Dynamique moléculaire dans la cellule - science.curie.fr · Mesure et correction éventuelle de l ... 1 les fonctions de Bessel modifiées d’ordre ... profils où Tb pas trop grand,

Dynamique moléculaire dans la cellule :

Mesure par la technique de FRAP

Formation microscopie confocale IRI 2011

François Waharte

Plateforme Imagerie Cellulaire et Tissulaire (PICT-IBiSA) UMR 144, Institut Curie/CNRS, Paris

Dynamique moléculaire dans la cellule

Protéine Rab6-GFP

Diffusion

Ecoulement Echange

tD ! r2 / D

D: 0,01 – 100 !m2 s-1 tV ! r1 / V V: 0-2 !m s-1

tchem ! r0 / kon = 1 / kon

kon : 103 – 1010 M-1 s-1

D V

kon , koff

Processus dynamiques complexes

Dynamique moléculaire dans la cellule

Image classique de fluorescence :

Etat stationnaire du système, information « statique », à l’équilibre"

Accès à la dynamique moléculaire :

Perturber le système en faisant : -  disparaître de la fluorescence (Photoblanchiment) -  apparaître de la fluorescence (Photoactivation) -  changer le spectre d’émission (Photoconversion)

Le photoblanchiment (photobleaching)

Cinétique de photoblanchiment de protéines fluorescentes

)exp()( 0 tkItI B!=

Actin filaments (FITC)

20 s 40 s 60 s 0 s

Diagramme de Perrin-Jablonsky

Modèle simplifié :

kB spécifique d’un fluorophore dans un environnement donné

Avantage : utilisable avec quasiment tous les fluorophores

F(t)

t

Molécules fluorescentes!

Molécules photoblanchies!

Laser à Pobs!Laser à PFRAP!

Hypothèse :!

pas de mouvement!( Tbleach<< Tretour )!

Plaser

Phase I : prébleach Phase II : bleach

F(t)

t


Laser à Pobs!

Plaser

Phase III : postbleach

F(t)

t


Laser à Pobs!

Hypothèse :!F(t) ~ C(t) !

(pas de photoblanchiment)!

} Fraction immobile

Molécule immobile!

Plaser

Phase III : postbleach Principe de la technique de FRAP

Quelles informations peut-on obtenir par cette technique ?

- Diffusion -  Flux -  Echange (kon/koff) -  Fraction mobile/immobile -  Communication entre compartiments cellulaires ou entre cellules -  Formation ou désassemblage d’un complexe moléculaire -  Continuité d’une organelle -  Confinement de la diffusion -  Autres informations fonctionnelles suivant le système étudié"

Hépatocytes (Calcéine)

Exemple de communication intercellulaire (perméabilité des gap-junctions)

Comment faire les mesures ? Instrumentation

S. Mazères, IPBS


S. Mazères, IPBS

Modulateur de puissance lumineuse - Miroirs - Filtres neutres - Diaphragme -  AOTF

Laser ou lampe

Obturateur

Obturateur

Microscope - Lentille de reprise - Diaphragmes - Objectif - Filtres

Echantillon - Cellule biologique - Sonde fluorescente photo dégradable

Photomultiplicateur - Conversion h" / i - Gain sur i


S. Mazères, IPBS

Ordinateur - Carte d'acquisition - Base de temps - Logiciel de contrôle - Programme de pilotage et d'acquisition

Voie "1" (A / D)

Voie "2" (D / A)

Voie "3" (D / A)


Laser ou lampe

Obturateur

Obturateur




Amplificateur - Conversion i / V - Gain sur V

Ordinateur - Carte d'acquisition - Base de temps - Logiciel de contrôle - Programme de pilotage et d'acquisition

Voie "1" (A / D)

Voie "2" (D / A)

Voie "3" (D / A)


Laser ou lampe

Obturateur

Obturateur




Amplificateur - Conversion i / V - Gain sur V

Logiciel dépouillement D et M


S. Mazères, IPBS

Combinaison instrumentales possibles

• FRAP en champ large

Hg Lamp ou laser

Shutter

• FRAP sur confocal

CCD

• FRAP en TIRF (spot ou région avec laser séparé, ou avec l’onde évanescente)

Mesure localisée dans une fine couche optique (membrane plasmique) FRAP sur des structures difficiles à observer en WF

- Module FRAP présent sur tous les confocaux commerciaux - Souplesse dans le mode de balayage (spot, ligne, image) et dans la forme de la région de photoblanchiment.

Combinaison instrumentales possibles

• FRAP + 4D : Combinaison d’acquisition vidéo WF ou spinning-disk 3D rapide avec FRAP laser

laser

Shutter z

Monochromateur ou laser (SD confocal)

CCD

FRAP en point ou ROI

• FRAP + 2 photons Un photon! Deux photons!

cytosol

1-2 µm

cytosol

Mesure locale de la mobilité, en 3D (volume défini)!

Même possibilités d’acquisition qu’en confocal

Miroirs de balayage

Modalités de FRAP

-  FRAP en spot, acquisition en spot (T) (Tbleach et dt ~ 10 !s)

-  FRAP en ligne, acquisition en ligne (XT) (Tbleach et dt ~ 1 ms) -  FRAP en spot, acquisition en image (XYT) (Tbleach et dt ~ 10 -1000 ms) -  FRAP en ligne, acquisition en image (XYT)

-  FRAP en région, acquisition en image (XYT)

FRAP sur un spot

FRAP sur une région

Tem

ps d

’acq

uisi

tion

FRAP sur une ligne

Intérêt de l’acquisition d’image en FRAP

-  Détermination de la région analysée (taille et position): important pour l’analyse et la modélisation

-  Mesurer l’anisotropie de la redistribution de fluorescence

-  Utiliser d’autres régions d’analyse pour corriger les courbes

-  Possibilité d’analyser les profils d’intensité -  Distinguer la diffusion et flux

Multilayer of DMPC labeled with 1% mol:mol NBD PC (T=25 °C) (C. Favard)

Limitations et artefacts

• Photoblanchiment réversible :

- Faire varier la taille de la région photoblanchie - Contrôle sur cellules fixées

• Dérive de la mise au point: - Stabiliser la température - Utiliser un système d’autofocus ou de stabilisation du focus

• Fluctuations de la source d’illumination : Mesure et correction éventuelle de l’intensité

• Mouvements de l’échantillon - Recalage d’images - Focus asservi par tracking de l’objet

• Réponse instrumentale :

- Mesure de la réponse du système à une impulsion lumineuse - Contrôle sur cellules fixées

Limitations et artefacts

Waharte et al. , Appl. Environ. Microbiol. 2010

Effet des mouvements dans l’échantillon (biofilms)

Analyse quantitative des données de FRAP

• Determination des paramètres d’acquisition dt images, Tbleach, taille zone bleachée

• Préparation des données brutes

correction éventuelle des données • Extraction des courbes et profils

mesure F(t), C(x,t) • Traitement des données extraites

normalisation, filtrage (logbin), représentation, moyenne • Ajustement des données avec un modèle théorique :

- manuel : pas de calcul d’erreur sur les paramètres mais fourchette de valeurs - régression non-linéaire (fit)

Analyse quantitative des données de FRAP

- Normalisation

Perte de fluorescence liée à la phase de bleach de x %, donc plateau max à 100 –x % Normaliser l’intensité à l’intensité de prébleach (avant de moyenner !)

- Corrections

Soustraction du bruit de fond (mesure dans ROI à l’extérieur de la cellule) Recalage des images Correction des fluctuations d’illumination et du photoblanchiment (mesure dans ROI de référence, autre cellule par exemple)

• photoblanchiment (+ perte fluo totale après phase de bleach) • asymptote (retour de fluo. Incomplet) • immobile = lent ! (souvent)

- Définition de la fraction mobile :

Caractérisation des conditions expérimentales

!"#$%&'($

!)"*"$&'($

• Photoblanchiment observationnel :

- Acquisition sans phase de photoblanchiment -  Réduire la puissance d’observation -  Correction ou modélisation pour l’analyse des données

• Effet du Tbleach sur le retour de fluorescence:

Cellule Hela GFP

Données L. Jordan

P=80 % P=40 %

Effet de la puissance laser sur le volume bleaché

Z

Z

Influence du focus

Z

Caractérisation des conditions expérimentales Modélisation mathématique

But : extraire des images ou de la courbe de retour une information sur la mobilité moléculaire

Etablir ou utiliser un modèle mathématique décrivant la dynamique moléculaire supposée des molécules d’intérêt

Modélisation mathématique de la diffusion

Rq : On peut avoir D=Dx+Dy+Dz (anisotrope) et D=D(x,y,z) (inhomogène) dans les cas complexe, mais on se restreint en général à D=Dx=Dy=Dz=cte

Ici, ensemble de molécules

Equation d’évolution du système (équation de diffusion) :

),,(),,( 2

2

2

2

tyxCyx

DtyxCt !!

"

#$$%

&

'

'+

'

'=

'

'

concentration C(x,y,z,t)

lié au gradient

Formule d’Einstein :

n : dimension spatiale D : coefficient de diffusion

D=kT/6##R # : viscosité R : rayon de la particule

<rn 2

>=2nDt

Déplacement quadratique moyen :

(milieu homogène, isotrope, particule sphérique)

Mouvement brownien (1 molécule)

Diffusion : solutions analytiques en dimension 1-3

1 D

3 D

2 D

Solution de l’équation de diffusion simple

1 photon 2 photons

Utilisé en FRAP sur microscope confocal (Lippincott-Schwartz)

Hypothèses :

•  réservoir rectangulaire (cellule rectangulaire),

•  bande de photo-destruction perpendiculaire au grand axe de la cellule (L)

•  w<<L

•  100% de photo-destruction dans la bande

D mesuré avec une précision de 30%

Diffusion 1D, bande rectangulaire

w x

Fluo

resc

ence

!"

=

#####

$

%

&&&&&

'

(

))*

+,,-

.++

/=

0 211

1!

)(n

d

n

tnnktf

0

Avec : $d = %2

/ 4D et % : demi-largeur du « spot » à 1/e2

F(t)= MF0 f(t) - MF0 + F0

Axelrod et al. Biophys. J. (1976)

Diffusion 2D, profil gaussien

Attention : nécessite de déterminer K précisément

k : quantité de bleach, k= aT I(0)

Diffusion 2D, profil circulaire uniforme

( ) ( ) ( )[ ]tdItdIt

dtf !!! 22.2exp)( 10 +"=

I0 et I1 les fonctions de Bessel modifiées d’ordre 0 et 1.

• Soumpasis Biophys J. (1983)

td : temps de diffusion caractéristique w : rayon de la région bleachée.

D = w2 / 4td

)0()()0()()(

FFFtFtf!"

!=

Fluorescence normalisée

x

Fluo

resc

ence

Rq: - Le calcul de D est indépendant du facteur de photo-destruction (K) - Pas utilisable pour un spot (gaussien) mais éventuellement pour une ROI sur confocal à balayage

Diffusion 2D + échange local

(Sprague et al., 2006)

Choix du modèle analytique

Klein & Waharte, Mod. Res. Ed. Micros. 2010

Aller au-delà des modèles classiques

- Pb: hypothèses de la plupart des modèles très contraignantes : Tb très court, profil de bleach précis, géométrie simple non bornée, diffusion simple" Nécessité de déterminer certains paramètres peu accessibles (ex: K ou T0) - D’autres approches peuvent lever certaines de ces limitations, notamment si basées sur la phase postbleach seulement (ex: profils où Tb pas trop grand, fonction de Green pour forme de profil arbitraire) - Utilisation de simulations numériques (FEM, Monte-Carlo") pour aller plus loin et incorporer des contraintes locales difficiles à imposer avec un modèle analytique"

Mesure de diffusion par l’analyse des profils

D’après Seiffert et Oppermann, J.of Microsc. 2005

Point-bleaching

Point-bleaching

line-bleaching

line-bleaching

Rhodamine B dans glycérol

Exemple d’application biologique

t0=-3 s t1=tbleach=0 s t2=0,6 s t3=3,6 s t3=6,6 s

&z

= 0.

3 !m

2h" bleach : 200 ms, 30 mW

1h" widefield epifluorescence

Combinaison FRAP 2 photons et acquisition WF 4D

MDCK E-Cadherin-GFP

Thèse S. de Beco, PNAS 2009

Dynamique de la E-cadhérine aux

jonctions adhérentes

x (µm)

x (µm)

F/F 0

F/

F 0

koff=0.025 s-1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

16 17 18 19 20 21 22

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

16 17 18 19 20 21 22

Dmb

endoconk

endocoffk

Diffusion

échange

0

1

2

3

4

5

0.1 1.25 10 100

time (s)

' (µ

m)

Diffusion exchange Dmb=0.05

!m2.s-1

(

((t) =

'(t) = '0

spatial temporel

A ! Indépendant de l’espace

! Composantes temporelles et spatiales liées

t=0, t=1 s , t=6 s, t=15 s , t=45 s , t=100 s

2'(t)

Critère : '(t)

'(t) 4


Exemple d’application biologique

Distinction diffusion/échange

Applications biologiques

n=16

0/ 1 offk tF F Ae!= !

$ résidence =koff-1= 230±50 s

'

Pré-bleach 0.6s 150s

450s 1050s

)

n=45 x (!m)

x

Dynamique dominée par l’échange du premier ordre


Conclusion

En perturbant l’équilibre du système, on peut sonder sa dynamique via l’utilisation de méthodes optiques avec une résolution spatiale au micron et sur des temps <1s jusqu’à plusieurs heures" Si possible utiliser une méthode basée sur l’acquisition d’images (information spatiale, traitement plus complet, analyse postbleach") Prudence sur l’interprétation des expériences et sur le choix du modèle mathématique !

Documents

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