Article original

Aromathérapie

Effet de l’huile essentielle de Thymus vulgaris sur les bactériespathogènes responsables de gastroentérites

M. Cheurfa, R. Allem, M. Sebaihia, S. Belhireche

Laboratoire de bioressources naturelles, faculté des sciences, université H.-B.-Chlef, BP 151, Chlef 02000, Algérie

Correspondance : Abou_yazid@hotmail.fr

Résumé : Différentes plantes aromatiques synthétisent desmolécules odorantes qui constituent les huiles essentiellescapables d’exercer un effet équivalent à celui des antibiotiques,et cela grâce à la nature chimique de leurs constituants. Cetravail porte sur l’étude de l’activité antibactérienne de l’huileessentielle de Thymus vulgaris vis-à-vis de cinq bactériespathogènes (Escherichia coli, Bacillus cereus, Citrobacter freun-dii, Klebsiella pneumoniae et Staphylococcus aureus) responsa-bles de gastroentérites. La composition chimique de l’huileessentielle de Thymus vulgaris a été analysée par GC/MS. Lesconstituants majeurs sont carvacrol et thymol. Les tests d’inhi-bitions sont réalisés par la méthode de diffusion des disques.Les résultats ont montré une forte activité antibactériennede l’huile essentielle avec des diamètres variant de 22,00 à45,00 mm. Ceux-ci suggèrent que l’utilisation de l’huile essen-tielle de thym permettrait de mieux protéger l’homme contreles bactéries responsables de gastroentérites.

Mots clés : Gastroentérites – Thymus vulgaris – Huileessentielle – Activité antibactérienne

Effect of essential oil of Thymus vulgaris on bacterialpathogens responsible for gastroenteritis

Abstract: Different aromatic plants synthesize molecules thatare fragrant essential oils that can have an effect equivalent tothat of antibiotics, thanks to the chemical nature of theirconstituents. This work concerns the study of the antibacterialactivity of essential oil of Thymus vulgaris against five patho-genic bacteria (Escherichia coli, Bacillus cereus, Citrobac-ter freundii, Klebsiella pneumoniae, and Staphylococcus aureus)responsible for gastro-enteritis. The chemical composition ofthe essential oil of Thymus vulgaris was analyzed by GC/MS.The major components are Carvacrol and Thymol. The inhi-bition tests were carried out by the disk diffusion method, theresults showed strong antibacterial activity of essential oil withdiameters ranging from 22.00 and 45.00 mm. These resultssuggest that the use of the essential oil of thyme could betterprotect humans against bacteria that cause gastro-enteritis.

Keywords: Gastroenteritis – Thymus vulgaris – Essential oil –Antibacterial activity

Introduction

La gastroentérite est une infection du système digestifqui cause des nausées, des vomissements, des crampes abdo-minales et des diarrhées. Elle peut être provoquée par denombreux agents, notamment les bactéries. Son traitementest basé sur les antibiotiques, mais la consommation inap-propriée et l’utilisation abusive de ces derniers ont accéléréla sélection de bactéries multirésistantes, constituant actuel-lement un problème de résistance aux antibiotiques et desanté publique [21].

Donc, le recours aux ressources naturelles, surtout auxplantes médicinales, devient très important et intéressantpour la recherche de nouveaux produits antibactériens plusefficaces [29].

Les huiles essentielles des plantes ont trouvé leur place enaromathérapie, en pharmacie, en parfumerie, en cosmétiqueet dans la conservation des aliments. Leur utilisation est liéeà leurs larges spectres d’activités biologiques reconnues[9,20].

L’activité antimicrobienne des huiles essentielles a étédémontrée in vitro par de nombreuses études, principale-ment vis-à-vis des bactéries pathogènes telles que Clostri-dium perfringes, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Sal-monella typhimurium, Listeria monocytogenes etYersinia enterocolotica [12].

L’objectif de ce travail est l’extraction, la détermina-tion de la composition chimique de l’huile essentielle deThymus vulgaris et l’étude de l’activité antibactériennevis-à-vis des souches bactériennes responsables degastroentérites.

Phytothérapie© Springer-Verlag France 2013DOI 10.1007/s10298-013-0777-7

Matériel et méthodes

Matériel végétal

La partie aérienne de la plante Thymus vulgaris a été récoltéeau mois de mars 2010, provenant de Madjaja, région deChlef, en Algérie.

Bactéries pathogènes étudiées

Les bactéries pathogènes citées ont été isolées à partir deselles de patients souffrant de troubles digestifs et de diar-rhées infectieuses (Escherichia coli, Staphylococcus aureus,Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii etBacillus cereus).

Antibiotiques utilisés

Les antibiotiques utilisés sont : imipénème pour Citrobac-ter freundii (Fig. 1) ; céfazoline pour Bacillus cereus (Fig. 2),Eschirichia coli (Fig. 3), Staphylococcus aureus (Fig. 4) etKlebsiella pneumoniae (Fig. 5).

Extraction de l’huile essentielle

L’extraction de l’huile essentielle a été effectuée par hydro-distillation dans un appareil de type Clevenger. Les distilla-tions ont été réalisées par ébullition de 100 g de matérielvégétal frais avec 500 ml d’eau dans un ballon pendant1 heure 30 minutes[2].

L’huile essentielle obtenue est conservée à une tempéra-ture de 4 °C et à l’abri de la lumière [6]. Elle est diluée dansdu méthanol (1 %, v/v) avant de procéder à l’analyse CG/SM(chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectromé-trie de masse).

Fig. 1. Effet antibactérien d’imipénème sur Citrobacter freundii

Fig. 2. Effet antibactérien de céfazoline sur Bacillus cereus

Fig. 3. Effet antibactérien de céfazoline sur Staphylococcus aureus

Fig. 4. Effet antibactérien de céfazoline sur Klebsiella pneumoniae

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Calcul du rendement

Le rendement en huile essentielle est le rapport entre lepoids de l’huile extraite et le poids de la plante à traiter. Lerendement, exprimé en pourcentage, est calculé par la for-mule suivante :

R = PB/PA × 100R : rendement de l’huile en pourcentage.PB : poids de l’huile en gramme.PA : poids de la plante en gramme.

Analyse chromatographique

La séparation des constituants de l’huile essentielle a étéeffectuée par le GC/MS ; les conditions opératoires sontcitées dans le Tableau 1.

Procédure microbiologique

Spectre antibactérien de l’huile essentielle de Thymus vulgariset des antibiotiques

Aromatogramme

L’huile essentielle de Thymus vulgaris est testée pour sonpouvoir antibactérien suivant la méthode de diffusion desdisques [26].

Les boîtes de pétri contenant le milieu Mueller-Hintonagar sont inondées par 1 ml de la préculture des bactériespathogènes. Après un séchage de 30 minutes à 37 °C, desdisques en papier buvard (6 mm de diamètre) imprégnésde 50 μl d’huile essentielle sont déposés à la surface de lagélose avec trois répétitions.

Les boîtes de pétri ainsi préparées sont préincubées dansdes conditions réfrigérées pendant deux à quatre heures à+4 °C afin de permettre la diffusion de l’agent inhibiteurqui sera suivie par l’incubation pendant 24 heures à 37 °C.

L’absence de croissance microbienne autour des disquesse traduit par un halo translucide ; le diamètre est mesuré etexprimé en millimètre (mm) [8].

Antibiogramme

Des boîtes de pétri contenant la gélose Mueller-Hinton sontensemencées par une charge bactérienne bien définie pourchaque bactérie pathogène ; des disques imprégnés d’anti-biotiques, de doses connues, sont appliqués à la surface ;les boîtes sont incubées à une température de 37 °C pendant18 à 24 heures.

Détermination de la concentration minimale inhibitrice

La concentration minimale inhibitrice (CMI) est définiecomme la plus petite concentration de produit pour laquelleaucune croissance bactérienne n’est visible comparative-ment au témoin, après un temps d’incubation à 37 °C [22].Les CMI de l’huile essentielle ont été déterminées selon laméthode rapportée par Pinto et al. [23].

Du fait de la non-miscibilité de l’huile essentielle à l’eau etdonc aux milieux de culture, une mise en émulsion a étéréalisée grâce à une solution d’agar à 0,2 % afin de favoriserle contact germe/composé. Des dilutions sont préparées aux1/10, 1/25, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500 et 1/1 000 dans cettesolution d’agar. Dans des tubes à essais contenant chacun13,5 ml de milieu Mueller-Hinton agar, on ajoute 1,5 mlde chacune des dilutions de façon à obtenir les concentra-tions finales de 1/100, 1/250, 1/500, 1/1 000, 1/2 000,1/5 000 et 1/10 000 (v/v), puis les tubes sont agités convena-blement avant de les verser dans des boîtes de pétri.

Des témoins contenant le milieu de culture plus la solu-tion d’agar à 0,2 % sont également préparés. L’ensemence-ment se fait par inondation de 1 ml de préculture des bacté-ries pathogènes ; l’incubation se fait à 37 °C pendant24 heures.

Fig. 5. Effet antibactérien de céfazoline sur Escherichia coli

Tableau 1. Les conditions opératoires.

Passeurd’échantillons

Automatique

Volume injecté 1 μlGaz vecteur HéliumColonne utilisée Élite-5ms (longueur : 30 m, diamètre :

0,25 μm)Températured’injection

250 °C

Températurede la ligne transfert

200 °C

Programmationde la température

T initiale : 110 °C pendant 10 minRampe 1 : 25°/min 275 °C pendant 10 minRampe 2 : 2,5°/min 300 °C pendant 10 min

Mode d’ionisation Impact électroniquePotentield’ionisation

70 eV

Températurede la source

200 °C

Balayage en scan(m/z)

20–500 UMA

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Résultats

Rendement

Le rendement moyen en huile essentielle a été calculé enfonction de la matière végétale. La plante de thym a fourniun rendement en huile essentielle d’environ 2 % ; cettevaleur est très proche de celle énoncée par El Ajjouri et al.[14], où le rendement oscille entre 1,75 et 2,05 %.

Un rendement de 2 % d’huile essentielle de thym obtenu àpartir des feuilles est considéré comme important par rap-port à celui donné par Dob et al. [11], obtenu à partir destiges et des feuilles (0,9 %). Des résultats similaires ont ététrouvés par certains auteurs [3,16] avec l’huile essentielle deThymus zygis avec un rendement allant de 2,3 à 3,6 %. Lerendement en huile essentielle atteint son maximum pen-dant la phase de floraison (0,9 à 1,4 %) et son minimumpendant la période de dormance (0,15 %) [19].

Composition chimique de l’huile essentiellede Thymus vulgaris

Les résultats de l’analyse de l’huile essentielle de Thymus vul-garis par GC/MS montrent que les composants majeurs sontrespectivement le carvacrol (34,62 %) et le thymol (27,43 %).D’après la décomposition chimique de cette huile, on peutdéduire qu’elle appartient au chémotype Thymus vulgaris àcarvacrol.

La variation de la composition chimique des huiles essen-tielles est influencée par les conditions édaphiques, climati-ques ainsi que les conditions de culture des plantes et mêmela méthode d’extraction et le mode de conservation [13,18].

Spectre antibactérien de l’huile essentiellede Thymus vulgaris et des antibiotiques

Le diamètre de la zone d’inhibition enregistré pour Citro-bacter frendii est de 29,00 mm avec l’antibiotique (imipé-nème) et de 27,00 mm avec l’huile essentielle de Thymus vul-garis (Tableau 2).

Escherichia coli présente une sensibilité à l’antibiotique(céfazoline) avec un diamètre de 31,00 mm et de 32,00 mmavec l’huile essentielle de Thymus vulgaris (Tableau 2) ; nosrésultats sont en accord avec ceux retrouvés par certainsauteurs [5,15].

Pour les autres bactéries, nous avons enregistré des dia-mètres d’inhibition très importants avec l’huile essentiellede Thymus vulgaris comparativement aux antibiotiques(Tableau 2). Des résultats similaires ont été trouvés avecl’huile essentielle de thym dont le diamètre varie entre20,00 et 24,00 mm pour Staphylococcus aureus [5].

D’autres travaux retrouvent des diamètres d’inhibitionentre 20,00 et 25,00 mm pour Bacillus cereus avec l’huileessentielle de Thymus fontanesii [17].

Ces souches présentent une sensibilité élevée à cette huile ;cette grande activité est liée à la présence de carvacrol et dethymol (composés phénoliques majoritaires) [28].

Détermination de la concentration minimale inhibitrice

Les bactéries pathogènes ont montré une grande sensibilité àl’huile essentielle de Thymus vulgaris surtout sur Bacil-lus cereus et Klebsiella pneumoniae (Fig. 6). Il y a absencede croissance des souches pour des concentrations de1/100 et 1/250 (Tableau 3).

Une concentration de l’huile essentielle de Thymus vulga-ris de 1/3 000 v/v était suffisante pour inhiber la croissancedes bactéries Gram positif (Staphylococcus aureus et Bacil-lus cereus), alors que Klebsiella pneumoniae a manifesté unecertaine résistance à cette concentration et une sensibilité àune concentration de 1/2 000. Une CMI était enregistrée

Tableau 2. Diamètre de zones d’inhibition en millimètre (mm)de l’huile essentielle de Thymus vulgaris et des antibiotiques vis-à-vis des bactéries pathogènes.

Bactéries Antibiotique

Imipé-nème

Céfazo-line

HEde Thymus vulgaris

Citrobacter frendii 29,00 ±0,30

– 27,00 ± 0,50

Staphylococ-cus aureus

– 26,00 ±0,10

45,00 ± 0,30

Klebsiella pneumo-niae

– 28,00 ±0,30

38,00 ± 0,60

Bacillus cereus – 16,00 ±0,40

43,00 ± 0,50

Escherichia coli – 31,00 ±0,10

32,00 ± 0,40

Fig. 6. Effet de l’HE de thym sur Citrobacter freundii

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pour Citrobacter frendii à une concentration de 1/1 000(Tableau 3).

La bactérie qui a résisté davantage à l’action de l’huileessentielle était Escherichia coli dont la CMI est de 1/500(Tableau 3). Les résultats de CMI de l’huile essentielle duthym vis-à-vis d’Escherichia coli sont comparables à ceuxtrouvés par Haddouchi et al. [15].

Discussion

Plusieurs auteurs rapportent que la richesse en dérivés phé-noliques confère aux huiles essentielles une forte activitéantimicrobienne [17,25]. L’huile essentielle de Thymus blei-cherianus et de Thymus ciliatus exercent une forte activitéantimicrobienne qui est due essentiellement à la présence dethymol [1,2,14].

Certains auteurs [12,24] ont testé un grand nombre deconstituants purs d’huiles essentielles contre 25 genres dif-férents de bactéries et ont démontré que le thymol est lecomposé qui possède le plus large spectre d’activité antibac-térienne, suivi du carvacrol et de l’α-terpinéol. Ces mêmesauteurs ont expliqué la différence de l’efficacité antimicro-bienne observée entre le thymol et le carvacrol par la posi-tion du groupement hydroxyle sur la structure phénoliquedes deux molécules.

Les composés chimiques de grande efficacité sont les phé-nols (thymol, carvacrol), les alcools (α-terpinène et linalol),des aldéhydes, des cétones et plus rarement des terpènes.Des espèces de genre Thymus qui contiennent des phénolsont un spectre d’action antibactérienne très large [1–3].

L’effet de l’huile essentielle de thym est également visibleen microscopie électronique ; un changement morpholo-gique des cellules de Staphylococcus aureus a été observémais sans lyse complète ; celle-ci ayant été enregistrée chezEscherichia coli [7].

Un autre mode d’action est évoqué par l’altération de lamembrane cellulaire et notamment de sa perméabilité quipeut entraîner des pertes anormales d’ions, voire de macro-molécules. Le traitement de Staphylococcus aureus par

l’huile essentielle de thym entraîne une perte d’ions depotassium par la bactérie ainsi qu’une inhibition de sa res-piration [4].

Chez Escherichia coli, des effets délétères ont été observéssur l’homéostasie en potassium ainsi que sur la respirationglucose dépendante. Ces résultats laissent supposer un effetnéfaste de l’huile essentielle sur l’intégrité ainsi que sur lesfonctions membranaires des micro-organismes [10].

Des travaux ont montré que le carvacrol provoque uneffet inhibiteur chez Bacillus cereus. Celui-ci est dû à uneforte diminution de l’ATP intracellulaire, une réduction dupotentiel membranaire et du pH intracellulaire et aussi àune influence sur le flux de potassium (intra- et extracellu-laire) [27,28].

Conclusion

Les résultats de notre travail montrent qu’avec une hydro-distillation nous avons obtenu une huile essentielle dont lerendement est de 2 % ; celui-ci peut être rentable à l’échelleindustrielle.

Les résultats de l’analyse par chromatographie en phasegazeuse couplée à la spectrométrie de masse indiquent unerichesse en composés phénoliques avec un pourcentage de34,62 et de 27,43 % respectivement pour le carvacrol et lethymol.

L’activité antibactérienne de l’huile essentielle de Thymus vul-garis a été étudiée à l’égard de cinq espèces pathogènes respon-sables de gastroentérites : Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae,Citrobacter freundii, Staphylococcus aureus et Bacillus cereus(Figs 7–10).

Nous avons constaté que l’huile essentielle de thym, dontle composé majoritaire est de nature phénolique, a un largespectre d’inhibition comprenant des bactéries Gram négatifet Gram positif ; ces dernières ont montré une grandesensibilité.

Tableau 3. Résultats de la concentration minimale inhibitrice d’HE de Thymus vulgaris vis-à-vis des bactéries pathogènes.

Bactéries Concentration d’HE de Thymus vulgaris

Témoin 1/100 v/v

1/250 v/v

1/500 v/v

1/1 000 v/v 1/2 000 v/v 1/3 000 v/v 1/5 000 v/v

Escherichia coli + – – – + + + +Klebsiella pneumoniae + – – – – – + +Bacillus cereus + – – – – – – +Staphylococcus aureus + – – – – – – +Citrobacter frendii + – – – – + + +

v/v : le volume de l’huile essentielle sur le volume de la solution d’agar.+ : croissance.– : pas de croissance.

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Fig. 7. Effet de l’HE de thym sur Escherichia coli

Fig. 8. Effet de l’HE du thym sur Klebsiella pneumoniae

Fig. 9. Effet antibactérien de céfazoline sur Bacillus cereus

Fig. 10. Effet de l’HE de thym sur Staphylococcus aureus

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