réalisées.
La première porte sur la souche N. meningitis. Dans ce cas, malgré l’effet négatif de la
présence des KPS sur la bactérie lors de l’adhésion à la paroi, ces même KPS sont
indispensables à la survie de la bactérie dans le milieu intracellulaire. Leur action est
supposée se dérouler face aux peptides antimicrobiens cationiques (Spinosa et al., 2007). La
seconde concerne la souche C. jejuni pour laquelle il a été montré qu’à contrario de l’étude
précédente, les KPS sont nécessaires à la fois lors de l’adhésion et de l’invasion (Bacon et al.,
2001 et Bachtiar et al., 2006).
47
Nous avons voulu répondre à la question « existe-t-il des modifications structurales
majeures au niveau des KPS lors de l’insertion du plasmide pMW23 chez Sm1021 comme
l’ont suggéré Reuhs et al., en 1995 ? ». Nous avons donc analysé la structure des KPS ainsi
modifiés et étudié plus en détail les raisons de la suppression et de la restauration du
phénotype symbiotique. Nous allons démontrer au cours de ce chapitre que la structure
primaire des KPS de Sm1021 n’a pas subit de modifications majeures lors de l’introduction
du plasmide pMW23, puisque les changements observés incluent à la fois une augmentation
du taux de polymérisation mais aussi l’augmentation de la production de l’ancre lipidique du
KPS.
Une étude complémentaire, afin de confirmer les résultats précédemment obtenus sur
le rôle des KPS chez Sm41 a été réalisée. En effet, la mutation exoB est très importante et ne
touche pas uniquement la biosynthèse des EPS mais aussi celle des LPS, puisque son effet
intervient dans la biosynthèse de l’UDP-glucose-4-épimérase. C’est pourquoi une étude
comparative avec une mutation moins drastique exoY a été effectuée. Par ailleurs, nous avons
pu, au cours de notre recherche, déterminer la présence de deux paralogues de RkpZ dans
Sm1021. Ceux-ci sont impliqués dans la production des KPS, mais ne semblent pas contrôler
leur taux de polymérisation. Nous avons essayé de déterminer la fonction des KPS de
Sm1021et d'en étudier le mode de synthèse.
48
49
RESULTATS
1 Choix de la mutation et effet du plasmide pMW23 sur la biosynthèse des KPS
L’analyse de l’effet du plasmide pMW23 a été réalisée au moyen des souches Sm1021
et Sm2011 afin de s’assurer que les légères différences génétiques, existant entre ces deux
souches affiliées, ne rentrent pas en jeu, de plus, ces deux souches ont des spectres d'hôte
légèrement diffèrents. Le plasmide pMW23 contient en multicopie un fragment génomique de
Sm41 incluant les gènes rkpZ, rkpS et une partie de rkpT. Contrairement à RkpZ, les protéines
RkpS et RkpT ne sont pas nécessaires pour l’expression des KPS riches en Kdo (Kiss et al.,
2001). Ils sont apparentés à la famille des transporteurs ABC. La mutation de ces deux gènes
n'induit pas de modification visible sur gel d’électrophorèse DOC-PAGE : l'export du KPS est
donc toujours assuré malgré l'absence de ces protéines.
La capacité du plasmide pMW23 à lever la déficience symbiotique des mutants EPS-
chez Sm1021 a, par le passé, été étudiée à partir d’une mutation exoB (Williams et al., 1990;
Reuhs et al., 1995). Les auteurs avaient démontré que les autres composés de surface présents
n’étaient pas capables de se substituer aux EPS puisque le mutant ne formait pas de nodule
viable. Une nuance a pourtant dû être apportée, car la mutation utilisée lors de cette étude était
de type exoB. Or, exoB possède un phénotype dit pléiotrope (Niehaus et al., 1998), c'est-à-dire
que le gène intervient dans plusieurs voies de biosynthèse. Ainsi exoB est impliqué dans la
biosynthèse d’un précurseur saccharidique : l'UDP-glucose-4-épimerase, requis à la fois pour
les EPS I, EPSII et les LPS (Niehaus et al., 1998). L'incapacité du mutant Sm1021 exoB à
réaliser la symbiose n'est peut-être pas uniquement due à l'absence des EPS mais aussi à une
modification dans la séquence saccharidique du cœur des LPS. Pour nous affranchir de ce
problème, nous avons donc réalisé l’étude qui va suivre à partir d’une mutation exoY codant
pour la première glycosyltransférase de la voie de biosynthèse des EPS I (Niehaus et al.,
1998). Par ailleurs, pour déterminer si la pléiotropie d’exoB a une influence sur le phénotype
conditionné par le plasmide pMW23, nous avons également étudié les polysaccharides de
surface après transfert du plasmide pMW23 dans le mutant Sm2011 exoB.
50
L’étude qui suit porte donc sur l’analyse des polysaccharides de surface de différents
mutants et souches sauvages :
Tableau 1: Différentes souches étudiées lors de ce travail. : à chaque souche est indiquée le phénotype qui résulte de la
mutation (délétion ou complémentation), ainsi que leur provenance et/ou les références bibliographiques qui s’y rapportent.
Souche phénotype référence, source
Sm1021 SU47 résistant à la streptomycine Meade et al., 1982
INRA Toulouse
Sm1021 exoY déficient en EPS
Larissa Sharypova faculté de génétique groupe de A.
Becker à l'université de Bielefeld
Sm1021 exoY pMW23
déficient en EPS et complémenté par un plasmide portant en multicopie le gène
rkpZ
Larissa Sharypova groupe de A. Becker à
l'université de Bielefeld
Sm1021 rkpZ1
déficient en KPS Larissa Sharypova groupe
de A. Becker à l'université de Bielefeld
Sm1021 rkpZ1 exoY
déficient en EPS et en KPS Larissa Sharypova groupe
de A. Becker à l'université de Bielefeld
Sm1021 rkpZ1 pPHU115
déficient en KPS et complémenté par un plasmide contenant le gène rkpZ
Larissa Sharypova groupe de A. Becker à
l'université de Bielefeld Sm2011 SU47
Sm41 exoB déficient en EPS
Putnoky et al., 1990 Larissa Sharypova groupe
de A. Becker à l'université de Bielefeld
Sm41 exoB rkpZ déficient en EPS et muté dans la
biosynthèse des KPS
Larissa Sharypova groupe de A. Becker à
l'université de Bielefeld
Sm41 exoB rkpZ pMW23
déficient en EPS et muté dans la biosynthèse des KPS et complémenté par un plasmide portant en multicopie le gène
rkpZ
Larissa Sharypova groupe de A. Becker à
l'université de Bielefeld
Sm1021 acpXL (AcpXL) mutation d’une protéine permettant le transport d'acide gras à longue chaîne
Ferguson et al., 2005 Larissa Sharypova groupe
de A. Becker à l'université de Bielefeld
Sm1021 smc04270 mutation qui par effet polaire déléte le gène lpxXL qui est une acyltransférase
INRA Auzeville
Sm1021 rkpA mutation sur une protéine possédant une
forte homologie avec une polyketide synthase
Kerestz et al., 1998 Larissa Sharypova groupe
de A. Becker à l'université de Bielefeld
51
La première analyse réalisée sur les composés de surface de ces mutants se fait au
moyen d'un gel DOC-PAGE à partir des extraits polysaccharidiques bruts (Figure 4). Nous
pouvons observer que l’addition du plasmide pMW23 sur Sm1021 directement ou sur son
mutant exoY induit l’apparition de KPS de grande taille. En effet, une large bande colorée en
bleu se situant bien au-dessus des LPS de faible masse molaire (r-LPS) indique que leur taille
varie entre 4-30 kDa. La couleur bleue la plus intense se situe dans le domaine de masse
proche des LPS de haute masse molaire (s-LPS). Dans le cas de la mutation exoB, nous
observons sur le gel une nette diminution de la quantité de LPS produits (qui se colorent en
brun-jaune), mais ceux-ci conservent leur taille. Ainsi seule une partie du cœur pourrait être
touchée par cette mutation. En effet, si seuls quelques sucres sont modifiés, la différence dans
la taille apparente ne serait pas visible sur le gel qui est à 18% d’acrylamide utilisé.
De cette analyse, nous pouvons déduire que la mutation exoB altère en partie la
structure, ou tout du moins le taux de production, des LPS (conformément à ce que laissait
supposer la prédiction de gène). Le mutant exoB ne sera donc pas utilisé pour le reste de notre
étude puisque pour déterminer le rôle et la structure des KPS obtenus par addition de pMW23,
il est souhaitable que de la biosynthèse des sucres soit aussi conservée que possible. Par
ailleurs, le profil obtenu avant ou après la mutation exoY indique que l’insertion de pMW23
produit le même effet sur le fond Sm1021 et dans son mutant exoY. En effet, ces KPS ont
même intensité et même taille dans les deux cas. Pour ces raisons, nous étudierons le mutant
déficient en EPS I, obtenu par la mutation exoY. Les différences génétiques entre Sm1021 et
Sm2011 ne semblent pas, avoir d’influence sur les composés de surface saccharidiques
puisque là encore le profil electrophorétique obtenu semble le même. Cette similitude a été
confirmée par des analyses en spectrométrie de masse. De fait, l’étude se fera sur la souche
Sm1021.
52
Figure 4: Gel DOC-PAGE des différents extraits bruts colorés au bleu d’alcian et au nitrate d’argent.
Les KPS observés suite à l'introduction du plasmide pMW23 issu de Sm41 dans le
génome Sm1021 possèdent les mêmes caractéristiques visuelles que ceux produits
directement par Sm41 (même distribution de taille et même coloration au bleu d’alcian). Mais
sont-ils de même nature que ceux de Sm41 ? C’est-à-dire, s’agit-il d’un polymère d’acide
pseudaminique lié à un acide glucuronique (Pse-GlcA) ou bien de ceux produits par la souche
sauvage Sm1021 avant l’insertion ? Pour répondre à cette question, différentes analyses ont
été réalisées.
2 Analyse par spectrométrie de masse de l’extrait brut
Dans un premier temps, l’analyse est réalisée sur la souche sauvage Sm1021 afin
d’obtenir un « blanc » pour l’étude des mutants. Comme il a été récemment rapporté, les KPS
de Sm1021 sont des homopolymères de Kdo reliés à des ancres lipidiques (Fraysse et al.,
2005). Leurs taille et balance hydrophile/hydrophobe rendent leur analyse difficile car ils ne
peuvent être purifiés facilement des autres constituants. En effet, les r-LPS présentent à peu
prés la même taille, et disposent eux aussi d’une ancre lipidique (le lipide A). De plus ces LPS
portent également plusieurs charges négatives (phosphates et sucre acides du cœur), tout
comme les KPS. Dans ces conditions, la détermination structurale des KPS, se fera forcément
53
au sein d'un mélange, ce qui n'est pas aisé. nous avons donc tout d'abord procédé à une
analyse directement sur l'extrait brut complet de la souche sauvage Sm1021.
Pour déterminer la composition saccharidique de cet extrait brut et plus
particulièrement mettre en évidence la présence d'un polyKdo lié à une ancre lipidique, une
analyse ESI-Q-ToF en mode négatif est réalisée. Le Kdo fait partie des sucres de la famille
des acides céto-désoxy-ulosonique, et sa masse molaire est de 238 Da (Figure 5). Les
jonctions osidiques résultant d’une perte d’eau, les unités de Kdo au sein d’un enchaînement
saccharidiques auront une masse de 220 amu. En raison de la présence d’un acide
carboxylique directement en α de la jonction osidique, les jonctions glycosidiques impliquant
l’oxygène porté par le carbone 2 deviennent particulièrement réactives.
Figure 5: Structure d'un acide 3-désoxy-D-manno-2-octulosonique (Kdo).
Sur les spectres obtenus, un profil complexe est observé, dans lequel une distribution
incrémentée de 55 amu débutant à m/z 870 est présente (Figure 6A). Des agrandissements des
profils isotopiques nous ont renseignés sur l'état de charge des ions présents.
Les écarts entre les ions isotopiques varient entre 0.33 et 0.25, ce qui nous indiquent
que nous sommes en présence d'ions multichargés portant jusqu’à quatre charges négatives
(Figure 6B). Ainsi, l’analyse en ESI-Q-ToF en mode négatif de l’extrait brut produit un
spectre qu’il est nécessaire de déconvoluer, c'est-à-dire dont il faut reconstruire le spectre
présentant uniquement des ions simplement chargés. Grâce à cette opération, un spectre plus
interprétable est obtenu (Figure 6C). Au final, une distribution dont les ions sont séparés de
220 amu, allant de [M-H]- = 2142 à 5242 Da, est obtenue. Nous sommes donc en présence
d'un oligomère de Kdo contenant au moins 21 unités Kdo correspondant aux lipopolyKdo
préalablement décrits dans la littérature. La distribution observée indique une grande disparité
54
dans la taille des KPS qui n'est pas représentative de leur composition in vivo. Les Kdo sont
des sucres facilement labiles en raison de leur nature chimique, donc, durant les différentes
étapes de purification ou dans les conditions d’analyse, ceux-ci ont pu se lyser. Ainsi, malgré
une faible énergie de collision, le mode d'analyse ne permet pas d'observer les KPS sans une
disparité de taille (7 à 21 Kdo) due à leur dégradation. Dans tous les cas, l'analyse ESI-Q-ToF
de l’extrait brut ne permet pas, dans ces conditions, d'observer l'ancre lipidique seule, et ce
malgré le fait qu’une hydrolyse des KPS ait apparemment eu lieu dans les conditions
d'analyse.
Figure 6 : Spectre ESI-Q-ToF obtenu pour l’extrait brut A) Spectre avant déconvolution nous observons les incréments de 55
amu B) Zoom sur un pic m/z 1035.8 indique que les incréments entre les ions du massif isotopique sont de 0.25 : l'ion est
quatre fois chargés négativement C) Spectre après déconvolution les incréments de 220 amu sont présent, les pics
correspondent à la masse de n x 220 amu + 622 amu, 622 correspond à la masse de l’ancre lipidique.
55
Figure 7 : Spectre MS/MS obtenu par FT-ICR de l’ion à m/z 842 correspondant au dernier membre de la série des fragments
du lipopolyKdo.
Grâce aux analyses précédentes, nous avons pu observer une distribution de même
nature que celle décrite Fraysse et al. auparavant. Pour s'assurer qu'il s'agit bien des mêmes
KPS, une analyse de spectrométrie de masse à résonance cyclotronique à transformée de
Fourrier (FT-ICR) est réalisée. Après une dégradation dans la source (CID : cone induced
dissociation), le dernier membre de la fragmentation de ces composés m/z 842 correspondant
à un Kdo rattaché l'ancre, est isolé et fragmenté par collision. Un ion à m/z 622 est produit par
perte d'un Kdo (Figure 7). Une alternative pour déterminer la présence de l’ancre consiste en
une hydrolyse douce. Celle-ci permet de détacher chimiquement l'ancre du polyKdo, ce qui la
rend facilement isolable, puisqu'elle forme avec le lipide A un précipité insoluble en phase
aqueuse. Le mélange lipidique peut être analysé directement en ESI-Q-ToF, en mode négatif.
Le spectre obtenu pour la fraction lipidique indique la présence des deux formes de l'ancre
déterminées par Fraysse et al., à m/z 622 et 594.
L'analyse en ESI-Q-ToF du mutant Sm1021 exoY ne produit pas tout à fait le même
profil que celui de la souche sauvage. Ainsi, sur le spectre obtenu avant déconvolution, peu de
polyKdo libres ont été observés. De plus, deux autres distributions, larges, portant trois et
quatre charges respectivement, se sont rajoutées au spectre de la souche sauvage. Après avoir
réalisé une déconvolution de ce spectre, la présence de glycanes cycliques acétylés et
glycérophosphates comme nous le démontrons dans le chapitre 2 est observée. Leur profil
caractéristique est représenté par une succession d’ions séparés de 162 unités de masse
correspondant à un oligohexose, avec une masse moyenne de 4018 Da. L'absence des EPS
semble ainsi compensée au niveau de ce mutant par la surproduction des glycanes cycliques
56
acides. Ceux-ci ayant également une masse proche de celle des KPS portant une ancre (masse
moyenne de 4018 Da pour les glycanes et 4362 pour le KPS portant l'ancre), nous supposons
que l'absence de signal provenant des KPS est due à une mauvaise ionisation et/ou à une
quantité moindre des KPS par rapport aux glycanes. Néanmoins, en augmentant l'énergie dans
la source, les oligomères de Kdo dus à la dégradation des KPS augmentent. Ceci indique la
présence d'un polymère de Kdo de taille supérieure, en mesure de se dégrader en oligomères
dans la source.
Pour s'assurer néanmoins que cette mutation exoY n’a pas modifié la nature des KPS,
une hydrolyse douce est réalisée. Le spectre obtenu nous confirme la présence de l'ancre en
quantités similaires à celle observées sur la souche sauvage. L'ancre ne se trouvant pas sous
forme libre dans l'extrait brut (puisqu’elle n’apparaît pas du tout sur les spectres de masse de
l’extrait), a été libérée par hydrolyse du polyKdo auquel elle était rattachée. La présence
d'oligoKdo en plus grande quantité que dans la souche sauvage nous permet de supposer que
l'absence des EPS1 n'est pas compensée uniquement par la production de glycanes cycliques
acides mais aussi par une plus grande quantité de KPS. La présence du lipopolyKdo dans
l'extrait brut a donc été déterminée par l'association de la présence d'oligomères allant de 2 à
15 unités dans l'extrait brut, à celle de l'ancre lipidique après hydrolyse douce.
La même analyse à été réalisée pour la souche Sm1021 exoY pMW23. Dans ce cas,
nous observons à nouveau une série de pics intenses séparés de 220 unités de masse. Les
glycanes cycliques acides sont présents mais de façon minoritaire. Il est à noter que pour cette
souche, après déconvolution, seuls les polyKdo libres, c'est à dire n’étant pas rattachés à une
ancre lipidique, sont observables (Figure 8).
57
Figure 8: Spectres obtenus en ESI-Q-ToF MS mode négatif après déconvolution par MaxEnt 3 de l’extrait brut de Sm1021
exoY pMW23.
Comme nous l’avons vu supra, les homopolymères à faible degré de polymérisation
peuvent être dus à une dégradation des KPS, comme ce fut le cas pour la souche Sm1021
exoY. Toutefois, pour Sm1021 exoY pMW23, ces oligomères présentent une masse suffisante
pour ne pas être interprétés comme résultant d'une dégradation, mais comme étant un
polyKdo sans ancre lipidique. Pour limiter la dégradation dans le spectromètre de masse et
donc pour préserver l’intégrité des KPS de plus grande taille, une diminution des voltages de
cône et de Rf lens a été réalisée. Là aussi, aucun polyKdo relié à une ancre n’a pu être
observé. Deux raisons peuvent expliquer cette absence : soit il n’y a pas de KPS reliés à une
ancre lipidique, soit il n’y a pas dégradation des KPS de grande taille portant l’ancre, ceux-ci
ne seraient donc pas accessibles dans les conditions d’analyses. En effet, malgré le fait que
l'appareil soit capable de transmettre et, de par sa haute résolution, de différencier des masses
supérieures à 4 kDa lorsque celles-ci sont multichargées, ne signifie pas forcément que les
molécules à analyser produisent un tel signal. En effet, dans des mélanges, il peut se produire
un phénomène de suppression de signal lié soit à un composé produisant une meilleure
ionisation soit à une matrice trop saline.
Ainsi les résultats des mesures effectuées en ESI-Q-ToF semblent indiquer que les
KPS sont des homopolymères de Kdo ne portant pas d’ancre lipidique. Pour déterminer si le
signal du polyKdo n'écrase pas le signal des lipoKPS, nous avons à nouveau réalisé une
58
hydrolyse douce. La fraction lipidique a alors été analysée par spectrométrie de masse. Nous
avons pu observer un spectre possédant en très grande quantité les ions m/z 594 et 622 (Figure
9). Une comparaison avec le type sauvage (rapport d'intensité des ions 622/LA) est présentée
dans le Tableau 2. Elle nous indique que l’ancre est produite en quantité plus importante que
dans les autres souches. Étant donné son absence dans l'extrait brut, cela signifie que cette
ancre était forcément reliée à une entité de masse inconnue via un sucre acidolabile de la
famille des céto-acides. Étant donné l'absence de signal en spectrométrie de masse la nature
de ce sucre reste inconnue et ne nous indique pas si les KPS de plus haute masse molaire
(synthétisé par pMW23) sont identiques à ceux de la souche sauvage ou à ceux produits par
Sm41.
Tableau 2: Résumé des résultats obtenus grâce aux analyses ESI-Q-ToF MS des polysaccharides de surface présents dans
l’extrait brut des différentes souches.
59
Figure 9 : Spectre ESI-Q-ToF MS de la fraction lipidique obtenue après hydrolyse douce de l'extrait brut pour le mutant
Sm1021 pMW23. Les valeurs entourées correspondent aux ions signatures de l'ancre des KPS
À ce stade, nous savons donc que le mutant Sm1021 exoY pMW23 possède des KPS
dont la taille varie entre 4 et environ 30 kDa, et qu’il s'agit de polymère portant a priori une
ancre lipidique, puis que celle-ci est libérée en grande quantité lors d'une hydrolyse douce.
Pour y voir plus clair, nous avons déterminé la nature des sucres qui composent ces KPS en
fonction de leur taille, au cas où leur structure serait variée. Nous avons également voulu
confirmer la présence de cette ancre lipidique dans les différentes gammes de taille des KPS.
Afin de nous assurer que l'ancre libérée n'était pas simplement celle correspondant aux KPS
natifs de Sm1021.
Lipide A
60
3 Analyse de la composition saccharidique des KPS en fonction de leur taille
Nous avons réalisé une colonne d’exclusion stérique de type S300 qui sépare les
composés en fonction de leur taille. Une analyse, par DOC-PAGE des différentes fractions
obtenues (Figure 10), nous a alors permis de visualiser la séparation effectuée. Les KPS sont
séparés en trois catégories : les grandes tailles (HMW) : 20-30 kDa, les tailles intermédiaires
(MMW) : 8-20 kDa, et enfin les plus petits composés (LMW) : 4-8 kDa.
Figure 10 : Gel DOC-PAGE après coloration au bleu d’alcian et nitrate d’argent de la séparation par chromatographie
d'exclusion stérique de l'extrait polysaccharidique de Sm1021 exoY pMW23. Les numéros en dessous des puits
correspondent aux fractions récoltées. C1 : extrait polysaccharidique de Sm1021 exoY pMW23, C2 : extrait saccharidique de
Sm1021 .
Après une étape de dialyse importante, nous avons déterminé la nature de sucres qui
composent ces trois classes de polysaccharides. Pour cela, deux techniques ont été
employées : l'analyse par chromatographie liquide échangeuse d'anions (HPAEC : High
HMW KPS MMW KPS LMW KPS
37 40 42 45 47 50 52 55 57 62 65 67 72 C1 C2 37 40 42 45 47 50 52 55 57 62 65 67 72 C1 C2
61
performance anion exchange chromatography) couplée à la détection ampérométrique pulsée
(PAD) et la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS).
La première possède l'intérêt de ne pas nécessiter de dérivation préalable à l'analyse ;
cependant, un inconvénient de la méthode provient du fait que l’attribution structurale n’est
liée qu’au temps de rétention (cf. chapitre 2). La GC-MS nécessite, quant à elle, une étape de
dérivation supplémentaire afin de rendre les oses volatiles. Durant cette étape les sucres
acides, peuvent se transformer (lactonisation (Blake et al., 1968)) ou se dégrader
(polyesterification : caramelisation, décarboxylation). Ceci résulte en une perte de sensibilité
importante pour ce type de composés. Un autre inconvénient de la méthode GC-MS se situe
au niveau de la multiplicité des pics obtenus pour chaque sucre. En effet, à la différence de la
HPAEC, les différentes conformations (furanose/pyranose) et anoméries y forment des pics
bien résolus. Néanmoins, l'intérêt majeur de l’utilisation de la GC-MS réside dans le fait que
l’attribution structurale est réalisée par comparaison des spectres de masse spécifiques
obtenus avec des banques de données très riches (NIST). De plus, cette méthode est tout aussi
sensible que la HPAEC-PAD. Ainsi, malgré la multiplicité des pics et les dégradations
susceptibles de se produire lors de la réaction de dérivation, la technique GC-MS possède une
sensibilité (0.01g/L avec quelques microlitres injectés) et une capacité d'identification adaptée
à nos besoins.
Pour procéder à cette analyse, il faut dans un premier temps effectuer une hydrolyse
douce suivie d’une extraction afin d’éliminer les résidus lipidiques dont les composants
viendraient encore complexifier l’interprétation. En effet, les acides gras, aminosucres et
autres glycérols libérés par les ancres lipidiques seraient analysables en GC-MS avec des
temps de rétention pas toujours très différents de ceux des sucres ciblés. Afin de limiter les
problèmes inhérent à la dérivation, il nous a fallut déterminer le type de modification à
effectuer. En effet, à ce jour, deux méthodes sont fréquemment rencontrées dans la
littérature : la silylation (Rojas-Escudero et al., 2004) et surtout l’acétylation (York et al.,
1985). Si ces méthodes sont particulièrement efficaces pour l’analyse des sucres neutres
(surtout quand elles sont précédées d’une étape de réduction levant la multiplicité des pics de
chaque sucre), elles nécessitent une étape de chauffage qui produit inéluctablement une
dégradation des sucres acides. Notre choix s'est ainsi porté sur une dérivation plus originale à
l’Anhydride Heptafluorobutyrique (HFBA) (Zanetta et al., 1999). Cette dérivation possède la
particularité de moins dégrader les sucres acides. Après différents essais, nous avons pu
remarquer que la méthylation des hydroxyles anomériques été bel et bien nécessaire. Pour
62
cela, Zanetta et son équipe ont proposé deux méthodes: la méthanolyse acide ou l'utilisation
de diazométhane. Dans les deux cas, en plus de la méthylation des hydroxyles anomériques, il
se produit une estérification des sucres acides.
Dans notre cas, les deux méthodes ont été testées sur un standard de Kdo, qui est l'un
des sucres acides les plus fragiles. L'utilisation du diazométhane n'a pas eu les résultats
attendus. En effet, le Kdo dérivé et injecté en quantités variables connues n'était soit pas
visible soit totalement dégradé. La méthanolyse, quant à elle, nous a paru avoir un double
intérêt puisqu'en plus d'estérifier les acides, elle permettait aussi de s'assurer que le mélange
injecté n'était composé que de monomères. Une mise au point de celle-ci sur du Kdo libre et
sur un trimère composé d'un acide sialique et de deux hexoses (6'sialyllactose) nous a permis
d'optimiser cette étape. Ainsi, le meilleur rendement d'estérification et de méthylation a été
obtenu sur le Kdo après une nuit à 80°C dans un mélange MeOH/HCl 1N. Dans ces
conditions, le trisaccharide testé est totalement hydrolysé. Nous avons donc réalisé la
méthanolyse (qui de toute façon s’imposait au préalable sur le surnageant obtenu après
hydrolyse douce) dans les conditions de la dérivation. Le résultat a été probant. Toutefois, il
est à noter qu'une méthanolyse efficace implique un mélange réactionnel exempt d'eau. Pour
cela, le surnageant de l’hydrolyse douce devra être systématiquement lyophilisé.
La difficulté de cette dérivation se situe dans le fait qu'il n'existe pas de banque de
spectres pour les sucres ainsi dérivés. Nous avons ainsi été amenés à réaliser cette banque à
l'aide de standards de sucres commerciaux. Ces standards ont subit le même traitement que les
échantillons afin de s'assurer de la reproductibilité des profils enregistrés. De plus, dans le cas
des sucres acides, différentes concentrations ont été testées pour s'assurer que les profils
chromatographiques de chaque sucre n’étaient pas dépendant de leur concentration avant
dérivation. Grâce à cela, nous avons pu déterminer le mode de fragmentation de chaque
standard en fonction de son anomérie et de sa conformation. Nous avons pu observer que les
profils chromatographiques étaient malheureusement concentration dépendantes Les
différents spectres ainsi obtenus ont été enregistrés dans une bibliothèque électronique. En
plus d'une plus grande stabilité des sucres, cette dérivation permet, en comparaison avec la
silylation ou l'acétylation, de diminuer le point de volatilisation des sucres. Ceci présente deux
intérêts : celui de diminuer à la fois le temps d'analyse, mais aussi les risques de dégradation
de ces dérivés sensibles à la chaleur, dans l'injecteur splitless.
63
Les différentes fractions de KPS collectées au cours de la SEC sur S300 ont ainsi été
traitées puis injectées en GC-MS. Une comparaison des temps de rétention et des spectres de
masse de chaque pic nous a permis de déterminer qu’il s'agissait uniquement de différentes
formes de Kdo et qu’aucun autre sucre n’était significativement présent parmi les KPS de
haute masse molaire. Nous avons réitéré l'analyse avec les deux autres fractions. Les KPS de
masse intermédiaire montrent également très majoritairement la présence de Kdo, tandis que
ceux de petite taille possèdent des pics supplémentaires intenses de glucose. La présence de
ce sucre est liée à celle des glycanes cycliques dont la masse est d’environ 4-6 kDa. Les
différents chromatogrammes indiquent que, quelle que soit la fraction, le sucre qui compose
les KPS est toujours du Kdo (Figure 11). Le plasmide pMW23 a donc produit des KPS dont
l'entité saccharidique est de même nature que pour le type sauvage: Sm1021 exoY pMW23
produit exclusivement des homopolymères de Kdo. Pour que ces KPS soient totalement
identiques au type sauvage, il faut qu’ils possèdent le même mode de jonction osidique à
savoir β 2-7 et portent une ancre lipidique de masse molaire 623 Da ou son autre forme à 595
Da.
Figure 11 Chromatogrammes des dérivés HFBA du standard obtenu après hydrolyse douce de 1mg/mL de Kdo (en haut) et
de la fraction des KPS de haute masse molaire montrant que les deux échantillons sont très proches.
16.0017.0018.0019.0020.0021.0022.0023.0024.0025.0026.0027.0028.0029.00
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
60000
65000
70000
75000
Time-->
15.0016.0017.0018.0019.0020.0021.0022.0023.0024.0025.0026.0027.0028.0029.000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
16000
17000
18000
19000
20000
Time-->
min
min
Abondance
Standard de Kdo
Echantillon
64
4- Détermination du mode d’enchaînement
Pour déterminer si le mode d’enchaînement des KPS produits par pMW23 est
identique à ceux produits par la souche sauvage, une analyse par RMN de la fraction de haute
masse molaire a été réalisée. Même s’il s’agit de la fraction la moins riche, elle possède un
intérêt majeur. Celui-ci est lié à la taille des composés. En effet, la proportion Kdo/ancre est
beaucoup plus importante dans cette fraction que dans les autres fractions. Or, l’ancre de
nature lipidique possède un fort taux de CH2 qui, en RMN, présente le même déplacement
chimique que certains signaux saccharidiques, susceptible de masquer les hydrogènes des
sucres. Or, cette ancre ne peut être éliminée sans couper les liaisons entre les unités Kdo.
Ainsi, si l'ancre devait être présente dans cette fraction, elle n’interférerait que peu puisque la
proportion de l’ancre serait faible face celle des Kdo. Par ailleurs il existe dans l’extrait brut
deux autres sortes de polysaccharide : les glycanes cycliques et les LPS rendant l'analyse de la
fraction de basse masse molaire impossible. Enfin, bien que présents en faibles quantités, les
LPS de haute masse molaire (s-LPS) contaminent la fraction de taille intermédiaire des KPS.
Or, en raison des unités répétitives de leur antigène O et des nombreux acides gras de leur
lipide A, ils seraient susceptibles de perturber le signal du polyKdo. Pour éviter les
contaminations dues à l’éluant de la colonne d’exclusion stérique (DOC et TRIS), une dialyse
très drastique a été réalisée avant l’analyse.
Pour vérifier la pureté de l’échantillon, une analyse en RMN du proton et du carbone a
été réalisée : seuls les déplacements chimiques du Kdo sont visibles. Nous avons pu observer
que le déplacement chimique du carbone 7 était légèrement deblindé δ= 70.92 ppm par
rapport à sa valeur sous forme libre δ= 69 ppm. Toutefois, cette valeur n'est pas suffisante
pour affirmer que la liaison osidique implique le carbone 7. Pour déterminer le mode
d’enchaînement, une RMN 2D 1H-13C de type HSQC a été effectuée. Cette séquence à la
particularité de produire des taches de corrélation entre les carbones et les hydrogènes
éloignés par deux ou trois liaisons (J2 ou J3). Le spectre obtenu est représenté dans la Figure
12.
Le spectre RMN du proton nous renseigne sur la nature de l’anomérie du Kdo ainsi
que sur sa conformation. Le déplacement chimique du carbone 2 égal à 100.3 ppm nous
65
indique que nous avons une forme pyranose. La différence de déplacement chimique entre les
deux hydrogènes portés par le carbone 3 est supérieure à 0.5 ppm, ce qui atteste d’une
anomérie β (Kohlbrenner et al., 1985). Le Kdo possède donc une conformation β pyranoside.
Nous avons donc réalisé une expérience HMBC afin de déterminer sans ambiguïté les
sites de jonction. Cette séquence permet de mettre en évidence les corrélations entre deux
atomes reliés par deux ou trois liaisons. L'attribution des différents atomes du sucre nous
permet de déterminer le mode de liaison. L’hydrogène porté par le carbone 7 (C7) corrèle
avec les deux carbones directement voisins (le C6 et C8), mais une tache de corrélation
supplémentaire avec le C2 est visible. Nous avons confirmé qu’il s’agissait bien du
déplacement du carbone 2 par la présence de taches de corrélation avec les deux H3
caractéristiques. Nous pouvons ainsi conclure sans ambiguïté que le mode de jonction est
exclusivement β 2-7 pyranoside (Figure 12).
Les différentes analyses menées nous ont permis de déterminer la composition
osidique des KPS produits pMW23 dans la souche Sm1201. Ceux-ci, quelle que soit leur
taille, sont composés exclusivement de Kdo. Les KPS de haute masse molaire nous ont
permis de déterminer le mode de jonction: β 2-7 pyranoside supposé identique quelque soit la
taille des KPS. La partie osidique est donc la même que celle observée pour la souche
sauvage Sm1021 (Figure 13).
66
Figure 12 Spectre RMN 2D 1H-13C obtenu grâce à une séquence HMBC permettant de déterminer les corrélations éloignées (J2 et J3 les J3 étant privilégiées) entre le carbone et l’hydrogène.
67
Figure 13 : Schéma de la structure de la partie osidique des KPS de Sm1201 de haute taille des mutants.
5- Mise en évidence de la présence d’une ancre lipidique
Comme nous l'avons vu dans le paragraphe 2, l'analyse ESI-Q-ToF MS de l'extrait
brut de la souche Sm1021 exoY pMW23 n'apporte aucune indication quant à la présence de
l'ancre lipidique sur les KPS puisque seuls les oligoKdo sont visibles sur le spectre. Pourtant,
celle-ci a été caractérisée en quantité importante après hydrolyse douce. Il nous faut donc
déterminer si les polysaccharides capsulaires de haute masse molaire portent cette ancre ou si
ces lipides proviennent des seuls KPS de petites tailles. Une chromatographie d’affinité au
moyen d’une phase contenant de la polymyxine B a été réalisée.
Il s’agit d’un peptide cationique cyclique connu pour avoir une affinité avec les
chaînes lipidiques des molécules tels les lipides A du LPS mais aussi les phospholipides
(Teuber et al., 1976). Ainsi, toutes les molécules portant une partie lipidique seront retenues
spécifiquement par la phase. Après une élution au DOC (tension actif ayant une forte activité
pour les sucres), une analyse par gel d’électrophorèse permet de visualiser les molécules qui
ont été retenues. Dans un premier temps, nous réalisons l'expérience sur la souche sauvage
Sm1021 pour s'assurer que les KPS de faible masse molaire sont retenus par la phase.
L'analyse DOC-PAGE révèle que les KPS de faible taille ainsi que les LPS sont élués en
présence de DOC: ils ont bien été retenus par la polymyxine B.
68
Nous avons réalisé la même expérience sur l'extrait brut de la souche mutante Sm1021
exoY pMW23. Le gel d’électrophorèse révèle que des KPS de grande taille et de masse
intermédiaire ont une affinité pour la polymyxine B. Les KPS de basse masse molaire se
retrouvent à la fois dans l'élution de lavage contenant les composés non retenus et dans
l'élution spécifique (Figure 14). Ceci pourrait être lié soit à leur très grande abondance dans
l’extrait brut pouvant saturer la phase, soit à la présence de deux types KPS avec et sans ancre
lipidique. Cette expérience a néanmoins mis en évidence la présence de KPS (coloration
bleue) portant une ancre lipidique (retenue par la phase greffée de polymyxine B) chez le
mutant, sur toute la gamme de taille.
À ce stade, deux cas de figure sont possibles : soit les lipoKPS synthétisés proviennent
d'une augmentation de taille des KPS de haute masse molaire, et dans ce cas l'ancre lipidique
sera de nature identique à celle observée sur les KPS de la souche sauvage, soit la voie de
biosynthèse est spécifique du plasmide pMW23 de Sm41. Alors bien qu’aucune ancre n’ai
jamais été mise en évidence chez Sm41, celle-ci produirait des KPS de nature inconnue
portants une ancre lipidique non caractérisée. L'analyse de l’ancre était donc nécessaire pour y
voir plus clair.
Figure 14 : Gel d'électrophorèse DOC-PAGE coloré au bleu d'alcian et au nitrate d'argent d’un extrait brut de la souche
Sm1021 pMW23 après la purification sur phase polymyxine B après élution, A) élution spécifique au DOC, B) élution de
lavage.
A B
HMW KPS
MMW KPS
LMW KPS
69
À nouveau, une hydrolyse douce des différentes fractions de KPS obtenues par la
chromatographie d'exclusion stérique a été entreprise. Aucun précipité n'est apparu. Toutefois,
la formation d'un précipité est concentration dépendante, ce qui signifie qu’en dessous d'une
certaine concentration, les composés lipidiques forment des vésicules mais ne s'agrègent pas
pour floculer. C’est pourquoi une extraction au chloroforme a été réalisée pour récupérer les
composés lipophiles. Les phases organiques ainsi obtenues à partir des différentes fractions
générées supra sont analysées en ESI-MS (Figure 15). Quelle que soit la fraction étudiée, les
ions diagnostiques m/z 622 et m/z 594 sont présents en MS mode négatif. Ceci nous indique
que l’ancre lipidique caractérisée par Fraysse et al. en 2005 sur la souche sauvage est
conservée. Pour les fractions de masses molaires moyennes (MMW KPS) ou de petites tailles
(LMW KPS), en plus de ces ions diagnostiques la présence de lipide A ou de phospholipides
membranaires est observée. Dans les MMW KPS, les lipides A sont liés à la présence des s-
LPS. Pour les LMW KPS, ce sont les r-LPS qui contaminent l'échantillon. Dans tous les cas,
le DOC provenant de l'éluant demeure présent.
Figure 15 : Spectre obtenu en ESI-Q-ToF MS de la partie lipidique de la fraction HMW KPS obtenue après hydrolyse douce
et extraction au chloroforme. ● Ions signatures de l'ancre lipidique des KPS, � pics dus à un reste de DOC [M-H]-=391,
[2M-H]-=783.
Ainsi, pour le mutant Sm1021 exoY pMW23, nous sommes en présence de KPS
formés d’un homopolymère de Kdo portant l’ancre lipidique de la souche sauvage. Les KPS
produits par le plasmide pMW23 sont donc ceux de la souche sauvage, mais à un degré de
polymérisation plus grand. Toutefois, les KPS ainsi produits sont un mélange
70
d'homopolymères de Kdo avec et sans ancre lipidique. Ceci est peut-être dû à la délétion du
gène exoY. Comme nous l’avions déjà vu avec la souche Sm1021 exoY, les oligoKdo sont
produits en plus grande quantité. La sécrétion massive de tels KPS (oligo et polymères de
sucre acide sans ancre) semble être une stratégie de la bactérie pour compenser l’absence des
EPS 1.
6- Structure de l'ancre lipidique du KPS
En ce qui concerne le genre Rhizobia, la présence d'une ancre lipidique n'a à ce jour
été déterminée que chez Sm1021. Or, la présence de lipoKPS a été démontrée pour beaucoup
de bactéries pathogènes, comme nous l’avons présenté dans l'introduction. Dans la grande
majorité des cas, l'ancre lipidique de ces lipoKPS sont de deux natures : il s'agit soit d'un
lipide A sur lequel est attaché un antigène K (KPS de type 1 et 4 de Escherichia Coli), soit
d'un diacylphosphoglycérol (KPS de Nesseria meningitis). Dans le cas de Sm1201, l'ancre n'a
pas la structure du Lipide A puisqu’il forme un ion monochargé à une masse de m/z 622 en
mode négatif tandis que le lipide A est composé de plusieurs ions dichargés entre m/z 861.6 et
1018.2 (Figure 9). Fraysse et al. en 2005 n'ont pas été en mesure de déterminer la structure
exacte de cette ancre, nous avons donc tenté de le faire.
L'analyse structurale de l'ancre lipidique des KPS de la souche sauvage était
jusqu'alors difficile, voire impossible. En effet, Les KPS et les LPS de la souche sauvage ne
sont pas séparables par les différentes méthodes disponibles, étant données leurs propriétés
physico-chimiques respectives. Les LPS sont des polysaccharides portant deux phosphates
liés à une pentaacyldiglucosamine, et possédant des sucres acides au niveau de
l'oligosaccharide de cœur (Campbell et al., 2002). Il en résulte les propriétés physico-
chimiques d'un amphiphile chargé négativement et dont la taille moyenne avoisine 4-5 kDa.
Les KPS, quant à eux, sont composés de Kdo et d'une ancre lipidique. Leur taille se situe au
alentour de 5 à 6 kDa. Ces polysaccharides ont donc, une taille, une balance hydrophobe-
hydrophile et une charge de même ordre. Ils ne peuvent donc être séparés par les techniques
chromatographiques conventionnelles, qu'il s'agisse d'exclusion stérique, d'affinité ou
d'échangeuse d'ion. Une hydrolyse douce peut permettre l'analyse de l'ancre. Mais, là encore,
les LPS posent problème : puisque leur lipide A est rattachée au cœur saccharidique par le
biais de deux Kdo. Ainsi, l'hydrolyse douce libère à la fois l'ancre et le lipide A. Néanmoins,
la mutation pMW23 nous permet d'avoir accès à un mélange dans lequel l'ancre est l'entité
71
majoritaire par rapport au lipide A. Ce mutant permet également, après une purification des
KPS de haute masse molaire par chromatographie d'exclusion stérique, d'obtenir une ancre
pure exempte de lipides A.
La première indication que nous possédons est la masse molaire de l'ancre : 623 Da et
595 Da. Sa parité ne s'explique que par la présence dans sa composition chimique d'un ou d'un
nombre impair d'azotes. De plus, le profil isotopique indique son M+1 représente 33% de M,
ce qui pointe sur une composition en carbone variant entre 30 à 35 atomes. Par ailleurs, cette
ancre est ionisable en mode négatif, elle porte donc un groupement acide capable de perdre un
hydrogène tel un acide carboxylique, un sulfate, ou encore un phosphate. La présence d'un
azote nous indique que celle-ci pourrait s'ioniser en mode positif. L'expérience a été réalisée
et nous avons observé en mode positif la présence d'un l'ion [M+H]+= 624 et 596 Da mais
avec un très faible rendement. Une première analyse en masse exacte a été réalisée sur le Q-
ToF Ultima dont nous disposons et qui possède une exactitude de masse de ∆m/m inférieur à
10ppm en présence d'un étalon interne. Quatre formules chimiques peuvent correspondre à la
caractéristique la masse de [M-H]-=622.45 et à un pourcentage pour l’ion isotopique avec un
[M+1-H] -=33% :
C33H69NO7S, C33H70NO7P, C36H65NO5S et C36H66NO5P
Le soufre modifierait néanmoins le profil du [M+2-H] - auquel cas, il représenterait 18% de
[M-H] -. Or dans notre cas, l’ion [M+2-H] - n’est que de 12% nous n’avons donc pas de soufre
dans la molécule.
Par analogie avec la nature phospholipidique des KPS de souches pathogènes, nous
avons réalisé une analyse comparative entre des standards de phospholipides sur TLC de
silice. L'éluant utilisé est composé de chloroforme/méthanol/ammoniaque 28% (50/25/5). Les
standards déposés correspondent aux phospholipides suivant:
dipalmitoylphosphatidylethanolamine (PE), dipalmitoylphosphatidylcholine (PC),
dipalmitoylphosphatidylinositol (PI), lysophosphatidylinositol ou
palmitoylphophotidylinositol (lysoPI). La différence entre la LysoPI et la PI réside dans la
présence d'un acide gras supplémentaire dans la PI. La comparaison de leurs facteurs de
rétention nous permet de déduire l'influence de l'augmentation de l'hydrophobie sur l'affinité
avec la phase silice. La PC et la PE ont été choisies car elles contiennent toutes les deux des
72
azotes au niveau de leur tête polaire. L’éluant étant basique (présence d'ammoniaque), le
groupement ammonium porté par la PE est donc sous sa forme NH2 tandis que la
phosphatidylcholine porte, quel que soit le pH, un ammonium quaternaire qui est toujours
chargé positivement. De ce fait, la PC possède l’interaction la plus forte avec la phase polaire.
Le phosphatidylinositol est le phospholipide présentant le plus d'affinité pour la phase grâce
aux 5 groupements hydroxyles de son squelette. L'ordre d'élution (du front d'élution jusqu'au
point de dépôt) est donc PE, PC, PI, LysoPI.
Les conditions d'élution et le choix des standards ayant été mis au point, il nous a fallu
déterminer la méthode de coloration des phospholipides. Pour cela, plusieurs colorants ont été
testés. Deux types de coloration sont possibles: non spécifiques (avec les vapeurs d'iode ou de
l'acide sulfurique concentré) ou spécifiques des acides gras (primuline), de l’azote
(ninhydrine, réactif de Dragendorff) ou du phosphate (phosphomolybdène). De plus, nous
avons réalisé une coloration à l'anthrone qui ne colore que les sucres et donc que le lipide A
(glucosamine). Dans le cas des standards, les différentes colorations à l'exception de
l'anthrone font apparaître quatre taches (Figure 16). Ceci nous a permis ainsi de mesurer les
facteurs de rétention de chacun des standards et de validité les protocoles de coloration.
73
Figure 16 : Schéma d’une plaque TLC éluée avec (CHCl3/MeOH/NH4OH 28% 50/25/5). Les facteurs de rétention ont été
obtenus (en trait plein) grâce aux différentes colorations et (en pointillé) par analyse ESI-MS après élution/désorption.
Lors de l'analyse par TLC du précipité, et ce quelle que soit la coloration, seules deux
taches apparaissent. Or, puisqu'elles apparaissent également lors de la coloration à
l'anthrone, cela signifie qu'il s'agit de deux formes des lipides A. L'une des deux taches
n'apparaît pas lors de la coloration spécifique au phosphore. Celle-ci correspond donc à des
lipides A déphosphorylés. Pour en avoir la confirmation, les deux taches sont grattées, éluées
et analysées en ESI-Q-ToF en mode négatif. Pour la tache la plus retenue sur la phase, le
profil observé correspond à celui des lipides A. Pour la seconde tache qui ne se colore pas au
phosphomolybdène, nous observons une faible quantité de lipides A monochargés ne portant
qu'un seul phosphate. Cette seconde tache serait donc un mélange de lipides A
monophosphatés et totalement déphosphorylé (ne se colorant pas au phosphomolybdène et
étant non visible en spectrométrie de masse en mode négatif). Lors de l'analyse, nous
observons un tout petit pic à m/z 622 élué avec les lipides A monophosphorylés. Toutefois, la
quantité observée est bien moindre que celle attendue, cela peut signifier que la partie de la
Rf= 0.34
Rf= 0.24
Rf= 0.13
Rf= 0.49
Rf= 0.4
Rf= 0.3
Rf= 0.26
74
plaque prélevée ne contenait qu'une partie de l'ancre éluée. Aucune coloration ne fait
apparaître l'ancre lipidique. Ceci peut être dû soit à un manque de sensibilité (primuline), soit
à des fonctions non accessibles (phosphomolybdène). Nous ne sommes donc pas en présence
d'un phospholipide classique.
Une coloration à l'azur A, permettant de mettre en valeur les composés portant un
sulfate, a été testée. Les taches des standards apparaissent ainsi que les deux taches du lipide
A. L'azur A, colorant cationique, n'est donc pas spécifique du sulfate et colore aussi tous les
composés anioniques, comme les phosphates. Malgré les grandes quantités d'ancre, aucune
coloration ne permet de la mettre en évidence. Pour déterminer son facteur de rétention, nous
avons donc prélevé des bandes à différentes hauteurs au-dessus de la tache des lipides A non
phosphorylés. Ces différentes fractions ont été ensuite éluées. Une analyse ESI-Q-ToF en
mode négatif a été réalisée pour déterminer la composition du mélange contenu dans les
bandes. Au facteur de rétention 0.34, nous obtenons la bande qui contient le maximum
d'ancre. Le facteur de rétention de l'ancre est semblable à celle du PI, bien que ceux-ci ne
contiennent pas d'azote. Il pourrait donc s'agir (en se basant sur la comparaison PI/lysoPI)
d'une phosphatidylcholine ne portant qu'un seul acide gras. Le fait qu'il réponde en ESI-Q-
ToF mode négatif nous indique qu'il ne s'agit pas d'une phosphatidylcholine. En effet celle-ci
est sous forme zwitterionique dans les conditions d'infusion en ESI-Q-ToF, il ne répondrait
pas en mode négatif.
Nous avons alors effectué l'analyse de la structure, grâce à des expériences ESI-Q-ToF
MS/MS. Pour cela, la caractérisation structurale a été tout d'abord réalisée sur des standards
de phospholipides, pour déterminer leur mode de fragmentation, en fonction du mode
d’ionisation et de la composition de la tête polaire, sur le Q-ToF Ultima. Les variétés de
phospholipides se différencient en spectrométrie de masse en fonction de leur tête polaire
(Figure 17) (Pulfer et al., 2003). De ces résultats, il a été possible de déterminer que le
phosphate porte toujours une charge négative mais qu’en fonction de la nature de la tête
polaire, le phospholipide est analysable, soit uniquement en mode négatif (Phosphoglycérol et
le phosphoinositol), soit en mode positif uniquement (la phosphatidylcholine), soit dans les
deux modes, pour le phophatidylsérine et éthanolamine. En mode négatif, nous avons constaté
comme le décrit la littérature, la perte de la tête polaire (ex glycérol et glycérophosphate pour
le phosphoglycérol), les ions correspondant aux acides gras et à la tête polaire libre. En mode
positif, nous visualisons les ions résultants de la perte par β-élimination des acides gras portés
75
par le glycérol, la perte de la tête polaire et les ions de celle-ci conformément à la littérature
(Pulfer et al., 2003). Seuls trois phopholipides contiennent un azote: les phosphatidylsérines, -
éthanolamines et -cholines. Les phosphatidylcholines ne répondent pas en mode négatif. De
ce fait, comme nous l’avions déjà fait pour les analyses par TLC, nous sommes en mesure
d'éliminer le fait qu’il puisse s’agir d’une phosphatidylcholine.
Figure 17 : Schémas des différents phospholipides et des fragmentations possibles en mode négatif et positif.
Une analyse MS/MS dans les deux modes a donc été réalisée sur la fraction lipidique
de l'extrait brut. Dans le mode négatif, la première fragmentation que l'on observe est la perte
d'un neutre correspondant à une perte de glycérol (Figure 18 A). La présence des ions m/z
153 et 171 nous indiquent que la molécule possède un phosphore lié à un glycérol et donc un
glycérophosphate. Lorsqu'il s'agit d'un phospholipide, les acides gras portés par le glycérol
sont coupés lors de l'analyse ESI-Q-ToF MS/MS. Dans notre cas, il n'apparaît aucun acide
gras ni aucune perte lui correspondant. L'absence de signal correspondant aux acides gras
indique que les chaînes grasses ne sont pas portées par le glycérol. L'ion à m/z 171 (153) nous
démontre que l'ancre est de nature glycérophospholipidique, le glycérol étant libre. Par
ailleurs, l'absence d'ions signatures d'une perte d'acide gras signifie que leur mode de liaison
n'est pas de type ester ou que la position β est tétrasubtituée. En mode positif, seul la perte du
phosphoglycérol est observée (Figure 18 B). L'entité ainsi formée porte la chaîne aliphatique
ainsi que l'azote et possède une masse moléculaire de 451 Da. De l'ensemble de ces résultats,
76
nous déduisons que nous sommes en présence d'un phosphoglycérol portant une longue
chaîne aliphatique et un azote, que le mode de jonction entre la partie polaire et hydrophobe
n'est pas de type ester et que la partie lipidique possède de 30 à 33 atomes de carbone.
.
Figure 18 : Spectres ESI-Q-ToF MS de l’ancre lipidique : A) en mode négatif : la perte de glycérol et la présence d’un pic à
m/z 153 spécifique des phosphoglycérols sont observé; B) en mode positif : seule la perte du phosphoglycérol est visible.
Pour localiser la partie aliphatique et celle portant l'azote, des digestions enzymatiques
ont été mises en œuvre. Pour ce faire, nous avons choisi d'utiliser des phospholipases. Pour
s'assurer que la liaison au phosphate est bien coupée, l’ancre sera digérée par la phospholipase
C, qui coupe entre le glycérol et le phosphate, et la phospholipase D qui coupe entre le
phosphate et la tête polaire. La digestion se réalisant dans l'eau, elle est faite sur l'extrait brut
pour éviter tous les problèmes d'insolubilité. Après une hydrolyse douce et d'une extraction au
chloroforme, la phase organique est analysée en ESI-Q-ToF en mode négatif. Seule la
présence du lipide A mono et diphosphorylé est observée. La disparition de l'ion m/z 622
signifie que les phospholipases C et D ont bien lysé autour du phosphate. Les phospholipases
77
reconnaissent donc l'ancre comme étant un phospholipide. Pour visualiser le résidu de la lyse
de l'ancre par les phospholipases, une analyse en mode positif est effectuée. Le spectre obtenu
est complexe et non résolu, nous ne pouvons donc pas nous assurer de la présence d'un l'ion à
m/z 452 qui confirmerait la scission entre le glycérophosphate et la partie lipidique. Une
digestion à la phospholipase A a alors été réalisée, permettant de couper spécifiquement les
acides gras liés au glycérol. Après digestion de l'extrait brut, une hydrolyse douce est
effectuée et nous vérifions si l'entité, dans son entier, est observable en ESI-Q-ToF. En mode
négatif, l'ion m/z 622 est présent, tandis qu'une grande quantité d'acides gras spécifiques du
lipide A est observée. L’ancre n'est donc pas lysée par cette enzyme. Sa présence n'est pas due
à un défaut d'activité de l'enzyme puisque celle-ci est capable de libérer les acides gras liés
aux glucosamines du lipide A. Nous en concluons que la chaîne aliphatique et la partie
contenant l'azote sont toutes les deux liées au phosphate et non au glycérol, ce qui confirme
les résultats obtenus en MS/MS.
Pour déterminer la nature de la chaîne aliphatique, différents traitements chimiques
sont envisagés. Comme nous le verrons dans la suite de l'exposé, L. Sharypova et al. ont
conçu un mutant Sm1201 rkpZ1 ne produisant ni KPS ni ancre lipidique. Cette souche sert de
blanc dans les conditions d’analyse. Pour déterminer si nous avons une éthanolamine liée par
son azote à un acide gras à longue chaîne (un C28 pouvant correspondre à la formule
chimique obtenue plus haut C33H69NO7P), nous avons pratiqué une saponification. Une fois
la saponification réalisée, le milieu est acidifié et le mélange est extrait au chloroforme. Après
méthylation des acides carboxyliques (éventuellement libérés) avec du diazométhane,
l’échantillon est triméthylsilylé et injecté en GC-MS. Il n'apparaît sur le chromatogramme ni
d'éthanolamine, ni de serine. Il s’avère aussi qu'aux températures les plus hautes, aucun acide
gras à longue chaîne autre que le 27OHC28 provenant des lipides A n'est visible. Cette
expérience montre qu'il n'y a ni amide, ni ester au niveau de l'ancre.
Pour en savoir plus, nous avons pris le parti de déterminer combien de sites étaient
acétylables. Cette donnée nous permet de déterminer le nombre d'hydroxyles libres mais aussi
le nombre de substitution que porte l'azote. Pour cela, la fraction lipidique obtenue après
hydrolyse douce de l'extrait saccharidique de Sm1021 exoY pMW23 est utilisée. L'acétylation
est réalisée et le produit de l’acétylation est analysé en ESI-Q-ToF mode négatif. L’ion m/z
622 a laissé place à un ion à m/z 790 et à un ion moins intense à m/z 748 (33% en intensité du
premier). Pour s’assurer qu’il s’agit de l’ancre acétylée, une analyse MS/MS est effectuée sur
78
l’ion m/z 790 pour s’assurer de la présence de la perte de 42 amu correspondant à une unité
acétate et d'ions compatibles. Nous nous assurons en plus qu’il y a toujours la présence de
l’autre forme de l’ancre qui diffère de la première par 28 unités de masse (Figure 19). Le
résultat de cet essai nous montre que la molécule possède quatre sites acétylables : trois sites
de nature hydroxyle et un azote, plus difficile à acétyler. Nous obtenons ainsi que en plus des
deux hydroxyles libres du glycérol, il reste donc un hydroxyle et un azote pouvant être
substitué, le phosphate n’étant pas substitué puisque qu’il porte la charge négative nous
permettant d’observer l’ancre en mode négatif. Ce qui nous amène à penser que l’hydroxyle
et l’azote fond partie d'une entité unique.
Ces différentes analyses nous ont permis de déterminer que nous sommes en présence
d’un phosphoglycérol portant sur le phosphate une chaîne aliphatique contenant un
groupement hydroxyle et un ammonium primaire ou secondaire. Il ne s’agit pas d’un
phospholipide commun car en plus du mode liaison de la chaîne grasse particulière - puisque
celle-ci n'est pas liée au glycérol-, la partie lipophile possède une taille de 30 ou 33 carbones.
En dehors de la perte d’un phosphoglycérol en ESI-Q-ToF, nous n’avons pas eu de preuve de
la présence d’un phosphate par d’autres techniques (coloration sur TLC).
79
Figure 19 : Spectre ESI-MS de l'ancre lipidique des LPS après acétylation en encart le spectre MS/MS de l’ion m/z 790.
Une analyse sur un appareil de type orbitrap a été réalisée au laboratoire d'application
de la société Thermo-finnigan. De l'analyse MS/MS, nous connaîtrons la masse exacte des
fragments obtenus en mode négatif afin de confirmer la présence d’un glycérophosphate. De
plus, la masse exacte obtenue dans ces conditions nous permettra de réaliser une
discrimination des différentes formules brutes obtenues précédemment puisque l'exactitude de
masse est < 1ppm. Des différents résultats, nous pouvons tout d’abord donner la formule brute
la plus proche de la masse mesurée C33H70NO7P avec une différence de 0.5 mDa soit 0.8 ppm
(Tableau 3).
Une analyse en masse exacte des fragments en MS/MS permet de préciser la nature
des différents composants. L'exactitude de masse reste proche de 1ppm et doit être strictement
inférieur à 10ppm. Grâce à cela, nous confirmons la présence du glycérophosphate à la fois
par la présence de l’ion m/z 152.9958 mais aussi par la perte de 92.0468 (la masse d’un
glycérol étant de 92.0473).
-42
-42
-18
-28
80
Tableau 3 : Tableau des masses exactes obtenues par analyse FT-ICR et avec masses exactes calculées des différents
fragments.
Formule brute
Masse exacte théorique Da
Masse mesurée Da Différence en mDa (ppm)
C33H69NO7P- 622.4817 622.4812 0.5 (0.8)
C36H65NO5P- 622.4606 622.4812 -20.6 (-33.1)
C33H68NO7S- 622.4722 622.4812 -9 ( -14.5)
C36H64NO5S- 622.4511 622.4812 -30.1 ( -48.4)
C3H6O5P- 152.9953 152.9959 3.9 (25)
C30H61NO4P- 530.4338 530.4344 -0.6 (-7.6)
C3H6O3 92.0473 92.0468 0.5 (5.4)
En résumé, ces analyses par spectrométrie de masse nous permettent de préciser que
l’ancre est composée d’un phosphoglycérol, qu'aucune chaîne grasse n’est liée à la partie
glycérol puisque l’action par la phospholipase A2 n’induit aucune coupure de l’ancre, et
qu’aucun fragment dû aux acides gras autres que ceux provenant des lipides A ne sont
observés en MS. L’utilisation de la phospholipase D, quant à, elle nous permet de déduire que
la partie contenant à la fois la chaîne aliphatique et l’azote est liée au phosphate. L'absence de
fragments correspondant à la chaîne en ESI-Q-ToF signifie que les modes de jonction entre la
partie hydrophobe et la partie contenant l'azote ne sont pas de type ester. La saponification ne
permettant pas non plus l’hydrolyse de l’entité aliphatique et azotée, ceci signifie que la
liaison entre ces deux entités n’est pas de type amide. Étant donnée la formule brute obtenue
grâce à la masse exacte, nous pouvons déterminer l’absence d’insaturation dans la molécule.
Le phosphate serait donc lié à la fois à la chaîne grasse et au glycérol. Comme celui-ci porte
aussi la charge négative, tous ses sites de liaisons sont donc utilisés: le polysaccharide est
donc lié au glycérol. L’acétylation nous a permis de déduire qu'en plus des deux hydroxyles
du glycérol, nous avons un azote (secondaire ou primaire) et un hydroxyle décorant la chaîne
aliphatique. Sm1021 est capable de synthétiser une chaîne grasse à 28 atomes de carbone
portant sur son squelette un hydroxyle en position 27, alors qu'elle ne produit que peu de
29OH-C30.
81
Ces différentes données nous permettent de supposer une structure dans laquelle un
27OH-C28 (C28) est lié à une glycérophosphoéthanolamine. La liaison amide serait ensuite
réduite en amine secondaire pour obtenir l’ancre de la masse 623 Da (Figure 19 A et B). Il
existe un autre membre composant l'ancre en plus de l’ion m/z 622 et qui se situe à m/z 594
c'est à dire avec deux CH2 en moins et non en plus dans la chaîne aliphatique. Bien que
globalement incongru, le schéma ci-dessous (Figure 20) est à notre sens le plus proche de la
réalité. En effet, l'abondance des phosphoéthanolamines dans la composition des
phospholipides membranaires Sm1021 en fait un candidat privilégié (Rammouz, 2006). Un
seul défaut existe pourtant : autant nous savons que la souche Sm1021 est capable de
synthétiser du C28 et une quantité plus infime de C30. À ce jour, la présente d'un acide gras à
26 atomes de carbone n'a jamais été prouvée. Pour cette raison, une deuxième solution est
possible en utilisant un acide gras aminé en C30, ainsi il n’y a plus intégration d’une
éthanolamine liée à un C26/C28 mais une combinaison d’un C28/C30 aminé plus plausible.
Figure 20 : Structures hypothétiques de l’ancre lipidique de masse molaire 623.
L'hypothèse selon laquelle la bactérie utilise des acides gras à longues chaînes a été
vérifiée en étudiant les ancres de deux mutants de Sm1021. La première AcpXL (est déficient
en une protéine supposée transporter et transférer les acides gras à longues chaînes), la
OH
O
HO
P
O
O
O NH
OH11
OH
O
HO
P
O
O
O
NH2 OH11
82
deuxième mutation se fait sur le gène Smc04270 (délétion par effet polaire sur LpxXL).
LpxXL est une acyltransférase caractérisée chez R. leguminosarum qui transfère
spécifiquement les 27OHC28 et 29OHC30 sur le OH en β de l’acide gras porté par l’amine de
la glucosamine (GlcN) (Basu et al., 2002). Ces souches possèdent donc la particularité de ne
pas contenir de C28 dans leur lipide A (Sharypova et al., 2003; Ferguson et al., 2005). Nous
avons réalisé une analyse ESI-Q-ToF MS sur le spectromètre Ultima en notre possession. Si
les lipides portés par l'ancre des LPS sont en rapport avec ces composés, leur synthèse devrait
aussi être affectée.
Les analyses du lipide A des deux souches présentent une caractéristique commune :
la disparition du C27OH-C28 au niveau des lipides A (m/z 763 au lieu de 975). Pour autant,
dans les deux cas, la présence de l'ancre des KPS (m/z 622 et 594) est conservée (Figure 21).
Ces deux souches nous indiquent que l’enzyme AcpXL permettant le transport du 27OHC28
n’est pas impliquée dans la synthèse de l’ancre, pas plus que LpxXL. Cette hypothèse est
confirmée par le mutant rkpA. En effet, ce mutant est un orthologue de la polyketide synthase
WcbR de Burkholderia mallei (Becker et al., 2005). Nous avons pu montrer que sa mutation
dans la souche Sm1021 inhibe complètement la synthèse de l’ancre tandis que les lipides A ne
sont pas modifiés. Il existe donc une voie de synthèse spécifique de l’ancre indépendante de
celle des ω-1OH C28 et C30.
83
Figure 21 : Spectre comparatif de la fraction lipidique, A) de la souche AcpXL ; B) de la souche Smc04270 (mutation par
effet polaire de lpxXL).
7- Activité symbiotique
Les tests biologiques ainsi que la construction de tous les mutants ont été réalisés par
L. Sharypova dans l'équipe de A. Becker de la faculté de génétique de l'université de Bielefeld
en Allemagne.
Les mutants de Sm1201 déficients en exopolysaccharides sont incapables d’infecter
leur plante hôte, et forment des pseudonodules vides dont les extrémités sont brunes. Cette
coloration est due à l'accumulation de composés phénoliques. Parfois ils forment des nodules
caractéristiques d'une infection retardée (Niehaus et al., 1998). .Le plasmide pMW23 restaure
le phénotype symbiotique normal chez Sm1201 exoB (Williams et al., 1990).
Des vérifications préliminaires sont nécessaires avant de tester l'activité symbiotique
de nos mutants. Tout d’abord, il faut vérifier que la souche sauvage est bien capable d'entrer
facilement en symbiose avec son hôte, la luzerne. Ensuite il faut vérifier qu'il n’y a pas eu de
disfonctionnement dans la construction du plasmide. Pour ce faire, le plasmide pMW23 a été
réintroduit dans la souche dont il est issu, Sm41, après une mutation exoB rkpZ, c'est à dire
déficiente en EPS (EPS-) et en KPS (KPS-). L’absence de ces deux polysaccharides induit
84
l’incapacité pour la souche mutante à entrer en symbiose avec son hôte. Le mutant, après
complémentation avec pMW23, retrouve l’activité symbiotique de Sm41 exoB. Le plasmide
porte donc toutes les composantes nécessaires à la restauration des KPS symbiotiquement
actifs. Dans les deux cas (Sm41 exoB et Sm41 exoB rkpZ pMW23), dix jours après
inoculation, les plantes ont une couleur vert foncé et portent sur leurs racines des nodules
roses. Pour s'assurer que les bactéries ont bien conservé leur mutation, les nodules roses sont
prélevés et une analyse génétique des bactéries infectieuses est effectuée. Seuls les mutants
sont identifiés.
Enfin, nous vérifions que quelle que soit la mutation induisant la déficience en
exopolysaccharides, le phénotype résultant demeure identique pour toutes les souches
affectées dans la biosynthèse des EPS. Pour cela, les mutants Sm1021 exoY et Sm2011 exoY
et exoB sont testés et analysés. Toutes ces mutations entraînent une absence de formation de
nodules viables. Seuls des nodules blancs (pseudonodules vide) sont observables. Ces
pseudonodules présentent à leur extrémité une coloration brune due à l’accumulation de
composés phénoliques, manifestation de réactions de défense chez la plante.
La capacité des différents mutants étudiés à entrer en symbiose avec leur plante hôte
est testée par le nombre de nodule viable associé à l'aspect de la plante (Tableau 4). Cette
analyse nous renseigne sur la capacité du symbiosome à fixer l'azote atmosphérique. Tandis
que l'aspect des nodules portés par les racines nous indique le moment critique dans lequel la
symbiose a été stoppée ou retardée (Figure 22).
Tableau 4 : Etude de la mise en place de la symbiose: effet du plasmide pMW23 et analyse du nombre de nodules fixant
l'azote après 20, 27 ett41 jours post inoculation. Dpi day post inoculation
% de plante avec des nodules roses
Souche
Nombre de
plantes testées 20 dpi 27 dpi 41 dpi
Couleur de la plante après
41 jours
1021 exoY 45 0 0 0 jaune
1021 exoY /pMW23 44 2 32 43 Vert
AK631 rkpZ 45 0 0 0 jaune
AK631 rkpZ /pMW23 45 100 100 100 vert foncé
AK631 18 100 100 100 vert foncé
Sm1021 18 100 100 100 vert foncé
Sm2011 18 100 100 100 vert foncé
85
Lorsque les mutants portant le plasmide pMW23 sont testés, la mise en place de la
symbiose apparaît retardée (12 jours pour les premiers signes de nodulation contre 10 pour la
souche sauvage). Mais surtout l’aspect des nodules est très différent ; en effet, nous observons
3 types de nodules : 1) les pseudonodules blancs vides, 2) les roses fixant l’azote, 3) les
nodules dits double-deckers (Figure 22). Ces derniers consistent en une base blanche
surmontée d’un lobe rose. Ils ont été décrits pour la première fois par Niehaus et al. en 1993.
Ils résultent d’une infection aberrante tardive des mutants déficients en exopolysaccharides.
Nous pouvons observer que quelle que soit la souche et la mutation EPS-, le résultat est le
même. Dans tous les cas, la symbiose est tardive et les trois types de nodules sont présents, et
nous pouvons en plus observer des manifestations de défense de la plante. Cela suggère que le
plasmide pMW23 est capable d’induire un KPS symbiotiquement actif mais que celui-ci
accroît aussi les possibilités d’invasions anormales ou que sont activité ne recoupe que
partiellement celle des EPS.
Figure 22 : Aspect des nodules de Medicago sativa en fonction de la souche inoculée. A) nodules blancs ne fixant pas
l’azote, dont les extrémités portent les signes de la mise en place des défenses de la plante, la coloration brune des extrémités
est due à l'accumulation des composés phénoliques.; B) Nodules roses normaux fixant l'azote atmosphérique; C) et D)
nodules bruns surmontés d'un lobe rose dit double-decker fixant l'azote ; E) nodules blancs de même type que A ; F) nodules
caractéristiques d'une infection retardée ; G) identique à B nodules roses normales ; Le tiret correspond à 1mm. Tous les
nodules sauf C sont photographiés à 46 jours C est photographié à 33 jours post inoculation.
86
8- Des paralogues de rkpZ dans la souche Sm1021
Comme il a été rapporté précédemment, la souche Sm1021 ne contient pas le gène
rkpZ complet, RkpZ étant une protéine contenant 440 aa. (Williams et al. 1990). Cependant,
le génome de Sm1021 contient trois gènes paralogues, c'est à dire des séquences de gène
proches de rkpZ (S. meliloti GenDB projet génome http://www.cebitec.uni-
bielefeld.de/groups/nwt/sinogate). Ces trois gènes sont localisés sur le plasmide symbiotique
pSymB, qui contient aussi d'autres gènes impliqués dans la biosynthèse des KPS (Becker et
al., 2005). L'un de ces trois gènes est tronqué et code pour une protéine à 126 acides aminés
(aa) ne représentant qu’un quart de RkpZ, une séquence si courte ayant peu de chance d'être
fonctionnelle, nous ne réalisons pas la mutation de ce gène. Les deux autres paralogues
nommés rkpZ1 et rkpZ2, codent pour des protéines probablement fonctionnelles comptant 432
et 343 aa respectivement. Ces protéines RkpZ1 et RkpZ2, sont des analogues de structure de
KpsC chez E. Coli, mais aussi de LipA de N. meningitis (ProDom database ; Servant et al.,
2002) codant toutes deux pour des protéines impliquées dans l’attachement de l'ancre
lipidique des KPS qui est prérequise pour l'export des KPS (Roberts et al., 1996). Leur rôle
dans la voie de biosynthèse et de transduction n'est pas de même importance pour les deux
génes. LipA intervient au moment de l'export (Tzeng et al., 2005). Sa mutation entraîne une
accumulation intracellulaire des KPS de N. meningitis. KpsC, lui, joue un rôle à la fois dans la
biosynthèse et dans l'export des KPS (Bronner et al., 1993; Rigg et al., 1998).
Nous nous sommes intéressés dans un premier temps au gène rkpZ1. À la différence
de rkpZ, qui ne forme pas de séquence de gène avec d'autres gènes symbiotiques, rkpZ1 se
superpose sur 4 nucléotides avec la partie 5' de rkpT1. Cette courte superposition indique que
rkpZ1, rkpT1 et rkpS1 doivent être cotranscris. RkpT1 et RkpS1 sont prédits comme étant des
protéines responsables de l'export du KPS.
Pour étudier le rôle de rkpZ1, L. Sharypova a construit un mutant en introduisant un
plasmide par intégration dirigée. Le gène rkpZ1 est ainsi éteint, ce qui peut avoir en plus un
effet polaire sur l'expression des gènes rkpT1 et rkpS1. Le mutant Sm1021 rkpZ1 perd ainsi sa
capacité à produire des KPS. Pour confirmer que la disparition des KPS est réellement due à
l'absence de rkpZ1 et non à un effet polaire possible sur rkpT1 et rkpS1, une analyse de
complémentation avec un plasmide (pPHU115) portant uniquement le gène rkpZ1 est
pratiquée. Il en résulte que les KPS de basses masses molaires sont à nouveau synthétisés
87
(Figure 22). Ce résultat nous indique d'une part que rkpZ1 est nécessaire à l'expression des
KPS et que lors de l'insertion, rkpS1 et rkpT1 restent fonctionnels. Ceci signifie que les gènes
rkpS1 et rkpT1 possèdent des cadres de lecture distincts de celui de rkpZ1, et qu’ils ne sont
pas cotranscrits malgré la superposition de rkpZ1 et rkpS1.
Différents jeux de mutation/complémentation ont été réalisés pour étudier les relations
fonctionnelles entre les paralogues de rkpZ. Pour cela trois plasmides ont été utilisés:
- pMW23 qui porte en multicopie rkpZ, rkpS et rkpT de AK631,
- pLS, plasmide contenant uniquement rkpZ en multicopie de AK631),
- pPHU115 qui porte uniquement le gène rkpZ1 en multicopie de Sm1021. Pour
chaque combinaisons entre mutants et plasmides, nous avons isolé les
polysaccharides et analysé les extraits bruts par DOC-PAGE et ESI-Q-ToF.
Plusieurs questions se posent auxquelles nous avons tenté d’apporter une réponse:
La première est « Le gène rkpZ1 est-il capable de se substituer à rkpZ? ». Le phénotype du
mutant Sm41 exoB rkpZ (AK631 rkpZ) se caractérise par la synthèse des KPS de très grande
taille et une déficience symbiotique : Fix- (Figure 23). La complémentation par pLS a rétabli
le phénotype Fix+ et les KPS synthétisés ont à nouveau une taille qui varie de 6 à 30 kDa,
confirmant que rkpZ est le seul gène affecté par sa mutation. Lorsque rkpZ1 (pPHU115)
complémente la mutation rkpZ dans AK631, le phénotype initial n’est pas restauré. Ceci
signifie que rkpZ1 n'est pas capable de se substituer à rkpZ.
Figure 23 : Gel DOC-PAGE des différents mutants de Sm1201 et Sm41 exo B (AK631). - rkpZ : délétion du
gène rkpZ de Sm41, -rkpZ1 : délétion du gène rkpZ1 de Sm1021 +rkpZ1 : complémentation avec le plasmide
contenant rkpZ1 de Sm1021, +rkpZ : complémentation avec le plasmide contenant rkpZ de Sm41 .
Sm1021 Sm41 exoY
sauv
age
- rk
pZ1
+ r
kpZ
- r
kpZ
1 +
rkp
Z
- r
kpZ
1 +
rkp
Z1
- rk
pZ1
- rk
pZ +
rkp
Z
- rk
pZ +
rkp
Z1
sauv
age
88
Il a fallut ensuite déterminer si rkpZ est a contrario capable de se substituer à rkpZ1.
Pour répondre à cette question, un mutant Sm1021 rkpZ1 a été construit par Larissa
Sharypova et al.. Pour ce mutant, nous n’observons plus la tache bleue vers 4-6 kDa,
marquant la présence de KPS sur le gel DOC-PAGE (Figure 23). La complémentation par
rkpZ1 seul (pPHU115) du mutant Sm1021 rkpZ1 rétablit le phénotype normal de Sm1021.
Nous en déduisons que seul le gène rkpZ1 est touché par la mutation et que les protéines
d'export rkpS1 et rkpT1 ne sont pas touchées lors de l'insertion. L'extinction de rkpZ1 est donc
seule responsable de la disparition des KPS.
Le mutant Sm1021 rkpZ1 a été complémenté par rkpZ, rkpS et rkpT (pMW23). Nous
constatons sur le gel DOC PAGE une augmentation de la taille des KPS et une diminution de
la quantité des KPS de basse masse molaire. Pour la souche Sm1021 rkpZ1 pMW23, la
production des KPS est globalement réduite (Figure 23 et 14A) en comparaison avec Sm1021
pMW23.
Pour s'assurer que ces changement sont dûs au gène rkpZ contenues dans le plasmide
pMW23, une complémentation rkpZ seul (pLS) a été effectuée. Le résultat obtenu demeure
identique au phénotype Sm1021 rkpZ1 pMW23. Cela nous indique que les KPS produits
peuvent utiliser au moins en partie la voie de transport des KPS de Sm1021 qui n'est pas
affectée par la mutation rkpZ1.
L'analyse de la fraction lipidique obtenue après hydrolyse douce de Sm1021 rkpZ1
pMW23 et Sm1021 rkpZ1 pLS indique que les KPS de haute taille synthétisés portent
toujours leur ancre lipidique.
Le tableau 5 récapitule les différents phénotypes observés pour les mutants étudiés.
Tableau 5 : Récapitulatif des effets sur la production des exopolysaccharides, de l’ancre des KPS, de la biosynthèse de KPS
de petite et grande taille ainsi que la capacité de fixer l’azote dans le nodule en fonction des délétions et des
complémentations avec les plasmides pMW23 (multicopie des gènes rkpZ, rkpT et rkpS) , pLS (multicopie de rkpZ) et
pPHU115 (multicopie de rkpZ1) pour les différentes souches. / signifie que le phénotype est inconnu +- présent mais en très
faible quantité, ++ présent en grande quantité
89
Souche
EPS
Ancre
KPS de haute masse
10 à 25 kDa
KPS de petite taille
4 à 8 kDa
Fixation de l’azote
(Fix)
Sm1021 + + - ++ +
Sm1021 exoY - + - ++ -
Sm1021 exoY pMW23
- ++ + + +
Sm1021 exoY rkpZ1 pMW23
- ++ + +- +
Sm1021 rkpZ1 + - - - /
Sm1021 exoY rkpZ1
- +- - - /
Sm1021 rkpZ1 pHU115
+ + - + +
Sm1021 rkpZ1 pLS
+ + + +- +
Sm41 exoB - / + - +
Sm41 exoB rkpZ - / - - -
Sm41 exoB rkpZ pMW23
- / + - +
Sm41 exoB rkpZ pLS
- / + - +
Sm41 exoB pPHU115
- / - - -
Comme nous l'avons vu, le gène rkpZ1 ne peut pas se substituer à rkpZ. Il ne joue pas
un rôle dans la régulation de la taille des KPS. Mais le gène rkpZ1 joue t'il un rôle dans la
formation du KPS portant l'ancre?
Pour le savoir, nous avons étudié l'extrait brut puis la fraction lipidique obtenue après
hydrolyse douce par une analyse ESI-Q-ToF en mode négatif de la souche Sm1021 rkpZ1.
Dans l'extrait brut, seuls les pics correspondant aux glycanes cycliques sont observables. Il
n'apparaît ni polymère ni oligomère de Kdo même en faible quantité (Figure 24A). Pour
nous assurer que nous n'avons pas perdu les KPS par dégradation. Nous avons cherché, en
vain, les ions indiquant la présence de l'ancre lipidique libre. Ceci allié à l'absence de Kdo
exclue la dégradation comme origine de l’absence des KPS. Une analyse de la fraction
lipidique après hydrolyse douce, ne permettant pas non plus la mise en évidence de la
90
présence des ions signatures de l'ancre lipidique m/z 622 et 594 (Figure 24 B). Nous savons
par ailleurs que la protéine responsable de la synthèse de l'ancre est RkpA (Becker et al,
2005). L'absence de lipopolyKdo indiquerait ainsi que le gène rkpZ1 interviendrait dans la
stabilisation du précurseur du KPS ou dans sa formation (condensation de l’ancre sur le
polymère).
91
Figure 24 Spectre ESI-Q-ToF MS en mode négatif A) Extrait Brut de Sm1021 rkpZ1 ; B) précipité obtenu après hydrolyse douce de Sm1021 rkpZ1 ; C) Extrait Brut de Sm1021 exoY rkpZ1 D)
précipité obtenu après hydrolyse douce de Sm1021 exoY rkpZ. ancre du KPS lipides A phospholipides glycane cyclique
EB Sm1021 rkpZ1 A LA Sm1021 rkpZ1 B
LA Sm1021 exoY rkpZ1 D
622
EB Sm1021 exoY rkpZ1 C
92
La mutation rkpZ1 pourrait agir tel un régulateur négatif de la production des KPS. En
diminuant la quantité de KPS produits, les autres polysaccharides présents masqueraient leurs
ions signature. Afin de savoir si tel est le cas, nous avons réalisé la même analyse sur le
mutant Sm1201 exoY rkpZ1 (Figure 24 C et D). En effet, nous avons pu constater que la
mutation exoY induisait une augmentation de la production des oligomères de Kdo, et des
glycanes cycliques afin de compenser l’absence des EPS I. Cette surproduction éventuelle
nous permettrait de nous affranchir du doute quant à leur non-détection en spectrométrie de
masse.
L'extrait brut de Sm1021 exoY rkpZ1 a montré la présence en faible quantité de l'ion
signature de l'ancre. Pour s'assurer qu'il ne s'agit pas d'un artefact, nous réalisons à nouveau
une hydrolyse douce. Les résultats indiquent que l'ancre est présente mais que sa quantité est
dix fois moindre par rapport aux lipides A (m/z 975) que dans le cas de la souche sauvage
Sm1021 ou son mutant Sm1021 exoY. Le fait que l’ancre lipidique soit présente dans
l’hydrolysat pourrait s’expliquer par la présence en quantité substantielle dans l’extrait brut de
lipo-KPS ou sa présence en assez grandes quantités dans l'extrait permettant sa concentration
lors de l'extraction par le chloroforme. Sa présence dans l'extrait brut, nous indique qu’elle se
trouve sous forme libre, or ce que nous observons n’est que le résidu de l'ancre après
extraction au phénol et plusieurs étapes de dialyse, elle est donc produite dans la bactérie en
grande quantités. Il est probable ainsi qu’à défaut d’être raccordée aux KPS, elle soit
accumulée dans le cytoplasme en association avec sa protéine de transport, ou qu'elle soit
adressée seule vers la membrane par la même voie que les phospholipides.
Pour déterminer si la protéine RkpZ1 permet d'attacher l'ancre à un oligoKdo ou si elle
est responsable de la biosynthèse de celui-ci, il faut s'assurer de la présence de celui-ci dans
les composés de surface de cette souche. Dans une analyse ESI-Q-ToF, une grande quantité
de glycanes peut masquer le signal de l'oligomère de Kdo. Il nous faut donc utiliser un
système chromatographique qui séparera les différents polysaccharides avant de les analyser
en SM. Nous avons choisi d'utiliser un couplage HPAEC-PAD-ESI-Q-ToF (cf. le chapitre 2).
Grâce à cette technique, nous avons un système chromatographique qui sépare les
polysaccharides en fonction de leur composition et de leur degré de polymérisation. Une
détection par ampérométrie pulsée permet de détecter spécifiquement les sucres. La
93
spectrométrie de masse permet de réaliser une détermination structurale grâce aux ions
spécifiques des sucres. Nous avons réalisé une hydrolyse douce de l'extrait brut de Sm1021
rkpZ1, et analysé le surnageant. En effet, les ancres lipidiques sont nuisibles à la colonne
employée. La phase aqueuse contient les oligo et polymères issus de l’hydrolyse des acides 2-
céto-3-désoxy-ulosoniques. Les chromatogrammes obtenus sont complexes (Figure 25).
L'appel d'ion à m/z 221, correspondant au Kdo en mode positif fait apparaître plusieurs pics.
Les spectres obtenus confirment qu’il s'agit bien d'oligomères de Kdo. Nous avons donc la
preuve que la bactérie synthétise des oligoKdo de taille inconnue mais en quantités suffisantes
pour ne pas être éliminée lors des différentes dialyses.
Figure 25 : Chromatogrammes obtenus en HPAEC-PAD-MS : A) chromatogramme obtenu en mode d'acquisition scan ; B)
obtenu par appel d’ion m/z 221 spécifique du Kdo.
Ainsi nous avons pu déterminer que l'ancre et l'oligoKdo sont produits en grandes
quantités sous forme libre. Néanmoins, les KPS ne sont pas visibles ni sur gel de
polyacrylamide ni en MS ceci indique que rkpZ1 sert à raccorder ces deux entités.
A
B
inte
nsit
é re
lati
ve %
94
L'introduction de pMW23 ou de pLS ( c'est à dire de rkpZ) dans la souche Sm1021
rkpZ1 induit la formation des KPS de très grandes tailles mais en quantités plus faibles que
dans le cas de Sm1021 pMW23. La bactérie n'utilise pas la voie d'export de Sm41. La
protéine RkpZ1 serait responsable de la formation du précurseur des KPS. En présence de
RkpZ, ce précurseur est totalement utilisé pour produire des KPS de grande taille. Les KPS de
haute masse molaire présents dans AK631 aurait un précurseur de structure proche de
l'oligoKdo portant une ancre lipidique. Cette hypothèse sera confirmée par la présence dans la
souche AK631 de l’ancre lipidique et de l’oligoKdo (cf. chapitre 2).
La même approche a été menée pour le gène rkpZ2. Le mutant rkpZ2 a été construit à
Bielefeld par insertion dirigé d'un plasmide, dont la transcription est indépendante de tout
autre groupe de gène impliqué dans la symbiose fixatrice d'azote. Le gène rkpZ2 est donc le
seul à être éteint dans ces conditions.
Dans ce mutant, la biosynthèse des KPS est totalement supprimée. Les analyses par
ESI-Q-ToF MS réalisées sur rkpZ2 montrent qu’aucun oligoKdo n'est produit et que dans
l'extrait brut, l'ancre n’apparaît pas non plus. Après hydrolyse douce, l'ion signature de l'ancre
n'est pas visible.
Une complémentation par rkpZ1 seul (pPHU115) ne rétablit pas le phénotype de la
souche sauvage. Ce résultat confirme que les deux protéines RkpZ1 et RkpZ2 ne sont pas
équivalentes. De plus, leur mutation implique une suppression de la production des KPS et
non une augmentation de leur taille. Le gène rkpZ2 coderait donc soit pour un régulateur de la
biosynthèse, soit pour la synthèse de l'oligomère de Kdo.
95
BILAN
L'introduction du gène rkpZ issu de la souche Sm41, dans la souche Sm1021 dite
sauvage, a produit une augmentation très nette de la taille des KPS. Ceux-ci sont composés
d'un mélange de KPS libres et portant une ancre lipidique. Les différentes analyses, ESI-Q-
ToF, RMN et GC-MS, ont montré que les KPS obtenus avec rkpZ étaient composés
d'homopolymères de Kdo liés en β(2-7), identiques à ceux de la souche Sm1021. L’ancre dont
les ions signatures se trouvent à m/z 622 et 594 en mode négatif, sont présents sur toute la
gamme de masse. Les oligomères de Kdo sans ancre pourraient provenir d'un amorceur
servant à la biosynthèse des KPS (Reuhs et al., 1995).
L’augmentation de la taille des KPS dans la souche Sm1021 pMW23 a permis
d'obtenir une purification de l’ancre des KPS. Ainsi, grâce à ce mutant, une hypothèse sur la
structure entière du lipopolyKdo a pu être établie (Figure 26).
Figure 26 : Structure hypothétique du lipopolyKdo.
96
Cette ancre, jusqu’à ce jour, n’a été mise en évidence que pour la souche Sm1021. Elle
ne possède que deux formes possibles séparées de 28 unités de masse : MW 595 Da et 623
Da. Ce manque de dispersité dans la taille indique que la longueur de la chaîne possède une
grande importance. La longueur de la chaîne correspondrait à celle d'un C28, donc à
l’épaisseur de la bicouche lipidique (8 nm). Ce qui signifie que les lipopolyKdo ne sont pas
sécrétés dans le milieu extérieur, sauf par hydrolyse des Kdo, lorsque ceux-ci se trouvent en
milieu acide. Ils permettraient à la bactérie de garder à sa surface une couche anionique
capable de fixer les protons du milieu extérieur et ainsi de survivre dans des milieux acides.
En plus de ce rôle, l’ancre pourrait posséder une activité symbiotique, en réprimant les chocs
oxydants (réaction de défense de la plante) chez leur plante hôte. En effet Scheidle et al.,
2005 ont utilisé un mélange de LPS et de lipopolyKdo (extrait brut) pour obtenir une fraction
lipidique. Cette fraction s'est avérée inhibitrice du choc oxydant. Ils en ont déduit que les
lipides A en étaient responsables mais ils sont contaminés à 50% par l'ancre lipidique des
KPS. Il serait intéressant de déterminer lequel des deux composés est responsable de la
répression du choc oxydant. En effet, les lipides A de Sm1021 sont pour 70% identiques à
ceux d’Agrobacterium tumefaciens qui eux élicitent cette réponse (Silipo et al., 2004; Escobar
et al., 2003). Il serait donc envisageable que ce soit l’ancre des KPS qui soient à l’origine de
l’inhibition.
Les deux paralogues de rkpZ, nous ont permis de mieux comprendre le mécanisme de
synthèse des KPS chez Sm1021.
RkpA est la protéine responsable de la synthèse de l'ancre lipidique.
RkpZ2 est responsable soit de la régulation de la synthèse, soit de la formation de
l'oligomère de Kdo.
RkpZ1 quant à elle agit lors de l'attachement de l'ancre produit par RkpA et de
l'oligoKdo peut-être produit par RkpZ2 (Figure 27). Dans le cas de Sm41, la biosynthèse du
KPS débute par la polymérisation d'un oligomère de Kdo de 4-7 kDa (Reuhs et al., 1995).
Ensuite, une ancre lui est rattachée grâce au groupe de gènes présent sur le chromosome. Pour
finir, il y a élongation de la chaîne saccharidique dans le cytoplasme et transfert d’oligomère
vers la surface bactérienne. Grâce au mutant Sm1021 rkpZ1 pLS nous avons pu déduire que
rkpZ était capable de synthétiser ce précurseur et de l'utiliser pour réaliser l'élongation du
97
KPS. Le précurseur de Sm1021 (polyKdo + une ancre) aurait une structure semblable à celui
de Sm41.C'est ce que nous le démontrerons dans le chapitre 2.
Figure 27 Schéma biosynthétique des KPS de Sm1021 faisant intervenir les protéines dont nous avons déterminé le rôle lors de
l’études des KPS de souches mutantes
Acheminement vers la membrane externe
rkpZ2 (?) rkpA
OligoKdo Ancre lipidique
rkpZ1
LipoKdo
rkpT1, rkpS1
Acheminement vers la membrane externe
rkpZ2 (?) rkpA
OligoKdo Ancre lipidique
rkpZ1
LipoKdo
rkpT1, rkpS1
rkpZ2 (?) rkpA
OligoKdo Ancre lipidique
rkpZ1
LipoKdo
rkpT1, rkpS1
98
99
Chapitre 2: Analyse des polysaccharides bactériens par
couplage HPAEC-PAD-MS
CONTEXTE
Les polysaccharides de surface jouent un rôle important dans la symbiose fixatrice
d’azote. Souvent riches en sucres acides, ils restent difficiles à analyser. En dehors de l’intérêt
porté aux composés de surface des Rhizobia, les sucres du type Kdx ou de la famille des
acides sialiques possèdent un intérêt biologique pour beaucoup d’organismes vivants (Angata
et al., 2001). Ils entrent dans la composition des KPS de bactéries pathogènes et jouent un rôle
dans les processus infectieux (cf. chapitre 1). La diversité chimique des acides sialiques et
ulosonique en général, leur ubiquité dans le monde vivant, en font des sucres d’un intérêt tout
particulier. L’analyse des sucres et en particulier celle des sucres acides est délicate.
Reprenons l’exemple de Sm1021 pour laquelle les KPS de petite taille sont analysables en
mélange par spectrométrie de masse ESI-MS. Toutefois pour les composés de grande taille
(pMW23), la chose est plus délicate et une confirmation par GC-MS est indispensable. Pour
permettre ce type d'analyse, une purification chromatographique doit être réalisée, ce qui
diminue significativement les quantités de matériel disponibles. Une expérience RMN à deux
dimensions n'est réalisable que les quantités sont suffisantes (pour un polymère de 4 kDa,
5mg sont tout de même nécessaires). La GC-MS est une technique sensible, qui demande
néanmoins une modification chimique des sucres pour les rendre volatilisables. Cette étape est
critique. Plusieurs dérivations sont possibles : une acétylation, une silylation, ou encore
acylation avec HFBA (cf. chapitre 1). Ces modifications chimiques demandent un apport
d’énergie thermique source de polymérisation ou de lactonisation pour les sucres acides. Il
faut ajouter à cela que face aux différents conformères et anomères d’un sucre, une multitude
de pics sont générés en GC, il est souvent indispensable pour simplifier l’interprétation de
recourir à une étape supplémentaire, la réduction de l’aldéhyde en alditol. Le protocole est
donc lourd et peu adapté aux sucres acides.
Il existe une autre technique de choix pour la détermination des sucres et qui ne
demande aucune dérivation préalable: la chromatographie par échange d’anion (Lee et al.,
100
1990 ; Cataldi et al., 2000). La capacité de séparation des colonnes chromatographiques
disponibles tant au niveau des monosaccharides que des polysaccharides allant de 2 à 60
unités, additionnée à la sensibilité et la sélectivité d’une détection par ampérométrie pulsée en
font une technique très efficace. La séparation des sucres n’est néanmoins possible que dans
des conditions alcalines extrêmes (pH 14) nécessaires à l’ionisation des groupements
hydroxyles des oses. Dans ces conditions, de nombreuses modifications chimiques peuvent
intervenir, telles que la transformation de Lobry de Bruyn et Van Ekenstein (1985)
(épimérisation et tautomérisation aldéhyde/cétone-alcool) ou la des-O-(N-) acétylation
(Dionex Technical note 20), voire la β-élimination des substituants en position 3 du sucre
dans le cas des sucres réducteurs (Dionex Technical note 20). Pour l’épimérisation des sucres,
la réaction est, généralement, lente à température ambiante : 2 à 3 heures sont nécessaires
pour épimériser la N-acétylglucosamine pour une concentration de 100mM d’hydroxyde de
sodium (Dionex Technical note 20). La des-N-Acétylation de ce même sucre à hauteur de20%
nécessite une nuit dans 150 mM de NaOH (Dionex Technical note 20). Il faut enfin 4 heures
pour hydrolyser 80% du laminaribiose (Glucopyranoside β-1-3 glucopyranose) dans 150 mM
de NaOH (Dionex Technical note 20). Dans les conditions d’analyses proposées, le temps
nécessaire et les concentrations sont tels, que les échantillons ne sont pas dégradés, à
l'exception du glucose-3-sulfate (Dionex Technical note 20). Il faut simplement veiller à
conserver l’échantillon uniquement dans l’eau.
La forte basicité de l’éluant est compatible avec la détection par ampérométrie pulsée.
Cette détection possède deux intérêts : tout d’abord une grande sensibilité, mais aussi une
bonne sélectivité, puisque le choix du cycle voltampérométrique permet de sélectionner
précisément les composés qui seront détectés (Rocklin et al., 1994). Lorsque le pH est
fortement alcalin, les sucres sont oxydés par catalyse électrochimique à la surface d'une
électrode en or sur laquelle est appliquée un potentiel positif (détection par ampérométrie
pulsée PAD). Le courant généré par l'oxydation est proportionnel à la concentration en
saccharide. Le signal obtenu est principalement lié à l'oxydation de l’alcool primaire porté par
le carbone 6 (Dionex Technical note 21).
La HPAEC (High performance anion exchange chromatography) est ainsi une
méthode simple, sans dérivation préalable, limitant les pertes au niveau des sucres acides.
Cette méthode sensible ne donne toutefois aucune information si ce n'est par comparaison des
101
temps de rétention avec ceux des standards. Les colonnes utilisées sont de type échangeuses
d’ions. Néanmoins, de par la nature du polymère qui les compose, elles ont aussi un
comportement de type exclusion stérique. Cette double propriété rend difficile la prédiction
du comportement de chaque échantillon. Il en résulte par exemple que les sucres acides sont
élués après des trisaccharides neutres. Ainsi, lorsque l’échantillon est complexe et/ou
polymérique (biologique), il n’est pas possible de déterminer avec certitude la nature des
sucres analysés. Il faut ajouter à cela que les temps de rétention varient avec le mode de
jonction. En effet s'ajoute à la liste des doléances le fait que les acides uroniques (déjà oxydés
en position 6), produise un signal faible en PAD. En effet, le cycle voltampérométrique a été
optimisé pour oxyder les alcools en acides, ainsi lorsque la position 6 est déjà de nature acide
cela induit une diminution significative de la sensibilité vis à vis de ces sucres.
Pour ces raisons, il apparaît que la solution analytique idéale serait un couplage entre
la HPAEC et un spectromètre de masse. Nous avons réalisé ce montage en couplant un
ICS2500 (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA) avec un ESI-Q-ToF Ultima (Waters,
Milford, MA, USA). Nous obtenons ainsi une méthode séparative efficace nécessitant peu de
matériel. L'existence de deux détecteurs présente un réel intérêt, puisque l'un est sensible et
spécifique des sucres (PAD), et l’autre détecteur (MS) un peu moins sensible, permet de
réaliser une identification structurale. Ce couplage est un défi puisque l’éluant
chromatographique contient en quantités importantes de l'hydroxyde ou de l’acétate de
sodium, composés non volatiles et très conductibles. L’utilisation d’un dessaleur en sortie du
PAD mais en amont de la source du spectromètre est donc une nécessité. La séparation
d’oligosaccharides utilisant le couplage en ligne de la HPAEC, du PAD, d'un dessaleur, et
d'un spectromètre de masse a rarement été décrite (Rumbold et al., 2002 ; Torto et al., 1998).
Deux publications majeures concernent la mise au point d'un tel couplage (Bruggink
et al., 2005 a et b). Bruggink et ses collaborateurs ont étudié deux systèmes. Dans le premier,
une colonne de 3mm de type CarboPac PA200 est utilisée et les deux détecteurs sont
positionnés en parallèle, le premier étant un spectromètre de masse de type quadripolaire, le
second un PAD. Le dessaleur est quant à lui placé entre le T et le spectromètre de masse
(Figure 1). Le positionnement des détecteurs en parallèle est dû au fait que le volume mort de
la cavité de la cellule ampérométrique est assez important pour qu’il en résulte une perte de
séparation entre un cétose et un aldose. Pour s’assurer de la réponse et de la sensibilité des
102
sucres en MS, du chlorure de lithium est ajouté post dessaleur. L’analyse des sucres neutres se
fait en mode positif. Les résultats obtenus montrent que la détection MS est 10 fois moins
sensible que le PAD pour l’aldose et le cétose testés, tandis qu’elle n’est que trois fois moins
sensible pour le saccharose (disaccharide glucose et fructose). Dans ces systèmes, seuls les
adduits lithium sont visibles. La limite de détection est mesurée en SIM à 1.49 pmole pour le
glucose, 1.19 pmole pour le fructose et 0.36 pour le saccharose.
Figure 1: schéma du montage réalisé par Bruggink en 2005 (a).
Lors de l’analyse de mélanges saccharidiques à différents degrés de polymérisation, la
coélution de plusieurs espèces rend les interprétations difficiles. Malgré cela, un appel d’ion
en MS est suffisant pour une interprétation. Cela nécessite toutefois de connaître la nature de
la molécule recherchée. Des tests sur des extraits alimentaires ont permis de mettre en exergue
une autre différence entre les deux détections. Ainsi beaucoup de pics détectés par le PAD ne
sont pas identifiables en MS. Ceci est dû au fait que la détection par ampérométrie pulsée
n’est pas spécifique uniquement des hydrates de carbone mais aussi des molécules contenant
des amines telles les acides aminés. Les sucres acides ne sont pas pris en compte lors de la
recherche par appel d’ion dans cette étude.
Dans un deuxième temps, la colonne utilisée est de type capillaire (I.D. 0.381mm) et la
phase stationnaire restant inchangée (CarboPac PA200). Le détecteur de masse quadripolaire
103
est remplacé par une trappe à ions et l’ajout de lithium est remplacé par un mélange aqueux à
50% acétonitrile contenant du chlorure de sodium (Figure 2). Grâce à ces modifications, la
limite de détection en spectrométrie de masse est améliorée à 110 fmole pour les glycanes
analysés. La possibilité de réaliser des analyses MS/MS en ligne associée à la résolution de la
colonne qui permet de séparer des isomères, et de donner des informations sur les
enchaînements et les modes de liaison, conduit à un système analytique intéressant dans
l’analyse de mélanges complexes de sucres.
Figure 2 : Schéma du montage réalisé par Bruggink (b).
Une autre étude est enfin intéressante à signaler. Van der Hoeven et ses collaborateurs
ont réalisé un couplage en ligne HPAEC-PAD-MS, le spectromètre de masse étant un appareil
à secteur magnétique. La colonne utilisée est de type CarboPac PA1 (250 mm x 2 mm id). La
nature de la solution régénérante nécessaire à compenser la concentration de 400mM de soude
a été étudiée. Le choix se porte soit sur de l'eau avec un courant de 500 mA appliqué à la
membrane du dessaleur, soit sur une solution d'acide sulfurique à 0.150 M (Van der Hoeven
et al., 1998a). Ils décrivent également la mise au point d'un gradient pour la séparation des
oligomères d'acide galacturonique, au cours duquel la concentration en NaOH passe de 100 à
400 mM en 45 min puis reste constant durant 30 min (Van der Hoeven et al., 1998b). Les
analyses sont réalisées dans les deux modes de détection/ionisation positif et négatif. Toutes
les analyses sont réalisées en mode balayage (scan).
104
Concernant l'efficacité du dessalage, les résultats obtenus indiquent la présence
d'adduits sulfate en mode négatif lorsque l’acide sulfurique est utilisé comme solution
régénérante. Les auteurs lui préfèrent donc une solution régénérante d'eau avec une
application d'un courant électrique sur la membrane du dessaleur (Van der Hoeven et al.,
1998a). Le raccordement au spectromètre de masse se fait aussi par division de l'éluant afin
d'obtenir un débit de 40µL/min (le débit dans la colonne étant de 200 µL/min) auxquels ils
ajoutent 10µL/min d'un mélange d'isopropanol et d'acétate de sodium pour obtenir une
nébulisation plus stable ainsi qu'une bonne ionisation par les ions sodium. Toutefois,
l’utilisation d'acétate de sodium lors de l'infusion dans la source ne permet pas de déterminer
si le système de dessalage est efficace. La quantité de soude pouvant être appliquée sur cette
colonne étant limitée, seuls les oligomères à 9 unités d'acide galacturonique ont été élués et ce
en près de 70min (Van der Hoeven et al., 1998b). Les quantités injectées sont de 140 pmoles
pour le DP4, 560 pmoles pour l'acide galacturonique et 82 pmoles pour un dimère de glucose.
Les auteurs ont déterminé que le mode d'ionisation/détection positif est équivalent, dans leur
condition, au mode négatif pour les mesures de l'oligomère d'acide galacturonique. Les
inconvénients de ce système sont donc : les temps d'analyse très longs, et une perte de
sensibilité due à la partition de l'éluant dès la sortie de colonne. L'utilisation du sodium pour
ioniser les molécules induirait, appliqué à l'ESI-Q-ToF, une perte de sensibilité importante et
une détérioration de l'appareillage.
Dans ce chapitre nous décrirons la réalisation d’un couplage entre un système HPAEC
et l'ESI-Q-ToF Ultima. Le système HPAEC est équipé d’une colonne de type CarboPac PA1
2mm spécialement étudiée pour l’analyse des monosaccharides. Nous avons analysé la
capacité du dessaleur en fonction des gradients d’hydroxyde de sodium utilisés, ainsi que de
la mise au point d’un gradient qui, dans un temps relativement court d’analyse, permet une
bonne séparation à la fois des sucres neutres et acides. Une fois la mise au point et les tests
réalisés sur des standards, nous avons appliqué ce couplage à l’analyse des polysaccharides
bactériens obtenus après extraction au phénol à chaud et hydrolyse douce.
105
RESULTATS
1 Couplage ESI-Q-ToF /HPAEC-PAD en ligne
Puisque l’analyse des sucres par HPAEC nécessite l’utilisation de soude et /ou
d’acétate de sodium, incompatible avec l’ionisation electrospray, nous devons utiliser un
dessaleur de type suppresseur autorégénérant d’anions (ASRS 4mm). À la différence de
Bruggink et al., nous allons réaliser le couplage PAD/dessaleur/MS en série (Figure 3). La
détection PAD, nécessitant la présence des ions hydroxydes pour catalyser l'oxydation des
sucres, le dessaleur sera placé après la cellule électrochimique. La capacité du dessaleur à
compenser l’augmentation de la concentration en soude lors du gradient, sans trop affecter la
largeur des pics, est testée. Pour ce genre de couplage la présence du détecteur PAD est
indispensable en raison de la complémentarité PAD/MS mais surtout pour la sauvegarde de
l'analyseur de masse. En effet, le spectromètre peut être gravement endommagé dans le cas de
défaillance du dessaleur, par introduction de sels non volatiles et corrosifs dans l'analyseur.
De plus, les ions sodium sont capables, même en faibles concentrations, de supprimer le
signal en formant des paires d’ions. L’absence de signal obtenu avec le détecteur MS peut être
due, soit à une quantité trop faible de polysaccharides lors de l’injection, soit à un mauvais
dessalage. Le PAD peut lever très rapidement le doute. En effet, si le signal enregistré par
ampérométrie pulsée est satisfaisant (contrairement à la spectrométrie de masse) cela signifie
que le dessaleur ne fonctionne plus de façon optimale.
La mise en place du couplage commence avec la mise au point du gradient le plus
adapté à l’analyse des sucres standards ou des mélanges polysaccharidiques d’origine
bactérienne. Les conditions de dessalage sont alors optimisées afin de supprimer tout au long
du gradient les sels présent. Enfin une fois ces paramètres établis, le choix du mode de
détection en spectrométrie de masse est effectué.
106
Figure 3 : Schéma du montage HPAEC-PAD–MS.
1.1 Choix du gradient
La colonne choisie est de type CarboPac PA1 de 2 mm, optimale pour l’analyse des
monosaccharides. Un premier gradient ternaire très efficace dans la résolution d’isomères
(résolution Gal/Glc=1) a été développé. Au cours des 15 premières minutes, la concentration
en soude augmente de 10 à 50 mM, puis elle passe à 80 mM en 5 min. À partir de là
concentration en acétate de sodium augmente de 0 à 90 mM, celle de NaOH restant constante.
Le retour aux conditions initiales se fait en 5 min. La capacité de séparation est très bonne
mais le gradient dure en totalité 40 min avec un temps de régénération de la colonne de 40min
nécessaire à obtenir une bonne répétabilité des temps de rétention des différents standards.
Une méthode d’analyse plus courte à été envisagée, dans laquelle le gradient n’est
composé que du gradient en acétate de sodium. Ainsi le programme débute avec une solution
de soude à 80 mM et seul un gradient en acétate de sodium de 0 à 90 mM est réalisé. Le
temps d’analyse est ainsi réduit à 20 min, et le rééquilibrage ne dure que 15 min.
Malheureusement avec ces conditions la séparation entre les isomères est presque nulle: Le
glucose et le galactose sont confondus. Pourtant ce programme présente un intérêt puisqu'il
107
augmente la réponse des sucres neutres au niveau du spectromètre de masse. En effet, l'acétate
de sodium présent dès le début est transformé, après passage dans le dessaleur, en acide
acétique, cette nouvelle source de proton permet une meilleure ionisation des sucres neutres et
améliorent leur réponse en spectrométrie de masse (jusqu'à 11 fois pour le rhamnose).
Un troisième gradient a été développé dans le cadre de l’analyse des polysaccharides
acides d’origine bactérienne Dans ce cas, la concentration de soude à 80mM reste constante
tout au long de l'analyse, en 15 min la concentration d'acétate de sodium passe de 0 à 108
mM. Ensuite la concentration en NaOAc augmente jusqu'à 180 mM en 15 min. L’éluant
revient ensuite aux conditions de départ en 10 min. Ce gradient diffère des deux autres par
une augmentation de 100% de la concentration en NaOAc. Un temps d’équilibrage de 15min
est nécessaire entre deux analyses.
1.2 Choix du régénérant de dessalage
L’efficacité du dessaleur est mesurée par conductimétrie. Dans un premier temps nous
avons fixé plusieurs paramètres: le débit maximum de la colonne à 300µL/min pour être
compatible avec la source ESI, requérant un débit de 2 mL/min pour la solution de régénérant.
Deux solutions régénérantes ont été testées, de l’eau et une solution à 0.25% d’acide
sulfurique dans de l’eau. Un suivi du pH permet de savoir si l’augmentation de la
conductimétrie au cours du gradient est due à la soude résiduelle (augmentation du pH) ou à
la formation d'acide acétique. Sans dessaleur, la valeur de la conductimétrie sature à 3500 µS
et le pH est égal à 14. Le programme utilisé pour tester l’efficacité du dessaleur est le
programme le plus long 40 min.
108
Figure 4 : Analyse conductimétrique de l'effluent du dessaleur afin de mesurer de l'efficacité du dessalage en fonction de la
solution régénérante employée.
Nous avons commencé par tester l’efficacité de l’eau en tant que solution régénérante.
La Figure 4 (la courbe en pointillé) nous indique que dans un premier temps (augmentation de
la concentration en soude) le dessaleur est efficace. Une légère augmentation de la
conductivité se produit au début du gradient en acétate de sodium. Il apparaît ensuite un point
de rupture suivi d'une augmentation subite de la conductivité montrant que le dessaleur ne
joue plus son rôle. L’analyse de la courbe du pH nous montre que lors de la première phase
d’augmentation de la conductivité, le pH diminue, ceci est dû à la transformation en acide
acétique de l’acétate de sodium (Figure 5). Au point de rupture, qui conduit à une saturation
du détecteur, l'augmentation du pH montre la perte de la suppression du dessaleur. Un courant
peut être appliqué sur la membrane du dessaleur permettant l'électrolyse de l'eau. Les protons
ainsi générés augmentent l'efficacité du dessaleur. Lors de la détection électrochimique des
sucres, nous ne pouvons pas induire ce courant lié au conductimètre. Un générateur externe
doit être utilisé. La source ESI étant mise sous haute tension 3000V, nous ne préférons pas
109
utiliser pas de courant extérieur supplémentaire à proximité spatiale de la source lors du
couplage.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 10 20 30 40 50 60
temps en min
pH
Figure 5 : Variation du pH lors de la régénération de la membrane avec de l'eau.
Nous avons ensuite testé l’utilisation de l’acide sulfurique à 0.25% dans l’eau et l’effet
du courant de polarisation pour s'assurer que l'ajout d'un courant externe n'est pas
indispensable. Nous recherchons la concentration en acide sulfurique minimale afin que la
régénération engendre aussi peu d'adduits de sulfate que possible lié au passage des contrions
à travers la membrane. La Figure 4 montre que là encore la conductivité augmente dès le
départ du gradient d'acétate de sodium. Néanmoins, il n’y a pas apparition d’un point de
rupture comme précédemment. L’analyse du pH au cours du temps nous permet d’observer
une diminution progressive de celui-ci (Figure 6). Cette diminution du pH est due à la
présence d’acide acétique dans l'effluent du dessaleur. Le dessaleur est donc capable de
compenser l'influx d’ions dans ces conditions. Le test est alors réalisé avec l’application d’un
courant sur les membranes pour permettre une électrolyse de l’eau (Figure 4). L’effet d’un
courant continu de 50 mA sur la suppression des cations n’est pas visible aux concentrations
étudiées, il n'est donc pas nécessaire d'augmenter la concentration en acide. Nous choisissons
donc d’utiliser une solution dans l’eau d’acide sulfurique à 0.25% sans application d’un
courant continu sur la membrane durant l’analyse. Pendant la période d’équilibrage, un
courant de 50 mA est appliqué sur les membranes du dessaleur pour régénérer celui-ci.
110
Figure 6 : Courbe de pH au long du gradient avec une solution régénérante de H2SO4.
Nous avons ensuite vérifié l’efficacité du dessaleur lors du programme utilisé pour les
polysaccharides bactériens. En effet celui-ci fini avec une augmentation importante de la
concentration en acétate (jusqu’à 180 mM) nécessaire à éluer les polysaccharides acides. Les
mêmes tests que précédemment ont donc été réalisés (Figure 7). À la différence de ceux
obtenus avec le programme, le pH de départ est de 4 et descend jusqu'à 3.7. Ceci nous indique
que l’augmentation de la conductimétrie est uniquement due à la formation d'acide acétique.
Le régénérant à 0.25% d’acide sulfurique est donc toujours efficace. Lors de l’analyse sur les
standards, nous notons néanmoins la présence d’adduits au sodium, tandis que nous n’en
avions pas avec le programme court moins drastique.
3,553,6
3,653,7
3,753,8
3,853,9
3,954
4,05
0 10 20 30 40 50
Figure 7 : Evolution du pH au long du programme correspondant aux échantillons biologiques.
111
1.3 Effet du dessaleur sur la résolution chromatographique
Comme Bruggink et ses collaborateurs ont pu le déterminer, l'ajout en série de la
cellule électrochimique et du dessaleur induit une perte de résolution lors de l'analyse en MS.
La mesure de la perte de résolution est réalisée à partir du programme long et grâce à
l'injection de deux isomères dont les temps de retentions sont proches: le glucose et le
galactose.
L'analyse MS se fait en mode positif. Le signal ampérométrique produit un
chromatogramme dans lequel les deux pics sont bien séparés (la résolution est alors de 1). Le
chromatogramme obtenu grâce au détecteur MS indique que la résolution entre ces deux pics
a diminué jusqu'à 0.7 (Figure 8). De plus, les pics sont élargit d'environ 30%. Les deux pics
demeurent pourtant identifiables par leur temps de rétention et leur signal en PAD. Leur
identification en MS est possible, malgré le fait qu'ils aient le même ion signature. La
différence de temps de rétention entre le PAD et le MS est de 20s, indiquant que le volume
mort entre les deux détecteurs est de 100µL. Nous jugeons que pour notre propos la perte de
résolution due à la cavité du PAD et au dessaleur ne nécessite pas de placer les deux
détecteurs en parallèle comme Bruggink et ses collaborateurs l’ont réalisé.
Figure 8: Comparaison des chromatogrammes obtenus en PAD et en MS avec un appel d’ion m/z 163. En détection PAD
nous observons par ordre d'élution le Rhamnose (Rha), le Galactose (Gal) et le glucose (Glc). L'appel d'ion a 163 amu ne fait
apparaître que les pics du galactose et du glucose
Rha
Gal
Glc
Glc
Gal
112
1.4 Choix du mode d'ionisation en MS
N-acetylneuraminyl α(2-6) lactose
Figure 9 : Structure du 6'sialyllactose.
Le choix du mode d'ionisation/détection est un dilemme surtout dans le cas des sucres
acides. Ces sucres possèdent des acides carboxyliques facilement ionisables en mode négatif,
permettant d'obtenir un rapport S/N optimum. Mais cela implique pour chaque échantillon de
réaliser une analyse dans les deux modes pour avoir une réponse complète quant à la
composition saccharidique, le Q-ToF Ultima ne pouvant changer d'un mode
d'ionisation/détection à l'autre en cours d'analyse. Nous avons donc voulu déterminer la perte
de sensibilité pour les sucres acides analysés en mode positif. Pour ce faire, les tests sont
menés sur un trisaccharide acide : le 6’sialyllactose (Figure 10). Les tests de sensibilité, dans
les deux modes, ont montré que leur intensité en scan était équivalente, et que la perte de
sensibilité ne se produisait que lorsque l’on atteignait une concentration inférieur à 10 µM. De
plus, en mode d’ionisation positif, le bruit n'est que trois fois plus important que celui du
mode de détection négatif.
Nous nous sommes également assuré que le mode d'ionisation n’induisait pas de perte
d’information lors des analyses MS/MS des polysaccharides. Pour cela, nous réalisons dans
les conditions d’analyse HPAEC-PAD-MS une analyse MS/MS sur le 6’sialyllactose. Dans
les spectres obtenus avec les deux modes d'ionisation/détection les informations sont les
mêmes : perte d’un sucre neutre (162 amu), présence d’un pic Hexose-acide N-acétyl-
neuraminique (NANA) m/z 470 en ESI - et avec une perte d'eau supplémentaire m/z 454 en
ESI+. L’ion spécifique du NANA m/z 292 en ESI+ et m/z 290 en ESI - est pareillement
observé. En mode positif, un ion supplémentaire à m/z 163 est présent et caractérise l'hexose
113
seul. Un avantage non négligeable du mode positif est que la quantité d’énergie de collision
appliquée est moins importante, permettant d’accroître la sensibilité de détection.
Figure 10 : A) chromatogramme obtenu par appel d’ion m/z 634 qui correspond à l’ion spécifique en mode positif du
6’sialyllactose B) chromatogramme obtenu en scan en mode positif C) spectre MS/MS en ESI + de l’ion m/z 634 D)
chromatogramme obtenu par appel d’ion à m/z 632 qui correspond à l’ion spécifique en mode négatif du 6’sialyllactose E)
chromatogramme obtenu en scan en mode négatif F) spectre MS/MS en ESI - de l’ion m/z 632.
Le signal obtenu en mode négatif ne permet pas un gain significatif de sensibilité,
nous avons donc décidé de n’utiliser que le mode positif pour analyser les échantillons
biologiques. Ceci va permettre d’analyser tous les oligosaccharides présents dans les extraits
bruts en une seule analyse sans perte d’information.
A
B
C
D
E
F
114
1.5 Sensibilité respective des détecteurs PAD et MS
La sensibilité en PAD ou en MS est dépendante de la nature des sucres. En PAD, la
réponse correspond à l’oxydation des alcools (notamment de l’hydroxyle porté par le carbone
6) et de l'aldéhyde (anomères). En ESI-Q-ToF, l’ionisation se place au niveau de la jonction
osidique (Harvey et al., 2005). La particularité de la réponse MS est quelle n’est pas linéaire
en fonction de la concentration sur une large gamme de concentration, et qu'elle est
dépendante de la nature des sucres et des conditions d'ionisation. Pour réaliser la comparaison
de ces deux systèmes de détection, différentes solutions de standards allant de 2 à 200 µg/mL
ont été préparées. Pour chacune de ces solutions, 5µL sont injectés. Les chromatogrammes
réalisés en MS ont été enregistrés en mode scan pour obtenir un maximum d'informations sur
les macrostructures biologiques à venir (dimères, adduits de sodium etc...). Les limites de
détection sont obtenues par appel d'ion spécifique des sucres analysés (Figure 11). Pour les
désoxysucres, l'appel d'ion optimal est à m/z [2M+H-2H2O]+=293, pour les hexoses à m/z
[M+H-H2O]+=163, pour le NANA à m/z [M+H]+=310 et pour les acides uroniques à m/z
[2M+H-2H2O]+=353.
Figure 11 : Comparaison des chromatogrammes reconstitués obtenus en mode d'acquisition en balayage ou en appel d’ion
m/z 353 pour les acides uroniques, m/z 163 pour les hexoses, m/z 293 pour les désoxysucres, m/z 310 pour le NANA.
Rha
Glc
NANA
GalA
115
Les courbes obtenues nous ont permit de déterminer les limites de détection des
différents sucres ainsi que les équations de la droite de régression et les coefficients de
corrélation linéaire (Tableau 1). Dans un premier temps, nous avons validé la reproductibilité
de la méthode d’analyse. Comme la détection PAD permet une identification uniquement par
le biais des temps de rétention, nous nous sommes assuré que ces temps de rétention étaient
également reproductibles. Comme l’indique la 2ème colonne du Tableau 1, la variation des
temps de rétention est d’autant plus élevée que la valeur de ce temps est grande. Le NANA,
lui, varie arbitrairement. Une augmentation du temps de régénération de la colonne a été
réalisée, mais sans améliorer les résultats. La variation pourrait être due à la présence d’ions
carbonates dans l’éluant variant au cours de la préparation des éluants qui doivent être
changés quotidiennement. Pour garder une bonne reproductibilité, un nettoyage bref de la
colonne a donc été effectué toutes les vingt analyses. Ces variations confirment la nécessité
d’avoir post PAD un détecteur permettant de faire une confirmation structurale.
Tableau 1: Tableau comparatif des limites de détection et des équations des droites en fonction de la nature du sucre mais
aussi du mode de détection.
standard Temps de rétention
(min) Limite de détection
(pmol)
Equation de la droite
r2
MS 130 0.1814x+15.174 0.9968 Rha
PAD
3.3±0.27 20±1 0.0613x+1.2152 0.9741
MS 138 0.0181x+12.698 0.9925 Glc
PAD
4.87±0.51 20±2 0.0347x+21.86 0.9992
MS 40 0.6893x+50.897 0.8663 NANA
PAD
13.68±0.62 123±5 0.0077x+6.1964 0.9976
MS 1651 0.0174+3.5768 0.9736 GalA
PAD
20.17±0.58 59±3 0.0354x 0.9931
MS 39 4.614x 0.9988 6’sialyl
-lactose PAD
17.55±0.24 20 0.0985x+ 0.4523 0.9999
116
La comparaison des limites de détection pour chaque type de sucre et chaque système
de détection nous permet d’observer que la détection PAD est plus sensible face aux
désoxyhexoses, aux hexoses et les acides uroniques tandis que la spectrométrie de masse
permet une meilleur détection des Kdx. Les deux systèmes de détection sont donc
complémentaires. Leur combinaison permet donc d'appréhender au mieux la composition des
polysaccharides biologiques complexes. Le fait que les Kdx répondent très bien en MS mode
positif rendra l’analyse des KPS d’autant plus aisée. Nous avons donc mis au point un
système analytique performant permettant une détermination efficace de la composition en
sucres, des sucres neutres (PAD) et acides (MS) à l’exception des seuls acides uroniques
(Figure 11).
2 Analyse des polysaccharides contenus dans les extraits bactériens
Comme nous l'avons vu dans les chapitres précédents, les polysaccharides de surface
des bactéries du genre Sinorhizobium jouent un rôle important dans la mise en place de la
symbiose fixatrice d'azote. Mais ces polysaccharides sont difficiles à purifier et à analyser.
Leur balance hydrophobe-hydrophile proche, une taille parfois semblable et les nombreuses
charges négatives qu'ils portent, permet rarement de les séparer. La nature acide des sucres
qui les composent, rend par ailleurs l'analyse de leur composition par GC-MS difficile. De ces
difficultés de purification résultent soit de trop petites quantités de produit pur ou un mélange
abondant mais trop complexe pour leur analyse. Ainsi, peu de structures de LPS et de KPS
ont été publiées à ce jour.
Nous allons réaliser l'analyse d'un extrait brut polysaccharidique par HPAEC-PAD-
MS. La HPAEC est capable de résoudre la complexité du mélange polysaccharidique contenu
dans l'extrait brut et ce malgré le fort caractère anionique des KPS et des LPS. Le couplage
HPAEC avec le PAD et la MS va donc nous permettre de réaliser, en une seul étape, l'analyse
de tous les constituants de l'extrait brut et cela à partir d'une faible quantité de polysaccharides
en mélange et (5 mg/mL et seulement 5 µL sont injectés).
Les KPS possèdent une structure consensus un Kdx et un hexose, ainsi une hydrolyse
douce permet de lyser les jonctions osidiques du polysaccharide impliquant la position 2 des
117
Kdx, tout en conservant le disaccharide unitaire. Les glycanes présents ne seront pas touchés
par l'hydrolyse, nous avons ainsi une information quant à leur taille et aux groupements
chimiques qu'ils peuvent porter. Les LPS sont coupés, séparant le cœur et le lipide A et
éventuellement l'antigène O.
Les extraits bruts de quatre souches ont été analysés en HPAEC-PAD-MS après
hydrolyse douce. Seul le genre Sinorhizobium a été étudié et trois espèces ont été choisies
meliloti, sp. NGR, fredii. La composition des KPS a été publiée pour les quatre souches:
Sm1021, AK631 (Sm41 exoB), SspNGR234 et Sf HH103. Les KPS des Rhizobia sont
constitués d’une unité disaccharidique répétitive à un haut degré de polymérisation. Un motif
consensus a pu être dégagé pour ce disaccharide. Il est en général composé d’un hexose et
d’un acide 2-céto-3-désoxyulosonique (Kdx) (Reuhs et al., 1998 ; Kiss et al., 2001). La
souche Sm1021 fait exception puisque ces KPS sont constitués exclusivement de Kdo, qui
plus est, portant une ancre lipidique. Sm41 autre représentant du genre Sinorhizobium meliloti
possède quant à elle des KPS constitués d’un acide glucuronique et d’un acide 5-acetamido-7-
hydroxybutyramido-3,5,7,9-tetradésoxy-L-glycero-L-manno-nonulosonique (5N-acétyl-7N-
hydroxybutyl-pseudaminique ou 5NAc7NBuOHPse) (Reuhs et al., 1998). Les KPS de S sp
NGR234 comportent un glucose et un acide 5,7-diacetamido-3,5,7,9-tetradésoxy-L-glycero-L-
manno-nonulosonique (5,7N-diacétyl-pseudaminique ou 5,7NdiAcPse) (Le Quéré et al.,
2006). La souche S. fredii HH103 à la particularité de présenter des polymères de grande
taille, poly-5,7NdiAcPse (Gil-Serrano et al., 1999).
Pour ces différentes souches, les chromatogrammes obtenus en HPAEC-PAD-MS
montrent des profils complexes dans les deux systèmes de détection (plus de 15 pics en
20min, Figure 12 pour la réponse en MS). La nature acide de l'éluant (qui contient une
concentration croissante en acide acétique), permet une bonne fragmentation des
polysaccharides sans avoir à appliquer une énergie de collision importante. L'utilisation de la
détection MS permet de caractériser trois familles d'homopolysaccharides : Les oligo-5NAC-
7NBuOH-Pse avec un appel d'ion à m/z 361, les oligoKdo à m/z 221, et les glycanes à m/z 325
(dimère de glucose).
118
Figure 12 : Chromatogrammes obtenus en ESI-MS en positif avec une acquisition en balayage de masse, pour les souches
étudiées S. sp. NGR234, S. meliloti 1021, AK631 et S. fredii HH103.
2.1 Sm1021
Peu de KPS ont été totalement caractérisés, ceux de Sm1021 font partie des
exceptions. Ce sont des homopolymères de Kdo liés en β2-7, rattachés à une ancre lipidique
(Fraysse et al., 2005). Le profil complexe obtenu pour Sm1021 (Figure 12) révèle non
seulement la présence de Kdo mais aussi de nombreux oligoKdo (Figure13).
SNGR234 Sm1021 AK361 SfHH103
119
Figure 13 : Chromatogramme obtenu par appel d'ion m/z 221 spécifique des Kdo pour la souche Sm1021.
Les oligoKdo éluant entre 7 et 12 min se caractérisent par une distribution de
fragments distants de 220 amu se terminant sur m/z 221 (Figure 14c). Mais la multiplicité des
oligoKdo correspondant aux résidus des KPS n'expliquent pas la complexité du
chromatogramme.
L'appel d'ion m/z 325 (spécifique des glycanes) fait apparaître des oligosaccharides
très retenus par la phase stationnaire (17 à 20 min). Le spectre du pic à 17,96 min indique la
présence de glycanes caractérisés par des fragments distants de 162 amu dont le plus petit
membre est l’ion m/z 325 (Figure 14A). Leur taille varie de 1314 à 3906 Da. En plus de ces
deux distributions, il reste toujours plusieurs pics de structures indéterminées. À notre grande
surprise, un appel d'ion m/z 361 (5NAc-7NBuOH-Pse) indique la présence de manière non
équivoque d'un oligo-5NAc-7NBuOH-Pse dont la distribution est caractérisée par des
fragments réguliers écartés de 360 amu (Figure 14D) dont les pics sont élués entre 5 et 7 min.
Une dernière série de pics s'étalant entre 18 et 23 minutes est encore plus étonnante.
Cette distribution se termine par un ion m/z 317, ce qui laisserait supposer la présence d'un
5,7NAc-Pse. Toutefois la distance entre les fragments réguliers de la série est de 162 amu sont
la signature d'un homopolymère d'hexose. Le 5,7NAc-Pse n'est pas un sucre couramment
décrit dans la famille Sinorhizobium meliloti. Nous pouvons donc supposer qu'il s'agit d'un
substituant particulier situé sur les glycanes. La masse m/z 317 correspondant également à un
glycérophosphate lié à un hexose. Une telle substitution a été rapportée au niveau d'un
glycanes cycliques dans la souche SfHH103 (Parada et al., 2006). Ces composés ont été
trouvés aussi chez Sm1021 dans des conditions de choc osmotique (Breedveld et al., 1995).
Nous avons donc réalisé une analyse en masse exacte pour déterminer la nature exacte de cet
ion (5,7NAC-Pse ou glucose-glycérophosphate).
120
Figure 14: Spectres obtenus lors du couplage HPAEC-PAD-MS A) distribution de glycanes cycliques B) distribution d'un
homo hexose dont l'ion de plus petite masse de la série m/z 317 C) d'un oligoKdo D) d'un oligo-5NAc-7NBu-Pse.
Pour réaliser l'analyse en masse exacte de cet ion, nous avons eu recours à la stratégie
suivante. Nous avons réalisé l'analyse en masse exacte de l'échantillon biologique en utilisant
comme calibrant interne (lock mass) l'oligoGlc présent à un temps de rétention proche. Nous
obtenons en ESI-Q-ToF avec une précision de 10 ppm les valeurs présentées Tableau 2. Le
résultat nous indique que nous sommes sans ambiguïté en présence des glycanes
glycérophosphorylés.
121
Tableau 2 : Tableau comparatif des résultats obtenus en masse exacte pour déterminer la structure des glycanes singuliers.
nom formule chimique
masse exacte masse lue différence
en mDa (ppm)
5NAC-7NBu-Pse C13H20N2O7
317.1349
-70.5 (-222)
Glc-glycérophosphate C9H18O10P
317.0638
317.0644±0.0029
0.6 (1.9)
2.2 S. fredii HH103
Dans le genre Sinorhizobium fredii, les KPS de plusieurs souches ont été caractérisés.
Les KPS de SfUSDA dont la structure a été utilisée pour déterminer la structure consensus,
l'hexose est soit un mannose, soit un OMe-mannose ou encore un galactose (Forsberg et al.,
1997). S. fredii HH103 possède, quant à elle, des KPS peu communs composées uniquement
de 5NAc-7NBuOH-Pse (Gil-Serrano et al., 1999). L'appel d'ion m/z 361 confirme la présence
d'oligomères de 5NAc-7NBuOH-Pse (Figure 15). Aucun oligomère de 5,7NdiAc-Pse n'a pu
être identifié.
La présence de glycanes cycliques est aussi mise en évidence par le chromatogramme
extrait m/z 325. L’appel d'ion m/z 317 indique la présence des glycanes glycérophosphorylés.
Ces glycérophosphoglycanes doivent correspondre à ceux trouvés par Parada et ses
collaborateurs en 2006. Dans ce travail, la présence de ces glycérophosphoglycanes a été
démontrée par une analyse RMN dans laquelle il a été déterminé qu'il s'agissait de β1-2
glucane cyclique glycérophosphorylés en position 6.
Étonnamment, le chromatogramme obtenu par appel d'ion m/z 221, ainsi que les
spectres obtenus, démontrent clairement que S fredii HH103 produisait, en plus de
l'homopolyPse, une grande quantité d'oligoKdo.
122
Figure 15 : Chromatogrammes comparatifs en PAD et en MS (TIC et les appels d'ion des principaux constituants) pour la
souche SfHH103.
2.3 Sm41 exoB (AK631)
Cette souche a été très largement utilisée dans l'étude des gènes impliqués dans la
biosynthèse des KPS ainsi que dans celle du rôle des KPS dans la mise en place de la
symbiose fixatrice d'azote. Pour autant, la structure de ses KPS, n'a jamais été totalement
caractérisée, mais a été donnée telle que par Reuhs et ses collaborateurs en 1998. Ceux-ci sont
constitués d'une unité répétitive d'un [5NAc-7NBuOH-Pse]-GalA.
Pour déterminer la présence de ce disaccharide constituant les KPS, nous avons
extrait le chromatogramme m/z 537 correspondant à la masse de l'entité proposée Pse-GalA
(Reuhs et al., 1998). Le spectre obtenu pour le pic à 13.67 min montre la présence de l'ion m/z
537 associé à une distribution non régulière de fragments et d'adduits (Figure 16). L'ion m/z
559 correspond à la forme [M+Na]+, et les ions m/z 519 et 501 correspondent à la perte d’une
ou deux molécules d'eau respectivement à partir de l'ion moléculaire. La présence de l'ion
123
fragment m/z 361 associé aux ions m/z 343 et 325 (pertes d'eau) ainsi que son adduit sodium
(contre ion du carboxylate) m/z 383 correspondent parfaitement à un monomère de Pse.
L'écart de masse entre l'ion moléculaire m/z 537 et le fragment m/z 361 est de 176
amu. Cette perte de neutre est la signature d'un acide uronique. La présence de ce composé en
quantité substantielle démontre que les propos de Reuhs et al. étaient bien fondés. Toutefois,
nous ne sommes pas en mesure (en l'absence de standard pour la détermination du temps de
rétention) de savoir si nous sommes en présence d'un acide galacturonique ou glucuronique,
ni quel est le mode de jonction des monomères du disaccharide.
L'association de l'appel d'ion à m/z 361 et des spectres correspondant indique la
présence d'un oligo 5NAc-7NBuOH-Pse comme cela a été observé pour la souche SfHH103.
-18 +22
DP1
DP2
DP3
124
Figure 16 : Comparaison des chromatogrammes obtenus en mode balayage (TIC) et en appel d'ion m/z 537, En encart le
spectre de masse du pic à 13.67 min. DP : degrés de polymérisation (DP1 correspond à l'unité disaccharidique [5NAc-
7NBuOH-Pse]-GalA).
Enfin l'appel d'ion m/z 221 indique que la souche AK631 produit elle aussi de grandes
quantités d'oligoKdo (Figure 17 A). Une importante distribution de glycanes
glycérophosphorylés (m/z 317) est également observée alors qu'il n'y a que très peu de
glycanes réguliers non substitués (m/z 325).
Figure 17 : Chromatogrammes obtenus par appel d'ion m/z 221 chez des Sinorhizobia différents de Sm1021.
2.4 S sp. NGR234
Les polysaccharides capsulaires de S sp. NGR234 ont été caractérisés comme étant
basés sur le dimère [5,7NdiAcPse-GlcA]n (Le Quéré et al., 2006) alors qu'au départ
[5,7NdiAcPse-Glc] avait été proposé (Reuhs et al., 1998). Nous avons donc réalisé deux
appels d'ion l'un pour le [5,7NdiAcPse-Glc] m/z 479 et l'autre pour [5,7NdiAcPse-GlcA] à m/z
493. Le chromatogramme m/z 479 laisse apparaître une distribution. Toutefois les spectres
obtenus montrent que ce fragment n'est pas celui attendu mais un des fragments de la
distribution des glycanes glycérophosphorylés (Figure 18). L'appel d'ion à m/z 493 n'a pas
révélé la présence de 5,7NdiAcPse-GlcA. Ainsi pour cette souche, la présence du disaccharide
unitaire des KPS n'a pas été retrouvée. Nous n'avons pas été en mesure de comprendre
pourquoi, dans cette souche, l'analyse des seuls KPS n'a pas fonctionné (les autres
polysaccharides étant présents) d'autant plus que leur visualisation fut aisée pour les trois
A
B
125
autres souches. Néanmoins, nous ne remettons nullement en cause la détermination structurale
pointue réalisée par Le Quéré et ses collaborateurs.
À nouveau, une faible quantité d'oligo5NAc-7NBuOH-Pse a pu être observée ainsi
qu'une quantité plus importante d'oligoKdo. Les deux distributions de glycanes (non modifiés
et glycérophosphorylés) sont présentes en quantités significatives.
Figure 18 : Spectre de masse obtenu pour le pic répondant à m/z 479. Le pic appartient à la distribution des glycanes
glycérophosphorylés.
Le Tableau 3 résume toutes ces observations
Tableau 3 : récapitulatif des oligosaccharides caractérisé dans les souches Sinorhizobia étudiées. Tr= trace.
Souche
polyKdo m/z 221
polyPse m/z 361
glycanes réguliers m/z 325
GlyceroP- glycanes m/z 317
HexA- 5NAc7NBuOHPse
m/z 537
HexA-5,7NdiAcPse
m/z 493
Sm1021 oui oui oui oui non non
AK631 oui oui non oui oui non
S. NGR234 oui Tr oui oui non non
Sf HH103 oui oui oui oui non non
GlyceroP: glycérophosphate
m/z
126
127
BILAN
Parmi les études portant sur le couplage HPAEC-PAD-MS, peu avaient été réalisées
sur un système positionné en série, sans impliquer une division de l'échantillon (Bruggink et
al., 2005 et Van der Hoeven et al., 1998). Les difficultés rencontrées par ces équipes se sont
situées au niveau du dessalage et de la perte de sensibilité liée à la division de l'échantillon.
Pour le premier point, Van der Hoeven et ses collaborateurs avaient éliminé la possibilité
d'utiliser l'acide sulfurique car la présence d'adduits sulfate avait été visualisée en mode
négatif. Bien que non volatiles, ces ions ne semblent pas poser de problème en mode positif,
qui est le mode d'ionisation/détection que nous utilisons. L'acide sulfurique possède un
avantage non négligeable qui est de ne pas nécessiter d'application d'un courant
supplémentaire sur la membrane qui pourrait interférer avec la haute tension (3 kV) appliquée
sur le capillaire de la source ESI à 10 cm du dessaleur. Nous avons ainsi développé un
système ne nécessitant ni partition de l'échantillon ni ajout d'ion sodium ou lithium afin
d'augmenter l'ionisation. En effet, le dessalage de l'éluant que nous avons choisi, riche en
acétate de sodium, induit la formation d'acide acétique propice à l'ionisation des sucres. En
comparaison avec Van der Hoeven (qui réalise également les analyses en mode scan suivi
d'un appel d'ion), nous avons une meilleure détection des sucres neutres (Glc) en améliorant la
limite de détection de 15%. Par contre pour l'acide galacturonique nous perdons en sensibilité
avec une limite de détection triplée (Tableau 4). Nous ne pouvons pas comparer nos résultats
avec les études faites par Bruggink, puisque lors de ces analyses en MS, il a utilisé le mode
SIM et non scan ce qui permet d'augmenter très significativement la sensibilité, de plus, le
travail a été réalisé sur colonne capillaire. La combinaison de la HPAEC-PAD et de ESI-Q-
ToF a démontré sa sensibilité et sa robustesse lors de l'analyse des oligosaccharides neutres et
acides, et ce, même lorsque le mélange de départ est très complexe (échantillon biologique).
128
Tableau 4 : Tableau comparatif des limites de détection obtenues dans ce travail et celles des travaux référents.
Standard LOD obtenue
par Van der Hoeven en pmole
LOD obtenue par Bruggink
en pmole
LOD obtenue dans cette étude
en pmole Glc 160 1.45 130
GalA 560 / 1560
Concernant l'analyse des extraits bruts bactériens, les résultats pour S. meliloti 1021, S.
fredii HH103 et AK631 ont montré des résultats corroborant les premières déterminations
structurales réalisées sur leurs KPS. Cette technique a en plus permis de mettre en évidence
deux faits importants. Les glycanes cycliques β1-2 glycérophosphorylés qui a été caractérisé
pour la souche S. fredii HH103 (en RMN) par Parada et al. de 2006 sont présents chez tous
les Sinorhizobia étudiées. La deuxième observation importante est la présence en quantité non
négligeable d'oligoKdo chez tous les Sinorhizobia. Nous savons que ces oligoKdo sont
constitutifs des KPS chez Sm1021 et qu'ils sont rattachés à une ancre lipidique. Cette
structure singulière qui n'a à ce jour été rapportée que pour Sm1021 était jugée comme une
particularité de cette souche (Becker et al., 2005). Or, l'étude menée ici semble démontrer le
contraire. Pour s'assurer qu'il s'agisse bien des mêmes KPS, il nous a fallu vérifier si les
oligomères de Kdo des autres souches sont eux aussi rattachés à une ancre. Pour ce faire, nous
avons analysé le précipité obtenu lors de l'hydrolyse douce des extraits bruts en ESI-MS mode
négatif (Figure 19). Nous avons observé la présence de l'ion m/z 622 et son pendant m/z 594
dans les souches AK631 et S. sp. NGR234. Une analyse MS/MS, nous indique qu'il s'agit
bien de la même ancre lipidique que chez Sm1021 (formation des ions m/z 153, 171 et perte
d'un glycérol (voir chapitre 1). Dans le cas de S. fredii HH103, nous observons deux pics
distants de 28 amu mais à une masse m/z 638 et 610 respectivement. Une analyse MS/MS de
l'ion m/z 638 indique néanmoins une fragmentation identique à celle de m/z 622 (Formation
des ions m/z 153, 171 et perte d'un glycérol). Nous sommes donc en présence d'une autre
forme de la même d'ancre vraisemblablement oxydée. La présence d'un lipopolyKdo n'est
donc pas spécifique de Sm1021. Reuhs et al. en 1998 avaient émis l'hypothèse qu'un
oligoKdo pourrait servir de précurseur à la synthèse des KPS. Nous pouvons donc supposer,
aux vues des résultats obtenus ici, que les lipo-oligoKdo servent de précurseur à la synthèse
des KPS non seulement pour Sm1021 et AK631 mais aussi pour tous les membres de la
famille des Sinorhizobia étudiés. Le fait qu'ils aient été découverts chez Sm1021 ne serait lié
129
qu'à la particularité que présente cette souche de produire uniquement des KPS de petites
tailles (cf. chapitre 1).
Figure 19 : Spectres de masse de la fraction lipidique pour S. sp. NGR234 et Sf HH103.
Ancre lipidique de S sp NGR234
Ancre lipidique de Sf HH103
m/z
130
131
Chapitre 3 : Analyse structurale du cœur des LPS de
Sm1021.
CONTEXTE
Les bactéries, comme la plupart des organismes, possèdent une membrane
phospholipidique délimitant le cytoplasme. Les bactéries de type Gram négatif possèdent en
plus une deuxième bicouche séparée de la première par un peptidoglycane. Cette bicouche est
asymétrique. Elle possède au niveau de sa face interne des phospholipides, alors que sa
surface externe est constituée majoritairement de lipopolysaccharides (LPS) (Figure 1). Ces
LPS représentent 75% de la surface de la membrane externe mais ne correspondent qu'à 3.5%
de la masse sèche d'une bactérie E. coli (Neihardt et al., 1990).
Figure 1 : Structure de la membrane bactérienne d'une bactérie Gram négatif.
La structure des LPS peut être divisée en trois parties: le lipide A, l'oligosaccharide de
cœur (le cœur), l'antigène O. Le lipide A représente la partie hydrophobe d'un LPS et permet
l'ancrage de celui-ci dans la bicouche lipidique. Chez les Rhizobia, sa structure est basée sur
une unité disaccharidique de type 2,3-diaminoglucose ou glucosamine. La liaison entre les
132
deux glucosamines est de type β (1-6) (Figure 2). La liaison au cœur se fait grâce à un Kdo lié
en 6'. Dans la majorité des cas, les glucosamines sont substitués par 4 à 6 acide gras β-
hydroxylés. Ces acides gras substituent les positions 2,2',3,3’ des glucosamines. Les acides
gras portés par les azotes présentent une substitution secondaire formant des dérivés alcoxy-
acyle. Il existe une grande disparité dans la composition des acides gras et dans les acylations
secondaires en fonction de la famille et du genre bactérien. Les deux glucosamines portent
généralement d'autres substitutions. Dans certain cas, la position réductrice du disaccharide
(sucre dit proximal) est soit oxydé en aminogluconate, soit substitué par un phosphate (Figure
2) (Ribiero et al., 1999). La seconde glucosamine non réductrice (dit distal) est soit
phosphorylée, soit substituée par un groupement galacturonate dans la position 4’. Les lipides
A sont la partie du LPS la plus simple à étudier, puisqu’ils peuvent être aisément séparés du
cœur. De par leur précipitation spontanée en milieu aqueux, il est possible de les isoler à partir
d'un mélange saccharidique complexe dans lequel se trouvent les LPS. De nombreuses
souches de Rhizobia ont une structure connue des lipides A. C'est le cas pour R. etli CE3 (Que
et al., 2000), S. sp. NGR234 (Gudlavalleti et al., 2002), R. leguminosarum (Bhat et al., 1991).
C’est aussi le cas de la souche qui nous intéresse plus particulièrement : Sm1021 (Kanipe et
al., 2003 ; Ferguson et al., 2005). Toutes les structures connues de lipide A chez Rhizobia
présentent une caractéristique commune qui est la présence d'un acide gras à très longue
chaîne hydroxylé en ω-1. Cet acide gras à longue chaîne, substitue la chaîne grasse de l'amide
sous forme d'un dérivé alcoxy-acyle. Son hydroxyle est souvent plus souvent substitué par un
hydroxybutyrate (Bath et al., 1991).
Raccroché au lipide A par deux Kdo, se trouve l'oligosaccharide de cœur. La structure
la plus simple des LPS est formée par un lipide A auquel est lié un oligosaccharide de cœur,
ils sont alors appelés r-LPS ou LPSI. Lorsqu'un oligosaccharide répétitif de type antigène O
peut être attaché en plus au niveau du cœur des r-LPS via un Kdo, ils sont alors noté s-LPS ou
LPS II.
133
Figure 2 : Schémas de différents lipides A. Deux formes sont présentés les lipides A de R. Etli ainsi que celui de Sm1021.
Le cœur est la partie la moins étudiée des LPS car elle est difficile à purifier et contient
de grandes quantités de sucres acides. Elle est en générale constitué d’une dizaine de sucres
(Figure 3). Ces études structurales au niveau du cœur sont basées sur des analyses HPLC et
des réactions aux anticorps polyclonaux, qui semblent indiquer qu’il existe un motif commun
entre les différentes souches de Sinorhizobia et R. leguminosarum, bien que de légères
modifications ne soient pas exclues (Reuhs et al., 1995).
L'antigène O est la partie la plus variable des LPS, si l'on compare les différentes
familles de Rhizobia. Il est constitué par une unité répétitive qui forme un polymère de taille
Proximal Distal
134
variable mais assez bien définie. La structure entière des LPS a pu être donnée pour les
souches Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli (Bhat et al., 1994; Carlson et al., 1989), R.
trifolii ANU843 (Carlson et al., 1988), R. etli (Forsberg et al., 1998), Bradirhizobium
japonicum 61A101c et B. elkanii (Carlson et al., 1992), S. fredii USDA, S. meliloti AK631 et
NRGx, et enfin pour S. sp. NGR 234 (Reuhs et al., 1998 et 2005).
Figure 3 : Schéma du lipide A associé à l'oligosaccharide de cœur chez R. leguminosarum (Forsberg et al., 1998).
Les LPS de la souche Sm1021 n'ont été à ce jour que partiellement étudiés, bien qu'il
s'agisse de la souche modèle de l'étude de la symbiose fixatrice d'azote et que son génome ait
été totalement séquencé (Galibert et al., 2001). Comme nous avons pu le voir dans les
chapitres précédents, sa surface possède certaines particularités. La première est que les
polysaccharides de surface sont quasi exclusivement de faible masse molaire et ancrés dans la
membrane (LPS et KPS).Ainsi, elle ne biosynthétise presque que des LPS de type r (composé
du lipide A et de l'oligosaccharide de cœur). La seule structure à avoir été bien étudiée est
celle du lipide A (Kanipe et al., 2003, Ferguson et al., 2005) (Figure 2).
135
Concernant la biosynthèse des LPS, Sharypova et ses collaborateurs, en 2003, ont mis
en évidence un parallèle entre R. leguminosarum et Sm1021. L'étude de séquences présentes
sur le chromosome de Sm1021 a montré la conservation de 7 gènes communs à tous les Gram
négatif. Ceux-ci sont impliqués dans la biosynthèse du squelette du lipide A (lpxABCDK, fabZ
et kdt) (Kannenberg et al., 1998; Raetz et al., 1990 et Capela et al., 2001).
Le gène acpXL fut préalablement identifié dans l'espèce R. leguminosarum (Basu et
al., 2002). Des tests in vitro ont démontré que cette protéine était capable de catalyser
l'insertion d'un acide gras à très longue chaîne sur un précurseur du lipide A (Brozek et al.,
1996). Un groupe de gènes contenant un homologue de acpXL a été mis en évidence chez
Sm1021, l'identité des protéines produites étant de 95% entre les deux souches. L. Sharypova
et ses collaborateurs ont pu démontrer que la délétion de ce gène produit la disparition de
l'acide gras en C28 de l'extrait brut (Sharypova et al., 2003). De plus, l'analyse du groupe des
5 gènes successifs de acpXL dans Sm1021 a montré une homologie avec le groupe de gènes
contenant acpXL dans R. leguminosarum (Figure 4). Le dernier gène de ce groupe appelé
lpxXL chez R. leguminosarum possède une bonne homologie à la fois avec msbB de S.
meliloti, mais aussi de E. coli. Les quatre gènes situés entre acpXL et msbB montrent des
similitudes avec les enzymes de E. coli responsables de la biosynthèse des acides gras. Le fait
que les gènes acpXL-msbB chez S. meliloti et acpXL-lpxXL chez R. leguminosarum soient
ainsi conservés, entraîne que toutes les protéines codées par ce groupe de gènes sont
vraisemblablement impliquées dans la biosynthèse, le transport et l'insertion dans les lipides
A des acide gras en C28 et C30.
Figure 4 : Comparaison des groupes de gènes acpXL-msbB de S. meliloti et acpXL-lpxXL de R. leguminosarum. Les
pourcentages entre les deux groupes de gènes correspondent à l'identité dans la séquence des acides aminés dans les protéines
prédites.
136
La structure des lipides A de la souche du mutant acpXL a été étudiée: les lipides A
biosynthétisés ne contiennent plus aucun acide gras en C28. Toutefois, Il a été déterminé que
la protéine permettant la liaison alcoxy-acyle n'ayant pas à sa disposition d'acides gras en à
longue chaîne remplace celui-ci par un acide gras en C18:1 ou C16:0 (Ferguson et al., 2005).
Des travaux quant à la capacité de ce mutant à entrer en symbiose ont été entrepris. Le mutant
Sm1021 acpXL (AcpXL) est capable d'établir la symbiose de façon retardée mais normale
tout comme le mutant acpXL de R. Leg. Ainsi la présence d'un acide gras à très longue chaîne
ne semble pas nécessaire à la mise en place du processus infectieux.
L'activité des seuls lipides A a été étudiée plus en détails : Urbanik-Sypniewska et ses
collaborateurs ont déterminé que les lipides A de R. leguminosarum et de Sm1021 possèdent
la même activité endotoxique sur des cellules animales, c'est-à-dire qu'ils sont capables
d'induire des réactions immunitaires, et que leur toxicité est comparable à celle des
entérobactéries dans le système étudié (la souris traitée à la galactosamine) (Urbanik-
Sypniewska et al., 1989). Le rôle de ces LPS dans la symbiose fixatrice d'azote semble
pourtant être totalement différent. Scheidle et ses collaborateurs ont voulu la comprendre le
rôle du lipide A dans le processus d'infection (Scheidle et al., 2005). Pour cela, des cellules
végétales stimulées pour produire une réaction de défense (choc oxydant) sont mises en
contact avec des LPS entiers provenant soit du mutant AcpXL, soit de Sm1021. Les LPS des
deux souches sont capables d'inhiber la mise en place des défenses de la plante. La même
étude a alors été mené avec leurs lipides A respectifs. Pour s'assurer de la part qui revient au
cœur et aux lipides A, un mutant déléte dans la biosynthèse du cœur a été étudié lpsB
(Campbell et al., 2002). Ces études ont permis d'obtenir le même profil d'inhibition, quelque
soit la souche. Scheidle et al. en avaient conclu que les lipides A étaient capables de bloquer
les réactions de défense de la plante et ce, que l'acide gras à longue chaîne soit présent ou non.
En effet, AcpXL a donné des résultats identiques à Sm1021. Peut-être est-il intéressant de
noter à ce stade que les lipides A obtenus l’étaient sous forme de mélange avec l’ancre
lipidique des KPS et ceux pour les trois souches testées, l'ancre serait donc peut être à
l'origine de la répression des réactions de défense (cf. chapitre 1).
Si des études exhaustives ont été menées quant aux rôles et à la structure des lipides A
dans le processus infectieux, fort peu de choses paraissent concernant le cœur. Pour étudier le
137
rôle du cœur, une délétion sur le gène lpsB (responsable de la glycosylation du Kdo associé au
lipide A) a été réalisée (Campbell et al., 2002). Les LPS ainsi obtenus à partir de la souche
Sm1021 lpsB sont modifiés sur l'oligosaccharide de cœur. Le phénotype résultant de la
mutation est la formation des cordons d'infections normaux (attestant de la conservation des
EPS) mais les nodules sont peu développés et les bactéries non viables. Cette mutation induit
une plus grande sensibilité de la bactérie aux antibiotiques de nature peptidique. Campbell et
ses collaborateurs en ont déduit que le cœur serait impliqué dans l'inhibition des défenses de
la plante lors de l'entrée dans le cordon d'infection. Toutefois, il est important de préciser que
les sucres acides du cœur assurent le pontage calcique entre les LPS qui est à l'origine de la
cohésion membranaire. Ainsi la mort des bactéries pourrait s'expliquer par l'absence de la
résistance des LPS face aux chocs osmotiques.
Il a été démontré que dans des conditions "symbiotiques" (induction NodD, SyrM par
des flavonoïdes) la souche S. sp. NGR234 était capable de produire des LPS de type "s"
tandis que, tout comme Sm1021, cette souche ne produit que des LPS de type "r" dans les
conditions de culture normale (Fraysse et al., 2002). Il semble donc que les LPS de haute
masse molaire jouent un rôle important dans la mise en place de la symbiose (Fraysse et al.,
2003). Par ailleurs, il est vraisemblable que l'oligosaccharide de cœur doit posséder une
structure adéquate pour être reconnue par l'enzyme qui transfère l'antigène O. Malgré l'intérêt
qu'il y a à connaître la relation rôle-structure de ce cœur, son étude structurale est aussi
difficile que celle de son rôle. Pour obtenir une structure, il est nécessaire d'avoir une fraction
de LPS très propre. Or, LPS et KPS possèdent chez Sm1021 des charges identiques, une
balance hydrophobe-hydrophile équivalente et une taille proche. Il en va de même pour
certain glycanes (cf. chapitre 2). Les r-LPS sont donc très difficiles à purifier. C'est dans ce
contexte difficile que nous tenterons de déterminer la structure de l'oligosaccharide de cœur.
138
139
RESULTATS
1 Détermination de la masse molaire du cœur
Ne disposant pas de fraction correspondant au cœur des r-LPS, nous avons déterminé
sa masse de façon indirecte; pour cela nous avons mesuré la masse molaire des lipides A issus
de la souche Sm1021. Puis nous avons déterminé celle des LPS bien plus délicate à mesurer
en raison de la complexité du mélange. De la différence entre les deux valeurs, nous avons pu
déterminer la masse molaire du cœur. Ce sous-chapitre vous présente les différents résultats
obtenus.
1.1 Masse et structure du lipide A
1.1.1 Sm1021
La masse molaire du lipide A a été réalisées, à la fois sur la souche sauvage, mais aussi
sur AcpXL. La fraction lipidique obtenue après l’hydrolyse douce de l’extrait brut contenant
les lipides A a été directement analysé en ESI-Q-ToF mode d’ionisation/détection négatif. Le
spectre obtenu a montré la présence de deux séries d’ions dichargés (les ions monoisotopiques
sont distants de 0.5 amu). Après calcul, nous obtenons les masses molaires suivantes :
2050.41, 2038.39/2036.3, 2022.41, 2010.39 pour la première série et pour la seconde 1950.41,
1938.39/1936.3, 1922.37, 1910.37 (Figure 5, Tableau 1). Ces deux massifs sont distants de
100 amu. D’après Ferguson et ses collaborateurs (2005), cette différence correspond à la
présence d’une substitution de l’hydroxyle du 27OHC28 par un méthoxybutyrate. Ceci a été
confirmé dans notre groupe au moyen d’études MS/MS (Rammouz et al., 2006).
Tableau 1 : Composition du lipide A en fonction de la masse observée.
masse Da composition
1910.37 2GlcN, (PO3H)2, (3OH C14)2, 3OH C16, 3OHC18, 27OH C28
1922.37 2GlcN, (PO3H)2, (3OH C14)2, 3OH C16, 3OHC19 :1, 27OH C28
1936.30 2GlcN, (PO3H)2, (3OH C14)2, 3OH C18, 3OHC18 :1, 27OH C28
1938.39 2GlcN, (PO3H)2, (3OH C14)2, 3OH C18, 3OHC18, 27OH C28
1950.41 2GlcN, (PO3H)2, (3OH C14)2, 3OH C18, 3OHC19 :1, 27OH C28
GlcN: glucosamine, PO3H: phosphate, 3OHCn: acide gras βhydroxylé à n carbone et 27OHC28: ϖ-1 acide octadecanoïque.
140
L'ionisation des polysaccharides étant très difficile à maîtriser surtout en présence de
sels, nous avons également fait les analyses en MALDI-ToF, en plaçant des résines
échangeuses de cations directement sur la cible. Dans le mode d’ionisation MALDI, tous les
composés identifiés présentent une perte partielle des phosphates (une différence de masse de
80 amu en est la signature) par exemple les ions m/z 1870.2, 1858.3/1856.2, 1842.2, 1830.2,
correspondent aux ions de m/z 1950.3, 1938.3/1936.3, 1922.3, 1910.3 respectivement mais
déphosphorylé. En ESI-Q-ToF, une telle perte ou absence n’est pas observable : il s’agit donc
d’un artefact de l'analyse en MALDI-ToF. Ce mode d'ionisation produit également une série
supplémentaire bien plus importante par rapport à celle déjà observée en ESI-Q-ToF. De
masse molaire de 1824.2, 1810.2, 1796.2 et 1724.2. Cette série montre une différence avec la
série du lipide A portant le méthoxybutyrate de 226 amu, correspondant à la perte d’un acide
gras en 3OH C14. Les dégradations du lipide A sont dues soient au MALDI soient à la résine
(pourtant indispensable à l'obtention d'un signal)
Figure 5 : Spectre ESI-Q-ToF du lipide A de Sm1021 A) nous observons trois séries correspondant à la perte d’un 3OHC14
(-113) et la substitution par un méthoxybutyrate (+50) B) agrandissement de la série contenant l’ion m/z 968 indiquant la
nature dichargée des ions.
A)
B)
- 113 (masse 226 amu)
+50 (masse 100 amu)
141
1.1.2 AcpXL
Le spectre du lipide A produit par AcpXL obtenu en ESI-Q-ToF montre toujours deux
distributions d'égale intensité. Contrairement à Sm1021, l'écart entre les deux distributions
n'est plus de 100 amu mais de 238 et 264 amu (pics majoritaires à 1301.8 et 1527.9). De plus,
les masses nominales des massifs ont été modifiées. Nous pouvons ainsi en déduire d'après la
différence de masse observée de 422 amu que les lipides A de AcpXL ne contiennent plus de
ω-1OH C28 (l’ion m/z 1527.8 chez AcpXL correspondant à l'ion m/z 1950.2 chez Sm1021).
La différence de 100 amu, présente dans les lipides A de Sm1021, a disparu pour la souche
AcpXL, ceci est normal puisque la substitution méthoxybutyrate était placée sur l'hydroxyle
de l'acide gras en C28. Deux nouvelles distributions sont apparues à plus 238 ou 264 amu,
correspondant à l’addition d'acide gras en C16:0 ou C18:1. Ainsi la mutation acpXL produit
des lipides A sur lesquels l'acide en position amide est substitué par un C16:0 ou un C18:1
Figure 6 : Spectre ESI-Q-ToF du lipide A de AcpXL.
1.1.3 LpxXL
Lors de l'étude de la structure des lipides A de la souche AcpXL, Ferguson et ses
collaborateurs ont aussi résolu la structure des lipides A de LpxXL chez R. leguminosarum.
Pour cette souche, la mutation lpxXL a produit des ancres dans lesquelles l'amide ne porte ni
142
le ω-1OH C28 et C30 ni aucun autre acide gras. En 2003, L. Sharypova et ses collaborateurs
ont identifié chez Sm1021 un groupe de gène possédant une bonne homologie avec lpxXL de
R. leguminosarum : msbB (Figure 4). Une collaboration avec INRA d’Auzeville (J. Batut, D.
Capela) nous a permis d'avoir accès à un mutant du gène Smc04270. Ce gène lorsqu'il est
muté induit par effet polaire la mutation du gène msbB. Pour confirmer à la fois l’effet polaire
et l’attribution de msbB, nous avons analysé les lipides A par ESI-MS (Figure7).
Figure 7 : Spectre de masse ESI-Q-ToF obtenu pour le en du lipide A de Sm1021 smc04270.
Sur le spectre obtenu à partir de la fraction lipidique de cette souche, nous pouvons
observer deux distributions (Figure 7). L'écart entre elles correspond à la perte de l'acide gras
3OHC14, écart que nous avions déjà observé chez Sm1021. Les masses nominales des deux
massifs correspondent à celles obtenues pour la souche AcpXL. Nous avons donc à nouveaux
des lipides A sans acides gras à très longue chaîne. Contrairement à AcpXL, aucun massif
entre 861 et 896 n’est observé, indiquant qu'aucun acide gras n'est en mesure de se substituer
au 27OHC28. Ainsi, la mutation sur msbB de Sm1021 induit les mêmes modifications que
celles observées pour lpxXL de R. leguminosarum. Ces deux souches, pourtant très éloignées
phylogénétiquement, ont donc une biosynthèse des lipides A étonnamment proches.
Un massif supplémentaire à [M-H]-+124 dont la nature n'a pu être déterminée a été
observée. Comme pour AcpXL, l'étude de la mise en place de la symbiose fixatrice d'azote
-113 (masse de 226 amu -3OHC14)
Séparation de 6 ou 7 amu comme dichargé la différence de masse est de 12 ou 14 amu
143
indique un phénotype retardé. La protection du OH en β de l'amide n'est donc pas à l'origine
de l'inhibition des défenses de la plante.
La masse et la composition du lipide A de ces souches sont connues et très différente. Cette
différence visualisée au niveau des lipides A, servira de point de comparaison afin d’identifier
les ions correspondants au niveau des LPS.
1.2 Masse molaire des LPS
L'analyse des LPS a été réalisée par deux systèmes de spectrométrie de masse
différents: un ESI-Q-ToF (Waters, Milford, MA, USA) et un MALDI-ToF (Brücker Daltonic,
Billerica, MA, USA).
Pour l'analyse en MALDI-ToF, nous déposons l'extrait brut sans aucun traitement
mais avec une résine de dessalage dans la matrice DHB. Le spectre obtenu montre dans les
hautes masses en plus de la distribution des lipopolyKdo, la présence d'une série de trois
massifs d'ions (Figure 8) : Le massif le plus intense contient les ions m/z [4075.3, 4061.3,
4047.3, 4033.3] (Figure 8A). Le second est distant du premier de 100 amu (ions m/z 3975.3,
3961.3, 3947.4, 3933.4). Enfin, le troisième massif (m/z 3749.1, 3735.1, 3721.1, 3707.1)
possède un écart de masse de 226.3 amu avec celle débutant à 3975. La distance entre chaque
membre au sein des massifs est de 12 ou 14 amu. Nous avons donc un profil en tout point
comparable à celui observé dans le cas du lipide A.
Ces massifs ne présentent aucune variabilité supplémentaire par rapport à celle
observée dans les lipides A, tels des écarts correspondants à des sucres. Nous devions donc
nous assurer qu’il s’agissait bien des LPS. Pour ce faire, une analyse identique a été réalisée
sur les LPS de AcpXL. Deux distributions majoritaires ont été observées avec des maxima à
m/z 3551 et 3815 respectivement, soit une différence est de 264 amu, tout comme il avait été
observé sur le lipide A. Le massif de la seconde distribution peut être séparé en deux séries
distantes de 26 amu. Ces deux séries présentant un écart de masse de 238 et 264 amu par
rapport à la première distribution et correspondent aux acyles gras en C16:0 et C18:1. Ainsi,
nous avons observé à nouveau des composés de plus haute masse molaire présentant une
variabilité exclusivement liée à celle des lipides A.
144
Dans les deux cas, nous observons donc bien des LPS. Contrairement aux glycanes
cycliques également présent dans l'échantillon en ESI-Q-ToF, nous n'avons observé aucune
variation correspondant à un hexose (162 amu), ou à d’autres sucres (146 amu ou 176 amu).
Puisque leurs masses ont des profils identiques à celles observées pour les lipides A, nous
pouvons en conclure que le cœur possède une composition unique bien définie. Toutefois,
nous avons observé précédemment que les lipides A étaient en partie déphosphorylée sur la
cible MALDI. En est-il de même avec les LPS ?
Figure 8 : Spectre de masse obtenu en MALDI-ToF a) spectre des LPS de la souche Sm1021, en encart agrandissement des
pics à m/z 4075 b) spectre des LPS de AcpXL, c) en ESI-MS-Q-ToF spectre des LPS de Sm1021 avec un agrandissement du
pic à m/z 1319.8 indiquant qu'il s'agit d'un ion trichargé.
Pour répondre à cette question, nous avons réalisé l'analyse des LPS en ESI-Q-ToF
afin de vérifier les masses obtenues précédemment (Figure 8B). Lors de l'analyse sans
traitement de l'extrait brut, les signaux des lipopolyKdo sont les seuls visibles. Leur présence
masque le signal des LPS. 1% d'acide acétique dégrade totalement les KPS mais sépare
également le cœur du lipide A. De ce fait, une hydrolyse plus douce à 0.5% d'acide acétique a
a)
10
%
1165.6
1191.7
1290.8
1286.7
1281.8
1319.8
1324.5
1328.8
1200 1300 1250 1350 1400 1150
m/z 0
1319.79 1320.13
1319.46 1320.46
1318 1319 1320 1321 1322
0
100
%
m/z
1295.8
m/z
m/z
3000 3500 4000
0
10
%
0
10
%
B
1353.1
a)
100
100
226
264
248
4075.263
4047.288
4061.277
4089.299
4033.265 14 14
14
a) LPS Sm1021 MALDI-ToF
b) LPS AcpXL MALDI-ToF
c) LPS Sm1021 ESI-Q-ToF
145
été réalisée. Grâce à cette hydrolyse, nous avons pu lyser les KPS en conservant néanmoins
un minimum de LPS. Les ions observés sur ce spectre sont multichargés (distance entre les
ions isotopiques de 0.33amu). Une déconvolution permet rapidement de déterminer la masse
des LPS. Les profils obtenus sont semblables à ceux des lipides A (différence de 100 amu liée
au méthoxybutyrate ainsi que de 226.4 amu correspondant à la perte d’un C14:3OH). Là
encore, aucune variation correspondant à un sucre n'a pu être observée. Mais dans ce cas les
masses observées en ESI-Q-ToF sont identiques à celle obtenues en ESI-Q-ToF. En effet,
l’ion m/z 1353 correspond à un ion monochargé de (1353x3+2) 4062 amu (ESI-Q-ToF) qui
est le membre précédent de l'ion marqué m/z 4075 en MALDI-ToF (moins 14 amu). Les LPS
observé en MALDI-ToF ont donc conservé leur intégrité (pas de déphosphorylation).
Le Tableau 2 représente un récapitulatif des différentes analyses, quels que soit le
mode d'ionisation et la souche étudiée. Ainsi, la comparaison de la masse des lipides A et des
LPS indiquent une masse pour le cœur de 2025 Da. L’oligosaccharide pris isolément aura
une masse de 2043 (2025 + 18amu). Une telle masse laisse peu de choix dans les
combinaisons possibles quant aux sucres. Deux Kdo sont toujours présents entre le cœur et
l'ancre. En pratique pour cette masse, une seule composition en sucre est plausible:
1 hexosamine, 2 hexoses, 5 acides uroniques, 3 Kdo
Comme il s'agit d'une différence de masse sur des spectres multichargés qui n'ont pas
été acquis en masse exacte, il n'est pas exclus qu'une erreur de 1 amu ait été effectué (25 ppm
d'erreur), dans ce cas le cœur peut être composé de :
3 hexoses, 5 acides uroniques, 3 Kdo
Tableau 2 : récapitulatif des différents ions majoritaires des LPS et du lipide A lui correspondant en fonction du mode
d’analyse.
Souche
Mode d’ionisation
Pic majoritaire des LPS masse en Da
Ion du lipide A correspondant en Da
4075.3 2050.3 MALDI 3975.3 1950.3
4061.3 2036.3
Sm1021 ESI 3961.5 1936.3
3815.9 1789.4 AcpXL
MALDI 3551.8 1525.8
146
2 Analyse structurale de l’oligosaccharide de cœur
2.1 Composition saccharidique
Pour déterminer la composition du cœur, nous avons utilisé le mutant Sm1021 rkpZ1.
Ce mutant en effet possède la particularité de ne pas produire de lipoKPS. Nous avons ainsi
pu limiter la quantité de Kdo liée aux KPS. Les échantillons oligossacharidiques analysés ont
été obtenus par hydrolyse douce soit de l'extrait brut soit de la fraction dite "LPS"
(purification sur une phase greffé de polymyxine B). Cette purification s’est, en effet, avérée
nécessaire pour éliminer les traces d'oligoKdo libre ainsi que les glycanes cycliques. Nous
avons ensuite effectué, sur ces fractions, une hydrolyse forte. Deux méthodes d'analyse ont été
utilisées pour déterminer la composition en sucres: la GC-MS et la HPAEC-PAD. Ces deux
méthodes sont complémentaires puisque l'ESI-MS permet une analyse structurale tandis que
la HPAEC permet de limiter la dégradation des sucres acides.
2.1.1 Analyse en GC-MS
L'analyse des sucres par GC-MS possède deux intérêts majeurs : une grande sensibilité
associée à une détermination structurale fiable. Celle-ci est rendue possible grâce aux spectres
signatures obtenus par impact électronique, comparés au spectromètre de masse et à une
banque de donnée exhaustive (NIST). Toutefois, cette méthode performante est dédiée aux
composés volatiles et nécessite donc une dérivation préalable. Or, les sucres acides sont très
sensibles à la température. Pour ces raisons, nous avons eu recours une dérivation peu
commune utilisant l'anhydride heptafluorobutyrique (HFBA) (Zanetta et al., 1999). Nous
avons déjà discuté, dans le chapitre 1, l’emploi de cette méthode et la nécessité d'une
méthanolyse préalable à la dérivation. Pour que cette solvolyse rompe les jonctions osidiques,
sans pour autant dégrader les acides uroniques, elle se déroule sur la nuit à 80°C. Au cours de
cette réaction, les hydroxyles anomériques sont méthylés et les acides estérifiés. La dérivation
HFBA possède l'intérêt de se faire à une température relativement basse (60°C) durant un laps
de temps court (30min), ce qui diminue la dégradation des sucres.
147
Aucun spectre de référence n'existant dans la banque de donnée, les différents
standards disponibles ont été injectés dans le GC au moyen d'un injecteur split/splitless. Ce
type d'injection limite la quantité d'acide heptafluorobutyrique résiduel présent dans
l'échantillon arrivant sur la colonne. Comme tous les réactifs d'acylation, le HFBA peut
détériorer la colonne qui est en silice greffée de silanes. L’injection de ces standards a permis
à la fois de réaliser une banque de spectre et de déterminer les temps de rétention, ainsi que
les facteurs de réponse, de chaque sucre par rapport au glucose (Tableau 3, Figure 9). Le
gradient utilisé pour le four est composé d’un isotherme à 70°C durant 3min, 5°C/min jusqu'à
100°C, 3°C/min jusqu'à 240°C, 5°C/min jusqu'à 300°C, suivi d’un isotherme à 300°C durant
10 min.
Tableau 3 : récapitulatif des temps de rétentions et des facteurs de réponse pour chaque sucre.
Sucre Temps de rétention min Facteur de réponse
Rhamnose 13.80 0.8
Mannose 19.23 0.7
Glucose 19.54
19.97
1
Galactose 18.74
20.51
0.9
Glucosamine 23.33
23.53
0.4
Galactosamine 23.15
23.67
0.5
Kdo 25.00
25.58
0.2
Acide Galacturonique 22.21
23.61
0.4
Acide Glucuronique 20.91
22.40
0.5
148
Figure 9 : Chromatogramme obtenu en GC-MS des dérivés HFBA des standards de sucres.
Une fois la banque de spectres réalisée, nous nous sommes intéressées à la présence
d'ions caractéristiques en fonction du type de sucre afin de faciliter l'interprétation des
spectres futurs. Nous avons observé les mêmes fragments spécifiques que ceux obtenus par
Zanetta et ses collaborateurs en 1999 (Tableau 4). L'impact électronique des composés
heptafluorobutyrylés implique la perte successive de un ou deux acides heptafluorobutyriques,
ainsi que la perte du OMe de l'anomère. Ces pertes vont induire en fonction du type de sucre
des ions caractéristiques. En plus, selon la nature du sucre, des pertes spécifiques peuvent se
produire telles que la perte de l'acide (-60 amu) pour les acides uroniques (Figure 10). Ainsi
des ions spécifiques se forment permettant une identification structurale (Tableau 4). Cela
implique aussi que selon la nature du sucre de type Kdx, les fragments spécifiques seront
différents en fonction des substitutions qu’ils portent (5,7NdiAcPsene donne pas les mêmes
ions que 5NAc-7NBuOHPse), permettant malgré leur masse élevée (au-delà du domaine de
masse de l'analyseur) d'en retrouver la structure.
149
Figure 10 : Spectre de masse obtenu en impact électronique du dérivé HFBA de l'acide glucuronique. En encart, les
fragments spécifiques des sucres acides.
Tableau 4 : Récapitulatif des masses molaires des dérivés HFBA de familles de sucres avec les fragments spécifiques de
chaque.
sucre masse molaire du sucre dérivé en Da
Fragments spécifiques m/z
pentose 752 479-325-265
désoxyhexose 766 492-279
hexose 978 519-337-277
hexosamine 977 472-276
acide uronique 810 537-323
Kdo 1054 377-293
Acide Glucuronique
m/e
150
Une fois que la fragmentation de chaque sucre a été identifiée ainsi que son temps de
rétention, nous avons injecté les échantillons et réalisé des appels d'ions spécifiques de chaque
famille (Figure 11). Nous avons ainsi obtenu la composition en sucres présenté dans le
Tableau 5.
Figure 11: Chromatogramme de l'extrait oligosaccharidique des LPS de Sm1021 rkpZ1.
Tableau 5: Quantités de chaque sucre obtenu en GC-MS pour le cœur de Sm1021 RkpZ1.
sucre Quantité en mole
Gal 50
Glc 100
GlcN 1
GalA 15
GlcA 8
Kdo 12
12.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.0034.0036.0038.00
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
750000
800000
850000
900000
950000
1000000
1050000
1100000
1150000
1200000
1250000
1300000
1350000
1400000
1450000
1500000
1550000
Time-->
21.00 21.50 22.00 22.50 23.00 23.50 24.00 24.50 25.00 25.50
TIC: 061214-01.D
GlcN GalA
GlcA Kdo
Glc
Gal
Gal
Glc
Man
min
Abondance
GalA
GlcA
151
Les résultats obtenus montrent une quantité aberrante de Glucose et de Galactose par
rapport aux sucres acides. Or, la souche rkpZ1 produit des glycanes en grande quantité. Ces
glycanes visualisés en mode négatif sont glycérophosphorylés comme il a été démontré dans
le chapitre 2 de ce travail. Or, leur phosphate en présence d'un cation divalent est capable de
lier les LPS. Ainsi, malgré la purification sur phase greffée par polymyxine B, nous avons
toujours une contamination par les glycanes cycliques. Cela n'explique pas pour autant la
quantité important de Galactose. Aucune analyse de la composition saccharidique des
glycanes n’a été réalisée pour estimer la quantité de galactose qui leur incombe, toutefois ils
ne sont peut-être pas la seule source possible de contamination. Une analyse de l’extrait brut
avant purification nous a donné une estimation de la composition en sucre de "la
contamination" quelle qu'elle soit. Ainsi nous avons quantifié 3 glucoses pour 1 galactose soit,
pour revenir aux valeurs du Tableau 4, la contamination compteraient, pour 100 glucoses: 33
galactoses. Ainsi sur les 55 galactoses quantifiés, 16 (55-33) pourraient être attribués aux
LPS. Ce qui au final donne une proportion identique de galactose et d’acide galacturonique.
La quantité de glucosamine quantifiée par cette méthode étant négligeable, nous ne
retiendront pas ici la première composition 1 hexosamine, 2 hexoses, 5 acides uroniques, 3
Kdo. En se basant sur la formule 3 Hex, 5 HexA, 3 Kdo. Ainsi aux 8+15=23 unités d'acide
uronique du Tableau 4 correspondraient à 5 sucres donc 2 acides glucuroniques pour 3 acides
galacturoniques. Par extrapolation les 16 unités de galactose représenteraient 2.6 c'est à dire 3
unités.
3 galactoses, 3 acides galacturoniques, 2 acides glucuroniques, 3 Kdo.
2.1.2 Analyse en HPAEC-PAD
Comme nous l’avons vu, l’analyse HPAEC ne nécessite pas de dérivation, et limite les
pertes matérielles au niveau des sucres acides. Il s’agit donc d’une technique complémentaire
à la GC-MS permettant d’affiner les résultats sur la composition saccharidique du cœur.
Toutefois, en raison de l'oxydation initiale de la position 6, la réponse des acides uroniques est
faible.
152
Les échantillons après hydrolyse forte ne contiennent plus que des monosaccharides.
Nous avons développé un programme permettant la meilleure séparation possible des sucres
en un temps minimum. L'augmentation de la concentration de NaOH 20 à 100 mM ce fait en
15 min, suivi d'un isocratique à 100 mM NaOH de 20 min. Durant les 15 dernières minutes, la
concentration en acétate de sodium augmente de 0 à 150 mM tandis que la concentration en
soude reste constante. Finalement, les deux éluants retournent aux conditions initiales en 10
min. Un délai de rééquilibrage de la colonne de 40 min est indispensable pour la
reproductibilité des chromatogrammes.
L’hydrolyse forte des oligosaccharides se fait avec du TFA, et non par méthanolyse
comme dans le cas de la GC-MS. Durant l'hydrolyse au TFA, l'oligosaccharide acide est
chauffé à 120°C. Une étude préliminaire a été nécessaire pour déterminer quel était le temps
minimum nécessaire pour hydrolyser totalement l'oligosaccharide sans dégrader les sucres
acides (lactonisation et polymérisation). Des tests sur des standards de sucres acides (acide
galacturonique et glucuronique) et sur des oligomaltoses ont été réalisés. Le résultat de ces
tests a montré que deux heures permettaient une hydrolyse totale des jonctions osidiques tout
en minimisant la dégradation des sucres acides. Le TFA doit être éliminé avant injection.
Nous avons injecté les standards de sucres en notre possession, et ainsi pu déterminer
leur temps de rétention (Figure 12). Sur le chromatogramme présenté, les sucres acides
injectés sont les plus courants parmi les polysaccharides. Le programme choisi permet d'avoir
une séparation entre les pics du GlcA et du GalA de 1 min. Il en est de même entre le NANA
et le Kdo. La résolution entre les pics est satisfaisante sachant que l'écart type déterminé sur le
temps de rétention est de 0.7 min. Pour les sucres neutres, la résolution entre deux isomères
n’est que de 0.7 mais le ∆tR n’y est que de 0.2 min. Nous avons ainsi mis au point un
programme permettant une bonne séparation à la fois pour les sucres acides et neutres.
153
Figure 12 : Chromatogramme obtenu par détection PAD des sucres les plus usuels : Rhamnose (Rha), Galactose (Gal),
Glucose (Glc), Mannose (Man), acide Neuraminique (NANA), Kdo, acide galacturonique (GalA) et acide glucuronique
(GlcA).
Pour donner les proportions relatives entre les oses dans les échantillons, il est
indispensable d'en connaître les facteurs de réponse par rapport à un standard existant dans
l’échantillon. Dans ce dessein, nous utiliserons comme référence le glucose. Ce sucre est
comme nous l’avons vu dans le paragraphe précédent, toujours présent dans les échantillons
en quantités non négligeables. Nous avons injecté à plusieurs reprises une concentration
équimolaire des standards monosaccharidiques les plus usuels avec du glucose. Les rapports
des aires obtenues en PAD sont présentés dans le Tableau 6.
Standards
Kdo
NA
NA
Gal
A
Glc
A
Glc
M
an
Gal
Rha
154
Tableau 6: Temps de rétention en min et les facteurs de réponse par rapport au glucose pour les principaux sucres.
Sucre Temps de rétention
min Facteur de réponse par
rapport au glucose Rhamnose 5.5± 0.3 0.3
Glucosamine 6.6± 0.5 1.9
Galactose 7.2± 0.5 0.6
Glucose 7.7± 0.5 1
Mannose 8.6± 0.5 0.5
NANA 29.9± 0.6 0.3
Kdo 30.3± 0.6 0.2
Acide galacturonique 33.5± 0.7 0.8
Acide glucuronique 34.7± 0.7 0.7
Comme nous l’avons vu dans le chapitre précédent, la purification de l’extrait brut par
la polymyxine B obtenu à partir d'un mutant ne produisant pas de lipopolyKdo a été
nécessaire. Le chromatogramme obtenu pour cet hydrolysât est présenté en Figure 13.
Figure 13 : Chromatogramme obtenu par détection PAD de l'hydrolysât du "cœur" des LPS de la souche Sm1021 rkpZ1.
155
Après avoir injecté les hydrolysats provenant d’extraits bruts de plusieurs cultures de
la souche Sm1021 rkpZ1. Voici la composition en sucres que nous avons obtenue par cette
méthode :
Tableau 7 : Résumé des sucres présents dans l'oligosaccharide de cœur avec la proportion de chacun.
Temps de rétention en min sucre quantité relative
7.18 Galactose 29
7.78 Glucose 100
8.46 Mannose 3
30.26 Kdo 23
33.3 Acide Galacturonique 19
34.37 Acide Glucuronique 13
Comme dans l'analyse précédente, la quantité de glucose est bien trop importante pour
appartenir au seul cœur. Nous supposons comme précédemment qu'il s'agit d'une
contamination par les glycanes glycérophosphorylés. Nous avons donc suivi la même
démarche en injectant l’échantillon avant purification. Dans ce cas nous mesurons pour 10
glucoses, 1 galactose. Ainsi, seuls 19 galactoses sur les 29 proviendraient du cœur. Nous
observons que le rapport sucres acides/Kdo est de 10/7. Or, les sucres acides sont au nombre
de 5 (d’après la masse déterminer par spectrométrie de masse), ce qui fixe le Kdo entre 3 et 4
unités. La quantité de mannose peut être considérée comme nulle. La proportion GalA/GlcA
est à nouveau de 3/2, nous pouvons donc en conclure que la composition en sucres acides est
de 2 acides glucuroniques pour 3 acides galacturoniques. À nouveau aucune quantité
significative de glucosamine n'a pu être détectée. Ce qui confirme les résultats obtenus par
GC-MS.
Les deux méthodes d'analyses nous donnent des résultats similaires sur la composition
en sucres:
3 Gal, 2GlcA, 3GalA, 3 Kdo
156
2.2 Analyse du mode de jonction : méthode de Hakomori
Une fois la composition saccharidique déterminée autant que faire se peut, nous avons
tenté de déterminer le mode de jonctions entre ces différents sucres. La position des liaisons
glycosidiques est analysée selon la méthode dite de Hakomori. Le principe de cette technique
consiste à méthyler les fonctions hydroxyles libres en milieu basique, puis à hydrolyser le
polysaccharide perméthylé afin de libérer les hydroxyles engagés dans des liaisons
glycosidiques (Figure 14). Après réduction des aldéhydes en alcool (transformation en
alditols), les hydroxyles libérés sont acétyles. L’analyse des acétates d'alditols partiellement
méthylés (PMAA) formés permet de déterminer les sites de liaison. Lorsque des acides
uroniques sont présents, leurs carboxyles sont réduits, puisque une étape de méthylation
préalable les transforme en esters. La technique de méthylation utilisée est une modification
de la méthode d'Hakomori (1964). Elle emploie comme base le carbanion du diméthylsulfinyl
de sodium, issu de l'action de l'hydrure de sodium (NaH) sur le diméthylsulfoxyde (DMSO) :
CH3SOCH3 + NaH → CH3SOCH2- Na+ + H2
Le polysaccharide est dissout dans le DMSO. La méthylation des hydroxyles est
réalisée par de l’iodure de méthyle. Les composés méthylés sont isolés et purifiés grâce à une
extraction en phase solide par chromatographie en phase inverse (Waeghe et al., 1983). Une
fois les oligosaccharides perméthylés purifiés, une hydrolyse forte à l’aide du TFA est
effectuée. Les carboxyles des sucres acides sont méthylés grâce au diazométhane. Les
aldéhydes des monosaccharides perméthylés et les esters sont alors réduit par du borohydrure
de sodium et les hydroxyles ainsi formés sont acétylés. Les composés sont alors analysés en
GC-MS. La fragmentation des PMAA en spectrométrie de masse est insensible aux
différences stéréochimiques. Mais la chromatographie en phase gazeuse permet souvent de
distinguer les dérivés par rapport à leurs temps de rétention relatifs. En revanche, la
fragmentation des PMAA est très caractéristique de la position des méthyles et acétyles. Le
spectre de masse issu de la fragmentation de chaque PMAA permet ainsi de déduire la
position des carbones engagés dans les liaisons glycosidiques (acétates) et celle de ceux qui
ne l’étaient pas (méthoxy) (Figure 14). Pour déterminer le mode d'enchaînement et le type de
sucres impliqués (Glc, Gal, GalA etc...), nous avons utilisé une base de données indiquant les
157
spectres de masse qui ont été enregistrés en fonction du mode de jonction et du sucre impliqué
(http://www.ccrc.uga.edu/specdb/ms/pmaa/pframe.html).
Figure 14 : Préparation des acétates d'alditols partiellement méthylés par la méthode de Hakomori modifiée et mode de
fragmentation des dérivés obtenus.
1,4,5,6-tétra-O-acéthy-2,3-di-O-méthyl-D-glucitol dérivée du
1→4GlcpA
1,5-di-O-acéthy-2,3,4,6-tétra-O-méthyl-D-glucitol
dérivée du Glcp terminal
158
Le chromatogramme obtenu par GC-MS lors de l'injection de l'échantillon biologique
ainsi traité est très complexe. Les contaminants inhérents à ce type de réactions chimiques
successives sont assez importants (Figure 15 A). Des appels d'ions ont donc été nécessaires
pour identifier les pics correspondant aux PMAA (Figure 15B). L’analyse révèle la présence
de 1,2,5-tri-O-acétyl-3,4,6-tri-O-méthyl-D-glucitol ainsi que de 1,3,5-tri-O-acétyl-2,4,6-tri-O-
méthyl-D-galactitol. Ce glucose initialement lié en 1-2 correspond très probablement aux
glycanes cycliques. En revanche, le fait que le galactose soit lié en 1-3 ne nous aide pas à en
comprendre l’origine (Tableau 8).
Figure 15 : A) TIC chromatogramme de l’oligosaccharide de cœur dérivé en PMAA. B) chromatogramme obtenu par appel
d’ion m/z 129. C) chromatogramme obtenu par appel d’ion m/z 117. En encart, le spectre obtenu pour le pic à tR 31,64min.
Tableau 8 : Identification en GC-MS des composés issus de l’hydrolyse de l'oligosaccharide de cœur après la procédure
d'Hakomori.
22.0024.0026.0028.0030.0032.0034.0036.0038.0040.0042.0044.0046.00
20.0022.0024.0026.0028.0030.0032.0034.0036.0038.0040.0042.0044.0046.000
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
22.0024.0026.0028.0030.0032.0034.0036.0038.0040.0042.0044.0046.00
117
129
161101
2338771
58173 203143 189 217
277
A) TIC
B) m/z 117
C ) m/z 129
159
temps de rétention
fragments primaires résidu substitué correspondant
% par rapport au pic le plus grand
26,5 131, 175, 189, 233 Rha 1,2 5
29,6 101, 117, 161 , 205 GlcT 4
29,7 101, 117, 161 , 205 ManT 3
30,08 101, 117, 161 , 205 GalT 3
31,38 129, 161 189 1,2Glc 100
31,64 117, 129, 161, 233 1,3Gal 10
31,76 113, 117, 129, 233 1,4Hex 5
32,21 117, 161, 189, 233 1,6Glc 2
33,35 129, 161, 261 1,2,3Hex 3
33,96 117, 161, 261 1,4,6Hex 2
34,03 129, 189, 233 1,2,6Hex 4
Le Tableau 8 donne le rapport entre les aires des pics des différents sucres. Notons que
certains PMAA génèrent un ion très intense tel le 129, et d’autres, une série de fragments.
Ainsi, leurs réponses en spectrométrie de masse est très variable. Aucun facteur de réponse
n’a été déterminé ni par nous, ni par d’autres. La procédure étant très lourde, nous n'avons
réalisé aucun blanc sur des standards. C’est pourquoi ces valeurs sont à manipuler avec
précaution et nous n’en retirons que l’information qualitative. Le rhamnose et le mannose ne
faisant pas partie des sucres significatifs trouvés dans les analyses précédentes, nous
supposons qu’ils appartiennent à l'unité répétitive de l'antigène O du s-LPS, faiblement
présent sur gel d'acrylamide mais qui auraient un facteur de réponse favorable.
Notre protocole de dérivation conduit par ailleurs à interpréter les sucres acides
comme étant des sucres substitués en position 6. Ainsi, dans l'analyse menée, nous avons 3
formes possibles pour les acides uroniques: en position terminale, ou liés en 1-4, voire en 1-2
donc impliqué dans la chaîne. L’hexose substitué en 1,2,6 pouvant aussi correspondre à l'unité
glucose portant le glycérophosphate dans les glycanes cycliques. La grande quantité de sucres
terminaux indique néanmoins que le cœur des LPS a une structure ramifiée. Cette
160
ramification se fait soit grâce à un Kdo soit à un hexose lié trois fois (en l’occurrence en
1,2,3).
En se basant sur la composition en sucre (3 hexoses, 5 acides uroniques et 3 Kdo), sur
les modes de jonctions caractérisés et sur les rares structures déjà publiées, nous proposons
une structure de type (Figure 16) :
Figure 16 : Structure hypothétique de l'oligosaccharide de cœur.
Hex
HexA
Kdo
Kdo
HexA HexA
HexA
HexA
Hex
Hex
Antigène O
Lipides A
Kdo
161
2.3 Analyse du cœur entier par HPAEC-PAD
Les contaminations rendant la détermination du mode de jonctions des sucres difficiles
et le mode de jonction ne nous informant pas sur l’ordre respectif des sucres, nous avons
essayé de purifier l’oligosaccharide de cœur en vue de déterminer sa séquence par ESI-
MS/MS. Pour cela, nous avons utilisé la HPAEC sur laquelle une colonne de type CarboPAc
PA100 a été installée.
En effet, une publication existe déjà dans laquelle cette même colonne était capable de
séparer des decamères portant 5 charges dues aux acides uroniques ou ulosoniques, en
utilisant un éluant composé de 200 mM d’acétate de sodium et 100 mM de soude (Goodarz et
al., 1998). Des tests sur des standards de sucre ont tout d’abord été réalisés. Il n’existe pas de
décasaccharide acide commercial. Seul l’acide colaminique purifié à partir de bactéries est
accessible. Il ne possède pas de taille définie et une hydrolyse même douce le dégraderait
totalement puisqu’il s’agit d’un polymère d’acide sialique. Nous avons donc utilisé des
dextranes commerciaux, donnés comme ayant une masse moyenne à 700 et à 5900 Da
respectivement (DP4 et DP36). Afin de définir si le temps d’analyse était raisonnable pour
permettre la purification des cœurs des LPS (masse de 2044 Da), le programme publié a été
testé avec ces standards. Les résultats ont montré que le dextrane de plus haute masse molaire
a pu être élué dans un temps de rétention inférieur à 40 min (Figure 17). Nous avons donc
supposé que malgré l’augmentation drastique de la charge (8 charges négatives), la force
élutrice serait néanmoins suffisante pour que le cœur soit décroché de la colonne.
162
Figure 17 : Chromatogrammes obtenus par HPAEC-PAD d'un mélange 1:1 (en haut) et 1:10 (en bas) de dextranes à une
masse moyenne de 700 et 5900 Da.
L’injection après hydrolyse douce de l’oligosaccharide de cœur a alors été effectuée.
Le chromatogramme obtenu présente une grande quantité de composés élués en début du
gradient. Néanmoins plus rien n'est élué dans le domaine attendu (>15 min) (Figure 13). Ce
résultat nous indique que l’oligosaccharide de cœur a été soit totalement retenu par la colonne,
soit que celui-ci est constitué d’un cœur externe et interne (comme proposé), et que lors de
l’hydrolyse douce, nous avons lysé la liaison au Kdo interne générant ainsi plusieurs entités.
Nous ne sommes dès lors plus en face d'un decamère, mais de deux oligomères de plus petite
taille. Nous avons alors augmenté la concentration en acétate de sodium jusqu'à 500 mM, sans
rien éluer de plus, laissant supposer que le cœur est bien constitué de deux entités plus petites.
163
Figure 18 : Chromatogramme obtenu par HPAEC-PAD sur colonne CarboPac PA100 de l’oligosaccharide de cœur.
164
165
BILAN
L’analyse de la structure des LPS de Sm1021 n’est pas chose facile. En effet, pour
cette souche les gels de polyacrylamide révèlent la présence très majoritaire des r-LPS par
rapport au s-LPS. Or, dans leur domaine de taille, sont aussi présents les KPS et les glycanes
cycliques. Les KPS sont composés d’un polymère de Kdo rattaché à une ancre lipidique et les
glycanes cycliques portent un glycérophosphate. Ceci leur donne des propriétés physico-
chimiques analogues aux LPS. À ce jour, il n’existe pas de système permettant leur
purification. C’est dans ce contexte délicat que nous avons entrepris de déterminer la structure
de l’oligosaccharide de cœur des LPS de Sm1021. Pour cela nous avons tout d’abord été en
mesure de définir la masse précise de l'oligosaccharide de cœur. Ceci a été possible grâce à la
comparaison des masses molaires des LPS dans leur intégralité avec celles des lipides A
correspondants. Nous avons ainsi pu définir la nature des sucres qui composent le cœur : 3
hexoses, 5 acides uroniques et 3 Kdo, seules combinaisons qui donnent une masse de 2045
Da. Les lipides A sont toujours séparés du cœur par deux Kdo liés en β2-7. Ainsi il reste
encore un Kdo pouvant faire partie de l’enchaînement oligosaccharidique, ou se trouver à
l'extérieur du cœur, afin de permettre la liaison avec l'antigène O (figure 19).
Figure 19 : Site de lyse lors de l’hydrolyse douce.
Antigène O
Cœur saccharidique
Lipide A
Lyse en position 2 des Kdo
Lyse en position 2 des Kdo
Kdo
166
Pour simplifier l’analyse des sucres nous avons utilisé une souche ne produisant pas de
lipoKPS : Sm1021 rkpZ1. Ainsi une purification sur une phase greffée de polymyxine B
devait permettre par lavage d’éliminer les glycanes cycliques et les restes d'oligoKdo.
Malheureusement les analyses de la composition saccharidique nous ont révèle la présence de
glucose 1-2 correspondant vraisemblablement à des glycanes glycérophosphorylé. Nous
n’avons donc pas pu déterminer de composition pertinente concernant les hexoses malgré
l’utilisation de deux méthodes distinctes. La composition est donc toujours entachée d’une
incertitude mais serait
3 Gal, 2GlcA, 3GalA, 3 Kdo
Nous avons ensuite réalisé la détermination du mode de jonction des sucres. Là encore
le 1-2 Glc présentait des quantités anormales, proches de celles obtenues lors de la
détermination de la composition saccharidique. L’analyse du mode de jonctions des autres
sucres montre la prépondérance des sucres terminaux indiquant que l’oligosaccharide du cœur
doit être fortement ramifié. Une ramification pourrait être liée à la présence du troisième Kdo
ou encore à un hexose substitué en position 2 et 3.
La purification du cœur par la HPAEC en vue de réaliser un couplage avec l’ESI-Q-
ToF afin de déterminer le mode d’enchaînement des sucres n’a hélas pas donné les résultats
escomptés. Ainsi, malgré les différentes analyses nous ne somme donc pas en mesure à ce
jour de donner une structure précise de l’oligosaccharide de cœur même si des avancées
significatives ont été faites.
167
III Conclusions et perspectives
168
169
Les polysaccharides de surface des Rhizobia jouent un rôle fondamental dans la mise
en place de la symbiose fixatrice d’azote. Celle-ci représente un véritable enjeu dans le cadre
d'une agriculture raisonnée, qui saurait être une réponse face aux pratiques intensives
actuelles. La compréhension des mécanismes d’action, en relation avec la structure des
polysaccharides de surface des Rhizobia, permettrait de mieux appréhender et maîtriser les
processus d'infections qui sont à la base de cette symbiose. Le fait de mieux comprendre les
différents processus clés peut permettre de mieux intégrer la symbiose légumineuse-Rhizobia
dans les cycles de culture afin de tendre vers un développement durable.
Au cours ce travail, nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux
polysaccharides de surface de Sinorhizobium meliloti 1021 qui a été choisi comme bactérie
modèle dans la symbiose fixatrice d'azote. C'est pourquoi son génome a été totalement
séquencé (Galibert et al., 2001). Pourtant, cette souche possède, du point de vue biochimique,
plusieurs particularités y compris au sein de ses polysaccharides de surface. Les KPS des
Rhizobia possèdent en général une taille allant de 7 à 12 kDa. Or, les KPS de Sm1021
(caractérisés par Fraysse et al. en 2005) ont une taille plus faible (4-6 kDa) et ne sont
composés que de Kdo. Ce polymère de Kdo est rattaché à une ancre lipidique. Cette dernière
particularité a été présentée comme une singularité de cette souche. Pour mieux comprendre
le rôle de ces composés, nous avons étudié certains mutants de Sm1021. Par un jeu de
complémentation/délétion nous avons pu avancer dans la compréhension de la biosynthèse et
de la relation structure/activité des KPS.
Dans un premier temps nous avons analysé et caractérisé les nouveaux KPS de haute
masse molaire produits par Sm1021 suite à l'insertion du plasmide. De cette étude, plusieurs
points importants ont été retenus. Nous avons tout d'abord pu démontrer par plusieurs
techniques (GC-MS, et la RMN) que les KPS produits sont semblables à ceux de la souche
"sauvage" Sm1021. C'est à dire qu'il agit d'un polymère de Kdo lié en β2-7 et rattaché à une
ancre lipidique et ce, quelle qu'en soit la taille. Ensuite, grâce aux mutations des gènes rkpZ1,
rkpA et aux complémentations avec pMW23 et pLS, nous avons pu comprendre la
biosynthèse de ces KPS et constater qu'à nouveau (et ce bien que leurs structures soient
différentes) les KPS de grande taille peuvent se substituer aux succinoglycanes. En effet, les
EPS jouent un rôle majeur dans les processus d'infection surtout les succinoglycanes, une
170
mutation exoY empêche leur biosynthèse, ce qui induit un phénotype Fix- (pas d'infection).
Or, la complémentation avec le plasmide pMW23 permet de restaurer le phénotype Fix+.
L’ancre des KPS n'avait à ce jour pas pu être caractérisée étant donnée la difficulté
inhérente à sa purification. La souche Sm1021 pMW23 en produisant de grandes quantités de
KPS portant une ancre, nous a permis d'envisager une détermination structurale. Nous avons
démontré que l'ancre était un glycérophospholipide contenant un azote. Mais contrairement à
un phosphoglycéride normal, la partie aliphatique est rattachée du coté du phosphate et non au
glycérol. De plus, l’azote est constitutif de la partie aliphatique et non dans la tête polaire. La
masse exacte nous permet de déterminer que l'ancre possède comme formule chimique :
C33H70NO7P. La partie aliphatique demeure non élucidée.
Des études complémentaires pour déterminer la structure complète de cette ancre sont
donc nécessaires. Pour cela, il faudrait réussir à obtenir une quantité importante de cette ancre
purifiée, pour pouvoir l'étudier sans ambiguïté par RMN. Or, jusqu’à ce jour, l’obtention d’un
composé propre n’a pas été possible. Pourtant le mutant Sm1021 pMW23, en produisant des
KPS de haute masse molaire, a apporté des perspectives encourageantes. Les KPS présents
dans les hautes masses sont exempts de tout autre polysaccharide, ainsi une chromatographie
d’exclusion stérique permet d’accéder à des KPS purifiés et donc à leur ancre. Toutefois il est
important de préciser que pour une masse moyenne de 25 kDa l’ancre ne représente que 2.5%
en masse des KPS. Ainsi, un grand nombre de chromatographies sur un grand volume de
culture devront être réalisées pour obtenir une quantité suffisante d'ancre afin d'en réaliser
l'étude par RMN de type 2DJ résolue.
Comme nous avons pu le montrer dans le cas de l'analyse des KPS de Sm1021, les
KPS sont toujours présents en mélange avec les LPS et les glycanes cycliques. La purification
de ces différentes entités est peu aisée. Pour déterminer la composition des polysaccharides
présents dans ce mélange complexe, en utilisant un minimum d'échantillon, nous avons mis
au point dans notre laboratoire un couplage HPAEC-PAD/ESI-Q-ToF. La mise en place de ce
couplage est un défi technique. En effet, la HPAEC nécessite un éluant aqueux contenant des
sels conducteurs et corrosifs, pour la séparation des mono- et oligosaccharides. Cet éluant
n'est donc pas compatible avec l'ESI-MS. Nous avons réussi, grâce à un dessalage efficace, à
obtenir à une bonne sensibilité en spectrométrie de masse pour les oligosaccharides ainsi
171
séparés, permettant la détermination des sucres neutres et acides. Nous avons aussi adapté la
méthode à un mélange complexe d’oligosaccharide provenant de l'hydrolyse douce des
extraits bruts bactériens. Nous avons, à partir du mélange complexe de départ, pu caractériser
les oligo- et disaccharides formant les unités répétitives des KPS. Nous avons ainsi pu
démontrer la présence dans tous les Sinorhizobia des oligomères de Kdo, et également montré
l'ubiquité des glycanes glycérophosphorylés. La présence de ces oligoKdo nous a amené à
déterminer si, comme Reuhs et al. le supposaient en 1998, le précurseur du KPS des souches
Sinorhizobia est un oligKdo portant une ancre lipidique. Pour cela, nous avons étudié les
lipides obtenus par hydrolyse douce de divers Sinorhizobia. L’ancre caractérisée pour la
souche Sm1021 était présente parmi toutes les souches étudiées. Ainsi, ce qui était considéré
comme une singularité de Sm1021 est un trait commun de tous les Sinorhizobia à savoir
l'existence d'un lipo-homopolyKdo. Le fait que cette structure n'ait été à ce jour observée que
dans la souche Sm1021 n’est dû qu'à l'incapacité de cette souche à synthétiser des entités de
grande taille.
Malgré le grand nombre de données obtenues grâce à la HPAEC-PAD-MS, nous
n’avons pas pu mettre en évidence le disaccharide formant le KPS de la souche S sp.NGR234.
Toutefois, nous avons pu confirmer les structures publiées auparavant, de façon plus ou moins
rigoureuses pour les quatre souches Sm1021, Sm41, SfHH103 et SspNGR234.
En plus de ces études sur les KPS, nous avons voulu avancer dans l'analyse structurale
des LPS de Sm1021. Pour ce faire, nous avons utilisé la méthode HPAEC-PAD-MS que nous
avons mise au point. Les oligosaccharides correspondant aux LPS n'ont pu être identifiés et ce
quelle que soit la souche. L'absence de ces oligosaccharides issus du cœur ou de l'antigène O
est peut-être due à une trop forte interaction de tels édifices avec la phase. Toutefois, une
augmentation de la concentration en acétate au niveau de l'éluant n'est pas possible dans le
cadre d'un tel couplage puisque l'efficacité du dessaleur n'est plus suffisante au-delà d'une
concentration de 250 mM NaOAc et 100mM de NaOH. Pour résoudre ce problème un
changement de colonne s'impose. Pour effectuer cette analyse, il faudrait travailler avec une
CarboPac PA100 qui permet de séparer des oligosaccharides plus gros (jusqu'à 5900Da) avec
100mM de NaOH et un gradient allant jusqu'à 200mM en NaOAc. De plus, cette phase est
compatible à 100% avec les solvants organiques standards, permettant d'ajouter un peu
172
d'acétonitrile propice à obtenir une nébulisation plus stable qu'avec de l'eau seule, le dessaleur
pouvant tolérer jusqu'à 50% d'acétonitrile dans l'éluant.
Des tests sur la capacité de la colonne à séparer des oligosaccharides plus gros avec ou
sans solvant organique sont tout juste entamés et devront être menés à bien. Une fois les
conditions expérimentales optimisées, l'efficacité du dessalage, dans les nouvelles conditions,
devra être testée, en vue de réaliser le couplage HPAEC-PAD avec ESI-Q-ToF MS. Cette
méthode d'analyse permettra de déterminer la masse des oligomères, mais aussi (en
appliquant une énergie de collision plus grande) de déterminer l'ordre dans l'enchaînement des
sucres du cœur ou de l'antigène O.
Nous avons néanmoins tenté d'en savoir plus sur les LPS par les méthodes plus
classiques. Ainsi en étudiant des lipides A de deux mutants acpXL et smc04270, nous avons
confirmé que le gène msbB de S. meliloti 1021 produisait une protéine ayant la même activité
enzymatique que LpxXL de R. leguminosarum, c'est-à-dire que cette protéine est responsable
de la fixation d'un acide gras spécifiquement sur le βOH de l'acide gras lié à l'amine de la
glucosamine distale. Par ailleurs, de la différence de masse obtenue par les LPS et les lipides
A des souches Sm1021 et AcpXL, nous avons déterminé la composition de l'oligosaccharide
de cœur: 3 hexoses, 5 acides uroniques et 3 Kdo. Les analyses en GC-MS et HPAEC-PAD
ont toutes les deux donné des proportions identiques pour chaque sucre soit : 3 galactoses
pour 2 acides glucuroniques et 3 acides galacturoniques. L'analyse du mode de jonction selon
Hakomori nous a permis de déduire que le cœur était fortement ramifié (présence de
nombreux sucres terminaux). Aucune étude sur les facteurs de réponse n'ayant été réalisée, les
résultats obtenus au niveau des acétates d'alditols partiellement méthylés, ne sont que
qualitatifs. Le principal problème rencontré au cours de ces analyses provient d'une
contamination par les glycanes cycliques glycérophosphorylés qui rend les interprétations
difficiles. Un protocole alternatif pour la détermination du mode de jonction des sucres acides
utilisant le triéthylborodeutéride de lithium ("Superdeuteride") est envisageable. Le
"Superdeuteride" réduit les groupements carboxyliques des acides uroniques estérifiés lors de
la méthylation (York et al., 1985). Une autre méthode peut aussi être réalisée : la dégradation
des acides uroniques par le lithium dans l'éthylène diamine qui les élimine en laissant intacts
les liaisons entre les sucres neutres (Smith et al., 1967). Par cette méthode, des informations
sur les enchaînements des sucres neutres seraient accessibles. Toutefois, avant de réaliser ces
173
différentes analyses, il faut absolument réussir à éliminer les glycanes cycliques
glycérophosphorylés. Le fait qu’ils ne soient pas élués dans la solution de lavage de la
polymyxine B pourrait être expliqué par le fait que des ions divalents forment des ponts entre
les glycanes et les LPS. Une méthode très simple permettrait alors d'éviter ces ponts: l'ajout
d'EDTA dans la solution de dépôt, qui chélaterait les ions divalents. Ainsi seuls les LPS
seraient retenus par la colonne. Une purification de l'extrait brut du mutant Sm1021 rkpZ1,
par cette technique, permettrait d'obtenir un LPS exempt à la fois de lipoKdo (mutation
rkpZ1) mais aussi de glycanes cycliques (EDTA). De plus le fait d'employer le mutant rkpZ1
en l'absence de la mutation exoY devrait empêcher la surproduction dommageable pour nous
des glycanes. Une analyse RMN ou par HPAEC-PAD-ESI-Q-ToF, sur la CarboPac PA100,
nous permettrait de déterminer l'ordre de liaisons des sucres. Nous aurions ainsi la structure
complète du cœur.
174
175
IV Matériels et Méthodes.
176
177
1 Cultures bactériennes
Les souches bactériennes AK631, Sm1021 et les mutants de Sm1021 utilisés dans le
chapitre 1, nous ont été fournies par le L. Sharypova de l’université de Bielefeld (Allemagne),
et par J. Batut et J. Dénarié de l’INRA d'Auzeville pour les souches Fredii HH103 et Sm1021
smc04270. Les colonies sélectionnées sur boîte de Pétri servent à ensemencer un 100 mL de
milieu de YEM (Yeast Extract Mannitol). Dans le levain ainsi obtenu sont ajoutés les
antibiotiques nécessaires à la sélection. Les plasmides pMW23, pPHU115 et pLS portent un
gène de résistance à la tétracycline (80 µg /mL). Sm1021 est une bactérie résistante à
Streptomycine (600 µg/mL), de plus, Sm1201 rkpZ1 et Sm1021 rkpZ2 sont résistants à la
kanamycine (50 µg /mL). Le milieu est mis sous agitation à 28°C durant 24 heures jusqu’à
obtention d’une densité optique de DO620= 1.
Pour simuler l’environnement dans lequel s’établit la symbiose fixatrice d’azote, une
culture sur milieu VINCENT (Tableau 2), qui est un milieu pauvre en azote et carbone, est
préparé. Pour cela, dans un erlen de 500 µL, des solutions A, B, C, D sont ajoutées. Le
volume est ajusté à 1litre. Les erlens sont mis à l’autoclave pour la stérilisation. Dans chaque
erlen sont rajoutés, à travers un filtre stérile (Tableau 3) : 10 mL glutamate de sodium à 100
g/L, 10 mL succinate de sodium à 200 g/L, 1 mL biotine à 500 µg/mL, 1 mL cocktail de
Murashige et Skoog. 10 mL du levain préparé dans le milieu de YEM sont alors ajoutés. Les
erlenmeyers sont mis à incuber sous agitation à 28°C et 120 tr/min. La culture est stoppée
quand la DO est comprise entre 0.9 et 1.1 en y ajoutant une pointe de spatule d’azide de
sodium. Pour les mutants, la durée moyenne d’incubation est de 48 heures
Tableau 1 : composition du milieu de YEM pH 6.8-7.0
178
Tableau 2 : Composition milieu VINCENT solutions autoclavables
Tableau 3 : milieu de Vincent solutions a ajoutés après autoclavage
2 Test de Gram
Pour vérifier que la culture est pure, une coloration Gram est réalisée (Tableau 4), qui
va permettre de visualiser les bactéries au microscope optique. Sm1021 étant un bacille Gram
négatif, des bâtonnets roses doivent être observées. La coloration se fait au moyen du KIT
Sigma-Aldrich Fluka 77730.
179
Tableau 4 : Protocole de la coloration Gram et composition du kit
3 Purification des Polysaccharides
3.1 Extraction au phénol à chaud
Pour éliminer la partie hydrophobe et réaliser la lyse des cellules, une extraction au
phénol à chaud est effectuée. Pour cela, le milieu de culture est centrifugé à 9000 tour par min
(tr/min) à 5°C durant 30 min, le culot est repris dans de l'eau ultra pure pour laver les
bactéries et éliminer une partie des glycanes cycliques. Ce culot ainsi obtenu contient les
bactéries. Le culot est repris dans 50 mL d’eau ultra pure et placé dans un ballon de 250 mL.
Puis il est chauffé sous agitation à 65°C. 40 g de phénol sont pesés et mis dans un bécher
chauffé. 1 mL d'eau y est ajouté. Quand tout le phénol s'est liquéfié, il est versé dans le ballon.
Au bout de 20 min, l’extraction est stoppée brutalement en plongeant le ballon dans un bain
de glace (Carlson et al. 1979). Le mélange est alors centrifugé à 5000 tr/min à 5°C durant 45
min. La phase aqueuse est prélevée et mise à dialyser sous agitation dans de l’eau ultrapure à
10% d’éthanol. La dialyse est réalisée à travers une membrane de 12 kDa MWCO. Le bain de
dialyse est changé 2 fois par jours jusqu’à disparition de l’odeur de phénol. Cette phase
aqueuse est alors traitée par des Rnase, Dnase, et protéinase K pour obtenir l’extrait brut.
180
3.2 Digestion enzymatique
3.2.1 RNase, DNase, Protéinase K
Un traitement enzymatique permettra de dégrader le matériel génétique et protéique
contenu dans les bactéries. Des solutions de ribonucléase (RNase), désoxyribonucléase
(DNase), et Protéinase K sont préparés à raison de 3.5 g/L. Par ailleurs, un tampon biologique
est élaboré avec 3 mg de TRIS (trishydroxyméthylaminométhane) et 40 mL d’eau ultrapure,
dont le pH est ajusté à 7 grâce à de la soude (NaOH) 1M et/ou d’acide chlorhydrique (HCl) à
2M. Le volume est complété à 50 mL avec de l'eau. À 10 mL de la phase aqueuse sont
ajoutés 400 µl de RNase, 400 µl de DNase, 60 mg de sulfate de magnésium (40 mM au final)
et 5 mL de tampon biologique. Le mélange est placé à 5°C durant 24 heures. Ensuite, 400 µl
de Protéinase K sont ajoutés au mélange oligosaccharidique qui est chauffé à 37°C dans un
bain-marie pendant 5 heures. Pour éliminer les molécules issues des différentes digestions,
une dialyse est effectuée. Nous obtenons ainsi l’extrait brut.
3.2.2 Phospholipases
Le traitement, avec les phospholipases, est réalisé dans le but de déterminer le mode
de jonction de la partie aliphatique avec le squelette phosphoglycérol en coupant les fonctions
esters et/ou phosphoesters, elles libèrent la partie lipidique des KPS de l'oligosaccharide. Pour
cela trois enzymes ont été utilisées: Phospholipases A2 (du venin d'abeille), C (de Clostridium
perfringens, type I), et D (de Streptomyces chromofuscus), les phospholipases sont
ressuspendues dans une solution de Tris-HCl à 50 mM, pH 8.0, aux concentrations de 1 U/µl,
0.2 U/µl, and 5 U/µl, respectivement. L'extrait brut (10 mg) est incubé avec 20 unités de
phospholipase, à 30°C pendant 1 h puis 37°C durant 16 h. Le même protocole est réalisé sur
un extrait brut mais sans enzyme dans le mélange réactionnel (Tzeng et al., 2005). Une fois la
digestion enzymatique finie, le mélange réactionnel est extrait avec du chloroforme. La phase
organique est séchée et analysée en ESI-Q-ToF.
181
4 Purifications des KPS et des LPS
4.1 Par chromatographie d’exclusion stérique (S300)
Dans le cas des mutants portant le plasmide pMW23, les KPS et les LPS possédant
tous la même balance hydrophobe-hydrophile et la même charge seront séparés en fonction de
leur taille par chromatographie d'exclusion stérique. La phase utilisée est de type Sephacryl
300, (dispositif Pharmacia), les dimensions de la colonne (2,6x93 cm pour un volume de
phase de 500 mL avec un volume mort de 70 mL) à un débit de 0.8 mL/min. L’éluant utilisé
est décrit dans le Tableau 5.
Tableau 5 : Composition de la solution éluante
250 mL d’éluant sont utilisés pour conditionner la colonne. Une solution de 20 mg
d’extrait brut dissous dans la solution de dépôt (qui contient en plus des sels déjà présents
dans la solution d’élution, de l’EDTA à une concentration de 292 mg/L) est déposée sur la
phase. Après le dépôt, on laisse le volume mort éluer. Des fractions de 2.5 mL sont alors
collectées. Le suivi chromatographique est effectué par gel DOC-PAGE. Pour cela, toutes les
10 fractions (et ensuite toutes les 2 pour affiner), 50µL d’éluant sont prélevés, séchés et repris
dans 20µL de tampon de chargement. 5µL d’échantillon sont alors déposés sur un gel
d’acrylamide DOC-PAGE (cf. 5.1). Les fractions chromatographiées sont alors regroupées en
quatre échantillons selon leur taille (les KPS de haute, moyenne et basse masse molaire et
celle dite LPS). Pour éliminer le DOC et le TRIS, les échantillons sont mis à dialyser dans un
bain contenant du carbonate d’ammonium à 1% et 10% d'éthanol. Les bains sont changés
Produit Concentration
NaCl 0.2 M
TRIS = tris - hydroxylméthyl aminométhane 10 mM
DOC = acide déoxycolique 0.5 g/L
182
matin et soir durant une semaine. Le dernier bain n’est composé que d'eau. Les dialysats sont
enfin évaporés et lyophilisés.
4.2 Par chromatographie d’affinité (polymyxine B)
Dans le cas des souches Sm1021 et Sm1021 rkpZ1, les LPS et glycanes cycliques se
trouve en mélange. Ces deux polysaccharides possèdent une masse proche mais une balance
hydrophobe hydrophile différente. Pour les purifier, nous utilisons une phase composée de
polymyxine B pour les séparer. La polymyxine B est un peptide possédant une affinité pour
les LPS. 10 mg de saccharides sont déposés sur une colonne de 1.5 cm x 10 cm contenant 10
mL de phase. La colonne est alors mise en circulation fermée sur la nuit dans un tampon
contenant 4% de carbonate d’ammonium. Cette phase permet aux LPS de s’adsorber sur la
phase d’affinité. La colonne est ensuite ouverte et éluée avec 150 mL de tampon à 4% de
carbonate d’ammonium avec un débit de 1 mL/min. Les LPS sont ensuite décrochés grâce à
une solution de carbonate d’ammonium 4% avec 0.5% de DOC. Les 150 mL d’éluant ainsi
obtenus sont mis à dialyser pour éliminer les sels (les mêmes conditions que précédemment).
Une lyophilisation termine la procédure.
5 Caractérisations
5.1 Gel DOC-PAGE
Avant de procéder aux techniques chromatographiques pour purifier les r-LPS et les
KPS, les extraits bruts ou fractionnés ainsi produits sont analysés sur un gel d’électrophorèse
afin de vérifier le profil saccharidique des différentes souches.
Le DOC étant un dénaturant anionique, c’est grâce à une différence de taille que les
polysaccharides vont se déplacer à des vitesses différentes sur un gel PAGE soumis à un
courant électrique. Le gel est constitué de deux parties : un gel de concentration et un gel de
séparation en fonction de la masse molaire. Plusieurs solutions doivent être préparées qui
serviront à fabriquer les gels mais aussi les tampons de chargement et de migration (Tableau
5).
183
Préparation des gels :
La solution de gel de séparation est coulée entre les deux lames de verre jusqu’à
environ trois centimètres du haut. Quelques gouttes d’eau ultrapure saturée en butanol sont
ajoutées pour aplanir la surface du gel. Une fois la polymérisation terminée, l’eau est éliminée
en l’absorbant avec du papier filtre. Ensuite, la solution de gel de concentration est déposée
jusqu’au bord supérieur du verre et un peigne y est plongé de manière qu’il n’y ait pas de
bulle d’air. Une fois la polymérisation finie, le peigne est enlevé puis le gel et les plaques sont
placés dans la cuve d’électrophorèse. Les tampons de migration sont placés dans les
compartiments prévus et un pré-run de 15 minutes avec un courant de 15 mA par gel est
appliqué. Les échantillons sont dissous dans le tampon de chargement à 1 mg/mL pour les
extraits bruts, 0.1 mg/mL pour les polysaccharides purifiés. 5µL de ces solutions sont
déposées sur les pistes du gel. La migration est alors lancée en appliquant un courant de 15
mA/gel. Nous arrêtons lorsque le bleu de bromophénol atteint environ 1cm du bas du gel.
Tableau 5 : Solutions utilisées pour l’analyse des oligosaccharides par gel DOC-PAGE
Solutions stock
Composition
A 30% d’acrylamide, 0.8% de bisacrylamide (mélange commercial) B 22.7g de TRIS, 75 mL d’eau ultrapure, ajuster le pH à 8.8 par HCl 1M
amener à 100 mL C DOC à 0.25%, une pastille de soude (DOC difficilement soluble dans l’eau)
D 7.7g TRIS, 75 mL d’eau ultrapure, ajuster le pH à 6.8 par HCl 1M amener à 100 mL
Tampons migration pour la cathode : 21.7 g/L de glycine, 4,5 g/L de TRIS, 2,5 g/L de DOC
pour l’anode : 24.28 g/L de TRIS chargement 4 mL de solution C, 5 mg de bleu de bromophénol, 2 mL de glycérol, 14 mL
eau ultrapure Gels séparation 6 mL de A, 2 mL de B, 2 mL de C, 18 µL de persulfate de sodium à 10%, 10
µL de TEMED concentration 340 µL de A, 500 µL de D, 1.6 mL d’eau ultrapure, 10 µL de persulfate de
sodium à 10%, 6.2 µL TEMED
184
Coloration des gels :
La coloration utilisée est une combinaison du bleu d’alcian et du nitrate d’argent :
Le gel est coloré durant la nuit avec 200 mL d’une solution à 0.005% de bleu d’alcian. Il est
ensuite lavé avec 100 mL d’eau ultrapure à 30% éthanol durant 10 min puis 100 mL d’eau
ultrapure pendant 5 min. C’en suit la sensibilisation avec 200 mL d’une solution de périodate
de sodium durant 5 min. Le gel est lavé avec 100 mL d’eau ultrapure durant 5min, le bain est
changé, et un lavage de 5 min est réalisé. Le gel est alors coloré au nitrate d’argent grâce à un
bain de 30 min dans 200 mL de la solution contenant le nitrate d’argent. La cuve est placée
dans le noir. Deux bains de lavage successifs sont réalisés avec 100 mL d’eau ultrapure. Une
révélation de la coloration au citrate de sodium et formaldéhyde est effectuée par un bain dans
100 mL de solution jusqu’à apparition des bandes. La coloration est stoppée par ajout d’une
solution de fixation 100 mL.
Tableau 6 : Solution utilisée pour la coloration au bleu d’alcian et au nitrate d’argent (Hitchcock et al., 1983) des Gels DOC-
PAGE
Coloration
Bleu d’alcian 0.005% bleu, 50% eau ultrapure, 45% EtOH, 5% CH3COOH
Périodate de sodium
0.3 g/L périodate (60 mg dans 200 mL d’eau)
Nitrate d’argent AgNO3 2 g/L (280 mg dans 140 mL d’eau), 1.5 mL NaOH 5M, puis NH4OH jusqu’à disparition du précipité
Citrate de sodium 100 mL d’eau ultrapure, 50 µL HCOOH, 50 µL citrate de sodium 10%
Solution de fixation
50% eau ultrapure, 45% EtOH, 5% CH3COOH
185
5.2 Analyse par spectrométrie de masse des polysaccharides
5.2.1 ESI-MS des extraits bruts et lipides A
Les analyses sont effectuées grâce à une source d’ionisation electrospray couplé à un
spectromètre en tandem quadripôle-temps de vol (ESI Q-ToF) sur un appareil de type Q-ToF
Ultima (Waters, Milford, MA, USA) en mode d’ionisation /détection le plus souvent négatif
mais le mode positif est aussi utilisé parfois.
Pour l’analyse des LPS et des extraits bruts, les échantillons sont dissous dans un
mélange 50:50:0.001 (v/v/v) de 2-propanol, eau, triéthylamine à une concentration de ~ 10
ng/µL avec un débit à 10 µL/min. Le voltage du capillaire de la source est de 3.0 kV et le gaz
de nébulisation est chauffé à 120 °C, le voltage de cône varie de 70 à 100 V, et celui du Rf
lens : 80 V, le profil MS [150(10%), 400(40%), 1000(40%) avec une rampe de 10%]. Lorsque
le spectre est complexe et composé d’ions multichargés la transformation en ions
monochargés est réalisée grâce au logiciel MaxEnt3.
Pour les lipides A, les échantillons sont dissous à une concentration de 50 ng/µL dans
un mélange CHCl3/MeOH/H2O (60:30:5) avec 5 mM de triéthylamine. Le voltage du
capillaire de la source est de 3.0 kV et le gaz de nébulisation est chauffé à 120 °C, le voltage
de cône varie de 70 à 100 V, et celui du Rf lens : 80 V, le profil MS [150(10%), 900(80%),
avec une rampe de 10%].
Pour les analyses en masse exacte, nous ajoutons dans le mélange d’infusion de
l’acide orthophosphorique qui servira de calibrant interne.
5.2.2 MALDI-ToF des extraits bruts et des lipides A
Les mesures en source d’ionisation/désorption assistées par laser (MALDI) à un temps
de vol (MALDI-ToF MS) sont réalisées sur un appareil de type Ultraflex (Brüker-Daltonics).
Les extraits bruts sont analysés en mode d’ionisation négatif. Un voltage d’accélération de 10
kV est appliqué. Les échantillons sont dissous dans une solution saturée d’acide gentisique
186
(DHB) pour obtenir une solution finale à 50 mg/mL. 1µL de cette solution est ensuite déposée
sur la cible et séchée à température ambiante.
5.3 Analyse des ancres lipidiques par TLC préparative
Des plaques de silice semi-préparatives (MERCK plaque sur de gel de silice 60 verre
sans indicateur fluorescent 20 cm x 20 cm d'une épaisseur de 0.25 mm) sont tout d’abord
éluées avec de l’acétonitrile, séchées et à nouveaux éluées avec un mélange
Chloroforme/méthanol/ammoniaque à 28% (50:25:5). La plaque est ensuite séchée et mise à
l’étuve sur la nuit. Le précipité obtenu après hydrolyse douce est repris dans le mélange
d’élution et déposé sur la plaque. La migration se fait durant deux heures avec un mélange
Chloroforme/méthanol/ammoniaque à 28% (50:25:5). Pour permettre au front d’élution
d’atteindre 1cm de la fin de la plaque.
5.3.1 Coloration à l’iode
Un cristal d’iode est déposé dans un récipient clos avec la plaque. Après quelques
secondes, les vapeurs d’iode colorent les composés en formant des taches brunes. Une fois la
plaque sortie du réceptacle, l’iode est rapidement éliminé par sublimation spontanée. Ainsi les
composés séparés ne sont pas dégradés.
5.3.2 Coloration à l’acide sulfurique
Une solution à 5% d’acide sulfurique dans de l’éthanol est préparée. Une bande
d’environ 2 cm est séparée de la plaque et le mélange est vaporisé. La bande est alors placée
sur une plaque chauffante à 100°C. Après quelques minutes, des taches brunes apparaissent.
Dans ce cas, il y a dégradation de l’échantillon.
5.3.3 Coloration à l’anthrone
Une solution à 5% d’acide sulfurique dans l’éthanol est préparée, ainsi qu’une solution
d’anthrone à 10% dans du chloroforme formant la solution B. La solution B est diluée par 10
avec la solution d’acide sulfurique. Le mélange est alors vaporisé sur une bande détachée de
la plaque. La plaque est chauffée et au bout de quelques minutes, les composés saccharidiques
sont colorés en vert (spécifique des sucres).
187
5.3.4 Coloration à la primuline
Une solution de primuline à 0.05% dans un mélange eau/acétone (20:80) est préparée.
Le mélange est vaporisé sur la plaque puis séché à l'air libre. Les taches dues aux composés
lipidiques sont observées sous lampe UV à 254nm (White et al., 1998)
5.3.5 Coloration à l'acide phosphomolybdique
Une solution à 5% d'acide phosphomolybdique dans 25% d'acide sulfurique et 75% de
méthanol est préparée. Le mélange est vaporisé sur un morceau de plaque. Après chauffage,
les composés phosphorylés apparaissent sous formes de taches bleu foncé sur un fond bleu.
5.3.6 Coloration à l'azure A
2 g d'azure A sont dissous dans 100 mL d'acide sulfurique à 1 mM. On vaporise le
mélange sur la plaque qui devient uniformément sombre. On lave immédiatement les plaques
dans un mélange d’acide sulfurique à 40 mM et d'éthanol (3:1). La solution et la plaque sont
agitées, en changeant le bain régulièrement, jusqu'à obtention de taches bleues sur fond bleu
clair apparaissant au bout de 1 heure. La plaque est alors enlevée de la solution de lavage.
5.3.7 Coloration de Dragendorff
Pour réaliser cette coloration, une solution commerciale du colorant de Dragendorff a
été utilisée. Les plaques sont vaporisées avec cette solution. Les composés portant un azote se
colorent en orange après quelques minutes.
5.3.8 Coloration à la ninhydrine
0.2 g de ninhydrine sont dissous dans 100 mL de butanol saturé en eau. On vaporise le
mélange sur la plaque de silice et on chauffe. Les composés portant une amine sont colorés en
violet.
5.3.9 Élution des composés adsorbés sur silice
Sur la plaque, des bandes de silice, correspondant à des temps de rétention défini, sont
prélevées. La silice est broyée pour former une poudre homogène. Cette poudre est alors
placée dans une mini colonne et élué avec 5 fois le volume mort par une solution 1:1
188
chloroforme/méthanol. L’éluant est alors séché. Les composés élués sont ensuite analysés en
ESI-Q-ToF dans les mêmes conditions que pour les lipides A.
6 Analyses structurales
6.1 Hydrolyse douce
Avant de pouvoir analyser la partie polysaccharidique, il est nécessaire de réaliser une
hydrolyse douce pour séparer la partie lipidique de l’oligosaccharide. Pour ce faire, 200µL
d’acide acétique à 1% sont ajoutés à 100 mg d’extrait brut. La solution est chauffée à 100°C
durant une heure. Les saccharides restent dissous et les lipides A. Le précipité obtenu par
centrifugation est lavé avec de l’eau puis avec du méthanol. La partie aqueuse contenant le
cœur est extraite trois fois avec du chloroforme pour éliminer les traces d’ancres lipidiques.
La phase aqueuse est alors lyophilisée.
Dans le cas de l’analyse en ESI-MS des LPS, l’hydrolyse douce est réalisée à 0.5%
d’acide acétique. Le mélange est alors lyophilisé.
6.2 Hydrolyse forte
Le type d’hydrolyse forte dépendra de l’analyse qui devra être réalisée sur les
monosaccharides. Pour l’analyse par HPAEC, l’oligosaccharide obtenu après hydrolyse douce
est dissous dans 200 µL de TFA à 2M et chauffé à 120°C durant 2 heures. Le mélange est
ensuite séché sous flux d’azote et repris dans de l’isopropanol. L’isopropanol est séché sous
flux d’azote. Les traces de TFA sont ainsi éliminées par coévaporation. Le protocole est
réalisé 3 fois.
Pour les analyses des dérivés HFBA, les oligosaccharides obtenus après hydrolyse
douce sont repris dans un mélange méthanol/acide chlorhydrique à 1M anhydre. Le mélange
est ensuite chauffé à 80°C sur la nuit. Les monosaccharides ainsi obtenus sont séchés et prêts
pour la dérivation
189
6.3 Analyse de l’ancre
6.3.1 Saponification
A 5 mg de la fraction lipidique obtenue après hydrolyse douce, sont ajoutés 200 µL
d’une solution de KOH dans l’eau à 5M. La solution est chauffée à 120°C durant 2heures. Le
mélange est refroidi à température ambiante. Ensuite la solution est neutralisée avec une
solution de HCl à 37%. La phase aqueuse est alors extraite au chloroforme. L’extraction est
renouvelée deux fois les fractions organique sont réunies et extraites avec de l’eau. Les acides
gras ainsi obtenus sont méthylés à l’aide de diazométhane. Les hydroxyles portés par les
acides gras sont silylés grâce à un mélange de 50 µL de HMDS, 20 µL de TMCS et 50 µL de
pyridine. Le mélange est vortéxé. Le mélange réactionnel est éliminé sous flux d’azote. Les
acides gras silylés et méthylés sont repris dans de l’hexane et injecté en GC-MS.
6.3.2 Acétylation
À 10 mg de la fraction lipidique, obtenue après hydrolyse douce, sont ajoutés 50µL
d’anhydride acétique et 50 µL de pyridine. Le mélange est chauffé durant 30 min à 120°C.
Le milieu est ensuite évaporé et analysé en ESI-Q-ToF dans les conditions appliquées pour
les lipides A.
6.4 Etude par HPAEC
L’analyse des hydrates de carbone s’effectue sur un système chromatographique de
type Dionex ICS 2500 (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA), composé d’une pompe
quaternaire à faible pression sans métal GS50, et d’un détecteur électrochimique ED50
raccordé soit à une cellule à ampérométrie pulsée (model ED40), soit à un conductimètre. Les
analytes sont injectées par une valve d’injection rotative sans métal de type RH9125
(Rheodyne, Cotati, CA), équipées d’une boucle de 5 µL. Deux colonnes sont utilisées : une
CarboPac PA1 (250 mm × 2 mm i.d.), avec une précolonne CarboPac PA1 (50 mm × 2 mm
i.d.) ou une CarboPAc PA100 (250 mm × 2 mm i.d.) avec une précolonne CarboPac PA100
190
(50 mm × 2 mm i.d.) (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA), dont les caractéristiques sont
données dans le Tableau 6.
La cellule à ampérométrie pulsée est équipée d’une électrode de travail en or d’un
diamètre de 1 mm et d’une électrode à pH Ag/AgCl qui correspond à l’électrode de référence.
Le cycle voltamétrique utilisé est : E1 = 0.1 V (tdel = 0.00–0.20 s, tdetection = 0.20–0.40 s), E2 =
−2.0 V (tred = 0.41–0.42 s), E3 = 0.6 V (tox = 0.43 s), E4 = −0.1 V (tred = 0.44–0.50 s).
Il est très important de minimiser la contamination des éluants par des carbonates, car
à pH ≥ 12, ils forment des anions divalents qui interagissent avec la colonne au travers de
liaisons très fortes empêchant les interactions avec les sucres Ceci occasionne une forte
diminution de la sélectivité de la colonne et une perte en résolution et efficacité. Avant de
réaliser les analyses, les solutions d’élution sont dégazées pendant 15 minutes à une pression
d’environ 40 kPa. Toutes les expériences sont réalisées à 23°C.
Tableau 6 : Caractéristique de la CarboPac PA1 et PA100
Caractéristique PA1 PA100
Application recommandée Analyse de composition en monosaccharide,
séparation d’homopolymère linéaire,
purification de sucres
Analyse et d’oligosaccharides
Composition de la phase Pellicule 10 µm polystyrène/divinylbenzène
greffé par des fonctions quaternaire d’ammonium,
latex de 580 micron
Pellicule 8,5 µm d’éthylvinylbenzène/divinylbenzène greffé par des fonctions
quaternaire d’ammonium, latex de 275 micron
Réticulation 2 % 25 % 5 % 6 %
Capacité d’échange d’anion 100 µeq pour 2* 250 mm 90 µeq pour 2 * 250 mm Débit recommandé 1 mL (2 mm) 1 mL (2 mm)
pH de travail 0-14 0-14 Compatibilité avec des
solvants organiques 2 % 2 %
Pression maximum supportée
4000 psi 4000 psi
191
6.4.1 HPAEC-PAD
Gradient de séparation des monosaccharides grâce à la CarboPac PA1
La séparation est optimisée en utilisant un gradient en deux étapes à un débit de 0.5
mL/min. Le gradient utilisé est le suivant : de 0 à 15 min, la concentration NaOH augmente de
20 à 100 mM, suivi d'un isocratique à 100 mM durant 5 min, de 20 à 35 min, la concentration
de NaOH reste constante tandis que celle de NaOAc augmente de 0 à 90 mM, le retour aux
conditions initiales se fait en 10 min. Un délai de 35 min entre deux injections est nécessaire
pour rééquilibrer la colonne.
Gradient de séparation des oligosaccharides grâce à la CarboPac PA100
Pour réaliser la séparation des oligosaccharides obtenus après hydrolyse douce, un
gradient est effectué, allant de 20 à 200 mM de NaOAc en 30 min, la concentration en NaOH
restant constante tout au long de l'analyse (concentration à 100 mM). Le retour aux conditions
initiales se fait en 10 min, et un temps de rééquilibrage de 20 min est nécessaire entre deux
injections.
6.4.2 HPAEC-PAD-MS
Toutes les analyses sont réalisées sur à la colonne CarboPac PA1.
Gradient de séparation des sucres neutres
La séparation des hexoses et des acides uroniques est effectuée en une seule analyse.
La séparation a été optimisée en utilisant un gradient en deux étapes à un débit de 0.3
mL/min: de 0 à 15 min, la concentration NaOH augmente de 10 à 50 mM, de 15 à 20 min, la
concentration augmente jusqu’à 80 mM NaOH, de 20 à 35 min, la concentration de NaOAc
augmente de 0 à 90 mM, le retour aux conditions initiales se fait en 10 min. Un délai de 35
min entre deux injections est nécessaire pour rééquilibrer la colonne.
192
Gradient rapide pour la séparation des sucres acides
Pour la séparation des seuls sucres acides, le gradient suivant a été utilisé à un débit de
0.3 mL/min: de 0 à 15 min, la concentration of NaOAc augmente de 0 à 90 mM et la
concentration of NaOH (80 mM) reste constante, de 15-20 min, la concentration de NaOAc
(90 mM) et NaOH (80 mM) sont constantes. Le retour aux conditions initiales se fait en 5
min. Un délai de 15min entre deux injections est nécessaire pour rééquilibrer la colonne.
Gradient des échantillons biologiques
La séparation des oligosaccharides d’origine biologique utilise le gradient suivant à un
débit 0.3 mL/min: en 0 à 15 min la concentration de NaOAc augmente de 0 à 108 mM et la
concentration de NaOH (80 mM) reste constante; 15 à 30 min la concentration de NaOAc
augmente de 108 à 180 mM et la concentration de NaOH diminue de 90 à 0 mM; la
concentration de NaOAc est constante à 180 mM durant 3 min ; les concentrations retournent
à leurs conditions initiales en 7 min. Un délai de 15 min de rééquilibrage est nécessaire entre
deux injections.
Pour le couplage HPAEC-PAD/ESI-Q-ToF MS la présence d’un dessaleur est
indispensable. Nous avons utilisé un dessaleur de type ASRS 4 mm (Dionex) avec un volume
mort de 40µL. Pour que le dessalage soit efficace une solution régénérante composée de
H2SO4 à 0.25% (93 mN) à un débit de 2 mL/min est employée. Le spectromètre ESI-Q-ToF-
MS utilisé est le même que précédemment. Le voltage appliqué au capillaire est de 3.0 kV, la
température du gaz de nébulisation est de 140 °C, le voltage du Cône est à 100V, celui du Rf
lens : 20V, le profil MS [m/z 150 (20%), m/z 900 (60%), rampe 20%]. L’énergie de collision
est de 10 V, elle augmente à 20 ou 40V pour les expériences MS/MS dans le mode
d’ionisation positif ou négatif respectivement.
6.5 Etude par GC-MS
Les analyses GC-MS sont réalisées sur un instrument 5973N (Hewlett Packard) en
mode d’impact électronique positif (énergie d’ionisation: 70 eV), l’injection est réalisée en
mode split T° 250°C avec un ratio de 25 : 1, Gaz vecteur : He, à un débit de 1.5 mL/min, le
débit reste constant tout au long de l'analyse. Le programme de température est : 70°C durant
3min, 5°C/min jusqu'à 100°C, 3°C/min jusqu'à 240°C, 5°C/min jusqu'à 300°C, suivi d’un
193
isotherme à 300°C durant 10 min. La colonne capillaire utilisée est de type HP5-MS (30m x
0.25 µm x 0.1µm), greffée méthyle avec 5% de diphényle. La ligne de transfert est à 280°C.
Le balayage de masse allant de 50 à 600 amu.
6.5.1 Dérivation par l’acide heptafluorobutyrique (Zanetta et al., 1999)
Les polysaccharides méthanolysés sont séchés et repris dans 50µL d’acétonitrile
anhydre auxquels nous ajoutons 25µL d’anhydride heptafluorobutyrique. Le mélange est
chauffé à 60°C durant 30min et évaporé sous flux d’azote. Il est ensuite repris dans de
l’acétonitrile anhydre qui servira à coévaporer l’HFBA restant (la procédure est répétée trois
fois). Enfin, de l’acétonitrile anhydre est ajoutée pour obtenir une concentration finale à 0.1
mg/mL prête à être injectée.
6.5.2 Méthylation/acétylation : méthode Hakomori
Pour obtenir le mode de liaison des monosaccharides entre eux, nous avons recours à
la réaction de perméthylation mise au point par Hakomori. Le principe de base est la
transformation des fonctions alcools en alcoolates par l’action d’une base forte, ici le
carbanion diméthylsulfinyle. Les alcoolates sont alors méthylés par l’iodure de méthane
(CH3I). Le carbanion diméthylsulfinyle est produit à partir du DMSO séché sur hydrure de
calcium. Le NaH est stocké à l’état solide en mélange avec 50% d’huile minérale. Il est
soumis à une extraction à raison de 2 g de mélange initial dans 50 mL d’hexane : la phase
organique est éliminée. La poudre de NaH est transférée dans 10 mL de DMSO anhydre puis
laissé sous agitation pendant 2 heures sous azote. Pour rester en atmosphère anhydre, la
solution de 10 mg d’oligosaccharides lyophilisés au préalable est dissoute dans 500 µl de
DMSO anhydre et placée dans un ballon sous azote. Au bout de 2 heures, une fois les sucres
dissous, 50 µl de la solution d’anion diméthylsulfure sont ajoutés. Après 2 h de réaction, un
test au triphénylméthane est effectué sur un échantillon du mélange réactionnel pour montrer
la présence du carbanion (coloration rouge). Si le test est négatif, 50 µl sont à nouveau ajoutés
et la réaction se prolonge 2 heures.
194
La méthylation des sucres est réalisée par trois ajouts successifs à 1 heure d’intervalle
de 100 µl de la solution d’iodure de méthyle, en alternance avec 100 µl du carbanion
diméthylsulfinyle à température ambiante. La dernière addition de CH3I est suivie de l’ajout
de 500 µl d’eau ultrapure pour stopper la réaction. Les sucres méthylés sont introduits dans
une Sep-Pack C18 (cartouche) qui a été auparavant conditionnée avec successivement de
l’acétonitrile et de l’eau ultrapure. Après dépôt, la cartouche est lavée avec de l’eau ultrapure.
L’élution se fait par une solution d’acétonitrile (10 mL). La phase organique est prélevée (qui
contient les sucres méthylés) et séchée.
Les sucres méthylés sont alors hydrolysés avec 2M de TFA à 120°C durant 2
heures. Le mélange est séché. Ensuite une méthylation des acides est réalisée par ajout de
500µL de diazométhane. L’échantillon est séché puis réduit. La réduction va permettre de
linéariser les sucres et donc de limiter les problèmes d’analyse liés aux multiples formes des
sucres (α ou β, pyranose ou furanose). Une solution de 10 mg/mL de tétraborate de sodium
(NaBH4), dans un mélange d’eau ultrapure/méthanol (1/1) est préparée. 200 µl de cette
solution sont ajoutées au cœur hydrolysé et la réaction se fait sur la nuit à 5°C. Ensuite le
NaBH4 en excès est neutralisé par ajout de quelques gouttes d’acide acétique glacial jusqu’à
ce qu’il n’y ait plus de dégagement gazeux. Le produit est lavé par un mélange acide
acétique/méthanol (1/9) et évaporé. Puis un lavage au méthanol suivi d’une évaporation sont
effectués jusqu’à disparition de l’odeur d’acide. Les produits réduits sont acétylés afin de les
rendre volatiles. À l’échantillon sec est ajouté 50 µl d’anhydride acétique et de pyridine. Le
tout est chauffé à 120°C pendant 20 min et évaporé à sec. L’échantillon est repris dans de
l’acétonitrile anhydre pour être prêt à injecter.
6.6 Etude par RMN
Les spectres RMN ont été acquis sur spectromètre Brüker (Fremont, CA, USA)
Avance 500-MHz équipé d’une cryosonde 5 mm CPTCI 1H-, la fréquence du carbone est de
125Hz et celle du proton à 500Hz. les acquisitions ont été réalisées à 20°C durant 20 heures.
Les KPS de haute taille obtenue par la S300 sont dissous dans du D2O (11.2 mg/mL) après
avoir réalisé trois cycles D2O-lyophilisation. Les échantillons sont ensuite introduits dans un
insert coaxial concentrique d'un diamètre de 5 mm et 18 cm de hauteur. Les déplacements
195
chimiques du carbone et des protons ont été obtenus grâce à une séquence HSQC (séquence
hsqcetgpsi). Pour déterminer le mode de liaison une expérience HMBC (séquence
hmbcgplpndqf) a été réalisée, cette analyse permet d’observer les corrélations carbone-proton
séparer par 2 ou trois liaisons.
196
197
V Bibliographies.
198
199
Angata T, Varki A. "Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: an evolutionary perspective." Chem Rev. 2002 ; 102 : 439. Bachtiar BM, Coloe PJ, Fry BN. "Knockout mutagenesis of the kpsE gene of Campylobacter
jejuni 81116 and its involvement in bacterium-host interactions." FEMS Immunol Med
Microbiol. 2007 ; 49 : 149. Bacon DJ, Szymanski CM, Burr DH, Silver RP, Alm RA, Guerry P. "A phase-variable capsule is involved in virulence of Campylobacter jejuni 81-176." Mol Microbiol. 2001 ; 40 : 769. Barbour MW, Dennis T, Hattermann R, Stacey GT ."Chemotaxis of Bradyrhizobium japonicum to Soybean Exudates." Appl Environ Microbiol. 1991; 57 (9) : 2635. Basu SS, Karbarz MJ, Raetz CR. "Expression cloning and characterization of the C28 acyltransferase of lipid A biosynthesis in Rhizobium leguminosarum". J Biol Chem. 2002 ; 277(32) : 28959. Bhat UR, Carlson RW, Busch M, Mayer H. "Distribution and phylogenetic significance of 27-hydroxy-octacosanoic acid in lipopolysaccharides from bacteria belonging to the alpha-2 subgroup of Proteobacteria." Int J Syst Bacteriol. 1991 ; 41(2) : 213. Bhat UR, Forsberg SL, Carlson RW. "Structure of lipid A component of Rhizobium leguminosarum bv. Phaseoli lipopolysaccharide." J. Biol. Chem. 1994 ; 269 : 14402. Blake JD, Richards GN. "Problems of lactonisation of uronic acid derivatives." Carbohydrate
Research 1968 ; 8 : 275. Becker A, Fraysse N, Sharypova L. "Recent advances in studies on structure and symbiosis-related function of rhizobial K-antigens and lipopolysaccharides." Mol Plant Microbe
Interact. 2005 ; 18(9) : 899. Bereman MS, Islam Williams T, Muddiman DC. " Carbohydrate Analysis by Desorption Electrospray Ionization Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry" Anal. Chem. 2007; 79 : 8812. Breedveld MG, Miller KJ. "Cyclic beta-glucans of members of the family Rhizobiaceae." Microbiol. Rev. 1994 ; 58 : 145. Bronner D, Sieberth V, Pazzani C, Smith A, Boulnois G, Roberts I S, Jann B and Jann K. "Synthesis of the K5 (group II) capsular polysaccharide in transport-deficient recombinant Escherichia coli." FEMS Microbiol. Lett. 1993 ; 113 : 279.
200
Broughton WJ, Jabbouri S, Perret X. “Keys to Symbiotic Harmony.” Journal of Bacteriology. 2000 ; 182(20) : 5641. Brozek KA, Carlson RW, Raetz CR. "A special acyl carrier protein for transferring long hydroxylated fatty acids to lipid A in Rhizobium." J. Biol. Chem. 1996 ; 271 : 32126. Bruggink C, Wuhrer M, Koeleman CA, Barreto V, Liu Y, Pohl C, Ingendoh A, Hokke CH, Deelder AM. "Oligosaccharide analysis by capillary-scale high-pH anion-exchange chromatography with on-line ion-trap mass spectrometry." J Chromatogr B Analyt Technol
Biomed Life Sci. 2005 a ; 829 : 136. Bruggink C, Maurer R, Herrmann H, Cavalli S, Hoefler F. "Analysis of carbohydrates by anion exchange chromatography and mass spectrometry." J Chromatogr A. 2005 b ; 1085 : 104. Burris RH. "Biological Nitrogen Fixation, 1924-1974". Plant Physiol. 1974 ; 54(4) : 443. Campbell GRO, Reuhs BL, Walker, GC. “Chronic intercellular infection of alfalfa nodules by Sinorhizobium meliloti requires correct lipopolysaccharide core.” Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 2002 ; 99: 3938. Canter Cremers HC, Batley M, Redmond JW, Eydems L, Breedveld MW, Zevehuizen LP, Pees E, Wijffelman CA, Lugtenberg BJ. "Rhizobium leguminosarum exoB mutants are deficient in the synthesis of UDP-glucose 4'-epimerase." J Biol Chem. 1990 ; 265(34) :21122. Capela D, Barloy-Hubler F, Gouzy J, Bothe G, Ampe F, Batut J, Boistard P, Becker A, Boutry M, Cadieu E, Dreano S, Gloux S, Godrie T, Goffeau A, Kahn D, Kiss E, Lelaure V, Masuy D, Pohl T, Portetelle D, Puhler A, Purnelle B, Ramsperger U, Renard C, Thebault P, Vandenbol M, Weidner S, Galibert F. "Analysis of the chromosome sequence of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti strain 1021." Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 ; 98(17) : 9877. Carlson RW, Hollingsworth RL, Dazzo FB. “A core oligosaccharide component from the lipopolysaccharide of Rhizobium trifolii ANU843.” Carbohydr. Res. 1988 ; 176 : 127. Carlson RW, Garci F, Noel D, Hollingsworth R. “The structures of the LPS core components from Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli and two of its symbiotic mutants, CE 109, and CE 309.” Carbohydr. Res. 1989 ; 195 : 101. Cataldi TR, Campa C, De Benedetto GE. "Carbohydrate analysis by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection: the potential is still growing." Fresenius J Anal Chem. 2000 ; 368(8) : 739. Corcoran AT, Annuk H, Moran AP. "The structure of the lipid anchor of Campylobacter jejuni polysaccharide." FEMS Microbiol Lett. 2006 ; 257(2) : 228. DeShazer D, Waag DM, Fritz DL, Woods DE. "Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant." Microb Pathog. 2001 ; 30(5) : 253.
201
Dionex Corporation. "Analysis of carbohydrates by high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection." Technical Note 20, Sunnyvale, California 1989. Dionex Corporation. "Optimal Settings for Pulsed Amperometric Detection of Carbohydrates Using the Dionex ED40 Electrochemical Detector." Technical Note 21, Sunnyvale, California 1998. Epple G, van der Drift KM, Thomas-Oates JE, Geiger O. "Characterization of a novel acyl carrier protein, RkpF, encoded by an operon involved in capsular polysaccharide biosynthesis in Sinorhizobium meliloti." J Bacteriol. 1998 ;180(18):4950. Escobar MA, Dandekar AM. "Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease." TRENDS.
Plant Science. 2003 ; 8(8) : 380. Fellay R, Rochepeau P, Relić B, and Broughton WJ. "Signals to and emanating from Rhizobium largely control symbiotic specificity", p. 199, in U. S. Singh, R. P. Singh, and K. Kohmoto (ed.), "Pathogenesis & host specificity in plant diseases: histopathological, biochemical, genetic and molecular bases, vol. 1. Prokaryotes". 1995 ; Pergamon/Elsevier Science Ltd., Oxford, United Kingdom. Ferguson GP, Datta A, Carlson RW, Walker GC. “Importance of unusually modified lipid A in Sinorhizobium stress resistance and legume symbiosis.” Mol. Microbiol. 2005 ; 56 : 68. Finan TM, Kunkel B, De Vos GF, Signer ER. "Second symbiotic megaplasmid in Rhizobium
meliloti carrying exopolysaccharide and thiamine synthesis genes." J Bacteriol. 1986 ; 167 : 66. Fraysse N, Lindner B, Kaczynski Z, Sharypova L, Holst O, Niehaus K, Poinsot V. "Sinorhizobium meliloti strain 1021 produces a low-molecular-mass capsular polysaccharide that is a homopolymer of 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid harboring a phospholipid anchor." Glycobiology. 2005 ; 15(1) : 101. Fraysse N, Couderc F, Poinsot V. "Surface polysaccharide involvement in establishing the rhizobium-legume symbiosis." Eur J Biochem. 2003 ; 270(7) : 1365. Fraysse N, Jabbouri S, Treilhou M, Couderc F, Poinsot V. "Symbiotic conditions induce structural modifications of Sinorhizobium sp. NGR234 surface polysaccharides." Glycobiology. 2002 Nov ; 12(11) : 741. Forsberg LS, Reuhs BL. "Structural characterization of the K antigens from Rhizobium fredii USDA257: evidence for a common structural motif, with strain-specific variation, in the capsular polysaccharides of Rhizobium spp." J Bacteriol. 1997 ; 179(17) : 5366. Forsberg LS, Carlson RW. "The structures of the lipopolysaccharides from Rhizobium etli strains CE358 and CE359 The complete structure of the core region of R. etli lipopolysaccharides." Biol. Chem. 1998 ; 273 : 2747.
202
Galibert F, Finan TM, Long SR, Puhler A, Abola P, Ampe F, Barloy-Hubler F, Barnett MJ, Becker A, Boistard P, Bothe G, Boutry M, Bowser L, Buhrmester J, Cadieu E, Capela D, Chain P, Cowie A, Davis RW, Dreano S, Federspiel NA, Fisher RF, Gloux S, Godrie T, Goffeau A, Golding B, Gouzy J, Gurjal M, Hernandez-Lucas I, Hong A, Huizar L, Hyman RW, Jones T, Kahn D, Kahn ML, Kalman S, Keating DH, Kiss E, Komp C, Lelaure V, Masuy D, Palm C, Peck MC, Pohl TM, Portetelle D, Purnelle B, Ramsperger U, Surzycki R, Thebault P, Vandenbol M, Vorholter FJ, Weidner S, Wells DH, Wong K, Yeh KC, Batut J. " The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti". Science 2001 ; 293 : 668. Gil-Serrano AM, Rodriguez-Carvajal MA, Tejero-Mateo P, Espartero JL, Menendez M, Corzo J, Ruiz-Sainz JE, BuendiA-Claveria AM. "Structural determination of a 5-acetamido-3,5,7,9-tetradeoxy-7-(3-hydroxybutyramido)-L-glycero-L-manno-nonulosonic acid containing homopolysaccharide isolated from Sinorhizobium fredii HH103". Biochem J. 1999 ; 342 : 527. Glucksmann MA, Reuber TL, Walker GC. "Genes needed for the modification, polymerization, export, and processing of succinoglycan by Rhizobium meliloti : a model for succinoglycan biosynthesis." J Bacteriol. 1993 ; 175 : 7045. Goodarz MT, Turner AG. "Reproducible and sensitive determination of charged oligosaccharides from haptoglobin by PNGase F digestion and HPAEC/PAD analysis: glycan composition varies with disease." Glycoconjugate Journal 1998 ; 15 : 469. Hakomori S. "A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfinyl carbanion in dimethylsulfoxide". J Biochem (Tokyo). 1964 ; 55 : 205. Harvey DJ. "Analysis of carbohydrates and glycoconjugates by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: An update covering the period 1999-2000." Mass Spectrom Rev. 2006 ; 25(4) : 595. Harvey DJ. " Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates." Mass Spectrom Rev. 1999 ; 18(6) : 349. Hitchcock PJ, Brown TM. "Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels." J. Bacteriol. 1983 ; 154 : 269-277. Kadrmas JL, Allaway D, Studholme RE, Sullivan JT, Ronson CW, Poole PS, Raetz CR. " Cloning and overexpression of glycosyltransferases that generate the lipopolysaccharide core of Rhizobium leguminosarum." J Biol Chem. 1998 ; 273(41) : 26432. Kanipes MI, Kalb SR, Cotter RJ, Hozbor DF, Lagares A, Raetz RH. "Relaxed sugar donor selectivity of a Sinorhizobium meliloti ortholog of the rhizobium leguminosarum mannosyl transferase LpcC”. J. Biol. Chem. 2003 ; 278 : 16365. Kanjilal-Kolar S, Basu SS, Kanipes MI, Guan Z, Garrett TA, Raetz CR. "Expression cloning of three Rhizobium leguminosarum lipopolysaccharide core galacturonosyltransferases." J
Biol Chem. 2006a ; 281(18) :12865.
203
Kanjilal-Kolar S, Raetz CR. "Dodecaprenyl phosphate-galacturonic acid as a donor substrate for lipopolysaccharide core glycosylation in Rhizobium leguminosarum." J Biol Chem. 2006b ; 281(18) : 12879. Kannenberg EL, Reuhs BL, Forsberg LSS, Carlson RW. "Lipopolysaccharides and K-antigens: their structures, biosynthesis, and functions". 1998 in : The Rhizobiaceae. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. Kereszt A, Kiss E, Reuhs BL, Carlson RW, Kondorosi A, Putnoky P. " Novel rkp gene clusters of Sinorhizobium meliloti involved in capsular polysaccharide production and invasion of the symbiotic nodule : the rkpK gene encodes a UDP-glucose dehydrogenase". J
Bacteriol. 1998 ; 180(20) : 5426. Kiss E, Reuhs BL, Kim JS, Kereszt A, Petrovics G, Putnoky P, Dusha I, Carlson RW, Kondorosi A. "The rkpGHI and -J genes are involved in capsular polysaccharide production by Rhizobium meliloti." J Bacteriol. 1997 ; 179(7) : 2132. Kiss E, Kereszt A, Barta F, Stephens S, Reuhs BL, Kondorosi A, Putnoky P. " The rkp-3 gene region of Sinorhizobium meliloti 41 contains strain-specific genes that determine K antigen structure." Mol Plant Microbe Interact. 2001 ; 14(12) : 1395. Kohlbrenner WE, Fesik SW. " Determination of the anomeric specificity of the Escherichia coli CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate cytidylyltransferase by 13C NMR spectroscopy." J. Biol. Chem. 1985 ; 260 : 14695. Kuo JS, Doelling VW, Graveline JF, McCoy DW. "Evidence for covalent attachment of phospholipid to the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type b." J Bacteriol. 1985 ; 163(2) : 769. Lagares A, Hozbor DF, Niehaus K, Otero AJ, Lorenzen J, Arnold W, Pühler A. " Genetic characterization of a Sinorhizobium meliloti chromosomal region in lipopolysaccharide biosynthesis." J Bacteriol. 2001 ; 183(4) : 1248. Lee YC. "High-performance anion-exchange chromatography for carbohydrate analysis." Anal Biochem. 1990 ; 189(2) : 151. Le Quéré AJ, Deakin WJ, Schmeisser C, Carlson RW, Streit WR, Broughton WJ, Forsberg LS. "Structural characterization of a K-antigen capsular polysaccharide essential for normal symbiotic infection in Rhizobium sp. NGR234: deletion of the rkpMNO locus prevents synthesis of 5,7-diacetamido-3,5,7,9-tetradeoxy-non-2-ulosonic acid." J Biol Chem. 2006 ; 281 : 28981. Lerouge I, Laeremans T, Verreth C, Vanderleyden J, Van Soom C, Tobin A, Carlson RW "Identification of an ATP-binding Cassette Transporter for Export of the O-antigen across the Inner Membrane in Rhizobium etli Based on the Genetic, Functional, and Structural Analysis of an lps Mutant Deficient in O-antigen " J. Biol. Chem. 2001 ; 276 (20) : 17190.
204
Lobry de Bruyn CA, van Ekenstein WA" Action des alcalis sur les sucres." Rec.Trav.Chim. 1895 ; 14 : 203. Maes E, Coddeville B, Kremer L, Guerardel Y. "Polysaccharide structural variability in mycobacteria: identification and characterization of phosphorylated mannan and arabinomannan." Glycoconj J. 2007 ; 24 : 439 Morelle W, Michalski JC. "Glycomics and mass spectrometry." Curr Pharm Des. 2005 ; 11(20) : 2615. Müller P, Keller M, Weng WM, Quandt J, Arnold W, Pühler A."Genetic analysis of the Rhizobium meliloti exoYFQ operon: ExoY is homologous to sugar transferases and ExoQ represents a transmembrane protein." Mol Plant Microbe Interact. 1993 ; 6(1) : 55. Neihardt FC, Ingraham JL, Schaechter M. “Physiology of the Bacterial Cell. A Molecular Approach.” Sinauer Associates, Sunderland 1990. Morona JK, Morona R, Paton JC. "Attachment of capsular polysaccharide to the cell wall of Streptococcus pneumoniae type 2 is required for invasive disease." Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 ; 103 : 8505. Niehaus K, Becker A. "The role of microbial surface polysaccharides in the Rhizobium-legume interaction." Subcell Biochem. 1998 ; 29 , 73. Parada M, Vinardell JM, Ollero FJ, Hidalgo A, Gutierrez R, Buendia-ClaveriaAM, Lei W, Margaret I, Lopez-Baena FJ, Gil-Serrano AM, Rodriguez-Carvajal MA,Moreno J, Ruiz-Sainz JE. "Sinorhizobium fredii HH103 mutants affected in capsular polysaccharide (KPS) are impaired for nodulation with soybean and Cajanus cajan." Mol Plant Microbe Interact. 2006 ; 19 : 43. Parkhill J, Sebaihia M, Preston A, Murphy LD, Thomson N, Harris DE, Holden MT, Churcher CM, Bentley SD, Mungall KL, Cerdeño-Tárraga AM, Temple L, James K, Harris B, Quail MA, Achtman M, Atkin R, Baker S, Basham D, Bason N, Cherevach I, Chillingworth T, Collins M, Cronin A, Davis P, Doggett J, Feltwell T, Goble A, Hamlin N, Hauser H, Holroyd S, Jagels K, Leather S, Moule S, Norberczak H, O'Neil S, Ormond D, Price C, Rabbinowitsch E, Rutter S, Sanders M, Saunders D, Seeger K, Sharp S, Simmonds M, Skelton J, Squares R, Squares S, Stevens K, Unwin L, Whitehead S, Barrell BG, Maskell DJ. "Comparative analysis of the genome sequences of Bordetella pertussis, Bordetella
parapertussis and Bordetella bronchiseptica." Nat Genet. 2003 ; 35(1) : 32. Petrovics G, Putnoky P, Reuhs B, Kim J, Thorp TA, Noel KD, Carlson RW, Kondorosi A. "The presence of a novel type of surface polysaccharide in Rhizobium meliloti requires a new fatty acid synthase-like gene cluster involved in symbiotic nodule development." Mol
Microbiol. 1993 ; 8(6) :1083. Price NP, Kelly TM, Raetz CR, Carlson RW. " Biosynthesis of a structurally novel lipid A in Rhizobium leguminosarum: identification and characterization of six metabolic steps leading from UDP-GlcNAc to 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid2-lipid IVA." J Bacteriol. 1994 ; 176(15) : 4646.
205
Pulfer M, Murphy RC."Electrospray mass spectrometry of phospholipids" Mass Spectrometry
Reviews 2003 ; 22 : 332. Putnoky P, Petrovics G, Kereszt A, Grosskopf E, Ha DT, Banfalvi Z, Kondorosi A. "Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide can have the same function in the plant-bacterium interaction." J. Bacteriol. 1990 ; 172 : 5450. Que NLS, Ribeiro AA, Raetz CRH. “Two-dimensional NMR spectroscopy and structures of six Lipid A species from Rhizobium etli CE3”. J. Biol. Chem. 2000 ; 275 : 28017. Raetz CRH. "Biochemistry of endotoxins." Annu. Rev.Biochem. 1990 ; 59 : 129. Raetz CR, Whitfield C. "Lipopolysaccharide endotoxins."Annu Rev Biochem. 2002 ; 71 : 635. Rammouz G. "Etude des composés lipidiques membranaires de Sm1021 et identification de la sphingosine 1-phosphate par électrophorèse capillaire couplée à la fluorescence induite par laser" thèse de doctorat 2006 Reuber TL, Walker GC. "Biosynthesis of succinoglycan, a symbiotically important exopolysaccharide of Rhizobium meliloti." Cell. 1993 ; 74(2) : 269. Reuhs BL, Carlson RW, Kim JS. "Rhizobium fredii and Rhizobium meliloti produce 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid-containing polysaccharides that are structurally analogous to group II K antigens (capsular polysaccharides) found in Escherichia coli." J Bacteriol. 1993 ; 175(11) : 3570. Reuhs BL, Williams MN, Kim JS, Carlson RW, Cote F. "Suppression of the Fix- phenotype of Rhizobium meliloti exoB mutants by lpsZ is correlated to a modified expression of the K polysaccharide." J Bacteriol. 1995 ; 177(15) : 4289. Reuhs BL, Geller DP, Kim JS, Fox JE, Kolli VS, Pueppke SG. "Sinorhizobium fredii and Sinorhizobium meliloti produce structurally conserved lipopolysaccharides and strain-specific K antigens." Appl Environ Microbiol. 1998 ; 64(12) : 4930. Reuhs BL, Relic B, Forsberg LS, Marie C, Ojanen-Reuhs T, Stephens SB, Wong CH, Jabbouri S, Broughton WJ. "Structural characterization of a flavonoid-inducible Pseudomonas aeruginosa A-band-like O antigen of Rhizobium sp. strain NGR234, required for the formation of nitrogen-fixing nodules." J Bacteriol. 2005 ; 187(18) : 6479. Ribeiro AA, Zhou Z, Raetz CRH. " Multi-dimensional NMR structural analyses of purified Lipid X and Lipid A (endotoxin)" Magn. Reson. chem. 1999 ; 37 : 620. Rigg GP, Barrett B, Roberts I S. "The localization of KpsC, S and T, and KfiA, C and D proteins involved in the biosynthesis of the Escherichia coli K5 capsular polysaccharide: evidence for a membrane-bound complex." Microbiology 1998 ; 144 : 2905. Robert IS. "The biochemistry and genetics of capsular polysaccharide production in bacteria." Annu. Rev. Microbiol. 1996 ; 50 : 285.
206
Rojas-Escudero E, Alarcan-Jimanez AL, Elizalde-Galvan P, Rojo-Callejas F. "Optimization of carbohydrate silylation for gas chromatography." J Chromatogr A. 2004 ; 1027 : 117. Rumbold K, Okatch H, Torto N, Siika-Aho M, Gabitz G, Robra KH, Prior B. "Monitoring on-line desalted lignocellulosic hydrolysates by microdialysis sampling micro-high performance anion exchange chromatography with integrated pulsed electrochemical detection/mass spectrometry. " Biotechnol Bioeng. 2002 ; 78(7) : 822. Schlaman HR, Okker RJ, and Lugtenberg BJJ. "Regulation of nodulation gene expression by NodD in Rhizobia." J. Bacteriol. 1992 ; 174 : 5177. Scheidle H, Gross A, Niehaus K. "The Lipid A substructure of the Sinorhizobium meliloti lipopolysaccharides is sufficient to suppress the oxidative burst in host plants." New Phytol. 2005 ; 165(2) : 559. Servant F, Bru C, Carrere S, Courcelle E, Gouzy J, Peyruc D, Kahn D. "ProDom: Automated clustering of homologous domains." Brief. Bioinform. 2002 ; 3 : 246. Sharypova LA, Niehaus K, Scheidle H, Holst O, Becker A. "Sinorhizobium meliloti acpXL mutant lacks the C28 hydroxylated fatty acid moiety of lipid A and does not express a slow migrating form of lipopolysaccharide." J Biol Chem. 2003 ; 278(15) : 12946. Silipo A, De Castro C, Lanzetta R, Molinaro A, Parrilli M. "Full structural characterization of the lipid A components from the Agrobacterium tumefaciens strain C58 lipopolysaccharide fraction." Glycobiology 2004 ; 14(9) : 805. Skorupska A, Janczarek M, Marczak M, Mazur A, Krol J. "Rhizobial exopolysaccharides: genetic control and symbiotic functions." Microb Cell Fact. 2006 ; 5 : 7. Szalo IM, Taminiau B, Mainil J. " Le lipopolysaccharide d’Escherichia coli : structure, biosynthèse et rôles." Ann. Méd. Vét. 2006; 150 : 108. Smith HJ, Huff B, Powers W, Caine D. "The reduction-methylation of cyclohexanone derivatives." J. Org. Chem. 1967 ; 32 : 2851. Snyder DS, Gibson D, Heiss C, Kay W, Azadi P. "Structure of a capsular polysaccharide isolated from Salmonella enteritidis." Carbohydr Res. 2006 ; 341(14) : 2388. Somasegaran P, Hobben H J. Handbook of Rhizobia. 1994 Springer-Verlag KG, Berlin, Germany Spinosa MR, Progida C, Tala A, Cogli L, Alifano P, Bucci C. "The Neisseria meningitidis capsule is important for intracellular survival in human cells." Infect Immun. 2007 ; 75 : 3594. Terefework Z. "Diversity and Phylogeny of Rhizobium galegae, and reflections on molecular evolution of rhizobium-legume symbiosis." Academic Dissertation, April 2002. University of Helsinki, Department of Applied Chemistry and Microbiology, Microbiology, Faculty of Agriculture and Forestry.
207
Teuber M, Bader J. "Action of polymyxin B on bacterial membranes. Binding capacities for polymyxin B of inner and outer membranes isolated from Salmonella typhimurium." Arch.
Microbiol. 1976 ; 109 : 51. Toby Kiers E, Rousseau RA, West SA and Ford Denison R. "Host sanctions and the legume rhizobium mutualism" Nature 2003 ; 425 : 78. Torto N, Bang J, Richardson S, Nilsson GS, Gorton L, Laurell T, Marko-Varga G. "Optimal membrane choice for microdialysis sampling of oligosaccharides." J Chromatogr A. 1998 ; 806(2) : 265. Troy FA, Frerman FE, Heath EC. "The biosynthesis of capsular polysaccharide in Aerobacter aerogenes." J Biol Chem. 1971 ; 246(1) : 118. Tzeng YL, Datta AK, Strole CA, Lobritz MA, Carlson RW, and Stephens DS. "Translocation and surface expression of lipidated serogroup B capsular polysaccharide in Neisseria meningitidis." Infect. Immun. 2005 ; 73 : 1491. Urbanik-Sypniewska T, Seydel U, Greck M, Weckesser J, Mayer H. "Lipid A with 2,3-diamino-2,3-dideoxy-glucose in lipopolysaccharides from slow-growing members of Rhizobiaceae and from "Pseudomonas carboxydovorans." Arch. Microbiol. 1989 ; 152 : 527. Uttaro AD, Cangelosi GA, Geremia RA, Nester EW, Ugalde RA. "Biochemical characterization of avirulent exoC mutants of Agrobacterium tumefaciens." J Bacteriol. 1990 ; 172 : 1640. Vandamme PE, Pot B, Gillis M, De Vos P,Kerster SK, Swings J. "Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics." Microbiol. Rev. 1996 ; 60 : 407. Van der Hoeven RAM, Hofte AJP, Tjaden UR, van der Greef J, Torto N, Gorton L, Marko-Varga G, Bruggink C. "Sensitivity Improvement in the Analysis of Oligosaccharides by On-line High-performance Anion-exchange Chromatography/Ion Spray Mass Spectrometry." Rapid comuication mass spectrometry 1998 (a) ; 12 : 69. Van Der Hoeven RAM, Tjaden UR, Van Der Greef J, Van Casteren WHM. Schols HA, Voragen AGJ, Bruggink C. "Recent progress in high-performance anion-exchange chromatography/ionspray mass spectrometry for molecular mass determination and characterization of carbohydrates using static and scanning array detection" Journal of Mass
Spectrometry 1998 (b) ; 33 (4) : 377. Vincent JM, 1970 "A manual for the practical study of root nodule bacteria." International Biological Programme Handbook No 15. Blackwell Scientific Publications, Oxford and Edinburgh. Waeghe TJ, Darvill AG, McNeil M, Albersheim P. "Determination, by methylation analysis, of the glycosyl-linkage composition of microgram quantities of complex carbohydrates." Carbohydr. Res. 1983 ; 123 : 281.
208
Williams MNV, Hollingsworth RI, Klein S, Signer ER. "The symbiotic defect of Rhizobium
meliloti exopolysaccharide mutants is suppressed by lpsZ+, a gene involved in lipopolysaccharide biosynthesis." J. Bacteriol. 1990 ; 172 : 2622. White T, Bursten S, Federighi D, Lewis RA, Nudelman E. "High-Resolution Separation and Quantification of Neutral Lipid and Phospholipid Species in Mammalian Cells and Sera by Multi-One-Dimensional Thin-Layer Chromatography."Anal. Biochem. 1998 ; 258 : 109. Whitfield C. "Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli" Annual Review of Biochemistry 2006 ; 75 : 39.
Young JPW, Haukk AKE. "Diversity and phylogeny of rhizobia." New Phytol. 1996 ; 133 : 87. York WS, Darvill AG, McNeil M, Stevenson TT, Abersheim P. “Isolation and characterization of plant cell walls and cell wall components.” Methods in enzymol. 1985 ; 118 : 3. Zaia J. "Mass spectrometry of oligosaccharides." Mass Spectrom Rev. 2004 ; 23(3) : 161. Zanetta JP, Timmerman P, Leroy Y. "Gas-liquid chromatography of heptafluorobutyrate derivatives if the O-methyl-glycosides on capillary columns: a method for the quantitative determination of monosaccharide composition of glycoproteins and glycolipids." Glycobiology 1999 ; 9 : 255. Zakhia F, de Lajudie P. "La taxonomie bactérienne moderne: revue des techniques application à la caractérisation des bactéries nodulants les légumineuses (BNL)." Can. J. Microbiol. 2006 ; 52 : 169.
