ELABORATION D’UN MODELE EXPERIMENTAL D’ANEMIE …

1Maître de conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’AlfortInvité : M. DEVAUCHELLE

ECOLE NATIONALE VETERINAIRE D’ALFORT

Année 2003

ELABORATION D’UN MODELE EXPERIMENTAL D’ANEMIE DEFICITAIRE EN EPO CHEZ LE CHAT :

ETUDE PRELIMINAIRE.

THESE

pour le

DOCTORAT VETERINAIRE

présentée et soutenue publiquement devant

LA FACULTE DE MEDECINE DE CRETEIL

Le 03 avril 2003

par

Juan, Luis HERNANDEZ RODRIGUEZ

Né le 10 janvier 1975 à Màlaga (Espagne)

JURY

Président : M. Professeur à la faculté de médecine de CRETEIL

Membres

Directeur : M. CRESPEAU Professeur à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort Assesseur : M. ROSENBERG

2

TABLE DES MATIERES

1 INTRODUCTION...........................................................................7

1.1 Une hormone synthétisée par les reins : l’EPO ............................................................ 7

1.1.1 Découverte de l’EPO........................................................................................ 7

1.1.2 Structure du gène de l’EPO et du peptide actif ................................................ 7

1.1.3 Localisation de la synthèse de l’EPO............................................................... 9

1.1.4 Régulation de la synthèse d’EPO ..................................................................... 9

1.1.5 Mode d’action cellulaire de l’EPO................................................................. 13

1.1.6 Physiologie de l’EPO ..................................................................................... 15

1.1.6.1 Concentration plasmatique de l’érythropoïétine................................ 15

1.1.6.2 Action physiologique de l’érythropoïétine ........................................ 16

a Action sur l’érythropoïèse ..................................................................................... 16 b Action sur la mégacaryopoïèse ............................................................................. 17 c Action sur les neurones ......................................................................................... 17 d Action sur les cellules endothéliales capillaires, myocardiques et musculaires lisses ......................................................................................................................... 17

1.2 L’anémie lors d’insuffisance rénale chronique........................................................... 17

1.2.1 Définitions...................................................................................................... 17

1.2.2 Origine de l’anémie lors d’insuffisance rénale chronique ............................. 18

1.2.2.1 Défaut de synthèse d’érythropoïétine ................................................ 18

1.2.2.2 Raccourcissement de la durée de vie des hématies et........................ 18

hyporéactivité médullaire .............................................................................. 18

1.2.3 Traitements de l’anémie lors d’insuffisance rénale chronique....................... 18

1.2.3.1 Traitement de l’anémie avant l’avènement de l’érythropoïétine

recombinante.................................................................................................. 18

1.2.3.2 Apport d’érythropoïétine recombinante............................................. 19

1.2.3.3 Thérapie génique................................................................................ 19

1.2.4 Modèles expérimentaux d’insuffisance rénale chronique.............................. 20

1.2.4.1 Modèle chirurgical ............................................................................. 20

1.2.4.2 Modèle médical.................................................................................. 20

1.3 Objectif de recherche.................................................................................................. 21

2 MATERIEL ET METHODE .......................................................21

2.1 Implication personnelle .............................................................................................. 21

2.2 Animaux ..................................................................................................................... 21

2.3 Administration ............................................................................................................ 22

2.3.1 Cyclophosphamide ......................................................................................... 22

2.3.2 Doxorubicine.................................................................................................. 22

2.3.3 Paraplatine...................................................................................................... 23

2.3.4 Radiations ionisantes...................................................................................... 24

2.4 Examens cliniques ...................................................................................................... 25

2.5 Examens hématologiques ........................................................................................... 25

2.6 Dosages plasmatiques................................................................................................. 26

2.6.1 Dosages biochimiques sanguins..................................................................... 26

2.6.2 Dosage de l’EPO ............................................................................................ 26

2.7 Analyses statistiques................................................................................................... 27

3 RESULTATS .................................................................................28

3.1 Cyclophosphamide ..................................................................................................... 28

3.1.1 Suivi clinique.................................................................................................. 28

3.1.2 Suivi hématologique....................................................................................... 28

3.1.3 Suivi du dosage de l’EPO............................................................................... 30

3.1.4 Suivi biochimique .......................................................................................... 32

3.2 Doxorubicine .............................................................................................................. 32

3.2.1 Suivi clinique.................................................................................................. 32




3.3 Paraplatine .................................................................................................................. 36

3.3.1 Suivi clinique.................................................................................................. 36


3



3.4 Radiations ionisantes .................................................................................................. 38

3.4.1 Suivi clinique.................................................................................................. 38




4 DISCUSSION.................................................................................40

4.1 Dosages de l’EPO....................................................................................................... 40

4.2 Obtention d’une anémie.............................................................................................. 40

4.3 Synthèse d’EPO.......................................................................................................... 41

4.4 Innocuité ..................................................................................................................... 41

4.5 Synthèse...................................................................................................................... 41

CONCLUSION.................................................................................43 BIBLIOGRAPHIE ...........................................................................44

4

SOMMAIRE DES FIGURES

Figure 1 : Structure primaire de l’érythropoïétine humaine....................................................... 8

Figure 2 : Structure du gène de l’érythropoïétine humaine...................................................... 10

Figure 3 : Modèle de régulation par le dioxygène du gène de l’érythropoïétine ..................... 12

Figure 4 : Liaison de l’EPO à son récepteur et transduction du signal .................................... 14

Figure 5 : Interprétation de l’érythropoïétinémie en fonction du taux d’hémoglobine............ 15

Figure 6 : Rôle de l’EPO dans l’érythropoïèse. ....................................................................... 16

Figure 7 : Champ d’irradiation des chats rad I et rad II. ......................................................... 24

Figure 8 : Répartition des concentrations sériques en érythropoïétine évaluées à partir de la

trousse EPOTrac selon l’hémoglobinémie moyenne. ............................................... 27

Figure 9 : Représentation graphique de l’évolution de l’hémoglobinémie des chats cyclo I et

cyclo II....................................................................................................................... 29

Figure 10 : Représentation graphique de l’évolution de la numération plaquettaire des chats

cyclo I et cyclo II. ...................................................................................................... 30

Figure 11 : Représentation graphique de l’évolution de l’hémoglobinémie et de

l’érythropoïétinémie du chat cyclo I. ........................................................................ 31


l’érythropoïétinémie du chat cyclo II. ....................................................................... 31

Figure 13 : Représentation graphique du suivi du poids des chats adria I et adria II. ............ 33

Figure 14 : Représentation graphique de l’évolution de l’hémoglobinémie des chats adria I et

adria II. ..................................................................................................................... 34

Figure 15 : Représentation graphique de l’évolution de la numération et formule leucocytaire

du chat adria I. .......................................................................................................... 35

Figure 16 : Représentation graphique de l’évolution de la numération et formule leucocytaire

du chat adria II.......................................................................................................... 35

Figure 17 : Représentation graphique de l’évolution de l’hémogobinémie des chats para I et

para II........................................................................................................................ 37

5

SOMMAIRE DES TABLEAUX

Tableau I : Valeurs usuelles d’érythropoïétinémie chez le chat avec la trousse EPOEIA

BioMérieux .............................................................................................................. 15

Tableau II : Dose de cyclophosphamide administrée quotidiennement aux chats cyclo I et

cyclo II..................................................................................................................... 22

Tableau III : Protocole d’administration de la doxorubicine au chat adria I........................... 23

Tableau IV : Protocole d’administration de la doxorubicine au chat adria II ......................... 23

Tableau V : Protocole d’administration du paraplatine au chat para I. ................................... 24

Tableau VI : Protocole d’administration du paraplatine au chat para II ................................. 24

Tableau VII : Repartition des doses de radiations chez les chats rad I et rad II...................... 25

Tableau VIII : Informations livrées par l’automate MS4 et valeurs usuelles........................... 25

Tableau IX : Dates des prélèvements pour analyses hématologiques et biochimiques ........... 26

Tableau X : Paramètres biochimiques sanguins dosés par le VetTest et leur valeur usuelle. .. 26

Tableau XI : Valeurs d’érythropoïétinémie obtenues avec la trousse de dosage EPOTrac pour

quelques chats indemnes d’IRC. ............................................................................. 27

Tableaux XIIet XIII : Résultats des examens hématologiques des chats cyclo I et cyclo II .... 28

Tableau XIVet XV : Résultats des dosages d’érythropoïétinémie chez les chats cyclo I et

cyclo II..................................................................................................................... 30

Tableaux XVI et XVII : Résultats des analyses biochimiques des chats cyclo I et cyclo II ... 32

Tableaux XVIIIet XIX : Evolution du poids corporel des chats adria I et adria II................. 32

Tableaux XXet XXI : Résultats des analyses hématologiques des chats adria I et adria II.... 33

Tableaux XXII et XXIII : Résultats des analyses biochimiques des chats adria I et adria II . 36

Tableaux XXIV et XXV : Résultats des analyses hématologiques des chats para I et para II.................................................................................................................................. 37

Tableaux XXVIet XXVII : Résultats des analyses biochimiques des chats para I et para II. 38

Tableaux XXVIII et XXIX : Résultats des analyses hématologiques des chats rad I et rad II.................................................................................................................................. 39

Tableaux XXX et XXXI : Résultats des analyses biochimiques des chats rad I et rad II....... 40

6

1 INTRODUCTION

1.1 Une hormone synthétisée par les reins : l’EPO

1.1.1 Découverte de l’EPO

L’existence d’un facteur intervenant dans la régulation et le maintien de la masse

érythrocytaire circulante est suspectée dès le début du XXème siècle par Carnot et Deflandre

(6). Dans les années 1950, de nombreuses expériences confirment son existence. La plus

célèbre est réalisée par Erslev A.J. et consiste à prélever le plasma de lapins anémiés par des

saignées répétées (14). Le plasma est ensuite injecté à des lapins normaux et l’on observe

alors l’apparition d’une réticulocytose sanguine, d’une polyglobulie absolue et d’une

hyperplasie érythrocytaire médullaire. La preuve de l’existence d’un facteur humoral à action

érythropoïétique fabriqué par les lapins anémiés et transféré aux lapins sains est alors établie.

En 1954, Stohlman et al. observent chez des patients humains souffrant d’une persistance du

canal artériel avec inversion de communication, une polyglobulie absolue et une hyperplasie

érythrocytaire médullaire généralisée, y compris dans des secteurs médullaires irrigués par le

sang correctement oxygéné (51). Ils en concluent qu’il existe un facteur humoral

érythropoïétique fabriqué dans le secteur soumis à l’hypoxémie.

C’est en 1957 que l’implication des reins dans sa sécrétion est mise en évidence par Jacobsen

et al. : Ils observent une augmentation significative de la concentration sérique en

érythropoïétine chez des rats quelques instants après les avoir soumis à une atmosphère

hypoxique. Cette augmentation est abolie chez les rats néphrectomisés (25).

Dans les années 1970, l’érythropoïétine humaine (ainsi appelée car ce facteur ne semblait pas

avoir d’action sur la production leucocytaire et plaquettaire) est isolée dans l’urine de patients

souffrant d’anémie due à une aplasie médullaire (35).

L’évolution des techniques de biologie moléculaire a permis par la suite successivement de

déterminer les caractéristiques moléculaires de l’érythropoïétine, de cloner puis de séquencer

son gène et d’éclairer sur son mode d’action sur les cellules cibles (29, 53).

1.1.2 Structure du gène de l’EPO et du peptide actif

Constitué de 3602 nucléotides, le gène de l’érythropoïétine humaine est localisé sur le

chromosome n°7 et est organisé en 5 exons et 4 introns. Il code pour une séquence peptidique

7

8

de 195 acides aminés. Les 27 premiers constituent le peptide signal qui autorise le passage

dans le réticulum endoplasmique. Les 166 suivants constituent la protéine active. Plusieurs

sites de glycosylation sont présents et sont mentionnés sur la figure 1. La structure secondaire

de la protéine est formée, selon les études, de 36 à 50 p.cent d’hélice alpha.

Figure 1: Structure primaire de l’érythropoïétine humaine.

Les sites de glycosylation de la protéine sont indiqués par un astérisque (*).

-27

MET GLY VAL HIS GLU CYS PRO ALA TRP LEU TRP LEU LEU LEU SER LEU LEU

+1

SER LEU PRO LEU GLY LEU PRO VAL LEU GLY ALA PRO PRO ARG LEU ILE CYS

10 20

ASP SER ARG VAL LEU GLU ARG TRY LEU LEU GLU ALA LYS GLU ALA GLU 30

30 * 40

ASN ILE THR THR GLY CYS ALA GLU HIS CYS SER LEU ASN GLU ASN ILE THR

50

VAL PRO ASP THR LYS VAL ASN PHE TYR ALA TRP LYS ARG MET GLU VAL

60 70

GLY GLN GLN ALA VAL GLU VAL TRP GLN GLY LEU ALA LEU LEU SER GLU

80 *

ALA VAL LEU ARG GLY GLN ALA LEU LEU VAL ASN SER SER GLN PRO TRP

90 100

GLU PRO LEU GLN LEU HIS VAL ASP LYS ALA VAL SER GLY LEU ARG SER LEU

110 120

THR THR LEU LEU ARG ALA LEU GLY ALA GLN LYS GLU ALA ILE SER PRO PRO

* 130

ASP ALA ALA SER ALA ALA PRO LEU ARG THR ILE THR ALA ASP THR PHE ARG

140 150

LYS LEU PHE ARG VAL TYR SER ASN PHE LEU ARG GLY LYS LEU LYS LEU TYR

160 166

THR GLY GLU ALA CYS ARG THR GLY ASP ARG

9

L’érythropoïétine féline présente une homologie de 85 p.cent avec la protéine humaine. La

plupart des changements d’acides aminés entre l’EPO humaine et féline sont cependant

conservatifs. Les caractéristiques physico-chimiques de la protéine sont donc très bien

conservées (2, 53).

1.1.3 Localisation de la synthèse de l’EPO

La mise en évidence de l’ARNm de l’érythropoïétine dans une cellule témoigne de sa

transcription au sein de celle-ci. L’ARNm codant pour l’érythropoïétine a été mis en évidence

dans des cellules interstitielles juxta-tubulaires rénales, dans les cellules de Ito situées dans

les espaces de Disse hépatiques et dans une sous-population d’hépatocytes. Les cellules

rénales et les cellules de Ito présentent des caractéristiques immuno-chimiques communes qui

les classent dans les cellules fibroblastiques de type I (2).

Chez le fœtus, l’érythropoïétine est essentiellement produite par le foie. Peu après la

naissance, les reins en deviennent les principaux producteurs. Le mécanisme de ce transfert de

synthèse du foie aux reins n’est pas encore élucidé (57).

De très faibles niveaux de production ont par ailleurs été détectés dans le poumon, la rate, le

cerveau et les testicules de rats.

1.1.4 Régulation de la synthèse d’EPO

L’élévation du taux sérique d’EPO chez les individus soumis à l’hypoxie est observée dès les

années 1970 (45). C’est avec l’avènement des techniques de biologie moléculaire que l’on a

montré que l’hypoxie est à l’origine d’une synthèse importante d’ARNm (technique de run-

on). La régulation de la synthèse d’EPO s’effectue donc à l’étage transcriptionnel. Il n’existe

pas de lieu de stockage de l’ARNm ou de la protéine. L’hypoxie agit directement sur le

niveau d’expression du gène. Le pic de synthèse d’ARNm codant pour l’érythropoïétine est

atteint en 4 à 8 heures et son amplitude est proportionnelle au degré d’hypoxie (22, 46).

La comparaison des séquences non codantes du gène de l’érythropoïétine humaine et murine

conduit à identifier 3 segments hautement conservés : le promoteur situé en région 5’, le

premier intron et une région de 120 paires de bases située en aval du site de poly-adénylation

(séquence «enhancer»). Des expériences de délétion montrent que seules la séquence

promotrice et la séquence «enhancer» sont indispensables à l’induction de l’expression du

gène lors d’hypoxémie (figure 2). Des expériences montrent l’implication de trois protéines

(HIF-1α ; HNF-4 et p300) dans l’activation du promoteur. Ces trois protéines s’associent et se

fixent à une séquence précise de bases situées dans la portion «enhancer». La fixation de ce

complexe induit des modifications conformationnelles permettant l’interaction de p300 avec

la séquence promoteur (figure 2) (22, 42).

Figure 2 : Structure du gène de l’érythropoïétine humaine. La séquence «enhancer» est agrandie pour permettre la visualisation des intéractions avec le complexe HIF-1α/HNF-4/p300 responsable de l’activation du promoteur.

5’ 3’ r enhancer

V IVIII II I

Il exis

Schust

non-hy

accept

(23, 46

Bunn

Son pa

promoteu

HIF-1α

P300

GGCCCTACGTGCTGTCTCACACAGCCTGTC

Séquence non transcrite homologue homme-souris indispensable à l’induction de l’expression du gène par l’hypoxémie

Séquence nohomme et so

Exons

te des éléments régulateurs «en amont» du complexe HIF

er et al. observent l’augmentation du taux sérique d’érythr

poxémiques traités avec du chlorure de cobalt. Ils avancen

eur d’électron de l’ion cobalt (Co 2+) au sein de protéines

). De nombreuses expériences confortent cette voie de l’h

à proposer le modèle présenté en figure 3 (13). HIF-1α es

ssage dans le noyau autorise la formation du complexe H

HNF-4

TGACCTCTC

n transcriteuris

-1α/HNF-4

opoïétine ch

t alors l’hy

-hèmes (typ

ème et con

t une proté

IF-1α/HNF

HNF-4

GACCTACCG

homologue entre

/p300. En 1989,

ez des animaux

pothèse du rôle

e hémoglobine)

duisent Ebert et

ine cytosolique.

-4/p300 et donc

10

11

l’activation de la transcription du gène de l’érythropoïétine. La forme oxydée de HIF-1α est

cependant rapidement reconnue et dégradée par un complexe enzymatique appelé protéasome.

Il existe dans le cytosol un complexe protéine-hème faisant intervenir les ions ferreux et

ferriques dans leur réaction d’oxydo-réduction. Lorsqu’il interagit avec le dioxygène, l’hème

est responsable de la libération d’ions superoxydes (O2-) au puissant pouvoir oxydatif. Cet ion

oxyde HIF-1α et provoque donc sa dégradation. En présence de dioxygène, le promoteur du

gène de l’érythropoïétine n’est donc pas activé. En l’absence de dioxygène, HIF-1α n’est pas

oxydé, passe dans le noyau et permet la formation du complexe HIF-1α/HNF-4/p300 (figure

3) (20, 24, 13, 27).

Figure 3 : Modèle de régulation par le dioxygène du gène de l’érythropoïétine

Fe3+ Fe2+

Complexe hème-protéine

O2 O2-

HIF-1α oxydé

hypoxie

protéasome

cytosol

Dégradation

HIF-1α

noyau

HNF-4 P300

12

13

1.1.5 Mode d’action cellulaire de l’EPO

En 1990, D’Andréa et al. utilisent l’érythropoïétine recombinante humaine ionisée pour

mettre en évidence l’existence d’un récepteur à la surface des cellules érythroïdes (3, 12). Ce

récepteur est présent en faible nombre : de quelques centaines à quelques milliers par cellule.

Sa densité est la plus élevée à la surface des pro-érythroblastes (Colony Forming Unit

Erythroïde CFU-E) et décroît au fur et à mesure de la maturation de la lignée. Les

réticulocytes et les érythrocytes sont dépourvus de récepteur. Le récepteur de

l’érythropoïétine a également été détecté sur les cellules mégacaryocytaires, les cellules

placentaires murines, les cellules endothéliales et certaines cellules neurales (16, 34, 43).

Le récepteur est constitué de deux chaînes peptidiques capables de se dimériser en présence

d’érythropoïétine. Lors de la dimérisation des deux chaînes, les deux segments

cytoplasmiques du récepteur se lient à une protéine à activité kinase, la Janus kinase 2

(JAK2). Celle-ci autorise la phosphorylation des résidus tyrosine du récepteur aboutissant au

recrutement et à l’activation de nombreuses molécules signals dont la protéine STAT5 (Signal

Transducer and activator of transcription). Dans certains cas, JAK2 peut directement

phosphoryler et donc activer STAT5 (figure 4) (1, 20, 34, 43).

Figure 4 : Liaison de l’EPO à son récepteur et transduction du signal (voie STAT)

membrane

2

STAT 5

La forme activ

pour CIS (cy

dans la différe

d’oncogènes (

de STAT5 dan

EPO

2

noyau

P P

P

cytosol 2

STAT 5

e de STAT5 intervient dans la régulation de certains gènes co

tokine-inducible SH2 protéine) et pour l’oncostatine M, pro

nciation et la multiplication cellulaire. Il a également été dém

c-fos, c-jun, pim-1 et c-myc) après la stimulation par l’érythr

s cette activation est toutefois inconnu (27).

EPO

2

P

STAT5

Gènes cibles de la mitose et de la différenciation

Jak
Jak Jak
mme ce

téines i

ontré l

opoïétin

Jak

STAT5

14

ux codant

mpliquées

’activation

e. Le rôle

1.1.6 Physiologie de l’EPO

1.1.6.1 Concentration plasmatique de l’érythropoïétine

La concentration plasmatique de l’érythropoïétine est considérée comme un bon marqueur de

sa synthèse rénale grâce à sa demi-vie plasmatique relativement courte (de l’ordre de 9

heures) et de son absence de stockage. L’antigénicité croisée entre la protéine humaine,

canine et féline a conduit à utiliser les trousses de dosage destinés initialement au dosage de

l’érythropoïétine humaine. Ces trousses font appel à des méthodes radio-immunologiques et

immuno-enzymatiques. La valeur de la concentration plasmatique dépend de la trousse

utilisée. Les concentrations de référence pour la trousse EPOEIA bioMérieux sont présentées

dans le tableau I (tableau I et figure 5) (9, 39, 40).

Tableau I : Valeurs usuelles d’érythropoïétinémie chez le chat avec la trousse EPOEIA BioMérieux

Moyenne (mU/ml) Ecarts (mU/ml)

Chat sain (8 à 15 g/dl) 9.1 1.0 à 26.7

Chat anémié sans IRC (inf. à 8 g/dl) 354 31 à 2500

Chat atteint d’IRC non anémié 8.1 1.1 à 19.2

Chat anémié et atteint d’IRC 6.6 1.0 à 16.4

(IRC : Insuffisance rénale chronique)

Figure 5 : Interprétation de l’érythropoïétinémie en fonction du taux d’hémoglobine

15

La concentration plasmatique de l’érythropoïétine est interprétée à la lumière du taux

d’hémoglobine au même moment. Ainsi, lors d’anémie, l’érythropoïétinémie normale doit

être élevée. A contrario, lors de polyglobulie, l’érythropoïétinémie normale doit être basse.

1.1.6.2 Action physiologique de l’érythropoïétine

a Action sur l’érythropoïèse Des expériences de culture de progéniteurs sur milieu semi-solide ont montré que les cibles

principales de l’érythropoïétine sont les progéniteurs érythroïdes et plus particulièrement les

Colony-forming-unit-érythroïdes (CFU-E). La fabrication de souris knock-out1 pour

l’érythropoïétine ou son récepteur a confirmé que la stimulation par l’EPO est indispensable à

la survie et à la prolifération des CFU-E. Elle protège en effet les CFU-E de l’apoptose et a un

effet mitogène. L’EPO joue également un rôle important dans la différenciation des CFU-E en

érythroblastes (19).

Ces expériences ont également montré que l’EPO ne joue aucun rôle dans l’engagement des

cellules souches (CFU-S) dans la lignée érythroblastique. Les CFU-E sont en effet produites

normalement chez les souris knock-out (Figure 6) (21, 50).

Figure 6 : Rôle de l’EPO dans l’érythropoïèse

Cellule souche engagée dans la

lignée érythroblastique

EPO

Multiplication Différenciation

Protection contre apoptose

1 So

Cellule souche

CFU-S CFU-E n Pro-érythroblastes

MOELLE

uris transgénique dépourvue du gène co

différenciatio

et érythroblastes

OSSEUSE SANCIRCUL

dant pour l’EPO ou pour son récepteur

érythrocyte

16

G ANT

17

b Action sur la mégacaryopoïèse

La détection du récepteur de l’EPO à la surface des cellules souches de la lignée plaquettaire

permet de suspecter un effet thrombopoïétique. Des études réalisées sur une lignée cellulaire

mégacaryoblastique in vitro ont montré que l’EPO provoque leur différenciation et leur

multiplication comme d’autres cytokines (thrombopoïétine par exemple). Aucune étude in

vivo n’a actuellement été menée. On peut toutefois remarquer que dans les expériences de

polyglobulie induite par hyper-érythropoïétinémie, aucune thrombocytose n’est observée.

D’autres voies de régulation de la thrombopoïèse sont sans doute prépondérantes (16, 36, 56).

c Action sur les neurones

Là encore, la découverte du récepteur de l’EPO au sein du système nerveux central laisse

suspecter une action sur la survie neuronale. Des expériences poussées ont montré que l’EPO

agit, via son récepteur, au sein des voies intracellulaires de l’apoptose. Il a été montré qu’au

cours de certains processus pathologiques comme l’hypoxie, l’ischémie et l’hémorragie

arachnoïdienne, l’EPO possède un effet trophique et protecteur qui limite la mort cellulaire.

L’EPO recombinante constitue donc un des espoirs thérapeutiques pour limiter les dommages

cellulaires au cours de ces processus pathologiques (5, 7, 31).

d Action sur les cellules endothéliales capillaires,

myocardiques et musculaires lisses

C’est la découverte du récepteur de l’EPO à la surface des cellules endothéliales capillaires,

myocardiaques et musculaires lisses qui a orienté les recherches vers une action

hémodynamique de celle-ci. L’EPO possède un effet hypertenseur direct qui n’est pas

uniquement lié à l’hyperviscosité sanguine associée à l’élévation de l’hématocrite (4, 18).

1.2 L’anémie lors d’insuffisance rénale chronique

1.2.1 Définitions

Le syndrome « anémie » est caractérisé par une diminution du taux d’hémoglobine

fonctionnelle circulante (inférieur à 8 g/dl chez le chat). En phase terminale d’insuffisance

rénale chronique, l’anémie fréquemment observée présente les caractéristiques suivantes : elle

18

est hyporégénérative (entre 5500 et 127500 réticulocytes/mm3), normocytaire (Volume

Globulaire Moyen entre 39 et 55 µm3) et normochrome (Teneur Globulaire Moyenne en

Hémoglobine entre 12.5 et 17.5 pg) (11).

1.2.2 Origine de l’anémie lors d’insuffisance rénale chronique

1.2.2.1 Défaut de synthèse d’érythropoïétine

Le défaut de synthèse d’érythropoïétine est la cause la plus fréquemment invoquée pour

expliquer l’anémie observée lors d’IRC. La comparaison des concentrations plasmatiques

chez des chats anémiés insuffisants rénaux chroniques (IRC) et chez des chats anémiés non

IRC montrent qu’effectivement l’érythropoïétinémie est plus basse lorsque l’anémie est

accompagnée d’IRC (tableau I) (38, 40).

1.2.2.2 Raccourcissement de la durée de vie des hématies et

hyporéactivité médullaire

Chez le patient urémique, la destruction des hématies est accélérée. Ce phénomène est

suffisamment chronique pour ne pas provoquer de syndrome hémolytique. Cette hémolyse

chronique est cependant à l’origine d’une baisse de la concentration sanguine en

hémoglobine. Chez le sujet insuffisant rénal chronique, la production médullaire

compensatrice est altérée faute de stimulation par l’EPO (54).

De plus, il a été démontré que la moelle osseuse des patients urémiques est moins réactive à

l’EPO. Reid et al. observent que le turnover des Colony-Forming-Unit Erythroid est plus bas

lors d’urémie élevée, et ce malgré le maintien d’une érythropoïétinémie élevée (43).

1.2.3 Traitements de l’anémie lors d’insuffisance rénale

chronique

1.2.3.1 Traitement de l’anémie avant l’avènement de

l’érythropoïétine recombinante

Une complémentation en fer, acide folique et histidine a été longtemps proposée pour pallier

tout déficit potentiel. Compte tenu de l’effet favorable du chlorure de cobalt sur la synthèse

d’EPO chez les individus sains, une supplémentation a été également proposée chez les

19

patients anémiés atteints d’IRC. Cette supplémentation est toutefois peu efficace car elle

intervient chez des individus dont la capacité de synthèse de l’EPO est très altérée (46, 54).

Les androgènes sont largement utilisés en médecine vétérinaire (Nandrolone : Trophobolène®

par exemple). Une stimulation de la multiplication des CFU-E a été observée in-vitro et

explique l’augmentation de l’hémoglobinémie observée in-vivo (8, 37).

1.2.3.2 Apport d’érythropoïétine recombinante

C’est dans les années 1980 que le gène de l’EPO est inséré dans le génome de cellules

ovariennes de hamster chinois. L’EPO recombinante humaine ainsi produite, injectée aux

patients humains assure une augmentation de l’hémoglobinémie et améliore la qualité de vie

des patients dialysés. Chez le chien et le chat, l’EPO recombinante humaine est également

efficace et permet une hausse de l’hémoglobinémie. Dans le traitement au long cours, il est

toutefois décrit une immunisation du patient canin ou félin contre l’EPO humaine injectée.

Les anticorps alors fabriqués annihilent non seulement les effets de l’EPO injectée mais

également ceux de l’EPO endogène. Une anémie arégénérative (aplasie érythroïde à EPO

nulle) peut donc voir le jour lors de traitement prolongé de chien ou de chat avec l’EPO

recombinante humaine (4, 10, 33, 54).

L’activité de l’EPO recombinante canine a été comparée expérimentalement à l’EPO

recombinante humaine chez des chiens sains. Elle a montré une efficacité identique sans

entrainer l’immunisation des patients. L’EPO recombinante constitue donc un bon traitement

des anémies déficitaires en EPO à condition de respecter la spécificité d’espèce et le rythme

d’administration (plusieurs fois par semaine). L’EPO recombinante canine n’est actuellement

pas disponible en médecine vétérinaire (41).

1.2.3.3 Thérapie génique

En matière d’anémie déficitaire en EPO (accompagnant l’IRC), la thérapie génique consiste à

transférer le gène d’intérêt par l’intermédiaire d’un vecteur. Des expérimentations utilisant un

vecteur viral délété pour ses séquences réplicatives (donc dépourvu de pouvoir pathogène) et

dans lequel a été introduit le gène de l’EPO ont été décrites. En particulier, une injection

intramusculaire unique d’adénovirus porteur du gène de l’EPO à des singes a montré une

expression du transgène pendant plus de 84 jours provoquant ainsi une hausse significative de

l’hémoglobinémie (47).

20

1.2.4 Modèles expérimentaux d’insuffisance rénale chronique

1.2.4.1 Modèle chirurgical

Parmi les modèles chirurgicaux de développement d’une IRC chez l’animal, le plus classique

se réalise en deux étapes :

• Le rein gauche subit une ligature de la branche médiale de l’artère rénale et des

artères interlobaires de la branche latérale.

• Une semaine plus tard, une néphrectomie droite est réalisée.

Cette technique est relativement simple à réaliser mais les résultats sont très variables et

imprévisibles à cause de la formation d’une vascularisation collatérale (15).

Plus reproductible, une deuxième méthode consiste à réaliser une néphrectomie partielle à

gauche et une néphrectomie totale à droite. Vaneerdeweg et al. montrent que la résection de

16-18 g de tissu rénal à gauche (chez des Beagles) associée à une néphrectomie droite permet

d’obtenir une insuffisance rénale chronique stable (52).

Lefebvre et al. décrivent une technique modifiée. Elle consiste en la réalisation d’une

néphrectomie droite et en l’électrocoagulation d’une partie du cortex rénal gauche. 120 points

d’électrocoagulation espacés de 1 cm dans le cortex rénal gauche d’un Beagle permettent une

insuffisance rénale chronique stable et reproductible (28).

1.2.4.2 Modèle médical

Plusieurs substances néphrotoxiques ont été utilisées pour créer une insuffisance rénale.

Fukuda et al. décrivent l’injection intraveineuse de 2 mg/kg de nitrate d’uranyle provoquant

une chute de la clairance de la créatinine et une hausse de l’urémie. L’insuffisance rénale est

maintenue grâce à des injections répétées (17).

D’autres protocoles faisant notamment intervenir des antibiotiques de la famille des

aminosides sont également décrits.

Certains de ces protocoles assurent une insuffisance rénale reproductible et prévisible.

Cependant, aucun ne permet de prévoir le délai d’apparition d’une anémie. Il n’existe par

ailleurs pas de modèle d’anémie déficitaire en EPO (comparable à celle présente lors d’IRC)

décrit dans la littérature.

21

1.3 Objectif de recherche

Dans le cadre d’une étude de traitement de l’anémie associée à l’insuffisance rénale chronique

chez le chat, notre objectif est de mettre en place un modèle d’anémie déficitaire en EPO.

L’idée est d’exploiter des procédés de traitement utilisés en cancérologie vétérinaire réputés

pour leur action anémiante. Cette étude vise à passer en revue quatre procédés et à évaluer la

facilité avec laquelle l’anémie apparaît et l’importance de la réponse rénale en synthèse

d’EPO. Cette étude préliminaire vise à identifier une substance susceptible de faire l’objet,

par la suite, d’une étude de validation de modèle d’anémie déficitaire en EPO chez le chat.

2 MATERIEL ET METHODE

2.1 Implication personnelle

Les soins quotidiens (nourriture et litière) ont été assurés par Joelle Gibouin et Marie-

Christine Voincher du centre anti-cancéreux vétérinaire des docteurs Devauchelle et Delisle.

Les prélèvements sanguins et l’administration des substances ont été réalisés, selon les

disponibilités, par Joelle Gibouin, Marie-Christine Voincher ou moi-même.

2.2 Animaux

Huit chats (4 femelles et 4 mâles) jeunes adultes (12 à 14 mois) provenant de la société

IFACREDO sont hébergés dans des cages par groupe de deux individus de sexe différent. Les

mâles sont castrés chirurgicalement le jour même de leur arrivée. Ils sont vaccinés contre les

virus de la panleucopénie, de l’herpès virose et de la calicivirose. Ils reçoivent une

alimentation industrielle sèche et disposent d’eau à volonté. Une période d’acclimatation d’au

moins 30 jours est respectée avant le début de l’expérimentation.

Chaque groupe de deux chats est soumis à l’action d’un des quatre procédés suivants :

• Administration de cyclophosphamide.

• Administration de doxorubicine.

• Administration de paraplatine.

• Exposition à des rayonnements ionisants.

Par soucis de simplicité, les chats sont baptisés de l’abréviation du procédé utilisé :

• Chats cyclo I et cyclo II pour les chats soumis à l’action de cyclophosphamide.

• Chats adria I et adria II pour les chats soumis à l’action du doxorubicine

(communément appelé adriamycine).

• Chats para I et para II pour les chats soumis à l’action du paraplatine.

• Chat rad I et rad II pour les chats soumis à l’action des radiations ionisantes.

Pour chaque groupe, le chat numéroté I est le mâle et le chat numéroté II est la femelle.

2.3 Administration

2.3.1 Cyclophosphamide

Dans l’organisme, le cyclophosphamide subit une transformation hépatique en deux principes

actifs (moutarde phosphoramide et nor-moutarde) et divers composés inactifs. Le moutarde

phosphoryle et le nor-moutarde sont deux agents alkylants responsables de la formation de

liaisons covalentes entre l’ADN (acide désoxynucléique) et les substrats nucléophiles et de

ponts alcoyles intra et interbrins. Ceci entraîne des modification physico-chimiques profondes

de l’ADN avec pour conséquence une inhibition de la transcription et de la réplication

aboutissant à une mort cellulaire (30). Le cyclophosphamide a montré, dans certaines

conditions d’utilisation, une toxicité hématologique à l’origine d’une pancytopénie.

Le cyclophosphamide (Endoxan®) est conditionné en comprimés dosés à cinquante

milligrammes. Il est administré quotidiennement de J0 à J0+42 par voie orale (directement

dans l’oro-pharynx) à la posologie de 50 mg/m2 aux chats cyclo I et cyclo II (tableau II).

Tableau II : Dose de cyclophosphamide administrée quotidiennement aux chats cyclo I et cyclo II

Posologie Poids Surface Dose calculée Dose administrée

Chat cyclo I 50 mg/m2 3.4 kg 0.22 m2 10 mg 12.5 mg (1/4 de comp d’Endoxan®)

Chat cyclo II 50 mg/m2 3.1 kg 0.22 m2 10 mg 12.5 mg (1/4 de comp d’Endoxan®)

2.3.2 Doxorubicine

Le doxorubicine appartient à la famille des antibiotiques anthracyclines. C’est un agent

intercalant dont le principal mode d’action fait appel à sa fixation à la topo-isomérase II. Le

22

23

complexe ainsi formé bloque l’accès des enzymes de la transcription et de la réplication à

l’ADN (30).

Le doxorubicine présente chez le chat une toxicité rénale ce qui en fait un bon candidat à la

création d’une anémie EPO-déficitaire.

Le doxorubicine (Adriblastine®) est conditionné en flacon de poudre dosé à dix

milligrammes à diluer dans 5 ml d’eau pour préparation injectable. Le principe actif est

administré à J0, J0+14, J0+28, J0+42 et J0+56 par voie intraveineuse stricte en bolus dosé à

30 mg/m2 aux chats adria I et adria II (tableau III et IV).

Tableau III : Protocole d’administration de la doxorubicine au chat adria I

Chat adria I Posologie Poids Surface Dose administrée

J0 30 mg/m2 3.9 kg 0.25 m2 7.5 mg J0+14 30 mg/m2 3.8 kg 0.24 m2 7.3 mg J0+28 30 mg/m2 3.8 kg 0.24 m2 7.3 mg J0+42 30 mg/m2 3.7 kg 0.24 m2 7.3 mg J0+56 30 mg/m2 3.4 kg 0.22 m2 6.6 mg

Tableau IV : Protocole d’administration de la doxorubicine au chat adria II

Chat adria II Posologie Poids Surface Dose administrée

J0 30 mg/m2 2.6 kg 0.19 m2 5.7 mg J0+14 30 mg/m2 2.5 kg 0.18 m2 5.5 mg J0+28 30 mg/m2 2.6 kg 0.19 m2 5.7 mg J0+42 30 mg/m2 2.5 kg 0.18 m2 5.5 mg J0+56 30 mg/m2 2.4 kg 0.17 m2 5.2 mg

2.3.3 Paraplatine

Dérivé du platine, aucune étude n’a encore été menée sur les effets du paraplatine chez le

chat. En revanche, les effets du cisplatine sont relativement bien connus. Celui-ci libère son

atome de platine dans le cytoplasme des cellules qui se fixe de manière covalent aux bases de

guanine de l’ADN. Les liaisons intra et interbrins créées empêchent l’action des complexes

enzymatiques et aboutit à la mort cellulaire. Sa toxicité hématologique et rénale fait du

cisplatine un bon candidat à la création d’une anémie déficitaire en EPO (32, 48, 49, 55). Le

cisplatine est cependant responsable chez le chat d’œdème pulmonaire systématiquement

mortel. Son utilisation est donc contre-indiquée (26).

L’essai porte donc sur le paraplatine dont les toxicités rénale et pulmonaire sont moindres.

Le paraplatine est administré à J0, J0+14, J0+28, J0+42 et J0+56 par voie intraveineuse en

bolus dosé à 60 mg/m² aux chats para I et para II (tableaux V et VI).

Tableau V : Protocole d’administration du paraplatine au chat para I

Chat para I Posologie Poids Surface Dose administrée

J0 60 mg/m2 3.7 kg 0.23 m2 14 mg J0+14 60 mg/m2 3.7 kg 0.23 m2 14 mg J0+28 60 mg/m2 3.8 kg 0.24 m2 14 mg J0+42 60 mg/m2 3.8 kg 0.24 m2 14 mg J0+56 60 mg/m2 3.8 kg 0.24 m2 14 mg

Tableau VI : Protocole d’administration du paraplatine au chat para II

Chat para II Posologie Poids Surface Dose administrée

J0 60 mg/m2 2.7 kg 0.18 m2 11 mg J0+14 60 mg/m2 2.7 kg 0.18 m2 11 mg J0+28 60 mg/m2 2.6 kg 0.17 m2 10 mg J0+42 60 mg/m2 2.6 kg 0.17 m2 10 mg J0+56 60 mg/m2 2.6 kg 0.17 m2 10 mg

2.3.4 Radiations ionisantes

Les radiations ionisantes sont produites par un accélérateur de particules. Les deux chats rad I

et rad II sont anesthésiés (10 mg/kg de kétamine + 0.2 mg/kg de diazépam en intra-

musculaire) et disposés en décubitus latéral. Deux doses équivalentes à 1.5 grays (Gr) de

chaque côté (soit 3 Gr par jour d’exposition) sont administrées à 48 heures d’intervalle sur

une surface visant à englober la colonne vertébrale, les scapula, le tiers proximal des huméri

ainsi que des fémurs et les os du bassin (Figure 7 et tableau VII).

Figure 7 : Champ d’irradiation des chats rad I et rad II

24

25

Tableau VII : Répartition des doses de radiations chez les chats rad I et rad II

Décubitus latéral droit Décubitus latéral gauche Total

JO 1.5 Gr 1.5 Gr 3 Gr J2 1.5 Gr 1.5 Gr 3 Gr

Total 3 Gr 3 Gr 6 Gr

2.4 Examens cliniques

Un examen clinique est réalisé quotidiennement. Il comporte en particulier l’évaluation de

l’état général, de l’appétit, du poids, de la couleur des muqueuses et la mesure de la

température rectale.

2.5 Examens hématologiques

Le sang est prélevé par ponction de la veine jugulaire et recueilli sur tube contenant 10 mg

d’éthylène diamine tétraacétique acide (EDTA). Seuls les chats soumis aux radiations

ionisantes, peu coopératifs, ont nécessité une anesthésie générale (10 mg/kg de kétamine + 0.2

mg/kg de diazépam en intramusculaire). Les prélèvements sont traités immédiatement par

l’automate MS4 de Melet-Schloesing. Les informations fournies par l’automate et les valeurs

de référence figurent dans le tableau VIII.

Tableau VIII : Informations livrées par l’automate MS4 et valeurs usuelles

Valeurs usuelles

Globules Rouges (GR) (1012/l) 5-10 Hémoglobine (Hb) (g/dl) 8-15 Hématocrite (Ht) (p. cent) 24-45 Volume Globulaire Moyen (VGM) (fl) 39-55 Teneur Corpusculaire Moyenne en Hb (TCMH) (pg) 12,5-17,5 Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb (CCMH) (g/dl) 30-36 Globules Blancs (GB) (109/l) 5,5-19,5 Lymphocytes (ly) (109/l) 1,5-7,7 Monocytes (Mo) (109/l) 0-0,8 Granulocytes (Gr) (109/l) 2,5-14,3 Plaquettes (Plt) (109/l) 300-800

Les dates de prélèvements varient d’une substance à l’autre. Les protocoles de prélèvement

ont été élaborés d’après les informations de pharmacodynamie disponibles chez le chat et

26

d’après l’expérience du docteur P. Devauchelle dans leur utilisation en cancérologie féline

(tableau IX).

Tableau IX : Dates des prélèvements pour analyses hématologiques et biochimiques

Chats soumis à l’action de Dates de prélèvement

- cyclophosphamide J0, J0+7, J0+14, J0+21, J0+28, J0+35, J0+42 - doxorubicine J0, J0+7, J0+14, J0+21, J0+28, J0+35, J0+42, J0+49, J0+56, J0+63 - paraplatine J0, J0+7, J0+14, J0+21, J0+28, J0+35, J0+42, J0+49, J0+56, J0+63 - radiations ionisantes J0, J0+1, J0+2, J0+3, J0+4, J0+5, J0+6, J0+7

2.6 Dosages plasmatiques

2.6.1 Dosages biochimiques sanguins

Le sang est prélevé par ponction de la veine jugulaire et recueilli sur tube contenant de

l’héparine lithium. Les chats soumis aux radiations ionisantes ont nécessité une anesthésie

générale (10 mg/kg de kétamine + 0.2 mg/kg de diazépam en intramusculaire). Les

prélèvements sont centrifugés et le plasma est analysé à l’aide de l’appareil de biochimie Vet-

Test de IDEXX. Les paramètres biochimiques sanguins dosés et leur valeur de référence

figurent dans le tableau X. Les dates de prélèvement figurent dans le tableau IX.

Tableau X : Paramètres biochimiques sanguins dosés par le VetTest et leur valeur usuelle

Paramètres Valeurs usuelles

Urée (g/l) 0.2-0.5 Créatinine (ml/l) 8-18

Protéines totales (g/l) 54-78 Glucose (g/l) 0.7-1.1 ALAT (UI/l) <25 PAL (UI/l) 20-63

2.6.2 Dosage de l’EPO

Quatre millilitres de sang prélevés par ponction de la veine jugulaire sont recueillis dans un

tube contenant 10 mg d’EDTA. Le plasma est séparé par centrifugation 1000G/mn pendant 10

mn à 4°C puis congelé à –80°C. Le dosage est réalisé au laboratoire de médecine nucléaire de

l’hôpital Saint-Louis à Paris. La trousse Diasorine EPO-Trac utilisé fait appel à une technique

radio-immunologique. Aucune valeur de référence n’a été publiée avec cette trousse chez le

chat. Nous avons donc réalisé une étude de faisabilité en soumettant plusieurs échantillons de

plasma EDTA provenant de chats anémiés (non IRC) et non anémiés. Les résultats figurent

dans le tableau XI et la figure 9.

Tableau XI : Valeurs d’érythropoïétinémie obtenues avec la trousse de dosage EPOTrac pour

quelques chats indemnes d’IRC

Hg (g/dl) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 22

EPO chat 1 41 63 48 31 8,4 11,3 6,4 14 8 18 11 6,8EPO chat 2 5,3 16 12 EPO chat 3 15,1 9,5

EPO moyenne 41 63 48 31 9,6 12,3 9,2 14 8 18 11 6,8

Figure 8 : Répartition des concentrations sériques en érythropoïétine évaluées à partir de la trousse EPOTrac selon l’hémoglobinémie moyenne

EPO

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Hg (g/dl)

EPO

(UI/m

l)

Malgré la petite taille des échantillons (n=17), la cohérence des résultats obtenus permet de

conclure au croisement des dosages de l’EPO humaine et féline. L’absence de valeur de

référence avec cette trousse nous semble tolérable en considérant J0 comme valeur basale.

2.7 Analyses statistiques

S’agissant d’une étude pilote, aucune étude statistique n’est réalisée. Il s’agit ici d’identifier

une substance potentiellement intéressante susceptible d’être validée comme modèle par la

suite. 27

28

3 RESULTATS

3.1 Cyclophosphamide

3.1.1 Suivi clinique

De J2 à la fin de l’expérimentation, les deux chats présentent une baisse d’appétit. Les

muqueuses deviennent pâles à partir de J0+21 chez cyclo I et cyclo II. A partir de J0+40, on

observe une anorexie et des pétéchies sur les muqueuses de cyclo II. Il décède à J0+43 des

suites d’une hémorragie péritonéale.

3.1.2 Suivi hématologique

Les résultats des analyses hématologiques réalisées à J0, J0+7, J0+14, J0+21, J0+28, J0+35 et

J0+42 ont révélé une anémie à partir J0+35 pour les chats Cyclo I et Cyclo II (tableaux XII et

XIII et figure 9).

Tableaux XIIet XIII : Résultats des examens hématologiques des chats cyclo I et cyclo II

Cyclo I J0 J7 J14 J21 J28 J35 J42

Hémoglobine 14,6 12,9 11,6 10,2 8,9 7,6 7 GR 11,1 10,1 9,5 8,2 7,5 6,9 6,5

Hématocrite 57 55 49 46 41 39 38 VGM 51 54 55 55 57 57 58

TCMH 13 13 12 12 12 11 11 CCMH 26 24 23 22 22 20 19

GB 19,6 18,1 17,6 15,1 12,4 11,2 10,9 Gran 10,3 8,5 7,9 6,4 5,1 3,9 3,2

Lymph 7,8 8 7,6 7,1 6,5 6,1 6,6 Mono 1,5 1,6 2,1 1,6 0,8 1,2 1,1

Plaquettes 363 262 245 218 230 213 219

Cyclo II JO J7 J14 J21 J28 J35 J42

Hémoglobine 13 13 11 9 8 7 6 GR 11 9 8 6 5 4 3

Hématocrite 61 55 46 35 29 25 24 VGM 57 59 61 62 62 65 72

TCMH 12 14 15 15 17 16 18 CCMH 21 24 24 23 23 24 25

GB 10 25,6 8,6 7,5 7,2 5,2 3,2 Gran 5,9 8,9 4,3 3,6 3,2 2,1 0,8

Lymph 3,1 14,8 3,5 3,2 3,2 2,8 2,1 Mono 1 1,9 0,8 0,7 0,8 0,3 0,3

Plaquettes 294 139 198 110 98 73 25

Figure 9 : Représentation graphique de l’évolution de l’hémoglobinémie des chats cyclo I et cyclo II.

0

24

68

10

1214

16

JO J7 J14 J21 J28 J35 J42

Jours

Hém

oglo

bine

(g/d

l)

Chat cyclo IChat cyclo II

De plus, on observe une baisse important de la numération plaquettaire chez cyclo II à partir

de J0+21 (Tableaux XII et XIII et figure 10).

29

Figure 10 : Représentation graphique de l’évolution de la numération plaquettaire des chats cyclo I et cyclo II.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

JO J7 J14 J21 J28 J35 J42

Jours

Plaq

uett

es (1

0 9/l)

Chat cyclo IChat cyclo II

3.1.3 Suivi du dosage de l’EPO

Chez les deux chats, la concentration sanguine de l’EPO montre une hausse significative à

partir de J35 : trois fois la valeur basale pour Cyclo I et six fois pour Cyclo II (Tableaux XIV

et XV et figures 11 et 12).

Tableaux XIVet XV : Résultats des dosages d’érythropoïétinémie chez les chats cyclo I et cyclo II

Cyclo I J0 J7 J14 J21 J28 J35 J42

Hémoglobine 14,6 12,9 11,6 10,2 8,9 7,6 7 Erythropoïétine 11 14 12 17 21 31 48


Hémoglobine 13 13 11 9 8 7 6 Erythropoïétine 8 14 13 14 17 63 74

30


l’érythropoïétinémie du chat cyclo I.

0

10

20

30

40

50

60

JO J7 J14 J21 J28 J35 J42

Jours

EPO

(mU

/ml)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Hém

oglo

bine

(g/d

l)

EPOHémoglobine

Figure 12 : Représentation graphique de l’évolution de l’hémoglobinémie et de l’érythropoïétinémie du chat cyclo II

0

10

20

30

40

50

60

70

80

JO J7 J14 J21 J28 J35 J42

Jours

EPO

(mU

/ml)

0

2

4

6

8

10

12

14H

émog

lobi

ne (g

/dl)

EPOhémoglobine

31

32

3.1.4 Suivi biochimique

Les résultats des examens biochimiques sanguins réalisés à J0, J0+7, J0+14, J0+21, J0+28,

J0+35 et J0+42 sont dans l’intervalle des valeurs usuelles (Tableaux XVI et XVII).

Tableaux XVI et XVII : Résultats des analyses biochimiques des chats cyclo I et cyclo II

Cyclo I J0 J7 J14 J21 J28 J35 J42

Urée(g/l) 0,3 0,4 0,4 0,6 0,3 0,4 0,2 Créatinine (mg/l) 12 15 13 15 12 17 14

Protéines totales (g/l) 58 66 63 65 62 63 58 ALAT (UI/l) 30 46 42 21 67 42 45 PAL (UI/l) 25 36 34 51 42 39 43


Urée (g/l) 0,4 0,3 0,4 0,6 0,4 0,6 0,5 Créatinine (mg/l) 12 15 13 14 17 13 15

Protéines totales (g/l) 59 63 62 64 66 63 61 ALAT (UI/l) 21 35 41 27 31 36 41 PAL (UI/l) 36 52 43 48 47 39 63

3.2 Doxorubicine


Les deux chats conservent un état général et un appétit normal pendant toute la durée de

l’expérimentation (63 jours). On observe cependant une perte de poids de 500 g pour le chat

Adria I et de 200 g pour le chat Adria II entre J0 et J0+63 (Tableaux XVIII et XIX et figure

13).

Tableaux XVIIIet XIX : Evolution du poids corporel des chats adria I et adria II

Adria I J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63

Poids (kg) 3,95 3,8 3,79 3,8 3,79 3,68 3,67 3,67 3,36 3,3

Adria II J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63

Poids (kg) 2,62 2,62 2,53 2,64 2,64 2,49 2,5 2,28 2,29 2,29

Figure 13 : Représentation graphique du suivi du poids des chats adria I et adria II

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63

Dates des pesées

Poid

s (kg

)

Adria IAdria II


Pendant toute la durée de l’expérimentation, aucune anémie n’est observée (Tableaux XX et

XXI et figure 14).

Tableaux XXet XXI : Résultats des analyses hématologiques des chats adria I et adria II

Adria I J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63

Hémoglobine 9,6 12 12,7 11 12 11 11 10,4 10,3 10,2 GR 7,2 8,6 9,7 8,4 8,7 8 8,4 7,8 8 7,9

Hématocrite 39 49 54 43 45 41 43 40 42 41 VGM 54 57 56 51 51 51 51 51 53 52

TCMH 13 14 13 13 14 13 13 13 13 13 CCMH 25 25 23 26 27 26 26 26 24 25

GB 8,4 20,7 36,7 5,7 30 8,4 9,6 3,9 20,5 3,2 Gran 5,1 5 19,4 4 16,8 5,4 6,9 2,8 7,8 1,9

Lymph 3,1 14,3 14,8 1,5 10,8 2,4 1,9 1 11,7 0,4 Mono 0,2 1,4 2,5 0,2 2,4 0,6 0,8 0,1 1 0,9

Plaquettes 273 144 267 222 126 82 368 184 260 320

33

Adria II J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63Hémoglobine 10 13,5 12,1 10,3 10,6 10,6 8,9 10 11,1 10,9

GR 7,6 8,7 9,4 7,8 7,9 7,6 6,6 7,2 7,9 7,8 Hématocrite 39 47 50 38 39 40 33 38 43 41

VGM 51 54 53 49 49 52 50 53 54 54 TCMH 13 16 13 13 13 14 13 14 14 13 CCMH 26 29 24 27 27 26 27 26 26 26

GB 7,1 9,3 22,9 8,7 13,2 2,3 9,1 2,3 14,8 2,6 Gran 3,5 3 19,2 6,5 5,6 1,7 7,7 1,6 9,9 1,4

Lymph 3,1 5,9 3,5 1,4 6,5 0,5 0,9 0,5 4,3 0,5 Mono 0,5 0,4 0,2 0,8 1,1 0,1 0,5 0,2 0,6 0,7

Plaquettes 429 165 329 290 224 184 604 382 376 320

Figure 14 : Représentation graphique de l’évolution de l’hémoglobinémie des chats adria I et adria II

0

2

4

6

8

10

12

14

16

J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63

Dates de prélèvement

Hém

oglo

bine

(g/d

l)

Chat Adria IChat Adria II

On observe également une leucopénie (GB< 5.5 milliers/ml) à J0+49 et J0+63 pour adria I et

à J0+35, J0+49 et J0+63 pour adria II (Figures 15 et 16).

34

Figure 15 : Représentation graphique de l’évolution de la numération et formule leucocytaire du chat adria I

0

5

10

15

20

25

30

35

40

J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63

Mill

iers

/ml

MonocytesLymphocytesGranulocytes

Figure 16 : Représentation graphique de l’évolution de la numération et formule leucocytaire du chat adria II.

0

5

10

15

20

25

J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63

Mill

iers

/ml

MonocytesLymphocytesGranulocytes


Compte tenu de l’absence d’anémie, les dosages d’EPO n’ont pas été effectués.

35

36


Pendant toute la durée de l’expérimentation, les résultats des dosages biochimiques sanguins

sont restés dans l’intervalle des valeurs usuelles (tableaux XXII et XXIII).

Tableaux XXII et XXIII : Résultats des analyses biochimiques des chats adria I et adria II

Adria I J0 J0+7

J0+14

J0+21

J0+28

J0+35

J0+42 J0+49

J0+56 J0+63

Urée (g/l) 0,3 0,4 0,5 0,5 0,3 0,5 0,4 0,3 0,3 0,4 Créatinine (mg/l) 12 15 16 14 13 12 14 13 16 15

ALAT (UI/l) 25 32 23 45 41 38 49 39 51 41 PAL (UI/l) 36 27 24 25 41 28 32 25 23 22

TP (g/l) 58 61 59 63 61 59 63 64 61 62

Adria II J0 J0+7

J0+14

J0+21

J0+28

J0+35

J0+42 J0+49

J0+56 J0+63


ALAT (UI/l) 36 37 41 48 51 52 41 31 45 38 PAL (UI/l) 21 26 32 25 23 38 32 31 29 21

TP (g/l) 65 66 63 71 67 65 62 69 67 65

3.3 Paraplatine


Les deux chats para I et para II ont présenté un état clinique satisfaisant au cours des 63 jours

d’expérimentation. Leur appétit, la couleur des muqueuses et leur examen respiratoire en

particulier sont restés normaux.


Les résultats des analyses hématologiques réalisées à J0, J0+7, J0+14, J0+21, J0+28, J0+35,

J0+42, J0+49, J0+56 et J0+63 sont restés dans l’intervalle des valeurs usuelles (Tableaux

XXIV et XXV et figure 17).

Tableaux XXIV et XXV : Résultats des analyses hématologiques des chats para I et para II. Para I J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63

Hémoglobine 14 11 10 11 12 11 10 11 11 10 GR 9,2 8,1 7,9 8,4 8,7 8 7,8 7,8 8 7,9

Hématocrite 55 49 43 43 45 41 38 40 42 39 VGM 54 57 56 51 51 51 51 51 53 52

TCMH 13 14 13 13 14 13 13 13 13 13 CCMH 25 25 23 26 27 26 26 26 24 25

GB 8,4 12,9 16,7 14,7 18,9 14,1 9,6 11,3 13,9 17,4 Gran 5,1 7 12,3 8,9 12,4 10,1 6,9 8,2 7,8 12,4

Lymph 3,1 5,1 3,7 4,6 4,2 3,5 1,9 2,4 5,1 4,1 Mono 0,2 0,8 0,7 1,2 2,3 0,5 0,8 0,7 1 0,9

Plaquettes 287 223 267 247 287 310 279 213 260 319

Para II J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63

Hémoglobine 12 11,5 12,1 11,9 11,1 10,6 10,1 10,5 11,1 10,9 GR 8,7 7,9 8,5 8,2 7,9 7,6 7,2 7,2 7,9 7,8

Hématocrite 44 42 45 39 37 35 33 38 43 41 VGM 51 54 53 49 49 52 50 53 54 54

TCMH 13 16 13 13 13 14 13 14 14 13 CCMH 26 29 24 27 27 26 27 26 26 26

GB 16,5 14,2 12,9 15,2 9,8 11,2 9,1 16,7 17,8 11,9 Gran 11,9 10,2 9,1 12 7,8 6,5 5,3 12,5 10,4 6,3

Lymph 3,1 3,6 2,6 2,5 1,5 4,1 3,2 3,5 6,4 0,5 Mono 1,5 0,4 1,2 0,7 0,5 0,6 0,6 0,7 1 0,7

Plaquettes 413 216 289 201 302 184 502 382 302 488

Figure 17 : Représentation graphique de l’évolution de l’hémoglobinémie des chats para I et para II

02468

10121416

J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63

Dates de prélèvement

Hém

oglo

bine

(g/d

l)

Para IPara II

37

38




Les résultats des analyses biochimiques réalisés à J0, J0+7, J0+14, J0+21, J0+28, J0+35,

J0+42, J0+49, J0+56 et J0+63 sont restés dans l’intervalle des valeurs usuelles (Tableaux

XXVI et XXVII).

Tableaux XXVIet XXVII : Résultats des analyses biochimiques des chats para I et para II

Para I J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63


ALAT (UI/l) 26 22 29 41 40 38 41 49 51 44 PAL (UI/l) 28 27 35 31 38 41 31 39 32 29

TP (g/l) 62 64 59 61 65 58 66 65 61 62

Para II J0 J0+7 J0+14 J0+21 J0+28 J0+35 J0+42 J0+49 J0+56 J0+63


ALAT (UI/l) 90 82 87 68 57 59 46 42 61 51 PAL (UI/l) 36 39 41 32 21 29 41 37 29 55

TP (g/l) 58 62 61 66 59 62 59 64 66 62

3.4 Radiations ionisantes


Les deux chats Rad I et Rad II ont présenté un état clinique satisfaisant pendant les 8 jours

d’expérimentation.


Les résultats des analyses hématologiques réalisés à J0, J0+1, J0+2, J0+3, J0+4, J0+5, J0+6 et

J0+7 sont restés dans l’intervalle des valeurs usuelles (Tableaux XXVIII et XXIX et figure

19).

39

Tableaux XXVIII et XXIX : Résultats des analyses hématologiques des chats rad I et rad II

Rad I J0 J0+1 J0+2 J0+3 J0+4 J0+5 J0+6 J0+7

Hémoglobine 14 10 12 9 11 13 13 12 GR 9,2 8,1 8,5 8,4 8,7 8,9 8,7 8,1

Hématocrite 48 41 43 35 39 41 45 40 VGM 51 53 52 52 51 53 54 52

TCMH 14 13 12 13 14 13 13 13 CCMH 25 25 23 26 27 26 26 26

GB 14,7 12,9 16,7 12,1 15,7 16,7 13,5 11,3 Gran 11,2 9,2 12,3 8,9 11,1 10,1 7,9 8,2

Lymph 3,1 2,1 2,7 3,1 4,2 5,5 4,7 2,4 Mono 0,4 1,6 1,7 0,1 0,4 1,1 0,9 0,7

Plaquettes 322 344 367 418 378 298 287 213

Rad II J0 J0+1 J0+2 J0+3 J0+4 J0+5 J0+6 J0+7

Hémoglobine 12 11,5 9,2 10,9 11,1 12,2 11,8 11,9 GR 8,7 7,9 7,5 8,2 7,9 8,4 8,1 8

Hématocrite 44 42 38 39 41 44 38 38 VGM 51 54 53 49 49 52 50 53

TCMH 13 16 13 13 13 14 13 14 CCMH 26 29 24 27 27 26 27 26

GB 11,4 10,4 12,9 11,8 9,8 12,3 12,2 14,1 Gran 6,7 6,8 9,3 8,2 7,8 8,6 8,3 11,3

Lymph 4,1 3,2 2,6 2,2 1,5 3,1 3,2 2,8 Mono 0,6 0,4 1 1,4 0,5 0,6 0,7 0

Plaquettes 389 216 218 187 210 184 224 267




Les résultats des analyses biochimiques réalisées à J0, J0+1, J0+2, J0+3, J0+4, J0+5 et J0+7

sont restés dans l’intervalle des valeurs usuelles (Tableaux XXX et XXXI).

40

Tableaux XXX et XXXI : Résultats des analyses biochimiques des chats rad I et rad II

Rad I J0 J0+1 J0+2 J0+3 J0+4 J0+5 J0+6 J0+7

Urée (g/l) 0,3 0,4 0,3 0,2 0,3 0,5 0,3 0,3 Créatinine (mg/l) 16 16 15 14 15 13 16 14

ALAT (UI/l) 26 22 29 41 40 38 41 49 PAL (UI/l) 28 27 35 31 38 41 31 39

TP (g/l) 58 61 63 66 65 64 66 63

Rad II J0 J0+1 J0+2 J0+3 J0+4 J0+5 J0+6 J0+7

Urée (g/l) 0,4 0,5 0,3 0,5 0,4 0,3 0,6 0,2 Créatinine (mg/l) 16 12 14 16 13 11 14 13

ALAT (UI/l) 90 82 87 68 57 59 46 42 PAL (UI/l) 36 39 41 32 21 29 41 37

TP (g/l) 67 68 71 68 66 69 70 68

4 DISCUSSION

4.1 Dosages de l’EPO

L’étude préliminaire de faisabilité du dosage de l’EPO féline avec la trousse Diasorine EPO-

Trac a montré une érythropoïétinémie élevée lors d’anémie. Ces résultats sont confortés chez

les chats cyclo I et cyclo II par l’observation d’une élévation de l’érythropoïétinémie avec la

baisse du taux d’hémoglobine (figure 11 et 12). Cette bonne corrélation entre le taux

d’hémoglobine et la concentration en EPO sérique laisse fortement suspecter un croisement

entre l’EPO humaine et féline. Cette trousse pourrait donc faire l’objet d’une étude de

validation.

4.2 Obtention d’une anémie

Aux doses et au rythme d’administration utilisés, seul le cyclophosphamide a permis

l’obtention d’une anémie. Les autres procédés (administration de doxorubicine, de paraplatine

ou radiation) n’ont pas provoqué de baisse significative de l’hémoglobinémie.

4.3

41

Synthèse d’EPO

La synthèse d’EPO a été évaluée par dosage plasmatique dans le cadre de l’administration du

cyclophosphamide. Compte tenu de l’absence d’anémie avec les autres procédés

(administration de doxorubicine, de paraplatine et radiations), le dosage n’a pas été réalisé.

La concentration plasmatique en EPO chez les chats cyclo I et Cyclo II, croît de manière

significative à partir de J0+35 (hémoglobine < 8 g/dl). L’anémie provoquée par

l’administration de cyclophosphamide provoque donc une synthèse importante d’EPO. Ceci

conduit à écarter le cyclophosphamide de la liste des substances intéressantes puisqu’à

l’origine d’une anémie non déficitaire en EPO.

4.4 Innocuité

Le cyclophosphamide a montré une toxicité hématologique importante. Il est à l’origine d’une

thrombocytopénie majeure à l’origine de la mort du chat cyclo I par hémorragie.

Le doxorubicine est quant à lui à l’origine d’une panleucopénie observée huit jours après

chaque injection. Cette leucopénie est cependant restée sans conséquence clinique (absence

d’hyperthermie ou de signe d’infection). Les concentrations leucocytaires sont rétablies 15

jours après l’injection (durée sans doute nécessaire à la moelle osseuse pour rétablir un

contingent leucocytaire normal).

4.5 Synthèse

Nous avons écarté le cyclophosphamide des substances d’intérêt pour deux raisons :

• L’anémie engendrée par l’administration de cyclophosphamide s’accompagne d’une

importante synthèse d’EPO aboutissant ainsi à la création d’une anémie non déficitaire

en EPO.

• La toxicité hématologique est importante puisque l’on a observé une thrombopénie à

l’origine de la mort du chat cyclo I.

Nous avons également écarté le doxorubicine de la liste des substances d’intérêt. En effet, on

aurait pu espérer obtenir une anémie en augmentant les doses administrées (35-40 mg/m²) ou

42

en réduisant les intervalles d’administration (par exemple 1 injection/semaine à 30 mg/m²).

Ceci n’est cependant pas réalisable à cause de l’importante leucopénie observée 8 jours après

chaque injection. Augmenter la dose ou réaliser une injection tous les 8 jours aurait sans

aucun doute provoqué une leucopénie incompatible avec la vie.

L’administration de paraplatine et l’exposition aux radiations ionisantes n’ont pas permis

d’obtenir une anémie. L’augmentation de dose ou du rythme d’administration pourrait

constituer une voie à explorer.

43

CONCLUSION

Les résultats de cette étude préliminaire sont somme toute assez décevants puisque aucun

procédé utilisé n’a créé une anémie déficitaire en EPO.

On peut toutefois mettre en avant la cohérence des valeurs d’érythropoïétinémie obtenues.

Ceci laisse penser que la trousse Diasorine EPO-Trac peut faire l’objet d’un travail de

validation dans l’espèce féline.

L’abandon des stratégies développées dans ce travail permet d’en envisager de nouvelles.

Ainsi, l’administration d’adénine a permis chez la souris la création d’une anémie répondant à

l’administration d’EPO (données Laboratoire de Thérapie génique hématopoïétique Hôpital

Saint Louis, non publiées). Cette observation conduit naturellement à envisager d’évaluer

l’adénine de manière similaire aux procédés présentés dans ce travail.

44

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ELABORATION D’UN MODELE EXPERIMENTAL D’ANEMIE DEFICITAIRE EN EPO CHEZ LE CHAT :

ETUDE PRELIMINAIRE.

NOM et Prénom : HERNANDEZ RODRIGUEZ Juan Luis Résumé : Dans le but de réaliser une anémie EPO-déficitaire (comparable à celle rencontrée lors d’insuffisance rénale chronique) chez le chat, plusieurs procédés ont été utilisés : administration de cyclophosphamide, administration de doxorubicine, administration de paraplatine, exposition à un rayonnement ionisant. L’étude a été menée sur 8 chats : 2 par procédé. L’innocuité des procédés a été évaluée cliniquement et biologiquement : un chat du groupe cyclophosphamide a présenté une thrombopénie majeure ayant entraîné la mort par hémorragie cavitaire. Les chats du groupe adriamycine ont présenté un amaigrissement modéré et une leucopénie sans conséquence infectieuse. L’obtention d’une anémie a été évaluée par un suivi hématologique régulier. En cas d’anémie, la réponse rénale de synthèse d’érythropoïétine a été évaluée par dosage sérique de l’hormone. Seuls les chats du groupe cyclophosphamide ont présenté une anémie. La synthèse d’érythropoïétine a cependant été très importante. Aucun des procédés utilisés n’a permis l’apparition d’une anémie déficitaire en EPO. Mots-clés : Erythropoïétine Chat Anémie Insuffisance rénale chronique Modèle expérimental Jury : Président : Pr …………. Directeur : Pr CRESPEAU Assesseur : Dr ROSENBERG Invité : Dr DEVAUCHELLE Adresse de l’auteur : M. Juan HERNANDEZ Bât B1 99 avenue du Général Leclerc 94 700 Maisons-Alfort

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EXPERIMENTAL MODEL OF AN EPO-DEPRESSED

ANAEMIA IN CATS : PRELIMINARY WORK.

Surname and Name : HERNANDEZ RODRIGUEZ Juan Luis Summary : Four procedures were tested in 8 cats in the aim to obtain an EPO-depressed anaemia (similar to renal failure anaemia) : cyclophosphamide administration, doxorubicine administration, paraplatine administration and radiation exposure. One cat belonging to the cyclophosphamid-group showed a severe thrombocytopenia followed by a peritoneal haemorrage causing death. The two cats in the adriamycine-group presented a moderate weight loss and an leucopenia without any infectious consequence. Only the two cats in the cyclophosphamid-group showed an anaemia but with a hight EPO level. None of the procedures was able to provoke an EPO-depressed anaemia. Key words : Erythropoïetin Cat Anaemia Chronic renal failure Experimental model Jury : President : Pr………… Director : Pr CRESPEAU Assessor : Dr ROSENBERG Guest : Dr DEVAUCHELLE Author’s adress : Mr Juan HERNANDEZ Bât B1 99 avenue du Général Leclerc 94 700 Maisons-Alfort France

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ELABORATION D’UN MODELE EXPERIMENTAL D’ANEMIE …