ÉÉtude du déterminisme tude du déterminisme de maturation et d’infectiosité de maturation et d’infectiosité des virus des hépatites B et Ddes virus des hépatites B et D

Laboratoire de virologie moléculaireLaboratoire de virologie moléculaireCamille SUREAUCamille SUREAU

Institut National de la Transfusion SanguineInstitut National de la Transfusion SanguinePARISPARIS

Laboratoire de virologie moléculaireLaboratoire de virologie moléculaireCamille SUREAUCamille SUREAU

Institut National de la Transfusion SanguineInstitut National de la Transfusion SanguinePARISPARIS

Le virus de l’hépatite BLe virus de l’hépatite B(HBV)(HBV)

Généralités (i)Généralités (i)

Plus de 350 millions de patients sont chroniquement infectés par HBV (OMS).

Il existe un vaccin efficace et sûr depuis 1984.

InfectionInfectionHépatiteHépatite

AiguëAiguë

GuérisonGuérison

ChronicitéChronicité

HépatiteHépatitechroniquechronique

CirrhoseCirrhoseHépatocarcinomeHépatocarcinome

Porteurs sainsPorteurs sains

95%95%

5%5%

70%70%

30%30%

Généralités (ii)Généralités (ii)

HepadnaviridaeHepadnaviridae

OrthohepadnavirusOrthohepadnavirus

HBVHBVWMHBVWMHBVGSHVGSHVWHVWHV

AvihepadnavirusAvihepadnavirus

DHBVDHBVHHBVHHBV

Les particules HBVLes particules HBV

100 nm

Diamètre: 42 à 46 nm

Diamètre: 20 nmLongueur variable

Diamètre: 20 nm

Le virion mature: la particule de DaneLe virion mature: la particule de Dane

Le génome HBVLe génome HBV

ADN circulaire partiellement bicaténaire

Organisation génétique très compacte:tous les nucléotides sont codantsles ¾ sont inclus dans deux ORFquatre ORF sont présentes

Sept protéines virales :polymérase viraleprotéine X (non structurale)protéine de capsideprotéine « e » (AgHBe)trois protéines d’enveloppe

Le Cycle de réplication HBVLe Cycle de réplication HBV

Les protéines d’enveloppe HBVLes protéines d’enveloppe HBV

La topologie des protéines d’enveloppe HBVLa topologie des protéines d’enveloppe HBV

S-AgHBs

M-AgHBs

La protéine La protéine L-AgHBsL-AgHBs

pre-S1 cytosolique

pre-S1 luminale

CI

RE

Les fonctions des protéines d’enveloppe (i)Les fonctions des protéines d’enveloppe (i)

S- et L-AgHBs S- et L-AgHBs sont nécessaires sont nécessaires à la maturation HBV à la maturation HBV

M-AgHBs M-AgHBs n’a pas de rôle connun’a pas de rôle connuIn vitroIn vitro

S-AgHBs S-AgHBs fournit le moteur du fournit le moteur du bourgeonnementbourgeonnement

L-AgHBs, L-AgHBs, par sa topologiepar sa topologie pre-S cytosoliquepre-S cytosolique,, permet lepermet le recrutement de la nucléocapside HBVrecrutement de la nucléocapside HBV [Domaine matrice (92-à-113)].[Domaine matrice (92-à-113)].

Les fonctions des protéines d’enveloppe (ii)Les fonctions des protéines d’enveloppe (ii)

L-AgHBs, L-AgHBs, par sa par sa topologietopologie pre-S externe pre-S externe permet permet l’al’attachement au ttachement au récepteurrécepteur de la cellule cible de la cellule cible (entrée virale).(entrée virale).

Les fonctions des protéines d’enveloppe (iii)Les fonctions des protéines d’enveloppe (iii)

Les fonctions des protéines d’enveloppe (iv)Les fonctions des protéines d’enveloppe (iv)

Les protéines d’enveloppe HBV bourgeonnent spontanément dans Les protéines d’enveloppe HBV bourgeonnent spontanément dans la lumière du RE, principalement sous forme de PSV.la lumière du RE, principalement sous forme de PSV.

La nucléocapside HBV peut être recrutée pour former des virions La nucléocapside HBV peut être recrutée pour former des virions matures.matures.

Une autre structure virale peut être enveloppée. Il s’agit d’une Une autre structure virale peut être enveloppée. Il s’agit d’une structure ribonucléoprotéique appartenant au virus de l’hépatite structure ribonucléoprotéique appartenant au virus de l’hépatite delta.delta.

Le virus de l’hépatite deltaLe virus de l’hépatite delta(HDV)(HDV)

GénéralitésGénéralités

HDV est: HDV est: Un virus enveloppé à ARN (-)Un virus enveloppé à ARN (-)

Un virus défectif, satellite occasionnel d’HBV, qui requiert la Un virus défectif, satellite occasionnel d’HBV, qui requiert la

présence des protéines d’enveloppe d’HBV pour accomplir son présence des protéines d’enveloppe d’HBV pour accomplir son

cycle infectieuxcycle infectieux

Le seul membre du genre Le seul membre du genre DeltavirusDeltavirus

Le virion HDVLe virion HDV

L’ARN HDVL’ARN HDV

Les protéines delta (AgHD)Les protéines delta (AgHD)

S-AgHDS-AgHD stimule la réplication de l’ARN HDV L-AgHDL-AgHD inhibe la réplication et dirige la maturation

La réplication du génome HDVLa réplication du génome HDV

Pol-II

Cycle de réplication HDVCycle de réplication HDV

Maturation HDVMaturation HDV

S-AgHBs S-AgHBs est suffisante pour la est suffisante pour la maturation HDV :maturation HDV :

elle assure le bourgeonnementelle assure le bourgeonnementelle possède un domaine matrice elle possède un domaine matrice

HDVHDV

L-AgHBs L-AgHBs est indispensable à l’entrée indispensable à l’entrée virale HDV car elle porte le domaine virale HDV car elle porte le domaine d’attachement au récepteur.d’attachement au récepteur.

Travail de thèseTravail de thèse

Objectifs de la rechercheObjectifs de la recherche

Recherche dans lesRecherche dans les BCY-I et –II BCY-I et –II de: de: déterminants de déterminants de maturation HBVmaturation HBV et et HDV ?HDV ? déterminants d’déterminants d’infectiosité ?infectiosité ?

Recherche dans le domaineRecherche dans le domaine pre-S pre-S de L-AgHBs de L-AgHBs de: de: déterminants d’déterminants d’infectiosité HDV ?infectiosité HDV ?

(Comparaison avec les (Comparaison avec les déterminants HBV)déterminants HBV)

ÉÉtat des connaissances sur la maturationtat des connaissances sur la maturation

Domaine matrice : résidus 92 à 113 sur pre-S. Bruss, V. (1997). J Virol 71, 9350-57.

Déterminant de maturation HBV: résidus 35 à 59 et R79 de la BCY-I. Loffler-Mary, H.,et coll.(2000). Virology 270, 358-67.

Domaine matrice : W-196,-199,-201 BCY-II. Jenna, S., et Sureau, C. (1999). J virol 73, 3351-58. Komla-Soukha, I., et Sureau, C. (2006). J virol 80,4648-

55.

La moitié C-terminale de BCY-I n’a pas été étudiée pour la maturation des virions car les grandes délétions sont délétères pour la stabilité des protéines.

HBVHDVHDV

ÉÉtat des connaissances sur l’entrée viraletat des connaissances sur l’entrée virale

Boucle Antigénique : impliquée à l’étape d’entrée virale. Jaoudé, G. A., et Sureau, C. (2006). J virol 79,

10460-66

Déterminant d’infectiosité : résidus 1 à 77 de pre-S1. Le Seyec, J. et coll. (1999). J virol 73, 2052-57. Myristate Bruss, V. et coll (1996). Virology 218, 396-99.

Domaine d’attachement au récepteur : résidus 2 et 48 de pre-S1. Gripon, P. et coll. (2005). J virol 79, 1613-22.

Séquence TLM (résidus 149 à 160): impliquée à l’entrée virale. (Stoeckl, L. et coll., (2006). PNAS 103, 6730-34.

TLM

1ere Partie1ere Partie

Déterminants de maturation et d’infectiosité Déterminants de maturation et d’infectiosité HBV et HDV dans les BCY-I et –IIHBV et HDV dans les BCY-I et –II

Création et criblage de mutations permissives pour Création et criblage de mutations permissives pour la secrétion de la secrétion de PSVPSV dans la dans la BCY-IBCY-I

(démarche expérimentale)(démarche expérimentale)

1. Transfection de cellules Huh-7 avec:

pT7HB2.7 ou dérivé

2. Analyse à J4 des protéines d’enveloppe présentes dans les cellules et les surnageants par WB (anti-S + anti-pre-S2)

Pour l’étude de la maturation HBV et HDV, les mutations doivent être permissives pour la sécrétion de

PSV.

Mutants BCY-IMutants BCY-I

Quelles sont les mutations Quelles sont les mutations BCY-IBCY-I permissives pour permissives pourla secrétion de la secrétion de PSVPSV??

Mutants permissifs pour la sécrétion de PSV obtenus

pour l’intégralité de la BCY-I.

La La BCY-IBCY-I est-elle impliquée dans la est-elle impliquée dans la maturation HBVmaturation HBV??

1. Transfection de cellules Huh-7 avec:

pCIHBenv(-) pT7HB2.7 ou dérivé

2. Analyse (J11)

ADN HBV cellule surnageant : IP anti-preS1

protéines d’enveloppe surnageant : ELISA anti-HBs

Mutation permissive quand le rapport ADN viral / protéines d’enveloppe dans le surnageant est conservé.

La BCY-I ne contient pas de déterminant

majeur de maturation HBV.

La La BCY-IBCY-I est-elle impliquée dans la est-elle impliquée dans la maturation HBVmaturation HBV? ?

1. Transfection de cellules Huh-7 avec:

pSVLD3 pT7HB2.7 ou dérivé

2. Analyse (J12)

ARN HDV (Cellules et surnageant)

protéine d’enveloppe (Surnageant)Mutation permissive quand le rapport ARN viral / protéines d’enveloppe dans le surnageant est conservé.

La La BCY-IBCY-I est-elle impliquée dans la est-elle impliquée dans la maturation HDV maturation HDV ? ?

(démarche expérimentale)(démarche expérimentale)

La BCY-I ne contient pas de déterminant majeur

de maturation HDV.

La La BCY-IBCY-I est-elle impliquée dans la est-elle impliquée dans la maturation HDVmaturation HDV? ?

La La BCY-IBCY-I a t-elle un rôle à a t-elle un rôle à l’entrée viralel’entrée virale ? (modèle ? (modèle HDVHDV))

(démarche expérimentale)(démarche expérimentale)

1. Normalisation des surnageants (ARN HDV)

2. Inoculation de cellules HepaRG (16 h, PEG)

3. Détection de l’ARN HDV dans les cellules 7 jours après inoculation

Mutation permissive quand la concentration en ARN HDV dans les cellules est équivalente à celle observée pour le type sauvage.

La BCY-I ne contient pas de déterminantmajeur pour l’infectiosité HDV.

La La BCY-IBCY-I a t-elle un rôle à a t-elle un rôle à l’entrée viralel’entrée virale ? (modèle ? (modèle HDVHDV))

Les résidus W-196, -199, -201 de la BCY-II ne sont pas nécessaires à la

maturation HBV.

Les résidus Les résidus TrpTrp de la de la BCY-IIBCY-II sont-ils impliqués dans la sont-ils impliqués dans la maturation HBV maturation HBV ? ?

1. Normalisation des surnageants (ADN HBV) (dilution en série)

2. Inoculation de cellules HepaRG (16 h, PEG)

3. Détection de l’ARNm HBV dans les cellules 12 jours après inoculation

Mutation permissive quand la concentration en ARNm HBV dans les cellules est équivalente à celle observée pour le type sauvage.

Les résidus Les résidus TrpTrp de la de la BCY-IIBCY-II ont-ils un rôle à l’étape ont-ils un rôle à l’étape d’entrée virale d’entrée virale ? ? (modèle (modèle HBVHBV))

(démarche expérimentale)(démarche expérimentale)

Les résidus W-196, -199, et -201 de la BCY-II

ne sont pas nécessaires à l’infectiosité HBV.

Les résidus Les résidus TrpTrp de la de la BCY-IIBCY-II ont-ils un rôle à l’étape ont-ils un rôle à l’étape d’entrée virale d’entrée virale ? ? (modèle (modèle HBVHBV))

Conclusion 1Conclusion 1

La BCY-I La BCY-I ne contient pasne contient pas de déterminant dede déterminant de maturation ni d’infectiosité HBV ou HDV.maturation ni d’infectiosité HBV ou HDV.

(Résidus Asp-33;Cys-48,-65,-69,-76;Tyr-72;Arg-73 (Résidus Asp-33;Cys-48,-65,-69,-76;Tyr-72;Arg-73 non testés car leur mutation n’est pas non testés car leur mutation n’est pas compatible aveccompatible avec la sécrétion des la sécrétion des PSV)PSV)

Les Trp-196, -199, et -201, de la BCY-II Les Trp-196, -199, et -201, de la BCY-II n’ont pas de rôle dans n’ont pas de rôle dans la maturation et la maturation et l’infectiosité HBV.l’infectiosité HBV.

Blanchet, M., et Sureau, C. (2006). J virol 80, 11935-45.

2ème partie2ème partie

Déterminants d’infectiosité Déterminants d’infectiosité

HDV et HBV HDV et HBV

dans le domaine pre-S de L-AgHBs.dans le domaine pre-S de L-AgHBs.

Démarche expérimentaleDémarche expérimentale

1.1. Production de virions Production de virions HDVHDV ou ou HBVHBV exprimant L- et S-AgHBs exprimant L- et S-AgHBs (simplification du modèle par absence de M-AgHBs)(simplification du modèle par absence de M-AgHBs)

2.2. Analyse et normalisation des surnageantsAnalyse et normalisation des surnageants

3.3. Inoculation de cellules sensibles HepaRG ou de cultures Inoculation de cellules sensibles HepaRG ou de cultures primaires d’hépatocytes humainsprimaires d’hépatocytes humains

4.4. Recherche d’Recherche d’ARN HDVARN HDV ou d’ ou d’ARNm HBVARNm HBV dans les cellules dans les cellules inoculéesinoculées

Extérieur

Membrane virale

Domaine d’attachement

Domaine matrice HBV

(topologie interne)

TLM1

48 92 113

149

160

Mutants pre-SMutants pre-S

Extérieur

Membrane virale

DA DM

TLM

Production des virions HDVProduction des virions HDV

Les mutations sont permissivespour la production de virions HDV.

Extérieur

DA DM

TLM110

Les résidus 11 à 75 sont impliqués dans l’infectiosité HDV.

Les résidus 76 à 110 (contenant le DM)ne sont pas impliqués dans l’infectiosité HDV.

Extérieur

DA DM

TLM110

Le domaine Le domaine pre-S1pre-S1 contient-il des déterminants contient-il des déterminants d’entrée virale HDV d’entrée virale HDV ? ? (cellules HepaRG)(cellules HepaRG)

La suppression du TLM est-elle délétère à l’entrée virale ?La suppression du TLM est-elle délétère à l’entrée virale ? (HDV/HepaRG/(HDV/HepaRG/PEGPEG))

La suppression du TLMn’est pas délétère pour l’infection en

présence de PEG.

Le PEG a t-il compensé une perte de fonction TLM?

Extérieur

DA DM

TLM

La suppression du TLM n’est pas délétère pour

l’infection en absence de PEG.

Extérieur

DA DM

TLM

La suppression du La suppression du TLMTLM est-elle délétère à est-elle délétère à l’entrée viralel’entrée virale en en absence de PEGabsence de PEG ? ? (HDV/HepaRG) (HDV/HepaRG)

La suppression du TLM n’est pas délétère pour l’infectiosité

HDV en culture primaire d’hépatocytes.

Extérieur

DA DM

TLM

Le Le TLMTLM est-il nécessaire à est-il nécessaire à l’entrée viralel’entrée virale en en culture primaire d’hépatocytesculture primaire d’hépatocytes ? ?

La suppression du TLM n’est pas délétère pour

l’infectiosité HBV en culture de cellule HepaRG.

Extérieur

DA DM

TLM

La suppression du La suppression du TLMTLM est-elle délétère à est-elle délétère à l’entrée viralel’entrée virale dans le dans le modèle HBV ?modèle HBV ? (HepaRG) (HepaRG)

La taille des délétions semble influencer l’infectiosité : nécessité d’une distance minimale entre le domaine d’attachement au récepteur (DA) et le DTM-I ?

153

80 97 107 115

DT

M-I

Quelles sont les conséquences de Quelles sont les conséquences de grandes délétionsgrandes délétions pre-S sur pre-S sur l’infectiosité des virions l’infectiosité des virions ?? ( (HDVHDV/HepaRG)/HepaRG)

DA

Conclusion 2Conclusion 2

Les déterminants d’infectiosité du domaine pre-S de la grande protéine Les déterminants d’infectiosité du domaine pre-S de la grande protéine d’enveloppe sont confinés aux 75 premiers résidus N-terminaux.d’enveloppe sont confinés aux 75 premiers résidus N-terminaux.

Une distance minimale semble requise entre le DTM I et le site d’attachement au Une distance minimale semble requise entre le DTM I et le site d’attachement au récepteur.récepteur.

Blanchet, M., et Sureau, C. (2007). J virol, sous presse.

Conclusion généraleConclusion générale

Conclusion généraleConclusion générale

Maturation HBV:Maturation HBV: S-AgHBs assure le bourgeonnement. S-AgHBs assure le bourgeonnement. L-AgHBs permet le recrutement de la nucléocapside (Domaine matrice).L-AgHBs permet le recrutement de la nucléocapside (Domaine matrice).

Pas de rôle des BCY-I et –IIPas de rôle des BCY-I et –II dans le recrutement de la capside. dans le recrutement de la capside.

Maturation HDV:Maturation HDV: S-AgHBs assure le bourgeonnement et possède un domaine matrice S-AgHBs assure le bourgeonnement et possède un domaine matrice

présent dans la BCY-II. présent dans la BCY-II. Pas de rôle de la BCY-IPas de rôle de la BCY-I..

Infectiosité:Infectiosité: déterminants communs entre déterminants communs entre HBV et HDVHBV et HDV sur pre-S1 (75 premiers sur pre-S1 (75 premiers

résidus N-terminaux). résidus N-terminaux). Pas de rôle des BCY-I et II, TLM, et DM.Pas de rôle des BCY-I et II, TLM, et DM.

Modèle d’entrée viraleModèle d’entrée virale

1. Attachement au récepteur résidus 1 à 48 (nécessité distance minimale avec DTM-I ?)

Gripon, p., et coll. (2005). J virol 79, 1613-22.Barrera, A., et coll. (2005). J virol 79, 9786-98. Engelke, M., et coll. (2006). Hepatology 43,750-60.

stabilisé par les résidus 49 à 75 ?Le Seyec, J., et coll. (1999). J virol 73, 2052-57.Blanchet, M., et Sureau, C. (2007). J virol, sous presse.

2. Endocytose

3. Echappement des endosomes indépendante du pH

Hagelstein, J., et coll. (1997). Virology 229, 292-94.

pas de fonction du TLMBlanchet, M., et Sureau, C. (2007). J virol, sous presse. Contrairement à Stoeckl, L., et coll. (2006). PNAS 103, 6730-34.

peptide fusion dans le DTM-I ?Grcacic, E., et coll. (2000). J virol 74, 2455-58.Etude en cours au laboratoire

intervention des résidus 49 à 75 ? isomérisation des ponts S-S de la BAG ?

Jaoude, G. A., et Sureau, C. (2005). J virol 79, 10460-66.

PerspectivesPerspectives

PerspectivesPerspectives

Identification du récepteurIdentification du récepteur Préciser la fonction des résidus 49 à 75 de pre-S1Préciser la fonction des résidus 49 à 75 de pre-S1 Préciser la fonction de la BAGPréciser la fonction de la BAG

Vérifier la transposabilité à HBVVérifier la transposabilité à HBV

Les Trp de la BCY-II:Les Trp de la BCY-II: sont conservés parmi les sont conservés parmi les OrthohepadnavirusOrthohepadnavirus n’ont pas de fonction à l’entrée viralen’ont pas de fonction à l’entrée virale n’ont pas de fonction dans la maturation HBVn’ont pas de fonction dans la maturation HBV leur conservation est-elle imposée par l’ORF P ?leur conservation est-elle imposée par l’ORF P ?

Laboratoire de virologie moléculaire - INTSLaboratoire de virologie moléculaire - INTS Georges Abou-JaoudéIsabelle Komla-Soukha

Jessica SalisseCamille Sureau

Laboratoire de Virologie transfusionnelle - INTSLaboratoire de Virologie transfusionnelle - INTSRémi Caparros

Inserm U271Inserm U271 Christian Trépo

Olivier Hantz