Éawk de la liaisai de l'hémoglobine porcine chez Acti~~)&cillrrsplcwop~~~iononiae

par

Marie ARCHAMBAULT

DCparttrnent dc microbidogie et immundogie Faculté de méûecine

Thèse présentée it la F;aculte des Ctudts supérieures en vue de l'obtention du gndc de

Pbiloaophiae Doctor (Pb.D.) en rnimhdogie et imrnundogie

Juin, 1999

uisitioris and 9 Acquisiüons et Bib iqiaphic Ssniiees services bibliographiques

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Universite de Montréal

Faculté des Ctudes supérieures

gtude de la liaisan de I'hémoglobine porcine chez Acti~t~baciliusplewopne~ll~niae

présentée par.

Marie Archarnbault

a &té &du& par un jury composé des personnes suivantes:

Dr Serge Larivière (Residen t-rapporteur)

Dr Mario Jacques (Dirswr de recherche)

Dr Marcelo Gottschalk (Membre du jury)

Dr Daniel Grenier (Examinateur externe)

T b acœptée le :

SOMMAIRE

Actinobaciüwplewoprteumoniae est un pathogène strict des voies respiratoires du porc et l'agent causal d'une pleuropmurnonie. Plusieurs facteurs de virulence dejà connus sont impliques dans ce processus infèctiewt. Récemment, nous avons démontré la liaison de l'h&noglobine porcine au lipopolysaccharide (LPS) d'A. pkuropnelulloniae. Nous avons dgalement mis en Cvidence qu'A. pleuropneumo~tiae pouvait utiliser I'hCmoglobine comme seule source de fer pour sa croissance. Par

contre, aucune information n'est prksentement disponible concernant le systeme d'acquisition en fer provenant de I'hdmoglobine porcine. Certains chercheurs ont identifie la liaison entre le LPS de certaines bactéries et I'hemoglobine humaine. De plus. des protéines liant I'hdmoglobine ont &té mises en tvidence chez certaines bactéries. L'intérêt premier des h d e s décrites dans cette thése Ctait de caractdriser les molécules impliquées dans la liaison de I'h6moglobine porcine chez A.

pLèuropneunwniae.

Le premier objectif de ce travail consistait ii dtudier l'effet de la liaison de I'htmoglobine porcine sur les propriétés biologiques et physiques du LPS d'A.

p&wopneunu>niae. Tout d'abord, la liaison de I'htmoglobine porcine ii la surface de la cellule entière d'A. pkuropneumoniae a éte mise en Cvidence par microscopie électronique ii transmission (MET) et par spectroscopie. Puis il a Cté observe par

cytometne en flux que cette liaison ne modifiait pas I'accessibilitd des anticorps aux antigènes de surface O et K. Ensui te. la liaison de I1hCmoglobine porcine au lipide A de la molécule de LPS a et6 confirmee par le ddplacement de la sonde fluorescente dansylcadavdrine. Des analyses en MET ont mis en evidence que l'hdmoglobine porcine fragmentait le LPS et diminuait ainsi sa vélocite de sédimentation sur un gradient de sucrose. Des tests sur lysats d'arnébocytes du LUnulus (ou LAL) ont révélé que I'hdmoglobine diminuait l'activité biologique du LPS et réâuisait @alement son habileté à stimuler la production d'oxide nitrique par les macrophages murins.

Le deuxitme objectif de notre enide consistait B 6laborer une mdthodologie nous permettant de quantifier la liaison de I'hdmoglobine porcine à la surface d'A.

pkuropne~~ll~rttae dans le but de comparer différentes souches et diffdrentes conditions de croissance. L'activité liant l'hémoglobine a Ct6 &valute chez A. pleuropnewnonioe par cytometrie en flux à l'aide d1h6moglobine porcine marqute à la fluoresdine. L'activité liant i%t?moglobine a 6tC &montrée chez des souches repr6senratives d'A.

pieuropneumuniae appartenant aux sCrotypes 1 et 2. En comparant l'activité liant l'h6moglobine chez A. pkwopneumoniae sCrotype 1 souche 4074 dans diffdrentes

conditions de croissance, il a dt t ddmontré que la restriction en fer augmentait l'expression des rdcepteurs d1h6moglobine. Ceci implique que l'activi tt liant I'ht5moglobine semble, en partie, répressible par le fer. Ces rdsultats nous indiquaient que, en plus des LPS. des protéines de la membrane externe (OMW) régulées par le fer pourraient possiblement ea impliquées dans l'activité liant I'Mmoglobine. De plus, des mutants isogdniques LPS et un mutant acapsult d 'A. pleuropneumo~~iae serotype 1

ont et6 testés par cytométrie en flux aiin de comprendre le r81e des polysaccharides de surface dans l'activitt? liant l'hémoglobine. Les exp6riences menées avec le mutant acapsuld ont indique que les molCcules de surface possddant une activitd liant l'hdmoglobine etaient plus exposdes à la surîace cellulaire en absence du polysaccharide capsulaire. Cependant, l'activité liant Iiht?moglobine des mutants LPS analyses dans cette etude était semblable à celle de la souche mère. Le profil des proteines de la

membrane externe d'A. pleuropneumoniae serotype 1 obtenu dans des conditions suffisantes ou cestreintes en fer a &té egalement &ait& sur gel de polyacrylamide. Des OMPs régulées par le fer ont 6té observées suggérant qu'une ou plusieurs de ces OMPs pourraient jouer un r61e dans l'activité liant l'h6moglobine d€tectée par cytométrie en flux.

Le troisième objectif de notre Ctude etait d'identifier et de caractériser un ou des

récepteurs protéiques impliqués dans la liaison de l'h6moglobine porcine. Les souches de référence représentant les 12 s6rotypes d'A. pleuropneumoniize ont tté examinées pwr tester leur habileté à utiliser diff&entes sources de fer pour leur croissance. Dans un test de promotion, toutes les souches ont utilise soit l'h6moglobine porcine ou lvhemine porcine. Cette acquisition ne semblait pas spécifique d'espèce étant donne que les souches d'A. pkuropneiunoriioe ont kgalement utilisé l'ht?moglobine bovine ou 1Wmine bovine comme seule source de fer pour croître. En utilisant une procédure de purification par affinité à l'aide d'hdmine- ou d'ht5moglobine-agarose, une OMP

majeure de 75 kDa liant lrh6mine et l'hémoglobine a &té isolCe chez A.

pleivopneumoniae sérotype I souche 4074 après croissance dans des conditions de

restriction ai fer. Des OMPs mineures de 47 et 36 kDa liant l'hemine ou l'hémoglobine ont dgalement dté identifih. Une Ctude portant sur les souches de r6férence des 12

sérotypes d'A. pleutopneumoniue après croissance dans des conditions de restriction en fer a révele que toutes les souches, excepté celles des s6rotypes 3, 6, 7, et 10

synth&isaient I'OMP majeure & 75 kDa liant l'hérnine et lliémoglobine. Cette étude a

egalement d6montré que 1'0MP mineure de 47 D a liant l'hémine et l'ht5moglobine etait conseniée chez toutes les souches testées représentant les 12 sérotypes; I'OMP mineure

de 36 k h liant l'hémine et l'htmoglobine a Cté isolée chez toutes les souches testées

sauf chez la souche 8329/85 représentant le sérotype 12. Le marquage de la cellule entiére d'A. pleumpneumoniae au palmitate radioactif a indiqud que I'OMP majeure de 75 kDa liant l'hdmine et l'h&noglobine n'était pas de nature lipoproteique. Cependant, les OMPs mineures de 47 et 36 kûa liant l'hémine et 1'hémog.Iobine poudent etre des lipoprotkines Ctant donne que des bandes d'approximativement 47 et 36 kDa ont et6 observees suite au marquage. Malgré plusieurs essais, il n'a pas dtd possible de ddterminer la séquence N-terminale en acides aminés de 1'OMP majeure de 75 kDa liant l'hemine et l'hdmoglobine. Afin de prouver que lfOMP majeure de 75 kDa pun fi& par

hdmine-agame ou Mmoglobine-agarose &aient identiques et dans le but d'obtenir une sequence nous permettant de synthétiser un olipnucldotide, ces proteines ont 6tk analysées par un spectromktre de masse awpld il un HPLC et & un séquenceur Edman. Ces analyses ont r6vele des peptides communs entnJ'OMP purifide par hdmine- agarose et I'OMP purifiée par hdmoglobine-agarose. Ces résultats suggkrent fortement que ces peptides proviendraient de la meme protéine. L'ensemble de nos résultats suggbrent donc que I'OMP majeure de 75 kDa et les OMPs mineures de 36 et 47 kDa liant l'hdmine et I'Mmoglobine chez A. pleurupneumoniue pourraient être impliquees dans le système d'acquisition en fer provenant de I'hémine ou de l'ht5moglobine porcine.

MOTS CLES: Actinobacillusp&raopneumoniae, lipopolysaccharides, hémoglobine, hémine, cytornétrie en flux, proteines liant lliemoglobine, protéines liant l'hdmine, fer.

vii

TABLE DES MATIERES

IDENTIFICATION DU JURY SOMMAIRE TABLE DES MATIERES LISTEDES TABLEAUX LISTE DES FIGURES LISTE DES SIGLES m ABR~VIATIONS D ~ C A C E REMERCIEMENTS

I. INTRODUCTION

1. Généralités sur la famille des P~stewelhcetae 2. Acti~~~bîtciIh pkuropneumoniae

2.1 Facteurs de virulence associ& à la cellule bactCrienne 2.1.1 Capsule

2.12 Membrane externe 2.1 2.1 Lipopol ysaccharides 2.1.2*2 Protéines & la membrane externe 2.1.2.3 Fimbriae ou Pili

2.1 Factem de vinilence &dits par la cellule bactkienne 2.2.1 Rotéases 2.2.2 Ekotoxhes 2.73 Superoxide dismutase 2 2 4 Utease 2.25 Fàcteur de pennCabilite

2.3 Pathogénie 2.4 Diagnostic 2.5 Traitement et prophylaxie

3. Les differents systèmes d'aquisition en fer chez les bactéries 3.1 Siderophocts et protéines liant la transfenine ou la lactoferrine 3.2 Llitme, I'Mmine et IWmoglobine

.. U

iii vii

X

xi xvi

xvii xviii

3.2.1 La liaison entre le lipopolysaccharide bactérien et l'hème, I'hdmine ou l'hémoglobine

3.2.2 Les protéines liant l'hi3me. l'htmine ou l'hémoglobine

3.23 Le système hdmophored6pendant 3.2.4 Le transport bactérien de l'hème, de l'hémine

ou de l'ht!moglobine 3.25 Méthodes mettant en évidence 11activit6 liant

l'héme, l'hémine ou I'hémoglobine

III. MATERIEL, METHODES ET RESULTATS

Article 1:

ARCHAMBAULT, Marie, Martin Olivier, Bernadette Foiry, Moussa Diarra, ~onia-haine Paradis et Mario Jacques. Effects of pig hemoglobin binding on some physical and biological properties of Actinobacillus pleuropnemoniae 1 i pop01 ysaccharides. Journal of Endotoxi n Researc h, 4: 53-65, 1997.

Article 2: ARCHAMBAULT, Marie, Stéphane Rioux et Mario Jacques. Evaluation of the hemoglobin-binding activi ty of Actinobacilllils p&uropneumoniae using fluorescein-iabeled pig hemoglobin and flow cytometry . FEMS Microbiology Letters, 173: 17-25, 1999.

Article 3: ARCHAMBAULT, Marie, Clément Rioux, France Dumas, Pierre Thibault. Chnstopher Elkins et Mario Jacques. Identification of hemin- and hemoglo bin- binding proteins of Actinobocillus pleutopneu))1oniue serotype 1.

IV. DISCUSSION GÉNERALE

VI. BIBLIOGRAPHIE lm

VII. ANNEXES

Annexe 1:

Article en collaboration

Anntxt 2: Liste des communications

LISTE DES TABLEAUX

II. REVUE DE LA L I T T ~ A T U R E

Tableau 1. Roteines bacteriennes liant lthème, l'hémine ou IWmoglobine de l'hdte.

Article 2. TABLE 1. Percentages of fluorescent events and modes recorded in flow cytometry anal ysis of A. plewopneumonioe reference strains and field isolates grown under iron- restricted conditions and incubated with a 1: 10 dilution of FLUOS-W.

TABLE 11. Percentages of fluorescent events and modes recorded in flow cytometry anal ysis of isogenic mutants of A. pleuropneumoru'ue serotype 1 strain 4074 al^ grown under iron-resûicted conditions and incubated with a 1: 10 dilution of FLUOS - Hb.

Article 3.

TABLE 1. Ability of A. pleuropneunwniae reference svains representing the twelve serotypes to use Hm and Hb as iron sources in a growth promotion assay.

TABLE II. Resence of Hb- and Hm-binding OMR in A. p l e u r o p n e ~ ~ a e reference strains representing the twelve serotypes.

TABLE III. Common tcyptic peptides between the 75-kDa OMR pun fied by ei ther Hb-agarose or Hm-agarose obtained by Matrix-assisted laser desorption ionizationl time-of- fliaht (MALDI-TOR .

LISTE DES FIGURES

II. REVUE DE LA LITTERATURE

Figure 1. Modèle schdmaiique de l'acquisition du fer provenant de la transfemne chez les Pustemikew. L'interaction de la transfemne avec le complexe Tbpll2 et la transduction d'dnergie via TonB entraîne un changement conformationnel de la transfemne et permet ainsi le relachement de ses cations ferriques. Ces ions sont transport6s à traven Tbpl où ils s'associent avec Fbp. Fbp transporte un cation femque à travers l'espace pdriplasmiqw une perméase de la membrane interne romnée de Fpcl et Fpc2 qui transloquent le ~ e 3 + il travers la membrane interne dans le

cytoplasme. Le complexe Apo-Fbp est alors séparé et Fbp redevient dispnible pour un autre cycle de transport du fer. Le transport du fer ii traven la membrane interne pounait concornittement se produire avec la réduction de L'ion femque en ion ferreux, le rendant ainsi disponible pour son utilisation biologique. Transfemne (Tl), protéine 1

liant la transfemne (Tbpl), protéine 2 liant la transfemne (Tbp2), proieine liant le fer krrique (Fbp), pennéase I liant le fer ferrique (Fpcl). perméase 2 liant le fer ferrique (Fpc2). membrane externe (OM), membrane interne (IM). Le cercle noir représente le fer. Traduit et modifi6 de Kirby et coll. (1 10). 19

Figure 2. Modtle hypothétique generai pour l'aquisi tion de I'héme. de I'hémine ou de I'h6moglobine. L'hdmine libre ou lie à I'hdmoglobine serait internalisé dans le @ri plasme via les rhpteurs de la membrane externe par l'action des molécules TonB- ExbBD. La topologie exacte et l'identité précise de plusieurs r&epteurs bactériens de surfàce demeure encore une spéculation. L'hémine serait transporté dans le cytoplasme par l'action d'un système comprenant une protéine périplasmique liant l'hdmine, une perméase de la membrane cytoplasmique et une ATPase. Le fer serait relâché de l'anneau porphyrique par l'action d'une oxygenase liant I 'h&me localisée dans le cytoplasme. Hemoglobine (Hb) , recepteur d'hemoglobine (Hm bR) , rbcepteur d'hbmine (HemR). membrane externe (OM). p6Rplasme (PP), membrane cytoplasmique (CM). Traduit et modifie de S tojilj kovic et d l . (20 1). 21

III. MATÉRIEL, METHODES ET RESULTATS

Article 1.

Figure 1. Electron transmission micrographs of whole cells of A. pleuropneumoniue serotype 1. ( A ) Control cells that were not stained, nor incubated with pig Hb. (B) Unstained cells that were incubated dunng 30 min with pig Hb (1 mglml). Bar. 200

nm.

Figure 2. EDS spectrum of whole cells of A. pleuropneumniae serotype 1 shown in Fig. 1. Elemental analysis of control cells (A) or cells incubated with pig Hb (B). A 8- fold increase in iron (Fe, arrows) was observed in cells previousl y incubated wi th pig Hb. 51

figure 3. Fiow cytometry analysis of whole cells of A. pkurupneunwniue serotype 2

not incubated with pig Hb (A) or incubated with pig Hb (B) were labeled with the anti- mouse IgG fluorescein isothiocyanate (FiTc)-conjugated antibody (left peak, control) or with monocl~nal antibodies against serotype 2 O-antigen plus the anti-mouse IgG FiTCsnijugated antibody (right peak). Whole alls of A. pleuropncumoniae serotype 1 not incubated with pig Hb (C) or incubatexi with pig Hb (D) were labeled with the

anti-mouse IgG RTC-conjugated anti body (left peak. control) or wi th monoclonal antibodies against serotype 1 capsular-antigen plus the anti-rnouse IgG FITC- conjugated antibody (ri ght peak). The horizontal bars labelled " 1 " indicate non-s peci fïc fluorescence wbile bars labelled "2" indicate specific fluorescence.

Figure 4. Transmission electron micrographs of negatively stained A.

plrwopneumoniae serotype 2 extracted LPS. In the absence of Hb, the LPS appeared as ribbon-like structures with frequent branching (A). When LPS was incubated with

Hb (1 rnglml) during 1 h, the typicai structure was broken down in shorter molecular aggregates or compietely disaggregated in small @cules (B). After 18 h of incubation with pig Hb. micelles were observed (C). A hexagonal lattice was observed when LPS from A.plewopneumoniae was incubated with polymyxin B (1 mglml) (D). Bar, 100

nm. 53

Figure 5. Western Blot analysis of fractions obtained following sucrose density centrifugation. A. pkuropne111110niae serotype 2 extracted LPS (A), pig Hb (C), or A.

plcuropncumoniae serotype 2 extracted LPS incubated with pig Hb (B and D) were

layered over a 120 % continuous sucrose gradient. Alter centrifugation, 8 fractions (of 1.5 ml) were recovered and analyzed by SDS-PAGE and Western Blot; fractions 1 and 8 correspond to the bottom and the top of the tubes. respectively. Nitrocellulose membranes were either incubated with a serum from a pig experimentally infected with A. pleuropneumoniae (A and B) or with a rabbit antiserum against pig Hb (C and D). 54

Figure 6. Dansylcadaverine displacement assay: representative emission spectra. The maximum fluorescence of DC was achieved by using 10 pglml of A. pkuropneunu>niae lipid A. The addition of different concentration of pig Hb (A) or

polpyxin B (B) to the mixture of lipid A and DC resulted in an attenuation of fluorescence intensity which is indicative of the displacement of bound DC to lipid A

by these compounds. DC done (50 PM) was used as control.

Figure 7. Inhibition of extmcted LPS or bacterial cells activation of cLAL by pig Hb or polymyxin B. A decrease was obtained in cLAL activation from the addition of ten-fold diluted pig Hb (starting concentration lmglml) (A) or polymyxin B (starting concentration 1 mglml) (B) to a constant concentration of extracteci LPS from serotype 1 or serotype 2 (1 pglml) or bacterial cells of serotype 1 or serotype 1 (1 mglml). Two independant experiments were p e r f o d , * P<0.05. 56

Figure 8. Effect of pig Hb (pHb), human Hb (hHb), or polymyxin B (PX) on LPS biological activity of SaIrnonella rninnesofc~ srnooth or Re 595 or A. pleutoprteunwniae serotype 1 in the cLAL test. The addition of pHb (1 mgiml) or W b ( 1 mglml) or PX ( 1

mglml) to extracted LPS ( 1 pg/ml) resulted in a signi ficant decrease of cLAL activation, * Pc0.05. 57

Figure 9. Effect of pig Hb on LPS biological activity of A. pleuropneumniüe serotype 2 in inducing Na- production in J774 cells. The addition of a constant concentration

of pig Hb (1 rng/ml) to ten-fold diluted extracted LPS (starting concentration 1 pglml) resul ted in a significant decrease of Nmm- production, *P<0.05. 57

Article 2. Figurr 1. Flow cytometry anai ysis of A. pleuropneumoniae serotype 1 reference strain 4074. Bacterial cells were grown under iron-restricted conditions and incubated with

1 5 (C), 1: 10 (D), 1:5û (E). or 1: 100 (F) dilutions of KUOS-Hb. Bacterial cells not

incubated with FLUOS-Hb (A) or incubated with uiilabeled pig Hb (B) served as controls.

Figure 2. Fiow cytometry anaiysis of A. pleuropne~~~~)niae serotype 1 reference strain 4074. Cells were grown under iron-resinctd (A, pealc II) or iron-sufficient conditions (B, peak II) and incubated with a 1: 10 dilution of FLUOS-Hb. Bacterial cells grown under iron-restricted (A, peak 1) or iron-sufficient conditions (B, peak 1) and not incubatecl with FLUOS-Hb served as controls. 65

Figure 3. Outer membrane proteins profile of A. pkuropneumoniae serotype 1

reference strain 4074 grown under iron-restricted or iron-sufficient conditions. OMPs were separated on 12.5% SDS-PAGE and stained with Coomassie blue (A) or transferred to nitrocellulose membranes for Western immunoblotting (B). The membranes were then incubated with semm from a pig experimentally infected with A .

pleuropnewlulni<ir serotype 1 . Lam 1, Molecular mass markea in ma. Lane 2, OMPs obtained from cells grown under iromsufficient conditions. Lam 3. OMPs obtained ftom cells grown under i ron-restrictcrl conditions. Amows indicate the p s i tion of iron- rcgulated OMR.

Article 3.

Figure. 1. Identification of Hm- and Hb-binding OMPs of A. pleuropneumoniue using affinity chrornatography. A SDS-PAGE gel stained with Coomassie blue is shown. Molecular mass markers in kDa (lane 1); Hb-agarose (lane 2) or Hm-agarose (lime 3)

af'fini ty-purified OMPs from A. pleuropneumoniae grown under iron-sufficient conditions; Hbagarose (lane 4) or Hm-agarose (lane 5) affinity-purifîed OMPs frorn A. pleuropneumniae grown under iron-limited conditions. Arrows indicate the

position of the 75,47 and 36lcDa Hm- and Hb-binding OMPs. 95

Figure. 2. Detection of Hm- and Hb-binding proteins in culture supematants. A SDS- PAGE gel stained with Coomassie blue is shown. Molecular mass markers in kDa (lane 1). Roreins located in concentrated culture supematants of' A. plcuropneunwniue grown under inwi-limited conditions and purified by affinity with Hb-agaruse (lane 2) or wiîh Hm-agarose (lane 3). OMPs from A. pleuropnewroniae growa under iron-

limited conditions and affi~ty pudkd by Hba8ar0ge (lane 4) or Hm-agarose (lane 5). Amwvs indicate the pition of the 75.47 and 36kDa Hm- and Hb-binâing OMR. %

Figure. 3. Labeling of A. pkuropneunwniae with [3~]palmitate. Ruorographic anal ysis of A. piewop~umoniae metabolical1 y labelled with [î~]-palrni tic acid. Molecular mass markers in kDa (lane 1); A. pleuropneunioniae grown under iron-

sufficient conditions (lane 2) or iron-limited conditions (lane 3). Arrows indicate the position of lipoproteins

Figure. 4. Western blot with biotinylated porcine Hb and avidin-horseradish peroxidase conjugate. Hm- and Hb-binding OMPs were resolved by SDS-PAGE, iransferred to nitroalluiose, and incubated with biotinylated porcine Hb (A) or avidin- hotseradish peroxidase ooajugate (B). Molecular mass markers in kDa (lane 1); OMPs from A. pfeuropnewnoniue grown under iron-limi ted conditions and affinity purified by Hb-agarose (lane 2) or Hm-agame (lane 3). The anow indiates the position of the 7SkDa Hm- and Hb-binding OMP.

Figure. 5. A hypothetical mode1 Tor the utilization of Hb andlor Hm by A.

pkuropnetmwniae. Extracellular Hm- and Hb-binding proteins would catch heme and shuttie it back to specific outer membrane receptors. Hm and/or Hb-bound Hm would be internalized into the perîplasm ihrough the outer membrane receptors by the action of TonB-ExbBD machinery. Hm would be transported into the cytoplasm by the action of

the Hm-specific protein-dependent uptake system which involves periplasrnic Hm- binding protein, cytoplasrnic membrane pcrrnease and ATPase. Iron would be released

from the porphyrin ring by the action of cytoplasmically located heme oxygenase. Periplasmic and cytoplasrnic mmponents of the A. pfeuropneunionioe Hm and Hb

utilization system are not yet identifid. 99

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS

Ac:

AcMo:

ADN: 't rà:

DO,

EUSA:

g: h: Hm: Hb: 1 gG: IROMP: Kb: k m t. LPS: M mg:

min: rnLI rnM MET m: OMP: PBS:

rpm: SDS-PAGE:

anticorps anticorps monoclonaux acide désoxyribonucléique

depi5 centigrade da1 ton

densite optique enzyme linked irnmuno-sorbent assay

gramme heure hémine h4moglobine immunoglobuline G protdine de la membrane externe rdgulée par le fer kilobase kilodalton Litre li pop1 ysaccharide molaire milligramme minutes millif i tre millimole microscopie électronique B transmission nanométre protéine de la membrane externe

solution saline tamponnée rotations par minute éiectrophorèse sur gel de polyacryIamide mienant du dodécyl sulfate de sodium seconde! miaogramme rnicrdiûe force de centrifugation

A la mémoire de mon Rre, Jacques A mon mari, Ludovic

A ma famille

REMERCIEMENTS

k tiens B remercier sincèrement tous ceux et celles qui ont contribit de pés ou de loin B la rçalisation de cette Chide. Je tiens B exprimer plus particulittcrnent ma fcconnaissana envers:

- le Dr Mario Jacques. professeur titulaire et directeur du Groupe de Recherche sur les Maladies Infectieuses Porcines (GREMIP) de la Faculté de médecine vétérinaire de l'université de Montréal. pur la wnfiaaœ, le suppod, la disponibilité et les excellents conseils scientifiques offerts pendant la rCalisation de ce travail ainsi que pour son soutien financier,

-le Fond pour la Formation & Chercheurs et l'Aide B la Recherche (FCAR), la Facule de méâecine vCtéruiaire et la Faculté des ttudes supérieuns de 1 TJniversitt de Monutal pour leur appui financier;

-le Dr Rokrt Higgins, professeur titulaire B la Faculté de mCdecine vCtCrinaire de l'Université de MontrCal, pour m'avoir pcnnis de travailler au laboratoire de diagnostic en bactériologie clinique pndant toute la dude & mai propmme de dwtomt;

-le Dr Chnstophcr Elkins, chercheur B l'Université de la Caroline du Nord. pour ses excdlcnts conseils scientifiques concernant une partie de a travail;

-les Drs Monique D w é et Mme10 Gottschaik, professeurs agrC@s P la Faculté de madecine vétérinaire & 1 'Université de Montra et mcm bres de mon comi te conseil, pour leur cdlaboration et leurs caiseils avisés;

-le secrétariat du GREMIP p r les nomkeuir savices rendus.

1. INTRODUCTION

ActUrohaciüusp&wopneumoniae est l'agent étiologique de la pleuropneumonie porcine. Cette infection. dpafldue &travers le monde, entraîne des pertes économiques importantes à l'industrie porcine. L'adhdrence d'un agent pathogéne ii la surface des cellules de 1'hBte et l'acquisition de fer représentent des Ctapes importantes de la pathogenèse de l'infection bactérienne. Des Ctudes ont &montré que lladbCsine majeure d 'A. pleuropneumoniae &ait le LPS. Dt plus. la partie polysaccharidique du LPS a eté identifiée comme agent responsable de lladherenœ d'A. plcuropneumoniae aux cellules des voies respiratoires du porc. Rdcemment, il a Ct6 d6montre que les LPS d'A.

pleurupneumoniae pouvait egalement lier lriémoglobine porcine et pourrait donc jouer un r8le dans l'acquisition du fer chez a micro-organisme.

À notre connaissance, aucune étude approfondie sur la liaison de l'hémogiobine porcine par A. pleuropneunwniae n'a Ctt5 rédisde jusqu1& maintenant Une telle &de permettrait de caractenser la liaison entre lli~moglobine porcine et la surface d'A. pleuropncumonioe et dtam61iorer nos connaissances sur les composantes impliquées dans le mbnisme d'acquisition du fer de l'hdmoglobine par cet agent pathogène.

L'un des buts du prdsent travail Ctait dYtudier l'effet de la liaison de I'hemoglobine porcine au LPS d'A. pleuropneu~lulnioae. Nous avons etudie en détail cette interaction et avons deteminé que I1hémoglobine modifie les proprietés physiques et biologiques du LPS d'A. pleutopneumoniae. Nous avons ensuite tlabor6 une rnCthoddogie nous permettant de quantifier la liaison de I'h6moglobine porcine a la surface d'A. pkuropnetunoniue en utilisant la cytomdtrie en flux. Nous avons dors détermine que l'activité liant l'h~moglobine &ait en m*e répressible par le fer et qu'elle pourrait donc impliquer des protéines de la membrane externe régul6es par le fer. Nous avons par la suite identifié chez A. p&uroprte~~)~,niae des récepteurs protéiques liant l'hémine et lli6moglobine.

II. REVUE DE LA LI-RATURE

1. G h h l i t d s sur la famille des Partsurellaceue

Cette famille comprend trois genres ofliaels: Pus&we&, Actimbaciflus et Hmmophilirr. Ce sont des bactenes P Gram négatif, anaérobies facultatifs et piuasites stricts des vertébrés. Les gennes du genre Acti~tobacifluic sont en fonne de coques et de

bacilles pléomorphes, seuls ou en paires. et ne sont pas particulièrement résistants aux conditions adverses. Ce prtsent travail porte sur une espèce causant une infection respiratoire importante chez le porc. soit Actinobacilllus pleuropneumoniac ( 145).

2. Acfinobacillur pîeuropneumoniae

A. pleuropneumoniue (anciennement connu sous le nom dtHaemophilics p&uropnemoniae et d'Haemphi11~~prahaemolytic~~) est l'agent Ctiologique de la pleuropneumonie porcine ( 145). Cette infection est contagieuse et atteint surtout les porcelets en bas age. Cette bactérie est distribuée mondialement et entraîne des pertes

6conomiques A l'industrie porcine. La maladie se caractérise par une pneumonie h6morragique nécrosanie et une pleuresie fibnneuse (76). C'est une bactérie en forme de coccobacille, capsulCe et fl-hemolytiquc. C'est un germe fragile qui survit peu

longtemps dans l'environnement. Deux biotypes ont Cté décrits: le biotype 1 requiert pour sa croissance du nicotinamide adenine dinucléotide (NAD), une -déhydrog6nase de la chaîne respiratoire. tandis que le biotype 2 est NAD-independant. Jusqu'h présent, 12 sérotypes du biotype 1 et deux sérotypes du biotype 2 ont et6 décrits selon des di fierences an tigeniques et structurelles dans leurs polysaccharides capsulaires. Le skrotypage est d'ailleurs principalement bas6 sur les antigènes capsulaires. Les serotypes 1 et 5 du biotype 1 ont ett subdivisés en sous-groupes (la, lb et Sa, Sb) selon des différences an tigdniques localisées dans les li pop01 y saccharides et la capsule. De plus la composition des LPS varie entre les sérotypes sauf pour les sérotypes suivants: 1.9, 11 et 3.6,s ainsi que pour 4 et 7 qui partagent des épitopes communs (159). La virulence entres les souches est variable. Des observations cliniques démontrent que les souches du biotype 1 sérotyps la, 1 b. 5% Sb, 9 et 10 sont plus virulentes que les autres souches du biotype 1 (37, 76). Les sérotypes 2 et 3 se retrouvent dans plusieurs pays d'Europe (208).

2.1 Facteurs de virultnct associCs b la cellule brctdriennt

2.1.1 Capsule

La structure et la composition chimique de la capsule d'A. p&u~opnew~u)niae ont et6 determinées pour les 12 sérotypes de rdference (159). En gdndral. les capsules consistent en des unites repétees de deux ou trois sucres maintenus par des liens glycosidiques, ou de polyrntres de type acide teichoique maintenus par des liens phosphate diester, ou de polyméres d'oligosacch;indes maintenus par da liens phosphate ( 159).

La spécificité des sérotypes d 'A. pleuropneumoniac est determinee par la capsule (92). 11 a dté demontrd, en utilisant la microscopie dlectmnique, que l'epaisseur de la capsule varie selon le sérotype; les plus virulents posdderaient une capsule plus tpaisse ce qui pourrait expliquer en partie pourquoi les sérotypes ne possèdent pas tous le meme degré de virulence (96). Paradis et coll. (1996) ont ddmontrd que la croissance sous des wndi tions rMui tes en fer n'affixte pas la production de la capsule.

La principale structure de surface bactérienne contre les mécanismes de

ddfense de I'h8te est la capsule conferant une protection contre la phagocytose et la lyse cellulaire m a i & par le compldment (91, 181). Normalement, les souches capsul6es d'A. plewopneumoniae sont résistantes P la lyse par le complément dans le s&um porcin en prdsence d'anticorps spécifiques (91, 181, 219); alors que les mutants acapsulés sont lysés par le sérum normal (9 1, 2 19). Une capsule fragile et faalement detachable a dte identifide chez une souche avinilente du sérotype 5 (100). D'autres etudes ont démontré que des mutants dtficients en matériel capsulaire des sérotypes 1 et

5 obtenus par passage en serie in vitro sont substantiellement attdnués dans leur virulence comparé ià la souche mére (9 1. 172).

Il a etc rapporté que l'injection de mataiel caplaire puri fit n'induit pas de signes cliniques et n'entraîne pas de ldsions pulmonaires chez les porcs (44, 45). L'immunisation à l'aide de matenel capsdaire purifie produit typiquement une faible réponse humorale (88). Meme si le matCriel capsulaire purifie est conjugue à une protéine améliorant son immunogdnicité, seulement une protection partielle contre l'infection est obtenue (91).

RCcemment, Ward et Inzana (218) ont identifie, clone et séquencé une portion du locus (cpxDCBA) implique dans le transport des polysaccharides capsulaires d'A. p&uropneunoniue sérotype Sa. Une region de l'ADN impliquée dans la biosynthèse des polysaccharides capsulaires d'A. plewopneumoniae sdrotype Sa a été Cgalement identifiée et caractérisée (220).

2.1.2 Membrane externe

Le lipopolysaccharide (LPS) ou endotoxine est une molécule de haute

masse moléculaire faisant partie de la membrane externe des bacténcs à Gram ndgatif (169). 11 est le constituant majeur du feuillet externe de la membrane externe. Le LPS est composé de trois parties: le lipide A. le noyau oligosaccharidique et l'antigene 0. Le lipide A est attaché au noyau oligosaccharidique qui à son tour est relie ik l'an tigi?ne 0.

Le lipide A, partie toxique du LPS. est la region la moins variable de la molécule. II est constitué d'un sucre. le diglucosamine, de groupes phosphates et de longues chaînes d'acides gras. Le lipide A sert à ancrer le LPS dans la membrane externe de la bactdrie. Des travaux menés dans notre laboratoire ont mis en evidence qu'une region du lipide A d'A. pleuropnew~u)niue est accessible en suf' (7). Le noyau oligosaccharidique est

compose d'un noyau interne et d'un noyau externe. Le noyau interne est composé dtheptoses et d'acide 3-d6soxy-D-mannosctulosonique (KDO) alors que le noyau externe est composé d'hexoses. Le KDO comporte huit atomes de carbone et relie la partie polysaccharidique au lipide A. Le noyau oligosaccharidique possede une structure plus uniforme que celle de l'antighie 0, le segment le plus variable du LPS.

Lbtigtne O est cornposb d'unit& repetks de sucres. La longueur des chaînes

d'antigène O determine le profil dlectrophorétiqw des LPS pouvant étre lisse (sérotypes

2 , 4 5 et 7). semi-nigueux (sérotypes 1 et 5) ou ruguew (sérotypes 3 et 6) (19.45).

La composition & la chaîne-O est spéafique du sérotype, leur longueur peut cependant varier entre les souches entrafnant des profils distincts B l'intérieur d'un meme sérotype

(2)

Le LPS possède diverses activités biologiques (43). En laboratoire, le LPS induit une torcicite chez les embryons de poulets, une blastogenést lymphocytaire et une gélification du test LAL Chez I'hdte, le LPS confère la résistance au compkment et B l'activité bactéricide du sdrum. 11 stimule Cgalement le relachement de mediateurs

proinflammatoires. Trois groupes de mediatewrr peuvent etre sécrétés : des protéines (TW, ILI, IL6, et IL8), des radicaux libres oxyg6nés (@O, Hz@, et NO), et des

lipides (prostaglandines ES). Si ces substanoes sont liMr&s en faible quantité, elles sont alors bént5fiques et offrent une stimulation g6ndrale du système immunitaire entraînant ainsi une destruction du pathogène. La situation est diffdrente si une grande quanti té de ces substances sont libérées dans l'organisme. Cette stimulation exagdrée

du systéme immunitaire peut à ce moment conduire un choc endotoxique lCtal(l82). Le LPS d'A. pleuropnewnoniae n'est pas capable d'induire à lui seul les lésions necrosanies et hémorragiques de la pleuropneumonie porcine. Le LPS doit alors agir de concert avec les autres facteurs de virulence pour provoquer les ldsions typiques de la pleuropneumonie porcine (2 14).

Des etudes ménées dans notre laboratoire ont ddrnontrd que le LPS est l'adhdsine majeure d'A. pleuropneunwniae (8.95, 157). Nos recherches ont dt?montré

que les isolats possédant des LPS lisses adhknnt fortement aux anneaux de trachée de porcelet tandis que les isolats possedant des LPS semi-rugueux adhèrent plus faiblement (8). D'autres travaux ont mis en &idence que la partie lipidique du LPS ne semble pas responsable de lladh&ence d ' ~ . pleuropneumonioe mais que la partie

polysacchandique est plut8t impliqude dans ce phOnom&ne (ln). Rtcemment, la liaison de l'hdmogiobine porcine au lipide A du LPS d'A. pleuropneunioniae a 6té dCmontree et cette liaison poumit &a impliquk dans le système d'acquisition du fer provenant de Iriémoglobine (7).

2.1.2.2 Protdines de la membrane externe

La membrane externe d'A. pleuropncumonioe est composée de trois il cinq protéines majeures et de 10 à 20 protéines mineures (90). Cenaines d'entre elles

semblent posMer un r&ie dans la réponse immune protectrice (28, 63, 166). De plus, des anticorps contre les OMPs d'A. pleuropneumoniae semblent jouer un r61e

important comme opsonines lors de la phagocytose (212). Sept profils protéiques sur SDS-PAGE ont et6 identifies parmi les souches de réference des neuf premiers sérotypes d'A. pleuropneumoniae. Les sérotypes 1 et 9 appartiennent à un profil. les

sérotypes 2 et 6 à un deuxitme profil et les sCrotypes 3,4,5,7 et 8 forment les cinq autres profüs (165).

Meme si les profils des OMPs diffèrent entre les sbrotypes d'A. pkwopneum~rtiae, il a et6 démontre que les isolats de tous les sérotypes possèdent plusieurs OMPs communes incluant: une lipoproteine de 14 kDa associee au peptidoglycane, nommée PalA et hautement immunogène (54); une OMP modifiable par la chaleur de 29/41 kDa; une OMP majeure variant entre 32 et 42 kDa selon les sérotypes et une OMP de 48 kDa (28). Lem r8les demeurent pour l'instant incornus.

Les effets de la restriction en fer sur le profil des OMPs d'A.

pleuropnewlulnk ont Cté documentes (34, 152). Des proteines majeures de la membrane externe rdgulées par le fer identifiées par Deneer et Potter (34) ont des masses moléculaires relatives de 76 et 105 kDa Ces chercheurs ont suggdré alors que

ces proieines pourrai*ent servir à acquérir le fer sous differentes formes pendant la

croissance in vivo. Des polypeptides de 47, 54, 79 et entre % et 102 kDa ont et6

egalement identifies chez A. plewopneumoniae dans des conditions de croissance restreinte en fer ( 152).

A. plerropneunwniue est capable d'utiliser la transfemne comme seule source de fer (64. 65). Deux protéines de la membrane externe rtgulées par le fer, de

masse moléculaire de 1 60 kDa (TfbA) et de 5 100 kDa (TfbB), ont ét6 identifiées comme des protéines liant la tnuisferrine (64, 67). Des anticorps contenus dans le sérum de porcs convalescents ont réagit contre ces deux protéines, indiquant ainsi qu'el les sont exprimées in vivo (34, 152). L'analyse génd tique des déterminants codant

pour les protéines liant la tnuisfemne a révelée deux gènes arranges en un opéron. Un @ne Fur codant pour un represseur a &té observde en amont de l'opéron t f i (tbp) (68.

203). Cette organisation est similaire celle décrite pour les rhpteun de transfemne de Neisseria mningitidik, Nekserfa gonuwbeae et Hwmophiüus influeme (68).

Lorsque du maltose est ajouté au milieu de culture des sérotypes 1, 2, 3, 5, 6 et 7 d'A. pleiropnewnoniae, une protéine de 42 kDa est nouvellement synthetisée (34). Les chercheurs supposent que cette protéine serait impliquée dans le transport du

maltose et permettrait une meilleure croissance in viho. Son importance in vivo n'est pas encore connue.

Une protéine de 50 kDa, dtnomme Omp lA, de la membrane externe d'A.

pkur~p~iunoriiae sCrotype 1 a été identifide comme étant une 1ipoprotCine (63).

L'immunisation de porcs avec OmplA a cod6ré une protection homologue (63). Son

rôle précis demeure incomu.

Inzana (90) a observé une structure ressemblant ài des fimbriae chez A.

pkwopncumoniae retrouve à I 'intérieur des phagosomes aprés intemalisation par des

leucocytes polymorphonucleaires. Des fimbriae ont été dgalement observés chez des

isolats d 'A. pleuropneumoniue aprks croissance sur géloses au sang (215). Ces fimbriae sont par contre rapidement perdus aprés quelques passages sur ce milieu. Pour l'instant le d e de cette structure dans la virulence d 'A. pieuropnewnoniae n'a pas encore dté établi.

2.2 Facteurs de virulewe sécdt6s par la cellule bactérienne

Six protéases pouvant degrader les immunoglobulines A porcines. la gtlatine et I'h~moglobine humaine, bovine ou porcine ont d t t decrites chez A.

pkwopneunwrriae (142). Leur masse moléculaire est de > 200, 200,90,80,70 et 50 kDa L'inhibition par I'EDTA de l'activité protéolytique et la réactivation subséquente par le calcium sugghre que des m&taIloprotéases sont responsables de cette activitb. Les chercheurs suggérent que ces proieases pourraient i 2 t ~ impliquk dans la virulence en clivant les immunoglobulines A porcines, facilitant ainsi la colonisation de ce micro- organisme au niveau des voies respiratoires. De plus, elles pourraient être impliquées dans la formation des kions pulmonaires en clivant directement les protéines de l'hôte.

Ces protdases pourraient egalement jouer un rôle dans l'acquisition du fer en dQmiant I'h6moglobine porcine.

2.2.2 Exotoxints

A. pleu~opneumoniue elabore differentes toxines labiles il la chaleur. Ces

toxines. membres de la famille des toxines RTX @pis in the structural @an), sont connues sous les noms ApxI. ApxlI, ApxIII et ApxiV pour & ~leuropnel~t~~niize #rX toxins (51,52). Les toxines RTX se retouvent chez d'autres bactéries à Gram n6gatiC et elles sont considérées comme des facteurs de vinilence. Un membre bien connu de

cette famil k est 1 'b6molysine alpha dtEu:herichia c d . Les membres de cette famille partagent des propribies structurales et fonctionnelles. incluant la présence d'unités répétées riches en glycine, un mode de sécrétion particdierayant une séquence signal B l'extr6mité C-terminale, une activation pst-traductionnelle, et une toxicité cellulaire reliCe à la formation de pores membranaires. Cependant, les toxines ont diff'nntes cellules cibles. activités toxiques (h6molytique. cytotoxique. leuwtoxique ou adenylate cyclase) et s@ificités d'hôte selon l'espèce bactérienne impliquée (22).

Les gknes codant pour les toxines RTX sont regroupdes en opdron consistant en quatre gènes contigus soit C. A. B. et D (223). Le @ne structural A et le

gène activateur C sont impliqués dans I'elaboration des protéines alors que les génes transporteurs B et D sont impliques dans l'exportation des protéines. Ces gènes sont exprimes pattir d'un promoteur commun situe en amont du gène C.

Apx 1 est une toxine forkment hémolytique de masse moléculaire apparente

de 105 kDa (56). Apx 1 est 'galement fortement cytotoxique pour les macrophages alvblaires et les neutrophilu (105). La toxine est produite par les sérotypes 1. 5, 9.

10. et 11. L'opéron apx I contient les quatre ghes de la famille des toxines RTX. Les genes impliqués dans la biosynthèse de 1'Apxi sont ddnommb apxlC, apxIA, apxIB et apxlD (51). Les sérotypes 2.4, 6, 7, 8, et 12 ne possèdent pas l'opéron apxlA et ne produisent alors pas la toxine Apx 1. L'opéron q x i est complètement absent chez le sérotype 3 (50). gén6ralement moins virulent (55).

ApxII est une toxine d'environ 1û3 à 105 D a . Elle a 6té originellement caracterisée à pamr de la souche de réference du strotype 2 (57). A pxi1 est faiblement hémolytique et peu cytotoxique pour les macrophages alvéolaires et les neutrophiles ( 105). Elle est synthétisée par tous les sérotypes sauf le sérotype 10. Les g h e s de h toxine ApxiI sont dgakment organisés en un opéron nomme upxiI comprenant apxIIC et apxllA. Aucun @ne de sécrétion n'a Cté identifie dans œt opéron (51).

Apx III est une toxine & 120 kJh et elle est synthétisée par les sérotypes 2, 3 , 4 6 et 8. Cette protéine est non htrnol ytique mais hautement cytotoxique (52, 90.

207). L'opéron apr l I comprend les génes apxlnc, apxlIIA. apxlllB et qxan> (51).

Apx IV est une nouvelle toxine RTX ddcouverte r&emment chez A. @~~pnrurnonhe (53). Cette toxine. exprimCe seulement dans des conditions in vivo,

est présente chez tous les sérotypes et possède une masse mol6culaire de 202 kDa

(183)-

Plusieurs souches d'A. pleuropneumoniac secrè ten t diffkrentes combinaisons de deux toxines A px. Sachant qu'A. pleiiropnemoniue peut utiliser I'h6moglobine porcine comme seule source de fer (7,34). il est tentant de spéculer que les souches ayant une forte activite hemolytique serait avantagée in vivo de par leur capacite ih relâcher l'hémoglobine par la lyse des erythrocytes. Des expériences d'inoculation menées chez le porc ii l'aide de toxines purifiees ont que les toxines Apxl, ApxII et ApxIII sont les facteurs de virulence responsables du developpement des signes cliniques et des lésions caract6ristiques de la pleuropneumonie porcine

(1W.

2.2.3 Superonide dismutase

A. pleuropnew~nioe produit une [Cu, Zn]-superoxide dismutase (SOD) ( 1 13). Sa séquence peptidique N-terminale suggtre une localisation extra-cytosolique de l'enzyme. Ceci suggère une protection contre les superoxides environnementaux. Plusieurs bacteries commensales des voies respiratoires sup6rieures produisent du

SOD. Cette enzyme pourrait donc tue impliqutk dans la survie des &&es implantées sur la surface mucosale (1 12). Des travaux suppl6mentaires sont nécessaires afin de déterminer si l'enzyme SOD contribue à la survie de ce micrwrganisme.

2.2.4 Uréase

Un cas clinique de pleuropneumonie associe à une souche uréase ndgative

d 'A. pleuropneunionioe a et6 prtic6demment décrit (12). Tascon et coll. (20a) ont demontré à l'aide de mutants uréase ndgative d 'A. pleuropneunwniae que la perte de l'activitt uréase ne modifie pas la virulence de ce micro-organisme chez le porc. Par contre. dans des conditions expérimentales differentes. des mutants uréase ndgative se sont averés moins virulents (13) de sorte que l'importance de cette enzyme comme facteur de virulence demeure pour l'instant controversée.

2.2.5 Un facteur de permCabllit6

Un facteur de perméabilité a dté retrouvd dans le surnageant de culture chez 18 isolats des serotypes 1 et 5 d'A. pleuropneunwniae (1 16). Ce facteur est non hhol ytique, non protéolytique et cause de l'oedéme dermique chez le lapin. Son rôle dans la vinilence demeure inconnu.

L'infection cau& par A. pleuropileunwniae peut être subaiguë. aiguë ou chronique ( 186). Les porcs de tous âges peuvent &tre affectés mais ceux de plus de 12

semaines semblent les plus vulnérables. Dans la fonne subaiguë, la mon survient à

l'intérieur de 24 ii 36 heures pst-infection. De plus, des morts subites chez des porcelets sans signes cliniques ont 6té rapportées. Les signes cliniques d'une infection aiguë ou chronique à A. pleuropnewnoniae peuvent inclure l'anorexie, la fievre, une dyspnde Iégere ou sévère avec cyanose et de la toux. Ltdpitaxis est communtment retrouve dans la forme aiguë de l'infection. À la nkropsie, les lésions de la forme aiguë sont représentées par une pleurdsie sérofibrineuse et une pneumonie hémorragique necrosante. La distri bution des lésions est genéralement bi latdrale. affectant principalement les lobes caudaux des poumons (189). Selon It6tendue des lesions pulmonaires et l'efficacité de la thCrapie à base d'antibiotiques. la fonne aiguë peut progresser d'une infection clinique sévtre à la mort en quelques jours ou bien se convertir en forme chronique. A la nécropsie, les infections chroniques se caractérisent par une pleurésie fibrineuse accompagnée de foyers nécrotiques pulmonaires (189).

Les porcs atteints par la forme chronique de I'infection sont considérds comme étant des porteurs de la maladie puisque la bactérie se retrouvent dans leurs foyers de nécrose pulmonaire (181). Les porcs atteints par la forme aiguë peuvent se rétablir completement. Leurs poumons peuvent eue alors totalement sains ou bien fibrosés ou nécrosés par endroit (11). Après s'etre rCtabli de l'infection, un porc peut demeurer porteur asymptomatique durant des mois (187).

La pathogénie de la pleuropneumonie porcine est idluende par différents facteurs. Le stress causé par l'entassement, le transport, les variations de température et une mauvaise ventilation des locaux augmente l'incidence de la maladie (145). En plus des conditions envinnimmentales, le statut immunitaire de lri8te et les facteurs de

vinilence discutés précéûemment joueraient un rdle très important dans l'&olution de la

maladie (76,90). La transmission de l'infection se fait par contact direct entre les pwcs

ou par voie indirecte (186). A. plruropncumoniae serait inhaie et pCnCtnrait dans les alvéoles pulmonaires via la trachée et les bronches. Il y aurait ensuite attachement de ce micro-organisme iî la muqueuse respiratoire. Ce processus impliquerait le LPS (8, 157)

de la bacterie et possiblement des fimbriae (90. 215). La multiplication du germe entraînerait ensuite la colonisation de la surface des muqueuses (182). Plusieurs facteurs de vinilence seraient alors impliqués dans cette 6tape. Les exotoxines, ApxI à

IV, et les prothes permettraient au micro-organisme d'accéder aux nutriments essentiels B sa croissance. Ce germe pourrait alors exprimer un ou des r6cepteun lui permettant d'acquérir les nutriments. C'est le cas pour la transfemne porcine dont l'acquisition se fait via des recepteurs protdiques de la membrane externe d'approximativement 60 et LOO kDa (59. 64. 65, 67). Les toxines, les protéases et k

LPS seraient également impliqués dans la formation des lésions chez le porc (76,90).

Ce micro-organisme doit dgalement interfçrer avec les defenses de I'h8te afin d'assurer sa survie. Encore une fois, plusieurs facteurs de virulence semient impliqués dans ce processus. La capsule protégerait de la phagocytose et de l'effet bactéricide du sérum (91, 181). Les toxines Apx semblent interférer avec les systi?mes de dkfense de i'h8te en dktruisant les macrophages alv6olaires (27, 29). I l est intéressant de spéculer que la liaison de l'hémoglobine au LPS d'A. pleuropneumoniae (7) permettrait le camoufflage d'A. pleuropneunioniue au système immunitaire. Les protéines de la membrane externe liant la transfemne porcine pourraient egaiement représenter un moyen par lequel cette bactérie se recouvre de prottines de I'hBte afin d'&happer 1 la repense immune. La SOD permettrait une protection contre les

superoxides environnementaux ce qui pourrait favoriser la survie des bacteries

implantées à la surface de la muqueuse respiratoire (1 12, 1 13). Le r8le prdcis de la SOD dans la pathogénie de l'infeciion demeure à &re éhcid6.

2.4 Diagnostic

A. pkivopneunwniae est un pathene strict, le porc etant le seul animal mnnu comme &nt susceptible à ce germe. De plus, ce microorganisme ne persiste pas dans l'environnement (145). Les sérotypes d'A. pkwopmmniiae sont distribuCs

géographiquement il travers le monde et leur prCvalence varie selon les pays. Les s6rotypes 1.5 et 7 sont les plus fdquenis aux Etats-Unis (188). En France, les isolats

appitrtie~ent principalement aux sérotypes 2 et 9 (132). Une Ctude portant sur

1'6~01 u tion de la distribution des di fferents séroty pes d'A. pleuropnemniac isoles de porcs malades au Qutbec, de la période 1970-1982 jusqu4 décembre 1997 a révele que le serotype 1, qui Ctait dominant jusqu'en 1992, a diminue considCrablement et il ne represente maintenant qu'environ 20 pour cent de tous les isolements effwniés dans les differents laboratoires de diagnostic (133). Depuis 1993, le sérotype 5 prédomine, de plus en plus suivi de près par le sérotype 7. Le nombre d'isolats d'A.

pleuropneumontae appartenant aux Jrotypes 3, 6 et 8 se maintient entre un et trois pour cent et il en est de meme pour les autres sérotypes (133).

Les spécimens permettant l'identification d'A. pleuropneumoniae au laboratoire de diagnostic sont les poumons. Le frottis direct est peu utile et n'est pas

effectué sur les poumons. Une culture sur gelose au sang avec une strie de Stoplylococcuruweus, pour fournir le facteur V, permet l'isolement du germe. On

peut utiliser &galement des milieux spéciaux, c'est-à-dire des geloses PPLO (Pleuqneumoniae !ike gganism). Il est maintenant possible de mettre en évidence le germe directement dans les poumons à l'aide d'immune-techniques (59). Cette technique est environ 1Oûû fois plus sensible que l'isolement par culture directe.

Plusieurs tests permettent le sérotypage des isolats. Les techniques d'agglutination sur lame, d'agglutination en tube et de prkipitation en tube capillaire utilisant des antisémms de lapins contre les bactéries entières ont dté utilisés (135). Le typage de routine se fait par le test de coagglutination (136). 11 est toutefois reconnu que des isolats non typables ainsi que des réactions crois6es surviennent & l'occasion (134).

Les réactions croisées existent en particulier entre les sérotypes 3,6 et 8, les s6rotypes 1,9 et 1 1 et les sérotypes 4 et 7 ( 13 1, 147, 150). La capsule serait l'antigène spécifique de sérotype (159) et les réactions croisdes seraient dues aux polysaccharides de la chaîne O du LPS des differents sérotypcs (9). Toutefois, l'immunodiffusion en gelose, Ilit?mag@utination indi- et la contre-immunoélectrophorèse sont utilisees lorsque le moindre doute existe quant à l'identité du drotype (136, 137). Le sérotypage peut être

egalement effectue par PCR en identifiant les gènes activateun et structuraux des toxines d'A. plewopneumoniae (51). 11 est &galement possible de sérotyper ces micro- organismes dans les tissus ih l'aide d'un test de particules en latex (89). Le sérotypage des isolats est recommandé pour conlimer rapidement un diagnostic et est essentiel si on considère un programme de vaccination. Le sérotypage peut demontrer la distribution I d e des sérotyp et permet 1'Cvaluation de la situation t?pidémiologique

(2m-

Plusieurs tests ont et6 ddcrits pour le diagnostic sérologique de la

pleuropneumonie. La fixation du compldment, l'ELISA et le test de neutralisation de

I'hérnol ysine ddtectent la prdsence d'anticorps contre A. p&uropneiononiae chez les porcs. Un test d'agglutination en tube au 2-mercaptc1éthawl(2-ME) peut tgalement Ztre

utilisé (138). La spécificite et la sensibilite varient selon les tests. La fixation du complément possède une haute sptkificité et une faible sensibilité; ltELiSA possède g6neralement une forte sensibilité et une fai Me spécificité; et le test de neutralisation des

hemolysines, qui a die developpé recemment. ne deteck pas le sérotype 7 car il ne produit pas d'hdmolysine. La procedure de fixation du complément demeure la méthode standard et est utilisée de routine pour tester les troupeaux aux États-unis (41). Des etudes ont et6 r6aiisées rdcemrnent gin d'augmenter la spécificite de la technique dtELISA (5, 70, 114, 164, 1%) OP des extraits cellulaires et des LPS ii longues chaînes ont et6 6valués comme antigénes (69, 7 1). Dans un test ELISA. les antigènes spécifiques de sérotype permettent l'identification des anticorps appartenant à

un sérotype ( 146). La determination des anticorps dans le sérum peut être utilisée afin de ddterminer les profiles d'anticorps des elevages ou pour demontrer la présence d'anticorps dans le colostrum (146). Jia stkologie est utilisde au Quebec pour le contr8le de l'infection et la mise sur pied d'elevages assainis. Dans tous les asu sérologiques. des précautions doivent eue prises alin d'exclure les anticorps produits par une infection à Actinobacillus suis ainsi que par les autres membres des

Pasteurellaceae (20B).

2.5 Traitement et prophylaxie

L'antibiothhpie est de mise lors d'une infection causée par A .

p&wopneumo>niae et l'antibiogramme est fait de routine. La pdnicilline, les tétracyclines, les sulfamid&, la tiamuline et le ceftiofure peuvent etre utilisés comme traitement (41). Bien que ces antibiotiques peuvent rtkiuire la mortalité et amdliorer le

gain de poids, ils nlCliminent pas l'infection dans un troupeau. De plus, la résistance aux antibiotiques devient de plus en plus commune chez A. plruropneuntoniae. Diffkrents plasmides seraient responsables de la r6sistance ik la streptomycine, aux sulfamidés, au chionuaphenicol et B la kamnycine (94).

La serologie et la vaccination sont utilisées dans le but de diminuer 1Fncidence de l'infection B A. plcuropncumoniue. Cette incidence peut etre &galement

réduite en regroupant les porteurs stro-positifs, en achetant des porcs dm-negatifs et en utilisant la quarantaine pour les nouveaux porcs (145). 11 existe plusieurs vaccins sur le marché; œ sont des bactérina faites de cellules enti&res et inactivées chimiquement. Les vaccins previennent les mortalitCs mais ne previennent pas l'infection ou le developpement de la maladie chronique et ceci peut affecter sérieusement la rentabilité de l'dlevage (42). De plus, les vaccins n'offrent pas de protection croisée contre les au- sérotypes (86). L'infixtion naturelle ou l'immunisation avec une souche vivante d 'A. pleuropneumoniue confèrent une protection contre tous les sérotypes (148, 149).

DO au succés limit6 des vaccins commerciaux. plusieurs stratégies d'immunisation ii l'aide de diffkrents facteurs de virulence ont kt6 testées afin de determiner si une protection compléte peut eue obtenue (35, 42, 63, 90, 163, 170, 171. 209). En gdndral , ces expérimentations ont atteint des niveaux de protection supérieure ou kgale Zt ceux des bactdnnes commerciales sans toutefois atteindre une protection compl&te. Des vaccins expérimentaux constitués de micro-organismes atténués et tués ont et6 d o ~ e s par aérosol ou par voie orale et ont d6rnontre une certaine protection (93). Une autre stratégie reside dans la gdn&ation de bacterines autogènes pouvant &ire plus efkace que les bactbrines commerciales car elles confèrent une immunité sp6ci fique B la souche enzootique de ltdlevage (185). Des vaccins sous-unitaires sont pr6sentement ii I'etude et certains vont faire leur introduction bient8t sur le marcht. Ils consistent en une varie& de combinaisons de sous-unîtes. Un grand nombre d'antigénes se sont r6v6ids protecteurs. Ils incluent les toxines Apx, les protéines de la membrane externe, les produits extracellulaires et certains antigénes de structure ou de fonction (77, 2 16). Les vaccins de ce type protégent gdndralernent contre tous les serotypes (208). Le traitement, la vaccination et de bonne mesure dbygihe permettent gdneralement le contrôle de la pleuropneumonie sur la ferme (208).

3. Les dim6rents syst&mes d'aquisition en fer chez b s baet6ries

De toutes les interactions qui surviennent entre un pathogéne et son hôte, une des composante commune et essentielle d'un processus infectieux implique la multiplication du microorganisme envahissant l'intérieur des tissus de l'hôte. Cette croissance est critique à l'ttablissement d'une infection et ddpend, en partie. de l'habileté du pathogbe ik acquérir certairis nutriments essentiels (182). Le fer est un dernent essentiel pour la plupart des pathogènes bactériens (17, 47. 120, 127, 158. 221,222). Le fer fonctionne awme un cofacteur mbdiant le transport de l'oxygène, la g6nCration d'dnergie et possètîe dgakment des fonctions d'oxydation. De plus. le fer

chdaté dans un anneau porphyrique. dénomme hème. peut servir comme substrat pour la croissance. Chez l'hâte. le fer extracellulaire est lit à des glycoprot6ines telles la

lactofemne et la transfemne contenues dans les sécr6tions exocrines. Le fer

intracellulaire est séquestré dans la femtine se retrouvant a l'intérieur des cellules eucaryotes et dans les protéines contenant l'heme telle l'h6moglobine. Le fer contenu

dans l'h6moglobine constitue environ 6û% des réserves totales de fer chez un humain

(155). Cette séquestration limite la disponibilite du fer libre à des niveaux en-dessous

de ceux requis pour supporter la croissance microbienne chez l'hôte ( 18, 222). Cependant, afin de survivre chez I'hBte, les bactéries pathoghes ont dbveloppé

diffdrents mecanismes de haute affinité pour acqudrir le fer (182). Un de ces systèmes

consiste en l'daboration de sidérophores &r&és dans l'environnement chélatant le fer de l'h6te puis se liant ensuite à un récepteur situé B la surface de la ôactkrie, ce qui

permet alors une intemalisation du fer. Un autre système consiste en un mécanisme

dependant d'un récepteur bacterien de surlace permettant d'acqdrir le fer provenant

directement de la lactoferrine. de la transferrine ou des protéines contenant de I'hkme

(25. 120, 127, 155, 158). Un nouveau système de captation du fer provenant de

l'hhne. de lqht?mine ou de Ith&nogiobine a et6 très récemment proposé. Ce nouveau sys téme, denomme hémophore-dépendant. consiste en la sécrétion de protéines

bacteriennes capables de lier les molecules d'hkme ou d'hémoglobine de

l'environnement et de les transporter ensuite aux tbpteurs bactkriens de surface liant

I'héme ou l'h6moglobine (66).

3.1 Sidhphores et protéines liant la transîtnine ou la Iaetohrrine

Le système le plus connu d'acquisition en fer implique la synthèse de

mol&cules de faible masse molCculaire nommCes siderophores. Plusieurs germes

pathogtnes synihdtisent un ou plusieurs sid6rophores; ceux-ci sont des agents chélatant

le fer de I1h8te. Ces germes peuvent alors utiliser le fer lié au siddrophore et ainsi

croître. Les siddrophores sont capables d'enlever le fer de la transferrine et de la

lactoîemne de l 'hW (15%. La pmduction de sidérophores constitue donc un facteur de

virulence important permettant dtacc6der au fer de l'h6te. Les siddrophores sont

sécrCtés suite B une restriction en fer et, une fois complexés au fer, ils sont alors transportés de nouveau B l'intérieur de la cellule via des récepteurs sp6cifïques de la

membrane externe. Les protéines régulées par le fer servent g&n&ralement de récepteurs p u r Ie complexe sidCrophons-fer et semblent essentielles pour l'acquisition du fer (143. 144).

Les sid6mphores microbiens peuvent &tre divisés en deux types chimiques: les phholates et les hydroxamates (155). Plusieurs bactéries entériques synthdtisent

par exemple le sidbrophore phdnolate enttrobactine et le sidérophore hydroxamate aérobactine. Certaines bactéries ont Cgaiement la capacité d'obtenir le fer via une variétt de siddrophores de types hydroxamates qui ne sont pas synth6tisds par le micro- organisme lui-meme mais plut& produit par un autre germe (6). Le femchrome et le femoxamine sont les siderophores les plus connus utilish par d'autres bacteries. Ils sont produits respectivement par certains fungi et par Actimmyces (155). A.

pleuropneumoniae semble capable d'utiliser les sid6rophores exogbnes (36).

Dans les fluides corporels de I'hSte le fer se retrouve lie à des protéines.

entre autre à la lactofemne et à la transfemne. La transferrine se retrouve majoritairement dans le sang et la lymphe alors que la lactoferrine se retrouve I l'intdrieur des neutrophiles et dans les s&cr&ions exocrines telles la salive, les sécr6tions nasales, le colostrum et le lait (155). On peut dire que la production de

transferrine et de lactofemne par I'hBte est un important mécanisme de defense, appelé parfois immunité nutritive. Les germes ont su ddvelopper des mécanismes rendant disponible ce fer sous ces differentes formes pour leur croissance. Les germes posséâant des recepteurs membranaires liant la transfemne ou la lactoferrine enlève directement le fer de celles-ci ( 155). Par exemple, NeLîserui mningifidh possède des

récepteurs de surf' liant la transfemne et la lactoferrine de l%&te, mais ces composés ne sont pas incorporCs dans la cellule pendant l'acquisition du fer (184, 190). Un r&ume des &tapes permettant l'acquisition du fer de la transfemne est présente à la

Figure 1. II est P noter ici qu'A. pleuropruwnoniue. tel que mentionne à la section

2.1.2.2, possède des récepteurs liant la transfemne porcine (64, 65). Jusqu'il ce jour.

aucune étude n'a encore €té &lis& sur les récepteurs liant la iactofemne.

Figure 1. Mudèle schematique de l'acquisition du fer provenant de la tmnsfemne chez les P~~teureUaceae. L'interaction de la transfemne avec le complexe Tbpll2 et la

transduction d'énergie via TonB entraîne un changement confotmarionnel de la transfemne et permet ainsi le relâchement de ses cations ferriques. Ces ions sont

transportes A travers Tbpl où ils s'associent avec Fbp. Fbp transporte un cation

femque B travers l'espace périplasmique B une perrnéase! de la membrane interne f m é e de Fpcl et Fpc2 qui transloquent le F& travers la membrane interne dans le cytop1asme. Le complexe A p F b p est alors séparé et Fbp redevient disponible pour un autre cycle de transport du fer. Le transport du fer ii travers la membrane interne pourrait conrimittement se produire avec la duction de l'ion ferrique en ion ferreux, le rendant ainsi disponible pour son utilisation biologique. Transferrine (TT). protéine 1

liant la transferrine (Tbpl), protéine 2 liant la transferrine (Tbp2). protéine liant le fer ferrique (Fbp), perméase 1 liant le fer femque (Fpcl), pennéase 2 liant le fer femque (Fpc2). membrane externe (OM) , membrane interne (IM). Le cercle noir représente le fer. Traduit et modifié de Kirby et w11. (1 10).

L'hdmoglobine, une protéine de 64 4% Da, est un t6tram&re compod de deux paires de sous-unités a et B appelées globines et de quatre groupements hemes

(155). Chaque sous-unit6 est Iide une moldcule d'hème. L'hemoglobine est la

protéine liant l'oxygène des globules rouges. Suite à une lyse érythrocytaire,

l'hémoglobine est relâchee dans la circulation et se lie alors à l'haptoglobine, une

glycoprottiine du plasma de 100 000 D a Une molécule d'hémoglobine lie une molécule

d'haptoglobine. Ce complexe hdrnoglobine-haptoglobine est rapidement metabolise par les hépathocytes (85). L'hCmoglobine libre apparait lorsque l'haptoglobine est saturée;

elle est alors rapidement oxydée et dissociée en mol&ules de globines et d'hèmes.

Lth*me libre est lié rapidement par une glycoproteine du plasma d6nornrné hemopexine. Cette molécule de 57 000 Da lie une molécule d'heme par molécule de

protéine. Ce complexe est ensuite transporté au foie oh l'hème peut alors être dQpdé

en bilirubine ou incorpore dans le cytochrome P 4 M (140). Le fer provenant de

I'hémoglobine est ainsi continuellement recycle chez l'hôte.

L'hème represente un ion mdtallique chélate dans un anneau porphyrique

(110). Des métalloporphyrines contenant d'autres ions metalliques comme le cuivre, le

magnésium ou le zinc sont inclus sous la rubrique heme. La désignation usuelle de

l'héme rdfère plut8t B du fer complexe iî un anneau de t&rapyrrole et sa masse

moléculaire est alors de 6650 D a La reaCtivité biologique de l'hime derive de l'habileté

de son ion métallique, le fer, à subir des changements oxidatifs réversibles. Lorsque le

Ter est sous la forme rbduite ~ e 2 + , le composé se nomme htme, alors que le terme

htmine est utilise pour la forme oxydée F6+. Cette propriéte permet à l'hème, un groupement prosthdtique d'une varitté dlht?rnoprotéines, d'effectuer le transport de

l'oxygéne (hemoglobine) et le storage (myoglobine), le transfert dtelectron et la

gdn6ration d'energie cellulaire (cytochrome b et c), la biotransfomation oxydative

(cytoc hrome P4SO). et 1 'activi te peroxyde d'h ydrogkne (catalases et peroxydases) . Cette caractéristique permet également la participation de Ilii?me à la peroxydation des

lipides des constituants de la membrane cellulaire (217). Cependant, l'htme est

toujours associe P des protéines due à sa grande réactivite biologique entraiAnant sa

propension à oxyder les constituants allulaim ( 141).

L'hCmoglobine, l'Mme ou lliémine ne sont normalement pas disponibles

aux micro-organismes & n t donnt leur localisation intracellulaire. C'est pourquoi, les

bactéries pathogènes peuvent utiliser les composés contenant de l'hème seulement aprZs les avoir rendu disponibles. Pour ce faire, les germes infectieux endommagent les

tissus de Ith8te ce qui permet le rrlilchement de matdriel intracellulain. Les toxines bactériennes telles les hdmolysines (32, 161, 1%) sont de bons exemples de facteurs de vinilence permettant la lyse des 6rylhrocytes ( 120, 155); les protéases (154, 191) et

lu cytolysines (1 15) jouent probablement aussi des rôles important dans le relâchement du matériel intracellulaire des cellules de I'hBte. Les germes pathogiines ont donc d6veloppé des mécanismes rendant disponible le fer sous ces diffdrentes formes pour

leur croissance. La majorité des bactéries sont capables de synthbtiser leur groupement hi?me suite à l'acquisition du fer. Ru contre certains microorganismes sont incapables de synthétiser ces groupements due à une altération dans leur biosynthbe enzymatique. Ces derniers requièrent donc la molécule d'hème pour leur croissance (66).

L'htmoglobine due à sa masse moléculaire de 64.4 kDa ne peut pas traverser le canal d'une porine de la membrane externe (120). Le detachement des groupements hémes aux chaînes globines semble alors &tre une etape essentielle à

l'acquisition de lbéme provenant de I'h6moglobine. Aucune information concernant cette&pe n'est disponible pour l'instant. L'héme, quant B lui, & n t hydrophobique a tendance à stagglom&er à pH physiologique (16). Ce qui suggere que l'heme ne traverserait pas le canal d'une porine de la membrane cellulaire sans protéine chaperone ( 151). Ces donnees laissent supposer que I'acquisi tion de l'hémoglobine, de l'Ume ou de I'hdmine impliquerait un processus medi6 par un rdcepteur protéique. Cette

interaction spefifique avec un récepteur exposé à la surface constituerait une ttape

importante dûns l'acquisition de Ili&me (120. 155).

Certains chercheurs ( 130, 201) ont suggdrd un systhme bacterien

permenant l'acquisition de l'h&noglobine, de I1héme ou de l'hemine qui devrait contenir en général les Bléments suivants (Figure 2): un moyen d'accéder au pool inhacellulaire des h6moprotéines (les hem01 ysines) ; I1habilet6 à extraire l'hème lie aux protéines de transport du s&um (protéases dégradant I'hémoglo#ne); la présence de

protéines de la membrane externe représentant des récepteurs fonctionnels accessible à

la surface (protéines liant l'hémoglobine, l'hème ou I'hémine) ; un moyen permettant le

transport de lth&me intact dans le pCriplasme (protéine périplasmique); la présence de protéines de la membrane cytoplasmique permettant le passage & l'hème au cytoplasme (penn6ase); l'existeaa d'un ClCrnent fournissant I'energie P a système (Ton-B); et un moyen de reguler l'expression de ce sysystème (le &presseur Fur). Chez les cellules

eucaryotes, il est postult que la translocation de l'hème it travers les membranes des

cellules depend de rdcepteurs spécifiques liant l'hème (60, 61, 72, 194) et dont l'expression est induite par une restriction en fer (19J). Chez les bacteries, plusieurs recherches supportent dgaiement ce modéle (voir sections 6.2.2). Il est pi^ contre tentant de supposer une &tape supplementaire dans œ modéle hypothetique: l'existence de récepteurs non protéiques liant l'hème, l'hemine ou l'hémoglobine reprdsentant des réservoirs fonctionnels de oes composts hème à la surf ixe de la bactérie poumit ttre un mécanisme d'accumulation des groupements h h e .

Figure 2. Modèle hypothktique gkntral pour l'acquisition de 1 'heme, de lthemine ou de

l'hémoglobine. L'hémine libre ou lie à l'hémoglobine serait internalis6 dans le périplasme via les rdapteurs de la membrane externe par l'action des molécules TonB- ExbBD. La topologie exacte et l'identité précise de plusieurs récepteurs bactériens de

surface demeure encore une spéculation. L'hémine serait tramporte dans le cytoplasme par l'action d'un système comprenant une protéine périplasmique liant l'hémine, une perméase de la membrane cytoplasmique et une ATPase. Le fer serait relâche de

l'anneau porphyrique par l'action d'une oxygbnase liant l'hème localisee dans le

cytoplasme. HCmoglobine (Hb), récepteur d'htmoglobine (HmbR), recepteur d'hémine (HemR), membrane externe (OM), périplasme (PP), membrane cytoplasmique (CM). ModifiC de Stojiljkovic et d l . (201).

3.2.1 L i liaison entre le LPS bactirien et I'hLme, Ith6mine ou 11h6mo~loblne

L':administration d'hémoglobine humaine purifiée comme substitut sanguin u t associée en médecine humaine B de multiples toxicités organiques (176). Plusieurs de ces effets toxiques sont caractéristiques de ceux produits chez I'hôk par les endotoxines bactériennes (ou LPS). Afin de mieux mmpnndre le rôle potentiel du LPS dans la toxicite observée par l'hdmoglobine humaine purifiée, certains chercheurs ont examin6 les interactions entre ces deux molécules.

Roth et coll. (173-179) ont étudié la liaison du LPS de certaines entdrobactéries (Escherichia coli 026: 86. Salmonella typhimurium PR 122(Rc) et Protesrrmirabilis S1959, R110 et R45) à I'ht5moglobine humaine. Ces chercheurs ont démontrd par plusieurs méthodes independantes la formation de complexes entre ces LPS et l'hémoglobine humaine purifiée La liaison du LPS a I'hdmoglobine humaine purifiée a 6te mise en &idence à l'aide de LPS radiomarqut5 (103). La liaison du LPS à

I'hdmoglobine a &té totalement inhibée par du LPS non marque indiquant ainsi que la liaison était spécifique. Le LPS pouvait lier les deux sous-unités a et D de

I'hdmoglobine humaine purifiée. Par contre, une plus grande quantité de LPS se liait à

la sous-unité B. indiquant ainsi une affinité plus forte pour celle-ci. Des etudes de liaison sur microplaque ont démontré que cette interaction était saturable et que la KD etait de 3.1 x 10s M (103). L'insolubilité des LPS dans l'éthanol a été kgalement utilisée afin de vérifier si 11h6moglobine humaine purifiée se complexait au LPS (176).

La prtkipitation de I'h6moglobine par l'dthanol est augmentde en présence de LPS. prouvant ainsi la formation de complexe entre ces deux mdécules.

Des ultrafiltrations de complexes htmoglobine-LPS sur des membranes de

3 0 et 100 kDa ont dCmontd que la majorité des LPS de ces complexes (874'7% et 64-

72%. respectivement) sont détectables dans les filtrats (103). Alors qu'en absence d'h6moglobine. le LPS n'est p detectable dans les filtrats. L1h6moglobine humaine purifiée entriilnne donc une dissociation des LPS en particules de faibles masses moléculaires pouvant passer à travers ces membranes. Une centrifugation de densité sur un gradient de sucrose a demontré que le LPS -migre avec l'hémoglobine, alors que le LPS libn a une vClocité de sédimentation plus élevée que le LPS des complexes hémoglobine-LPS (103, 175, 176). Ces résu1 tais indiquent que lldmoglobine humaine purifi& diminue la densité des LPS et modifie ainsi leur vélocité de sédimentation. Des

€tudes en microscopie electronique P transmission ont rdvdlt que l'htmoglobine humaine purifibe modifie l'ultrastructure des LPS en causant sa désaggrégation en petites particules (173). Ces etudes démontrent pour la premiére fois la formation de complexes entre I'h~moglobine et le LPS et indiquent que l'htmoglobine peut modifier certaines caractéristiques physiques et biologiques des LPS.

La liaison de l'h6moglobine humaine purifiée a eté egaiement associée à une augmentation de l'activité biologique du LPS déterminée par un test de LAL ( 103, 104, 175, 176). Lth&noglobine humaine purifide a dgalement augmenté I'habilete du LPS à

stimuler la production de "tissue factor"par les cellules endothbliales de veines ombilicales humaines (H WEC) ( 174) et par les cellules mononucl6aires humaines (179). In vitro, I'hdmoglobine a augmenté l'habileté du LPS à activer la coagulation (178) et la cascade du complbment (46, 102). La synergie i n vitro n'est pas encore comprise et demeure inexpliquee.

La liaison entre le fer et le LPS a 6té legalement dtudite (180). I l a Çté demontré que 1,s B 2 moles de fer se liait i I mole de LPS. La constante d'affinité enm le fer et le LPS est de 1 13 PM. Ces chercheurs ont également rapporté l'effet du fer sur l'activité biologique du LPS. La liaison du fer au LPS a entraînk une diminution de l'activité biologique d6terminLe par un test de LAL et une diminution de stimulation de

l'activité procoagulante des cellules endothéliales. De plus. il a et6 rapporté que le LPS pr6-incubé en présence de fer enmnne des taux de mortali te plus bas chez les souris comparés A ceux obtenus par l'injection de LPS seul (97, 162).

White et d l . (225) ont men6 des enides de toxicité iri vivo. Un groupe de

lapins recevant de I'hCmoglobine contaminee par du LPS avait des taux de mortalité plus élevés compad à ceux ayant r q u de l'htmoglobine sans LPS. Ces chercheurs ont également émis l'hypothtse que le LPS augmenterait Itactivi té toxique de l'hdmoglobim humaine purifiée. En effet, une h6patotoxicité a et6 rapportée en absence de LPS, suggdrant ainsi une toxicité intrinsèque par l'h6moglobine (128). De plus, il a

été démontré que l'administration d'hdmoglobine seule augmentait la susceptibilité des animaux et des humains aux ideciions bii~térie~eS (17). L'hdmoglobine s'est révdlde etre un facteur augmentant la virulence dans cemines infections péritonéales ( 17, 8 1,

82). Cet effet de vinilence serait causé par l'habilete de I'hdmoglobine ii offrir aux

bactéries envahissantes un supplément de fer pouvant soutenir une multiplication bactérienne rapide dans un enviro~ement mimialement restreint en fer (l7,7S').

Lth&noglobine libre, l'hème et le fer peut également abolir l'effet bactéricide et bactériostatique du plasma (17) et inactiver les neutrophiles (109). 11 a été

aussi démontré que I'hemoglobi ne diminue l ' id ux de neutrophiles transpéritonéaux (81) et nuisait au chCrnotactisme et à la repense phagocytaire (82). En utilisant un modèle murin, Griffiths et Stevenson (75) ont récemment etudit les effets de

l'administration d'hemoglobine seule et ont démontre qu'elle aggrave les septidmies il E s colis L'htmoglobine est donc par elle-même toxique chez lih8te en bloquant ses ddfenses immunitaires et en permettant aux bactéries envahissantes de se multiplier plus rapidement. La contribution du LPS dans la toxicité N, vivo de l'hémoglobine n'est p . encore bien comprise. Griffith et Stevenson ont spéculd qu'un produit toxique, quel qu'il soit, administre chez l'hôte pourrait contribuer h la toxicite intrinsèque de

1 'hdmoglobine (75).

La liaison du LPS bactérien à l'ht?moglobine ou IWmine a été tgalement etudide $1 n de comprendre 1 'importance de cette liaison chez les micro-organismes. L'hémine est un facteur de croissance chez PorpIiytom0nu.s gingivalis (62). La liaison de l'hkmine humaine au LPS de P. gingivalis a dté ddmontrée (73). Cette activité liant l'hemine semble être médiée par la région du lipide A du LPS. De plus la cellule entiere a bté capable de lier I'hdmine, demontrant ainsi indirectement qu'une region du lipide A

est accessible en surface. Cette interaction a bté suggdrde comme moyen de stockage de IWmine à la surface de la cellule bactérienne.

Acii~~)buciillur cu:tinomycetemcomi101ts est capable d'utiliser l'hdmoglobine humaine comme seule source de fer pour sa croissance (74). Il a eie demontré que le LPS d'A. actitwmycetemcomitu11~ pouvait lier ltht5moglobine humaine (74). Cette interaction ne semble pas impliquer la région du lipide A de la molécule de LPS & n t donne qu'aucune inhibition n'a eté observée avec le LPS pr6-incubé en présence de polymyxine B, un antibiotique inhibiteur de l'activité biologique du LPS et capable de lier le lipide A du LPS. Les chercheurs ont proposé que cette liaison entre le LPS et l'hémoglobine pourrait faciliter l'acquisition du fer chez cette bacterie et suspectent egalement que cette interaction pourrait eüe due à la charge des deux mol6cules.

Des travaux menés dans notre laboratoire ont mis en évidence la liaison entre le LPS d'A. pkwopneunioniae et l'hémoglobine porcine (7). Cette liaison implique la région du lipide A du LPS car la polymyxine B a reussi ib inhiôer

l'attachement de l'hémoglobine au LPS de ce micro-organisme. De plus. il a étt? dbmmtré en micruscopie électronique ii transmission B l'aide dhn anticorps anti-lipide A (AcMo E5) qu'une région du lipide A est accessible en surface.

Appelmelk et coll. (4) ont réalisé une dtude portant sur la liaison entre la lactofemne et le LPS de différentes bactéries & Gram négatif. II a eté demontré que la lactofemne diminue lbabilett! du LPS ii stimuler la production de cytokines par les monocytes. Ces études in vitro ont dbmontrt? que la lactofemne lie directement le lipide A purifié ainsi que le LPS intact de difft5rentes bactéries à Gram ndgatif. Cette liaison a 6té inhibée par le lipide A et la polymyxine B. Cette interaction a dté suggéree pour expliquer l'effet anti-endotoxique de la lactderrine.

Aucun transport transmembranaire de molecule d'hème, d'hemine ou dWmoglobine via le LPS n'a die rapport6 dans la littérature. Le LPS ne permettrait donc pas le passage de ces molBcules dmh&me B travers la membrane externe. Cette

fonction serait plut& effectuée par des protéines de la membrane externe liant I'hème. I'hdmine ou l'hémoglobine ( 120).

3.2.2 Les protéines liant Ifhème, I'himine ou 1'hémogIobine

Plusieurs protéines dont la fonction serait de lier I'hdmoglobine. I'heme ou lhdmine à la surf'ace de la cellule bactérienne ont kt6 caractérisées ( 120) et un résume de celles découvertes jusqu'à ce jour est pr6sent6 dans le Tableau 1. Elles resident géndralement dans la membrane externe. et leur domaine de liaison est accessible il la surface. Cette affirmation est supportée par les résultats d'etudes biochimiques portant sur le marquage de cellules entières et la chromatographie d'affinité de cellules entières. Le mecanisme d'interaction le plus frQuemmemnt rencontré consiste en une liaison directe entre le rkepteur de surface bactérien et le composé contenant de l'hème (18,

110. 127, 155). Seulement quelques uns de ces récepteurs liant Iliémoglobine, Mme ou Ith6mine ont etc caractérisés au niveau genktique. Ces nouvelles informations ont demontré la nécessité de ces protéines bactdriennes de surface dans Ifacquisition du fer provenant de l'hémoglobine. & I'hème ou de 1Wmine (120. 127).

Ces protéines liant I'htmogiobine. l'htme ou I'htmine demontrent une sptcifcité importante pour la molécule dhéme (14 84. 117-1 19, 123). Cette propri6té semble 6tre confer& par la présence de fer h l'intérieur de l'anneau tétrapyrrole &nt

dom6 que cette interaction ne s'&end pas B la protoporphyrïne IX, un compos6 structurellement relie B llitme (84, 117-1 19). La reconnaissance de la protéine escorte

liant l'hémoglobine, l'hème ou lhdmine ne semble pas en gdndral être un prhlable au processus (W. 1 17-1 19, 123). C'est pourquoi une propndté implicite de ces récepteurs

semble etre leur capacite à lier l'Mme sans tenir compte de llenvironnement protéique immédiat (120). Des etudes de compétition (1 17-1 19) et de mutation (84) confirment

cette propriete.

Plusieurs protéines liant l'hémoglobine. l'hème ou llht?mine ont éte

identifiées chez des bactdries du genre Hiumophilur et Neisseria. Haemophifm inflicenzae est un parasite strict retrouve surtout au niveau des muqueuses respiratoires des vertébrés. H. influenzae type b peut causer des méningites, des péricardites et des pneumonies chez les humains (30). H. infruenzae est un pathogène qui requiert de

l'h&me pour sa survie (78). Chez ce micro-organisme, une protéine de 39.5 D a de la membrane externe liant l'hemine et regulée par le fer a et6 reconnue pour avoir egalement une Spccificité pour I1ht!moglobine (1 18). De plus, le gène. hel, codant pour

une lipoproteine E(P4) de la membrane externe semble &tre essentiel dans l'acquisition de l'htme par H. influenzae dans des conditions aérobiques (167). Cette lipoprotdine

E(P4) jouerait un r81e dans la liaison et/ou le transport de I'heme chez H. influenzae

( 167).

Une lipoproteine p6nplasmique de 51 kDa liant l'hème, nommée HbpA. a die découverte chez H. injluenzue type b (78) et sa structure ainsi que ses fonctions ont

éte &tudides (38). Cette lipoprotéine serait im pliquee dans I'im portation de l'hème à

travers la membrane interne à lhtérieur de la bactérie et serait l'élément clef de la survie

de ce micro-organisme dans le sang. La lipoprotéine HbpA serait une cible intéressante car son inhibition permettrait l1artt!t du transport de lth&me. Cette lipoproteine pourrait

@aiement setvir comme moyen de transport seleciif permettant à des composés

toxiques d'atteindre l'intérieur de la cellule bactérienne. Les chercheurs suggérent que

leurs rCsultats est le point de depart de nouvelles straiegies concernant le developpement de nouvelles drogues (38).

En utilisant une méthode & purification pnr affinité à l'aide d'hemoglobine- agarose, une p r o l n régui& psr le fer & 120 kDa liant lliémoglobine, nommée HgpA a Cîé isolCe chez H. in/%rnzmr type b souche HI689 (101). Ren et col1 (168) ont

identifie par la suite une autre protéine de 115 kDa, denommée HgpB, liant

l'hémoglobine seule ou cornplexCe B l'haptoglobine chez H. influenzae H1689. Un double mutant HgpA et HgpB a présenté une habileté réduite B utiliser l'hémoglobine complexée! ih l'haptoglobine, par contre son aptitude a utiliser lth&noglobine seule n'a pas et6 altérée. Un isolement par chromatographie d'aifïnitd des protéines liant l'ht5moglobine du double mutant a rdv&?e une nouvelle protéine d'approximativement 120 kDa La séquence interne de ce peptide a rdvdlde que cette nouvelle proteine liant 1 'hémoglobine est une troisième protéine mais hautement homologue B Hg pA et HgpB. (168). Des travaux réalis& sur des sécretions provenant des canaux auditifs de jeunes enfants ont rCvéi6 que les ghes codant pour la protbine HgpA de 110 kDa liant lth6moglobine chez H. inpuenaze sont transcrits in vivo lors d'otites aigues (224).

Wong et coll. (226) ont dgalement identifié et caractérise des récepteun de l'hème complexé à l'hdmopexine chez la souche 760705 d'H. influenaze type b. Trois protéines de la membrane externe de 29.38 et 5'7 kDa ont eté identifiées comme des rdcepteurs dth6mopexine par chromatographie d'affinitd à l'aide d'une colonne Sépharose4 couplée ii de l'hemopexine. De plus. ces récepteurs seraient régulés par le fer. Après immunobuvardage, les protéines de 29 et 57-kDa ont et6 capables de lier l'hdmopexine. Les auteurs sugghient alors l'existence d'au moins deux récepteurs liant l'hème cornplex6 à l%dmopexine chez H. injuenzoe type b.

Haemophilus ducrryi est l'agent causal d'une infection transmissible sexuellement qui se manifeste par des ulcérations gdnitaies pouvant etre accompagnées par une lymphadénopathie g6nirale (39). H. ducreyi doit obtenir la molécule dth&me de son hBte 6tant incapable de la synthetiser lui-meme. Les h6molysines produites par ce pathogène permettent la libération de l'hdmoglobine des globules rouges (156). Ce

micro-organisme ne produit pas de sid6rophore et est incapable d'utiliser la transfemne et la lactofemne comme source de fer pour croître; l'hemine et I'h6moglobine représentent donc des sources de fer et d'héme importantes pour H. ducreyi. Une protéine de 100 kDa liant l'htmoglobine, désignée HgbA, a eté identifiée récemment chez plusieurs souches dW. ducreyi (39). Cette protéine semble etre fonctionnellement et immunologiquement conservee parmi diverses souches d'H. dilcreyi (39).

L'expression de HgbA est régulCe par le niveau d'hemine dans le milieu de culture a non par la quantité de fer. La liaison de lli~moglobine ii H. dumeyi n'est pas spécifique d'espèce car l'h6mogiobine de plusieurs espèces animales ont supporté la croissance dtH. ducreyi et ont compétitionnt5 contre de l'hemoglobine humaine marquée (39). Le gtne hgbA codant pour cette protéine liant Ili~moglobine a et6

identifit et caractérisé (40). Des insertions ou des d6lCtions dans le gène h g M ont aboli l'expression de la protéine HgbA ainsi que la liaison à I'htmoglobine. Une mutagenèse dans le gène hgbA effectuée par insertion B L'aide d'échanges alléliques a aboli la liaison P l'hémoglobine ainsi que son utilisation comme source de fer. La séquence déâuite en acides aminés est similaire i celle des rCcepteurs de la membrane externe appartenant il la famille TonB-&pendante (40)

La construction de mutants isogéniques HgbA a démontre que ce récepteur dli6moglobine était TonB-dépendant (36). Le séquençage des gènes du système TonB a rév61ée que leur arrangement était exbB exbD TonB. La proximité et la structure de ces gènes suggtxent qu'ils soient transcrit en opéron. Leur arrangement et leur séquence en nucléotides et en acides aminés sont irès similaires ii ce que l'on retrouve chez les autres P~steureUlmceue. Un mutant isogdnique HgbA d'Ho ducreyi n'a pas ét6 capable de lier ou d'utiliser l'hémoglobine comme source de fer mais à réussi cependant il utiliser l'hémine libre, indiquant que l'utilisation de l'hdmine ne requiert pas le

récepteur d'htmoglobine HgbA. De plus il a CtC démontre par Stevens et coll. (197)

qu'un mutant isogdnique de h g M (HupA mutant) exprime une virulence réduite dans

un rnodi?le animal d'infection pour Ho ducreyi.

Le @ne tdhA codant pour un récepteur de la membrane externe de 75 kDa liant l'hème chez JX ducreyi a Cté clone puis séquencé (210). Ce récepteur est exprime dans des conditions restreintes en hème et semble bien conservé chez les différentes souches d'Ho ducrcyi. Une boîte TonB semble etre présente pris de l'extremitd N- temiinale de TdhA et des boîtes Fur ont Cté obsewées dans la rCgion du promoteur de tdM. Les homologies de séquences ont rCvCI6 une relation avec cinq récepteurs TonB- dtpendant appartenant ih d'autres bactéries. Des Ctudes de comparaison entre HgbA et

TdhA ont mis en Cvidence que dans des conditions de restriction en heme, la proüiine HgbA est exprimée 50 à 100 fois plus que la protéine TdhA. Cette dernière observation laisse supposer l'existence d'un système complexe de régulation.

Nefiseria gonorrhoeae est l'agent Ctiologique de la gonorrhée, une maladie transmissible sexuellement affectant Iliumah et caractérisée par une infiammation

purulente du tractus génital m l e et femelle (20). La majoritt5 des isolats de N. gononhue ne peuvent pas utiliser I'hémoglobine humaine comme source de fer pour leur croissance par contre une minorité d'isolats en sont capables. Cette population mineure d'idats -Tt facilement à l'aide d%t!moglobine et exprime des protéines de la

membrane externe de 42 kDa (HpuA) et de û9 kDa (HpuB) liant l'hémoglobine dans des conditions restreintes en fer. Il semble que les deux protéines soient nécessaires B

l'utilisation de l'héme provenant de I'h6moglobine (20).

Chen et coll. (21) ont identifie et purifie également une protdine de la membrane externe de 89 kDa regulte par le fer et liant l'hémoglobine chez N. gonorrhe<me. La séquence N-teminale des acides amines de la protéine a r6velé qu'en positions de 2 ii 16, les acides amines sont identiques il ceux d'une protdine de la membrane externe de 85 kDa de N. ncningitidk régulée par le fer et liant le complexe hdmoglobine-haptoglobine. Des mutants isogéniques construits par &change dlélique n'exprimant plus la protéine de 89 kDa ont 4ie incapables d'utiliser 1 'h6moglo bine pour supporter leur croissance; ils peuvent par contre croître à l'aide d'heme. Les chercheurs suggerent que ce récepteur liant I'h6moglobine est fonctionnel et essentiel à la croissance ii l'aide d'hemoglobine.

N. gonorrhwue exprime egalement deux protéines liant l'h6mine de masse

moléculairede 97 et 44 kDa Un anticorps mom>clonal dirige contre la proteine de 97

kDa liant l'hdmine a inhibé l'utilisation de l'hemine par la bactérie. Ce qui suggkre que la protéine de 97 kDa de N. gonowbeae soit impliqutk dans I 'acquisi tion en fer sous forme d'hemine ( 122).

Neisseria meningitidb est l'agent causal d'une méningik cér6br*spinale d'allure dpidémique chez l'humain (201). Les protéines liant l'hdmine chez N. meningitidis poseden t des masses molCculaires de 98 et 50 kDa, qui ressemblent beaucoup à celles retrouvées chez N. gonuwhueae (1 17). De pl us, des anticorps ont r6v616 que les protéines de N. meningitidlr et de N. gonorrhoeae sont antigeniquement reliées (120).

Le gène codant pour un récepteur liant 11h6moglobine chez N. meningitidis

du sérogroupe C a tté clont? par compl6mentation dans un mutant E. coli requérant de la porphyrine (201). Ce gkne nomme h b R code pour une protéine de la membrane externe de 89.5 kDa et elle possède une homologie de séquence en acides amin& avec

des rCcepteurs TonB-dCpendants de d'autres bacteries à Gnun negatif. La protéine HmbR est très similaire aux récepteurs de transferrine et de lactofemne des Neheria. Un mutant h b R a aCté incapable d'utiliser l'hémoglobine mais pouvait toujours utiliser l'hthine comme source de fer. Il s'est r6v6lt attdnué dans un mod&le d'infection chez

le rat, ce qui indique que 1'uiilisation de I'hdmoglobine est importante dans la vinilence chez N. meningitidis (201). D'autres clones qui n'ont pas hybride avec la sonde hm bR ont compl4mente un mutant porphyrine E. coli hemA a d ? sur un milieu gdlosé supplément6 en hémine. Les chercheurs suggérent alors l'existence &un second gène

codant pour un récepteur sptkifïque L llMmine chez N. meningitidis (201). I l serait possible que le récepteur pour l 'mine soit indispensable pour lrutilisation de l'hème provenant de l'h6moglobine (120). Cette deuxiéme protéine pourrait avoir le rBle de faciliter voir meme augmenter l'efficacité de la liaison à I'héme. Ceci ressemble au modèle proposé pour le récepteur de la transfemne chez N. gonorrhoeae où la protéine

2 liant la transferrine possèâerait le r8le de faciliter la liaison de la transfemne à l'autre récepteur ( 120).

L'opkron hpuAB de N. ncningitidis codant pour des progines permettant l'utilisation de lthCmoglobine cornplexde B I'haptoglobine a eté récemment caractérisé (126). Une protéine de la membrane externe rdgegulée par le fer de 85 D a , nomme

HpuB, est requise pour l'utilisation du fer provenent de Itht5moglobine seule ou de

I'hdmoglobine complexée à l'haptoglobine. Le géne hpuS a t?té clone et la séquence en acide amine du produit de ce gène a rtvdle un récepteur de la membrane externe appartenant à la famille TonB. Le géne hpuA, codant pour une lipoprottine de 34.8

kDa a etd par la suite identifie (126). La structure de cet opéron suggère que HpuA et

HpuB reprdsente un systéme de rtkepteurs & deux composantes analogue aux rdœpteun de riansferrine TbpA et TbpB. La protéine HmbR s'est révClée etre identique

à HpuB (201). De plus, une proteine péri plasmique liant IWmine a eté proposée chez N. rneningitidis (201).

TaMeau 1. Protéines bactériennes liant I'héme. I'hdmine ou l'h6rnoglobine de l'hôte. -

Bacténe Nomdelaprotéineou Natureetlocalisation Masse Fonction Ré ferenœ du gène molMaire

( k W EschericICiacoli chuA IROMP 69 lie hémi ne (213) 0157:H7 souche EDL 933

lie hème

Haemopliilus HgbA ou HupA OMPTonB-dépendante 100- 108 lie Hb et Hb-haptoglobine (39)

ducrey i tdhA OMPTmB-dépendante 75 lie l'hème (2 10)

H(~mophi1us - IROMP 393 lie Hb et hémine (1 18)

inJuemae type b !ROMP 120 lie Hb et Hb-haptoglobine (101)

H ~ P B OMP 115 IieHbetHb-haptoglobine (168) - piotéine 1 20 lie Hb ( 168)

TaMeau 1. ProMnes bactériennes liant I'heme, I'hemine ou I'ht5moglobine de I ' h h (sui te).

-

BriCne Nom de la protéine ou Nature et localisation Masse Fonction Référence

du @ne moléculaire

protéine majeure, enveloppe protéine mineure protéine mineure

protéi w mineure protéine mineure

protane mineure

protéine mineure

protéine mineure

protéine mineure

lie hémine

lie hémine

lie hémine

lie hémine lie hémine

1 ie Mmi ne

lie hémine

lie hémine

lie hémine

Vibrw - IROMP 88 lie Hb et hémine ( 130)

anguil(amn - ONP 82 lie Hb et hémine ( 130)

RV22 - IROMP 76 lie Hb et hémine ( 130) - OMP 46 lie Hb et hdmine ( 130)

- OMP 37 lie Hb et hdmine (130)

Tablew 1. R&nes bactériennes liant l'hème, I'hemine ou 1 b6moglobim de l'hôte! (suite). - - pp

Bactérie Nom de la proteine ou Nature et ldisation Masse Fonction Réfd~nce du @ne moléculaire

( k W Vibio - OMP 97 lie Hb et héinine ( 130)

0nguiUarm - JROMP 79 lie Hb et htmine ( 130) H775-3 - JROMP 76 lie Wb et héinine ( 130)

- OMP 56 lie Hb et hémine ( 130)

- OMP 46 lie Hb et hemine ( 130)

- OMP 39 lie Hb et hémine (130)

Vibrio choletae - protéine, membrane interne 26 lie Hb et hemine (83) - IROMP 77 lie Hb et hémine (83)

36,s lie Hb et hémine Vibrio vulniificus

biotype 2

drogroupe E souche E86

Tableau 1. Rotéines bact&ie~es liant Iih&me, I'hemine ou I'h6moglobine de l'h8te (suite).

Bacrérie Nom & la protéine ou Nature et localisation Masse Fonction Référenœ du @ne mdéculaire

Yersinia H m R IROMP 78 lie hémine ( 199) enCerditica HemP - 6.5 lie hémine ( 149)

HemS protéine cytoplasmique 42 enzyme, lie hemine (200)

HemT protéine périplamique 27 lie hémine (2m) HenU Pm- lie hémine (200)

W V pmtéine liant I'ATP 24.5 transport hdmine (Zab

3.2.3 Le système hinophore-dépendant

Dans les sections discutées précédemment, les récepteun de la membrane externe reconnaissent directement les compoBes hème, hemine ou hdmoglobine. Une autre f v n d'obtenir ces composCs impliquerait la sécr6tion d'une protéine, denommée hemophore. liant l'heme, l'hdrnine ou l'hdmoglobine retrouves dans l'environnement; lriemophore transporterait ensuite ces composés à un récepteur spécifique localisé dans la membrane externe (66). Ce système d'acquisition du fer provenant de l'hkme, de l'hdmine ou de l'htmoglobine se nomme systéme h6mophore-dependant et il a et6 detecté jusqua maintenant chez H. influenzue (23). Sewatiamarcescens ( 123) et E. coli souche EB 1 (154).

L'utilisation par S. marcescens de l'hème lie il I'hkmoglobine requiert une protéine extracellulairede 19 kDa liant l'hème, dtnommde HasA (123). Selon les chercheurs, HasA servirait d'intermédiaire vehiculant ainsi l'hème au rdcepteur de surface pour I'intemalisation subsequente. La proteine HasA est sécretée via un système ABC transporteur et la chaperone SecB serait impliquée dans la sécrétion de cette protéine (33). Les travaux de Létofft? et coll. (124) ont permis l'identification chez

S. marcesceas d'une protéine de la membrane interne. HasD. possédant une cassette

liant I'ATP, et d'une deuxième prottine de la membrane interne, HasE qui serait probaôlement la protéine de fusion. Les génes HusA, HaD, et tkirE appartiennent au meme opéron et Fur semble reguler la transcription de cet opéron (124).

Ce système d'acquisition de l'héme chez S. marcescens a eté égaiement dtudit-5 chez un mutant d'E. coli hemA posddant du défauts enzymatiques dans la biosynthese de l'tkrne et ne pouvant pas alors utiliser les supplements d'hème exogène pour croître (66). Ceci implique que ce mutant ne possède p de système de transport de l'hème à mven son enveloppe cellulaire. Des etudes & complementation ont mis en

Cvidence une OMP régulée par le fer de 92 kDa, denommée HasR, qui il elle seule a permis au mutant E. coli hemA de c r o h avec de I'heme ou de l'hémoglobine comme seule source de fer. Ceci indique que HasR est essentielle à l'acquisition de l'héme provenant de Ili~moglobine. La s&r&ion de la protéine extracellulaire liant l'hème HasA par le mutant E.cofi hemA n'a pas permis il elle seule la croissance l'aide drihne ou d'hémoglobine dCmontrant ainsi que cette proteine ne semble pas essentielle

au système. Fàr contre la sécrétion cancommitante & HasA par le mutant E. coli hcmA produisant HasR a grandement facilite l'acquisition de l'hème provenant de

11h6moglobine. Sa sCcrétion a en effet raduit de 100 fois la concentration minimale d'hemoglobine satisfaisant les besoins en porphyrine de la cellule. Les chercheurs suspectent que la protéine HasA, tout comme un sidérophore, pourrait lier l'hème OU

l'hémoglobine de l'environnement et delivrer ensuite ces moldcules P une OMP spécifique p u r le complexe hème-HasA. Cette enide constitue le premier rapport demon tran t une synergie entre une OMP, HasR, et une protCine extracell ulai re liant lth&me, HasA. Cette demitxe jouerait alors le r8le d'un transporteur de llhii!me et les chercheurs l'ont nomme un hemopbore.

Ho influemue type b souche DL42 est egalement capable de lier l'heme complexé à l'hérnopexine (79,226). Une pmeine de la membrane externe de 1 0 kDa, nommée HxuA, a dté identifiée chez Ho influenzae type b comme eiant un rtkepteur de

l'hème complexe à I'hémopexine (79). Cette protéine semble fonctionneUement consent& panni les souches dlH. irrfluenzae et s'est retrouvee egalement dans le surnageant de culture (23). Des investigations gCn6tiques ont defini une série de ghes impliques dans le processus (24). L'analyse des mutations a incrimine trois gènes, nomme hxuB, huC, et hxuA, dans l'utilisation de l ' hhe cornplex6 à I'hémopexine

(24). Les @es k u C et hxuB codent pour des OMPs. La protéine HxuC de 78 kDa s'est r6velee similaire aux OMPs TonB-dependantes appartenant d'autres bacteries. Alors que I'OMP de 60 kDa, d6nommée HxuB, est similaire à lliémolysine ShlB de S.

murcescem. Des mutants de chacun de ces génes ont et6 construits et aucun n'a &te

capable d'utiliser 1Wme complexe à lthémopexine. La protbine HxuB semble etre

impliquk dans le relâchement de la mdécule soluble HxuA. Alors que l'expression de I'OMP HxuC semble requise pour l'utilisation de lfh&me libre à faible concentration par H. injlwnzue type B. Un scénario ressemblant à celui proposé pour la protCine HasA

de S. marcescens serait alon possible pour H. influenasu type b. L'acquisition de

I'hiime complexé à I'hémopexine serait don en partie medide par la liaison de ce

compost? B la f o m sécrétée de la protéine HxuA (120). Ce complexe se lierait ensuite à

la surface de la cellule bactérienne via d'autres rthpteurs: les protéines HxuC, HxuB

ou bien les protéines deja dCcntes de 57,38 ou 29 kDa (226). Une liaison directe entre l'hème cornplex6 à lhémopexine et la membrane externe pourrait également se réaliser ind6pendarnment de la protéine HxuA, et pourrait représenter une méthode directe de liaison de hème cornplex6 B ltht5mopcxine (120).

Otto et c d . (14)) ont caracteris6 une protease de 110 kDa liant I'Mmoglobine de la souche EB 1 d% cdi provenant d'une infection de plaie intra-

abdominale chez un humain. Cette enzyme apparait etre egalement une protéine liant I'htme. Une purification par affinité de cette protdine bifonctionnelle a pemis d'identifier le produit extracellulaire du gène, puis de cloner et d'anaiyser ce gène. Cette

protéine semblerait interagir d'abord avec l'hdmoglobine, puis la dégraderait et subséquemment lierait la molécule d'hème relilchée. Ces résultats suggèrent que la protéine serait impliquée dans l'acquisition de l'hème provenant de l'hémoglobine. Cette prothe appanient à la classe IgAl protéase-like, plus précisément il la famille

Tsh. Elle serait portée par le plasmide de virulence pCoWI00 de 144 kpb et serait sécr6tée comme un précurseur polypeptidique. Sa translocation à travers la membrane externe et son clivage subséquent semblerait etre très rapide. Son transfert B travers la membrane cytoplasmique serait un processus plus lent. Les chercheurs suggérent que cette protéase liant l'hdmoglobine est une proteine autotransporteur. Les autotransporteurs sont de larges polypeptides organisés en domaines fonctionnels et sont eventuellement tmnsloqués ii la surface de la cellule. Les fonctions de translocation ndcessaires seraient exécutées par son précurseur polypeptidique de 148 kDa. Le domaine B du précurseur serait responsable pour le vansport final de cette protéase de

110 kDa à travers la membrane externe. Une &tude présentement en cours vise à

determiner le ou les récepteur(s) membranaire(s) de ce système. Les chercheurs suspectent qu'un récepteur de 1Wme de 69 kDa (213) pourrait possiblement jouer ce r61e.

3.2.4 Le transport bactlrlen de IthLme, de I'h6mlnt et de Iihémoglobine

Chez les bactéries à Gram ndgatif, le fer doit &tre transport6 à travers la membrane externe pour atteindre l'espace périplasmique; il doit ensuite se deplacer du

périplasme au cytoplasme (1). Les evenements succédant ii la liaison entre l'hiime, l'hdmine ou lih6moglobine et leur(s) récepteur(s) bacterien(s) commencent à se ddfinir. La dissociation du complexe récepteur-hème, hemine ou hemoglobine semble un Mnement spontant? requdrant peu d'énergie (195). Lth&me semble être ensuite activement transporté à l'intérieur de la baciene (26.32.62.84).

Une fois l'hème P la surface de la cellule bactérienne, il peut alors traverser la membrane exteme de deux façons. Le premier système de transport serait dependant de la protéine TonB et permettrait ainsi le transport de l'héme B travers la membrane externe (120). Les informations suivantes supportent cette théorie: la prCsence d'un gène TonB ou de son équivalent (99). la présence d'une boîte TonB (1 1 1, 199.20 1),

l'homologie stmctwale avec d'autres protéines TonB-ddpendantes dt?j& caractérisées (83, 11 1, 199, 201) et la présence de protéines ExbB, ExbD et TonB (98). L'autre mécanisme, peu répandu, n'entraînerait pas le relachement de l'hème & la surface cellulaire mais impliquerait plut& le transfert du complexe héme-récepteur à travers la membrane externe comme il a dîé demontré pour la proteine de la membrane externe de 26 kDacha Porphyromonasgingivolis (15). On ne sait pas encore si ce méwiisme est TonB-independant (120).

L'effet oxydatif de lih&me libre laisse supposer la prtsence d'une protdine de transport flriplasmique permettant de véhiculer l'hème du périplasme au cytoplasme bactt?rien ( 120). La découverte, chez YersUiia enterolitica, des composantes formant un ABC transporteur contr6lé par trois gènes (200) a confinnt5 cette spéculation (120).

Une lipoproteine de 51 kDa, nommée HbpA, a et6 identifiée comme étant une composante périplasmique chez H. infruenzae type b (78, 80). Alors que chez Vibrio

clwkrue une composante de la membrane interne de 26 kDa serait Cgalement une candidate pdriplasmique (84). Une pennQase, comme celle ddcouverte chez Y. enten,lirica (200). permettrait ensuite l'entrée de l'hème dans le cytoplasme.

Plusieurs événements difftrents peuvent arriver à lfh&me une fois B l'inierieur du cytoplasme. Certains de ces évenements sont l'incorporation directe à

l'intérieur des hémoprotéines, ou liùération du fer de l'anneau porphyrique et l'entrée de ce Ter dans le pool de fer inorganique de la bactérie (120). Cette libération wuiert la présence d'une enzyme degraciant l'hème, probablement une homologue de l'héme oxyghase. Un &ne codant pour une protbine possédant ce genre d'activité a die isole chez Y. enterolitica (300).

Les facteurs gouvernant le trajet de l'hème à travers les différents compartiments de la cellule tract6rienne demeurent encore peu compris (120). Le fer joue probabiement un rôle primordial dans la régulation de l'expression des protéines impliquees dans l'acquisition du fer provenant de l'hème. de lthdmine ou de

I'hdmoglobine. L'expression de plusieurs protéines telle que HemR ( lB), Hu tA (84).

et k reCeptew hhe-hdmopexine (226) est augmentée dans des conditions de restriction en fer. Loque la disponibilite du fer est restor&, la synthèse de ces protéines est alors réprimée (120). Des recherches ont identifie une séquence Fur localisée en amont du

codon de depart chez W C (23), hemR (199), et liwA (83). De plus, l'identification chez N. mningitidis (108.21 1) et N. gomwIioeae (10) d'un homologue Fur confirme

que ce dpressw gouverne par le fer est Cgalement fonctionnel chez les pathogènes appartenant h la famille des Neissericiceue. Chez H. infuenzue, Ith&me satisfait des demandes en fer et également une indispensable demande en porphyrine (26). C'est pourquoi un autre système de régulation impliquant l'héme semblerait exister chez cette

bactérie (79, 139).

3.2.5 Mdthodes mettant en ividence I'actlvltL liant I'hime, 19h6m&ne ou

Il hémoglobine

Plusieurs etudes ont examind l'activité liant Ifhéme, I'hCmine ou I'h6moglobine chez differentes espèces bactériennes ( 120). Ces diff6nntes mdthodes se veulent être

qualitatives ou quantitatives pour la bacterie entiere et nous permettent donc de

visualiser ou de quantifier la liaison de lth&me, de l'hdmine ou de l'hdmoglobine par la bactérie,

L'ac tivi te liant l'hémine chez Leg ionelfa pnemwphifa, A. pleuropncunoniae, P. gingiwlis et H. influenzae Type b a été mise en dvidence par une methode liquide où

l'analyse des résultats est efftxtuée par spectrophotom&ie (34,62, TS). Elle consiste h

mesurer indirectement l'activitd liant l'hdmine ou Ilidmoglobine en quantifiant l'habileté de la bacterie à enlever ces composés d'une solution dont la concentration en hdmim ou en hdmoglobine est bien connue. Une concentration fixe de bactérie est exposée P une concentration croissante d'hémine ou d'hémoglobine. Après incubation et centrifugation. l'absorbante du surnageant est obtenue à l'aide d'un spectrophotomètre P une longueur d'onde de 400 nm. Une solution d'hémine ou d'hémoglobine sans ûactt?rie dont on connaît la concentration et la densité optique sert alors de contrble. Il

reste ensuite à etablir la quantité d'hémine ou d'hémoglobine qui n'est plus dans le surnageant mais plut& liée à la bacterie. L'activité liant l'hémine ou llit!moglobine est donc inversement proportionnelle ii l'absorbatice du sumageant.

L'activité liant I'h6mogiobine chez PrevoteUa intemedia et P. gingivalis a dtt!

ddteminée par liaison directe en utilisant ltht?moglobine humaine radiomarquée ii l'iode12 (3,62, lu). Le principe de la technique est dïncuber des concentrations croissantes d'hémoglobine marquee il une quantite precise de bactéries. Les échantillons sont ensuite dtposés sur un gradient de sucrose puis centrifugés. La radioactivité est ensuite ddterminée par un compteur gamma. Les résultats sont analysés

par un progrme nomme "Equilibrïum Binding Data Analysisw .

La liaison de l'hémoglobine par des souches d'E. coli, dtHaemphilus et de Neisseria a €te quanti fite par des tests d'immunobuvardage en utilisant de I'hCmoglotine biotinylée (20.2 1, 49, 101, 12 1, 129, 2û2, 226). Le principe consiste à

effectuer des dilutions en série de cellules bacteriennes entiéres et de les ddposer sur une membrane de nitrocellulose. Une concentration préd6tenninde d'hemoglobine biotinylée est ensuite ajoutée. La membrane est incubée avec un conjugut avidine ou streptavidine qui se lie alors avec la partie biotinylée de lriémoglobine. La réaction est r&v&?e grilce au substrat, le Qchloro-1-naphthol. Ce type de protocole a C t é @lement utilisé pour doser l'activiie liant l'hémoglobine chez N. meningitidis et P. gingivalis

(58) avec de I'hCmoglobine marqude à la peroxidase. Aprés la rkvelation, les immunobuvardages sont quantifies en utilisant un densi tomeue.

LtactivitC liant Llibme complexé & lthtmopexine a Ctt dCtennin6e chez H. influenzue. De l'hkme coup16 h de lthémopexine humaine a Cté marque ii la radioactivité à l'aide d'iode 125 et a Cté utilisé dans une methode d'immunobuvardage sur ce1 lules entières (23). Des empreintes de colonies bactdriemes sont effectuees sur un papier filtre Whatman. Le filtre est ensuite incuM avec le complexe héme-hémopexine- iode125. Après lavages le filtre est autoradiographie. Cette technique a &té Cgalement utilisée pour mettre en Cvidence l'activité liant i'htmoglobine chez H. duncyi B l'aide d'hémoglobine humaine radiomarquée à l'iode 12s (39).

La liaison de lth6moglobine porcine il la surface d 'A. pkuropneumuniue a CtC

prdc6demment demontrée dans notre laboratoire par microscopie tlectronique &

transmission (7). Une goutte d'une suspension bactérieme est placée sur une grille qui est par la suite incubee en présence dWmoglobine porcine. Les grilles sont ensuite incubees avec un antisérum de lapin contre l'hémoglobine porcine puis incubBes avec

un antisérum contre des IgG de lapin conjugué B des particules d'or. Puis les grilles sont colorées par coloration negaiive au phosphotungstate et examinCes à l'aide d'un

microsfope 61ectrcmique h transmission.

Jusqu'a présent, aucune dtu& ne mentione l'utilisation de la cytomdtrie en flux afin de quantifier l'activité lianie de chacune des cellules d'une population bactérieme.

AiticIe 1:

ARCHAMBAOLT, Marie, Martin Olivier, Bernadette Foiry, Moussa D i a &nia-haine Riradis et M o Jacques.

Effeçts of' pig hemoglobin binding on sunc physicai and biological properties of Actinobacillrrspietuopneunwniae Lipopoiysaccharides.

Joumai of Endotoxin Rcsearch 4 5365,1997.

Rg and h u m Hb, uid polymysin 0 nilfrte were 0 b W d fiani Sferm C h e Co., St Loulr, MO, USA. Dliiiy- w u obulncd fioni Molcculu Rokr @ugene, OR, USA). LPS fiom S l t m ~ ~ I l t r mkIICIo(. (salmth and Re 59s) rnd EtrfiirrScfiiir adi(Olll*Sa uid RdF583) w a t obubKd from Slgru.P@rnd hwiuiHb riodrsoiudorir(1~iiir)rmcprpucdinendouxh kwncr (k rodr t~~ofC IpcCod,W&Hok ,MA, U S A ) r n d ~ b t h u i 0 . 6 N / m l d ~ u -by=

Continuous sucme dendty grdents (12 ml; 5-20%) wctc prrpucd in 0.05 M Tris and 025% dmxycholic rdd in pyrogen-ircc wrtcr. LPS fiom A. B, final concentmion of 1 m&/mi, w u rddcd to r p@ Hb solution of 10 mg/d and the mfxnin was incubned for 1 h rt 3TC. Aliquots (100 pl) of LSSHb mimtrrs, IPS done, or Hb done wm rhcn tyereâ over r waow p- dient and camifiaged rt 52 000 g fa 4 h in a Bcdmirn L M 5 ultracentrifuge r SW28 mot. Foliowlng cen- ffigrtion, the tubes were puncnirrd d 1.5 mi k- tionr were coIIec!ed uid a d p e d by gel ckcirop-

Murine mauophages, ceil Une J774, wm cultutcd in RPW-1610 (Cibco BRL, Burlùigion, Onurio, Currda) m u t phenol containing 1046 heat-Wvated FBS (HyQone l.boratories hc, ïqp, VT, USA), 5% Lduu- mllK (Gibco BRL) and 5% penidliin-streptomydn (Wbco BRU, nimulrtcd with A. plcwrppiini111011ior ~totypc 2 LPS pnincubrted or not with pig Hb, uid ruryed for production of nitek d d e (NO;) as daAkdn Adhuent mrerophap monohyers w m obuhed by pkting the C& in 24-well mfcroiti~r ph- (Fdcm 3047, Dicûhon hbwuc, Uncoln Puk, NJ, USA) at 5 x 101 cclWmll f a 4 h at 37C in 546 CO, and manohyas wae thaiwuhcdwithwumculturemedium.Ceflr~then a p e d to dilutionr of LPS (1 Wxnl to 0.001 @mi) pdncubricd(30min)ornotwithpigHb(l mgMori0 mgiml) for 24 h rt 3fC in 5% CO, Foilm incubation, mn cuhurr NW- t- CO- md NO,- pro ducibn detmaintd by the Grri#' lemion. brkby, J Iquouof3oO~wt fe r rmovcdEronr~ t io r icd mcdhimrndineubrtednithur~voIwuofCnirt' mplt (1% @If&) s lmuihw d 0.1% (whr) lu* thplcthy- - in 215% Pt- p h a k d d ) n r # i a n ~ f i 1 5 m f a , A k o i b i n c c wm&mmind withrnmtOmnrd~&n 540 n m C e l î r n c d i u n r ~ r k o r b r n e c & 5 1 0 n m . r rh ieh indudtdr~tdrkarbumdwioHb, w r r r u ~ f i e u h n d f a g N 0 , - c o n c # n n i o n w m k t e d d b p ~ r o d h i m n i a f i c m r a r r n d u d . Ibcprodunia i~~aprnrrd~8 i iM/ f~ l ( isEc lk

SiKC ce& of A. plcwnpwumollhw apprnd to k coated wfth pdg Hb rfter o shmt incubrtion pid, we ihen cktmnind whcther bindlng of pig Hb to whole ce& iRtcrftn with rht accessiwty of mtibodies to surface rntigenr, Cells, incubtcd with or without pig Hb, wen iirututeâ with monoclod uiübodies rgrinst 0- or cap nilu-anrfgeri~ and alulyzed by now cyrorncrry. Figure 3 shows represenutivt flow cyiomcuy proNes of whole ceils of A. plcwropireuinoiirrir incubrttâ or not with pig Hb, The 1~ECIfjbility of LPS û-uitigcn m. 3 0 ) or cap rukr mtigens (Fige 3 C, D) to uitfbodies did not seem to be affected by r pre-incubation with pig Xb, since the flu- orrrccnct panems (Fig. 3Bp) o M e â wen s i m h to the fluorescence patterns of conml cells not grc-incu- bMed with pig Hb (Fig. 3AC).

lhfr experirnent was conduad to cvaiurte the des of pi& Hb binâing on the morphology of U S qpgates. Mokcukr rggngates of A. ptrwiopficwfiumiar extractcd LPS rppemd as dbbons of rpprOdlIlltety 12 rn widt in the a b c e ofpig Hb (Fig. 4 4 as pmrfously describdto Incubation of pig Hb with cnncred LPS for 1 h multtd in the dhgpgation of tPS into rmrllct r%gcgries (Fi& dB). Mer a longer incubation pcriod (18 h) with p@ Hb, and1 spherid pUrrc1es which Kcm to k micelks m m obwrveâ (Fg. 4C). nit e fkt of pig Hb on 19s w u h m from the hexagonal Lttîce observecl when A. - m i o r tPS w u incubrtcd with polympin B

40).

~ininroîA.plciriiPpiin#iimirc~2IPSuidpie H b w m e I i y c n d a v r r r s u ~ ~ ~ A f i a u l m c c n - tnnyrtbn and SDSPAGE. Wutetu b&t was p u f i i r o ~ t h e d i r t r l b u t b n d L P S f n t h e ~ t tirrrroiutPSdone#dfaKiiudinto.tlfiKIlont~~A, b i-8)dthtnnto#gdknt,rrhciurmortdtk

LPS in Hb/LPS mbnuns (Fig. 58, h e s Z8) had a sedi- menution rate similm to that of' Hb donc (Fi#. SC, iants 74). Mort of the Hb hwn HblUS mixtures (Fi& SD, lrncs 73) d Hb done remhed in the top Lycr of the su- paâknt. Simil.+ rrnilts wen obtainecl with A. m m o l l i u mxype 1 LPS. 'lhnrfotc, incubation with pie Hb irkacucd the dciurty of WS, rcnihing in a ditrmnt migmïon of IPS in a ntcrorc gmht,

cahuiccment of nublc~ccnee Lntcndty which lo indiu- dvedintmcrion of DC with Upid A. 'Ihc mrrinui Glue ~ o f D C w a s r d i i ~ ~ e d w i t h 2 0 ~ m i o f A -lac lipid A. The dâition of polymydn B œpigHbtothemiriundUpidAuidDCrCIUftdhur menurtion of fluorescence intendty (Tic. 6) which b idkative of the dispkement of bound DC to Upid A by !haecompoun&

We c o m p ~ d IPS done and tPSHb complues for rMUty to h a s e murine n i r c r o p ~ e s NO; nleuing uplcity. IPS done (0.1-1 (ig/d) inductd subrunttl NO; mlew (Fig. 91, whtnas incubation of LPS (0.1-1 r%d) pie Hb (1 qw) dsniscrntly dmmed reltase of NO;. Incubation of LPS with pie Hb (10 Wml) d t e d in NO; produetion dniifat to the W- gound Ievel (macrophages done in RPMI-1640) (data not rharm).

Article 2: ARCHAMBAULT, Marie. Sttphane Roux et Mario J'ues.

Evaluation of the hanoglobin-binding activi ty of Acn'11obocilfkrp&woprteumoniue

using fluorescein-labeled pig hemoglobin and flow cytometry.

FEMS Microbiology Letters 173: 17-25.1999.

FEMS Microbiololy LAttrn 173 (1999) 17-U

Evaluation of the hemoglobin-binding activity of A ctinobacillus pleuropneumoniae using fluorescein-labeled

pig hemoglobin and flow cytometry Marie Archambault, Stéphane Rioux, Mano Jacques

G m p k Rechrrrhc sur tes Mu1udie.f Infertinu*~ aû Porc. and Diprtrmrnt & Parhvlogir cr Midio iogi r . FacyI~i k Mikrinr C'iririnatre. tinirrrrire & Adontriai. CP. 5400. St-&orinriK. QW. J2S X d . C m &

In the pmcnt studp. the hcmoqlobin (Hbbbinding activity of Acfinobucihs pleuropneumoniae was examincd using fluorescein-lakled pie Hb and flow cytornctry. Cornparison of the Hb-binding activity of A. pkurop~un~ottia~ erotypr 1 stnin 4074 q o w undcr iron-mtriacd conditions vrith œlls pown under iron-sufiiuent conditions indicatcd that iron- mtriction in A. pleuroprieumonia~ promota the cirpmsion of' Hb rcctpton, and that Hb-bindin~ activity is, at leart in pan. iron-mpmsible- Hb-binding activity was also obrrncd in npmcntatiw nnins of A. plruropwumoniae klonginq to Krorypcs 1 and 2. In addition, A. plmtopneunronia~ serotypc 1 LPS or capsule isopnic mutants wert tesied in flow cytomctry in ordcr to undentand the influence of surface poiysaccharida on Hbbinding aciivity. fipcrimcnu with on aapuiatcd mutant indicattd ihat surface moleculcl with Hb-binding aaivity arc more crposrd rt tkœU surface in the absence of crpsular polymccharidcr. Houmer. tthc Hb-binding aaivity of LPS mutants rnaIyzcd in this study was unchanpi cornparrd to the pamt stmin, The ouicr membrane prorcins profile of A. plruropneun~ouiae serotypc 1 grown undcr iron-mtrictcd or iron-suficient conditions was also cvaluatcd by polyacrylamidc p l clmrophorcris. Iron-nguhtcd outcr membrane proteins w m obwrvrd undcr iron- testrictcd growth conditions which s u g w s thrt one or mon of these ouicr membrane proteins m y piay a rok in the Hb binding activity dctcctcd by flow cytomctry. Q 1999 Fdention of Europcan Microbiologinl Socictier. Publishcd by

b

Elsevier Science B.V. All rights mcrved.

1. Inrroluctioii exocrine secretions and most of the intracellular iron is scqucrtetcû as hcrnclcontaining protcins, such as

lronisaneucntialnutrientforbactMalgrowth. hemo~obin(Hb)[1).niisqucornitionlimitstht In the host. ertracellular iron is bound <O the imn- rvaiiabiliiy of fnc iron to knls klow that mquired binding giycoprotcins loctoferrui and transknin in to nippon microbial growth (il. Homvcr. to survive

in the hosi, boctcriat pethogens have evolved diffcr- cnt hifi-iffinity iron-acquisition rnechanisms de-

*- a Cantrponding autha. ~ e l . : +I (450) nuni. rit. 8348: a m to o b h i n ~ ~ One s h wm a m ~ -

Fu: +I (4W)) 778-8108; E-mri~:~uni@mcdwt.umonvc~).a the ciaboration of sidetophores that chclate cxiemal

iron followeâ by binding to thcit copatc receptor and subsequcnt intcmalization. Anothcr systcm uti- lises a receptor-mediateû rnechanism to aquire iron from lactofcnin. trandemn or hemecontaining pro- teins [12].

Acrinohcillus pleuropneu~tomiae, a member of the Pastcurcllaceae family, is the causativc agent of por- cine plcuropneumonia. Among the 12 serotypcs tec- ognized, scrotype 1 is important in North Amcricci, whilc scrotype 2 is dominant in many Europcan countries 133. Scvcral bacterial componcnts, including RTX toxins, lipopolysaccharidcs (LPS), capsular polysaccharides. outcr mcm branc protcins (OMPs). and proteases appear to contribute to tbc disase proccss [4]. WC and othcrs dcmonstratcd that A. pleuropneuntoniae can utilizc pig Hb as a sole murcc of iron for growth in vitro [5,6]. We reccntly rc- portcd the binding of pig Hb to A. pleuropneunroniae LPS (5.7) and hypothcsùed ihat iPS might perform a 'docking' funcrion. We also suspect that surface protcins arc thcn involvcd in the iron uptakc from pie Hb.

Recent studics havc examined diffcrcnt bactcrial spmspmcs for Hbbinding activity using dot blot assays and biotinylated-H b (8.9) horseradish pcroxidasc-Hb conjuptc PO] or lz5I-H b [11.12). Western blot assays using radioiodinated-Hb [13] or radioiodinatcd- hemc :hcmopexin [14] and spcctrophoiomctrical mcthod (1q werc also uscd to dctcnnine the Hbbinding activity. WC havc prcviously visualitcd the binding of pie Hb to a limitcd numkr of cclls of A. pl4uropneunioniae uang immunogold lakling and elrctron microscopg [q. To the bcst of our knowlcdge, no study has used flow cytomctry to cvaluate t he expression of Gram-ncgativc bacterial surface molcculcs wit h Hb-binding activity. In the pmcnt study, fluorescein-labelcd pig Hb was pncr- atcd and usd in flow cytometry to quantify the H bbinding act ivity of A. pleuropneumonim.

2.1. Bac~erid isoiates. isogrnic mutants, a d groirth conditions

A. pieuroplieumoniae rcfcrencc s t d n s of srotypc 1 [ m i n 0074; semi-rough LPS profile) and seratype 2

(strain 4226; smooth LPS profile) wcn providcd by A. Gunnarson, National Veiennary lnstitutc, Upp- sala, Swdcn. A. pieuropneuntoniuc field isolates of rcrotypc 1 (FMV 87-682; semi-roua LPS profile) and serotypc 2 (Q 87-981 : rough LPS profile) wcrc uwd in prcvious studics [S), Bactcria wcn grown in brain hcart infusion liquid medium (BHl; Difco, Dt- troit, Ml) supplemcnted with 5 pg of NAD ml''. To obtain iron-mtricicd conditions, the culture medium was supplemcnted with 36 pg ml" of defcrratrd EDDH A (eth ylencdiaminc di-eh ydroxyphcny lacetic acid; Sigma, St. Louis, MO) [la. Cultures were in- cubateâ at 37OC for 18-24 h in a 5% COr atmos- phcrc.

In some cxperiments, isogcnic mutants of A. pieu- ropneumoniae obtained by mini-Tnl0 transposon mutagenesis [17) werc used in flow cytomctry. A na- lidixic ocid-tesistant mutant (4074 NalR) was isolatcd from A. pleuroprteunroniae scrotypc 1 nfcrencc strain 4074 and uscd as rdpicnt strain for transposon mu- tagentsis, whilc fichericltiu coli S 1 7.1 Apir (PLOF/ Km) was used as donor strain. Mutants 15.1 (rough LPS), 5.1 (LPS with a rnodified corc-lipid A rcgion showing a faster migration on Tricine-SDS-PAGE), and 33.2 (without capsule) were pown on BH1 agar plates supplcmentcd with 15 pg ml'' of NAD. 30 pg ml'l of nalidixic acid. and 75 pp ml-' of kanamycin. Plates wcrc incubatcd at 37'C for 18-24 h in a 5% CO? atmospherc.

2.2. iubeling of pig Hb iritlt fluorescein

Labeling of pie Hb with fluorescein was donc us- ing a FLUOS lakling kit accordinp to the manufac- turer's instructions (Bochrinpcr Mannheim. Laval. Qui., Canada). The molat ratio was set after stand- ardiitation al 1 :100, i.e. I molecule of Hb w s rnixcd with 100 molcculcs or FLUOS. Bricfly. pi$ Hb (1 mg; Sigma) uïis dissolved in I mi of phosphate-buf- fend saline (PBS 0.01 M, pH 7.4). A volume of393 pl of a FLUOS solution (20 mg ml") was addcd to the Hb solution (1 ml) and incubated in the dark for 2 h at room icmpemturc with gentle agitation. Hb- FLUOS miction mix was tbcn applied to a Sepha- dcx Cà-25 column and mnaining. non-reactcd FLU- was separaicd by gel filtration. To awss h m rpcificity, bovine Hb (Sima) was also laklcd recordhg to this protocol.

Ovemight bacterial cultures wen washed and re- suspendcd in PBS to an Awo nm of 0.2, quivalent to approximately 10" CFW ml']. A volume of 1 ml of bacterial suspension mas distribuied in cach Eppen- dorf microtest tubes which wcre then ccntrifuged at IOOOOxg for 10 min. The pellets wctc muspendcd in 450 vl of PBS and incubaied with 50 pl of FLUOS*Hb (final dilution 1 :IO) for 60 min ai 37'C. Cells wcrc washcd threc tirnes in 700 )il of

PBS and ccntrifugtd ai 1 0 0 x g for 10 min, thcn the pellets w c n fixcd with 2% parafonnaldchyde. Cclls were kept in the dark at 4.C until analyzcd by llow cyiomctry as pmriously descrikd 11%). The flow analysis was pcdonned with a FACStar flow cytomcter (Becton Dickinson Immunocytomttry Sys- rems, San Jose. CA) quipped wiih a watcr=coolcd 2-W argon ion laser oprating ai 488 nm and a 2001 mW light output. Suspensions of cclls of A. pleuro- pneumoniae that have not bccn incubatcd with FLUOS-Hb sewd as controls. Bacterial cells wcre

IiCiik-

Fi& I. Fiaw cytomciry andysiz of A. plMoprmonirr rroiyp 1 rd- anin 4074. Biciciirl cells wm p w n undrr itan-miriricd condilions and incuùatcd wlih 1:s (Cl. 1 :IO (Dl. 1:Sû (El. or 1 :IO0 (FI âüuiions or FLUOSHb ôactciirl œilr mi incubaird 6 t h FLUOSHb (Al or iacubaitd wiih unhùckd pis Hb (Bi & u conttdL-

rlso incubottd with unlaklcd pi8 Hb to detcrminc whether Hb, by itsclf. possesl~s a fluorescent activity.

Outer membranes from A. pleuropneumoniae nfer- aicc stnin of serotypc 1 (strain 4074) grown undct iron-sufficien t or iron-mt rictcd conditions wcrc ex- tractcd and isolatcd by the mcthod of Elkins (121 with some modifications. Briefly, whole A. pleur+ pneun~oniae cells wcre disrupted with a French press. Intact cells and cclt dcbris wcn mnoved by centri- fuwtion at 12000xg Tor 10 min at 4OC. The super- matant was then subjected to centrifugation at IûOûûû xg for 1 h at 4'C which yicldcd a total mcm- branc pellet. The pellet was rinscd twicc with watcr without disturbing the pellet and was solubilized nith 1% Sarkosyl at room tcmpcratun for I h with rocking. The suspension was subjccttd to ccn- trifugation at lOOOOOxg for 1 h at 4°C and the Sarkosyi-solu blc cytoplasmic mcm branc supcmatan t was discarded. The Sarkosyl-insoluble pellet was rc- suspendcd into 1% Sarkosyl and thcn ccntrifuged. The pcllct containing outcr mcmbrancs was storcd at -ZO°C for further cxpcrimcnts.

2.5. Ele~~crropltoresis a~nd H'rrtern blor anal)-sis

Outer membrane protcins from A. plmropneunto- niae rcfcrcncc strain 4074 of sctotypc 1 grown under iron-suficient or iron-mtrictcd conditions wcrc an- alyzcd by SDS-polyacrylamidc gel clcctrophomis (SDS-PAGE)- The SDSPAGE was conducted by the discontinuous buffcr systcm of Lammli, with a 4.5% polyacrylamidc sucking gel and a 123% poly- acrylamide running ecl (7j. Samples were boiled for 10 min in solubiliration buffet (62.5 mM Tris-HCI, pH 6.8, 2% SDS, Iû% BJycerol, 5% &mercaptoctha- 001, and 0.025% bromophcnol blue). Prcstaincd low mokculrr mass markcrs wcm obtaincd from Bio- Rad (Miuissauga. Ont., Canada). Gels were run in a MinlPROTEAN II vertical slab clcctrophomis œll (No-Rad) and then staincd with Coomassk bril- fiant blue R-250 or ttrinsfed to nitroccllulo~ mmihnes for Western immunoblotting as pnvi- owly d d k d (t). ftK membranes mre t&ii incu- batcd with antiùodies from a pig errprimrntolly in-

fccted with A. plruropneumniae serotypc 1 (kindly supplieâ by M. Gottschalk, Faculti de Midecine Vétérinaire, Univeniti de Montrial, St-Hyacinthe, Canada).

Flow cytomctry mults werc expresscd as percent- agc of gaicd f!uorescent evcnts which is the percent- agc of fluorescent œlls out of 10 OOO cclls. The mode is the point of maximum frtqucncy; i t rcprescnts the most elcvatcd fluonscent intcnsity of the majoritp of cclls. All cxperiments wcrc pcrformcd at lcast twice and amples wcre always donc in duplicatc. The modes and the pcmntagcs of gatcd fluorescent cvcnts werc cxprcssed as mcan f standard error (mean f S.E.). The significanct was cvaluatcd by the two-tailcd paited two group Studcnt's t-test with n=4. Results wctt considercd sipificantly difi fcrcnt if P < 0.05.

3.1. E~~uIuarion of the Hbbinding acriiliry of A. pleuropneuntoniae serotjpe I siruin 4074 using FL UOS- Hb

Prdiminary cxpcrimcnts to dctcmine the appto, priate FLUOS-Hb working dilution which allows optimal labcling of A. pkuropneunroniae serot ypc 1 main 0074 in flow cytometry wcrc donc using 1 5 . 1 : 10, 1 :XI, and 1 : 100 dilutions (Fig 1C-F). These histosfams showcd a progtcssivc demase in the duomccncc intcnsity of the bactcn'al cc11 population as the dilution of FLUOS-Hb was incteascd. Whcn cells wre pown under iron-rcstricted conditions to mimic host environment whcrt iron availa bility is limitai, and then incubattd with the FLUOS-Hb dilutions meniioncd above, 93.7 f f .8%, 92.2 2 1.60/0. 828f 6.5% and 69.2f 12.1% of the bacterial cell population wos recordcd as duonsccnt cvcnts. re- spectively (Fie. IC-F). Suspensions of œlls of A. pleurop~enntoniue ihat bave not b e n incubateci with FLUOSHb rcrvcd as controls (Rg. LA) and prcmtages of duoracent evcnts wcrt always undcr 8%. Bacterial œlls that wcn inaibatcd with unla- kkd pi^ Hb se- rlro as controls throughout

the study and perccntages of fluorescent cvcnrs wen du, undcr 8% (Fig, IB). Pctccniagcs of fluorescent wcnts of A. pleuropnanrontae incubaicd with FLUOS-Hb dilutions mentioncd abovc wtt signifi- cantly dincrtnt (PcO.05) from the conirol œlls. M d c s of A. pleuropneumoniae incubated with FLUOS-H b dilutions 1 :S and 1 : 10 (Fig. 1C.D) were significanily diflcnnt (P < 0.05) ftom the con- trol cclls (Fie. 1A.B). Subsequcnt cxpcrimtnts wcrc pcrfomed with a FLUOG-Hb dilution of 1:10, a dilution giving an optima1 cell lakling.

Cornparison of the Hbbinding activity of A. pleu-

ropneumoniae scrotypc 1 strain 4074 gmwn undcr iron-mtrictcd conditions with cclls Brown undcr iron-sufficicnt conditions using FLUOS-Hb was studied to undmtand the implication of iron+eprcs- sibk OMPs in the Hbbinding activity of this micro- organism. Tbc pcrcentagc of fluoresceni cvcnts of A. pleuropneumoniae serotype I strain 0074 grown undcr iron-rcstrictcd conditions (Fig. U, pcak II ; 92.2 f 1.6%) was significantly difi'trcnt (P < 0.05) from the percentagc obtaincd whtn cclls were grown undcr iron-sufficient conditions (Fig. ZB, ptak II) wherc 78220.5% of the bacterial ccll population

ER. 2- Flow cyromriy rnilysis of A. pkwropnrvmmior miype 1 d i anin 1074. Cdlr were #~om under imn-nrirhed (A. plk I n of im-rumcirnt cordirions (B. p r k I l ) rad Urubrird with r 1:lO dilution of FLUCK-HL. PIEUtUl QUI undn iron-muiEicd (A. p#ls 1) or imn-sdbnt conditions (B. prit J I and not incubiud w i l FLUOS-Hb s r r d u conttok

was recordai as fluorescent cvents. Suspensions of ctlls of A. plmropnmmoniae yown under iron-rc- strictcd conditions (Fig. U. peak 1) or iron-sutiicicnt conditions (Fi& TB, pcak 1) and that have not k e n incubatd with FLUOSHb servcd as controls and werr u'gnificantly diffcrent (PcO.05) from bacterial el ls incubaicd with FLUOS-Hb. ïhese mults indi- cate that iron-restriction in A. pleuropumoitiae pro- motes the expression of Hb reccptors. and that Hb- binding activity is. at least in pan. iron-repmsiblc. Although WC pnviously reportcd that A. pleuropneu- moniae lipid A was able io bind pie Hb (5.q. it is quitc possible ihat in addition somc OMPs mighi act as iron-repressible surface nccptofls) for Hb as hy- pothcsized by Dcnccr and Pottcr [6) and ourstlvcs (fl. We thus propose thai the basic levcl of Hbbind- ing activit y, ob~rvcd undcr iron-sufficien t condi- tions. would bt mainly attributable to LPS and that the highcr lcvel of Hbbinding acrivity, obsmcd undcr iron-nstrictcd condiiions. would correspond to LPS and iron-repnssiblc OMPs. To asscss host spccificity, wc laklcd bovine Hb

with fluorcscxin and thcn cxamincd the bovine Hb- binding activiiy of A. pleuropneunioniae using flow cytomctry. Thc results obtaincd with fluorcsccin-ia- klcd bovine Hb (data not shoum) wcre not signifi- cantly diffcrent from the o n s obtaincd with fluores- min-labcled pie Hb (P > 0.05). This is not surprisin8 sincc studics in our laboratory have rtvcalcd chat A. pleutopneunionfae strains 4074 and 4226 could obtain iron from Hb of eithcr pig, shccp. human. toat. bo- vine, rabbit. or horst [q. In addition, according to the litctaturc. the binding sp.ficity of Hb mcepton displays nonc of the smcs bias cvidcnt in the bac-

tcrial transfemn receptors [19]. Althoufi ptcfenn- tially rccognizing humrn Hb, the Hb rcccptor of Haemophilus UIfluen:ae readily binds non-human mrnmalian Hb as wcll as Hb cornplexcd to hapio- globin (20). This suggcsts that conservcd amino acid midues in the globin chains sunounding the hcme ctcvice may bc involvcd in binding (1).

3.2. Presence of Hbbindrng acriviry in other A. pleuropneuntoniae holares

Hb-binding activity was evaluated in rcprcsenta- tive isolatts of A. pleuropneumoniae klonging to se- rotypcs l and 2 (Table l). A. pleuropneunioniue scro- type 2 rcfercnct strain (4226) and field isolatcs of ~ r o t y p c 1 (FMV 87-682) and ~ r o t y p e 2 (Q 87- 981 ) wcrc also able to bind FLUOS-Hb. Pcrccniagcs of fluomccnt evcnis and modes of these rcprescnia- tive isolates incubated with FLUOS-Hb werc signifi- cantly difktcnt (PcO.05) from the control cells which werc bacterial cclls noi incubatcd wr'th FLUOS-Hb. These results dcmonstratc a functional consctvation of Hb-binding activity arnong two clin- ical significant scrotypcs of A. pkuroprreunloniae.

'fhc pcrccntagcs of gated fluorescent evcnts or A. pleuropneumoniae scrotypc 2 nfcrmcc main (4226) wcrc lower than the oncs observed with the scrotypc 1 nlirenœ strain (0074) (P=0.02) and mith the k l d isolaies of serotype 1 (FMV 87-682) (P=0.03) and serotype 2 (Q 87-98 1 ) (P ~ 0 . 0 3 ) (T'able 1 ). The rea- sons for this disctcpancy arc unclcar at the moment. Ont possible cnplanation might involve the pmcncc of a difkrcni type of LPS. ï h c serotype 2 refcrcnce strain (4226) is the only one among the isolates

Tabk 1 Ptmniaps of fluorescent m i s ind m o d e ncordcd in dow cyiometry uulyir of A. p l m o m i w nf' nrainr aird k l d irahies grown under iron-mtrictcd conditions and inrubatcd with a I:lO dilution of FLUOS-Hb

Refmnct stnins or isolata Y. of pial duomxnt cnnW Modesn

Controt ceIlrd Cdlr lrbckd wiih FLUOS-Hb Control allrd Celb hkkd wiih FLUOStHb

!kroiyp I d?rencr anin $071 3.6222 9222 1.6" 10.92 1.1 2131 2-%55" F i khu dvrotype 1 IFMV 8 7 4 2 ) 5.9f 3 97.8 f I .bkc IS.6f0.6 4418fU68'' Srtalyp f dmicr itnin 4226 2.7 2 1.11 O1.7 t 3.dh 16220.6 21M22û71tb Fwld irolric of serotype 2 (Q 87-98 1 ) 3 2 f 05 %.7 f O@ 15.6 f 0.6 6301 2 ,XW"

'Expmd u mcin 2S.E. (n =dl. bPcO.os cofnpand to mi to l œlb.

0.05 compind to the i r t ~ anin or the mme mi= dBm&l dis not incubital with FLUOSHb.

ttstcd that has a smooth LPS profik. It is thus tcmpting to speculate that with a smooth LPS pro- file, Hb acnssibility to the con-lipid A region is demascd and that a smooth LPS structure would also mask surfacc iron-tcgulatcd proteins which we suspect to be involvcd in the iron uptake.

The field isolatcs of scrotypc I (FMV 87482) and scrotypc 2 (Q 87-981) had the highcst modes (Table 1). This implics that the majority of these cells bound more FLUOS-Hb than the cclls of A. pleurapneutrto- niae rcfcrcncc strains of Krotype 1 (0074) and sero- typc 2 (4226). These diffennccs werc not sipificant (P>O.OS) as determincd by the Studcnt's I-test. However. fidd isolatcs of seratype I (FMV 87-682) and scrotypc 2 (Q 87-90]) showed the highcst pcr- centages of fluorescent events which wcre sipifi- cantly differcnt (P ~ 0 . 0 5 ) from those obtaincd by the refercnce strains. Interestingfp. t hex field isola tes sccmcd to have a grcatcr Hb-binding activity than the rcference strains which have bccn maintaincd in culture collection for many years.

3.3. The Hb-binding ucti\*ity of A. pleitropneurwoniae serorypc 1 isogenic mutants

Hb-binding activity of A. pltwopnainioniae scro, typc I LPS or capsule mutants was testcd in flow cytometry to evaluatc the influcncc of sutfacc poly- saccharides on Hbbinding act ivity. A. pleuropneu- ntoniue scrotypc 1 LPS or capsule mutants wcre also able to bind FLUOS-Hb and their pcrccntagcs of fluorescent events and modes were significantly diffcrent (P<O.OS) from the control cells which were bacterial cclls not incubated with FLUOS-Hb

(Table 2). A significant inmase (P=0.01) in the pcr- ccntages of gatcd fluorescent events of capsule mu- tant 33.2 campad to the wild-type parent strain NalR was obscrvcd (T'able 2). These mulis indicate that surface molcculcs with Hb-bindinp activity are more cxposcd at the cc11 surface in the absence of a capsular matcrial laycr. ln addition, capsule mutant 33.2 (Table 2) had the hifiest mode, but this rcsuli was not signifiant (P > 0.05) when compared io the wild-type parcnt strain NalR.

The Hb-binding activity, expresscd as the percen- tage of ptcd fluorescent evcnts. of A. pleuropneu- ntoniae LPS mutants 15.1 (rough LPS) and S. 1 (LPS with a modificd core-lipid A neion) grown undcr iron-rcstricted conditions were highcr than the oncs observeci in the wild-type parent strain NalR (Table 2). Howevcr, thme differcnces wcre not significant (P>O.O5). It appcars that the diKercnccs krwcen the mi-rough LPS profile of the wild-type parent arain NalR and the rough LPS profile of the mutant 15.1 did not allow a signifiant inmase of the Hb acctssibility to surface protcins and to the cote-lipid A region of LPS. The mutation in the con region of mutant 5.1 did not cithcr significantly modify the Hb acctssibility ta the cote-lipid A region. which was show to bind pig Hb [5,7]. or to surface proteins.

3.4. Eflects of iron resrricrion on rlw OMPs pro#lc of A, pleuropneuntoniae serotype I strain 4074

Efkts of iron restriction on the OMPs profile of A. p/.uropn4untrrniae have been document cd (for ex- ample. sec (6.211). Major iron-rcgulatcd OMPs idcn- tificd by Dencer and Potter [6] had relative moIccular

stnîn a 7 4 NolR poun unda iton-mtticteâ conditions and UKubritcd ~ i t h r 1 :IO dilution of FLUOS-Hb

Pamit sinin and isqenic muiinu Y* of ptd lluorrrcnt e m t P Modesa

Conirol cellsJ Ceils lrkkd with FLUOS-Hb Control cells" Celh lakkd with FLUOS-Hb

Pareni strrin 107J NalR 7.3 2 0.3 94.6 f 2.5'' Mutant 15.1 rroufi LPSl 7.8 2 0.2 97.6 f 0.5" Mutant 5.1 (modified con-lipid A irpon] 7 -4 20.6 98.0 t 0.6'' Muiant 332 twithoui capsuk) 7.8 2 4 %.fi 2 Zlh

%p.d u ","af S E (n=4). bP c 0.05 coinparal to control cells.

0.01 compnd to pmt nnin. dBmwhl œlls not incubata! with FLUOS-Hb.

sizes of 76 and 105 kDa. They sugptcd that these p t c i n s mifit aquifc complexcd iron during powth in vivo. Polypeptides of 47, 9, 79 and k- twccn % and 102 kDa were identified in A. pleuro- prunioniize grown undcr iron-rcsirictd conditions (211. Two iron-rcgulated OMPs of +60 kDa CtfbA) and = 100 kDa (TCbB) have ken identificd Bi A. p/europneunioniae as transfcm*n binding pro- tchs (22.23).

Outer membranes from A. pleuropneunioniae refcr- eoce main 4074 of scrotype 1 grown under ironsuf- f ien t or iron-testrictcd conditions wcre analyzed by SDS-PAGE (Fie. 3A). lron restriction induccd by EDDHA multcd in the appearance of OMPs with r relative molccular mass betwcm 81 and 102 kDa (Fig, 3A), Iron-rcgulatcd OMPs with a lower relative nwrlccular mass ktwccn 32 and 46 kDa and around 60 kDa wcre also obscwcd. In addition, an increase in the synthcsis of a 75 kDa OMP was noticcd whcn d l s wcre grown under iron rcsttiction. This protcin mifit concspond to the 76-kDa protein identified by tknccr and Potier 161 and to the 79-kDa protcin idmtificd by Niven et al. [ZI]. Ii is likely that somc of thcsc OMPs play a role in the Hb-binding activity detectcd by flow cyiometry. WC suggcst thar one or marc of thcsc OMPs may serve as m p t o ~ for Hb. and could bc implicatcd in the iron transport inro iht cclt like ii has bctn proposcd for othcr Pasttur- ellactac (12). Wotks arc undcrway to charactcrizc OMPs of A. plcuropneurrroniue with Hb-binding ac- thity.

Analysis of the scrolo~cal nsponsc to outrr mcm- brane antipcns during A. plmropneuntoniae inliction in pigs has idcniified a numbcr of OMPs that are cmly reactive with convalescent scrum [24], including the 76- and IObkDa iron-npmsibk protcins [6]. To u ~ s s the imtnunogcnicity of the A. plruropneunm- rryle iron-rcgulated OMPs, wc pcrCormcd Western bbtting with OMPs from iron-starvcd cclls of scro, iypc 1. Proteins werc clcctrophorctically tnnsf'crtcd io nitroccllulo~ membrane and mctcd with conva- lescent-phase antiscrum iiom a pie urpcrimentally mftcted wiih A- pleuropn~~~toniae setotypc 1, Fout oT the iron-rrpulatcd OMPs wcre immunogcnic ac- cording to Wmem ùnmunoblots (Fig. 38). Two o r ibcm had a relative mokculat mas ktween 81 and 105 kDa. The 0th- two iron-rqplated OMPs had a bwet relative m o k u h r mass kiwem 35 rnd 81

Fi& 3. Ouier membrane proteins ptoflk OC A. plniropnmnumiar wiotyp 1 rd" sinin 4074 pown undtr iron-miriacd or iron-rumcicni conditions. OMPs were uprratcd on 12.5% SDS- PAGE and riaincd wiih Coomrssic blw (Al or rnnrfcrrcd IO ni- iroorllulosc nmnbnnes for W a i m immunoblotttn# ~ B J . ï h c membranes cnrc ihcn incubaicd uith wrum ftom a pig ex@- mmullg infkcteâ with A. plturopwuntonirr* wotypc 1. Lane 1. mokculrr mur nurkcn in kDa: lrnt 2. OMPI obraincd from cells grown under iron-su!Rcient conditions: ianc 3. OMPs ob- irincd from œlls pown undcr iron-miriard condiiions. Anovs indicaie ihe position or iron-ngulricd OMPr.

kDa, but the iron-regulattd OMP of 75 kDa did not react with the convalescent-phase antistrum.

In the ptcscnt siudy, we quantitateci A. pleuropneu- n~oniae Hbbinding activity usine fluorcsccin-labelcd pi8 Hb and flow cytometry. Flow cytomctry is a powerful procedure that can mcasurc several param- eters on tcns of thousands of individual cclls within a few minutes. We dcmonstratcd that in A. pieuropneu- nioniae, the Hbbinding activity is, at least in part, iron-rtprcssible. We propose that the total Hbbind- ing activity observed in our study is attributable to both LPS and iron-rcprcssible OMPs. Wc have d a vclopcd a simple and rapid flow cytomctric analysis that allows quantification of the cxpnssion of A. pleuropneunroniae surface molecula wit h H b-binding activity using fluorescein-laklcd pig Hb which can k adaptcd and advonugcously used with Hb of dif- ferent hosts and othcr bacterial sWcs.

This work was supportcd in prt by Orants from Natural Sciences and Engineering Rnclrch Council of Canada (OGPûûû3428) and ftom Fonds pour la Formation de Chercheun et 1'Aidt à la Recherche (FCAR: 99-ER.0214). MA. and S.R. arc the rccip

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1çtroupe de Recherche sur les Maladies Infectieuses du Porc. and Depanement de Pathologie et Microbidogie, Faculté de Médecine VCtCrinaire, Univenit6 de Montrdai. St-Hyacinthe, QuCbec. CaiiPda J2S 7C6; Z ~ n i t t de Recherche en Vaccinolo$ie, Centre Hospitalier Universi taire de QuCbec, Quebec, Canada 0 1V 402; 3~iotechndo~~ Research Insti tute. NRC. Montreal. QuCbec. Canada H4P 2R2; 41nstitute for Biological Sciences, NRC, ûtmwa, Canada KI A OR6; S~niversi ty of North Carolina, Chape1 Hill. NC 27599. USA ; 6~esent address: Intellivax International Inc.. Montréal. Qutkc, Canada H4P 2R2.

Keywords: Acfinobocillrrr p1europneu11u)niue. OMP. hemoglobin-binding protein, hemin-binding prorin

*Comspoadcnce to: M o Jaquts. Faculté de Médecine VCttrinaire. Université de Mon-, 3 2 0 rue Sicotte. St-Hyrinthc. Qu6bec. Canaûa J2S 7C6; Tel: (450) 723- 8521 ext. 8348; Fax: (450) 778-8108; Email: jrqmOmcdverumontrcai.ca

ABSTRACT

The refercnce stroins mprescnting tbe twelve serotypes of Actino6uacilh pk1(1opnc10110nicac wen ensmined for their Pbility to utilize various iron-cmtaining compounds as an iron source for growth. ln a growth promotion assay. ail the

rcfennce strains were able to use either porcine and bovine hemoglobin (Hb) or pacine and bovine M n (Hm). Using an affinity purification procedure with Hm- or Hb-agame. a major Hm- and Hb-binding outcr membrane protein (OMP) of approximately 75 LDa was isolated from A. p I c u t o p ~ ~ 1 ~ ) n i O c serotype 1 strain 4074

grown under iron-nstricted conditions. Minor Hm- and Hb-binding OMPs with molecular masses of about 47 and 36 kDa werc also identifid. In addition, soluble Hm- and Hbbinding Tictors of approximative1 y 70 and 104 kDa w e n dctcctcd in the culture supernatant. A survey of A. pkurop~~~unwnùu revealed that dl tested strains. excep refercnce strain of serotyps 3.6.7. and 10. synthesized the 75-kDa Hm- and Hb-binding OMP under im-mtricted conditions. The screcning also demonstrated that the ability to express the minor 47-LDa Hm- and Hb-binding OMP was a cnwrvcd trait in al1 strains reprrsenting the twelve scrotypcs; the 36-kDÎ Hm- and

Hb-binding OMP was isolated from al1 the reference strains. except rcfetcnce slrain 8329185 npmenting serotype 12. Labeling of cells with ~Hlpalmitate indicated that

the 75-kDa Hm- and Hb-binding OMP was not a lipoprotein. However. the minors Hm- and Hb-binding OMPs could k lipopmieins since bands around molccular masses of 47 and 36 kDa werc observed. Despite many atiempts. it was not possible to detamine the N-terminal amino acid quencc of the major 7SkDa Hm- and Hb- binding OMP. In oodcr to &temine whethcr the major 7SkDa OMR purified by eirhcr

Hmagarose a Hbagan>se wen identicai. these protcins wcre exciscd and digesteû in- gel with trypsin. Roteolytic fragments wen then sepafated on a microbon HPLC culurnn and fractions collccted were analysecl by mass specmmctry. Mat~ix-assisteci lasadeso@on ionizati0nltirn~-flight (MALDI-ToF) anaiyzes nvcalcd a numkr of common tryptic peptides ktween the H b - a m - and Hm-agame-purilied OMPs strmgly sugpting diat 1&st peptiâes aiginaie f m the same protein. Taken togethcr. out data suggest that A.pkwopnemnùae express Hm Hm Hbbiding proicins that could be impliatcd in the itai uptake fmn pcinc Hb ami Hm.

INTRODUCTION

OC the b e y complu interactions which ocaa betwcen a patho~n and its host, one ammon essential component of the inftctiious pioass involves the multiplication of the invading microorganisrn within host tissues. Such gmwth is critical to the establishment of an idection and depnds, in part, upon the ability of the piubogen to scavenp certain essentiai nutrients (37). Iron is essential for bacterial growth (23. 26. 35. 42). In the host. extracellular iron is bound to the iron-binding glycoproteins lactoferrin and transfemn in exocrine secrctions, while most of the intracellular iron is

sequestcreâ as heme-containing proîeins such as hemoglobin (Hb). This sequestration limits the availability of frec. imn to levels k l o w that requimd to support miCrobial growth (23, 26. 42). However. to survive in the host, bacterial pathogens have evolved different high-affinity iiron-acquisition mechanisms designed to obtain iron (37). One such system comprises the elaboration of siderophores that chelate externa1 iron followed by binding to their cognate receptor and subsequent internalization. Another system utilises a receptor-mediard rnechanism to acquin i ra i from lactoferrin. msfemn or heme-containing proteins (6. 23. 26. 34. 35). A large numbcr of pathogenic bacterial species use heme compounds as a source of iron. and various outer membrane proteins have ken isolated and characteria which proposed function is to bind heme to the bacterial ce11 surCace (23, 34). In these systems the outer membrane reoeptor di rectl y recognized the heme compounds. Another more corn plex way to obtain heme involves an ext~cellular protein. named hemophore, that binds heme and shuttles it back to a specific outer membrane rcceptor (15). This hemophore- dependent heme acquisition system bas ben detectcd in Haelt~lphilus injuenzae (5). Senufia mcltcescens (24) and Ercherichia coli sttain EB 1 (33)

AchmkilIirspiewop~~~unwniac, a memkr of the Pas&~pcllacrae family. is the causative agent of porcine pleuropneurnonia Among the 12 serotypes recqniud. serotypes 1. 5 and 7 are important in North America (29) while serotype 2 is preûominant in many european counrries (28). Several bactcrial compments, including RTX toxins (two of which exhibit hemolytic activity). lipopdysaccharides (LPS). c~peular polysaccharides and outer membrane proteins (OMR) appcsr to contribute to the disesse process (16). Potentid iron sources for A. plciuvpneionoriiac include p i n e transfemn (32), exogenous siderophorcs (9) and heme compounds likrattd fmn host alls (8). W c Piid ohm demonstrataî that A. ~ ~ ~ ~ p ~ y y l l l o n i o l ocrotypts 1

and 2 can utilut porcine Hb or bcmin (Hm) as a soie aorirce of iron for p w t h in vin0 (4.8). We ttccntiy reported the binding of porcine Hb to A. pkmpllclPlUNljOe LPS

(1.4) and hypoîhtsized tbat LPS &ght prfonn a adocking" function. WC suspect that suiface proteins on Uien invdved in the iton uptakc from porcine Hb. Cornparison, using flow cytomey, of the Hb-binding activity of A. picump~ultlorUaC p w n unda im-mtn'ctcd conditions with a l l s grown undcr iron-sufficient conditions indicatad chat iron-restriction promotcd the expmion of Hb nccptors, and that Hb-binding activity was, at least in part, iron-ieprrssible (2)

The mechanism by which A. plcuropneumo~~ioc utilize Hm- and Hb-iron sources as well as the protein components involved have so far not k e n identifid. Such a systcm could serve as an important mechanism for the in vivo iron acquisition by A. pkwopneumoniue. The aim of the pnsent study was to idcntify proteins of A. plewopneumodae serotype 1 which express Hb- or Hm-binding anivity.

MATERIALS AND NIETHODS

Bicterial iwlates and srowth conditlonr. A. pleuropnemoniue nfewnœ sûains repmnting the twclve serotyps wen uaed in the pwmit study. Bacteria were gmwn in brain har t infusion liquid meûium (BHI; Difco Laborotories, Detroit, MI) supplemented with 5 pg of NADIml. To obtain iron-restricted conditions Cor preption of outer membranes. the culture medium was supplemented with 100 pM of defemted EDDHA (ethylenediarnine di-O-hydroxyphenylacetic ticid; Sigma Chernical Co., St. Louis, MO) (9). Cultures were incubated at 37°C for 18-24 h in a 5% Cm atmospbtm.

Growth promotion umy. The utilization of heme compounds by iron-nstricted A. p&uropneunwniue was determineci by a plate assay (4. 8) with some modifications. Briofly. fmh overnight cultures of the nference strains of A. pIcwopneumoniue were resuspended at a concentration of approximatively 108 CNIml ( A m of 0.2) in

phosphate-buffered saline (PBS 0.01 M. pH 7.4). Fifty microliters of the cells suspension were spnad onto the surface of a BHI-NAD agar plate containing 200 FM of deferrated EDDHA. a concentration that inhibits the growth of A.

plemprteumorUoe. Sterile fil ter disks (Becton Dickinson. 6.25 mm in diameter) were UKn placed onto the agar plate and 10 pl of porcine a b i n e Hb (10 mdml. dissolved in PBS) or Hm (10 mglml. dissolvod in 3û96 W O H ) werc spottcû onto the filter disks. Zones of p w t h around the disks wen evaluated aftcr incubation at 37.C under an atmosphere of's% COy for 48 h. A solution of FE13 (10 mglml, dissdvcd in PBS)

and PBS buffer were used as controls.

Prepirmtion of outer membranes. Outer membranes from A. plcuropnrunoniue reference strain of serotype 1 (strain 4074) grown under iron-sufficii or iron- reseicted conditions were urtracted and isolatcd by the method of Eîkins (10) wi th some modifications. Briefl y, w hole cell s of A. p&uropneiunoniac were disrupuxi with a French press. Intact alls and a l1 dekir w a e rcmoved by centrifugation at 12 000 X g for 10 min at 4.C. The supernatant was lhcn subjccted to centrifugation at 100 000 X g for 1 h at 4.C which yielded a total membrane pellet. The pellet was t k n solubilîzcd with 1% Sarkœyl si room tanpetatm for 1 h with roclong. The suspension was subjcced to centrifugation at 100 000 X g for 1 h at C C and the Sukosyl-soluble CytOpIasmic membrane supemtant was d i s c d d The Sarkosyl-insoluôie pellet was

muspendcd into 1% Sarkosyl and then ccntrifuged. The pllet coniaining outer membranes was conscrvd at -2O.C for further exprimcnts

Afïinlty purification witb Hm- or Hb-agiror. Analytical purification was perfonned in microcentrifuge tubes as descrikd by Elkins (10). Outer membranes were sdubilized by using 1% Zwittcrgent 3.14 (Calbiochem. La Jolla. CA) in 50 mM Tris. 150 mM NaCl and 5 mM EDTA pH 7.5 with rocking at 37.C for 1 h. After centrifugation at 12 500 X g for 10 min, the soluble fraction containing OMPs was

mixed with sdid-phase bovine Hm- or bovine Hb-agarose (Sigma) and gently rocked for 1 h at room temperature. The agarose containing the ligand-nceptor complex was washed in the above-mcntioned buffer to nmove nonspecifically bound proteins. The complexes were resuspended in Laemrnli sample buffer for analytical SDS-PAGE or Far-Western blotting. Solubilized whole alls of A. plrwop~umoniue reference strains ~presenting the twelve serotypes grown under iron-restricted conditions and proteins in concentratcd lyophilizad culture supematants obtained from 250 ml of ovemight culture of A. pleuropncumo~tiue serotype 1 strain 4074 grown under iron-restricted conditions were also submitted to this afrnity purification methodology using Hm- or Hb-agarose.

Eleetrophoresir. The SDS-PAGE was conducted by the discontinuous buffer system of Laemrnli (21). with a 4.5% plyacrylamide stacking gel and a 12.5% plyacrylarnide nwiing gel (1). Samples were boiled for 10 min in solubilization bufrer (62.5 m M Tris-HCI. pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol. 5% Smetcaptoechawl. and 0.025% bromophenol blue). Restained low molecular mass markers were obtained from Bio-Rad (Mississluga, ûntario, Canada). Gels were run in a Mini-

PROTEAN II vertical slab elcctrophoresis ceIl (Bio-Rad) and then stained with Coomassie brilliant blue R-250 or trans f e d to nitrocellulose mem branes for Far- Western blot.

Labellng of ed ls wlth [3~]~i lmitatc . To exponentially growing cells of A.

pièwopneumoniue setotypt 1 strain 4074 submitted to iron-nstrictcd wnditions or to irm-sufricient conditions. [3~]palmitatc (5 mCiiml) was addcd to a final concentration of 50 pciiml. Incubetion was thcn wntinuated for 2 h for culture under imn-sufficient conditions and 8 h for culture under iroa-ctstricted conditions. Labeling was stopped by pncipitation with trichloloc~cttic acid (10%. wtlvol) for 30 min on ice. Re ins were plleicd by centrifugation at 15 0 X g for 20 min. and the pellets wen washed

twice with methano1 to remove lipids. The dried pellets were nsuspended in sample buffer and Uien analyzed by SDS-PAGE. The radiolabelled protein bands in the dneû gel were detected by fluorography using EN~HANCE (Dupont, NEN Research Roducts) aooording to the manufacturer's instructions.

Labeling of porcine Hb with biotin or digoxipnin. Porcine Hb (Sigma) was

biotinylated as d d b e d previously by Frangipane et al (1 1). Briefl y, Hb (1 mglml) was dissolved in PBS and biotin-NHS (Sigma) was dissolved to a concentration of 1

mglml in dimethylformamide. To 5 ml of potcine Hb solution was added 430 pl of the biotin-NHS solution, and following incubation for 2 h at mom temperature. unbound biotin was removed by passage through a Sephadex 0-25 cdumn. Labeling of porcine Hb with di goxigenin (DIG-NHS) was done using a DIG lakling kit according to the

manufactunr's instructions (Roche Biochemicals, Laval. Québec, Canada). The molar ratio was set after standardization at 1: 10. i.e. 1 molecule of porcine Hb was mixeâ with 10 molecules or DIG-NHS. Briefly. porcine Hb (1 mg) was dissolved in 1 ml of PBS. A volume of 5.85 pl of a DIG-NHS solution (20 rng/ml) was adâed to the Hb

solution (1 ml) and incubated for 2 h at m m temperature with gende agitation. Porcine Hb-DIG-NHS reaction mix was then applied to a Sephadex 0-25 column and remaining, non reacted DIG-NHS was sepratecl by gel filtration.

Far- Western blot. Western blots were cMied out as describeci by Towbin et al. (41). Al1 incubations were followed by four 3-min washcs with aTris-saline buffer (10

m M Tris. 150 mM NaCl. pH 7.4). The membranes were first incubated at m m kmperature for 1 h with 2% skim milk ad thcn ovemight at 4.C. The membranes were incubated wi th bioti nylated porcine Hb or wi th digoxigenin-labded porcine Hb and then incubated at rcmm temperature for 1 h wiih an avidin peroxidase conjugate (Bio- Rad) or an anti-DIG peroxidase oonjugate (Roche Biochemicais). Reactions were

revealed by addition of 4-chloro-1-naphthol and hydrogen proxide as chromogenic su bsmte.

N-terminal amlno acid rcquence dctermlnition. For N-tcnninal amino acid d y s i s . the major 75-kDa OMPs pwificd by eithcr Hm- or H b a g ~ > s e werc 9cperaied by SDS-PAGE. dcctroôiotîeû (o a poiyvinylideae difluaide membrane (Bia-Rsd) and staincd with Ponceau. The N-terminai amino acid sequence was detcnnined by standard Edman degradation on a mode1 AB1 4 n A microsquencer (Applied Biosystcms, h t e r City, CaiifoMa).

Mitrix-Alristed Lucr Dtsorptlon Ioniutlon/Timt-Of-Fmt (MALDI- TOF). Rotein bands from the major 75-LDa OMW pwified by cither Hm- or Hb- agarose were cut out and submitted to 'in gel" rduction (DTT) and alkylation (Iodoaœtamide) of the disufide pups pior to m i n digestion (43.44). The enzyme used was the modified sequencing grade trypsin (Romega). T b peptides extracted from the gel were septaratcd on a Brownlee HPLC microbore Cl8 column (OD-300, 7p, 2.1 X 30 mm, ABI) using an Applied Biosystems 130A Separation System. Peptides were eluted at 200 pllmin wiih the rollowing gradient program: 0 min (0-

80% B) and 40-5'7 min (80-10% B). Solvant A king 0.1% TFARI20 and solvant B king 0.08% TFA in 70% acetonitrileR120. The peptides were detecied by their absorbante at 220 nm. Many fractions from samples or the 75-kDa OMR purifiai by either Hm- or Hb-agarose were analyzed by MALDI-TOF mas spcctrometer. Fractions X11 and 116 fran the 7ikDa OMP pwified by Hb-agame and X14 and t 18 rmm the 75-kW OMP purifiai by Hm-agarose were analyzed by MS-MS-Sequencing (mon complete dissociation of the peptide ions with argon gas) and common sequences in both OMPs were confinmd by peptide sequencing on the Rocise model

49 from Applied Biosystems.

RESULTS

Growth promotion i iuya . To detcmine whether A. pkuropncunioniae rcference strains reprcsenting the twelve serotypes could utilize heme compounds as the sole source of iron. we carricd out plate assays in which the abilities of various heme cornpounds to ovcrcome EDDHA-induced iron restriction wcrc evaluated. Ail the

svains were able to use either porcine and bovine Hliron sources or porcine and

bovine Hm-iron sources (Table 1). However, svain Kl7 of serotype Sa did not appear to use porcine or bovine Hb but was able CO aquire iron from porcine and bovine Hm since growth around the disks was obsewed with these cornpounds. In contrast, streins 13039 of serotype 10 and 561s of serotype 11 exhibited growth only with

porcine and bovine Hb-iton sources. Al1 the nfennce strains were able to use the control iron source FeCl3.

Identification of Hm- and Hb-blnding OMPs. To detemine whether A.

plrwoprrewwniae serotype 1 strain 4074 expressed iron-regulated Hm- and Hb- binding OMPs, outer membranes were prepared from cells grown in both iron- sufficicnt and iron-restricted conditions. Sol ubilized outer mcm branes were then subjected to affinity purification with immobilized bovine Hm or Hb and similar OMP profiles were obtaîned regardless of the ligand used (Fig. 1 lanes 2 to 5). This proadure yielded a major Hm- and Hb- binding OMP of approximatel y 75 kDa isolatad from A. pkuropneumoniue grown under iron-restricted condi tions (Fig. 1 lanes 4 and 5) and also under iron-sufkieni m d i tions (Fig. 1 lanes 2 and 3). The s ynthesis of the

major 75-kDa Hm- and Hb-binding OMP was increased under iron-restncted conditions (Fig.1 lanes 4 and 5). Minor Hm- and Hb-binding OMPs with molecular mass of about 47 and 36 kDa (Fig.1 lanes 2 to 5) were also isolated. Hm- and Hb- agame alone were used as controls (not shown).

Presence of the major or mlnor Hm- and Hb-binding OMPs in A .

pkuropneunonioe rtftnnce drains npreaentlng the twelve serotypes. Solubilizcd whole alls of A. pIcuropnerun0~ rcference strains mpresenting the twelve semtypes p w n under iron-mtricted conditions wcre submitted to the Hm- and Hbagarose affinity pirification pmeùurc dacikd unâer Materials and Methods. The ourvey of A. plcump~~~umoniae rclèrmœ strains revcaled that al1 tested suains. except nftrcnce sirsin of scrotypcs 3.6.7. and 10. synthesized the 75-kDa Hm- and Hb ôinâing OMP in vimo under irai-restrictcd conditions (Tabie 2). The scrrcning aiso

demonstrated that the in vitro ability to express the 47-kDa Hm- and Hb-binding Oh@ was a conserved trait in al1 nfemnce sirains npctstnting the twelve serotypes (Table 2). The 36kDa Hm- and Fbbinding OMP was imlated from al1 the reference strains, exccpt sûain 8329M of serotype 12.

Detection of Hm- and Hb-bindlng proteins in culture supernitants.

Roteins in mncentrated culture supmatants fmm A. p&uropne~~~~~)niae serotype 1 strain 4074 were also submittcd to the affinity purification procedure Wng Hm- or Hb agarose to determine whether Hm- and Hbbinding proteins muld k secreted in the environment. A soluble Hm- and Hb-binding factor of approximately 70 kDa was

detected in the cul turc supernatant of A. pleumpnelunoniae (Fig. 2, lanes 2 and 3) w hich migrated more rapidly than the major 75-kDa Hm- and Hb-binding OMPs (Fig. 2. lanes 4 and 5). A soluble Hm- and Hb-binding factor of approximately 104 kDa was also obsesved in smaller amount in the supernatant (Fig. 2. lanes 2 and 3).

Labeling o t eells wlth [3~ ]~dmi t i t e . A. pLvropnew~nioc was metabolically lakled with [3~]-~almitic acid to determine whether the 75.47- and 36kDa Hm- and

Hb-binding OMPs were lipoproteins. SDS-PAGE and fluorographic analysis of laôeleû A. pleuropnelullom*ue grown in the presence (Fig. 3, lane 3) and absence of deferrated EDDHA (Fig. 3, lane 2) indicatcd that the 7SkDa Hm- and Hb-binding OMP was not a lipoprotein since no band wuld k observai ktwcen 68 and 97 kDa on the film (Fig. 3. lanes 2 and 3). When A . p I c u t o p ~ ~ ~ ~ l l ~ n i c u was grown under iron- rcsvictcd conditions, thne lipoproicins with mdecular masses between 68 and 43 kDa and two lipoproteins with lower molccular masses between 43 and 29 kDa were observed (Fig. 3, lane 3). The minor 47- and 3bkDa Hm- and Hb-binding OMR cwld k lipoproteins since bands around molecular masses of 47 and 36 kDa were observeâ on the radiographie film. Four bonds klow the 29-kDa marker were also observed and some of them might rcprcsent the LPS of A. plrrsropnewwniae since the

lipid A c a e region of LPS is seen at the bottom of the gel.

Far-Westera blot with biotinylated porcine Hb or with DIG-labelcd porcine Hb. Ear-Western blot assays werc cPrricd out to detemine whether OMPs purificd by Hm-ap08e could bind ôiocinylateû Hb and thenfore paove îhat OMPs purificd by Hm-agarose arc iâentical to th- pirificd by Hb-agarocu. A positive signal was obtaiaed from the elecwMaaed 75- Hm- and Hb-binding OMPs incubatcd with the biothylated porcine Hb Pad avidin-borscdish pmrUdascamjugate (Fig. 4A.

laaes 2 and 3). However. this nsction was due to nonspecific interaction of this potein with avidin-horscmdish peroxidase conjugatc (Fig. 4B. lanes 2 and 3) and did not npccscnt spcific binding by porcine Hb itself. We thenfore peirormed Far- Western

blotting using DIG-labelcd porcine Hô, but our attempts to demonstrate direct binding of DIG-laklcd porcine Hb by the 75-,47-. and 36-kDa Hm- and Hb-binding OMR rrPnsfed to nitroallulose after SDS-PAGE werc unsucccssful (data not shwn).

N-terminal imino r l d wquence determination ot the major 75-kDa Hm- and Hb-binding OMPa. In order to detcnnine whethcr the major 75-kDa OMPs pwified by ei ther Hm-agarose or Hb-agarose were identical. these proteins were submitteâ to N-terminal arnino acid sequencing. The 75-kDa OMPs purified by eirher Hm- or Hb-agarose were separateci by SDS-PAGE. electmblotted to a pdyvinylidene difluoride membrane and staincd with Ponceau. Despite many attempts and diffennt (rcatments. the N-terminal amino aci*d sequence could not k deiermined by standard Edman &gradation.

MALDI-TOF anrlysis of the major 15-kDa Hm- and Hb-binding OMPs. S ina the N-terminal amino acid sequence seemed to k blocked. the major 75-Ba OMPs purificd by eiiher Hm-agarose or Hb.agarose were excised and digested in-gel with trypsin. Pmteolytic fragments wen separattct on a microbon HPLC column and fractions wcre cdlcmed. Some of them were analysai by mas spectrometry. MALDI- TOF analyses revealed wmmon tiyptic peptides between the fiactions from the Hb- agarose and Hm-agirrose purificd OMPs which smngly suggests that these peptides originate Crom iht sarne protein (Table 3).

DISCUSSION

A. pleuropncumoniac is able to acquire iron from different sources such as porcine transfemn (12-14), exosenous sideiopbores (9). and Hm or Hb (4. 8). The mechanisms by which A. plcuropwumoniae utilize Hm- or Hb-iron sources as well as the protein components involved have so fat received li ttle attention. Such systems could serve as importent mechanisms for the in vivo iron uptake by A.

pleuropneianoniae. W e previously described the binding of porcine Hb to A. p l c u r o p n e u m o ~ LPS (1.4). More recendy, using flow cytometry and fluorescein- labeled porcine Hb, we observeci that iron-restriction promoted the expression of Hb teceptors (2) which led us to suspcct that surface proteins could k involved in the iron uptake from porcine Hb.

In the present study we report that al1 A. pleurop~w~u)niae derence strains were able to use either porcine Hb or porcine Hm. These results confimed the previously published findings (4, 8) that most strains of A. pleuropneumniue serotypes 1 and 2 could utilize Hm and Hb as a sole source of iron for growth. Interestingly, we observed the prrscnce of a brown pigmentation in colonies growing around the disks wntaining porcine Hm or Hb. We klieve that those brown colonies were causecl by accumulation of Hm or Hb at the surface of the cell. In PorpIiyromlu~s gingivalis Mack pigmentation of mlonies by heme accumulation is thought to be nlated to virulence (38).

The data presenteâ hen mpon for the first time Hm- and Hb-binding proteins of A. pleuropneumoniue. These proteins were affinity-purified with bovine Hm or Hb

immobilized on agarose as the ligand. Minor Hm- and Hb-binding OMPs with molecular masses of about 47 and 36 kDa were identified. The survey of A.

pkuropnew~u)niue reference strains revealed that al1 express the 47-kDa Hm- and Hb- binding OMP. The 36-kDa Hm- and Hb-binding OMP was isdated from al1 the reftrence s a n s , exccpt strain 8329185 of serotypc 12. The expression of the 47-kDa Hm- and Hbbinding OMP in al1 refctcnce stniins of A. pièutopneumoniioc and nsults of the p w t h promotion assay allow us to suspect an important role for this protein in the acquisition of hemc fran Hm and Hb.

Lipopotcins am commonly found in association With bacterial cell membranes (19). An incrrPPcd numkr of becterial lipop~tcins have bem idcntificd in ment yean, and several of thcm have k e n shown to passas metabdic andlor binding functions (17, 18. 25). For example. a heme-binding lipoprotcin of 51 kDa of Huernophilus Uljhemae was idtntified (II) anci a lipoptcin d34.8 kDa which has bcen implicated

in the Hb-hapmglobin-utilization systern or Nb nwningitidir was -nt1 y isolaled (25).

We decided thercfore to label A. pleuropnemniue lipopmtcins. In our merabolic lakling assay with [3~]-~alrnitic acid. three lipoproteins with rnolecular masses

ktwecn 68 and 43 kDa and two IipoprotQns with lower molecular masses betwan 43 and 29 kDa were observecl when cells werc grown under imn-restrictad conditions. The minor Hm- and Hb-binding OMPs could k lipoproteins sinœ bands around mdecular masses of 47 and 36 kDa werc observed. The MkDa Hm- and Hb-binding OMP of A. pleuropneumonicrc obsewed in this study might k related to the 40-kDa pmtective outer membrane lipoprotein (Om lA) h m A. pleurop1t~cu1y)niae previously described by Gerlach et al. (12). In addition, the 47-lrDa Hm- and Hb-binding OMP of A. pkwopneumoniae identified in this study might be nlated to the AopA protein. a wmmon 48-kDa OMP of A. pleurop~t~wltoniae identifïcd by Cruz et al. (7). Four bands klow 29 kDa were also obsmed in this study and we suggest that some of them might be related to the LPS of A. pkwopmtunoriiue.

A major Hm- and Hb-binding OMP of 75 kDa was also identified in A.

plewopnew~u)nicte and its expression was increasd under iron-restricted conditions. A 76kDa protei n of A. pfewop~iunoniue identified by Den#r and Potter (8) displayed an ability to bind Congo nd and hemin, we sugpt that this protein might be related to the major 75-kDa Hm- and Hb-binding OMP identified in the present study. Interestingly. a TonB-depndent heme receptot of 75 kDa was recently identified in Huernophilus ducteyi (40). A survey of A. pleurupneumoniae relerence strains rcvealed that al1 tested strains. except strains of serotypcs 3.6, 7, and 14 syn thesized the 75-kDa Hm- and Hb-binding OMP in vin0 under iron-restncted conditions. Metabolic labeling with [3~]-p..lrnitic acid of A. plcmpnelolulniae grown in the presence and absence of EDDHA indicaîed that the major 75kDa Hm- and Hbbinding OMP was not a lipoprotcin.

In the Far-Western blot assays, a positive signal was obtained from the electroblotted 75-kDa Hm- and Hb-binding OMP incubated with the biotinylated porcine Hb and avidin-horsedish peroxiâase conjugate. However. this naction was

due to nonspecifîc interaction of this protcin with avidin-horseradish pmxidase conjugate and did not rcpfcsent epecific binding of porcine Hb itselr, suggesting the

presence of biotin in the 75-Da Hm- and Hb-ôinding OMPs. Two biotinylated pmteins of approximaicly 38 and 105 LIà have k c n dcscribed in P~~&~Ilamul!ucW (36). Thest biorin-containhg proteins w t n responsible fa false-pi rive rcactions in colony lift-hybridization assays basd upon biotin-avidin dctcction systcm. The prcsenœ of biotinyiated proteins in bacterial gcnera 0 t h than Pos&weIlo that can

interfére with Western blotting have also been describcd (3, 27). Interestingly, a 75- k i h protein of A. pleuropmumoni~~~ dcscnbed by Gerlach et al. (13) was shown to bind streptavidin-phosphatase done in a transfemn Westem blot-li kt assay and an avidin-binding protein of 70 kDa was identified in ktimbocillur acti1~~ltyce1c11~:omr'tarts SUNY 465 (27). According to our mults and to the litterature. it is thercfore tempting to speculate that the 7EltDa Hm- and Hb-binding OMP of A.

pkurop11~l~l~lnÙze described in this study wuld k analogous to the 75-kDa protein described by Gerlach et al. (13) and is a tiotin-containing protein.

In view of the fact that idse-positive signals were obtained using biotinylated porcine Hb. we decided to label porcine Hb with digoxigenin and repeat the

experiment No reactions were obtained with the 75-, 47- and 36-kDa Hm- and Hb- binding OMPs in a Far-Westeni blot using DIG-labeled porcine Hb. Interestingly. Stevens et al. (49) enwunier the same p d e m since al1 their attempts to demonstrate direct binding of radidakled Hb by HupA. the Hb utilization protein A of H. ducreyi, transferred to nitrocellulose after SDS-PAGE were unsuccessful. It appears that Hb- binding activity d those m i ~ r ~ ~ ~ g a n i s r n s is lost during denaniration of the samples for SDS-PAGE

The N-taminal amino acid sequence of the major 75-kDa Hm- and Hb-binding OMP could not k determincd by standard Edman degradation. Therefore, to determine whethcr the 7SkDa OMPs purified by either Hm-agarose or Hb-agarose were identical, these OMPs w e n excised and digcsted in-gel with trypsin. Rote01 ytic

fmgmtnts werc scpafated on a microbore HPU: column and fractions collecteâ were anal- by mass spectrometry. MALDI-TOF analyses mealed common ciyptic peptides ktwcen fractions from the Hb-agarose- and Hm-agarose-purified OMPs strongly suggesting that these peptides onginate from the same protein. A BLAST scarch of the GcnBank databapc found no signifiant homologies wi th other bacterial proieins.

Roteins in concentratcd culture supernatanu from A. pleuropneumuniae scrotypc 1 s e n 4074 wcre submittcâ to the affinity purification procedure using Hm- or bagarose to detcnaine whcthcr cntraccllular Hm- and Hb-binding proteins were p m n t A soluble Hm- and Hb-binding factor of appmximatcly 70 kDa was detected

in the culture supernatant of A. pkwopnew~y)niue. A soluble factor of approximately 104 kDa was also obscrved but in smaller amount in the suprnatant Intcrtstingly, Negrete-Abascai et al. (30) have rcported that culture supernatants of A.

200,90,80,70. and 50 kDa These protcsacs w c n able to degraûe porcine IgA and

porcine. human, and bovine Hb. In addition, they suggested that proteolytic cleavage of Hb could be a mechanism for imn acquisition. The soluble 7û-kDa Hm- and Hb biniing protein of A. pIeuropne~ll~~rUac described in this study could k relateci to the

extracellular protaise of 70-kDa reported by Nepte- Abescal (30). 1 t bas becn nponad that Vibrio vu111ijku.s utilizear di ffemii hane proteins as sole source of iron for grow th using an extracellular protcase and that protcase-deficient mutants of Vibrio vulnificus

could not utilize any heme proteins as imn source (31). In addition, a Hb protease secfcted by the pathogenic EsciicrrCIricrculi strain EB 1 was recendy characteruad and is part d a hemophmdependent &me acquisition system (33). This protein m e d Hbp interacis with Hb. degrades it. and subsequently binds the released heme. This may suggest that proteolysis at the proximity of' the outer membrane of A.

plewopneiunoniae cwld be important for removal of' the transported ligand (Hm) from the bound macromolecular ligand (Hb) to allow transport a~cross the outer membrane.

How heme crosses the outer membrane of A. pkuropneumoniac is presently not b w n . although recent studies in H. ducreyi and H. injuenzae have determineci that this process is dependmt cm the activity of the TonB protein (20. 40). So far, on1 y a strong indication of TonB-like polypeptides was seen in A. p&uropneumoniae for which proteins of 28 and U k D a were detectcâ in the ce11 lysates by the MAb 4H4, a monoclonal antibody thai was generated against gel-purifïed E. coli TonB fusion protein (22). Which of these two proteins npresent TonB homolog remains for the moment unclear (22).

A model for Hb and Hm utilization is presented in Fig.5. In this model. extracellular Hm- and Hb-binding proteins idcntiricd in this study would catch heme and shuttle it back to specific outer membrane reccptors. The finding of bernophore- dependent heme aquisi tion system in H. influenzue (5). S. marcescens (24) and E. coli suain EB 1 (33) supports the existence of such systems in other bacteria The Hm and Hb rcceptors idcntified in this saidy could then transport Hm into the periplasm by a TonB-dependent mccbanism. Once in the periplasm. Hm would k transportai into the cytoplasm by a Hm-spwific periplasmic-protein depend«it system. The finding of the hernin-specific periplasmic uptake systcm in Yeninid erttcro&ica (39) supports the existena of such systems in other heme-utilizing microorganisms. In the cytoplasm, iron would bc nleaseû fmm the porphyrin ring by the action of a heme oxygenase. an enzyme which cleaves the heme moiety (39).

Because the 7%. 47- and 36- Hm- and Hb-binding OMPs idcntified in this shdy are fouad in outer membrane ~ ~ t i o n s , thcy arc lilrely candidates for Hm and Hb mœptors. They ewld amaivably constitute eithcr thrœ independent Hm and Hb

receptors or form only one hemc reccptot as both previously described for oîhcr

bockria (23). It is also tcmpting to specuiatc that the soluble Hm- and Hb-binding factors idmtified in this study might k part of a hemophore-dependent system. Although the spccific isdation of these proteins by Hm- and H b - a m suggests an implication in a Hm- and Hb-rrceptor-mcdiated iron-acquisition pcoccss, the pncise role of these components awaits definitive experiments with isogenic mutants in the genes coding for Uiese proteins. The pathways by which A. plcuropne~~t~)niac utiliac Hm- and Hbimn sources are of intemt in an attmipt to understand the role of surface molecules in pathogenesis.

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supportcd in part by gtants from Natural Sciences and Engineering Rriearch Council of Canada (ûûP03428 to M.J.) and from Fonds p r la Formation de Chercheurs et l'Aide ii la Recherche (FCAR; 99-ER-0214). M A . is the recipient of a studentship from FCAR

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TABLE 1. Abi li ty of A. pleuropne~mniue relerence sirains representing the twelve seroty pes Co use Hm and Hb as ircm sources in a growth promotion assay.

Diameîen (in mm) of m e of growth obtained with di fferent i ron sources

Reference strain porcine H b porci ne Hm bovine H b bovine Hm M I 3 ( S ~ Y pe)

-- - - -- - - - - - - - - - - -

4074 (1) 17 17 15 17 10 4226 (2) 17 15 14 16 1 1

1421 (3) 15 12 10 15 10

1462 (4) 15 15 16 16 1 1

K17 (5) - 17 - 18 10

Femo (6) 18 17 16 16 9

WF.83 (7) 17 13 14 13 10

405 (8) 13 16 12 L 7 10 13261 (9) 15 15 14 15 10

13039 (IO) 13 - 9 - 9

56153 (11) 16 - 13 - 10

8329185 (1 2) 15 13 12 14 9

- No bacterial gmwth

i

B 'Et

La liaison de l'hémoglobine porcine au LPS d'A. pleutopnewtu)niue a CE récemment dtrnontrée (7). Il a &gaiement &té mis en Cvidence que certaines souches des s6mtypes 1 et 2 d'A. pleuropneunw~~iae pouvaient utiliser l'hémoglobine comme

seule source de fer pour sa croissance (7). La liaison entre le LPS et I'hemine ou l'hémoglobine a été egalement rapportée chez d'autres bactéries (73, 74, 103, 104,

175, 176). De plus, des protéines liant I'htme, I'hémine ou I'hCrnoglobine ont et6 mises en &idence chez différentes bactéries (120). Nous avons alors tmis Ithypothése qu'il existe un système de récepteurs constitue de LPS et de pro9nes B la surface d'A. plewopwumoniae qui serait implique dans la liaison de l'h&noglobine porcine.

L'objectif du present travail Ctait donc de caractenser les molécules impliquh dans la liaison de l'hemoglobine porcine chez AD pleuropneumoniae. Nous avons dtudit en dttail l'effet de la liaison de l'htimoglobine porcine sur les propridtes biologiques et physiques du LPS d'AD pleuropneumoniae. Nous avons alors observé la liaison de l'hdmoglobine porcine iî la surface de la cellule entihre d'A.

plewopneulloniae. Nous avons egalernent dCtemin6 que cette liaison ne modifiait pas l'accessibilité des anticorps aux antighes de surface O et K. Nous avons précédemment démontré que des rdsidus de lipide A sont accessibles à la surlace d'A.

pleuropnetunoniae, principaiement autour des vesicules de la membrane externe de la bacterie (7). Ceci pourrait expliquer pourquoi I'h~moglobine n'interfère pas avec

l'accessibilité des anticorps aux antighnes de surface O et K.

Nous avons confirme dans cette Ctude le pr6cedent résultat à savoir que la liaison de l'hdmoglobine porcine est ami buable au lipide A de la moMcule de LPS. La liaison du lipide A à l'hémoglobine ou à I'hémine a eté rapportée chez Porphyromonus

gingivaüs et chez certaines entérobacténes (73. 176). Des chercheurs ont demontre que le LPS d'Actino6ucillw acn'nornycetemcomitoas p v a i t lier l'h6moglo bi ne humaine

(74) mais cette interaction ne semblait pas impliquer la région du lipide A de la molécule de LPS. Nos analyses ont egaiement mis en evidence que I'hCmoglobine porcine fragmentait le LPS et diminuait ainsi sa velocit6 de sédimentation sur un gradient de sucrose. Ces r&sultats ont et6 rapport& pour I'hemoglobine humaine et le LPS d'entérobactéries (103, 173, 175, 176).

Nous avons ensuite d6tennint que l'hémoglobine diminuait I'activite biologique du LPS et qu'elle réduisait &gaiement son habilete à stimuler la production d'oxide nitrique par les macrophages murias. Far contre, la liaison de I'hCmoglobine humaine a

Cté associée ii une augmentation de llactivitt biologique du LPS de certaines entérobactéries ( 103. 104. 175, 176). Ces derniers résultats sont contradictoires à ceux

que nous avons obtenu et pourraient possiblement s'expliquer par le fait que la composition du lipide A difkre panni les bactéries B Gram ntgatif (107) et que le test LAL et la mtthode d'extraction du LPS etaient diffdrents. En effet, le type dbexosamine. le degré de phosphory lation. et la longueur des chaînes d'acides gras diffèrent entre le lipide A de diffdnntes familles bactériennes (107). Le LPS p u t &ûe

purifi6 par différentes mdihodes et il peut même &e acheté commercialement (3 1). De plus, certains chercheurs produisent leur test LAL alors que d'autres utilisent un test LAL commercial. Étant donné que nos résultats ne concordaient pas avec ceux existant dans la littérature nous avons efîectué notre test LAL avec de I'hdmoglobine humaine et du LPS dkntérobacieries. Dans notre essai. l'hémogiobine humaine a diminue l'activité biologique du LPS des entérobactéries. Nous pensons que le test LAL et les réactifs utilisés seraient responsables, du moins en partie, des résultats diffdrents obtenus par les deux groupes de recherche. 11 est intéressant de noter que la liaison du fer au LPS a entraîne une diminution de l'activité biologique du LPS et une diminution de

stimulation de l'activité procoagulante des cellules endahdliales (180). De plus, il a dté rapportd que le LPS prd-i ncubd en présence de fer était moins létal in vivo (97. 162).

Notre etude nous a permis d'élaborer une méthodologie en cytomCtrie en flux permettant de quantifier la liaison de l'hémoglobine porcine à la surface d'A. pleuropmmniae. Nous avons quantifié l'activite liant l'hémoglobine chez des souches repr6sentatives d'A. pleuroprtemoniar appartenant aux sérotypes 1 et 2. Nous nous sommes alors demande le r8le que pouvait jouer les polysaccharides de surface

dans l'activité liant I'h6moglobine. Des mutants isogdniques LPS et un mutant acapsulé d 'A. pleurupneumoniae sémtype 1 ont &té testés par cytométrïe en flux. I-activité liant I'hdmoglobine des mutants LPS analysés dans cette dtude était semblable h celle de la

souche mtre. Ces résultats semblent indiquer que les mutations dans la region du

noyau oligosacchacidique ou de l'antigène O n'affecte pas ou peu l'activite liant l'h6mogiobine qui implique d'ailleurs le lipide A. Les expériences menées avec le mutant acapsulC ont indique que les molécules de surface posséâant une activité liant ItMmoglobine Ctaient plus exposées B la surf= cellulaire en abence du polysaccharide capaulaire. Le matériel capsulaire sem Me donc masquer des composantes importantes de la membrane externe qui sont impliquées dans l'activité liant IriémogIobine.

Nous avons de plus dCmontré que la restriction en fer augmentait l'expression des rdcepteurs d'hCmoglobine. Ces rtsultats impliquent que I'activite liant lth6moglobine est. du moins en partie, rdpressiMe par le fer. Ces donndes nous indiquaient que des prottines de la membrane externe (OMPs) rdgulCes par le fer pouvaient possiblement ttre impliquees dans 11activit6 liant l'hemoglobine. C'est d'ailleurs pourquoi le profil des proteines de la membrane externe d'A. pleuropneuntoriiae sérotype 1 obtenu dans des conditions de croissance suffisantes ou restreintes en fer a été tvalué sur gel de polyacrylamide. Plusieurs OMPs rdgulées par le fer ont M observées suggtrant qu'une ou plusieurs de ces OMPs pounaient jouer un r8le dans l'activité liant l'h6moglobine dttectée par cytométrie en flux. Des OMPs r6guldes par le fer chez A. pleuropneunwniae ont déjh 6t6 rapportées par d'autres chercheurs (34,64, 67, 152).

Nous voulions ensuite déterminer l'habileté des souches de rdférence représentant les 12 sérotypes d'A. p&uropneultooniiac ih utiliser differentes sources de fer pour leur croissance. Toutes les souches ont utilise soit I'htmoglobine et/ou l'hémine porcine indiquant ainsi qu'un syst&me d'aquisi tion du fer provenant de

l'hdmoglobine etlou de l'hdmine est présent chez toutes ces souches. Cette acquisition ne semble pas sp6cifique d'espèce & n t donne que les souches d'A. pleuropneumoniae ont utilise egalement l'hemoglobine ou l'hdmine bovine comme seule source de fer pour croître. L'utilisation de Ilidmine ou de 1 'hémoglobine comme source de fer pour la croissance avait dtjà tté rapportCe chez des isolats des sérotypes 1 et 2 (7, 34). Etant donne que toutes les souches ont rtussi utiliser soit l'h6moglobine et/ou I'hdmine porcine et que tous les isolats testés en cytomdtrie en flux &aient capables de lier l'hdmoglobine à leur surface et que. de plus. cette activité liant l'htmoglobine etait en partie rtpressible par le fer. nous avons alors pense qu'après la liaison de l'hémoglobine aux LPS, d'autres molécules, dont possiblement des protdines de la membrane externe, pouvaient etre impliqutes dans l'acquisition du fer. Plusieurs proteines de la membrane externe dont la fonction serait de permettre l'acquisition du fer provenant des cornposés Ume ont eté récemment décrites chez diffdrentes bacteries (120).

Afïi d'identifier des récepteun protéiques impliqués dans la liaison B l'hémine eUou l'htmoglobine porcine. nous avons utilisé la chromatographie d'affinité oh la

protéines bactériennes Ctaient immobilisées à l'aide d'hémine- ou d'htmoglobine- agame. En utilisant cette procéâure une OMP majeure de 75 kDa liant I1hCmine et

I'hdmoglobine a ttd isolee chez A. pleuropneumoniae sémtype 1 souche 4074 après croissance dans des conditions de restriction en fer. Des OMPs mineures de 47 et 36

kDa liant l'hémine ou l'h6moglobine ont tté tgalement identifiées. Une etude portant sur les souches de rtférenœ des 12 s&otypes d'A. pkuropnciunoniue après croissance dans des conditions de restrictions en fer a révtlC que toutes les souches spth6tisaient au moins une de ces OMPs liant l'hémine et l'hemoglobine. Nous avons dgalement

identifie une protéine extracellulaire de 70 kDa liant l'hdmine et l'h6moglobine chez A.

pleuropneumoniae.

Les OMPs majeures de 75 kDa puririees par hemine-agarose ou Mmoglobine- agarose ont et6 analysées par un spectrometre de masse couple à un HPLC et B un séquenceur Edman. Ces analyses ont r6vClé des peptides communs entre I'OMP phfiée par hémine-agarose et ItOMP purifiée par hémoglobine-agarose. Ces résultats suggèrent fortement que ces peptides proviendraient de la meme OMP. Malgr6 plusieurs essais, il n'a pas dté possible de d6terminer la séquence N-terminale en acides aminés de L'OMP majeure de 75 kDa liant l'hemine et l'hémoglobine.

L'ensemble de nos rdssultats suggerent que I'OMP majeure de 75 kDa et les OMPs mineures de 36 et 47 H a liant l'hemine et l'bt5moglobine chez A.

pkwoprteumoniae pourraient bue impliquées dans le systeme d'acquisition en fer provenant de 1 'hdmine ou de I1hCmoglobine porcine. L'accumulation de l'h&noglobine à la surface de la fcllule bactérienne via son LPS pourrait agir comme un réservoir externe de storage de cette molbule. On peut Cgalement supposer que la liaison d'une molécule de I'hSte (I'hdmoglobine) à la surface bactérienne pourrait être un mécanisme permettant à la bacttrie d'échapper au systeme immunitaire. II existe di ffdrents mécanismes bactériens permettant d'échapper au système immunitaire. L'un d'entre eux est le recouvrement de mol6cules de lth6te à la surface de la bactdrie. En se recouvrant d'hemoglobine, A. pleuropneunwniue pourrait cacher ses antigènes de surface et dors échapper au système de reconnaissance de IliBte. Les macrophages, et autres cellules présentatrices d'antigtnes, ne pourraient donc pas reconnalve cet élement étranger de sorte que la présentation de Itantig&ne au système immunitaire ne

serait pas effectuée. Cette C i a p de reconnaissance et de présentation de l'antigène est essentielle iâ l'initiation de la réponse immune (182).

Le fer libre chez 1Wte se retrouve à des niveaux en-dessous de ceux requis pour supporter la missance microbienne (18,222). Afin de survivre chez I'Mte, les

bacteries pathogènes ont dtvelopp6 diff6nnt.s mécanismes de haute affi nit6 pour acqudrir le fer (182). Un de ces systèmes consiste en l'élaboration de protCines de suiface pcrmetlaat d'acqu6rir le fer provenant direciement de lriéme, de IWmine ou de Iriémoglobim (120). Un autre système d6nommé hémophored6pendant consiste en la s6cr6tion de prottines bactbriennes capables de lier les molCcules d'hérne ou d'h6moglobine de l'environnement et de les transporter ensuite aux rdcepteun bactériens de surface liant 1'hCme ou I'hemoglobine (66). Pendant l'infection. les cellules d'A. pleurop~teutmniae produisent des exotoxines. Deux de ces toxines sont connues pour avoir une activité hCmolytique. ce qui provoque un relâchement de l'hémoglobine des globules rouges. A. pleuropneumoniae pourrait alors qu6rir le fer in vivo en liant l'hémoglobine disponible B son LPS puis ii ses protdines liant lth6mine ou l'htimoglobine. Nous ne savons pas pour l'instant si ce double système de liaison à

l'hhglobine fonctionne ddpendarnment ou indtpendamment l'un de l'autre. Leur rBle semble par conm complementaire en ce sens que la liaison de l'hémoglobine porcine au LPS reprdsente selon nous une &tape de liaison permettant l'accumulation de I'hdmoglobine porcine h la surface du microsrganisme. L'OMP majeure et les OMPs mineures liant Ith&nine et I'hemoglobine identifiées dans ce travail seraient quant à elles im pliquh dans I'aquisi tion du fer provenant de Iliémoglobine porcine. Nous avons kgalement identifie une proteine extracell ulaire de 70 kDa 1 iant l'hémine et I1hdmog lobine chez A. pleutopneunu>niae. ce qui suggere l'existence dlun s y sterne hemophore-dépendant chez œ microorganisme. Les etudes recueillies dans cette th&= demontrent pour la première fois qu'A. pleuropneunwniae possede des récepteurs

protéiques liant I'htimine et l'htmoglobine. Des travaux supplémentaires sont requis d'identifier les autres proteines impliquées daas I'intemalisation subséquente du fer

ainsi que dans son transport du ptriplasme au cytoplasme.

V. CONCLUSION GÉNÉRALE

Les travaux dCcrits dans cette thèse ont permis d'augmenter nos connaissances sur les molécules impliqudes dans la liaison de Iridmoglobine porcine chez A. pleuropneumoniae. Nous avons tout d'abord d M t l a effets de la liaison de

lth~moglobine porcine sur les propriCtCs biologiques et physiques du LPS d'A. pleuropneumoniae. Les effets de l'h~moglobine porcine sur le LPS d'A.

plewopnerononiae n'avaient d'ailleurs jamais CtO rapportés.

Lors de cette ttude, nous avons élaboré une m6thodologie nous permettant de quantifier la liaison de l'hémoglobine porcine la surface d'A. pleuroprte~lt~~niae. Nous avons d6montré que la restriction en fer augmentait l'expression des récepteurs d'hémoglobine impliquant ainsi que L'activité liant l'h6moglobine &ait, en partie, répressible par le fer. Cette m6thodologie pourrait etre avantageusement utilisée pour ddterminer l'activité liant l'hémoglobine chez d'autres micro-organismes.

Au cours du prbnt travail, nous avons Qalement ddmontré pour la premii?re fois qu'A. pkuropneumoniae exprime des protdines liant l'hdmine et l'hdmoglobine. En utilisant une procédure de purification par affinité à l'aide d'hdmine-agarose ou d'hémoglobine-agame, une OMP majeure de 75 kDa liant l'hemine et l'hémoglobine a &é isolée chez A. pleuropne~tl~wae sérotype 1 souche 4074 après croissance dans des

conditions de restriction en fer. Des OMPs mineures de 47 et 36 kDa liant l'hémine ou l'hémoglobine ont Cie Cgalement identifiées. L'ensemble de nos r6sultats suggèrent que I'OMP majeure de 75 kDa et les OMPs mineures de 36 et 47 D a liant I'hemine et l'h~moglobine chez A. pleuropnewnonioc pourraient eue impliquh dans le système d'acquisition en fer provenant de 1' hémine ou de lBt?moglobine porcine.

Ces travaux ouvrent la voie à de futures recherches sur le système d'acquisition du fer provenant de l'ht5moglobine chez A. pleuropnemoniae. La mutation, par transposition ou échange all6lique. de chacune de ces proteines liant I'hemine et I'hemoglobine serait une approche permettant de détenniaer leur rôle dans l'acquisition du fer.

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Article

Inhibition of adhercnce of ActimbaciIlrrr~ewopmiunonicrC to porcine respiratory tract

celis by monodonai antiùodies dimicd against LPS and partial dwactcrization of the LPS ~ p m s

~ania-haine Rvadis. J. Daniel Duheuil. Marcclo Oonschalk. Mvle Amhimbiult and Mario Jacques

Dans ce travail, j'ai efftctu6 l'extraction cles macmphogcs des poumons de porcs et j'ai partici* P. la rédaction du manuscrit

ABSTRACT

Actinobacillrrsp&wop~~~l~lt~nicac is the causativt agent of' porcine fibrinohemonbegic necrotizing pleuropneumonia We have previously identified die Iipopolysoccharides (LPS) as the major adhesin of A. piewop~t~runoniue involvecl in adherence to porcine respiratory tract cells. In the pnsent study. adherence of A. pkuropnerrmoniioc to porcine tracheal f m n sections was inhibited by homologous monovalent Fab fragments produced from monoclonal antibodies S. 1 G8F10 and 102-002 directal. rcspectively, against the A. plciiropneunwriicu serotype 1 or serotype 2 Oantigens. These results confirm the important role played by LPS in adherence of A.

p lc~~~pne~l l l~r t ioe and suggest that these adhesins might rcprtsent good vaccine

candidates. We also investigated the prescnce of A. pkuropnerunonioc recepton in tracheal cell prcparations from piglets of four differmt brreds. Using Far-Western binding assays, we identified proteins recognized by whole cells of A.

plcuropnéunwrtioe nlerencc mains for serotypes 1 and 2, and local isolates klonging to the same semtypcs, and also recognized by extracted LPS from both rderence strains. We conliinned the proteinaceous nature of these LPS-binding molecules by

their staining with Cwmassie brilliant blue, scnsitivity to proteinase K digestion. nsistance to sodium m-periodate oxidation, and their inability to stain with glycoprotein specific rcagents. Four low molecular mass bands (14 17 D a ) samed to comspond to histones. We ais0 idenrificd proteins at Mr 38 5ûû that could rcpresent putative naptors for A. pleump~t~~lll~nicrc LPS in wim mpiratory tract cells.

Key words: A. pIcwop~runoniue, lipopolysaccharides. adherenœ, respiratory tract,

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Liste des communications

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