Développement d'une thérapie génique pour l'Ataxie de ... · trinucléotide GAA au niveau du 1er intron du gène de la frataxine (FXN). Le nombre de trinucléotides augmente de

Développement d’une thérapie génique pour l’Ataxie de Friedreich en induisant l’expression du gène de la frataxine

avec les TALEs-FT

Mémoire

Khadija Cherif

Maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire

Maître ès sciences (M.Sc.)

Québec, Canada

© Khadija Cherif, 2017

Développement d’une thérapie génique pour l’Ataxie de Friedreich en induisant l’expression du gène de la frataxine

avec les TALEs-FT

Mémoire

Khadija Cherif

Sous la direction de :

Jacques P. Tremblay, directeur de recherche

iii

Résumé

L’ataxie de Friedreich (FRDA) est la plus fréquente des ataxies héréditaires autosomiques

récessives. FRDA est due à une mutation du gène de la frataxine (FXN) situé sur le

chromosome 9, q13. Cette mutation est une augmentation du nombre de répétitions du

trinucléotide GAA au niveau du 1er intron du gène de la frataxine (FXN). Le nombre de

trinucléotides augmente de moins 30 chez les sujets normaux jusqu’à 1300 chez les

patients. Cela a pour conséquence de diminuer l’expression de la protéine frataxine, une

protéine qui joue un rôle important dans le métabolisme du fer dans la mitochondrie.

Mon projet traite de l’utilisation des protéines TALE-platinum (plTALE) fusionnées avec

des systèmes permettant une stimulation de la transcription (FT), tel que VP64 ou P300.

Ces plTALEs ciblent spécifiquement la région régulatrice du gène FXN pour augmenter

sa transcription et ainsi induire une augmentation de l’expression de la protéine frataxine.

Les plTALEs contiennent des variations au niveau des acides aminés 4 et 30 pour chaque

RVD (Repeat Variable Di-residues) en plus des variations des acides aminés 12 et 13.

Ces variations permettent d’augmenter la spécificité des plTALEs pour les séquences

nucléotidiques ciblées. L’assemblage des RVD de plTALEs a été fait par 4-modules RVD

ce qui permet d’obtenir un rendement d’assemblage de 100%.

Nous avons produit 34 effecteurs plTALE-FT qui ciblent 14 séquences du gène FXN afin,

de sélectionner 3 plTALE-VP64 et 2 plTALE-SunTag10X qui peuvent augmenter la

transcription et l’expression du gène FXN de 2 fois jusqu’à 19 fois dans les différentes

cellules modèles FRDA. Nous avons quantifié le taux de synthèse des ARNm et de la

protéine FXN après le traitement in vitro avec ces plTALEs-FT par qRT-PCR et westerns.

Les résultats montrent que ces plTALES-FT sélectionnés induisent l’activité

transcriptionnelle du gène endogène FXN, ainsi que l’expression de la protéine frataxine

in vitro. L’augmentation de la frataxine augmente l’activité d’aconitase qui est modulée

réversiblement par le niveau de la frataxine dans la mitochondrie. Nous avons utilisé un

virus AAV9 pour livrer plTALE-FT dans les souris modèles de FRDA dans le but de

valider l’efficacité de ces effecteurs in vivo avant de passer aux tests précliniques. Les

résultats de ces traitements in vivo ne sont pas encore disponibles.

iv

Abstract

Friedreich's ataxia (FRDA) is the most frequent autosomal recessive hereditary ataxia.

FRDA is due to a mutation of the frataxin gene (FXN) located on chromosome 9, q13.

This mutation is an increase in the number of repetitions of the trinucleotide GAA in the

1st intron of the frataxine gene (FXN). The number of trinucleotides increases from less

than 30 in normal subjects up to 1300 in patients. This decreases the expression of the

protein frataxin, a protein which plays an important role in the metabolism of iron in the

mitochondria.

My project deals with the use of TALE-platinum (plTALE) proteins fused with

transcription-enhancing systems (FT), such as VP64 or P300. These plTALEs specifically

target the regulatory region of the FXN gene to increase its transcription and thus induce

an increase in the expression of the frataxin protein.

The plTALEs contain variations in amino acids 4 and 30 for each Repeat Variable

Diresidues in addition to the variations of amino acids 12 and 13. These variations make

it possible to increase the specificity of the plTALEs for the targeted nucleotide

sequences. The assembly of the RVDs of plTALEs was done using modules containing

4 RVDs, which makes it possible to obtain an assembly efficiency of 100%.

We produced 34 plTALE-FT effectors that target 14 sequences of the FXN gene to select

3 plTALE-VP64 and 2 plTALE-SunTag10X, which increased FXN gene transcription

and expression by up to 19-folds in different FRDA model cells. We quantified the

synthesis of mRNAs and of FXN protein after in vitro treatment with these plTALEs-FT

by qRT-PCR and westerns. The results show that these selected PlTAL-FT induced the

transcription of the endogenous FXN gene as well as the expression of the frataxin protein

in vitro. The increase in frataxin increased the aconitase activity, which is modulated

reversibly by the level of frataxin in the mitochondria. We used an AAV9 virus to deliver

plTALE-FT in FRDA model mice to validate the efficacy of these effectors in vivo before

proceeding to preclinical testing. The results of these in vivo treatments are not yet

available.

v

Table des matières

Résumé ..................................................................................................... iii

Abstract..................................................................................................... iv

Table des matières ......................................................................................v

Liste des tableaux ..................................................................................... xi

Liste des figures ....................................................................................... xii

Liste des abréviations ............................................................................... xv

Remerciements ..................................................................................... xviii

Chapitre 1 : La maladie de Friedreich ...................................................... 1

1.1 L’ataxie de Friedreich (FRDA)....................................................... 1

1.1.1 Introduction générale ................................................................... 1

1.1.2. Historique ................................................................................... 1

1.1.3 Incidence ..................................................................................... 2

1.1.4 Cause........................................................................................... 3

1.2 FRDA et le stress oxydatif ............................................................... 3

1.3 Symptômes cliniques de FRDA....................................................... 4

1.3.1 Symptômes neurologiques ........................................................... 4

1.3.2 Symptômes cardiaques ................................................................ 5

1.3.3 Autres symptômes cliniques ........................................................ 5

1.4 Anatomopathologie ......................................................................... 6

1.4.1 Neuropathologie (Fig. 4) ............................................................. 6

1.4.2 Hypertrophique cardiaque ........................................................... 8

1.5 Frataxine .......................................................................................... 8

1.5.1 Gène de la frataxine (FXN) ......................................................... 8

1.5.2 La protéine de la frataxine ........................................................... 9

1.5.3 La fonction de la frataxine ......................................................... 10

1.5.4 L’absence de la frataxine ........................................................... 11

1.6 Déficience moléculaire de la FRDA .............................................. 11

1.6.1 Formation d’ADN collant (Sticky DNA) ................................... 12

1.6.2 Formation d’hybride RNA-DNA ............................................... 12

1.6.3 Changement d’épigénétique ...................................................... 13

1.7 Diagnostic de FRDA ...................................................................... 13

1.7.1 PCR ........................................................................................... 14

vi

1.7.2 Triplet-repeat (TP-PCR) ............................................................ 14

1.7.3 RT-PCR quantitatif en temps réel (qRT-PCR) ........................... 15

1.7.4 Southern Blot ............................................................................ 15

1.8 Thérapie ......................................................................................... 15

1.8.1 Principe et le but des traitements de FRDA ............................... 15

1.8.2 Exemple des thérapies ............................................................... 16

1.8.2.1 Idébénone ............................................................................ 16

1.8.2.2 Inhibiteurs des histones désacétylases (HDACi) .................. 17

1.8.2.3 La protéine frataxine exogène.............................................. 17

1.8.2.4 Thérapie génique ................................................................. 18

1.9 Modèles animaux et cellulaires de FRDA .................................... 19

1.9.1 Modèle Animaux ....................................................................... 20

1.9.1.1 Souris MCK et souris NSE .................................................. 20

1.9.1.1.1 Souris MCK .................................................................. 20

1.9.1.1.2 Souris NSE .................................................................... 20

1.9.1.2 Souris knock-in ................................................................... 21

1.9.1.2.1 Souris KIKI et souris KIKO .......................................... 21

1.9.1.2.2 Souris YG8R et souris YG22R ...................................... 22

1.9.2 Modèle des cellules FRDA : fibroblastes, lymphoblastes et les

cellules iPSC dérivées de patients FRDA ........................................... 23

Chapitre 2 : Thérapie génique................................................................. 25

2.1 Définition ....................................................................................... 25

2.2 Différents types de thérapie génique ............................................ 25

2.2.1 Thérapie génique somatique ...................................................... 25

2.2.1.1 In vivo ................................................................................. 25

2.2.1.2 Ex vivo ................................................................................ 25

2.2.2 Thérapie génique germinale ...................................................... 26

2.3 Moyens de livraison du gène d’intérêt.......................................... 26

2.3.1 Les vecteurs............................................................................... 26

2.3.2 Les vecteurs viraux .................................................................... 27

2.3.2.1 Adénovirus .......................................................................... 27

2.3.2.2 Virus adéno-associé ............................................................. 28

2.3.2.3 Retroviridae ......................................................................... 30

2.3.2.3.1 Gamma-rétroviral vecteurs ............................................ 31

2.3.2.3.2 Les lentivirus ................................................................. 31

2.3.3 Les vecteurs non-viraux ............................................................ 32

2.3.3.1 Les vecteurs chimiques ........................................................ 32

2.3.3.2 Les acides nucléiques nus .................................................... 32

vii

Chapitre 3 : Transcription effecteur activateur-like (TALE) .................. 33

3.1 TALE/TALEN ............................................................................... 33

3.2 La limite majore des effecteurs TALENs/TALEs ........................ 35

3.3 Construction des TALEs ............................................................... 35

3.3.1 Réaction de Golden Gate ........................................................... 35

3.4 Platinum-TALE (plTALE) ........................................................... 37

3.5 Les facteurs de la transcription .................................................... 38

3.4.1 VP64 ......................................................................................... 39

3.4.2 p300 .......................................................................................... 39

Chapitre 4 : Hypothèse et l’objectif ......................................................... 41

4.1 Hypothèse....................................................................................... 41

4.2 Objectif .......................................................................................... 42

Chapitre 5 : Matériels et méthodes .......................................................... 43

5.1 Platinum TALE-VP64 (plTALE-VP64) ....................................... 43

5.1.1 Introduction ............................................................................... 43

5.1.2 La construction plTALEs-VP64 ................................................ 43

5.1.2.1 Première étape de la construction des plTALENs (pFUS2) . 44

5.1.2.2 La deuxième étape de la construction des plTALENs .......... 45

5.1.2.3 La construction des plTALEs-VP64 .................................... 46

5.1.2.3.1 Le clonage In-fusion ...................................................... 47

5.1.2.3.2 La construction finale de plTALEs-VP64 ...................... 47

5.1.3 Test plTALEs-VP64 in vitro ..................................................... 48

5.1.3.1 Les cellules fibroblaste des patients FRDA ......................... 48

5.1.3.2 Nucléofection ...................................................................... 48

5.1.3.3 qRT-PCR............................................................................. 49

5.1.3.4 Western blot ........................................................................ 49

5.2 Les vecteurs lentivirus ................................................................... 50

5.2.1 Introduction ............................................................................... 50

5.2.2 La construction des pLenti-plTALEs-VP64............................... 51

5.2.3 La production purification et titrage des Lentivirus dans 293T .. 51

5.2.4 Traitement des cellules FRDA par les lentivirus exprimant

plTALEs-VP64 .................................................................................. 52

5.3 La mutagenèse des RVD ............................................................... 53

5.3.1 Introduction ............................................................................... 53

5.3.2 Mutagénèse des modules RVD .................................................. 53

5.3.3 La construction des nplTALEs-VP64 ........................................ 53

viii

5.3.4 Test nplTALEs-VP64 in vitro.................................................... 54

5.4 plTALEs-p300 ............................................................................... 54

5.4.1 Introduction ............................................................................... 54

5.4.2 La construction plTALEs-p300 ................................................. 54

5.4.3 Test plTALEs-p300 in vitro....................................................... 55

5.5 plTALEs-SunTag (plTALE-ST) ................................................... 55

5.5.1 Introduction ............................................................................... 55

5.5.2 La construction plTALEs-ST10X et plTALEs-ST24X .............. 56

5.5.2.1 La construction de pCR3.1-plTALE-ST10X et de pCR3.1-

plTALEs-ST24X ............................................................................. 56

5.5.2.2 La construction de scFV- SpGFP-Vp64-GB1-NLS (scFV) . 57

5.5.3 Test plTALEs-ST in vitro .......................................................... 57

5.6 pAAV-plTALEs ............................................................................. 58

5.6.1 La construction des pAAV-plTALEs-FT ................................... 58

5.6.1.1 La construction pAAV-plTALEs-VP64 .............................. 59

5.6.1.2 La construction pAAV-plTALEs-ST10X ............................ 59

5.7 Test d’aconitase ............................................................................. 60

Chapitre 6 : Résultats .............................................................................. 61

6.1 L’induction du gène FXN in vitro dans les fibroblastes FRDA

avec plTALEs-VP64 ............................................................................ 61

6.1.1 La détermination des séquences ciblées ..................................... 61

6.1.2 La détermination des séquences des RVD ................................. 62

6.1.3 Les plTALEs-VP64 ................................................................... 63

6.1.3.1 La première étape de la construction des plTALENs ........... 63

6.1.3.1.1 pFUS2-RVD (pour les plTALENs à 13 RVD) ............... 63

6.1.3.1.2 pFUS2-RVD (pour les plTALENs à 15 RVD) ............... 63

6.1.3.2 La deuxième étape des plTALENs ...................................... 64

6.1.3.3 Les constructions pCR3.1-plTALEs-VP64 .......................... 65

6.1.3.3.1 Les construction ptCMV-plTALEN-VP64-XbaI ........... 65

6.1.3.3.2 Les constructions pCR3.1-plTALEs-VP64 .................... 66

6.1.4 L’induction du gène FXN in vitro par plTALEs-VP64 .............. 68

6.1.4.1 La sélection des meilleurs plTALEs-VP64 .......................... 68

6.1.4.2 L’effet synergique des plTALEs-VP64 sur l’induction du

gène FXN des cellules FRDA4078.................................................. 71

6.1.4.3 L’induction de l’expression de la protéine frataxine par les

effecteurs plTALEs-VP64 ............................................................... 71

6.1.4.4 Traitement des cellules FRDA provenant de 4 patients avec

des plTALEs-Vp64 sélectionnés. .................................................... 72

ix

6.1.4.5 L’induction de l’expression de la protéine frataxine par les

effecteurs plTALEs-VP64 dans des cellules provenant de 2 patients

FRDA ............................................................................................. 73

6.2 Les vecteurs lentiviraux comme outils pour l’expression

génétique des plTALEs-VP64 dans les cellules FRDA. ..................... 74

6.2.1 Les vecteurs pLenti-plTALE-VP64 ........................................... 74

6.2.2 L’infection des cellules FRDA4078 avec les lentivirus qui

expriment plTALEs-VP64 ................................................................. 76

6.3 L’amélioration de la spécificité et de l’affinité des plTALEs avec

de nouvelles séquences nRVD (nplTALEs) ........................................ 78

6.3.1 Les nplTALEs-VP64 ................................................................. 78

6.3.2 Des nplTALE-VP64 qui ciblent le promoteur du gène FXN pour

induire la transcription du gène .......................................................... 80

6.4 Le changement épigénomique du gène FXN avec

l’acétyltransférase p300 fusionné avec des plTALEs ........................ 81

6.4.1 Les plTALEs-p300 .................................................................... 81

6.4.2 L’induction du gène FXN par plTALE-p300 ............................. 82

6.5 L’induction du gène FXN avec plTALEs-SunTag qui recrute 10

ou 24 copies de VP64 ........................................................................... 85

6.5.1 La construction plTALEs-SunTag10X et plTALE-SunTag24X 85

6.5.2 Traitement in vitro des cellules FRDA4078 par le système de

plTALE-ST ........................................................................................ 88

6.5.3 L’effet synergique des plTALEs-ST10X et plTALEs-ST24X sur

l’augmentation de l’activité du gène FXN .......................................... 90

6.5.4 Activation du gène FXN endogène dans des fibroblastes de 4

patients FRDA avec plTALEs-ST (Fig. 70 et 71) ............................... 91

6.5.5 L’induction de l’expression de la protéine frataxine avec les

effecteurs plTALEs-VP64 dans les cellules provenant de 4 patients

FRDA (Fig. 72) .................................................................................. 94

6.6 Les pAAV-plTALEs-VP64 et ST .................................................. 95

6.6.1 Les pAAV-plTALEs-VP64 ....................................................... 95

6.6.2 Les pAAV-plTALEs-ST10X ..................................................... 96

6.6.3 Traitement des cellules FRDA4078 par pAAV-plTALEs-ST10X

........................................................................................................... 96

6.7 L’augmentation de l’activité d’aconitase dans les cellules traitées

par les effecteurs plTALE-ST10X ...................................................... 99

Chapitre 7 : Discussion ......................................................................... 101

x

Chapitre 8 : Conclusion et perspective .................................................. 106

Bibliographie ......................................................................................... 107

xi

Liste des tableaux

Tableau 1: Historique de la découverte de la maladie de l'ataxie de Friedreich. ............ 2

Tableau 2: les principaux signes de la maladie de FRDA. ............................................ 4

Tableau 3: Liste des noms des plTALEs-VP64 avec la séquence des RVD qui sont

complémentaires aux nucléotides ciblés. ..................................................................... 62

Tableau 4: Les codons des nouveaux et des anciens RVD avec leurs nucléotides cibles.

................................................................................................................................... 79

Tableau 5: La liste des nplTALE-VP64 avec leurs séquences des nRVD et leurs

séquences cibles .......................................................................................................... 79

Tableau 6: La liste des plTALE-p300 avec leurs séquences RVD et leurs séquences

cibles. ......................................................................................................................... 82

Tableau 7: La liste des plTALEs-ST10X. ................................................................... 87

Tableau 8: La liste des plTALEs-ST24X. ................................................................... 87

xii

Liste des figures

Figure 1: Des signes classiques de FRDA:.................................................................... 6

Figure 2: La coupe transversale de moelle épinière d’un patient FRDA atteint au niveau

du cordon postérieur et le faisceau pyramidal (cordon latéral). ...................................... 7

Figure 3: L’aspect des noyaux dentelés (DN) dans un patient FRDA. ........................... 7

Figure 4: L’anatomopathologie des cerveaux FRDA. ................................................... 8

Figure 5: L’aspect brut du cœur dans les patients FRDA. ............................................. 8

Figure 6: La représentation moléculaire du gène FXN (entre chaque 2 exons il y a un

intron). .......................................................................................................................... 9

Figure 7: Les principaux sites régulateurs du gène FXN. .............................................. 9

Figure 8: La localisation de la frataxine dans la mitochondrie et dans le cycle de la

production d’énergie. .................................................................................................. 10

Figure 9: La dérégulation de la chaine respiratoire et le cycle de la production d’énergie

en absence et en diminution de l’expression de la frataxine dans la mitochondrie. ....... 11

Figure 10: Une présentation schématique de la forme d’ADN anormal dans le cas de

FRDA. En haut l’ADN triplex et en bas l’ADN collant. ............................................. 12

Figure 11: La formation d’hybride RNA-DNA dans le cas FRDA. ............................. 13

Figure 12: Schéma représentatif des différents produits d’amplification avec 3 amorce

dans Triplet-repeat (TP-PCR). ..................................................................................... 15

Figure 13: Présentation de la structure d’euchromatine (gène actif) et de la forme

l’hétérochromatine (gène silencieux). .......................................................................... 17

Figure 14: Les domaines de Tat-FXN protéine de fusion. ........................................... 18

Figure 15: Présentation de la structure moléculaire de complexe TALE-FT ................ 19

Figure 16: Présentation schématique de la génération des souris MCK et des souris

NSE. ........................................................................................................................... 20

Figure 17: Représentation schématique de la génération des souris KIKI et KIKO. .... 21

Figure 18: Représentation schématique de la génération des souris YG8R et les souris

YG22R. ...................................................................................................................... 23

Figure 19: Présentation des différences majeures entre thérapie génique in vivo et ex

vivo ............................................................................................................................ 26

Figure 20: La structure et l'organisation du génome du virus adéno-associé (AAV). ... 29

Figure 21: Cycle de vie de l’AAV. ............................................................................. 29

Figure 22: Cycle de réplication des rétrovirus. ............................................................ 31

Figure 23: Les différentes parties des TALEs. ............................................................ 33

Figure 24: Les différents domaines liés après le N-ter des TALEs. ............................. 34

Figure 25: Deux paires des TALENs ciblent deux séquences spécifiques d’ADN. ...... 34

Figure 26: Les deux grandes étapes de l’assemblage des RVDs avec la réaction Golden

Gate ............................................................................................................................ 36

Figure 27: L’assemblage plusieurs inserts dans un seul vecteur selon la réaction Golden

Gate de NEB. .............................................................................................................. 37

Figure 28: L’assemblage des RVDs Platinum-TALE (plTALE) en deux grande étapes.

................................................................................................................................... 38

Figure 29: Activation de la transcription après le recrutement du complexe

transcriptionnel par le domaine d’activation fusionné avec TALE. .............................. 39

xiii

Figure 30: Le VP64 regroupe 4 séquences de VP16 (image du bas), pour activer la

transcription après le recrutement du complexe transcriptionel (image du haut)........... 39

Figure 31: Le rôle de p300 dans l’activation du gène après l’acétylation et le

remodelage de la chromatine. ...................................................................................... 40

Figure 32: La présentation schématique pour les grandes étapes de la construction des

plTALEs-VP64 ........................................................................................................... 44

Figure 33: Le protocole de la réaction d’assemblage des 4 modules des RVD d’étape 1

................................................................................................................................... 45

Figure 34: Le protocole de la réaction d’assemblage finale de l’ensemble des RVD dans

un vecteur ptCMV afin de construire plTALENs......................................................... 46

Figure 35: Le schéma de test in vitro des plTALEs-VP64 dans des cellules FRDA. .... 49

Figure 36: pAAV_TALE-TF(VP64) -BB_V3 ............................................................ 58

Figure 37: La localisation schématique des régions ciblées du promoteur et de l’intron 1

du gène FXN ............................................................................................................... 61

Figure 38: Position des séquences ciblées. .................................................................. 62

Figure 39: PCR pour sélectionner les bonnes constructions de l’assemblage de 4 RVD

pour plTALENs contenant 13 RVD. ........................................................................... 63

Figure 40: PCR pour sélectionner l’assemblage de 4 et 2 RVD pour plTALENs à 15

RVD. .......................................................................................................................... 64

Figure 41: PCR pour sélectionner l’assemblage final des plTALENs 13 et 15 RVD. .. 64

Figure 42: L’image du vecteur et de l’insert utilisés dans la réaction de clonage In-

fusion pour faire ptCMV-plTALENs-VP64-XbaI :...................................................... 65

Figure 43: Le produit de PCR de la sélection des clones positifs plTALENs-VP64-

XbaI. ........................................................................................................................... 66

Figure 44: La présentation de l’insert plTALE-VP64 et du vecteur pCR3.1 digéré par

MluI et XbaI pour faire la construction pCR3.1-plTALE-VP64................................... 66

Figure 45: Le produit de la digestion pour sélectionner les constructions positives ayant

pCR3.1-plTALE-VP64. .............................................................................................. 67

Figure 46: Les séquences des acides aminés de N_ter-15 RVD-C_ter-NLS-VP64 de la

construction plTALE-6-15 qui a été séquencée avec 4 amorces. .................................. 68

Figure 47: L’image représentative des fibroblastes FRDA4078 en culture, 24 h après la

nucéofection avec un plasmide contenant le gène GFP. ............................................... 70

Figure 48: L’induction du gène FXN dans les cellules FRDA4078 par des plTALEs-

VP64. .......................................................................................................................... 70

Figure 49: L’induction de l’expression de la protéine frataxine dans les cellules

FRDA4078 ................................................................................................................. 72

Figure 50: L’induction du gène FXN dans 4 différents types de cellules FRDA avec les

plTALEs-PV64-6-15, 8-15 et F4-15 par rapport aux témoins. ..................................... 73

Figure 51: L’induction de l’expression de la protéine frataxine dans deux autre cellules

FRDA traitées avec les plTALEs-VP64 par rapport aux contrôles négatifs. ................. 74

Figure 52: Les produites de digestion purifiée des vecteur pCR3.1 et des inserts digérés

par BstI/XbaI pour faire les constructions pLenti-plTALEs-VP64. .............................. 75

Figure 53: La sélection des clones positives pLenti-plTALEs-VP64 par une double

digestion (BstI/XbaI)................................................................................................... 75

Figure 54: Le résultat de séquençage pLenti-plTALE-VP64-11-15 avec 4 amorces; ... 76

xiv

Figure 55: L’activité transcriptionnelle du gène FXN dans les cellules FRDA4078

traitées avec les lentivirus qui expriment plTALEs-VP64 par rapport aux témoins

négatifs. ...................................................................................................................... 77

Figure 56: L’analyse de l’expression de la protéine frataxine dans les cellules

FRDA4074 traitées avec les lentivirus qui expriment plTALEs-VP64 par rapport aux

témoins négatifs .......................................................................................................... 78

Figure 57: Les produits de purification du vecteur pCR3.1 et des nplTALEs-VP64-6-15

et 11-15 digérés par MluI et XbaI pour faire les constructions pCR3.1-nplTALEs-VP64.

................................................................................................................................... 79

Figure 58: Le résultat du séquençage de nplTALE-8-15-VP64 avec 4 amorces. ......... 80

Figure 59: L’activité de gène FXN dans les cellules FRDA4078 traitées par nplTALEs-

VP64 et dans les cellules témoins. ............................................................................... 81

Figure 60: La structure moléculaire de plTALE-P300 dans le pCR3.1 contient le

promoteur CMV, le N-ter, le RVD, le C-ter, le NLS-VP64 et le p300. ........................ 82

Figure 61: La présentation des fragments du vecteur linéaire et de l’insert utilisés dans

le clonage In-fusion pour construire les plTALEs-p300. .............................................. 82

Figure 62: La transcription du gène FXN dans les cellules traitées par les plTALEs-

p300 et les cellules témoins. ........................................................................................ 83

Figure 63: L’activité transcriptionnelle du gène FXN avec l’effet synergique des

effecteurs VP64 + p300 et plusieurs p300 ensemble qui ciblent séquences 6, 8 et F4. .. 84

Figure 64: L’analyse de l’expression de la protéine frataxine dans les cellules traitées

avec plTALE-p300 et avec plusieurs effecteurs VP64 et p300 et dans les cellules

témoins. ...................................................................................................................... 85

Figure 65: La structure moléculaire de plTALE-ST10X/24X...................................... 86

Figure 66: Le résultat de séquençage pCR3.1-plTALE-ST10X-4-13 avec 4 amorces. . 88

Figure 67: L’induction de l’activité du gène FXN des cellules FRDA4087 par les

plTALEs-ST10X et plTALEs-ST24X normalisée par GAPDH et HPRT et par rapport

aux témoins. ................................................................................................................ 89

Figure 68: Le taux d’expression de la frataxine dans les cellules traitées par plTALEs-

ST10X et plTALEs-ST24X normalisé par GAPDH et par rapport au contrôle. ............ 90

Figure 69: L’effet synergique des plTALEs-ST10X sur l’activation de la transcription

du gène FXN dans les cellules FRDA4078. ................................................................. 91

Figure 70: Le nombre de copies d’ARNm FXN après une induction du gène endogène

FXN avec 2 meilleurs plTALEs-ST10X-4-15 et plTALEs-ST10X-6-15 dans 4 cellules

FRDA par rapport aux fibroblastes normaux et témoins négatifs. ................................ 93

Figure 71: L’augmentation de l’activité du gène endogène FXN normalisé par les gènes

GAPDH et HPRT dans les 4 FRDA traitées par les plTALEs-ST10X-ST10X par

rapport aux contrôles négatifs...................................................................................... 94

Figure 72: L’induction de l’expression de la protéine frataxine dans 4 cellules FRDA

traitées avec les plTALEs-ST10X-ST10X par rapport aux contrôles négatifs. ............. 95

Figure 73: Les noyaux des cellules FRDA4078 traitées par pAAV-plTALEs-ST10X. 97

Figure 74: Les cellules FRDA4078 traitées par plTALE-ST10X. ............................... 97

Figure 75: Les résultats d’induction du gène endogène FXN avec les effecteurs

plTALEs-ST10X exprimés par les vecteurs pCR3.1 et pAAV. .................................... 99

Figure 76: L’augmentation de l’activité d’aconitase dans les cellules FRDA4078

traitées par les effecteurs plTALEs-ST10X-6-15 plus 8-15. ....................................... 100

xv

Liste des abréviations

AAV Adeno-Associated virus

AAV9 Adeno-Associated Virus Sérotype 9

ADN Acide Désoxyribonucléique

ADNc Acide Désoxyribonucléique Complémentaire

Amp Ampicilline

AAC Adénine-Adénine-Cytosine

ARN Acide Ribonucléique

ARNm Acide Ribonucléique Messager

ATP Adénosine Triphosphate

Bax Protéine Bcl-2–Associated X

BGH Bovine Growth Hormone

BSA Bovine serum albumin

CAG CMV Early Enhancer/Chicken β Actin

CMV Cytomégalovirus

CHU Centre Hospitalier Universitaire

C-ter Extrémité Carboxy-Terminale

CI Cystéine- Isoleucine

CMH Recepteur Protéine

Cas9 CRISPR Associated Protein 9

Cre Cycling Recombination

CpG Cytosine–Phosphate–Guanine

Ca2+ Calcium Ions

CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

ChIP Chromatin ImmunoPrecipitation

DRG Ganglions de la Racine Dorsale

DTT Dithiothreitol

DNase I DNA Plymerase I

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

EF1 Elongation factor 1 alpha

EN Acide glytamique- Asparagine

EIAV Virus de l'Anémie Infectieuse Equine

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

EGR3 Early Growth Response Gene

FBS Fetal Bovin Serum

FXN Frataxine

FT Facteur Transcription

FRDA Friedreich Ataxia

Fe-S Fer-Soufre

FAST-1 FXNAntisense Transcript - 1

FoKI Flavobacterium Okeanokoites

FR Facteur de Répression

GAG Guanine-Adénine- Guanine

GFP Green Fluorescent Protein

GAA Guanine-Adénine-Adénine

GAPDH Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase

GABA Acide Gamma-Aminobutirique

HAT Acétyltransférase

https://fr.wikipedia.org/wiki/Ad%C3%A9nine


https://fr.wikipedia.org/wiki/Cytosine


https://fr.wikipedia.org/wiki/Phosphate

https://fr.wikipedia.org/wiki/Guanine




xvi

H2O2 Peroxyde d'Hydrogène

HCl Acide Chlorhydrique

HBSS Hanks Balanced Salt Solution

HPRT Hypoxanthine phosphoribosyltransferase

HG Histidine- Glycine

HD Histidine-Acide aspartique

HIV Human Immunodeficiency virus

His6 Hexa-Histidine Tag

hFxn Human Frataxin

H3K27me3 Histone3 Lysine27 Trimethylation

H3K9me3 Histone3 Lysine9 Trimethylation

HDACi Inhibiteurs des Histones Désacétylases

H3 Histone 3

HRP Horseradish Peroxidase

iPSC Induced Pluripotent Stem Cells

IRM Image par Résonance Magnétique

KCl chlorure de potassium

KH2PO4 Potassium dihydrogen phosphate

kDa KiloDalton

Klf4 Kruppel-Like Factor 4

Kb Kilobase

KO Knock-Out

LB Luria-Bertan

LTR Longue Répétition Terminale

LoxP Locus of X-over P1

MCK Muscle Creatine Kinase

ml Millilitre

mg Milligramme

mm Millimètre

mM Milli molaire

MoMLV Virus de le Leucémie Murine de Moloney

MyoD Myogenic Differentiation

NSE Neuron Specific Enolase

NaCl Chlorure de Sodium

Na2HPO4 Sodium phosphate dibasic

nm Nanonètre

NHEJ Non Homologous End Joining

NLS Signal de localisation Nucléaire

NI Asparagine-Isoleucine

NG Asparagine-Glycine

NN Asparagine-Asparagine

N-ter Terminaison Amine

OH Groupe Hydroxyle

O2- Superoxyde

Oct4 Octamer-Binding Transcription Factor 4

PBS Phosphate-Buffered Saline

P300 Co-activating Proteins

PCR Polymerase Chain Reaction

PUMA Upregulated Modulator of Apoptosis

P53 Tumor Protein 53

https://fr.wikipedia.org/wiki/Peroxyde_d%27hydrog%C3%A8ne

https://fr.wikipedia.org/wiki/Groupe_fonctionnel

https://fr.wikipedia.org/wiki/Hydroxyle

https://fr.wikipedia.org/wiki/Superoxyde

xvii

P65 Transcription Factor

pb Paire de Bases

qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction

qRT-PCR Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction

RVD Repeat Variable Diresidues

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

ROS Reactive Oxygen Species

Rev Regulator of virion protein

rAAV Adeno-Associated Virus Recombinante

Sox2/SRY Sex Determining Region Y

SsRNA Single-Stranded Ribonucleic Acid

SRF Serum Response Factor

SP1 Specificity Protein 1

SDS Sodium Dodécyl Sulfate

SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SAGA Serum Response Factor

sfGFP Superfolder Green Fluorescent Protein

TGC Thymine-Guanine- Cytosine

Tris-HCl Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride

TP-PCR Triplet-Repeat PCR

TSS Transcription Start Site

TFAP2 Transcription Factor AP-2 Alpha

TTC Thymine- Thymine-Cytosine

TAT Peptide Trans-Activateurs

TBP TATA-Binding Protéine

TFIIB Transcription Factor II B

TFAP2α transcription factor Activator Protein 2 alpha

TALE Transcription Activator-like Effector

TALEN Transcription Activator-like Effector Nucleases

VP64 4 X VP16

VP16 Herpes Simplex Virus Protein vmw65

VIF Virus de l'immunodéficience Féline

YAC Yeast Artificial Chromosomes

µg Microgramme

µm Micromètre

https://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction

https://fr.wikipedia.org/wiki/Thymine



https://en.wikipedia.org/wiki/Herpes_simplex_virus_protein_vmw65

xviii

Remerciements

Tout d’abord, je tiens à exprimer mes sincères remerciements à mon directeur de

recherche Dr Jacques-P. Tremblay pour m’avoir accepté au sein de son équipe, de m’avoir

formé puis m’encadrer durant ma Maitrise, ainsi que de m’avoir fait confiance et cru en

moi pour réaliser ce projet, mais également pour sa patience, sa disponibilité, ses

nombreux conseils scientifiques et ses suggestions pertinentes.

Mes sincères remerciements aussi à Joël Rousseau pour sa collaboration essentielle à la

réussite de mon projet, sa disposition, et le temps consacré pour me faire profiter de sa

grande expérience. C’est principalement, grâce à son aide que j’ai pu avancer ce projet.

Je remercie Pierre Chapdelaine, qui m’as apporté son expertise de la technologie des

TALEs et pour les expériences réalisées dans les cultures de fibroblaste. De m’avoir aidé

à faire les premiers pas dans ce projet, de m’avoir inculqué la patience ainsi que la

fascination pour la recherche et enfin, je le remercie pour sa présence à mon séminaire.

Je remercier Dominique Ouellet pour son aide et ses conseils, ses réflexions qui mènent

souvent à des solutions et des suggestions très importantes, ainsi que de m’avoir aidé à

apprendre la production des Lentivirus.

Je remercier Catherine Gérard la collaboratrice principale de ce projet qui est responsable

de la partie in vivo, je lui souhaite une bonne continuation avec de bons résultats in vivo

merci pour le cadeau de 13-01-2017.

Je remercie mes chers collègues pour nos conversations scientifiques et intellectuelles et

pour l’environnement au sein du laboratoire, particulièrement Benjamin Duchene pour sa

bonne humeur et ses débats que j’ai très souvent apprécié. Jean-Paul Iyombe-Engembe

pour son encouragement et son aide moralement et scientifiquement et surtout au niveau

de la langue française. Je n’oublierai jamais mon ami, mon camarade de classe et mon

collègue du laboratoire, Arnaud Perrin, qui as un bon cœur, aimable et très serviable, avec

qui j’ai partagé des moments de pause, j’ai apprécié nos discussions, sans oublié ses aides

depuis mes premiers jours au laboratoire jusqu’à aujourd’hui et qui a était ma référence

de la langue française, ses conseils qui m’ont aidée d’amélioré mon niveau de la langue

française. Arnaud, n’oublie pas qu’il te reste que 2 chances!

xix

Mes remerciements aussi à toutes les personnes rencontrées dans le laboratoire et qui ont

contribué à nos travaux, Véronique Dorval, Daniel Skuk et sa pertinente expertise dans

les greffes de myoblastes, merci de m’avoir rappelé des bons souvenirs de mon pays natal,

Chantale Maltais et sa petite princesse, William-Edouard Gravel et son animation positive

dans le laboratoire, Daniel Agudelo avec qui nous n’avions pas les mêmes préférences de

température ambiante, mais nous partagions le même amour pour la thérapie génique,

Anteneh Argaw et ses discussions riches et Antoine Guyon pour son sérieux au

laboratoire.

Je remercie tous les membres du centre génomique du CHU de Québec (Plate-forme de

l'expression génétique, CHU de Québec, Québec) particulièrement Nathalie Paquet pour

les tests de qRT-PCR réalisés tout au long de ce projet et pour sa collaboration

professionnelle.

Je remercie la société Amorchem qui nous a fait confiance en finançant ce projet

Je remercie la directrice de programme Dr Josée N Lavoie, ainsi que Madame Chantal

Joubert pour leurs orientations et leurs conseils pendant ma maitrise.

Je remercie les professeurs Dr Sébastien Hébert et Dr Bruno Gaillet d’avoir accepté de

corriger ce travail

Aux différentes personnes des services administratifs uLaval.

Pour terminer, un grand Merci à ma mère, à mes frères et mes sœurs, à mes amis pour

leurs aides, leurs amours, leurs pensées, leurs soutiens et leurs encouragements.

1

Chapitre 1 : La maladie de Friedreich

1.1 L’ataxie de Friedreich (FRDA)

1.1.1 Introduction générale

L’ataxie de Friedreich (FRDA) est la plus fréquente des ataxies héréditaires autosomiques

récessives [1] [2]. Cette maladie est la conséquence de la diminution du niveau de la

protéine frataxine dans les cellules jusqu’à 5-35 % par rapport aux taux normaux [3]. Les

porteurs asymptomatiques produisent environ 50% de la protéine frataxine [4]. Ce

déséquilibre est le résultat d’une mutation au niveau de 1er intron du gène FXN situé dans

le chromosome 9q13. Cette mutation se traduit par une hyper expansion du nombre de

répétitions du triplet GAA jusqu’à 1300 [3], par rapport aux personnes normales dont le

nombre des répétitions est compris entre 5 à 70 [5]. 98% des patients sont homozygotes

pour cette mutation, les autres cas ont une répétition du triplet GAA sur un allèle et une

mutation ponctuelle sur l’autre allèle [6] [7] [8]. Cette expansion du triplet GAA est due

à un déplacement du brin qui contient la répétition GAA, lors de la réplication de l’ADN,

pour former une structure secondaire qui contient un nombre élevé de répétitions GAA.

Cette anomalie génétique empêche le glissement de l'ARN polymérase, ce qui bloque la

transcription. Il y a aussi formation d’hétérochromatine ce qui rend silencieux le

promoteur du gène FXN, ce qui diminue l’expression de la protéine frataxine. La frataxine

est une protéine mitochondriale importante dans la régulation du fer et le métabolisme

cellulaire. La sévérité de cette anomalie est corrélée avec l’allèle qui a moins de

répétitions [3]. La maladie FRDA cause des impacts profonds sur la santé humaine,

présentés sous forme des différents symptômes qui apparaissent à partir de l'âge 10-15

ans et dure environ 25 ans conduisant à l'utilisation du fauteuil roulant [3]. Les symptômes

les plus marquants de FRDA sont des troubles de la coordination des mouvements, la

neuro-dégénérescence, la cardiomyopathie, la dérégulation de la glycémie avec diabète

sucré, l'atrophie optique, la perte auditive et l'apnée du sommeil [1] [2] [9] [6] [7]. Ces

symptômes sont dus au stress oxydatif (un évènement secondaire de la progression de

FRDA, qui cause le dommage des cellules des tissus ciblés) [1].

1.1.2. Historique

La maladie a été découverte par un médecin allemand, Nikolaus Friedreichentre 1863-

1877, comme une maladie héréditaire. C’est lui qui a identifié les premières

caractéristiques et décrit certains symptômes de FRDA. Quelques années plus tard, Mott

2

[10], a étudié la lésion du noyau dentelé chez un seul cas de FRDA, afin d’expliquer des

détails neuropathologiques de cette maladie. À partir des années 80, les études montrent

les liens entre FRDA, le déficit en frataxine ainsi que l’excès de fer. À ce jour, les rôles

précis de la frataxine dans la biogenèse de complexe fer-soufre (Fe-S), chaperonne de fer

et l’accumulation de fer au niveau des mitochondries des cellules restent inconnus [8].

Année

1863–1877 Friedreich publie des descriptions détaillées de la maladie FRDA [11].

1907 Mott [10] décrit des symptômes neuropathologiques d'un seul cas de

FRDA, y compris la lésion du noyau dentelé.

1957 Urich et al. [8] ont montré l'existence de lésions "suprasegmental" dans

FRDA.

1980 Lamarche et al. [12] ont découvert des granules contenant du fer dans les

cardiomyocytes des patients atteints de FRDA.

1996 Campuzano et al. [13] ont identifié la mutation commune chez des

patients atteints de FRDA, par la suite ils ont identifié la protéine

frataxine et son rôle dans le métabolisme du fer.

1997 Rötig et al. [14] ont découvert le complexe "fer-soufre" et la carence des

protéines (complexes I, II et III de la chaine de transport mitochondrial

d'électrons) et l’aconitase, dans les biopsies de l’endocarde des patients

FRDA.

2002 Mühlenhoff et al. [15] ont reconnu l'importance de la frataxine dans la

biogenèse du complexe fer-soufre (Fe-S). La déficience du complexe

Fer-S est un facteur critique dans la pathogenèse de FRDA.

Tableau 1: Historique de la découverte de la maladie de l'ataxie de Friedreich [8].

1.1.3 Incidence

La fréquence de la maladie FRDA est déterminée avec le développement de la biologie

moléculaire pour confirmer la mutation car souvent les patients ont un mauvais

diagnostique. Les études actuelles estiment qu’une personne sur 29 000 est atteinte de

cette maladie. Un homme et une femme sur 85 sont porteurs de la mutation. Ceci est une

augmentation par rapport aux anciennes statistiques indiquant qu’une personne sur

50 000 était atteinte par la maladie de FRDA et qu’une personne sur 110 était porteuse de

la mutation [16] [17].

3

La maladie de FRDA est fréquente en Europe, en Amérique, en Afrique du Nord, au

Moyen-Orient, et aux Indes. La maladie est particulièrement absente dans les populations

sahariennes et d'Extrême-Orient. Le nombre de personnes avec FRDA aux États-Unis est

estimé à 9000 [8].

1.1.4 Cause

La maladie FRDA est une maladie héréditaire autosomique récessive due à la

transmission de la mutation du gène FXN situé sur le chromosome 9 locus 13 (9q13),

issus de deux parents porteurs de la mutation. Les porteurs hétérozygotes pour le gène

muté n’ont pas de symptômes. La maladie s’exprime exceptionnellement sur deux

générations successives [2] [7].

1.2 FRDA et le stress oxydatif

Le stress oxydatif est le principal symptôme des conséquences cellulaires de la diminution

d’expression de la frataxine dans les cellules [9]. En général, c’est le résultat du

déséquilibre de la production des dérivés réactifs de l’oxygène (ROS, Reactive Oxygen

Species) qui dépasse le niveau de leurs défenses anti-oxydantes utilisées par la cellule

pour neutraliser et empêcher la production des ROS. Les ROS sont des produits

incomplets de la réduction d’oxygène avec l’eau pendant la respiration mitochondriale

par le métabolisme en aérobie cellulaire. Ils peuvent être l’anion superoxyde (O2-) et le

radical hydroxyle (OH) avec un électron des radicaux libres, ainsi que le peroxyde

d’hydrogène (H2O2). L’effet négatif des molécules ROS est l’oxydation des différents

composants cellulaires tels que les protéines, les lipides et l’ADN, pour favoriser des

maladies ou un vieillissement accéléré [2] [9] [18].

Dans le cas de FRDA, la diminution de l’expression de la frataxine provoque le

dysfonctionnement des complexes fer-soufre qui sont nécessaires pour la chaine

respiratoire mitochondriale, et l’augmentation de fer libre dans la matrice mitochondriale.

Ces anomalies favorisent la catalyse de la dismutation du superoxyde en dioxygène et

peroxyde d’hydrogène par la superoxyde dismutase, ce qui provoque les dommages de la

chaine respiratoire et la production de ROS. Donc la carence en frataxine pourrait rendre

la cellule plus susceptible aux dommages induits par le stress oxydatif. Ces dommages

induisent l’apparition des symptômes typiques de la maladie FRDA [2] [9] [19].

4

1.3 Symptômes cliniques de FRDA

Les patients touchés sont normaux à la naissance et pendant une période, jusqu'à l’âge

d'apparition des premiers symptômes (10-15ans) [3]. Les patients hétérozygotes peuvent

avoir des caractéristiques cliniques atypiques, avec une tendance à avoir moins de

dysarthrie que les patients homozygotes, mais ont une atrophie optique avec une plus

grande fréquence [8].

La réduction de l'expression de la frataxine dans les cellules cause plusieurs symptômes

(Tableau 2), qui touchent les organes les plus sensibles au stress oxydatif, comme le

système nerveux pour la dégénérescence et le cœur pour l’hypertrophie cardiaque.

L’absence totale de la biosynthèse de la frataxine provoque une létalité embryonnaire

chez les modèles murins de FRDA [2] [8].

Tableau 2: les principaux signes de la maladie de FRDA[20].

Les symptômes les plus souvent associés à la progression de la maladie FRDA sont des

symptômes neurologiques et des symptômes cardiaques.

1.3.1 Symptômes neurologiques

En général, le nombre de tri-nucléotides GAA dans l’intron 1 du gène FRDA est

inversement corrélé avec l’âge d’apparition de la maladie et directement corrélé avec la

sévérité des symptômes neurologiques [20] (des troubles de coordination des

mouvements, la perte des réflexes, et des troubles de l’équilibre) [9] [17]. Ces signes

commencent par une faiblesse des membres inférieurs chez la majorité des patients

5

FRDA, qui cause l’instabilité avec des chutes lorsqu‘ils sont debout ou lorsqu’ils

exécutent des mouvements. Par la suite les symptômes progressent aux membres

supérieurs et jusqu’à la tête [17].

La dégénérescence spinocérébelleuse cause la dysarthrie, la perturbation des réflexes

posturaux et l’hypotonie musculaire. L’atteinte corticospinale est responsable de

l’abolition des réflexes ostéotendineux et de l’apparition du signe de Babinski. D’autre

part, l’atteinte des cordons postérieurs permet la réduction de la sensation tactile et cause

des problèmes de proprioception [20].

D’autres symptômes neurologiques liés à la maladie de FRDA sont des douleurs, des

spasmes musculaires, l'atrophie optique et / ou une déficience visuelle chez 5 à 25% des

FRDA et la neuropathie auditive avec une déficience auditive [17].

1.3.2 Symptômes cardiaques

La cardiomyopathie hypertrophique est le symptôme cardiaque le plus commun. C’est le

second symptôme clinique important le plus commun dans deux tiers des patients [9]

[17]. Cette cardiomyopathie hypertrophique est la cause principale de décès précoces

chez 83,3% des FRDA. En général ce symptôme est moins fréquent chez les FRDA avec

le nombre de répétitions de triplet GAA très petit, et au début de la maladie [8] [17]. La

cardiomyopathie chez les patients FRDA est caractérisée par l’augmentation de

l’épaisseur de la paroi du ventricule gauche (due à l'hypertrophie des myocytes), qui cause

une insuffisance cardiaque et la mort. Cette hypertrophie est corrélée avec le nombre de

répétitions GAA dans l’allèle qui contient le moins de répétitions [3]. La détection de la

cardiomyopathie hypertrophique se fait par l’électrocardiographie et l’échocardiographie

[17], plus récemment par l'IRM et la spectroscopie 31P [8].

1.3.3 Autres symptômes cliniques

Un diabète sucré, présent chez 8-32% des FRDA [avec leur besoin en insuline], qui

requièrent de l’insuline, l’apparition du diabète est corrélée avec le nombre de répétitions

de GAA [8]. De plus, 60 à 80 % des patients de FRDA ont des complications

orthopédiques et 80% ont des malformations au niveau des jambes avec pied creux

bilatéral (Fig. 1) [17]. Plusieurs patients FRDA souffrent aussi d’une scoliose grave et

d’un mal de dos, en raison d'une combinaison de spasmes musculaires para-spinaux,

d’une déformation de la colonne, de malformations du squelette et d’une mauvaise assise

qui nuit au confort du patient même dans un fauteuil roulant (Fig. 1) [9] [17]. Le temps

6

moyen avant la nécessité d’utiliser un fauteuil roulant dépend de l'apparition des

symptômes (10 à 15 ans). L'espérance de vie moyenne des patients FRDA est de 25 à

36,5 ans [17].

Figure 1: Des signes classiques de FRDA:

Des pieds creux bilatéraux, des déformations de la colonne vertébrale et des malformations du

squelette. © ELSEVIER.INC.-NETTERIMAGES.com

1.4 Anatomopathologie

1.4.1 Neuropathologie (Fig. 4)

La neuropathologie de l’ataxie de Friedreich est caractérisée par une sévère atrophie des

ganglions de la racine dorsale (DRG), ce qui les rendent difficiles à reconnaitre lors de la

dissection. Cette lésion est causée par une destruction progressive des neurones les plus

grands et des axones myélinisés plus épais. La dégénération réduit principalement le

diamètre de la moelle épinière (Fig. 2), ou les voies spinocérébelleuses. Les cordons

postérieurs et les voies cortico-spinales sont atteints de façon constante [8] [9] [20].

Au niveau thoracique, la lésion implique les faisceaux graciles et cunéiformes dans la

même mesure, mais dans les segments du col utérin. L'apparence gélatineuse n'est pas

toujours en forme de coin, mais semble parfois comme un bouchon sur les colonnes

dorsales. La perte de fibres dans les domaines antérolatérales correspondant aux spino-

7

cérébelleuse et cortico-spinales peuvent également être visibles à l'œil nu (Fig. 2) [8] [9]

[20].

La dégénérescence cérébelleuse tardive est présente plus au niveau du noyau dentelé que

dans le vermis du cortex cérébelleux, cette lésion est variable d’un individu à l’autre (Fig.

3) [8] [9] [20].

Figure 2: La coupe transversale de moelle épinière d’un patient FRDA atteint au niveau du

cordon postérieur et le faisceau pyramidal (cordon latéral). (http://www.afaf.asso.fr/).

Figure 3: L’aspect des noyaux dentelés (DN) dans un patient FRDA [8].

(a) FRDA, (b) le contrôle normal. Les lignes interrompues indiquent l'emplacement approximatif

de la matière grise des noyaux dentelés. La petite taille du noyau dans le patient FRDA est particulièrement visible par la taille réduite de la zone marquée pour le fer (a). Le noyau dentelé

normal montre le ruban typique de méandres gris (b). Le produit de la réaction pour le fer ne se

localise pas avec la matière grise, mais se prolonge dans la substance blanche.

Les lésions de dégénérescence spinale diminuent la concentration de glutamate et de

glycine dans la substance grise de la moelle épinière (Fig. 2 et 3), et les lésions

de dégénérescence cérébelleuse causent la diminution des concentrations de l’acide

gamma-aminobutirique (GABA) et de glutamate dans les régions vermiennes et

hémisphériques du cervelet ainsi que la diminution des récepteurs des benzodiazépines

au niveau du noyau dentelé et de l’une des régions afférentes principales du cervelet. Il y

a une corrélation entre, la sévérité des symptômes, le dysfonctionnement métabolique et

http://www.afaf.asso.fr/

8

la diminution de la quantité de glucose utilisée. Également, il y a une diminution de la

concentration du cytochrome oxydase, l’enzyme mitochondrial impliqué dans la

phosphorylation oxydative dans cervelet [20].

Figure 4: L’anatomopathologie des cerveaux FRDA[21]. a) l’absence d’atrophie cérébelleuse après une année, b) une légère atrophie cérébelleuse après 10

ans, c) une atrophie cérébelleuse marquée après 20 ans.

1.4.2 Hypertrophique cardiaque

Les études montrent la présence d’une hypertrophie cardiaque par l’augmentation de

l’épaisseur de la paroi de ventricule gauche (due à l'hypertrophie des myocytes) (Fig. 5).

La cardiomyopathie dans les patients FRDA peut être concentrique, hypertrophique et

dilatée. Elle est caractérisée par des thrombus muraux dans le ventricule gauche et par

l’accumulation des granules riches en fer [8].

Figure 5: L’aspect brut du cœur dans les patients FRDA [8].

(a) L'hypertrophie cardiaque accompagnée de la décoloration du myocarde induit le rétrécissement des ventricules. (b) L'hypertrophie cardiaque affectant seulement la paroi

ventriculaire gauche et le septum interventriculaire induit une augmentation du ventricule droit.

1.5 Frataxine

1.5.1 Gène de la frataxine (FXN)

Le gène de la frataxine (FXN) situé sur le chromosome 9q13, contient cinq exons et 4

introns, avec 3 dinucléotides CpG (sites de méthylation) [2] [22]. Le premier intron

contient la répétition du triplet GAA jusqu’à 70 pour les personnes normales (Fig. 6) [22]

9

[23], et de plus de 100 jusqu'à 1300 répétitions pour les cas de FRDA [3]. Cette répétition

bloque la transcription et cause une modification épigénétique qui réduit l’activité du

promoteur du gène FXN [3] [22].

Figure 6: La représentation moléculaire du gène FXN (entre chaque 2 exons il y a un intron)

[22].

Le promoteur du gène FXN contient des sites de liaisons pour 4 facteurs de transcription

majeurs (TSS1 (Transcription Start Site 1), TSS2 (Transcription Start Site 2), TFAP2

(transcription factor Activator Protein 2) et EGR3 (Early Growth Response Gene)). Les

2 premiers sont situés en amont du site d’initiation de la traduction à une distance de 221

pb et de 60 pb de la région du promoteur intro\PDE. Le 3eme facteur TFAP2 est situé entre

les sites d’initiation de la transcription, TSS1 et TSS2, et le 4eme facteur EGR3 se localise

au niveau de l’intron 1. Il existe également une séquence E-box qui régule l’expression

des gènes dans les neurones et dans les muscles (Fig. 7) [22].

Figure 7: Les principaux sites régulateurs du gène FXN [22].

1.5.2 La protéine de la frataxine

La frataxine est une protéine hautement conservée de la bactérie à l'homme. Elle est le

résultat d'un transcrit de 1.3 Kb. Elle est destinée à la mitochondrie sous forme d'un

précurseur de 23 kDa (forme intermédiaire de 210 AA). Après un clivage enzymatique,

elle se localise à l’intérieur de la mitochondrie sous une forme active de 14 kDa [2] [8].

L'emplacement de la frataxine peut être proche ou dans la membrane mitochondriale

interne, suggérant qu’elle peut jouer plusieurs rôles dans le métabolisme et la production

d’énergie cellulaire. Elle pourrait donc être impliquée dans le transport du fer à travers la

10

membrane mitochondriale ou dans le transport d'électrons par des complexes fer-soufre

[2] [7] [8].

1.5.3 La fonction de la frataxine

La fonction principale de la frataxine est encore controversée, bien que les différentes

recherches montrent que cette protéine peut intervenir dans plusieurs fonctions cellulaires

(Fig. 8) [1] [2]:

• Régulation du fer dans les mitochondries

• Régulation du métabolisme cellulaire dans les mitochondries

• Homéostasie du fer intracellulaire

• Biogénèse de l’hème

• Catalyse enzymatique

• Régulation des gènes

• Empêche l’accumulation de fer

• Désintoxication

• Activité chaperon de fer

• Assemblage des complexes fer-soufre dans la mitochondrie et dans le

compartiment extra-mitochondrial

• Empêche la génération de stress oxydatif

Figure 8: La localisation de la frataxine dans la mitochondrie et dans le cycle de la

production d’énergie.

(Adapté de www.grand-est.inserm.fr). La protéine frataxine peut intervenir dans plusieurs fonctions cellulaires au niveau de la

mitochondrie, telle que : la régulation du métabolisme cellulaire, la biogenèse de l’hème, et la

catalyse enzymatique.

http://www.grand-est.inserm.fr/

11

1.5.4 L’absence de la frataxine

La diminution de la production de la frataxine dans les cas de FRDA peut causer différents

problèmes dans la cellule [2] (Fig. 9) :

• Déficiences enzymatiques mitochondriales telles que l’aconitase et les complexes

I, II et III des mitochondries,

• Empêche la biosynthèse du complexe fer-soufre

• Problème dans la respiration mitochondriale

• Problème de la production d’ATP

• Fer libre et l’accumulation de fer mitochondrial

• Augmentation de la production des ROS dans la mitochondrie

• Dommage oxydatif qui inactive les enzymes mitochondriaux et induit la

production d’autres radicaux libres

Figure 9: La dérégulation de la chaine respiratoire et le cycle de la production d’énergie en

absence et en diminution de l’expression de la frataxine dans la mitochondrie.

(Adapté de www.grand-est.inserm.fr).

L’absence ou la diminution de la protéine frataxine dans la mitochondrie peut induire différents problèmes au niveau de ce dernier, tel que; le stress oxydatif, l’accumulation de Fer dans la

mitochondrie et la dérégulation de la chaine respiratoire.

1.6 Déficience moléculaire de la FRDA

L’hyper-expansion de la répétition GAA au niveau de l'intron 1 provoque la mise sous

silence de la transcription par la formation des structures anormales d'ADN (triplex ou

ADN collant), la formation d'un hybride ADN-ARN, ou la formation d'hétérochromatine.

Le triplex (ADN collant) formé par la séquence de longue répétition GAA provoque aussi

des instabilités génétiques et des recombinaisons génétiques [7] [24].

http://www.grand-est.inserm.fr/

12

1.6.1 Formation d’ADN collant (Sticky DNA)

La répétition GAA peut provoquer la formation d’une structure d’ADN de triple hélice

(ADN triplexes ou Sticky DNA) due à l’association de deux brins ayant la répétition GAA

et d’un brin ayant la répétition TTC (Fig. 10). La structure de l’ADN triplex inhibe la

transcription en piégeant l’ARN polymérase hors de la transcription des séquences

répétées triplet GAA [7] [24].

Figure 10: Une présentation schématique de la forme d’ADN anormal dans le cas de FRDA.

En haut l’ADN triplex et en bas l’ADN collant [24].

1.6.2 Formation d’hybride RNA-DNA

Lors de la transcription des séquences répétées GAA, un hybride ARN-ADN est formé

au cours de déplacement de l'ARN-polymérase et avec le sur-enroulement négatif de

l'ADN derrière l'ARN-polymérase. Le brin non-transcrit se replie alors en arrière pour

former un triplex d'ADN. Le nouvel ARN naissant s’hybride au brin matrice formant un

hybride ARN-ADN (Fig. 11) [7] [24].

13

Figure 11: La formation d’hybride RNA-DNA dans le cas FRDA [24].

A) La transcription au niveau de la répétition GAA, B) formation un triplex d'ADN par le brin non-transcrit et le double brin d’ADN au niveau de la répétition GAA, C) et D) formation de

l’hybride ADN-ARN.

1.6.3 Changement d’épigénétique

L’expression du gène FXN chez les patients FRDA, peut être affectée par les différents

changements épigénétiques au niveau de l’ADN, tel que la méthylation de l’ADN et des

modifications des histones, à cause de la répétition du triplet GAA au niveau de l’intron

1 du gène FXN. Dans certaines cellules des FRDA, il y a plus de méthylation des résidus

CpG en amont de la répétition et moins de méthylation en aval de la répétition par rapport

aux cellules saines. Des études sur l’analyse des modifications des histones par ChIP et

qPCR ont montré que dans cette anomalie de FRDA il y a aussi une diminution du niveau

de l’acétylation des lysines 9 et 14 de l’histone H3 et une augmentation de triméthylation

de H3K9. Des chercheurs ont également prouvé que le niveau de formation

d'hétérochromatine est augmenté beaucoup plus avec un nouveau transcrit antisens

(FAST-1) du gène FXN, en tant que médiateur de la formation de l’hétérochromatine [3]

[7] [25].

1.7 Diagnostic de FRDA

Les maladies génétiques sont généralement difficiles à diagnostiquer en utilisant

seulement leurs symptômes, car de nombreuses maladies peuvent partager des

symptômes similaires. Par exemple, 3 maladies, l’Ataxie avec déficience en vitamine E,

A-lipoproteinaemia et la maladie de Refsum, ont des symptômes semblables à FRDA.

Afin de diagnostiquer plus précisément la maladie FRDA, il existe des tests de diagnostic

14

moléculaire qui sont utilisés pour confirmer et détecter la présence de la mutation de gène

FXN qui est différente des autres maladies génétiques ayant des symptômes similaires.

Les techniques de diagnostic qui peuvent être utiles, dans le cas de la maladie FRDA,

comprennent des procédés et des outils qui sont basés sur l'analyse de l'ADN, ainsi que

l'analyse des niveaux d'ARNm et de protéine frataxine [7]. Ces techniques permettent

aussi de détecter des répétions du triplet GAA dans le premier intron du gène FXN, ces

techniques sont basées sur des réactions PCR, RT-PCR ou Southern/Norton blot [7].

1.7.1 PCR

La PCR utilise des amorces qui flanquent la région d'intérêt afin de l’amplifier. Les

produits de PCR peuvent ensuite être analysés en utilisant une électrophorèse sur gel

d'agarose ou d'autres techniques. Cependant, la limite majeure de cette technique et la

taille du fragment à amplifier (3-4 kb). Par conséquent, il peut être difficile d'amplifier un

allèle contenant une très grande répétition de GAA par une PCR classique. D'autres

techniques basées sur la PCR sont explorées afin de trouver des méthodes efficaces pour

le diagnostic moléculaire de FRDA [7].

1.7.2 Triplet-repeat (TP-PCR)

Le Triplet-repeat PCR (TP-PCR) est évalué comme méthode de dépistage pour FRDA.

Cette technique a été développée par J P Warner et al, 1996 [26], afin d'identifier

l'expansion de répétition CAG de la dystrophie myotonique de Steinert. Elle utilise un

ensemble de trois amorces pour amplifier la région contenant la répétition, afin de

déterminer leur taille exacte (Fig. 12) [7].

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Warner%20JP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9004136

15

Figure 12: Schéma représentatif des différents produits d’amplification avec 3 amorce dans

Triplet-repeat (TP-PCR) [7].

1.7.3 RT-PCR quantitatif en temps réel (qRT-PCR)

La RT-PCR est une méthode alternative de diagnostic de FRDA, elle permet de quantifier

des niveaux d'ARNm du gène FXN, en utilisant une PCR quantitative en temps réel

spécifique, qui mesure les produits de PCR amplifiés générés au cours de chaque cycle

du processus de PCR sur l’ADNc, produit par transcription inverse de l'ARNm du gène

FXN. Le niveau d’ARNm chez les patients FRDA est inférieur au niveau d’ARNm des

individus sains. Avec une forte corrélation inverse entre les niveaux d’ARNm du gène

FXN et le nombre de répétitions GAA [3] [7] [27].

1.7.4 Southern Blot

La technique Southern Blot permet la détection de molécules spécifiques d’ADN dans un

mélange séparé par un gel. Lors de cette technique, l'ADN extrait, puis purifié, est digéré

par des enzymes de restriction, les fragments obtenus sont séparés par une électrophorèse

sur gel d’agarose, puis transférer sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon, les

séquences des fragments d’ADN d’intérêt sont détectées dans la membrane par

hybridation moléculaire avec des sondes marquées d'acides nucléiques (Département de

biochimie, Université d’Oxford, 2006) [7].

Le Southern Blot a été utilisé comme test moléculaire, de dépistage des patients FRDA,

pour détecter l’expansion du triplet GAA du gène FXN[7].

1.8 Thérapie

1.8.1 Principe et le but des traitements de FRDA

Actuellement il n’existe aucun traitement (thérapie) curatif connu pour FRDA. Par

conséquent, la plupart des traitements potentiels sont encore en phase d’essais cliniques

16

en France, aux États-Unis et au Canada. Ils visent la réduction et la gestion des symptômes

pour ralentir la progression de la maladie en :

• Aidant les mitochondries à mieux fonctionner

• Réduisant les contraintes imposées à la mitochondrie

• Vérifiant si les fonctions normalement effectuées par la frataxine peuvent être

remplacées par d’autres protéines.

• Utilisant des anti-oxydants

• Augmentant le niveau de la frataxine par l’utilisation des histones désacétylases

(HDAC), l’interferon gamma (montré dans les deux modèles cellulaires et animaux

de l'ataxie de Friedreich), l’érythropoïétine (EPO) (hormone produite dans le corps

pour augmenter le nombre de globules rouges)

• Travaillant sur le développement de thérapies basées sur la livraison systémique des

protéines ou des gènes exprimant la protéine frataxine capables de corriger la

mutation du gène FRDA

1.8.2 Exemple des thérapies

1.8.2.1 Idébénone

L'idébénone est une molécule de type quinone permettant le transport des électrons dans

la membrane interne de la mitochondrie. C’est un antioxydant qui protège contre les

lésions oxydatives. Il est en phase d’essais en Europe. Son effet est variable selon les

patients, ce médicament permet de protéger les constituants cellulaires contre l’action

pro-oxydante du fer. In vivo, il peut réduire l’hypertrophie des parois du myocarde, la

fatigabilité, la chélation de fer et l'amélioration des mouvements fins chez certains

patients. Cependant, une amélioration significative de l’ataxie n’a pas été obtenue par ce

traitement (http://www.afaf.asso.fr/).

Bien que le site d’Ataxie Canada, a annoncé en Juin 2014, que Santé Canada avait

approuvé avec conditions le SNT-MC17/l’idébénone pour le traitement de l’ataxie de

Friedreich, cette permission a depuis été retirée.

Aux États-Unis, l’essai clinique de phase III IONA (Idebenone effects On Neurological

ICARS Assessments) est en cours sur plus 50 patients selon leur disponibilité.

(Http://lacaf.org/fr/tag/idebenone/).

http://www.afaf.asso.fr/

17

Ce traitement produit par le groupe Pharmaceutique Takeda (Japon), et commercialisé

par le laboratoire Santhera dans l’Union Européenne, en Suisse, en Amérique du nord

sous le nom de Catena, Raxone ou Sovrima (http://www.kjer-france.org/).

1.8.2.2 Inhibiteurs des histones désacétylases (HDACi)

Les inhibiteurs des histones désacétylases (HDACi) de la classe III activent le gène FXN

dans plusieurs modèles de FRDA, par une réduction de H3K9me3 et H3K27me3. Ceci

permet une accessibilité accrue de la DNase I, et l’induction d’histones acétylés de la

chromatine (Fig. 13). Ce traitement peut augmenter de 67% de l’expression de la

frataxine, en réactivant le contrôle épigénétique du gène FXN traité [1] [28] [29] [30].

Figure 13: Présentation de la structure d’euchromatine (gène actif) et de la forme l’hétérochromatine (gène silencieux) [28].

Selon la Figure 14, l’histone acétylée change l’organisation des nucléosomes, et active le

gène FXN. Une longue répétition de GAA chez les patients FRDA conduit à la formation

de l’hétérochromatine méthylée (gène non actif), avec la condensation des nucléosomes,

qui va bloquer le recrutement du complexe transcriptionnel et réduire l’accessibilité de

DNaseI (Fig. 14) [28] [29] [30].

1.8.2.3 La protéine frataxine exogène

L’administration de la protéine frataxine exogène, fusionnée au peptide trans-activateurs

de la (TAT) pour transduction aux mitochondries des cellules de FRDA in vitro et in vivo.

TAT-FXN (Fig. 14) injecté réduit la caspase-3, qui est activée à cause du stress oxydatif

chez des cellules de FRDA. Chez les souris injectées, TAT-FXN (Fig. 14) augmente la

vitesse de croissance et la durée de vie moyenne de 53% après la diminution des

symptômes cardiaque, elles augmentent aussi l'activité de l'aconitase dans les

mitochondries [31].

18

Figure 14: Les domaines de Tat-FXN protéine de fusion [31].

TAT de côté 5’ sous forme précurseur de la ADNc de hFXN, avec un promoteur T7 et His6 pour

la purification par chromatographie d’affinité

1.8.2.4 Thérapie génique

Actuellement, il existe plusieurs stratégies de thérapie ‘moléculaire’ en phase de

recherche pour traiter la maladie FRDA, on trouve :

-L’administration du gène de la hFXN in vivo, pour ré-exprimer le taux normal de la

frataxine dans les cellules de FRDA à l’aide d’un vecteur viral, AAV sérotype 9 pour

livrer hFXN humaine par la voie intrapéritonéale dans des souris modèles de la FRDA

(NSE-Cre et MCK-Cre), différentes doses d’injection ont été testées pour optimiser celle

qui permettra de doubler la durée de vie de souris FRDA traitées et permettant de

diminuer les ou certains des symptômes de FRDA. Les résultats d’ELISA dosage

d'immuno-absorption par enzyme liée montrent la présence de la frataxine dans les

organes les plus touchés par la maladie FRDA, le cœur, le cerveau, les muscles, les reins

et le foie [32].

-L’augmentation de l’expression de la frataxine à l’aide de AAV-TALE-FT. Le FT est un

domaine d’activation de la transcription (ex. VP64) (Fig. 15), qui permet de recruter le

complexe transcriptionnel et d'activer la transcription du gène, ce domaine d’activation a

été fusionné avec TALE (Le nucléase effectrice de type activateur de transcription), une

protéine de liaison à l’ADN ciblant la région régulatrice du gène de FXN. Les premiers

résultats montrent que le domaine d’activation VP64 augmente l’expression de la protéine

jusqu’à 2 fois dans des cellules de fibroblastes de patients de FRDA, in vivo le TALE-

VP64 a été livré à l’aide du AAV9. Le AAV9-TALE-VP64 injecté par voie

intrapéritonéale dans des souris YG8R (les souris modèles de FRDA), augmente

l’expression de la protéine dans 3 organes (le cœur, les muscles et le foie), cette approche

thérapeutique reste un traitement potentiel de FRDA qui nécessite d’être développée dans

le futur [33] [34].

19

Figure 15: Présentation de la structure moléculaire de complexe TALE-FT Le TALE fusionné avec le domaine d’activation de la transcription VP64 (a) et p65 (b) a été fait

dans le plasmide pCR3.1 pour but d’induction le gène endogène FXN [33] [34].

Toutefois l’approche par l’édition du génome (Genome Editing) avec les technologies

CRISPR/Cas9 et TALEN (transcription activator-like effector nuclease) pour corriger in

vitro et in vivo les mutations au niveau du gène FXN, est une approche prometteuse pour

ce type de maladie.

1.9 Modèles animaux et cellulaires de FRDA

Les chercheurs ont mis au point des modèles cellulaires et animaux, d’une part pour

mieux comprendre l’aspect et les mécanismes moléculaires et biochimiques de la maladie

de FRDA et, d’autre part, pour développer des stratégies thérapeutiques. Ces modèles

sont des mammifères les plus proches physiologiquement et génétiquement des patients

FRDA humains. Ils existent des modèles de FRDA favoris qui diffèrent par leurs

avantages et leurs inconvénients [35].

Un bon modèle de FRDA devrait avoir un niveau très réduit de la frataxine, c’est pourquoi

les cellules directement issues de patients FRDA sont les candidats idéals en tant que

modèle cellulaire. Le modèle animal, quant à lui, devrait avoir des signes cliniques de la

FRDA, à savoir des neuro-dégénérescences ainsi que la cardiomyopathie observée chez

les patients FRDA.

20

1.9.1 Modèle Animaux

1.9.1.1 Souris MCK et souris NSE

Ce sont des modèles de souris transgéniques caractérisées par l’équipe de Dr. Puccio en

générant des souris knock-out (KO) conditionnelles, par la délétion du gène FXN dans

des tissus spécifiques à l’aide du système Cre-LoxP(Fig. 16) [36].

Figure 16: Présentation schématique de la génération des souris MCK et des souris NSE [35].

Souris knock-out conditionnelle pour la frataxine (FXN) dans quatre différents tissus spécifiques

pour générer la souris MCK-Cre ou la souris NSE-Cre, en utilisant deux promoteurs différents

pour exprimer Cre-recombinase induisant l’excision de l’exon 4.

1.9.1.1.1 Souris MCK

C’est un modèle de souris knock-out conditionnelle généré par l’utilisation de système

Cre-LoxP (Fig. 17). Ces souris expriment la Cre-recombinase sous contrôle du promoteur

kinase musculaire de créatine (MCK, « Muscle Creatine Kinase »). Elles sont

caractérisées par une cardiomyopathie hypertrophique, une lésion spino-cérébelleuse

progressive, une ataxie sensorielle et certains aspects du diabète, avec déficience des

complexes fer-soufre (l'aconitase, succinate déshydrogénase) en plus d’une accumulation

de fer dans les mitochondries. Elles présentent des caractéristiques biochimiques de

FRDA avec l’absence de stress oxydatif [35] [36].

1.9.1.1.2 Souris NSE

C’est un modèle de souris knock-out conditionnelle utilisant le promoteur de l’énolase

neuronale (NSE, « Neuron Specific Enolase ») pour exprimer la Cre-recombinase dans

les neurones (Fig. 17). Néanmoins, dans ces souris, la Cre-recombinase s’exprime

21

également dans le cœur et le foie. L’expression de la Cre-recombinase va causer la

cardiomyopathie et la neuropathologie typique de FRDA, avec un aspect de l’ataxie

progressive et de l'accumulation de fer dans les mitochondries. La cardiomyopathie

observée dans ces souris est similaire à celle des mutants MCK, avec un ventricule gauche

défectueux dilaté. Les souris NSE ont deux limitations principales : (1) phénotype très

sévère (avec une espérance de vie d’une moyenne de 25 jours), et (2) des caractéristiques

non représentatives dont les lésions spongiformes dans le cortex à cause d’une carence de

la frataxine dans les mitochondries [35] [36].

1.9.1.2 Souris knock-in

1.9.1.2.1 Souris KIKI et souris KIKO

Ce sont des modèles de souris qui ont été générés à l’aide de l’approche knock-in, en

introduisant une expansion de 230 répétitions GAA dans le premier intron du gène FXN

des souris knock-in homozygotes (KIKI). Cette mutation induit une diminution de la

production de la frataxine atteignant jusqu’à 66-83%. Le croisement de KIKI avec des

souris knock-out pour le gène FXN, donne naissance à des souris hétérozygotes KIKO

avec une diminution de la production de la frataxine jusqu’à 25-36%. Les souris KIKI

développent des signes de neuro-dégénérescence associés à des signes de

cardiomyopathie. Par contre, les souris KIKO n’ont pas d’accumulation de fer dans les

mitochondries, et ne présentent aucun signe de fibrose dans le cœur ni de défauts de

coordination et pas de phénotypes cardiaques et neurologiques (Fig. 17).

Figure 17: Représentation schématique de la génération des souris KIKI et KIKO [35].

La souris KIKI a été générée par l'insertion de la séquence de 230 GAA dans le premier intron du

gène endogène de FXN. La souris KIKO résulte de croisement entre des souris KIKI avec des souris hétérozygotes knock-out pour le gène FXN.

22

1.9.1.2.2 Souris YG8R et souris YG22R

Ce sont des modèles de souris qui ont été obtenus par l’utilisation des vecteurs YAC pour

introduire des répétitions GAA exogènes humaines dans locus du gène FXN. Ainsi, les

souris obtenues sont les souris YG8 avec deux transgènes en tandem ayant respectivement

des séquences de 90 et 190 GAA répétitions et les souris YG22 avec un seul transgène

d’une séquence de répétition de 190 GAA. Par la suite ces lignées des souris ont été

croisées avec des souris hétérozygotes knock-out pour gène FXN afin d’obtenir les souris

YG8R et YG22R (Fig. 18).

Ces dernières contiennent des répétitions GAA du gène FXN humain avec l’inactivation

du gène FXN endogène de souris. Les deux modèles ont une diminution d'ARNm de FXN

dans tous les tissus, surtout dans le cervelet (62% pour les souris YG22R, et 57% pour

les souris YG8R) et dans le muscle squelettique (57% pour les souris YG8R). Leurs

phénotypes de FRDA sont progressifs dans des deux modèles avec des signes de stress

oxydatif dans leurs tissus. L’absence de signes cardiaques observés dans les souris

YG22R s’accompagnent avec une diminution de l'activité d’aconitase cardiaque dans les

souris âgées de 6 mois. La différence entre les souris YG8R et YG22R se situe au niveau

des sites d’intégrations du YAC [35] [36].

23

Figure 18: Représentation schématique de la génération des souris YG8R et les souris YG22R [35].

Les souris YG8R et YG22R ont été générées par l’addition des séquences humaines de répétitions

GAA dans le gène FXN endogène à l’aide de YAC pour générer des souris transgéniques (YG8 et YG22), croisement de ces dernières avec le modèle de souris hétérozygotes knock-out pour le

gène FXN donne des souris YG8R et YG22R qui contiennent respectivement deux ou un seul

transgène FXN humaine contenant une répétition GAA.

1.9.2 Modèle des cellules FRDA : fibroblastes, lymphoblastes et les cellules iPSC

dérivées de patients FRDA

Les cellules issues de patients FRDA sont le modèle cellulaire le plus représentatif de

cette maladie, car elles portent le gène FXN complet avec la répétition GAA qui cause

une diminution de l’expression de la frataxine. Ces cellules sont des fibroblastes primaires

ou des lymphoblastes qui sont très accessibles, mais elles ne présentent pas le phénotype

biochimique des complexes associés à FRDA malgré la diminution de la synthèse

d’ARNm du gène FXN et l’expression de ce dernier. Ces fibroblastes sont les plus utilisés

pour développer des traitements pour la maladie FRDA. Cependant, les neurones et les

cardiomyocytes sont les cellules les plus favorisées, puisqu’elles sont les plus affectées

par les symptômes de FRDA, pour cela elles sont les plus intéressantes à étudier. Il existe

en outre une lignée de cellules reprogrammées à partir de fibroblastes de la peau de

patients de FRDA (par Oct4 / Sox2 / Klf4 / c-Myc ou Oct4 / Sox2 / Lin28 / Nanog) pour

obtenir des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) qui peuvent donner la naissance

24

de tous les types cellulaires telles que les neurones et les cardiomyocytes. Ces cellules

contiennent la répétition GAA typique des patients FRDA induisant la diminution du taux

d’ARNm du gène FXN, mais elles ne présentent pas le phénotype biochimique de FRDA

[35] [36].

25

Chapitre 2 : Thérapie génique

2.1 Définition

La thérapie génique est une approche thérapeutique visant à « corriger ou supplémenter »

la séquence d’un gène responsable d’une maladie. De façon succincte, les buts principaux

de la thérapie génique sont (Genetics Home Reference - https://ghr.nlm.nih.gov/ Gene

Therapy, 2016) :

• Remplacement d'un gène muté qui cause la maladie génétique avec une nouvelle copie

saine.

• Inactivation par knock-in et knock-out un gène muté qui fonctionne mal.

•Introduction d'un nouveau gène dans le corps pour lutter contre une maladie.

2.2 Différents types de thérapie génique

Il existe deux types de thérapie génique qui sont décrits selon Misra et al, en 2013 [37] à

savoir la thérapie génique somatique et la thérapie génique germinale.

2.2.1 Thérapie génique somatique

C’est une thérapie avec but de traiter une génération d’être vivant sans transmettre la

correction à leur descendance. C’est donc une thérapie qui ne cible pas les cellules

germinales. Il y a deux types de thérapies somatiques [37]:

2.2.1.1 In vivo

C’est l’introduction directe du gène thérapeutique dans l’organisme vivant par la voie

intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire ou alors par l'administration in situ

directement dans des cellules cibles de l’organisme. La limite majeure de cette technique

est l’effet secondaire du reste de vecteur de livraison et la réponse immunitaire (Fig. 19)

[37].

2.2.1.2 Ex vivo

Ce type de la thérapie génique somatique est basé sur une combinaison de thérapie

génique et cellulaire et se déroule en 3 étapes (Fig. 19).

1 - Prélever et cultiver des cellules cibles ayant une anomalie génétique de l’organisme

vivant.

2 - Introduire le gène d’intérêt dans les cellules prélevées pour la thérapie génique in vitro

26

3 - Réimplanter les cellules traitées par thérapie génique in vitro de nouveau dans

l’organisme vivant (thérapie cellulaire).

Cette technique très spécifique permet de cibler des cellules bien déterminées sans avoir

une réponse immunitaire. La limite majeure de cette technique est la toxicité associée à

la méthode de transduction et le rendement parfois limitée de ce type de manipulation

[37].

Figure 19: Présentation des différences majeures entre thérapie génique in vivo et ex vivo

http://www2.cnrs.fr/image.php?id_media=1366&id_site=18 (Illustration de Journal du CNRS,

d'après Catherine Caillaud).

2.2.2 Thérapie génique germinale

C’est une thérapie génique qui cible les cellules germinales ou l’embryon au stade

précoce. Par utilisation de micro-injection directement dans la cellule cibles, pour changer

le patrimoine génétique qui sera transmis à toutes les cellules de la future descendance

[37].

2.3 Moyens de livraison du gène d’intérêt

2.3.1 Les vecteurs

Les vecteurs sont caractérisés par leurs capacités d’introduire et d’exprimer un gène

d’intérêt dans une cellule cible [37].

Les différents avantages d’utilisation des vecteurs sont :

• Cout de la production faible,

• Facilité de production,

http://www2.cnrs.fr/image.php?id_media=1366&id_site=18

27

• Faible immunogénicité,

• Faible toxicité et pouvoir pathogène,

• Capacité de transduire et cibler des différents types cellulaires,

• Capacité de livrer des longues séquences d’ADN,

• Expression permanente du gène d’intérêt.

Il existe deux types de vecteurs qui sont utilisés dans la thérapie génique : les vecteurs

viraux et les vecteurs non viraux.

2.3.2 Les vecteurs viraux

Ces vecteurs les plus utilisés dans la thérapie génique, après élimination de tout le matériel

génétique responsable de leurs pouvoirs pathogènes, pour les remplacer par des séquences

adaptées aux cellules mammifères et des gènes d’intérêt. Ils sont caractérisés par leur

capacité à transduire la majorité des types cellulaires. La livraison et la réplication du

gène d’intérêt se font directement dans les cellules cibles, après l’injection des vecteurs

viraux dans un organisme ou après l’infection des cellules en culture par des vecteurs

viraux. Ceci va permettre par la suite la réplication et l’expression du gène d'intérêt dans

les cellules cibles. Les limites majeures d’utilisation des vecteurs viraux sont leur

immunogénicité et le risque d’induire une pathologie suite à une mutation du génome de

l’hôte [37].

Il existe plusieurs types des vecteurs viraux qui diffèrent par leurs avantages et leurs

inconvénients. Les plus connus sont :

2.3.2.1 Adénovirus

Ils appartiennent à la famille des adénoviridae, genre mastadénovirus. Ce sont des virus

contenant un ADN double brin formant un génome linéaire non segmenté de 26 à 45 kb.

La taille du virus est de 90 à 120 nm avec une capside icosaédrique (formées de 13

protéines). Il existe, plus de 100 sérotypes. Cinquante-un d’entre eux infectent l’Homme.

Le sérotypes 5 est le plus utilisé dans la thérapie génique [38].

Les adénovirus sont très efficaces pour la thérapie génique, grâce, à leur capacité de

transduire des cellules quiescentes. Ils ne risquent pas d’induire une mutation, car ils sont

non intégratifs. Cependant à cause de cette caractéristique, l’expression du transgène est

non permanente (dure seulement quelques semaines). Les adénovirus sont capables de

transporter un long fragment d’ADN d’intérêt (jusqu’à 7,5 kb). Ils sont faciles à manipuler

par des techniques de biologie moléculaire pour produire des titres élevés.

28

Plusieurs études sont faites pour améliorer le tropisme des adénovirus, la propriété

responsable de l’infection à travers la membrane cellulaire de l'hôte et réduire la réponse

immunitaire [39].

2.3.2.2 Virus adéno-associé

Les virus adéno-associé (AAV, « Adeno-Associated Virus »), sont les vecteurs viraux les

plus utilisés pour la thérapie génique. Ils sont de petite taille (25 nm) et sont non

enveloppés. Ils contiennent un ADN simple brin linéaire et appartiennent à la famille des

Parvoviridae et au genre Dependovirus. Leur réplication ne se produit qu’en présence

d'un virus auxiliaire, soit d'adénovirus ou virus de l'Herpès [40].

Le génome viral du AAV est environ de 4,7 kb de longueur. Il contient deux répétitions

terminales inversées qui flanquent des deux gènes Rep et Cap. Ces deux gènes codent

pour des protéines qui facilitent la réplication virale et l'assemblage de la capside grâce à

un épissage alternatif. Le gène Rep se traduit en quatre protéines en chevauchement

(Rep78 / Rep68 et Rep50 / Rep42), qui sont essentielles pour la réplication virale,

l'intégration, la régulation transcriptionnelle et l'assemblage des virus. Le gène Cap code

pour trois protéines structurales (VP1, VP2 et VP3). L'auto-assemblage des virus dans un

diamètre de 26 nm de particules icosaédriques par une protéine d'assemblage d'activation

(AAP) contribue à la formation de la capside. Les répétitions terminales inversées

contiennent des séquences palindromiques formant une structure en épingle à cheveux

sous forme de T, qui connecte avec des sites de liaisons spécifiques pour les protéines

Rep. Elles sont les seuls éléments en cis nécessaires à l'encapsidation virale. En

conséquence, Rep et Cap peuvent fonctionner en Trans pour soutenir l'assemblage des

virions et la production des vecteurs utiles pour la recombinaison génétique (Fig. 20) [41].

29

Figure 20: La structure et l'organisation du génome du virus adéno-associé (AAV) [41].

Figure 21: Cycle de vie de l’AAV [40].

Il y a deux étapes du cycle de vie de l'AAV après une infection réussie, une étape lytique

et une étape lysogène. La phase lytique se découle en présence d'un virus auxiliaire: un

adénovirus ou un virus herpès (Fig. 21). Ces derniers fournissent différents gènes qui

jouent un rôle d'assistance et un rôle dans la régulation d'expression des gènes cellulaires,

en fournissant un milieu intracellulaire permissif pour une infection productive de l'AAV.

En l'absence d'adénovirus ou du virus de l'herpès, la réplication d’AAV est très limitée,

l'expression des gènes viraux est réprimée, et le génome de l'AAV peut établir une latence

par l'intégration dans une région chromosomique [40].

Il y a plusieurs avantages qui favorisent l’utilisation de l’AAV en tant que véhicule pour

des applications en thérapie génique. Ceux-ci comprennent l'absence de la pathogénicité

et de toxicité du virus, sa persistance, sa disponibilité sous différents sérotypes (plus d’une

centaine de sérotypes), ainsi que sa capacité à se fixer et à entrer dans la cellule cible avec

30

un transfert réussi vers le noyau, et d'être exprimé dans le noyau pendant une période de

temps prolongée. En plus, des modifications et des développements ont permis

d’améliorer l’utilité de l’AAV dans le monde thérapeutique sans pouvoir pathogène et

d’augmenter sa persistance. Ces éléments ont conduit à la construction des vecteurs

pAAV qui ne codent pas pour Rep et qui manquent de cis-actif EEI (nécessaire pour

l'intégration au site spécifique), avec des deux ITR nécessaires pour l'assemblage [40].

Le développement d’un vecteur rAAV pour la thérapie génique a été basé principalement

sur le pouvoir de transduire des cellules des différents tissus tels que les muscles, le foie,

le cerveau, la rétine et les poumons en plusieurs semaines d’infection. L'efficacité de la

transduction est dépendante de l'efficacité de chaque étape de l'infection par AAV, la

liaison, l'entrée, le trafic viral, l’entrée nucléaire et la synthèse du second brin [40].

Le plus grand défi de ces vecteurs AAV est la réponse immunitaire des cellules de l’hôte.

En effet les cellules T cytotoxiques peuvent éliminer les cellules infectées et empêcher la

ré-administration du vecteur par la production d’anticorps [40].

2.3.2.3 Retroviridae

Les rétrovirus sont des complexes des virus d'ARN simple brin, enveloppés avec un

génome diploïde ssRNA. Ils ont la caractéristique typique de s’intégrer dans l'ADN de

l'hôte. L'ARN viral est transcrit de manière réversible par le reverse transcriptase et

s'intègre sous forme de provirus grâce à l’intégrase. Les rétrovirus coopèrent très

efficacement avec des enzymes de la cellule de l'hôte, et ils les utilisent pour leur propre

réplication et l'expression de protéines virales (Fig. 22) [42].

Les vecteurs viraux d'ARN dérivés de rétrovirus sont dépourvus des gènes nécessaires à

la réplication. Ayant un diamètre de 80 à 130 nm et une taille de génome de 8-11 kb, ils

peuvent accepter de 7-10 kb de gènes exogènes. Ils sont fabriqués dans des cellules qui

contiennent trois gènes principaux, pol, gag et env qui codent respectivement pour la

reverse transcriptase et l’intégrase, les protéines de la capside et les protéines de

l’enveloppe. Ils possèdent aussi la longue répétition terminale (LTR) qui est importante

pour l'emballage, la transcription inverse, l'intégration et la régulation de la transcription

[43] [44].

Il existe de nombreux types de rétrovirus (le virus de la leucémie bovine, le virus du

sarcome de Rous, les lentivirus et les spumavirus) qui ont été utilisés pour la préparation

des vecteurs. Les vecteurs les plus populaires sont des constructions à base de MoMLV

(le virus de la leucémie murine de Moloney) et le VIH [42].

31

Figure 22: Cycle de réplication des rétrovirus.

(Http://www.slideshare.net/guestc0268e/retroviruses-compressed)

2.3.2.3.1 Gamma-rétroviral vecteurs

Ce sont des vecteurs à base MoMLV où l’assemblage des gènes (gag-pol ou des gènes

supplémentaires) ne se produit pas par un chevauchement des gènes. Ces vecteurs sont

spécifiques pour les cellules en division. L’intégration de l’ADN viral n’est possible que

pendant la mitose à cause de la difficulté de transporter de l’information génétique à

travers la membrane nucléaire. Le génome intégré code pour l’intégrase, la capside, p12

et l'ADN proviral. Ce dernier est entouré par deux longues répétitions terminales (LTR)

(contient région U3, R et U5). La transcription de l'ADN proviral commence à partir de

l’amplificateur (enhancer) du promoteur dans la région 5 ' de U3 [42].

2.3.2.3.2 Les lentivirus

Il existe 3 générations de lentivirus qui sont plus complexe par rapport aux vecteurs

dérivés du MoMLV. Ils sont caractérisés par leur grande sécurité et leur efficacité de

transférer des gènes. Les deux premières générations sont constituées de trois plasmides,

contre quatre plasmides pour la troisième génération. Les lentivirus sont capables de

transduire des cellules quiescentes (non pas en division) et de traverser les nucléopores

de noyau à l’aide des protéines virales et cellulaires. Les vecteurs lentivirus sont basés

sur différents types de virus : le VIH, le virus de l'immunodéficience féline (VIF), le virus

de l'immunodéficience simienne (SIV) et le virus de l'anémie infectieuse équine (EIAV).

Le pseudo typage VSVg est le plus utilisé pour les lentivirus [42].

32

2.3.3 Les vecteurs non-viraux

Les vecteurs non-viraux transfèrent l’ADN conjugué avec des protéines spécifiques ou

avec des liposomes. Ils permettent le transfert de l’ADN vers la cellule cible grâce à des

récepteurs spécifiques. Ils peuvent aussi être des chromosomes artificiels ou des ADN

nus transférés directement dans la cellule sans l’intermédiaire des molécules spécifiques.

Les vecteurs non-viraux sont moins efficaces par rapport aux vecteurs viraux ce qui

explique leur utilisation limitée [37].

2.3.3.1 Les vecteurs chimiques

L’approche de transfert non viraux est la plus prometteuse pour transférer un gène à

l’intérieur de la cellule cible est un système purement chimique. Cette approche se base

sur le transfert d’ADN par les liposomes, la condensation de l'ADN avec des lipides

cationiques et des polymères ou des peptides. Ce sont des complexes qui traversent la

membrane plasmidique par l’absorption cellulaire l’endocytose [37].

2.3.3.2 Les acides nucléiques nus

Il existe un ensemble de techniques pour transfecter l’ADN dont le but consiste en

l’injection des plasmides nus directement dans la cellule cible. Les procédés les plus

utilisés sont l'électroporation, la nucléofection (création de pores dans la membrane

plasmidique par un champ électrique), la sonoporation (des ultrasons pour désagréger la

membrane cellulaire), la magnétofection (utilisation de particules magnétiques sous

forme des complexes avec l'ADN), les canons de gènes (des particules d'or revêtues

d’ADN sont propulsées dans les cellules en utilisant une pulsation de haute pression).

Chaque méthode a ses propres avantages et ses inconvénients [37].

33

Chapitre 3 : Transcription effecteur activateur-like

(TALE)

3.1 TALE/TALEN

Les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN « Transcription

activator-like effector nucleases ») est un groupe des protéines (100 kDa) de l’agent

pathogène (bactérie Xanthomonas sp) des plantes. Ils ont des domaines de liaison à

l’ADN (TALE) au niveau des séquences cibles spécifiques. Le TALE est le résultat de

l’assemblage des multiples répétitions des RVDs (Repeat Variable Di-residus)

spécifiques pour se lier aux nucléotides. Chaque RVD contient 34 acides aminés

similaires (conservés) sauf des acides aminés 12 et 13 par lesquels les TALEs se lient

avec des nucléotides de la séquence cible de l’ADN selon une complémentarité NI = A,

HD = C, NG = T et NN = G (Fig. 23) [45] [46] [47].

Le TALE peut-être fusionné avec un activateur de la transcription (TALEs-FT), un

répresseur de la transcription (TALEs-RT) ou un domaine nucléase FokI (TALENs) pour

réguler et modifier spécifiquement des gènes d’intérêts du génome dans différents

contextes, y compris la modulation de la transcription et l'édition du génome (Fig. 24)

[45] [46] [47].

Figure 23: Les différentes parties des TALEs [45].

Le TALE contient des différents parties : N-ter, C-ter, RVD et séquence de NLS avant le domaine

activateur AD.

34

Figure 24: Les différents domaines liés après le N-ter des TALEs [48].

Figure 25: Deux paires des TALENs ciblent deux séquences spécifiques d’ADN [45].

Le nombre final des domaines de liaison des RVD est égal au nombre de nucléotides

ciblés dans l’ADN. La séquence ciblée doit commencer par un nucléotide thymidine (T).

La séquence RVD est entourée par deux extrémités N et C terminales qui sont identiques

pour tous les TALEs/TALENs (Fig. 23). Le VP64 est le facteur de transcription le plus

utilisé pour moduler la transcription des gènes en fusionnant avec le TALE. Après le

ciblage des régions régulatrices des gènes grâce aux RVD et le recrutement de complexe

de la transcription par le VP64 pour initier et activer la transcription. Les TALENs sont

le résultat de la fusion entre le C-ter du domaine de liaison à l’ADN (TALE) et la nucléase

FokI. Une paire de TALENs, ciblant deux séquences séparées par un nombre fixe de

nucléotides, est requise pour couper le double brin de l’ADN, (Fig. 25). La correction de

cette coupure se fait soit par la recombinaison homologue (RH) avec un ADN donneur

exogène [45], ou soit par fusion non-homologue (NHEJ, Non Homologous End Joining).

Ces corrections permettent de supprimer ou de rendre non-fonctionel (KO, Knock-Out)

le gène cible

Il existe des outils et des procédures pour construire le domaine de liaison à l’ADN

(TALE) lié avec un domaine protéique, afin de les tester in vitro et in vivo sur des modèles

cellulaires ou animaux.

35

3.2 La limite majore des effecteurs TALENs/TALEs

Les protéines de liaison à l’ADN TALENs/TALEs ont une grande utilité et de diverses

applications pour l’ingénierie et l’étude de génome. Cependant, la limite majore de ces

effecteurs se présente par deux grandes incertitudes. La première est la réponse

immunitaire in vivo avec la production des anticorps anti TALENs/TALEs [49]. La

deuxième limite est la spécificité vers la séquence cible qui produit des hors cibles à cause

des homologies entre les séquences d’ADN de génome [50]. Plusieurs études

immunologiques et bio-informatique en cours de développement se concentrent sur ces

deux limites major et leurs impacts sur la fonction de ces outils génomiques modernes.

Afin de répondre à ces préoccupations, d’utiliser des animaux immunosuppresseurs avec

une dose optimale d’injection in vivo peuvent réduire la réponse immunitaire contre ces

protéines TALENs/TALEs [51]. Ainsi que d’utiliser TALENs/TALEs avec un grand

nombre des RVD peut diminuer la probabilité d’hors cible de ces effecteurs vers les

séquences cibles d’ADN [52] [45] [50].

3.3 Construction des TALEs

La construction des monomères de domaine de liaison à l’ADN (TALE) est très difficile.

Pour surmonter cette difficulté, il y a des stratégies de ligature spécifique après

l’utilisation des enzymes de restriction de type II. Ces stratégies ont pour but d’améliorer

le système d’assemblage des monomères des RVD de TALE en optimisant la

construction de plus grand nombre des monomères en moins d’étape et en combinant des

étapes de digestion et de ligation en une seule réaction d’assemblage de Golden Gate [45].

3.3.1 Réaction de Golden Gate

La réaction Golden Gate est une méthode de clonage ayant pour but d’assembler plusieurs

inserts dans un seul vecteur. Elle nécessite deux enzymes pour une seule réaction, la T4

DNA ligase et l’enzyme de restriction BsaI/Esp3I (BsmBI), pour créer des séquences

cohésives de quatre paires de base à chaque extrémité des plasmides à assembler. Ces

séquences cohésives qui se chevauchent sont produites par digestions successives par

Bsal et par BsmBI, tel qu’indiqué dans les Figures 26 et 27. L’extrémité cohésive

gauche du premier insert et l’extrémité cohésive droite du dernier insert doivent se

chevaucher avec les deux extrémités cohésives du vecteur digéré dans le but de construire

un vecteur avec plusieurs inserts (Fig. 27) [53].

36

A la fin de l’assemblage, des procédures de PCR et de séquençage ont été réalisées pour

vérifier le résultat de l’assemblage des RVDs. Ces techniques visent à vérifier la longueur

de l’ensemble des RVD insérés dans le vecteur et la séquence des nucléotides.

Les procédures et les étapes de l’assemblage sont basées sur plusieurs kits de construction

des TALEs\TALENs qui sont commercialisés par Addgene (Cambridge, Ma, USA) et

tous basés sur le même principe d’assemblage Golden Gate

(Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_034463.1).

Figure 26: Les deux grandes étapes de l’assemblage des RVDs avec la réaction Golden Gate

(Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_034463.1).

La réaction Golden Gate de l’assemblage des RVD effectuée en deux grandes étapes. La première utilise la T4 DNA ligase et l’enzyme de restriction BsaI et la deuxième la T4 DNA ligase et

l’enzyme de restriction Esp3I (BsmBI)

37

Figure 27: L’assemblage plusieurs inserts dans un seul vecteur selon la réaction Golden

Gate de NEB.

(Http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

L’extrémité cohésive gauche du premier insert et l’extrémité cohésive droite du dernier insert

doivent se chevaucher avec les deux extrémités cohésives du vecteur digéré dans le but de

construire un vecteur avec plusieurs inserts.

3.4 Platinum-TALE (plTALE)

Dans le TALE classique, les 34 acides aminés des RVD de TALE sont similaires sauf les

acides aminés 12 et 13 qui sont spécifiques à chaque nucléotide. Sakuma et al. [54] ont

montré que des TALENs/TALEs ayant des variations d’acides aminés autre que ceux des

positions 12 et 13 induisent une activité plus élevée que des TALEN/TALEs classiques

avec des répétitions constantes (RC). Pour cela, le kit d’assemblage Platinum-TALEs,

diffère donc de celui utilisé pour assembler des TALEs classiques. Par des nouvelles

variations des acides aminés 4 et 30 en plus des variations des acide aminé 12 et 13 des

RVD. Ainsi par la technique d’assemblage des séquences des RVDs implique deux étapes

de clonage de type Golden Gate. La première étape par BsaI permet de regrouper 4 RVDs

dans un seul plasmide pFus2. La deuxième étape utilise l’enzyme Esp3I(BsmBI) pour

regrouper plusieurs plasmids contenant chacun 4 RVDs dans un seul vecteur ptCMV-VR

pour exprimer le TALE. L’assemblage de ces 4 plasmides est très efficace (100 %) par

rapport à l’assemblage de 10 plasmides (10%) utilisé pour construire les TALEs

classiques. Cette technique d’assemblage utilise en effet moins de plasmides de départ

(p1HD-P4HD, p1NG-p4NG, p1NI-p4NI et p1NN-p4NN) (Fig. 28) [54] [55].

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

38

Figure 28: L’assemblage des RVDs Platinum-TALE (plTALE) en deux grande étapes [54]. La première étape assemble les RVDs par groupes de 4 dans les vecteurs pFus. La deuxième

étape regroupe l’ensemble des RVD dans un seul plasmide ptCMV-VR

3.5 Les facteurs de la transcription

Les facteurs de la transcription FT sont des protéines qui peuvent moduler l’expression

des gènes lorsqu’ils sont fusionnés à un domaine de liaison à l’ADN. Les meilleurs

facteurs de la transcription sont caractérisés par des régions courtes avec des résidus

acides et hydrophobes. La structure du domaine activateur acide n’est pas définie qu’après

une interaction protéine-protéine. C’est pareil pour des domaines activateurs qui sont

riches en glutamine ou en proline [56].

Les domaines d’activation de la transcription les plus souvent fusionnés avec TALE sont

VP64 et p300 (Fig. 29), car ils sont plus efficaces pour induire l’expression des gènes

[47] [57]. C’est pourquoi dans ces travaux, ont été utilisé les systèmes plTALE-VP64 et

plTALE-p300 comme outils pour augmenter l'expression du gène FXN dans le modèle

des fibroblastes de patients FRDA, et dans des souris modèle YG8R de cette maladie.

39

Figure 29: Activation de la transcription après le recrutement du complexe transcriptionnel

par le domaine d’activation fusionné avec TALE [58].

3.4.1 VP64

VP64 est un activateur de la transcription composé de quatre copies en tandem d’une

protéine de l'herpès simplex appelée VP16 (DALDDFDLDML) (Fig. 30), séparées par

des liens glycine-sérine. Lorsque VP64 est fusionné à une protéine de liaison à l’ADN

qui cible la région régulatrice du gène, le VP64 réagit comme un puissant activateur de la

transcription en recrutant la machinerie de l’ARN polymérase II et les facteurs qui

remodèlent la chromatine [45] [47] [48]. Cet activateur peut interagir avec de grands

nombres des protéines, tel que la TATA-binding protéine (TBP), le TFIIB et le complexe

SAGA (Fig. 30) [56].

Figure 30: Le VP64 regroupe 4 séquences de VP16 (image du bas), pour activer la

transcription après le recrutement du complexe transcriptionel (image du haut) [45].

3.4.2 p300

L’acétyltransférase des histones p300 est un co-activateur transcriptionnel, qui module la

transcription des gènes par remodelage de la chromatine et par l’instabilité du nucléosome

après l’acétylation des histones H3K27. Il joue un rôle important dans la régulation

épigénétique qui permet d’activer et de stimuler la transcription des gènes (Fig. 33) [59].

Donc l’acétyltransférase p300 humaine peut activer et agir sur la transcription et

l’expression du gène lorsqu’il est fusionné avec une protéine de liaison à l’ADN (TALE)

qui cible une séquence au niveau des régions régulatrices du gène (Fig. 31) [60] [47].

40

Figure 31: Le rôle de p300 dans l’activation du gène après l’acétylation et le remodelage de

la chromatine [61].

41

Chapitre 4 : Hypothèse et l’objectif

4.1 Hypothèse

FRDA est une maladie génétique dégénérative autosomique récessive caractérisée par

plusieurs symptômes qui affectent principalement le système nerveux et le cœur [2]. La

cause de cette ataxie héréditaire est une mutation au niveau du premier intron du gène

FXN (codant pour la protéine frataxine) situé dans le chromosome 9q13 [3]. Cette

mutation est une augmentation du nombre de triplet GAA [3] qui cause une diminution

de l’expression de la protéine frataxine. La frataxine est une protéine mitochondriale

exprimée dans toutes les cellules, à des niveaux variables dans différents tissus et durant

le développement [13]. La frataxine joue plusieurs rôles dans le métabolisme et la

production d’énergie cellulaire de la mitochondrie. L’augmentation du nombre de GAA

provoque un silence partiel du gène FXN et donc une diminution de la transcription et

d’expression de la frataxine [2] [7] [24]. La carence de cette protéine conduit au stress

oxydatif (révélé par l'augmentation des concentrations plasmatiques de malondialdéhyde,

produit de peroxydation lipidique) et l’accumulation de fer dans le mitochondrie [2]. Ce

déséquilibre se traduit par plusieurs symptômes présentés par des troubles de la

coordination des mouvements, la neuro-dégénérescence, la cardiomyopathie.

Il n’existe aucun traitement curatif de cette maladie. Cependant plusieurs stratégies

thérapeutiques en voie de développement parmi eux la thérapie génique qui est une

approche prometteuse afin de développer des traitements pour des maladies génétiques

héréditaires. Dans notre cas, la thérapie génique est donc une stratégie efficace pour traiter

cette anomalie en visant la cause principale à savoir la diminution de la transcription du

gène FXN par l’activation de la transcription du gène endogène et ainsi l’augmentation

de l’expression de la frataxine.

Pour augmenter la transcription du gène FXN dans FRDA, je me suis basé sur des

résultats antérieurs de notre laboratoire [33]. Ces résultats ont démontré que le domaine

activateur de la transcription VP64 fusionné avec des TALEs qui ciblent le promoteur du

gène FXN, augmente la transcription de ce gène et double l’expression de la protéine

FXN dans les fibroblastes de patients FRDA. L’augmentation de l’ARNm de la FXN a

aussi été observée dans les fibroblastes des souris YG8R [33].

42

Pour cette approche Chapdelaine et al. (2013) [33] ont ciblé avec 12 TALEs 12 séquences

au niveau du promoteur du gène FXN pour identifier le TALE le plus efficace afin

d’activer la transcription du gène FXN dans des cellules FRDA. Chaque TALE contient

13 RVDs fusionnés avec différents domaines activateurs de la transcription (p65,

TFAP2α, SRF, SP1, er MyoD) pour tester leur efficacité in vitro sur des fibroblastes

humains et murin contenant un gène FXN la mutation responsable de la FRDA.

Le TALE#8-VP64 double l’expression du gène FXN par rapport au contrôle négatif (les

cellules traitées par le vecteur qui n’exprime pas le TALE-VP64). Le VP64 est donc un

domaine activateur qui peut induire et augmenter la transcription du gène endogène FXN.

4.2 Objectif

Selon notre hypothèse, l’objectif de mon projet de recherche est d’activer le gène FXN

pour augmenter la transcription de ce gène par la suite l’augmentation de l’expression de

la protéine frataxine dans les modèles FRDA à l’aide du système plTALE-FT au lieu de

TALE classique. Pour atteindre cet objectif principal, des objectifs spécifiques doivent

d’abord être atteints :

1. L’induction du gène endogène FXN à l’aide des TALEs platinum (plTALE) qui

contient des variations au niveau des acides aminés 12 et 13 des RVD ainsi que

d’autres acides aminés 4 et 32 pour augmenter la spécificité et l’efficacité des

séquences des RVD.

2. La production des plTALEs avec le promoteur CMV dans le vecteur pCR3.1 et les

lentivirus qui expriment les effecteurs plTALEs avec le promoteur EF-1.

3. Le ciblage de différentes séquences au niveau du promoteur (séquences qui fixent des

FT et celles qui ne fixent pas les FT).

4. La production des plTALEs avec 13 et 15 RVD.

5. L’utilisation de deux domaines activateurs VP64 et p300.

6. L’induction du gène endogène FXN à l’aide des systèmes plTALE-SunTag10X/24X

qui contient 10 ou 24 VP64.

7. L’induction du gène endogène FXN dans les différentes cellules FRDA avec de

différents nombres de répétitions GAA en comparaissant avec des cellules fibroblaste

des personnes normales (NED).

8. Rétablir le phénotype biochimique des cellules FRDA in vitro après l’induction du

gène FXN.

43

Chapitre 5 : Matériels et méthodes

5.1 Platinum TALE-VP64 (plTALE-VP64)

5.1.1 Introduction

Les plTALEs sont des protéines de liaison à l’ADN produites par le Platinum Gate

TALEN Kit (Addgene Inc, Cambridge, Ma, USA) qui se distinguent des TALEs

classiques par deux particularités. La première repose sur des variations des acides aminés

4 et 32 des séquences RVD (Repeat Variable Di-residues) ainsi que des variations des

acides aminés 12 et 13 qui se trouvent dans les TALEs classiques. La deuxième

particularité est la technique d’assemblage des RVD des 4 modules des RVD qui se fait

en 2 étapes. Cette technique est très efficace comparativement à l’assemblage de 10

modules RVD. Dans un premier temps, elle permet de regrouper 4 modules des RVD

ensemble dans un seul plasmide nommé pFUS2, par la suite, on procède à l’assemblage

de ces groupes de 4 modules des RVD dans un unique vecteur ptCMV-VR [54] [55].

Ce kit contient 34 plasmides, répartis comme suit : 16 plasmides contenant les différents

modules de RVD (p1HD-P4HD, p1NG-p4NG, p1NI-p4NI et p1NN-p4NN), 10 plasmides

de pFus2 pour regrouper chaque groupe de 4 RVD successifs et 8 plasmides de ptCMV-

VR qui contiennent un seul module de RVD et une nucléase FokI. Cette dernière sera

remplacée par un domaine activateur (VP64 ou p300) pour construire plTALE-

Vp64/p300 [54] [55] (Fig. 32).

5.1.2 La construction plTALEs-VP64

La construction des plTALEs-VP64 se fait d’abord en deux grandes étapes par la méthode

d’assemblage de Golden Gate pour produire plTALENs. Ces derniers contiennent le

domaine nucléase FokI. Cette nucléase est ensuite remplacée par un VP64 au cours d’une

troisième étape pour construire le plTALE-VP64 (Fig. 32).

44

Figure 32: La présentation schématique pour les grandes étapes de la construction des

plTALEs-VP64

(Adapté de [54]).

5.1.2.1 Première étape de la construction des plTALENs (pFUS2)

La première étape a pour but de regrouper chaque groupe de 4 RVD (50 ng/µl) successifs

dans un seul plasmide pFUS2 (25 ng/µl) selon une réaction de Golden Gate. Elle nécessite

deux enzymes, la Quick ligase et le BsaI-HF avec le tampon 10X T4 DNA ligase (New

England Bioloabs Inc., Ipswich, MA, USA) dans une seule réaction de trois cycles (37

°C pendant 5 min, 16°C pendant 10 min). Elle a été suivie par une incubation à 50 °C

pendant 30 min et à 80 °C pendant 5 min après l’addition de 0,25 µl de tampon 4, 0,25 µl

de BSA 10X et 0,1 µl de BsaI-HF (Fig. 33). Le principe de cette réaction est de créer des

séquences cohésives à chaque extrémité avec quatre paires de bases en chevauchement,

rendu possible après la digestion par BsaI-HF. L’extrémité cohésive droite du premier

module de RVD se chevauche avec l’extrémité cohésive gauche du module RVD suivant.

L’extrémité cohésive gauche du premier insert (module 1 de RVD) et l’extrémité

cohésive droite du dernier insert (module 4 de RVD) doivent se chevaucher avec les deux

extrémités cohésives du vecteur pFUS2 digéré pour assembler les 4 modules des RVD.

Le produit de cet assemblage a été amplifié dans des bactéries compétentes DH5 après

une transformation par un choc thermique à 42 °C pendant 45 s et suivi par une incubation

à 37 °C pendant une heure et une incubation à 37 °C pendant la nuit sur un milieu solide

LB-Amp (100 µg/ml).

45

Des colonies bactériennes ont été cultivées dans le milieu liquide LB-Amp (100 µg/ml) à

37 °C pendant la nuit. Ensuite, une extraction d’ADN plasmidique (le plasmide de

l’assemblage contient des 4 RVD) a été faite par le Kit de ThermoFicher scientific

GeneJET Plasmid Miniprep (#K0503). À la fin, une réaction PCR a été réalisée sur 50 ng

de plasmide d’assemblage extrait, en utilisant les amorces pCR8_F1 : TTG ATG CCT

GGC AGT TCC CT et pCR8_R1 : CGA ACC GAA CAG GCT TAT GT pour amplifier

le fragment de 4 RVD dans pFUS2. L’amplification par PCR se fait avec l’enzyme de

polymérase Phusion® High-Fidelity (New England Bioloabs Inc., Ipswich, MA, USA) à

la température d’hybridation de 55 °C et à la température d’élongation de 72 °C pendant

15 s pour les deux. La PCR permet de sélectionner les bonnes constructions de

l’assemblage de 4 RVD après une analyse de la taille attendue par une électrophorèse sur

gel d’agarose 1%.

Figure 33: Le protocole de la réaction d’assemblage des 4 modules des RVD d’étape 1

(Https://www.addgene.org).

5.1.2.2 La deuxième étape de la construction des plTALENs

Cette étape a pour but de regrouper l’ensemble des séquences des RVD complémentaires

à la séquence cible d’ADN dans un seul plasmide ptCMV-VR (50 ng/µl) qui contient le

dernier RVD le treizième ou le quinzième, selon le principe de la réaction de Golden

Gate. Elle permet d’assembler les groupes des RVD successifs (50 ng/µl) pour construire

plTALENs. Cette étape nécessite deux enzymes, la Quick ligase et Esp3I (BsmB1) (New

England Bioloabs Inc., Ipswich, MA, USA) dans une seule réaction de six cycles (37 °C

pendant 5 min et 16 °C pendant 10 min). Elle a été suivie par une incubation à 37 °C

pendant 60 min et 80 °C pendant 5 min après l’addition de 0,5 µl de tampon Tango, 0,5

µl de 10 mM DTT et 0,2 µl de Esp31 (BsmB1) (fig. 34). Pour créer des séquences

cohésives de chaque extrémité avec quatre paires de bases en chevauchement après la

digestion avec Esp3I. L’extrémité cohésive droite du premier module de 4 RVD 1ui se

chevauche avec l’extrémité cohésive gauche du second module de 4 RVD. L’extrémité

46

cohésive gauche du premier module de 4 RVD et l’extrémité cohésive droite du dernier

module de 4 RVD doivent se chevaucher avec des deux extrémités cohésives du vecteur

ptCMV-VR digéré pour construire un plTALENs.

Le produit de cet assemblage a été amplifié dans des bactéries compétentes DH5 après

une transformation par un choc thermique à 42 °C pendant 45 s, suivit, par une incubation

à 37 °C pendant une heure et une incubation pendant la nuit à 37 °C sur un milieu solide

avec LB-Amp (100 µg/ml).

La sélection des bonnes constructions des RVD des plTALENs contenant 13 RVD ou 15

RVD a été faite selon la même procédure de sélection décrite dans la première étape c’est

à dire avec l’utilisation des amorces de PCR de TALE-F : GAG CAC CCC TCA ACC

TGA CCC CAG et de TALE-R : TCG AAA GCT GGG CCA CGA TTG. Le programme

de PCR suit la cinétique 66 °C pendant 15 s (hybridation) et 72 °C pendant 50 s

(élongation).

Les constructions finales des plTALENs ont été validées par un séquençage qui confirme

la conformité des séquences nucléotides de plTALENs, cela fut possible grâce à 4

amorces:

T7p : TAA TAC GAC TCA CTA TAG G du côté 5’de N-ter

TALE-F : GAG CAC CCC TCA ACC TGA CCC CAG du côté 5’des RVD

TALE-R : TCG AAA GCT GGG CCA CGA TTG du côté 3’des RVD

BGH : TAG AAG GCA CAG TCG AGG du coté 3’ du FokI

Figure 34: Le protocole de la réaction d’assemblage finale de l’ensemble des RVD dans un

vecteur ptCMV afin de construire plTALENs

(https://www.addgene.org).

5.1.2.3 La construction des plTALEs-VP64

Nous avons utilisé deux clonages pour construire les plTALEs-VP64 à partir des

plTALENs (contenant la nucléase Fok1). Le plTALE-VP64 a été fait dans un plasmide

pCR3.1 qui contient un promoteur CMV et un gène de résistance Amp.

https://www.addgene.org/

47

5.1.2.3.1 Le clonage In-fusion

Le premier clonage avec un clonage In-fusion a pour but d’introduire un insert VP64-

XbaI dans les régions 3’ C-ter des constructions plTALENs. Nous avons utilisé le kit In-

Fusion Cloning technology (Clontech Laboratories Inc, Mountain View, États-Unis) pour

faire la construction plTALENs-VP64-Xba1. Tout d’abord, le vecteur plTALENs a été

linéarisé par BamHI et le fragment d’insert VP64-XbaI a été amplifié par des amorces

TALE-VP64-F : ACC AAC AGA AGG ATC CCC GAG AGG ACA et TALE-VP64-R

: GTC CTC TCG GGG ATC CAC AGT CGA GGC T. Par la suite, une réaction de

ligation a été faite sur une concentration d’ADN (insert + vecteur) de 1-10 ng/µl avec un

ratio 3 : 1 d'insert/vecteur. Nous avons utilisé 2 µl d’enzyme d’In-fusion et nous avons

complété le volume final à 10 µl avec l’eau. La réaction de clonage In-fusion a été incubé

à 50 °C pendant 25 min. Les produits de cette réaction ont été utilisés pour transformer

les bactéries compétentes Stellar fournies avec le Kit. La transformation a été faite par un

choc thermique à 42 °C pendant 45 s plus une incubation à 37 °C pendant une heure, et

une incubation pendant la nuit à 37 °C sur un milieu solide avec LB-Amp 100 µg/ml.

La sélection des constructions plTALENs-VP64-XbaI a été faite par une réaction de PCR

avec les amorces, TALE-VP64-F et TALE-VP64-R et un programme de 60 °C pendant

20 s (hybridation) et de 72 °C pendant 30 s (élongation).

5.1.2.3.2 La construction finale de plTALEs-VP64

Le deuxième clonage est pour construire plTALEs-VP64 dans un vecteur de pCR3.1

(Addgene Inc, Cambridge, Ma, USA). Cette réaction a été faite par une double digestion

MluI/XbaI (New England Bioloabs Inc., Ipswich, MA, USA) qui permet de cloner un

insert Mlu1-TALE-VP64-Xba1 de taille de 657 pb dans le vecteur pCR3.1 qui contient

le promoteur CMV et un gène de résistance Amp. Le vecteur et l’insert ont été purifiés

par gel extraction (Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction Kit #K0691) et ont été liés

avec l’enzyme Quick ligase. Le produit de ligation a été utilisé pour transformer des

bactéries compétentes DH5 par un choc thermique à 42 °C pendant 45 s, plus une heure

d'incubation sous l'agitation à 37 °C et enfin une incubation à 37 °C pendant la nuit sur

un milieu solide de LB-Amp (100 µg/ml).

La sélection des clones positifs qui contiennent les bonnes constructions plTALEs-VP64

se fait par une double digestion et un séquençage. La double digestion a été faite par

MluI/XbaI à 37°C pendant deux heures. Le séquençage qui confirme les séquences

correctes des nucléotides des plTALEs-VP64 a été fait par 4 amorces :

48

T7p : TAA TAC GAC TCA CTA TAG G du côté 5’de N-ter

TALE-F : GAG CAC CCC TCA ACC TGA CCC CAG du côté 5’des RVD

TALE-R : TCG AAA GCT GGG CCA CGA TTG du côté 3’des RVD

BGH : TAG AAG GCA CAG TCG AGG du coté 3’ du VP64

5.1.3 Test plTALEs-VP64 in vitro

5.1.3.1 Les cellules fibroblaste des patients FRDA

Dans cette approche, 14 plTALEs-VP64 qui ciblent différentes séquences au niveau de

la région régulatrice du gène FXN ont été construits. Ces plTALEs-VP64 ont été testés

in vitro sur des fibroblastes du patient GM04078 (FRDA4078) (obtenues de l’Institut

Coriell, Camden, New Jersey). Ces cellules contiennent 541/420 répétitions de GAA. Par

la suite, les meilleurs plTALEs-VP64 ont été sélectionnés puis testés in vitro sur les

fibroblastes de quatre différents patients : FRDA66 (240/640), FRDA162 (355/805),

FRDA4675 (255/1140) et FRDA4743 (470/970). Les résultats de ces tests ont été

comparés par rapport à l’activité transcriptionnelle du gène FXN dans des fibroblastes

des personnes normales : NED29178 NED36091, NED36320 et NED34769 obtenues de

l’Institut Coriell.

Les cellules FRDA et NED ont été cultivées dans un milieu DMEM (Dulbecco's Modified

Eagle Medium de Wisent Inc., Saint-Jean-Baptiste, QC, Canada) avec 10 % de FBS

(Gibco Inc., Burlington, Ontario), 1 % d’antibiotiques (la pénicilline et la streptomycine)

(Gibco® by Life Technology Inc. #15140-122, USA) et 1 % de milieu Non-Essential

Amino Acid 100X (NEAA, Wisent Bioproducts Inc, #321-011-EL, Canada) après

incubation à 37 °C sous 5 % de CO2.

5.1.3.2 Nucléofection

Les cellules FRDA ont été électroporées à l’aide de la technologie de nucléofection

Amexa (Les Produits Scientifiques ESBE , St-Laurent, QC) pour introduire le plasmide

pCR3.1-plTALE-VP64 à l’intérieur des noyaux des cellules FRDA [62]. Nous avons

utilisé pour cette technique 10 µg des plasmides plTALEs-VP64 et 100 µl de la solution

de la nucléofection pour resuspendre 106 des cellules FRDA. Le mélange a été transféré

dans une cuve pour l’électroporation avec un programme de P 022 (Fig. 35).

Les cellules traitées par plTALEs-VP64 pendant 2 ou 3 jours avec un changement de

milieu chaque 24 h afin de les analyser par qRT-PCR et Western Blot. Pour évaluer l’effet

de ces plTALEs-VP64 sur l’augmentation de la transcription et l’expression du gène FXN

49

par rapport aux deux contrôles négatifs des cellules nucléofectées juste par la solution de

nucléofection (cellules non traitées) et des cellules traitées par le vecteur pCR3.1 qui

n’expriment pas le plTALEs-VP64 (vecteur vide).

Figure 35: Le schéma de test in vitro des plTALEs-VP64 dans des cellules FRDA.

5.1.3.3 qRT-PCR

Cette technologie a pour but d’analyser l’effet des différents plTALEs-VP64 sur

l’augmentation de la synthèse de l’ARNm du gène FXN et pour sélectionner les

plTALEs-VP64 les plus efficaces pour cette approche. Nous avons quantifié le nombre

de copies d’ARNm par une qRT-PCR. Par la suite, nous avons déterminé l’augmentation

de l’activité transcriptionnelle du gène FXN normalisé par des gènes GAPDH et HPRT.

Ce test a été réalisé en collaboration avec le centre génomique du CHU de Québec (Plate-

forme de l'expression génétique, CHU de Québec, Québec). Les différentes amorces

utilisées pour cette approche sont les suivantes :

Amorces FXN : AAG CCA TAC ACG TTT GAG GAC TA / TTG GCG TCT GCT TGT

TGA TCA. Amorces GAPDH : TTG GCA TTG TGG AAG GGC TCA T / CGG CAC

CCC TCT ACC CAA AAG. Amorces HPRT1 : CAG GAC TGA AAG ACT TGC TCG

AGA T / CAG CAG GTC AGC AAA GAA CTT ATA GC. Amorces TALE : GAG TCG

GTG TCA CAG AAC TCG AG / CGC CTG GTC AGG TGT CTG AGT TG.

5.1.3.4 Western blot

Après l’extraction d’ARNm via l’utilisation du TRIzol (pour quantifier l’ARNm par qRT-

PCR), le reste d’extrait des cellules FRDA traitées par plTALEs-VP64 a pu être soumis

à une extraction de protéines. Les protéines ont été précipitées par isopropanol à

température ambiante et ont été lavées avec 0,3 M de guanidine hydrochloride et

d’éthanol pur. Un tampon de resuspension (10% SDS, 0,25M Tris HCl, glycérol, -

Mercaptoéthanol et le bleu de bromophénol) a été utilisé pour la dénaturation des

50

protéines à 100 °C pendant 5 min. La concentration des protéines a été quantifiée par le

test à l’Amido black. Une quantité de 25-40 µg de protéines a été séparée sur un gel SDS-

PAGE de concentration de 15 % pour la frataxine et de 9 % pour l’étude de la réponse

immunitaire in vivo. Le transfert des protéines a été fait sur une membrane de

nitrocellulose (BioRad Inc, Mississauga, Ontario). La membrane a été bloquée pendant

une heure à température ambiante avec 0,1X PBS (13,7 mM NaCl, 0,27 mM KCl, 1 mM

Na2HPO4 et 0,176 mM KH2PO4), 0,05 % de Tween et 5 % de lait.

Les différents anticorps primaires et secondaires ont été utilisés : l’anti-frataxine

(#ab110328, Abcam Inc., Toronto, Canada) avec une concentration de 1/500 dans un

tampon de 0,1X PBS, 0,05 % de Tween et 5 % de lait pendant la nuit à 4 °C. L’anti-

GAPDH (Temecula Inc. #MAB374) avec une concentration de 1/30000 dans un tampon

de 0,1X PBS, 0,05 % de Tween et 5 % de lait pendant la nuit à 4 °C. L’anti-ß actine

(Sigma Inc., #A-1978, Markham, Ontario) avec une concentration de 1/10000 dans un

tampon de 0,1X PBS, 0,05 % de Tween et 5 % de lait pendant la nuit à 4 °C. La présence

d’anticorps contre les plTALE a été vérifiée dans les sérums des souris injectés par AAV-

plTALE-TF. Ces sérums étaient dilués 1/250, dans un tampon de 0,1X PBS, 0,05 % de

Tween et 5 % de lait. La réaction a duré toute la nuit à 4 °C. Un anti-Flag conjugué avec

HRP (Sigma, #A85922MG, Markham, Ontario) avec une dilution de 1/15000 dans un

tampon de 0,1X PBS, 0,05 % de Tween et 5 % de lait pendant la nuit à 4 °C. La membrane

a été lavée 3 fois avec 0,1 % PBS et 0,05 % de Tween, 10 min pour chaque lavage à la

température ambiante. L’anticorps secondaire utilisé était est un anticorps de souris anti-

lapin dilué à 1/10000 dans un tampon de 0,1X PBS, 0,05 % de Tween et 5 % de lait

pendant une heure à température ambiante. Après trois lavages par 0,1 % PBS et 0,05 %

de Tween pendant 10 min pour chaque lavage, la membrane a été révélée en utilisant le

kit de Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad Inc, Mississauga, Ontario) et un

développeur pour visualiser les bandes des protéines. Ces derniers ont été quantifiés par

le logiciel ImageJ.

5.2 Les vecteurs lentivirus

5.2.1 Introduction

Les lentivirus intégratifs sont des vecteurs largement utilisés dans la thérapie génique,

grâce, à leur capacité d’infecter des cellules avec une expression à long terme. Ils sont

capables de traverser les pores nucléaires en absence de division cellulaire [63]. Cette

technologie a une grande utilité pour améliorer l’étude in vitro de notre approche

51

thérapeutique contre la maladie de FRDA. L’infection des cellules FRDA par les

lentivirus pLenti-plTALEs-VP64 intégratifs contenant un promoteur EF-1, peuvent

induire une forte expression de la protéine plTALE-VP64 de manière permanente afin

d’activer le gène endogène FXN dans des cellules FRDA.

5.2.2 La construction des pLenti-plTALEs-VP64

Nous avons préparé des constructions pLenti-plTALEs-VP64-GFP qui ciblent des

séquences 6-15, 8-15 et F4-15 avec 15 RVD. A partir de ces constructions, des lentivirus

ont été produits et purifiés pour livrer les effecteurs plTALEs-VP64 dans les cellules

FRDA. La préparation de pLenti-plTALEs-VP64 se fait par un clonage nécessitant une

double digestion avec deux enzymes de restriction BstxI/XbaI (New England Bioloabs

Inc., Ipswich, Ma, USA). Le plasmide pLenti-EF1 (Addgene Inc, Cambridge, Ma, USA)

a été digéré par ces deux enzymes pour le linéariser. Parallèlement, nous avons digéré

pCR3.1-plTALE-VP64 par les mêmes enzymes pour récupérer l’insert linéaire plTALEs-

VP64. Une réaction de ligation a été faite par un enzyme Quick Ligase pour relier le

vecteur et l’insert digérés et purifiés, afin de construire le pLenti-plTALE-VP64. Ce

dernier a été utilisé pour transformer les bactéries compétentes CC2B (cette souche de

bactéries diminue la recombinaison de l’ADN) par un choc thermique. Les bactéries ont

été incubées sur un milieu solide LB-Agar (100 µg/ml) pendant la nuit à 37 °C. Nous

avons produit 3 pLenti-plTALE-VP64 qui codent pour les séquences 6-15, 8-15 et F4-15.

La digestion enzymatique par BstXI/XbaI et le séquençage ont été utilisés pour

sélectionner les clones positifs qui contiennent les bonnes constructions. Ces derniers ont

été cultivés dans un milieu liquide LB-Amp (100 µg/ml) pendant la nuit pour produire le

plasmide pLenti-plTALE-VP64-GFP en grande quantité par Maxiprep (Thermo Fisher

Scientific-GeneJET Plasmid Maxiprep #Kit K0491).

5.2.3 La production purification et titrage des Lentivirus dans 293T

La production des lentivirus a été faite dans des cellules 293T à confluence de 80-85 %.

Ces cellules ont été cultivées sur le milieu DMEM, avec du glucose à 4500 mg/L, 10 %

de FBS, 1 % d’antibiotiques (la pénicilline et la streptomycine) et d’anti-mycoplasme. La

production des lentivirus à petite échelle a été faite dans des boites de pétris 100 mm par

la méthode de transfection phosphate de calcium. Deux solutions ont été utilisées pour

cette transfection. La solution I contient, 15 µg de vecteur pLenti-plTALEs-VP64, 15 µg

de vecteur Gag-Pol, 5 µg de vecteur rev, 5 µg de vecteur VSV-G 50 µl de CaCl2 de 2,5

M (Thermo Fisher Scientific Inc, Mississauga, ON, Canada) et d’eau pour compléter 500

52

µl de la solution I. La solution II contient 500 µl de HBSS (0,28 M de NaCl fourni par le

Laboratoire MAT Inc. (Québec, Qc, Canada), 0,05 M de tampon HEPES et 1,5 mM de

Na2HPO4 fourni par le Laboratoire MAT Inc., Québec, Qc, Canada). Ces deux solutions

ont été bien mélangées pendant 20 min avant de les ajouter dans les cellules 293T en

culture. Le milieu de culture a été changé après 6 h. Les lentivirus ont été produits pendant

deux jours à la température 37 °C sous 5 % de CO2.

Après 28 h, le milieu de culture a été récolté et centrifugé à 2000 rpm pour éliminer le

reste des cellules. Le surnageant a été filtré avec une membrane 0,22 µm (Millipore Inc.,

Carrigtwohill, Co, Cork, Ireland) et les lentivirus ont été purifiés par ultracentrifugation

(24,500 rpm, 4 °C pendant 1,5 h) dans un tube Beckman contenant la solution de sucrose

20 % et un tampon phosphate PBS 1X (#311-010-CL, Wisent Inc., Saint-Jean-Baptiste,

QC, Canada). Les particules pseudovirales ont sédimenté sous forme de culot et le

surnageant a été éliminé. Le culot a été resuspendu dans 100 µl de PBS 1X pendant 1 h à

4 °C pour le stocker à -80 °C.

Le titrage de virus a été fait sur les cellules HEK293T cultivées dans une plaque de 24

puits à une confluence 60 à 70%. Une série de dilutions des lentivirus avec le milieu

DMEM a été ajoutée dans chaque puits avec 4 mg/ml de Polybrène (hexadimethrine

aromide) (Thermo Fisher Scientific Inc, Mississauga, ON, Canada, #BP178-500)) Ces

cellules infectées par le lentivirus ont été incubées pendant 48 h à 37 °C sous 5 % de CO2.

Les cellules ont été récoltées après traitement par trypsine, centrifugées à 1000 rpm

pendant 10 min et lavées deux fois avec PBS 1X. A la fin, ces cellules ont été fixées avec

la solution de 3,75 % formaldéhyde dans PBS 1X. Les cellules transduites avec les

particules virales et qui expriment la GFP ont été quantifiées par cytométrie en flux.

5.2.4 Traitement des cellules FRDA par les lentivirus exprimant plTALEs-VP64

Des cellules FRDA ont été cultivées avec un milieu DMEM dans une plaque de 6 puits

jusqu’à 40,000 à 55,000 cellules/puits. Le milieu de culture a été changé par 1 ml de

DMEM contenant 4 mg/ml de Polybrène et un multiple d’infection égale à 1 (MOI : 1)

pour chaque lentivirus produit ainsi que pour le contrôle négatif (un lentivirus qui

n’exprime pas un plTALE). Le milieu de culture a été changé toutes les 24 h jusqu’à une

confluence de 95 %, le temps nécessaire pour le passage ces cellules infectées. Ces

dernières ont été analysées par qRT-PCT et western, pour vérifier l’activité

transcriptionnelle dans des cellules FRDA traitées par ces lentivirus-plTALEs-VP64 par

rapport au contrôle négatif.

53

5.3 La mutagenèse des RVD

5.3.1 Introduction

Les plTALEs sont des protéines de liaison à l’ADN grâce à la reconnaissance spécifique

des nucléotides de la séquence cible par les RVD. Il existe une cartographie d'affinité

relative pour chaque combinaison de RVD et ses propriétés de reconnaissance de base

[64]. Ce répertoire est nécessaire pour la conception des nouveaux plTALEs (nplTALE)

avec de nouveaux RVD qui ciblent les mêmes séquences décrites auparavant. Ces

nouveaux RVD peuvent être des alternatifs utiles pour la reconnaissance des bases

ciblées. Pour cela nous avons proposé une nouvelle conception des RVD pour améliorer

leurs spécificités et leurs affinités afin d’améliorer l’efficacité des plTALEs-VP64. Les

changements des RVD sont les suivants : NI en CI, NN en EN et NG en HG [64].

5.3.2 Mutagénèse des modules RVD

Pour construire des nplTALEs des mutations ont été faites sur des vecteurs des modules

RVD. Ces mutations sont plus précisément au niveau des nucléotides d’acides aminés 12

des RVD pour changer NI en CI, NG en HG et NN en EN.

Nous avons utilisé le kit de mutagenèse Q5 (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA,

USA) pour modifier dans les plasmides les nucléotides codant pour les acides aminés en

position 12 des RVD. La mutagenèse a été faite par une réaction PCR avec un ADN

polymérase d’haute-fidélité appelée Q5. Ainsi avec des amorces mutagènes spécifiques

pour chaque plasmide RVD. Le but de cette approche est d’amplifier les nouveaux

plasmides qui contiennent des substitutions des bases dans cette région. Un enzyme

Kinase Ligase-DpnI (KLD) a été utilisé pour dégrader l’ancien plasmide de base. A la

fin, les nouveaux plasmides avec les nouveaux RVD ont été utilisés pour transformer les

bactéries compétentes E. coli NEB 5 fournies avec le kit pour amplifier les plasmides

qui contiennent les nouveaux modules RVD.

La sélection des colonies positives qui contiennent des plasmides avec les nouveaux RVD

se fait par le séquençage. Par la suite, des colonies positives ont été cultivées dans le

milieu liquide LB-Amp (100 µg/ml) afin d’extraire les plasmides des modules des

nouveaux RVD par de Kit de Miniprep (Thermo Fisher Scientific-Gene JET Plasmid

Miniprep Kit # K0503).

5.3.3 La construction des nplTALEs-VP64

Pour construire les nplTALEs avec les nouveaux RVD (nplTALE), nous avons utilisé les

nouveaux plasmides du Kit TALEN Platinum muté (avec p1HD-P4HD, p1HG-p4HG,

54

p1CI-p4CI et p1EN-p4EN) pour construire deux nplTALE-VP64 ciblant les séquences

8-15 et F4-15. La construction de ces nplTALEs-VP64-8-15 et F4-15 a été faite selon les

mêmes étapes que la construction des plTALE-VP64 décrits dans le paragraphe 5.1.

5.3.4 Test nplTALEs-VP64 in vitro

Les deux nplTALEs-VP64 produits ont été testés dans les cellules FRDA4078

nucléofectées selon le protocole décrit précédemment pour analyser par qRT-PCR et

western blot l’activité du gène FXN des cellules traitées par rapport aux témoins.

5.4 plTALEs-p300

5.4.1 Introduction

La p300 est une histone acétyltransférase (HAT) qui régule la transcription et le

remodelage de la chromatine par l'acétylation des histones. Pour cela nous avons fusionné

la p300 avec des protéines de liaison à l’ADN plTALEs qui ciblent la région d’initiation

de la transcription et une séquence au niveau de l’intron 1 du gène FXN. Ces complexes

plTALEs-p300 ont été rapportés être plus efficaces pour induire la transcription de gènes

après l'acétylation de l'histone H3-lysine 27 [60] [65].

5.4.2 La construction plTALEs-p300

Les plTALEs-p300 ont été construits pour induire et activer l’expression du gène FXN

dans les cellules des patients FRDA. La p300 (acétyltansferase humaine, HAT, p300-

Core) remplace le domaine d’activateur transcriptionnel VP64 dans la construction

plTALE-VP64 pour faire une nouvelle construction plTALE-p300. Cette construction a

été faite par un clonage dit ‘In-fusion’. Nous avons utilisé le plasmide pCDNA-dCas9-

p300 (fourni par Addgene Inc, Cambridge, Ma, USA) pour amplifier un insert de p300-

core avec les amorces p300_info_F : GGC CAG CGG TTC CGG AAT TTT CAA ACC

AGA AGA ACT ACG et p300_info_R : CAG CGG GTT TAA ACG GGC CCT GAT

GAG CGG TTT AAA CTC AAG AA. Le domaine activateur VP64 des plTALEs-VP64

a été enlevé par une double digestion avec les deux enzymes de restriction ACCIII/ApaI

(New England Bioloabs Inc., Ipswich, MA, USA) pour linéariser les vecteurs plTALEs

avec 15 RVD et enlever VP64. A l’aide du Kit de clonage In-fusion, le domaine

activateur VP64 a été remplacé par p300 pour faire plTALEs-p300 à 50 °C pendant 25

min. Ce produit de clonage In-fusion a été utilisé pour transformer des bactéries

compétentes DH5α par un choc thermique à 42 °C pendant 45 s et une incubation à

55

37°C pendant 1 h, les bactéries transformées ont été incubées sur un milieu solide LB-

Amp (100 µg/ml) à 37 °C pendant la nuit.

Des colonies positives ont été cultivées dans un milieu liquide LB-Amp (100 µg/ml) pour

extraire les constructions plTALEs-p300 par miniprep. Une double digestion a été faite

sur ces derniers pour sélectionner des clones positifs contenant la construction plTALEs-

p300 avec 15 RVD qui ciblent séquences 6-15, 8-15 et F4-15. Les constructions

sélectionnées ont été validées par un séquençage par 4 amorces, T7p, TALE-F-TALE-R

et BGH.

5.4.3 Test plTALEs-p300 in vitro

Les trois effecteurs plTALEs-p300 ont été testés in vitro sur des cellules FRDA4078 par

une nucléofection selon un protocole décrit auparavant. Pour analyser l’activité du gène

FXN après ces traitements, nous avons réalisé des qRT-PCR et des westerns sur les

cellules traitées pour les comparer aux témoins.

5.5 plTALEs-SunTag (plTALE-ST)

5.5.1 Introduction

Les effecteurs plTALEs-VP64 avec le promoteur CMV et des RVD normaux (NI, NN,

HD et NG) peuvent activer le gène endogène FXN en ciblant des séquences spécifiques

au niveau de la région d’initiation de la transcription et une séquence au niveau d’intron

1. Par la suite, un nouveau système plTALEs-ST a été construit pour améliorer notre

approche thérapeutique de la régulation transcriptionnelle du gène endogène FXN dans

le cas de FRDA. Ce système d’induction est formé de plTALE fusionné avec les épitopes

SunTag (ST). Ces derniers permettent de recruter plusieurs domaines activateurs

transcriptionnels VP64. Chaque peptide ST (SunTag) dans les plTALEs-ST10X et

plTALEs-ST24X recrute le complexe scFv-sfGFP-VP64-GB1 qui contient le VP64 pour

activer le gène FXN [66]. Donc les plTALEs-ST10X et plTALEs-ST24X recrutent

respectivement 10 et 24 VP64.

Les protéines plTALEs-ST10X et plTALEs-ST24X qui ciblent une séquence au niveau

de promoteur du gène FXN, ont été exprimées par un seul vecteur pCR3.1-plTALE-ST.

Les scFv (single chain variable fragment) qui sont fusionnés avec sfGFP-VP64-GB1 ont

été exprimés par un autre vecteur pCR3.1-scFv-sfGFP-VP64-GB1. Le nombre d’épitope

SunTag détermine le nombre des VP64 recruté par plTALEs-ST, les plTALEs-ST10X et

les plTALEs-ST24X recrutent donc respectivement 10 et 24 VP64. Le sfGFP-GB1

56

stabilise le complexe scFV et empêchent leur agrégation dans des cellules mammifères.

Ce système est le résultat de la multimérisation des protéines sur une séquence cible

d’ADN grâce à l’affinité entre les domaines des anticorps scFV-VP64 et les séquences

des épitopes SunTag fusionné avec plTALEs.

5.5.2 La construction plTALEs-ST10X et plTALEs-ST24X

Trois vecteurs ont été construits pour le système de plTALEs-ST. Les deux premiers

vecteurs pCR3.1-plTALE-ST10X et pCR3.1-plTALE-ST24X avec respectivement 10 et

24 SunTag et un vecteur pCR3.1-scFV-SpGFP-VP64-GB1-NLS.

5.5.2.1 La construction de pCR3.1-plTALE-ST10X et de pCR3.1-plTALEs-ST24X

Nous avons remplacé le domaine VP64 par les épitopes SunTag (ST). Le VP64 existe

dans la partie 3’ du plTALE de la construction pCR3.1-plTALE-VP64. Un clonage après

une double digestion a été utilisé pour faire les nouvelles constructions pCR3.1-plTALEs-

ST10X et pCR3.1-plTALEs-ST24X. Les deux enzymes de restriction StuI\XbaI (avec

tampon Cut Smart de New England BioLabs Inc., Ipswich, MA, USA) ont été utilisés

pour ST10X et les deux enzymes de restriction RsrII\XbaI (avec tampon Cut Smart de

New England BioLabs Inc.) pour ST24X. Les inserts ST10X et ST24X ont été obtenus à

partir des vecteurs pHRdSV40-dCas9-10xGCN4_v4-P2A-BFP et pHRdSV40-NLS-

dCas9-24xGCN4_v4-NLS-P2A-BFP-dWPRE (Addgene Inc, Cambridge, Ma, USA). Les

tailles obtenues sont 743 pb pour ST10X, 1773 pb pour ST24X et 7584 pb pour le vecteur

pCR3.1-plTALE avec 13 RVD digéré avec StuI\XbaI ou RsrII\XbaI. Une réaction de

ligation a été faite pour construire pCR3.1-plTALEs-ST10X et pCR3.1-plTALEs-ST24X

avec l’enzyme Quick Ligase (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA). Le produit de

ligation a été utilisé pour transformer les bactéries compétentes DH5α par un choc

thermique et incubation pendant la nuit sur le milieu solide LB-Amp (100 µg/ml).

L’ADN plasmidique extrait des clones positifs ont été sélectionnés par les doubles

digestions (utilisation des enzymes de restriction utilisées dans les clonages) et par le

séquençage avec 4 amorces. La bonne construction validée de chaque clonage a été

utilisée pour construire d’autre pCR3.1-plTALEs-ST10X et pCR3.1-plTALEs-ST24X

qui ciblent d’autres séquences de la région régulatrice du gène FXN. Les nouveaux

plTALEs-ST ont été construits par un clonage effectué après une double digestion avec

MluI/PflMI (New England BioLabs Inc.). Ce clonage a permis de remplacer l’ancien

plTALE contenant 13 RVD avec d’autres plTALEs de tailles 1692 pb (13RVD) et 1892

pb (15RVD) dans les vecteurs linéaires pCR3.1-plTALE-ST10X de taille 6435 pb ou

57

dans un pCR3.1-plTALE-ST24X de taille 7673 pb. Des ligations des inserts et des

vecteurs digérés purifiés ont été faites par l’enzyme Quick Ligase à la température

ambiante pendant 15 min. Les produits des ligations ont été utilisés pour transformer des

bactéries compétentes DH5α par choc thermique suivi d’une incubation à 37 °C pendant

toute la nuit sur un milieu solide LB-Amp (100 µg/µl). Les nouvelles constructions ont

été validées par les doubles digestions et un séquençage par 4 amorces (T7p, TALE-F,

TALE-R et BGH).

Nous avons construit 12 plTALEs-ST qui ciblent des déférentes séquences de la région

régulatrice du gène FXN. 4 plTALEs-ST10X avec 13 RVD ciblant des régions 6, 7, 8, et

10; 4 plTALEs-ST10X avec 15 RVD ciblant les séquences 6,7, 8 et F4; ainsi que 4

plTALEs-ST24X qui ciblent deux séquences 6 et 8 de la région régulatrice du gène FXN

(2 plTALEs-ST24x de 13 RVD et 2 plTALEs-ST24X de 15 RVD).

5.5.2.2 La construction de scFV- SpGFP-Vp64-GB1-NLS (scFV)

Cette construction a été faite dans le plasmide pCR3.1 par un clonage après une double

digestion EcoRI/NoTI (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA, USA) à 37 °C pendant

la nuit. La digestion a été faite sur le pCR3.1 pour libérer un vecteur linéaire de 5017 pb

et sur un plasmide pHRdSV40-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS (Addgene Inc,

Cambridge, Ma, USA) pour libérer un insert de taille 2061 pb. Les deux produits de la

digestion ont été liés par l’enzyme Quick Ligase à la température ambiante pendant 15

min. le produit de ligation a été utilisé pour transformer des bactéries compétente DH5α

et incubé à 37 °C pendant la nuit sur un milieu solide LB-Amp (100 µg/µl). Une colonie

positive a été sélectionnée par un séquençage avec 2 amorces T7p et BGH.

5.5.3 Test plTALEs-ST in vitro

Les activités de ces plTALEs-ST ont été testées in vitro sur des cellules FRDA selon un

protocole de nucléofection. Une quantité de 10 µg d’ADN (4 µg de pCR3.1-scFv plus 6

µg de pCR3.1-plTALEs-ST) a été utilisé pour traiter les cellules de FRDA pendant 2

jours. Nous avons ensuite analysé l’activité de la transcription et de l’expression de gène

FXN dans des cellules traitées et des cellules témoins (les cellules traitées par la solution

de nucléofection et les cellules traitées par les vecteurs vides) par qRT-PCR et western.

58

5.6 pAAV-plTALEs

5.6.1 La construction des pAAV-plTALEs-FT

Nous avons sélectionné cinq plTALEs-FT pour les tester in vivo sur les souris modèles

YG8R. Ces souris contiennent des répétitions GAA de 190 et 90 dans leur premier intron

du gène FXN. Les plTALEs-FT qui ont été testés in vivo sont : 3 plTALE-VP64 ciblant

des séquences 6, 8 et F4 avec 15 RVD, ainsi que 2 plTALE-ST10X ciblant les séquences

6 et 8 avec 15 RVD. Des virus adéno-associés de sérotype 9 (ssAAV9) ont été produits

et purifiés par la plateforme d'outils moléculaires (Centre de recherche Institut

Universitaire en Santé Mentale de Québec) pour délivrer ces effecteurs, afin d’induire le

gène endogène FXN in vivo dans les souris YG8R. Le AAV9 exprime les effecteurs

sélectionnés dans la majorité des tissus grâce au sérotype 9 qui permet de transduire les

virus dans la plupart des tissus des organes de souris tel que le cerveau, le cœur, le foie,

le rein et les muscles [34] [67] [68].

Tout d’abord, les constructions pAAV-plTALE-VP64 et pAAV-plTALE-ST10X ont été

produites dans un vecteur pAAV_TALE-TF(VP64) -BB_V3 (Addgene, #42581,

Cambridge, Ma, USA) (Fig. 36). Ce dernier contient un promoteur de CAG ayant un

pouvoir d’expression similaire au promoteur CMV [34] [69]. Il contient aussi deux

fragments des ITR de chaque côté 3’ et 5’. La taille maximum d’insert utilisé dans ce

vecteur viral pAAV est de 4700 pb.

Figure 36: pAAV_TALE-TF(VP64) -BB_V3 (Https://www.addgene.org).

59

5.6.1.1 La construction pAAV-plTALEs-VP64

Trois pAAV-plTALEs-VP64 ont été construits, ils ciblent trois séquences, 6, 8 et F4 avec

15 RVD. Ils ont été faits par un clonage effectué après une double digestion par deux

enzymes de restriction NheI/MluI. Un vecteur pAAV_TALE-TF(VP64)-BB_V3 a été

digéré par ces deux enzymes pour linéariser le vecteur de clonage. Parallèlement, les 3

inserts plTALE-6-15, plTALE-8-15, et plTALE-F4-15 ont été libérés après la digestion

des constructions pRC3.1-plTALE-6-15, pRC3.1-plTALE-8-15 et pRC3.1-plTALE-F4-

15 par ces deux enzymes NheI/MluI. Les assemblages des constructions finales pAAV-

plTALEs-VP64 ont été faits par Quick Ligase à température ambiante pendant 15 min.

Le produit de ligation a été utilisé pour la transformation des bactéries CC2B (qui

permettent de diminuer la recombinaison homologue d’ADN) avec un choc thermique à

42 ºC pendant 45 s plus une incubation à 37 ºC pendant 1 h et une incubation à 37 ºC

pendant la nuit sur un milieu solide LB-Amp (100 µg/ml).

Les colonies positives ont été cultivées dans un milieu liquide LB-Amp (100 µg/ml), afin

d’extraire les plasmides de constructions pAAV-plTALEs-VP64 par miniprep. Les

constructions ont été validées par un séquençage en utilisant 4 amorces : ITR5’ : CCT

CTG ACT TGA GCG TCG AT (cible 5’ de ITR avant le promoteur), N-ter : TALE-R :

CTC GAA AGC TGG GCC ACG ATT G (cible 3’ du RVD), BGH : TAG AAG GCA

CAG TCG AGG (cible 5’ du VP64) ITR3’ : TAC TAT GGT TGC TTT GAC GT (cible

3’ d’ITR après VP64)

5.6.1.2 La construction pAAV-plTALEs-ST10X

La construction de système pAAV-plTALEs-ST10X a été faite avec 2 constructions. La

première est pAAV-plTALE-ST10X qui exprime les plTALEs-ST10X-6-15 ou les

plTALEs-ST10X-8-15 et la deuxième est pAAV-scFV-SpGFP-VP64-GB1-NLS (pAAV-

scFV) qui exprime le spGFP-VP64. La construction de pAAV-plTALE-ST10X a été faite

par un clonage après une digestion enzymatique avec MluI/PflMI pour le vecteur

pAAV_TALE-TF(VP64) -BB_V3 et pour les inserts plTALEs libérés à partir des

constructions pCR3.1-plTALEs-VP6. Le vecteur et les inserts digérés servent pour faire

les constructions finales pAAV-plTALE-ST10X-6-15 et pAAV-plTALE-ST10X-8-15

après une ligation par Quick Ligase à la température ambiante pendant 15 min. La

construction pAAV-scFV a été faite par un clonage In-fusion entre un vecteur

pAAV_TALE-TF(VP64)-BB_V3 linéaire avec BamHI/EcoRI et un insert de scFV-

SpGFP-VP64-GB1-NLS amplifié par PCR (Amorces; Fwd-homoBamHI_scFV : TTT

60

TTC AGG TTG GAC CGG TGG ATC CAT GGG CCC CGA CAT CGT GAT GAC

CCAG ET et HomoEcoRI_rev : CGA GCT CTA GGA ATT CTC ATT ACG GCC ATG

GCG TAG GCG GCC T). Le produit de la ligation et de clonage In-fusion ont été utilisés

pour transformer les bactéries compétentes CC2B avec un choc thermique à 42 ºC

pendant 45 s, suivi d’une incubation à 37 ºC pendant 1 h et une incubation à 37 ºC pendant

la nuit sur un milieu solide LB-Amp (100 µg/ml).

Les colonies positives ont été cultivées dans un milieu liquide LB-Amp (100 µg/ml), afin

d’extraire les plasmides des constructions pAAV-plTALEs-ST10X et pAAV-scFV par

miniprep. Les constructions ont été validées par un séquençage avec 4 amorces :

ITR5’, N-ter, BGH et ITR3’.

Les constructions pAAV-plTALEs-ST10X sélectionnées et validées ont été testées in

vitro dans les cellules FRDA4078 pour vérifier l’efficacité de ces effecteurs exprimés par

le pAAV sur l’activation du gène endogène FXN par rapport aux contrôles négatifs et aux

pCR3.1-plTALEs-ST10X.

5.7 Test d’aconitase

La diminution dans la protéine de liaison de fer mitochondriale frataxine entraîne une

diminution de l'activité des diverses protéines mitochondriales de fer-soufre, y compris

l'aconitase. Ce dernier catalyse l'isomérisation du citrate en isocitrate [70] [71]. La

modulation réversible de l’aconitase a été utilisée comme biomarqueur des lésions

oxydatives de FRDA. Pour cela, l'activité de 1'acconitase a été mesurée en utilisant un

Kit Aconitase Activity Assay Kit (Sigma-ALORICH, # MAK051, ST. Louis, USA).

Cette activité d'aconitase est déterminée dans une réaction enzymatique couplée dans

laquelle le citrate est converti en isocitrate par l'aconitase (www.Sigma-aldrich.com).

Un million des cellules FRDA4078 traitées par les effecteurs plTALEs-ST10X-6-15 plus

plTALEs-ST10X-8-15 et un million des cellules de chaque contrôle négatif ont été lysées

dans 100 µl de la solution de tampon d'essai. Le matériel insoluble a été éliminé par

centrifugation 800 g pendant 10 minutes à 4 °C. L’extrait cellulaire a été incubé dans la

glace pendant 1 h après l’addition 10 µl de la solution d'activation aconitase. 40 μl de

lysats de cellules entières a été ajoutés à la réaction d'essai avec et sans enzyme mix plus

10 µl de la solution de tampon d'essai. Le résultat de l’activité d’aconitase est un produit

colorimétrique qui a été mesuré à l’absorbance de 450 nm.

61

Chapitre 6 : Résultats

6.1 L’induction du gène FXN in vitro dans les fibroblastes FRDA avec plTALEs-

VP64

6.1.1 La détermination des séquences ciblées

Les protéines de liaison à l’ADN plTALEs ciblent les séquences spécifiques de la région

régulatrice et d’initiation de la transcription du gène FXN située à 220 nucléotides en

amont de site d’ATG (Fig. 37). L’un de ces plTALEs cible aussi une séquence située à

234 nucléotides en aval de l’ATG (Fig. 37). La région ciblée contient des séquences qui

fixent des facteurs de la transcription du gène FXN. Certaines des séquences ciblées fixent

les facteurs de transcription et d’autres ne fixent pas les facteurs de transcription. Elles

commencent toujours par une thymidine T de côté 5’ et elles sont de taille de 13 ou de 15

nucléotides [33] [72]. L’avantage de cibler une séquence plus longue est pour réduire

l’effet de hors cible et augmenter l’efficacité des plTALEs [45].

Figure 37: La localisation schématique des régions ciblées du promoteur et de l’intron 1 du

gène FXN

Onze séquences ont été ciblées au niveau de la partie régulatrice du gène FXN et l’intron

1 (Fig. 38). Dix de ces séquences sont situées en amont du site d’ATG jusqu’à 220

nucléotides et 1 séquence de 15 nucléotides en aval du site d’ATG par 234 nucléotides au

niveau d’intron 1 qui a été ciblée par le plTALE-F4-15 avec 15 RVD. Nous avons produit

14 plTALEs-VP64 qui ciblent ces séquences. 3 plTALEs-VP64 de 13 RVD ciblent des

séquences 1, 2 et 3 situées en amont de site du facteur de la transcription SRF par 48

nucléotides. 6 plTALEs-VP64 ciblent les séquences 6, 7 et 8 situées entre les sites des

facteurs de la transcription SFR et TFAP2 avec 13 et 15 RVD pour chaque séquence

ciblée. Deux plTALEs-VP64 avec 13 RVD ciblent la séquence 10 en amont du site

TFAP2 par 2 nucléotides et la séquence 11 en amont de ce site. Trois plTALEs-VP64

ciblent 3 séquences F2, F3 et F4 correspondants aux séquences des facteurs de la

transcription TFAP2 (13 nucléotides), SP1 (13 nucléotides) et EGR3 (15 nucléotides)

(Tableau 3).

62

Figure 38: Position des séquences ciblées.

Position des séquences ciblées par rapport au site d’ATG des séquences ciblées par les plTALEs

au niveau de promoteur et de l’intron 1 du gène FXN.

6.1.2 La détermination des séquences des RVD

Le nombre de monomères des répétitions RVD des plTALEs est égal au nombre des

nucléotides (13 ou 15) de la séquence ciblée du gène FXN. C’est pour cela que le nombre

de RVD de chaque plTALE-VP64 est soit de 13 ou de 15 RVD selon la longueur de la

séquence ciblée. La détermination de la séquence des RVD de chaque plTALE qui est

complémentaire à la séquence ciblée a été faite selon la complémentarité entre les RVD

et les nucléotides : NG = T, HD = C, NI = A et NN = G [73] (Tableau 3).

Tableau 3: Liste des noms des plTALEs-VP64 avec la séquence des RVD qui sont

complémentaires aux nucléotides ciblés.

63

6.1.3 Les plTALEs-VP64

6.1.3.1 La première étape de la construction des plTALENs

6.1.3.1.1 pFUS2-RVD (pour les plTALENs à 13 RVD)

Nous avons construit trois groupes d’assemblage (V1, V2 et V3), chaque assemblage

contient 4 modules de RVD dans un plasmide de pFUS2. Les bonnes constructions pour

chaque assemblage sont déterminées par la longueur des produits PCR, cette taille avec

les amorces pCR8_F1 et pCR8_R1 est de 639 pb (Fig. 39). Les trois assemblages

successifs correspondent à la séquence des 12 RVD complémentaires aux 12 nucléotides

de la séquence cible de 13 nucléotides (le premier nucléotide étant le T).

Figure 39: PCR pour sélectionner les bonnes constructions de l’assemblage de 4 RVD pour

plTALENs contenant 13 RVD.

6.1.3.1.2 pFUS2-RVD (pour les plTALENs à 15 RVD)

Nous avons construit quatre groupes d’assemblage (V1, V2, V3 et V4), les trois premiers

contiennent 4 modules RVD et le quatrième en contient 2. La taille attendue pour

sélectionner la bonne construction pour chaque assemblage est vérifiée par une PCR

(Amorces pCR8_F1 et pCR8_R1) et est de 639 pb pour l’assemblage de 4 RVD et 439

pb pour l’assemblage de 2 RVD (Fig. 40). Les quatre assemblages successifs

correspondent aux 14 RVD complémentaires aux 14 nucléotides de la séquence ciblée de

15 nucléotides.

64

Figure 40: PCR pour sélectionner l’assemblage de 4 et 2 RVD pour plTALENs à 15 RVD.

6.1.3.2 La deuxième étape des plTALENs

Cette construction a été faite par l’assemblage des vecteurs précédents (V1, V2 et V3

pour pTALENs de 13 RVD et V1, V2, V3 et V4 pour plTALENs de 15 RVD) dans un

seul vecteur de ptCMV-VR. Ce dernier contient le treizième ou le quinzième RVD et la

nucléase FokI spécifique pour copier le double brin d’ADN. La sélection des plTALENs

(13 ou 15 RVD) a été effectuée par PCR (amorces TALE-F et TALE-R) pour sélectionner

les bons assemblages des plTALENs de 13 ou 15 RVD. La taille attendue de cette

sélection est de 1332 pb pour 13 RVD (Fig. 41A) et de 1532 pb pour 15 RVD (Fig. 41B).

Les constructions plTALENs sélectionnées par PCR ont été validées par le séquençage

avec 4 amorces T7p, TALE-F, TALE-R et BGH. Cette technique permet de confirmer les

séquences correctes des constructions positives des plTALEs avec les amorces suivantes :

T7p : séquence du côté 5’de N-ter

TALE-F : séquence du côté 5’des RVD

TALE-R : séquence du côté 3’des RVD

BGH : séquence du coté 3’ du VP64

Figure 41: PCR pour sélectionner l’assemblage final des plTALENs 13 et 15 RVD.

A) La sélection plTALENs à 13 RVD. B) La sélection plTALENs à 15 RVD

65

6.1.3.3 Les constructions pCR3.1-plTALEs-VP64

6.1.3.3.1 Les construction ptCMV-plTALEN-VP64-XbaI

La construction de plTALE-VP64 à partir de plTALEN commence par la construction de

ptCMV-plTALEN-VP64-XbaI. Pour cela, un fragment de VP64 plus le site de XbaI ont

été insérés dans différentes constructions des plTALENs et cela par le clonage ‘In-fusion’

Le clonage In-fusion a été fait avec un insert amplifié par PCR (TALE-VP64-F et TALE-

VP64-R) de taille 657 pb (Fig. 42A) et un vecteur plTALEN linéarisé par BamHI de taille

7766 pb pour plTALENs à 13 RVD et 7966 pb pour les plTALENs à 15 RVD (Fig. 42B).

Figure 42: L’image du vecteur et de l’insert utilisés dans la réaction de clonage In-fusion

pour faire ptCMV-plTALENs-VP64-XbaI :

A) L’insert VP64-XbaI amplifié par TALE-VP64-F et TALE-VP64-R, B) Le résultat de la

linéarisation des plTALENs (13 et 15 RVD) par BamHI.

Les bonnes constructions ptCMV-plTALENs-VP64-XbaI ont été sélectionnées par PCR

(TALE-VP64-F et TALE-VP64-R) et ont été validées par le séquençage avec les mêmes

amorces. La PCR permet de sélectionner les plTALENs qui contiennent l’insert VP64-

XbaI cloné par le clonage In-fusion. Cette technique permet d’amplifier cet insert à partir

des clones positifs. La taille attendue de cette amplification est de 657 pb dans tous les

plTALENs à 13 et à 15 RVD (Fig. 43). La construction finale contient des plTALE-VP64

plus les deux sites de restriction MulI et XbaI. Ces derniers vont servir pour insérer

plTALEs-VP64 dans le pCR3.1 par une double digestion.

66

Figure 43: Le produit de PCR de la sélection des clones positifs plTALENs-VP64-XbaI.

6.1.3.3.2 Les constructions pCR3.1-plTALEs-VP64

C’est la dernière étape de la construction des plTALEs-VP64 par un clonage effectué

après une double digestion (MluI/XbaI) dans un vecteur pCR3.1. Les constructions

ptCMV-plTALENs-VP64-XbaI ont été digérées par une double digestion (MluI et XbaI)

pour libérer les inserts plTALEs-VP64 avec les tailles de 2063 pb pour les 13 RVD et de

2263 pb pour les 15 RVD (Fig. 44 A et B). La taille de vecteur pCR3.1 digéré par les

mêmes enzymes est de 5685 pb (Fig. 45B).

Figure 44: La présentation de l’insert plTALE-VP64 et du vecteur pCR3.1 digéré par MluI

et XbaI pour faire la construction pCR3.1-plTALE-VP64. A) Le produit de la digestion des ptCMV-plTALENs-FokI-VP64 par MluI et XbaI pour liber

l’insert plTALE-VP64. B) L’image présente les inserts plTALEs-VP64 de 13 et 15 RVD et le

vecteur pCR3.1 digéré par MluI et Xbal pour faire les constructions pCR3.1-plTALEs-VP64.

La sélection des clones positifs pour les constructions finales des plTALEs-VP64 a été

faite tout d’abord par une double digestion par MluI et XbaI. Les bons clones positifs

permettent d’obtenir les tailles de 5685 pb et 2063 pb pour les pCR3.1-plTALE-VP64 à

13 RVD et les tailles de 5685 pb et 2263 pour les 15 RVD (Fig. 45). Cette sélection a été

validée par un séquençage.

67

Figure 45: Le produit de la digestion pour sélectionner les constructions positives ayant

pCR3.1-plTALE-VP64.

Le séquençage permet de confirmer les séquences exactes de chaque construction

sélectionnée par la double digestion (MluI et XbaI). Il a été fait grâce à 4 amorces, T7p,

TALE-F, TALE-R et BGH (Fig. 46A) pour séquencer 4 fragments de la construction

N_ter-RVD-C_ter-NLS-VP64 de pRC3.1-plTALEs-VP64. Les résultats de ces

séquençages correspondent aux 4 fragments qui se chevauchent pour donner la séquence

finale de plTALEs-VP64 (Fig. 46C). Exemple de séquençage de plTALE-VP64-6-15 par

4 amorces (Fig. 46 B et C):

- Le séquençage par amorce T7p permet de séquencer le N-ter (720 pb) du coté 5’

jusqu’aux 2 premiers RVD.

- Le séquençage par amorces TALE-F permet de séquencer des séquences des RVD du

coté 5’ à partir du deuxième jusqu’au huitième RVD.

- Le séquençage par amorces TALE-R permet de séquencer 10 derniers RVD du coté 3’

à partir le quinzième RVD.

- Le séquençage par amorces BGH permet de séquencer le dernier RVD, la séquences C-

ter, la séquence NLS qui se trouve en amont de VP64 et les 4 VP16 de VP64. Cette

amorce cible 3’ du VP64.

68

Figure 46: Les séquences des acides aminés de N_ter-15 RVD-C_ter-NLS-VP64 de la

construction plTALE-6-15 qui a été séquencée avec 4 amorces. A) Le schéma représente les différentes parties moléculaires de la construction plCR3.1-plTALE-

VP64 (le promoteur, N-ter, les RVD, C-ter, NLS et VP64) avec les localisations des amorces

utilisées pour le séquençage. B) Le résultat du séquençage par 4 différentes amorces qui ciblent 4 régions différentes au niveau de la construction plTALE-6-15. C) Le chevauchement des 4

séquences des résultats de séquençage qui correspondent à la séquence de plTALE-6-15.

6.1.4 L’induction du gène FXN in vitro par plTALEs-VP64

6.1.4.1 La sélection des meilleurs plTALEs-VP64

L’efficacité de chaque plTALEs-VP64 a été testée sur des fibroblastes du patient

FRDA4078 par une nucléofection et incubation à 37 ºC pendant 3 jours. La nucléofection

permet de délivrer ces effecteurs plTALEs-VP64 dans la majorité des cellules

69

nucléofectées, soit plus de 90 % des cellules après 24 h (a été optimisé auparavant par

notre laboratoire avec cytométrie en flux) (Fig. 47). Ces traitements in vitro ont pour but

de mesurer l’activité de ces effecteurs sur l’augmentation de la transcription et de

l’expression de la frataxine dans des cellules FRDA4078 par rapport aux deux contrôles

négatifs. Ces contrôles sont des cellules nucléofectées juste avec la solution de

nucléofection et des cellules traitées avec le vecteur pCR3.1 vide qui n’exprime pas de

plTALE. Les activités des plTALEs-VP64 ont été mesurées par la quantification de

nombre des copies d’ARNm FXN dans 1 µg d’ARN total extrait à partir ces cellules

FRDA4078 traitées par les plTALEs-VP64. Ainsi, les quantités d’ARNm FXN ont été

normalisées par rapport aux ARNm des gènes GAPDH et HPRT. Les résultats montrent

que l’effet de chaque plTALE-VP64 sur l’augmentation de l’expression du gène FXN

dans les cellules FRDA4078 varie selon la séquence ciblée. Les plTALEs à 13 RVD qui

ciblent les séquences 1, 2, 3, 7, F2, 11 et F3 n’ont pas d’effet sur l’augmentation de

l’expression du gène FXN des cellules FRDA4078 traitées par ces plTALEs-VP64 par

rapport aux contrôles négatifs. Les plTALEs-VP64 qui ciblent les séquences entre les

deux sites des facteurs de la transcription SFR et TFAP2 (séquences 6, 7 et 8) avec 13 et

15 RVD augmentent le niveau de l’expression du gène FXN tel qu’indiqué par

l’augmentation du nombre des copiés d’ARNm FXN dans ces cellules traitées par ces

plTALEs-VP64. Cette augmentation atteint jusqu’à 2 fois par des plTALEs-VP64 à 15

RVD qui ciblent les séquences 6 et 8 (**** p value ˂ 0,0001). Le plTALEs-VP64 qui

cible la séquence F4 avec 15 RVD augmente le nombre de copies d’ARNm FXN dans

des cellules FRDA4078 par plus que deux fois (**** p value ˂ 0,0001). Ces

augmentations significatives ont été normalisées par rapport le gène GAPDH et par

rapport aux contrôles négatifs. Donc les plTALEs avec 15 RVD sont plus efficaces que

les plTALEs avec 13 RVD qui ciblent les mêmes séquences au niveau des régions

régulatrices du gène FXN (Fig. 48 A et B).

Par la suite nous avons sélectionné les 3 meilleurs plTALEs-VP64 (plTALE-6-15,

plTALE-8-15 et plTALE-F4-15) qui augmentent le plus l’activité transcriptionnelle du

gène FXN dans les cellules FRDA4078 par rapport aux contrôles négatifs. L’efficacité de

ces 3 plTALEs sur l’augmentation significatives de la transcription du gène FXN dans les

cellules FRDA4078 a été testée plusieurs fois (n=10) (**** p value ˂ 0,0001) pour

vérifier l’effet de ces plTALEs sur l’induction de l’activité transcriptionnelle du gène

FXN par rapport aux témoins (Fig. 48 C). Le résultat montre que les 3 plTALEs-VP64

70

induisent l’activité transcriptionnelle du gène FXN avec une faible variation entre leurs

efficacités.

Figure 47: L’image représentative des fibroblastes FRDA4078 en culture, 24 h après la

nucéofection avec un plasmide contenant le gène GFP.

Figure 48: L’induction du gène FXN dans les cellules FRDA4078 par des plTALEs-VP64. A) L’augmentation de l’activité transcriptionnelle du gène FXN normalisée par rapport au gène

GAPDH des cellules FRDA4078 traitées avec 14 différents plTALEs-VP64) (**** p value ˂

0,0001). B) Nombres de copies d’ARNm de FXN dans un 1 µg d’ARN total extrait de cellules

traitées ou de cellules témoins (**** p value ˂ 0,0001). C) L’induction du gène FXN par les 3 meilleurs plTALEs-VP64 par rapport aux témoins (n=10) (**** p value ˂ 0,0001).

71

6.1.4.2 L’effet synergique des plTALEs-VP64 sur l’induction du gène FXN des

cellules FRDA4078

Nous avons traité les cellules FRDA4078 simultanément avec plusieurs plTALEs-VP64

(10 µg d’ADN) qui ciblent différentes séquences pour vérifier la présence d’effets

synergiques [74] [75] de ces effecteurs sur l’induction du gène FXN des cellules

FRDA4078 par rapport aux contrôles négatifs. Nous avons utilisé pour cette approche les

plTALEs-VP64 les plus efficaces en combinaison de 2, 3 ou 4 meilleurs plTALEs-VP64

ensembles. Les résultats montrent que le nombre de copies d’ARNm FXN augmente

encore plus lorsque nous avons traité ces cellules avec plusieurs plTALEs-VP64 par

rapport aux contrôles négatifs. L’effet synergique augmente la transcription du gène FXN

normalisé par rapport à GAPDH jusqu’à 3 fois lorsque nous avons utilisé 4 effecteurs qui

ciblent les séquences 6-15, 8-15, 10-13 et F4-15. Donc l’effet synergique de certains

plTALEs-VP64 induit la transcription du gène FXN encore plus par rapport aux contrôles

et par rapport à l’effet d’un seul plTALE-VP64 (Fig. 48).

6.1.4.3 L’induction de l’expression de la protéine frataxine par les effecteurs

plTALEs-VP64

Nous avons analysé l’effet de ces 3 meilleurs plTALEs-VP64 sélectionnés qui ciblent les

séquences 6, 8 et F4 avec 15 RVD sur l’expression de la protéine frataxine par western

blot. Les résultats ont été normalisés par GAPDH et par rapport au contrôle négatif (les

cellules traitées par pCR3.1 vide). Ces analyses montrent que ces 3 effecteurs augmentent

aussi l’expression de la protéine frataxine (Fig. 49). D’après le contrôle négatif, cette

augmentation est de 2,5 fois avec plTALE-6-15 et un peu plus que 2,5 fois avec plTALEs-

8-15, plTALE-F4-15 et avec la combinaison de plTALEs-6-15 et 8-15 ensemble. La

combinaison de 3 plTALEs n’augmente l’expression de la frataxine que de 1,9 fois par

rapport au contrôle négatif. Donc ces 3 plTALEs n’ont pas un effet synergique sur

l’expression de la frataxine par rapport à l’effet d’un seul plTALE (Fig. 49).

72

Figure 49: L’induction de l’expression de la protéine frataxine dans les cellules FRDA4078

L’induction de l’expression de la protéine frataxine dans les cellules FRDA4078 traitées avec 3

plTALEs-VP64 sélectionnées et avec une combinaison de 2 et de 3 plTALEs-VP64 par rapport aux cellules témoins.

6.1.4.4 Traitement des cellules FRDA provenant de 4 patients avec des plTALEs-

Vp64 sélectionnés.

Le nombre de répétitions de GAA varie d’un patient à l’autre. Cette variation influence

forcément l’activité transcriptionnelle du gène FXN et donc le niveau d’expression de la

protéine frataxine. Pour vérifier l’efficacité de cette approche thérapeutique, nous avons

traité les fibroblastes de 4 patients FRDA avec les meilleurs effecteurs plTALEs-VP64

sélectionnés auparavant (Fig. 50). Ces fibroblastes contiennent différents nombres de

répétitions de triplet GAA, cellules FRDA66 (240/640), FRDA162 (355/805),

FRDA4675 (255/1140) et FRDA4743 (470\970). Elles ont été traitées pendant 3 jours

avec des plTALEs-VP64-6-15, plTALEs-VP64-8-15 et plTALEs-VP64-F4-15.

L’activité de chaque plTALEs-VP64 sur chaque cellule de FRDA a été normalisée par

rapport aux gènes GAPDH et HPRT et par rapport aux 2 contrôles négatifs (les cellules

non traitées et les cellules traitées par un vecteur vide pCR3.1). Nous avons détecté des

effets positifs dans les 4 FRDA traitées avec les 3 plTALEs-VP64. Ces derniers

augmentent le nombre de copies d’ARNm du gène FXN environ 2 fois dans les 4 FRDA.

Ces activités ont été normalisées avec les gènes GAPDH et HPRT et montrent une

augmentation d’environ 2 fois dans les FRDA162 (355/805) et FRDA4743 (470\970) et

plus que 2 fois dans les FRDA4675 (255/1140) et FRDA66 (240/640) par les 3 plTALEs-

VP64. Ces résultats montrent que les trois plTALEs-VP64-6-15, plTALEs-VP64-8-15 et

plTALEs-VP64-F4-15 induisent la transcription du gène FXN dans les cellules FRDA

ayant différents nombres de répétitions du triplet GAA. Donc ces plTALEs-Vp64 sont

efficaces même avec un grand nombre de répétitions de GAA dans le gène FXN de

73

255/1140 et de 470/970 qui causent un silence épigénétique et une forte diminution de

l’expression de la protéine FXN.

Figure 50: L’induction du gène FXN dans 4 différents types de cellules FRDA avec les

plTALEs-PV64-6-15, 8-15 et F4-15 par rapport aux témoins.

6.1.4.5 L’induction de l’expression de la protéine frataxine par les effecteurs

plTALEs-VP64 dans des cellules provenant de 2 patients FRDA

Nous avons analysé l’efficacité de ces effecteurs plTALEs-VP64 sélectionnés auparavant

par l’induction de l’expression de la protéine frataxine dans les cellules de deux patients

FRDA ayant un grand nombre de répétitions (FRDA4675, avec 255 et 1140 répétitions

et FRDA4743 ayant 470 et 970 répétitions) (Fig. 51). Les résultats montrent que les

effecteurs plTALEs-VP64 augmentent l’expression de la protéine frataxine des cellules

74

FRDA traitées. Dans les FRDA4675 l’augmentation est environ 2 fois avec les plTALE-

VP64-6-15, plTALE-VP64-8-15 et plTALE-F4-15, ainsi que dans les FRDA4743 traitées

avec le plTALE-VP64-6-15 et plus que 1,5 fois avec les plTALE-VP64-8-15 et plTALE-

VP64-F4 dans les mêmes cellules.

Ces résultats suggèrent fortement que les effecteurs plTALEs-VP64 qui ciblent des

séquences spécifiques peuvent activer la transcription du gène endogène FXN, ainsi que

l’expression de la protéine frataxine des cellules traitées.

Figure 51: L’induction de l’expression de la protéine frataxine dans deux autre cellules

FRDA traitées avec les plTALEs-VP64 par rapport aux contrôles négatifs.

6.2 Les vecteurs lentiviraux comme outils pour l’expression génétique des plTALEs-

VP64 dans les cellules FRDA.

6.2.1 Les vecteurs pLenti-plTALE-VP64

La construction des pLenti-plTALE-VP64 a été faite par un clonage après une double

digestion par BstI/XbaI. Le vecteur linéaire de taille 10254 pb contient un promoteur

EF1. Les 3 inserts plTALEs-VP64 avec 15 RVD (2724 pb) ont été libérés après la

digestion des constructions pCR3.1-plTALEs-VP64 qui ciblent les séquences 6-15, 8-15

et F4-15. Les produits de la digestion ont été purifiés avant la ligation (Fig. 52). La

transformation de produit de ligation donne des colonies qui contiennent les bonnes

75

constructions pLenti-plTALEs-VP64. Ces dernières ont été sélectionnées par une double

digestion (BstI/XbaI) après l’extraction d’ADN plasmidique (Fig. 53). Les 3

constructions sélectionnées ont été validées par le séquençage avec 4 amorces SALE-1-

F, TALE-F, TALE-R et SALE-1-R, permettent de séquencer les fragments N-ter du coté

5’, RVD du coté 5’, RVD du coté 3’ et les 4 VP16 du coté 3’ (exemple le séquençage de

pLenti-plTALE-F4-15) (Fig. 54).

Figure 52: Les produites de digestion purifiée des vecteur pCR3.1 et des inserts digérés par

BstI/XbaI pour faire les constructions pLenti-plTALEs-VP64.

Figure 53: La sélection des clones positives pLenti-plTALEs-VP64 par une double digestion

(BstI/XbaI).

A) La sélection pLenti-plTALEs-6-15. B) La sélection pLenti-plTALEs-8-15 et pLenti-plTALEs-

F4-15.

76

Figure 54: Le résultat de séquençage pLenti-plTALE-VP64-11-15 avec 4 amorces; Les 4 amorces sont : SALE-1-F, TALE-F, TALE-R et SALE-1-R.

6.2.2 L’infection des cellules FRDA4078 avec les lentivirus qui expriment plTALEs-

VP64

Nous avons infecté les cellules FRDA4078 avec les lentivirus produits et purifiés (avec

ultracentrifugation) qui expriment les plTALEs-VP64-6-15, plTALEs-VP64-8-15 et

plTALEs-VP64-F4-15 et les lentivirus qui n’expriment pas un plTALE-VP64 comme

contrôle négatif avec un MOI égale à 1. Un changement de milieu a été fait après 24 h

puis les cellules infectées ont été passées après 3 jours. A 95% de confluence, les cellules

infectées avec les différents lentivirus et les cellules témoins ont été récoltées par un

traitement à la trypsine 0,25% dans le but d’analyser le taux de transcription du gène FXN

par qRT-PCR utilisant des amorces qui ciblent les ARNm de FXN, de GAPDH et de

HPRT. Après l’extraction d’ARN une extraction des protéines a été faite pour analyser

l’expression de la frataxine dans ces cellules traitées par rapport aux témoins. Les résultats

obtenus (Fig. 55) montrent une faible augmentation non significative de l’activité

transcriptionnelle du gène FXN dans les FRDA4078 traitées par les lentivirus qui

expriment plTALEs-6-15 et plTALEs-8-15 par rapport aux témoins. Une absence de

l’induction du gène FXN dans les cellules FRDA4078 traitées par les lentivirus qui

expriment plTALE-F4-15. Le taux d’ARNm a été normalisé avec les gènes GAPDH et

HPRT et par rapport aux témoins. Les mêmes effets ont été obtenus sur l’expression de

la protéine frataxine (Fig. 56). Les lentivirus qui expriment le plTALE-6-15 et plTALE-

8-15 augmentent l’expression de la protéine par 1,2 et 1,4 fois normalisée par le gène

GAPDH et par rapport aux contrôles négatifs et une diminution de l’expression de la

77

frataxine dans les cellules infectées par les lentivirus qui expriment plTALEs-VP64-F4-

15. Ces résultats montrent que les lentivirus qui expriment plTALEs-VP64 avec

promoteur EF-1 sont moins efficaces par rapport aux plasmides pCR3.1-plTALEs-

VP64 (ayant un promoteur CMV) qui ciblent les mêmes séquences et qui ont été

nucléofectés dans les cellules FRDA4078.

Figure 55: L’activité transcriptionnelle du gène FXN dans les cellules FRDA4078 traitées

avec les lentivirus qui expriment plTALEs-VP64 par rapport aux témoins négatifs. A) le taux de la transcription du gène FXN normalisé par le gène GAPDH (p value = 0,2799). B)

Le taux de la transcription du gène FXN normalisé par le gène HPRT (p value = 0,2755).

78

Figure 56: L’analyse de l’expression de la protéine frataxine dans les cellules FRDA4074

traitées avec les lentivirus qui expriment plTALEs-VP64 par rapport aux témoins négatifs

Le plenti-TALE8 est un lentivirus qui exprime le TALE-VP64 classique qui cible la séquence 8-

13. Il a été sélectionné par Chapdelaine, P. et al en 2013 [33].

6.3 L’amélioration de la spécificité et de l’affinité des plTALEs avec de nouvelles

séquences nRVD (nplTALEs)

6.3.1 Les nplTALEs-VP64

Dans le but d’améliorer notre approche thérapeutique, nous avons construit des

nplTALEs-VP64 pour augmenter la spécificité et l’affinité des RVD afin d’améliorer

l’efficacité des plTALEs qui ciblent des séquences au niveau de la région régulatrice du

gène FXN. Tout d’abord, des mutations ont été faites sur les nucléotides codant pour

l’acide aminé en position 12 dans les RVD. Des mutations ont permis de remplacer les

NI, NG, et NN par respectivement CI, HG et EN dans les nouveaux RVD. Ces nouveaux

RVD contiennent aussi 34 acides aminés et ne différent des RVD normaux que par des

substitutions des nucléotides codant pour l’acide aminé en position 12. Ces changements

de bases sont AAC en TGC (NI en CI), AAC en CAC (NG en HG) et AAC en GAG (NN

en EN) (Tableau 4). Par la suite, 2 nouveaux nplTALEs-VP64 de 15 RVD ont été

construits par les nouveaux modules nRVD, selon le même protocole et les mêmes étapes

de la construction des plTALEs-VP64 décrits dans la partie 5.1. Ces nplTALEs-VP64

contiennent les nouveaux RVD et ils ciblent les séquences 8-15 et F4-15. Les

constructions finales des nplTALEs-VP64 ont été faites dans le vecteur pCR3.1 par un

clonage après une digestion enzymatique (MluI et XbaI) pour les constructions ptCMV-

nplTALENs-VP64 et le vecteur pCR3.1. Ce clonage a été fait par un vecteur pCR3.1

linéaire de taille 5685 pb et l’insert nplTALE-VP64 de taille de 2263 pb (Fig. 57) pour

faire de nouveaux nplTALEs-VP64 qui ciblent les séquences 8-15 et F4-15 (Tableau 5).

79

Ces constructions ont été validées après séquençage avec 4 amorces différentes (T7p,

TALE-F, TALE-R et BGH) comme nous l’avons indiqué précédemment (exemple de

séquençage nplTALEs-VP64-8-15 (Fig. 58).

Tableau 4: Les codons des nouveaux et des anciens RVD avec leurs nucléotides cibles.

Figure 57: Les produits de purification du vecteur pCR3.1 et des nplTALEs-VP64-6-15 et

11-15 digérés par MluI et XbaI pour faire les constructions pCR3.1-nplTALEs-VP64.

Tableau 5: La liste des nplTALE-VP64 avec leurs séquences des nRVD et leurs séquences

cibles

80

Figure 58: Le résultat du séquençage de nplTALE-8-15-VP64 avec 4 amorces. A) le résultat du séquençage avec chaque amorce qui cible une région de la construction pCR3.1-

nplTALE-VP64. B) La figure illustre le chevauchement des résultats de séquençage du plasmide

nplTALE-VP64-8-15.

6.3.2 Des nplTALE-VP64 qui ciblent le promoteur du gène FXN pour induire la

transcription du gène

Les nplTALEs-VP64 ont été testés in vitro sur les cellules FRDA4078 après une

nucléofection pour analyser leurs effets après 3 jours sur l’augmentation de l’activité

transcriptionnelle du gène FXN des cellules traitées. Des analyses de qRT-PCR ont été

faites pour quantifier le nombre de copies d’ARNm du gène FXN dans ces cellules

traitées, l’activité de la transcription a été normalisée par rapport aux gènes GAPDH et

HPRT et par rapport aux contrôles négatifs (les cellules FRDA4078 non traitées et les

cellules traitées par un plasmide pCR3.1 vide) (Fig. 69).

Les résultats montrent que le nombre de copies d’ARNm FXN n’augmente pas dans ces

cellules traitées avec les nplTALE-VP64-8-15 et nplTALE-VP64-F4-15 par rapport aux

contrôles négatifs. Le taux d’ARNm qui a été normalisé avec les gènes GAPDH et HPRT

ne change pas dans ces cellules traitées par rapport aux témoins. Ces 2 nplTALE-VP64

avec des nRVD ; CI, NN et NG n’activent pas le gène FXN in vitro dans les cellules

FRDA4078. Donc, la spécificité des nRVD vers les séquences cibles a été diminuée c’est

81

pour cela l’efficacité de ces 2 effecteurs avec VP64 qui ciblent 8-15 et F4-15 diminue

aussi par rapport aux plTALEs-VP64 qui ciblent les mêmes séquences.

Figure 59: L’activité de gène FXN dans les cellules FRDA4078 traitées par nplTALEs-VP64

et dans les cellules témoins.

A) Le nombre de copies d’ARNm FXN dans les cellules FRDA4078 traitées par nplTALEs-VP64

et dans les cellules témoins. B) et C) L’activité transcriptionnelle du gène FXN dans ces cellules normalisées par les gènes GAPDH (p value = 0,7857) et HPRT (p value = 0,9063).

6.4 Le changement épigénomique du gène FXN avec l’acétyltransférase p300

fusionné avec des plTALEs

6.4.1 Les plTALEs-p300

Au lieu d’utiliser un domaine d’activation de la transcription tel que VP64, nous avons

aussi essayé d’augmenter la transcription par un changement épigénétique du gène FXN

avec l’acétyltransférase p300 tel que rapporté pour le gène IL1RN, MYOD et OCT4 [65].

Pour cela, 3 plTALEs-p300 qui ciblent les séquences 6-15, 8-15 et F4-15 (Fig. 60)

(Tableau 6) ont été construits dans le plasmide pCR3.1 qui contient le promoteur CMV.

Les plTALEs-p300 ont été faits par le clonage In-fusion entre les vecteurs pCR3.1-

plTALEs et l’insert p300. Un fragment de p300 de taille 2010 pb a été amplifié par PCR

avec 2 amorces, p300_info_F et p300_info_F. Parallèlement, une digestion enzymatique

a été faite sur pCR3.1-plTALEs-VP46-6-15, pCR3.1-plTALEs-VP46-8-15 et pCR3.1-

plTALEs-VP46-F4-15 pour éliminer le fragment de VP64 et le remplacer par le p300. Le

vecteur linéaire obtenu est de 7800 pb contient le N-ter, les RVD et le C-ter (Fig. 61). Les

clones positifs ont été sélectionnés après séquençage avec deux amorces, p300_info_F et

p300_info_R qui permettent de séquencer du côté 5’ et 3’ de p300, afin de vérifier les

séquences correctes de ces constructions.

Le séquençage permet d’identifier les bonnes constructions plTALEs-p300-6-15,

plTALEs-p300-8-15 et plTALEs-p300-F4-15 qui contiennent p300 pour les tester in vitro

sur les cellules des FRDA4078. Le même protocole de nucléofection a été utilisé pour

82

traiter ces cellules avec ces effecteurs suivi par des analyses de qRT-PCR et western pour

vérifier l’activité de ces plTALEs-p300.

Figure 60: La structure moléculaire de plTALE-P300 dans le pCR3.1 contient le promoteur

CMV, le N-ter, le RVD, le C-ter, le NLS-VP64 et le p300.

Tableau 6: La liste des plTALE-p300 avec leurs séquences RVD et leurs séquences cibles.

Figure 61: La présentation des fragments du vecteur linéaire et de l’insert utilisés dans le

clonage In-fusion pour construire les plTALEs-p300.

A) Le produit de la digestion pRC3.1-plTALEs-VP64 par AccIII et ApaI. B) Le produit d’amplification de p300 avec 2 amorces, p300_info_F et p300_info_F.

6.4.2 L’induction du gène FXN par plTALE-p300

Les cellules FRDA4087 ont été traitées par ces 3 plTALEs-p300. Par la suite, des analyses

ont été faites sur l’activité de la transcription et de l’expression du gène FXN dans ces

cellules traitées par rapport aux contrôles négatifs (les cellules non traitées et les cellules

traitées par pCR3.1 vide) (Fig. 62). Les résultats montrent que ces plTALEs-p300

n’activent pas fortement la transcription du gène FXN dans les cellules traitées par rapport

aux contrôles négatifs. Le nombre de copies d’ARN augmente un peu suite au traitement

avec le plTALEs-p300-8-15 (une augmentation significative) et le plTALE-p300-6-15

(une augmentation non significative) par rapport aux contrôles négatifs avec une absence

d’effet de plTALE-p300-F4-15. Le taux de l’activité transcriptionnelle a été normalisé

par rapport aux gènes GAPDH et HPRT et montre des augmentations significatives

83

d’environ 1,5 fois par plTALE-p300-8-15, 1,2 fois par plTALEs-p300-6-15 et moins

d’une fois par plTALE-p300-F4-15 par rapport aux contrôles négatifs.

Les effets des plTALEs-p300 sont très faibles par rapport aux effets des plTALEs-VP64

qui ciblent les mêmes séquences. Donc, pour activer le gène endogène FXN, les effecteurs

VP64 sont beaucoup plus puissants que les effecteurs p300 fusionnés avec des plTALEs

qui ciblent les séquences au niveau du promoteur et de l’intron 1 du gène FXN.

Figure 62: La transcription du gène FXN dans les cellules traitées par les plTALEs-p300 et

les cellules témoins.

A) Le nombre de copies d’ARNm FXN dans les cellules traitées et les cellules témoins (* p value = 0,0202). B) et C) Le taux d’augmentation de la transcription du gène FXN normalisé par deux

gènes GAPDH (** p value = 0,0085, **** p value ˂ 0,0001) et HPRT (** p value = 0,0285, ****

p value ˂ 0,0001).

Nous avons testé les effets synergiques des différentes combinaisons des plTALEs-VP64

avec plTALEs- p300 et de plusieurs plTALE-p300 ensemble ciblant les différentes

séquences du gène FXN (Fig. 63). Des analyses ont été faites sur les effets synergiques

de ces effecteurs sur la transcription du gène FXN des cellules FRDA4078 normalisé par

rapport aux gènes GAPDH et HPRT et par rapport aux contrôles négatifs. Les résultats

montrent que l’activité transcriptionnelle du gène FXN dans les cellules FRDA4078

augmente par l’effet de combinaison plTALE-VP64-6-15 et plTALE-p300-8-15 environ

de 2 fois. Les résultats précédents montrent que plTALE-VP64-6-15 augmente aussi

l’activité transcriptionnelle du gène FXN dans les cellules FRDA4078 environ 2 fois. Le

même effet a été observé lorsque ces cellules ont été traitées par 2 autres effecteurs

ensemble plTALE-VP64-8-15 et plTALE-p300-6-15. Donc l’effet de la combinaison de

ces 2 plTALEs (VP64 + p300) n'active pas plus la transcription du gène FXN, que l’effet

d’un seul effecteur VP64. Ainsi les combinaisons plTALE-VP64 et plTALE-p300 qui

ciblent les séquences 6 et 8 n’ont pas d’effet synergique sur l’induction du gène FXN

dans les cellules FRDA4078. Par contre, l’utilisation d’une combinaison des 2 plTALEs-

84

p300 qui ciblent les séquences 6-15 et 8-15 dans ces cellules, augmente significativement

l’activité transcriptionnelle du gène FXN environ 2 fois par rapport aux contrôles. Donc

la combinaison des 2 plTALEs-p300 a un effet synergique sur l’augmentation de l’activité

transcriptionnelle du gène FXN des cellules FRDA4078 par rapport aux contrôles

négatifs et par rapport à l’effet d’un seul plTALE-p300. Cette activité est l’équivalente à

l’effet d’un seul plTALE-VP64 avec 15 RVD qui ciblent séquences 6-15, 8-15 ou F4-15.

Figure 63: L’activité transcriptionnelle du gène FXN avec l’effet synergique des effecteurs

VP64 + p300 et plusieurs p300 ensemble qui ciblent séquences 6, 8 et F4.

Les effecteurs utilisés pour ce test VP64-6 (plTALE-VP64-6-15), VP64-8 (plTALE-VP64-8-15),

p300-6 (plTALE-p300-6-15), p300-8 (plTALE-p300-8-15). Les résultats statistiques de ce test sont (* p value = 0,0349) pour le GAPDH et (* p value = 0,0114 et ** p value ˂ 0,0063) pour

HPRT.

Nous avons analysé l’effet des plTALEs-p300 qui ciblent des séquences 6-15, 8-15 et F4-

15 sur l’expression de la protéine frataxine dans les cellules FRDA4078 traitées par ces

effecteurs (Fig. 64). Les protéines extraites après l’extraction d’ARNm ont été analysées

par western blot. Le taux d’expression de la protéine a été normalisé par rapport au gène

GAPDH et par rapport aux contrôles négatifs. Les résultats montrent que les effecteurs

p300 fusionnés avec plTALEs et qui ciblent les séquences 6-15, 8-15 et F4-15 réduisent

l’expression de la protéine frataxine de 30% pour les plTALE-p300-6-15 et plTALE-

p300-8-15 et de 60% pour plTALE-p300-F4-15. L’utilisation de p300 et de VP64

ensemble diminue aussi l’expression de la frataxine. Par contre, l’utilisation 2 plTALE-

p300 qui ciblent les séquences 6-15 et 8-15 augmentent l’expression de la frataxine

environ 2 fois. Donc, l’effet des effecteurs p300 sur l’induction du gène FXN entraine un

changement épigénétique de ce gène. Ce changement apparait avec l’utilisation de

plusieurs plTALEs-p300 qui ciblent différentes séquences au niveau du site d’initiation

de la transcription du gène FXN.

85

Figure 64: L’analyse de l’expression de la protéine frataxine dans les cellules traitées avec

plTALE-p300 et avec plusieurs effecteurs VP64 et p300 et dans les cellules témoins.

6.5 L’induction du gène FXN avec plTALEs-SunTag qui recrute 10 ou 24 copies de

VP64

6.5.1 La construction plTALEs-SunTag10X et plTALE-SunTag24X

Les résultats précédents ont montré que les effecteurs plTALE-VP64 avec 15 RVD, qui

ciblent les séquences 6-15, 8-15 et F4-15 et qui sont insérés dans le pCR3.1 qui contient

le promoteur CMV, induisent le gène FXN environ le double dans les cellules de FRDA.

C’est pourquoi nous avons essayé un nouveau système qui utilise tous les avantages de

plTALE-VP64 mentionnés auparavant, mais à l’aide de 10 ou de 24 VP64 au lieu d’un

seul VP64, nous avons donc produit des plTALE-SunTag10X (plTALE-ST10X) et des

plTALEs-SanTag24X (plTALE-ST24X).

Nous avons construit plusieurs pCR-3.1-plTALE-ST10X et pCR-3.1-plTALE-ST24X

(Fig. 65 A) (Tableaux 7 et 8) qui expriment le plTALE-ST10X et plTALE-ST24X, et

nous avons produit un pCR3.1-scFV-SpGFP-Vp64-GB1-NLS qui exprime le scFV-

spGFP-VP64 (Fig. 65 B). Cette protéine scFV-spGFP-VP64 se lie avec le ST qui est

fusionné avec les plTALEs pour induire le gène FXN. Les plTALE-ST10X et plTALE-

ST24X peuvent recruter respectivement 10 et 24 VP64 selon le nombre d’épitopes ST

fusionnés avec le plTALE qui ciblent le gène FXN. Des vecteurs pRC3.1-plTALEs-

StuI/XbaI (13 RVD) et pRC3.1-plTALEs- RsrII\XbaI (13 RVD) et des inserts ST10X-

StuI/XbaI et ST24- RsrII/XbaI ont été purifiés après une digestion enzymatique pour faire

des clonages des premières constructions plTALE-ST10X et plTALE-ST24X. Les tailles

des fragments ont été analysées sur un gel d’agarose 1% pour chaque produit de double

digestion. Nous avons ainsi obtenu les fragments de 7584 pb pour pRC3.1-plTALEs-

86

StuI/XbaI (13 RVD), de 743 pb pour l’insert ST10X- StuI/XbaI, de 7592 pb pour les

vecteurs pRC3.1-plTALEs- RsrII\XbaI (13 RVD) et 1773 pb pour l’insert ST24-

RsrII\XbaI. Des réactions de ligation ont été faites pour faire les premières constructions

de pCR3.1-plTALE-ST10X (13 RVD) et de pCR3.1-plTALE-ST24X (13 RVD). Les

constructions ont été validées par le séquençage avec 4 amorces, T7p, TALE-F, TALE-

R et BGH (Fig. 65 A) qui permettent de séquencer 4 fragments de la construction

plTALE-ST. Ces constructions validées ont été utilisées pour faire le reste des plTALE-

ST10X et plTALE-ST24X par un clonage après une double digestion avec deux enzymes

MluI/PflMI pour remplacer les plTALEs spécifiques pour chaque séquence cible dans la

construction initiale de plTALE-ST. Le séquençage par 4 amorces a été utilisé pour

valider les constructions de pRC3.1-plTALE-ST sélectionnées après ces clonages (un

exemple de séquençage de plTALE-ST10X-8-13 par T7p, TALE-F, TALE-R et BGH est

illustré dans la Fig. 66. Parallèlement, la construction pCR3.1-scFV- SpGFP-Vp64-GB1-

NLS a été effectuée par un clonage après une double digestion par EcoRI/NotI. Ce

clonage a été fait dans un vecteur de pCR3.1 digéré (EcoRI/NotI) et purifié (fragment de

5017 pb) et avec un insert purifié de 2061 pb obtenu après une digestion enzymatique par

les mêmes enzymes. Ces fragments (le vecteur + l’insert) ont été utilisés pour faire la

construction finale qui a été validée par le séquençage avec deux amorces T7p et BGH.

Figure 65: La structure moléculaire de plTALE-ST10X/24X

A) La structure de pCR3.1-plTALE-ST exprime le plTALE fusionné avec 10 ou 24 épitopes SunTag (ST) qui recrutent les scFV-sfGFP-VP64. B) La structure moléculaire de scFV- sfGFP-

VP64-GB1-NLS qui exprime le spGFP-VP64 qui se lie avec ST pour activer le gène FXN.

Nous avons construit au total 12 différents plTALEs-ST. Quatre d’entre eux contiennent

13 RVD et 10 ST (i.e., plTALE-ST10X) et ciblent les séquences 6, 7, 8 et 10 (plTALE-

ST10X-6-13, plTALE-ST10X-7-13, plTALE-ST10X-8-13et plTALE-ST10X-10-13).

Quatre autres contiennent 15 RVD et 10 ST (i.e., plTALE-ST10X) et ciblent les

séquences 6, 7, 8 et F4 (plTALE-ST10X-6-15, plTALE-ST10X-7-15, plTALE-ST10X-

8-15 et plTALE-ST10X-F4-15) (Tableau 7). De plus 4 autres plTALEs-ST contiennent

13 ou 15 RVD et 24 ST et ciblent les séquences 6 et 8 (i.e., plTALE-ST24X-6-13,

87

plTALE-ST24X-6-15, plTALE-ST24X-8-13 et plTALE-ST24X-8-15) (Tableau 8).

Nous avons utilisé ces systèmes plTALEs-ST pour traiter les cellules FRDA4078 in vitro

par nucléofection, afin, d’analyser le taux de la transcription et de l’expression du gène

FXN des cellules FRDA4078 traitées par ces effecteurs plTALEs-ST. Par la suite, nous

nous sélectionné les meilleurs plTALEs-ST pour induire l’expression du gène FXN pour

des tests supplémentaires sur d’autres cellules FRDA in vitro et sur le modèle de souris

YG8R in vivo.

Tableau 7: La liste des plTALEs-ST10X.

Tableau 8: La liste des plTALEs-ST24X.

88

Figure 66: Le résultat de séquençage pCR3.1-plTALE-ST10X-4-13 avec 4 amorces.

6.5.2 Traitement in vitro des cellules FRDA4078 par le système de plTALE-ST

Nous avons traité les cellules FRDA4078 par ces nouveaux plTALEs-ST pendant 2 jours

pour analyser leurs effets sur l’activité de la transcription et l’expression du gène FXN.

Les effets des plTALEs-ST ont été normalisés par rapport aux gènes GAPDH et HPRT

et par rapport aux contrôles négatifs (les cellules non traitées et les cellules traitées par le

vecteur qui exprime scFV plus le vecteur pCR3.1 vide) (Fig. 67). Les résultats montrent

que les plTALEs-ST10X sont meilleurs que les plTALEs-ST24X. Ces derniers

augmentent la transcription du gène FXN dans les cellules FRDA4078 au maximum 2

fois pour le plTALE-ST24X-6-15 (augmentation significative). Au contraire, les

plTALEs-ST10X qui ciblent les régions 6-15 et 8-15 sont très efficaces. Ils augmentent

l’activité transcriptionnelle du gène FXN dans ces cellules FRDA4078 plus que

plTALEs-ST24X. On constate une augmentation significative de plus de 5 fois par le

plTALEs-ST10X-6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 (n = 6) normalisés par GAPDH et HPRT

et par rapport aux contrôles négatifs. Ces résultats confirment aussi que les plTALE-

ST10X avec 15 RVD ciblant les séquences 6 et 8 sont plus efficaces que les 13 RVD qui

ciblent ces mêmes séquences pour augmenter l’activité transcriptionnelle du gène

endogène FXN dans les cellules FRDA4078. Ces 2 meilleures plTALEs-ST10X

augmentent aussi l’expression de la protéine frataxine dans ces cellules FRDA4078

traitées pendant deux jours. Cette augmentation est de 3 fois dans des cellules traitées par

des plTALEs-ST10X-6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 et de 2 fois dans des cellules traitées

par plTALEs-ST10X-8-13 normalisé par GAPDH et par rapport au témoin. Les 4

89

plTALEs-ST24X et plTALEs-ST10X-7-13 n’augmentent pas l’expression de la protéine

frataxine dans les cellules FRDA4078 (Fig. 68).

Figure 67: L’induction de l’activité du gène FXN des cellules FRDA4087 par les plTALEs-

ST10X et plTALEs-ST24X normalisée par GAPDH et HPRT et par rapport aux témoins.

Les plTALEs-ST24X augmentent l’activité du gène FXN dans les cellules FRDA4078 environ 2 fois par le plTALE-6-15 normalisé par GAPDH (*** p value = 0,0004) et HPRT (** p value =

0,0349). Les plTALEs-ST10X induisent la transcription du gène FXN plus que 5 fois par

plTALE-ST10X6-15 (**** p value ˂ 0,0001) et plTALE-ST10X (*** p value = 0,0001)

normalisé par GAPDH.

90

Figure 68: Le taux d’expression de la frataxine dans les cellules traitées par plTALEs-

ST10X et plTALEs-ST24X normalisé par GAPDH et par rapport au contrôle.

6.5.3 L’effet synergique des plTALEs-ST10X et plTALEs-ST24X sur

l’augmentation de l’activité du gène FXN

Pour exploiter encore plus l’efficacité de ces plTALEs-ST10X et plTALEs-ST24X sur

l’activation du gène FXN dans les cellules FRDA4078 nous avons traité ces cellules par

une combinaison de 2 meilleurs plTALEs-ST10X qui ciblent les séquences 6 et 8 avec

13 et 15 RVD pendant 2 jours. L’effet synergique de ces 2 plTALEs-ST10X sur

l’augmentation de l’activité transcriptionnelle du gène FXN a été normalisé par le gène

de GAPDH et celui d’HPRT et par rapport aux témoins négatifs (n=5) (Fig. 69). Les

résultats montrent que l’effet synergique de ces 2 plTALEs-ST10X avec 13 RVD

augmente la transcription du gène FXN plus que 2,7 fois par contre la combinaison de 2

plTALEs-ST10X avec 15 RVD augmente significativement la transcription du gène FXN

plus que 10 fois (**** p value ˂ 0,0001). Par conséquent, cet effet synergique plTALEs-

ST10X avec 15 RVD augmente aussi l’expression de la protéine plus que 5 fois (Fig. 68).

Donc l’utilisation de la combinaison de 2 plTALEs-ST10X avec 15 RVD qui ciblent les

séquences 6 et 8 qui sont séparés par 10 nucléotides, permet de recruter 20 VP64 au

niveau de cette région cible située entre les sites de SFR et TFAP2. Ces 20 domaines

activateurs VP64 servent pour activer la transcription du gène FXN après le recrutement

du complexe transcriptionnel.

91

Figure 69: L’effet synergique des plTALEs-ST10X sur l’activation de la transcription du

gène FXN dans les cellules FRDA4078.

Cet effet a été normalisé par les gènes GAPDH et HPRT (n = 5, **** p value ˂ 0,0001).

6.5.4 Activation du gène FXN endogène dans des fibroblastes de 4 patients FRDA

avec plTALEs-ST (Fig. 70 et 71)

L’efficacité des meilleurs plTALEs-ST10X qui ciblent séquences 6 et 8 avec 15 RVD a

été testée sur d’autres cellules de FRDA de 4 patients différents ayant un nombre de

répétitions GAA différents. Nous avons utilisé les mêmes protocoles de nucléofection

avec les mêmes quantités d’ADN pendant 2 jours de traitement pour augmenter la

transcription et l’expression du gène FXN dans ces cellules FRDA. L’activité de ces 2

plTALE-ST10X a été normalisée par les gènes GAPDH et HPRT, par rapport aux

contrôles négatifs (les cellules non traitées et les cellules traitées par pCR3.1 vide et

pCR3.1-scFV) et par rapport aux NED (des fibroblastes des personnes normaux). Les 2

plTALEs-ST et leurs effets synergiques activent la transcription du gène FXN dans les 4

FRDA traitées par rapport aux contrôles négatifs et par rapport aux 4 NED. Ces effecteurs

augmentent significativement le nombre de copies d’ARNm FXN dans ces 4 FRDA

traitées par rapport aux contrôles, ces augmentations sont plus élevées que les nombres

de copies d’ARNm FXN dans les 4 NED. Les effets des plTALEs-ST10X augmentent la

transcription du gène endogène FXN dans les FRDA66 (les nombres des répétitions GAA

est de 240/640) de 5,5 fois par le plTALEs-ST10X-6-15 et plus que 4 fois par plTALEs-

ST10X-8-15 avec un effet synergique de ces 2 plTALEs-ST10X dans ces cellules qui

augmente la transcription du gène FXN par 14,5 fois. Dans les cellules FRDA162 (les

nombres des répétitions GAA est de 355/805) l’effet de plTALEs-ST10X-6-15 augmente

92

la transcription du gène endogène FXN plus que 3 fois. Le plTALEs-ST10X-8-15 quant

à lui permet une augmentation jusqu’à 3,5 fois, ainsi avec un effet synergique de ces 2

plTALEs-ST10X, on observe une augmentation de la transcription du gène endogène

FXN supérieure à 10 fois. Dans les cellules FRDA4675 (les nombres des répétitions GAA

est de 255/1140), les 2 plTALEs-ST10X-6-15 et 8-15 augmentent la transcription du gène

endogène FXN plus de 4 fois et leur effet synergique augmente la transcription dans les

cellules FRDA4675 plus de 19 fois, normalisées par GAPDH. Chaque plTALEs-ST10X-

6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 séparément, augmente la transcription de la FXN dans les

cellules FRDA4743 (les nombres des répétitions GAA de 470\970) de 4 fois et de 3,5 fois

respectivement et, avec un effet synergique de ces 2 effecteurs, de 12 fois normalisées

par GAPDH. Ces résultats montrent que les plTALEs-ST10X-6-16 et plTALEs-ST10X-

8-15 sont les effecteurs efficaces pour augmenter l’activité transcriptionnelle du gène

endogène FXN dans le cas de FRDA. Ces effecteurs sont aussi efficaces pour activer la

transcription du gène endogène FXN dans les cellules qui contiennent un grand nombre

de répétitions GAA avec une faible expression de la frataxine comme le cas de

FRDA4743, FRDA4675 et FRDA162.

93

Figure 70: Le nombre de copies d’ARNm FXN après une induction du gène endogène FXN

avec 2 meilleurs plTALEs-ST10X-6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 dans 4 cellules FRDA par

rapport aux fibroblastes normaux et témoins négatifs. Les résultats statistiques : p value ˂ 0,0001 dans FRDA66, FRDA162 et FRDA4675 et p value =

0,0008 dans les FRDA4743

94

Figure 71: L’augmentation de l’activité du gène endogène FXN normalisé par les gènes

GAPDH et HPRT dans les 4 FRDA traitées par les plTALEs-ST10 par rapport aux

contrôles négatifs. A : ** p value = 0,0018, B : *** p value = 0,0002, C : ** p value = 0,0032, D : p value = 0,0103,

E/F : **** p value ˂ 0,0001, G : ** p value = 0,0029 et H : ** p value = 0,0045

6.5.5 L’induction de l’expression de la protéine frataxine avec les effecteurs

plTALEs-VP64 dans les cellules provenant de 4 patients FRDA (Fig. 72)

Les protéines des cellules de 4 patients FRDA différents ont été analysées par westerns

après le traitement avec les plTALEs-ST10X. Les résultats montrent que la forte

activation de la transcription dans les 4 cellules FRDA traitées avec les plTALEs-ST10X

induit une forte expression de la protéine codée par le gène FXN activé. Les effecteurs

plTALEs-ST10X-6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 augmentent l’expression de la protéine

frataxine par 3 fois et par plus de 4 fois dans les cellules FRDA4743, par 3,4 fois et 3,8

fois dans les cellules FRDA4675, par 3,5 fois et 4,7 fois dans les cellules FRDA162 et

par 7 fois et 9 fois dans les cellules FRDA4078. Cette activation est beaucoup plus forte

avec l’effet synergique de ces 2 effecteurs dans les cellules FRDA4675 et dans les cellules

FRDA4078, l’augmentation dépasse en effet 12 fois. En conclusion, la forte activation de

la transcription du gène FXN des cellules FRDA ayant différents nombres de répétitions

GAA active aussi l’expression de la protéine frataxine dans ces cellules traitées par ces

effecteurs.

95

Figure 72: L’induction de l’expression de la protéine frataxine dans 4 cellules FRDA traitées

avec les plTALEs-ST10X par rapport aux contrôles négatifs.

6.6 Les pAAV-plTALEs-VP64 et ST

Les meilleurs plTALEs-FT sélectionnés auparavant qui ciblent des séquences spécifiques

au niveau de site d’initiation de la transcription du gène FXN ont été testés in vivo, afin

de valider l’efficacité de ces meilleurs effecteurs plTALEs-FT in vivo sur des souris

modèles YG8R nous avons utilisé des AAV9 comme vecteurs de livraison des plTALEs

in vivo. Les vecteurs AAV9 les plus utilisées dans les essais de thérapie génique, fourni

une expression systémique stable et à long terme dans la plupart des tissus tel que le cœur

et le cerveau grâce au sérotype 9 [34].

6.6.1 Les pAAV-plTALEs-VP64

Les Constructions pAAV-plTALEs-VP64 ont été faites dans un vecteur pAAV_TALE-

TF(VP64) -BB_V3 par un clonage après une double digestion avec 2 enzymes de

restriction MluI/NheI. La digestion enzymatique donne un vecteur pAAV de 4651 pb et

un insert plTALE de 2051 pb qui servent pour faire la construction finale pAAV-plTALE-

VP64.

Les constructions positives ont été validées par la digestion enzymatique et un séquençage

avec 4 amorces. Les résultats de ce dernier correspondent aux séquences nucléotides

attendues de chaque construction pAAV-plTALE-6-15, pAAV-plTALE-8-15 et pAAV-

plTALE-F4-15. Ces derniers ont été utilisés pour la production des virus AAV9 qui

expriment plTALE-6-15, plTALE-8-15 et plTALE-F4-15.

96

6.6.2 Les pAAV-plTALEs-ST10X

Nous avons produit deux types de constructions pAAV-plTALEs-ST10X-6-15 ou

pAAV-plTALEs-ST10X-8-15 et pAAV-scFV-SpGFP-VP64-GB1-NLS (pAAV-scFV)

pour faire le système de pAAV-SunTag. Les pAAV-plTALEs-ST10X ont été faits par un

clonage avec le vecteur pAAV de taille 5433 pb et les inserts plTALE-6-15 ou plTALE-

8-15 de taille 1892 pb. Le vecteur et les inserts ont été produits par une double digestion

avec les enzymes de restrictions MluI/PflMI. La construction pAAV-scFV a été faite par

le clonage In-fusion avec de vecteur pAAV digéré par BamHI/MluI de taille 3966 pb et

l’insert amplifié par PCR de taille 2060 pb. Les clones positifs ont été validés par les

séquençages avec quatre amorces pour les pAAV-plTALEs-ST10X et avec 2 amorces

pAAV-scFV qui permettent de valider les bonnes constructions avec les bonnes

séquences nucléotides attendues.

6.6.3 Traitement des cellules FRDA4078 par pAAV-plTALEs-ST10X

Les pAAV-ST10X ont été testés in vitro sur des cellules FRDA4078, afin de tester

l’efficacité de ces effecteurs exprimés par le pAAV qui contient le promoteur CAG. Ce

test a été fait par nucléofection avec 10 µg d’ADN (6 µg de pAAV-plTALE-ST10X plus

4 µg de pAAV-scFV) et incubation pendant 2 jours à 37 ºC. Le traitement a été fait par

rapport aux contrôles négatifs (les cellules non traitées et les cellules traitées par le vecteur

pAAV vide plus le pAAV-scFV) et par rapport au plTALE-ST10X exprimé par les

pCR3.1 avec le promoteur CMV.

Dans le système SunTag, le plTALE-ST10X recrute 10 de sfGFP-VP64 ce qui donne un

marquage fluorescent grâce à leur signal extrêmement intense. Ce dernier peut-être une

étiquette lumineuse qui permet de confirmer le ciblage de chaque plTALE.

L’observation par microscopie des noyaux des cellules traitées par ce système permet de

révéler un marquage qui est beaucoup plus lumineux dans le locus génomique ciblé par

plTALE-ST10X après le recrutement de 10 sfGFP-VP64 par rapport au contrôle négatif

traité avec un vecteur qui n’exprime pas le plTALE et un vecteur qui exprime sfGFP-

VP64 (Fig. 73). Le GFP de ce dernier s’exprime normalement dans le noyau et le

cytoplasme et il ne contient pas l’étiquette lumineuse.

97

Figure 73: Les noyaux des cellules FRDA4078 traitées par pAAV-plTALEs-ST10X. A) le contrôle négatif ; les cellules traitées par un vecteur pAAV qui n’exprime par le plTALE

plus un pAAV-scFV, le vert de GFP est normal il contient pas l’étiquette lumineuse. B) Les

noyaux des cellules FRDA4078 traitées avec plTALE-ST10X-6-15. Ils contiennent des étiquettes

plus lumineuses des locus ciblés par plTALE-ST10X après le recrutement de scFV-sfGFP.

Figure 74: Les cellules FRDA4078 traitées par plTALE-ST10X. En haut, les cellules FRDA4078 traitées par pAAV-plTALEs-ST10X-6-15 plus 8-15, le signal de

GFP se localise au niveau de locus ciblés par plTALEs qui fixent 10 GFP-FV64 par chaque

plTALEs (un total de 20 GFP-VP64) pour construire l’étiquette lumineuse. En bas, les cellules

FRDA4078 traitées par pCR3.1-plTALEs-ST10X-6-15 plus 8-15 les étiquettes plus lumineuses

des loci ciblés par les effecteurs qui recrutent 20 GFP-VP64 (la forte intensité du signal lumineux

est due à l’expression de GFP-VP64 par le promoteur CMV).

98

Le traitement in vitro des cellules FRDA4078 avec les pAAV-plTALEs-ST10X et les

pCR3.1-plTALEs-ST10X permet d’activer le gène endogène FXN par les deux types de

vecteurs. L’observation microscopique des cellules traitées par ces effecteurs montre des

étiquettes qui sont beaucoup plus lumineuses dans les cellules traitées par pAAV et

pCR3.1 avec plus de signal dans les cellules traitées par pCR3.1(Fig. 74). La différence

de signal est due à la différence de promoteur de chaque vecteur.

Les effecteurs plTALE-ST10X exprimés par les pAAV et pRC3.1 augmentent l’activité

transcriptionnelle du gène FXN avec les mêmes efficacités par rapport aux contrôles

négatifs (Fig. 75). L’activité du gène FXN augmente plus que 8 fois par le plTALEs-

ST10X-6-15 exprimé soit par pRC3.1 ou par pAAV. Cette activité augmente aussi

environ 5 fois par le plTALEs-ST10X-8-15 exprimé par pAAV et environ 8 fois par les

plTALEs-ST10X-8-15 exprimés par pCR3.1. L’effet synergique de ces deux effecteurs

exprimés soit par pCR3.1 ou pAAV augmente la transcription du gène endogène FXN

plus que 18 fois dans les cellules traitées. Ces augmentations ont été normalisées par les

gènes GAPDH et HPRT et par rapport aux contrôles négatifs.

Les effecteurs plTALEs-ST10X exprimés à partir les vecteurs pCR3.1 et pAAV avec

promoteur CMV et CAG ont les mêmes effets d’induction de l’activité du gène endogène

FXN in vitro. Les pAAV-pTALEs seront utilisés pour les tests in vivo sur des souris

modèles de FRDA YG8R.

99

Figure 75: Les résultats d’induction du gène endogène FXN avec les effecteurs plTALEs-

ST10X exprimés par les vecteurs pCR3.1 et pAAV.

Ces résultats ont été normalisés par rapport aux gènes GAPDH et HPRT et par rapport aux

contrôles négatifs (dans les cellules FRDA4078).

6.7 L’augmentation de l’activité d’aconitase dans les cellules traitées par les

effecteurs plTALE-ST10X

La modulation réversible de l’aconitase a été utilisée comme biomarqueur des lésions

oxydatives de FRDA. Pour cela, l’activité de l’enzyme aconitase peut être utilisée comme

indicateur de niveau de la frataxine dans la mitochondrie. L’activité de l’aconitase dans

les cellules traitées par les effecteurs plTALEs-ST10X-6-15 plus plTALEs-ST10X-8-15

et les contrôles négatifs (les cellules non traitées et les cellules traitées par pCR3.1-scFV

plus pCR3.1 vide) a été mesurée par l’absorbance à 450 nm (Fig. 76). Les résultats

montrent que le niveau de l’activité d’aconitase augmente significativement plus que 2

fois dans les cellules traitées par ces effecteurs par rapport aux contrôles négatifs (N=3, *

p value = 0,0343). L’activité d’aconitase dans les cellules contrôles est 29 et 31 %.

Cependant, le taux de l’activité d’aconitase dans les FRDA4078 traitées par ces effecteurs

atteint 67 %. Donc, ces résultats indiquent que l’augmentation de la transcription du gène

endogène FXN, ainsi que l’expression de la protéine frataxine dans les cellules traitées

par les effecteurs plTALEs-ST10X augmentent l’activité de l’enzyme aconitase. Donc ils

suggèrent fortement que les effecteurs plTALEs-ST10X peuvent rétablir les phénotypes

moléculaires et biochimiques de la FRDA.

100

Figure 76: L’augmentation de l’activité d’aconitase dans les cellules FRDA4078 traitées par

les effecteurs plTALEs-ST10X-6-15 plus 8-15.

Cette augmentation est par rapport aux contrôles négatifs, les cellules non traitées et les cellules

traitées par les pCR3.1-scFV plus pCR3.1 vide (N = 3, * p value = 0,0343).

101

Chapitre 7 : Discussion

La compréhension de la pathogenèse moléculaire de FRDA a contribué au

développement des différentes approches thérapeutiques, qui visent l’augmentation de

l’expression de la protéine frataxine. Pour ce même objectif, nous avons utilisé la thérapie

génique pour augmenter l’expression de la protéine frataxine en utilisant le système

plTALE-FT [47] [57] [74] [75]. Ce dernier contient des facteurs d’activation de la

transcription (VP64 ou p300) fusionnés avec des protéines de liaison à l’ADN plTALE

qui ciblent la région régulatrice du gène FXN. Nous avons testé cette approche in vitro

afin d’identifier le système plTALE-FT le plus efficace avant de passer aux tests

précliniques in vivo.

Les TALEs-FT ont une grande utilité pour augmenter l’expression des gènes endogènes

[76]. Pour cette raison, nous avons donc utilisé les plTALEs-FT pour activer le gène FXN

in vitro dans des fibroblastes de patients FRDA. Les plTALEs sont caractérisés par 4

variations d’acides aminés dans leurs RVD et par une technique efficace d’assemblage

en 4-modules RVD (Fig. 39, 40 et 41) [54] [55]. Nous avons utilisé le domaine activateur

transcriptionnel VP64 fusionné avec un plTALE pour activer le gène endogène FXN [47]

(Fig. 46A). Nous avons ciblé 14 séquences au niveau de la région régulatrice de ce gène

(Fig. 37 et 40), des séquences cis et des séquences qui ne fixent pas les facteurs trans au

niveau de site de l’initiation de la transcription.

Dans la première partie nous avons construit dans le vecteur pRC3.1 14 plTALEs-VP64

ciblant des séquences du gène FXN (Tableau 3). Ces différents plTALE-VP64 ont été

testés sur les cellules FRDA pour induire la transcription et l’expression de la FXN. Le

traitement des cellules FRDA a été fait par nucléofection. Cette technique permet de

transfecter l’ADN dans plus de 90% des cellules [62] (Fig. 47).

Les résultats de ce traitement montrent que les plTALEs-VP64 qui ciblent les séquences

entre les deux sites SFR et TFAP2 et la séquence qui cible EGR3, activent très bien la

transcription du gène FXN dans les cellules FRDA (Fig. 48). Chapdelaine, P. et al en

2013 [33] ont démontré que le TALE-VP64 contenant 13 RVD et qui ciblait la séquence

8 (située entre les sites SFR et TFAP2) activait le gène FXN dans les cellules FRDA. Les

plTALEs-VP64 avec 15 RVD activent l’expression de la FXN plus que les TALE-VP64

et les plTALEs-VP64 avec 13 RVD qui ciblent les mêmes séquences [45]. Les plTALEs-

102

VP64 qui ciblent les séquences 6-15, 8-15 et F4-15 augmentent la transcription et

l’expression de la FXN plus que de 2 fois par rapport aux contrôles négatifs (Fig. 48 et

49). Les meilleurs plTALEs-VP64 (plTALE-6-15, plTALE-8-15 et plTALE-F4-15) ont

un faible effet synergique sur l’augmentation de la transcription du gène FXN [74] [75].

Miller et al. ont été démontré qu’il est possible d’augmenter l’affinité des TALEs pour

une séquence de nucléotides en mutant l’acide aminé en position 12 des RVD des TALEs

[64]. Cependant, cette approche n’a pas produit des effets bénéfiques dans mes

expériences! En effet mes résultats démontrent que ces nouveaux RVD ont diminué

l’efficacité des plTALE-VP64 (Fig. 59) qui induisent l’activité du gène endogène FXN

dans les cellules FRDA comparativement à l’utilisation des plTALE-VP64 avec les RVD

normaux.

D’autre part, il est possible d’augmenter l’efficacité des plTALE-VP64 par l’utilisation

des lentivirus qui expriment ce gène sous le control d’un promoteur EF1. Ces lentivirus

qui expriment les plTALE-6-15 et plTALE-F4-15 ont un effet non-significatif sur la

transcription de gène FXN. Par contre, le lentivirus codant pour le plTALE-8-15 a induit

une faible augmentation de l’expression de la protéine frataxine (Fig. 55 et 56). Ces

résultats démontrent que les plTALEs-VP64 exprimés par les lentivirus sont moins

efficaces que les plTALEs-VP64 exprimé par le vecteur pCR3.1 sous le control du

promoteur CMV. Ces derniers induisent une plus forte augmentation de la transcription

et de l’expression du gène FXN dans les cellules traitées [33].

Par la suite, nous avons testé un autre domaine activateur, le p300, fusionné avec des

protéines plTALEs (plTALE-p300) (Fig. 60). Ces derniers ciblaient les mêmes séquences

actives sélectionnées auparavant avec les plTALEs-VP64 (Tableau 6). Des cellules

FRDA4078 ont été nucléofectées in vitro avec le plasmide codant pour plTALE-p300.

De plus, nous avons aussi vérifié s’il y avait un effet synergique entre plTALEs-VP64 et

plTALEs-p300 et entre plusieurs plTALEs-p300 ensemble. Ces traitements ont démontré

que les effecteurs plTALEs-p300 sont moins efficaces que les effecteurs plTALEs-VP64

qui ciblent les mêmes séquences contrairement à ce qui a été rapporté par Hilton et al

[65]. En effet, les plTALEs-p300-6-15 et plTALE-p300-8-15 ont augmenté l’activité

transcriptionnelle du gène FXN respectivement par seulement 1,2 et 1,5 fois

comparativement avec les plTALEs-VP64-6-15 et plTALE-VP64-8-15 qui ont produit

des augmentation plus que 2 fois (Fig. 62). La combinaison des effecteurs plTALEs-

103

VP64 et plTALEs-p300 n’a pas activé la transcription du gène FXN par rapport à l’effet

d’un seul plTALE-VP64 et par rapport aux contrôles négatifs, contrairement à ce qui a

été montré par Anthony et al [74] pour l’activation du gène IL-2 par l’effet synergique

des effecteurs TBP-TALE et VP64-TALE dans les cellules 293FT. Cependant, le

traitement des cellules avec deux plTALEs-p300 qui ciblent les séquences 6-15 et 8-15

dans les cellules FRDA4078, augmente la transcription et l’expression du gène FXN

environ 2 fois (Fig. 63 et 64) [65]. Ce qui suggère que l'acétylation de la chromatine ne

se produit qu’avec l’utilisation de deux plTALEs-p300 en même temps. Ce résultat est

l’équivalent de l’effet d’un seul plTALE-VP64 qui cible 6-15, 8-15 ou F4-15. Donc le

traitement des cellules FRDA par effecteurs plTALEs-VP64 est plus efficace que le

traitement par plTALEs-p300.

Ces résultats établissent que les effecteurs plTALE-VP64 exprimés par promoteur CMV

dans le vecteur pCR3.1, sont un outil puissant pour induire le gène endogène FXN. Cela

peut être dû à des différences dans la structure et la fonction des protéines VP64 et leur

interaction avec le complexe transcriptionnel du gène FXN [45] [47] [48]. Ces effecteurs

sont efficaces lorsque les plTALEs ciblent les séquences spécifiques au niveau de

l’initiation de la transcription 6-15 ou 8-15 et la séquence qui cible le site de facteur de la

transcription EGR3.

L’objectif d’améliorer cette technologie plTALE-VP64 pour traiter les cellules FRDA in

vitro nous permet d’exploiter encore plus l’effet de ces effecteurs dans le but d’augmenter

encore plus l’activité du gène endogène FXN. Pour cela, nous avons utilisé le système

plTALEs-SunTag qui cible les séquences actives de la région régulatrice du gène FXN

avec les 10 ou 24 VP64 recrutés par le SunTag qui est fusionné avec un seul plTALE

(Fig. 65). Nos résultats montrent que le système transcriptionnel plTALE-SunTag peut

activer fortement l'expression du gène endogène en utilisant un seul plTALE-ST10X. Une

observation similaire a été faite par le groupe Tanenbaum et al avec une protéine dCas9

fusionnée avec un SunTag et un ARNg ciblant le promoteur du gène CDKN1B [66]. Les

plTALEs-ST10X-6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 permettent d’augmenter l’activité

transcriptionnelle du gène FXN de plus que 5 fois (Fig. 67) et l’expression de la protéine

frataxine d’environ 3 fois (Fig. 68) dans les cellules FRDA4078 par rapport aux contrôles

négatifs. D’une autre façon, Haivan Ji et al. [77] a été montré une augmentation d’environ

27 fois de l’expression du gène reporteur luciférase avec le dCas9-SunTag24X.

Cependant, l’effet synergique de ces effecteurs plTALEs-ST10X active le gène endogène

104

FXN dans les cellules FRDA encore plus (Fig. 69). Cette activation de l’activité

transcriptionnelle dépasse 10 fois dans les cellules FRDA4078 et est plus que 6 fois pour

l’expression de la protéine frataxine. Par contre les plTALEs-ST24X et certaines

plTALEs-ST10X avec 13 et 15 RVD qui ciblent des séquences non actives au niveau du

promoteur et la séquence EGR3 n’ont pas un grand effet sur l’activité du gène endogène

FXN par rapport aux deux effecteurs cités auparavant et par rapport aux contrôles

négatifs. L’utilisation un seul effecteur plTALEs-ST10X qui cible le séquence 6-15 ou 8-

15 et recrute 10 VP64, induise la transcription du gène FXN après le recrutement le

complexe transcriptionnel à l’aide les 10 VP64[45] [47] [48] [56] [66]. L’utilisation 2

plTALEs-ST10X qui ciblent deux régions actives au niveau du site d’initiation de la

transcription permet de recruter un total de 20 VP64 ce qui permet d’avoir une activation

puissante de l’expression du gène endogène FXN [66] [74] [75] [77].

La validation de ces effecteurs plTALEs-VP64 et plTALEs-ST10X comme un traitement

efficace in vitro contre la maladie de FRDA a été effectuée avec des cellules de différents

patients FRDA qui contiennaient un nombre différent de répétitions du triplet GAA. Ces

cellules FRDA66, FRDA162, FRDA4675 et FRDA4743 contiennent respectivement des

nombres de répétitions GAA de 240/640, 355/805, 255/1140 et 470\970. Les résultats ont

démontré que les effecteurs plTALEs-VP64 activent la transcription environ 2 fois dans

toutes les cellules FRDA même dans les cellules ayant un grand nombre de répétitions de

GAA (255/1140 et de 470/970) (Fig. 50 et 51). Ainsi, dans les 4 patients FRDA avec des

répétitions différentes, les plTALEs-ST10X ont augmenté fortement l'expression du gène

FXN en utilisant un seul effecteur ou l’effet synergique de deux effecteurs plTALEs-

ST10X-6-15 et plTALEs-ST10X-8-15 (Fig. 70, 71 et 72). Les plTALEs-ST10X-6-15 ont

activé la transcription du gène FXN dans FRDA66, FRDA162, FRDA4675 et FRDA4743

par; 5,5 fois, 3 fois, plus que 4 fois et 4 fois, respectivement [66] [77]. Les plTALEs-

ST10X-8-15 ont activé la transcription du gène FXN dans FRDA66, FRDA162,

FRDA4675 et FRDA4743 par 4 fois, 3,5 fois, plus que 4 fois et 3,5 fois, respectivement

[66] [77]. L’augmentation de l’activité transcriptionnelle du gène FXN est très forte dans

les cellules qui ont été traitées avec les deux effecteurs plTALEs-ST10X-6-15 et

plTALEs-ST10X-8-15 en même temps. Cette forte activation a augmenté la transcription

du gène FXN 14,5 fois, 10 fois, 19 fois et 12 fois respectivement dans les cellules

FRDA66, FRDA162, FRDA4675 et FRDA4743, ainsi que l’expression de la protéine

frataxine qui a été augmentée plus que 12 fois dans FRDA4675. Donc le système

105

plTALEs-ST10X est un système puissant qui permet de réguler l’expression du gène

endogène FXN dans différents cas de FRDA [66] [74] [75] [77].

L’observation microscopique des cellules FRDA4078 en culture ayant été traitées par

deux effecteurs plTALE-ST10X-6-15 et plTALE-ST10X-8-15 en même temps, permet

de démontrer un marquage fluorescent due à la présence du GFP fusionné au scFV-VP64

(Fig. 73 et 74) [66]. Ce signal démontre que les plTALEs-ST10X s’attachent au

promoteur du gène FXN et recrutent de 20 protéines scFV-VP64-GFP.

Dans le but de démontrer l’amélioration du phénotype biochimique des cellules

FRDA4078 in vitro, un test d’aconitase a été effectué sur des cellules traitées en même

temps avec deux effecteurs : plTALE-ST10X-6-15 et plTALE-ST10X-8-15. L’activité

d’aconitase est en effet contrôlée réversiblement par le niveau de la frataxine dans la

mitochondrie. Ce test a démontré que l’activité d’aconitase augmente significativement

dans ces cellules traitées par ces effecteurs par rapport aux contrôles négatifs (les cellules

non traitées et les cellules traitées par le pCR3.1-scFV et le pCR3.1 vide) (Fig. 76).

Khonsari et al., [71] ont aussi démontré que l’activité aconitase augmente 2 fois dans les

fibroblastes FRDA traités avec des lentivirus qui expriment la protéine frataxine in vitro.

Donc, nos résultats démontrent que la transcription du gène endogène FXN dans les

cellules FRDA est augmentée par les effecteurs plTALE-VP64 et plTALE-ST10X qui

ciblent des séquences spécifiques au niveau de la région régulatrice du gène FXN. Cette

augmentation du niveau la protéine frataxine permet de rétablir le phénotype biochimique

normal dans les cellules FRDA tel que démontré par l’augmentation de l’aconitase dans

ces cellules traitées par ces effecteurs.

En résumé cette application de la technologie plTALE-FT sera particulièrement

importante pour réguler l’activité transcriptionnelle dans le cas FRDA. Elle peut être une

approche très prometteuse pour traiter la maladie de FRDA par l’induction du gène

endogène FXN ainsi que l’augmentation de l’expression de la protéine frataxine chez les

patients de FRDA. Cette approche thérapeutique pourra aussi être utilisée pour de

nombreuses autres maladies héréditaires dues à des haplo-insuffisances.

106

Chapitre 8 : Conclusion et perspective

Dans ce projet, nous avons obtenu des résultats in vitro intéressants qui nous permettent

d’exploiter les technologies plTALEs-VP64 et plTALEs-ST10X comme une approche

thérapeutique. Ces derniers pourraient être particulièrement utiles pour traiter la maladie

FRDA. Cette approche thérapeutique a pour but d’augmenter la transcription du gène

FXN, et augmenter ainsi l’expression de la protéine frataxine dans un but ultime de

rétablir l’activité métabolique de la mitochondrie dans les cellules des patients FRDA.

Les protéines de liaison à l’ADN plTALEs qui ciblent des régions importantes d’initiation

de la transcription du gène endogène FXN sont fusionnées directement avec les domaines

activateurs VP64 ou avec le système SunTag qui permet de recruter 10 VP64 augmentant

ainsi l’activité transcriptionnelle du gène FXN in vitro dans différentes cellules FRDA.

Cette augmentation transcriptionnelle permet d’augmenter l’expression de la protéine

frataxine dans ces cellules. Ce qui permet d’augmenter l’activité de l’enzyme aconitase

dans les cellules traitées par le système plTALEs-ST10X. Ces démonstrations in vitro

sont des preuves du rétablissement de l’activité normale des mitochondries dans les

cellules FRDA traitées.

Ces résultats in vitro nous permettront de tester prochainement ces effecteurs in vivo sur

les souris YG8R qui sont un modèle de la maladie FRDA [34] [36]. Les tests in vivo

seront effectués avec l’utilisation des vecteurs de livraison AAV9 qui expriment les

meilleurs effecteurs plTALE-VP64 et plTALEs-ST10X sélectionnés dans les tests in

vitro. Ce test va nous permettre de valider l’efficacité de ces effecteurs in vivo pour traiter

des souris modèles YG8sR avant de passer aux tests cliniques pour valider cette approche

thérapeutique contre la maladie FRDA chez l’Homme. Avant de passer aux tests

cliniques, une étude des effets hors cibles (off-target) des plTALEs-FT sera nécessaire.

Cette étude pourra utiliser entre autres les techniques RNA-Seq et ChiP-Seq.

Cette technologie plTALEs sera utile pour activer un ou plusieurs gènes dans des

maladies héréditaires. D’autre part, en remplaçant le VP64 dans le KRAB [48] elle

pourrait être au contraire un moyen de réduire l’expression d’un ou de plusieurs gènes.

Cette technologie pourra aussi être utile pour mieux comprendre le rôle de plusieurs

gènes.

107

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Développement d'une thérapie génique pour l'Ataxie de ... · trinucléotide GAA au niveau du 1er intron du gène de la frataxine (FXN). Le nombre de trinucléotides augmente de