Dyskératose congénitale et biogénèse des RNA H/ACA .

Christian Trahan et François Dragon,

Centre BioMed, Département des

sciences biologiques, UQÀM.

Pathologie qui affecte les tissus à haut renouvellement

diagnostique difficile en raison des désordres variés:

Hyperpigmentation de la peau (89%)

Dysplasie des ongles (88%)

Aplasie de la moelle osseuse (86%)

Leucoplasies des muqueuses (78%)

Pathologies pulmonaires (20%)

Perte prématurée des cheveux (16%)

Tendance à la malignité (10%)

Ostéoporose (10%)

Aplasie de la moelle osseuse (86%)

Dyskératose congénitale (DC)

Dyskératose congénitale (DC)

Petite stature /retard de développement

microcéphalie

épiphora

Hypoplasie cérébellaire

Nécrose avasculaire des hanches et des épaules

Problèmes gastroentérique

Déficiences immunologique

Perte prématurée des dents

Autres désordres …

autres…

Dyskératose congénitale (DC)

Raccourcissement des télomères transmis à chaque génération.

La DC est donc considéré comme un problème de la biologie des télomères.

Corrélation entre la longueur des télomères et l’apparition des phénotypes.

Des mutations génétiques ont été identifiés chez environ la moitié des individus répertoriés au DCR

Les gènes impliqués ont en commun la biologie des télomères:

Dyskératose congénitale (DC)

Forme autosomique dominante; mutations dans le RNA de la télomérase (hTR).

Forme récessive reliée à l’X; mutations dans dyskérine.

Formes autosomique récessives; mutations dans NHP2 et NOP10.

DNA télomérique

[TTAGGG]n

[AATCCC]n

2-30 kpb50-300 b

3’5’

[TTAGGG]n

[AATCCC]n

T-loop

D-loop5’

3’

Problème de réplication des extrémités chromosomiques

fourche de réplication 3’

5’

synthèse dubrin avancé

3’5’

Synthèse dubrin retardé

3’5’

3’5’

3’5’

Extension et dégradationdes amorces

Télomères et problème de réplication

Transcriptase inverse (hTERT)

RNA (hTR)

3’

5’

CAAUCCCAAUC

Transcriptase inverse (hTERT)

RNA (hTR)

3’

5’

CAAUCCCAAUC

Extension des télomères par la télomérase

50-300 b

GGTTAGGGTTAGGGTTAGnGGTTAG

Structure secondaire de hTR et mutations causant la DC.

snoRNA scaRNA

rRNA snRNA

ψ ψ

GAR1

GAR1

NAF1

(3)

(2)

CTD

polIICTD

polII

dyskérineNOP10

NHP2

Nucléole,Corps de Cajal

Cytoplasme

Noyau

Site de transcription des RNA H/ACA

NAF1

(1)

Modèle de la biogénèse des RNA H/ACA in vivo.

Protéines H/ACA

Élaboration d’un système d’étude in vitro.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

Inv 4

13-416

C408G

Méthodologie

Transcription/traductionin vitro (35S-méthionine)

NAF1DyskérineFibrillarine CTRL-NHP2NOP10

IP dyskérine ou NAF1

SDS-PAGE 4-12%

fixation, séchage sur papier à chromatographie et analyse sur un Molecular Imager FX.

Analyse des RNA sur Molecular Imager FX

35Stransparent

Analyse surnageantsSDS-PAGE 4-12%

Transcription in vitro (32P-CTP)

hTR204 hTR204 mutésU3 RNA CTRL-

Purification sur gel

IP dyskérine ou NAF1

Le tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 s’assemble correctement

NAF

1Dys

k.

fibril

larin

eNHP2

NOP1

0

NAF1dyskérine

NOP10

NHP2

fibrillarine

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

T IP T IP T IP T IP T IP T IP T IP

- NAF

1

- NHP2

- NOP1

0- N

AF1,

NOP1

0- N

AF1,

NHP2

- dys

k.

Tout

es

IP dyskérine

Le tétramère lie spécifiquement le domaine H/ACA de hTR.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

NAF1 requiert la présence du trimère pour s’associer à hTR204.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

NAF1 requiert la présence du trimère pour s’associer aux RNA H/ACA

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

Conclusions

Nous avons élaboré un système de reconstitution in vitro qui récapitule l’assemblage précoce du domaine H/ACA de hTR tel que rapporté in vivo. Ce système nous a permis d’analyser l’effet des mutations dans ce domaine sur l’assemblage de la RNP.

Nous démontrons pour la première fois que la délétion Δ378-451 ainsi que la mutation ponctuelle C408G abolissent la liaison du tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 au domaine H/ACA de hTR.

Nos résultats suggèrent que les mutations C408G et Δ378-451 engendrent des défauts d’assemblage in vivo, ce qui entraîne probablement la dégradation de hTR et conduit tout droit à la DC.

Aucun défaut d’assemblage n’est causé par la mutation C450A n’a pu être détecté dans notre système.

Perspectives

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR.

NAF1

dyskérine

NOP10NHP2

La transversion C408G et la délétion Δ378-451 empêchent l’assemblage du domaine H/ACA de hTR.

Conclusions

perspectives

Méthodologie

Transcription/traductionin vitro (35S-méthionine)

NAF1DyskérineFibrillarine CTRL-NHP2NOP10

IP dyskérine ou NAF1

SDS-PAGE 4-12%

fixation, séchage sur papier à chromatographie et analyse sur un Molecular Imager FX.

Analyse des RNA sur Molecular Imager FX

35Stransparent

Analyse surnageantsSDS-PAGE 4-12%

Transcription in vitro (32P-CTP)

hTR204 hTR204 mutésU3 RNA CTRL-

Purification sur gel

IP dyskérine ou NAF1

hTR WT hTR-G450AMature

3’end3’ genomic sequence

Mature

3’end3’ genomic sequence

TGC AGTTCGCTTTCC… frequency TAC AGTTCGCTTTCC… frequency

TGC 1/9 TAC 4/9

TGC A 2/9 TAC AG 1/9

TGC AA 1/9 TAC AGAA 1/9

TGC AAAA 1/9 TAC AAAA 1/9

TGC AGAAA 1/9 TAC AGTTC 1/9

TGC AGTTCGCT 2/9 TAC AGTTCGCT 1/9

TGC AGTTCGCTT 1/9

HeLa BeWoMature3’end

3’ genomic sequence frequencyMature3’end

3’ genomic sequence frequency

TGC AGTTCGCTTTCC… TGC AGTTCGCTTTCC…

TGC 6/11 TGC 9/12

TGC A 2/11 TGC A 1/12

TGC AG 1/11 TGC AAAAA 1/12

TGC AGAAAAA 1/11 TGC AGTA 1/12

TGC AAAAAA 1/11

Conclusions

perspectives

Remerciements

François Dragon, Directeurles membres du laboratoire

Yves Henry, CNRS Toulouse.

Lapins Néo-Zélandais blanc

Caroline Martel, assistante de recherche.

Chantal Autexier, McGill.

Gabriele Varani and Steve Reichow, University of Washington