Ensemencement d'Une Galarie API 20

TECHNIQUES DE LABORATOIRE POUR LE DIAGNOSTIC DESBACTRIES PHYTOPATHOGNES

Ce document a pour objectif de prsenter les diverses techniques utilises auLaboratoire de diagnostic en phytoprotection pour la dtection et lidentificationdes bactries phytopathognes.

Lisolement des bactries sur des milieux de culture gnraux ou diffrentielsdemeure souvent ltape de base pour le diagnostic des maladies bactriennes. la suite de leur mise en culture, les bactries sont identifies par les techniquessuivantes :

Tests biochimiques classiques Systme API 20E Systme Biolog Test srologique ELISA Test biologique

Une dtection des bactries directement dans les tissus vgtaux peut treralise par les techniques suivantes :

Test srologique ELISA Immunofluorescence (IMF)

Des tests sont raliss pour vrifier la rsistance de certaines bactries desproduits utiliser dans le cadre de la lutte antiparasitaire.

Rsistance du Xanthomonas campestris au cuivre Rsistance de Erwinia amylovora la streptomycine.

ISOLEMENT DES BACTRIES PHYTOPATHOGNES SUR DESMILIEUX DE CULTURE GLOSS

Lisolement des bactries phytopathognes, sur des milieux de culture gloss,demeure souvent ltape de base pour le diagnostic des maladies bactriennes.Par la suite, diverses techniques peuvent tre utilises afin didentifier lesbactries isoles. Les milieux de culture utiliss au Laboratoire de diagnostic enphytoprotection sont de deux types :

milieu diffrentiel : diffrents genres et espces bactriens peuvent y crotremais ce type de milieu permet facilement de reconnatre un genre ou uneespce grce son apparence unique et caractristique.

milieu gnral : toutes les espces bactriennes phytopathognes peuvent ycrotre.

Ces milieux de culture doivent contenir tous les lments essentiels lacroissance dune bactrie soit des sources de carbone et dazote ainsi que dessels minraux.

Parmi les genres bactriens phytopathognes les plus couramment identifis auLaboratoire de diagnostic en phytoprotection, nous retrouvons : Agrobacterium,Clavibacter, Erwinia, Pseudomonas, Streptomyces et Xanthomonas . Cependant,dautres genres bactriens ont t galement identifis soit Acidovorax,Rhodococcus , Burkholderia et Ralstonia.

Depuis la mise en place du Laboratoire de diagnostic en phytoprotection (1986),les principales espces bactriennes identifies sur les plantes cultives reuessont:

Acidocorax avenae subsp. cattleyae (phalaenopsis) Agrobacterium tumefaciens (framboisier, bleuet, plantes ornementales,

pommier) Burkholderia cepacia (oignon) Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (poivron, tomate) Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (pomme de terre) Erwinia amylovora (pommier, sorbier, poirier, framboisier) Erwinia carotovora subsp. atroseptica (pomme de terre) Erwinia carotovora subsp. carotovora (plusieurs espces vgtales) Erwinia tracheiphila (concombre) Pseudomonas corrugata (tomate) Pseudomonas fluorescens IVb, Pseudomonas marginalis et Pseudomonas

viridiflava (plusieurs espces vgtales)

Pseudomonas syringae pv. apii (cleri) Pseudomonas syringae pv. lachrymans (cucurbitaces) Pseudomonas syringae pv. maculans (crucifres) Pseudomonas syringae pv. syringae (lilas, impatiens) Pseudomonas syringae pv. tomato (tomate) Ralstonia solanacearum (tomate) Rhodococcus fascians (granium) Streptomyces spp. (pomme de terre, rutabaga, betterave, carotte) Xanthomonas campestris pv. armoraciae (crucifres) Xanthomonas campestris pv. begoniae (bgonia) Xanthomonas campestris pv. campestris (crucifres) Xanthomonas campestris pv. carotae (carotte) Xanthomonas campestris pv. cucurbitacearum (citrouille) Xanthomonas campestris pv. glycines (soya) Xanthomonas campestris pv. hederae (hedera) Xanthomonas campestris pv. pelargonii (granium) Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (piment, tomate) Xanthomonas campestris pv. vitians (laitue) Xanthomonas fragariae (fraise)

PROTOCOLE POUR LISOLEMENT DES BACTRIES SUR DES MILIEUX DE CULTURE GLOSS

tissu vgtal

symptomatiquePrlever des pices du tissuinfect et les laver leau durobinet.

Eau physiologiquestrile (NaCl 0,85%)

Sectionner les pices en deuxet les placer dans de leauphysiologique strile. Laissertremper de 20 minutes 2heures, selon la bactrierecherche.

1/10 1/100

Pour les tissus prsentant une pourriture molle, faire des dilutions1/10 et 1/100.

laide dune anse inoculer strile, ensemencer parpuisement des milieux de culture spcifiques labactrie recherche, afin d'obtenir des colonies isoles.

1/10 1/100

la suite dune incubation de 24 72 heures 26oC, vrifier la croissance bactrienne. Notersil y a prsence de colonies caractristiques.

partir dune colonie isole, inoculerun milieu de culture gnral afin deraliser subsquemment des testsdidentification.

SPCIFICATIONS SUR LA PRPARATION DES ISOLEMENTS,SUR LES MILIEUX DE CULTURE GLOSS ET LES TESTS

DIDENTIFICATION

SYMPTME PRINCIPALBACTRIE PHYTOPATHOGNE

SPCIFICATIONS POUR LAPRPARATION DES

ISOLEMENTS

MILIEU DECULTURE

TESTS POURLIDENTIFICATION DES

BACTRIES

CHANCREErwinia amylovoraErwinia carotovora subsp. atroseptica*Erwinia carotovora subsp. carotovora*

Pseudomonas corrugataPseudomonas syringae

Faire tremper dans leauphysiologique (0,85 %) de 40 60 minutes.Enlever lpiderme des tigespour E. amylovora et P.syringae .*Faire des dilutions 1/10 et1/100

CCTMSMSKBKB

API 20ETests biochimiquesTests biochimiquesBiologLOPAT

FLTRISSEMENT/DPRISSEMENT

Clavibacter michiganensis subsp.michiganensisErwinia amylovoraErwinia tracheiphilaRalstonia solanacearumXanthomonas campestris pv.pelargonii

Faire tremper dans leauphysiologique (0,85 %) 2heuresEnlever lpiderme des tiges.

LPGA

CCTNAP

SMSALPGA

ELISA

API 20ETest biologiqueBiologELISA

POURRITURE MOLLEBurkholderia cepaciaErwinia pectinolytiquesErwinia amylovoraPseudomonas fluorescents etpectinolytiques

Faire tremper dans leauphysiologique (0,85%) de 20 30 minutes.Faire des dilutions (1/10,1/100) avant ltalement surmilieu de culture

LPGA

MS

CCT

KB

Biolog

Tests biochimiques

API 20E

LOPAT

TACHE ET BRLURE FOLIAIRE

Acidovorax avenae subsp.cattleyaeClavibacter michiganensis subsp.michiganensisPseudomonas syringaeXanthomonas campestrisXanthomonas campestris pv.campestris et Xanthomonascampestris pv. armoraciaeXanthomonas campestris pv.pelargonii

Faire tremper dans leauphysiologique (0,85%) de 20 30 minutes

KB

LPGA

KB

LPGA

LPGA

LPGA

Biolog

ELISA

LOPAT

Biolog

Test biologique

ELISA

DESCRIPTIONS MORPHOLOGIQUES DES COLONIESBACTRIENNES SUR MILIEUX GLOSS

PSEUDOMONAS FLUORESCENTS

Lorsquune bactrie du genre Pseudomonas fluorescent est souponne, unmilieu B de King (milieu KB) est inocul et incub 26oC pour 24 72 heures.Aprs le temps dincubation, nous recherchons sur le milieu de culture laprsence de colonies bactriennes produisant des pigments fluorescents bleuts.Ces pigments sont visibles lorsque les milieux de culture sont exposs lalumire ultra violet (UV). Dans laffirmative, des tests biochimiques connus sousle nom de LOPAT sont raliss pour identifier lespce bactrienne.

Croissance : gnralementabondante aprs 48 heures

Colonie : blanchtre crme

Pigment : fluorescent et diffusdans le milieu

Diamtre moyen : 1 3 mm(aprs 48 heures dincubation)

ERWINIA PECTINOLYTIQUE

Lorsquune bactrie du genre Erwinia ayant une activit pectinolytique estsouponne, un milieu MS est inocul et incub 26oC pour 24 72 heures.Aprs le temps dincubation, nous recherchons sur le milieu de culture laprsence de colonies bactriennes oranges ayant une marge nbuleuse. Danslaffirmative, des tests biochimiques classiques sont raliss pour dterminerlespce.


Colonie : orange avec contournbuleux


XANTHOMONASLorsquune bactrie du genre Xanthomonas est souponne, un milieu LPGA estinocul et incub 26oC pour 24 72 heures. Aprs le temps dincubation, nousrecherchons sur le milieu de culture la prsence de colonies bactriennes jauneple jaune vif. Dans laffirmative, pour dterminer lespce ou le pathovar,nous ralisons les tests suivants :

Xanthomonas campestris test BiologXanthomonas campestris pv. armoraciae test biologiqueXanthomonas campestris pv. campestris test biologiqueXanthomonas campestris pv. pelargonii test ELISA

Croissance : gnralement abondanteaprs 48 heures

Colonie : luisante, marge bien dfinie etayant une couleur jaune ple jaunevif

Diamtre moyen : moins de 1 mm(aprs 48 heures); il faut souventattendre 72 heures pour obtenir descolonies de 1 2mm

CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSISLorsque Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis est souponn, unmilieu LPGA est inocul 26oC pour 24 72 heures. Aprs le tempsdincubation, nous recherchons sur le milieu de culture la prsence de coloniesbactriennes irrgulires, crme jauntre. Dans laffirmative, pou erlespce, un test ELISA est ralis.

Croissance : gnralement peu abon-dante aprs 48 heures

Colonie : ronde irrgulire ayant unecouleur crme jaune

Diamtre moyen : moins de 1 mm(aprs 48 heures dincubation);il faut souvent attendre 72 heuresdincubation pour obtenir des coloniesde 1 2 mm.

72 heures

48 heuresr dtermin

ERWINIA AMYLOVORA

Lorsque Erwinia amylovora est souponn, un milieu CCT est inocul et incub 26oC pour 24 72 heures. Aprs le temps dincubation, nous recherchons sur lemilieu de culture la prsence de colonies bactriennes particulirement convexeset bleutes. Dans laffirmative, un test API 20E est ralis pour identifier labactrie.


Colonie : vue du dessus, ellessont trs convexes, luisantes etdune couleur gristre bleute

Vue du dessous, ellesprsentent une marge luisante


Vue par dudessus du Ptri

du Ptri

Vue du dessous

TESTS BIOCHIMIQUES CLASSIQUES

Bien que les tests biochimiques constituent une approche classique pour lidentificationdes bactries, il nen demeure pas moins quils sont particulirement utiles pour ladtermination de certaines espces et sous-espces de bactries phytopathognes.Grce ces tests, il est possible de connatre certaines caractristiques du mtabolismedes bactries isoles.

Les tests biochimiques permettent donc de vrifier si la bactrie a un mtabolismeoxydatif ou fermentatif, sil y a formation dun acide la suite de lutilisation dunhydrate de carbone (ex : glucose, arabinose, sorbitol ...), si un compos particulier estutilis comme seule source de carbone (ex : citrate, malonate ...), si un acide aminpeut tre transform (ex : arginine, lysine, tryptophane ...), si un enzyme particulier estprsent (ex : oxydase, catalase, pectinase ...) ou si des molcules complexes sontdgrades (ex : glatine, amidon ...).

Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, ces tests sont utiliss pouridentifier les Erwinia pectinolytiques et les Pseudomonas fluorescents.

1. Si des colonies bactriennes, sur le milieu MS (Miller-Schroth), possdent lescaractristiques dun Erwinia, les tests effectus pour vrifier sil sagitrellement dun Erwinia pectinolytique sont: oxydase, catalase,oxydation/fermentation, dgradation de la pectine (pectinase). Par la suite,pour diffrencier les espces et les sous-espces dErwinia pectinolytique lestests suivants sont raliss : transformation du sucrose en substancesrductrices, utilisation du mthyl-glucoside, production dindole etcroissance 35oC :

Tests biochimiques et culturaux pour distinguer les Erwinia pectinolytiques

Tests

Erwinia

Oxydase Catalase Oxydation/Fermentation

Pectinase Mthyl-glucoside

Sucrose Productiondindole

Croissance 35oC

Erwiniacaratovorasubsp.carovotora

- + + + - - - +

Erwiniacarotovorasubsp.atroseptica

- + + + + + - -

Erwiniachrysanthemi

- + + + - - + +

Lgende :

Oxydase

Catalase

Fermentation

Pectinase

Mthyl-glucoside

Sucrose

Indole

Dtermination de la prsence de lenzyme cytochrome C oxydase.

Dcomposition du peroxyde dhydrogne (H2O2) par la catalase.

Utilisation du glucose en condition anarobie.

Dtermination de la prsence de pectinases (substrat utilis : lacidepolygalacturonique).

Utilisation du mthyl-glucoside comme seule source de carbone.

Transformation du sucrose en substances rductrices.

Formation dindole partir du tryptophane (acide amin).

2. Si des colonies bactriennes fluorescentes, sur le milieu B de King,caractristiques dun Pseudomonas sont prsentes, les tests raliser(connus sous le nom de LOPAT) pour distinguer les espces sont :production de levane, prsence doxydase, dgradation de la pectine(pectinase), prsence darginine dshydrolase et lhypersensibilit du tabac.

Tests biochimiques et culturaux pour distinguer les espces dePseudomonas fluorescents

GroupeTests

Pseudomonas Levane Oxydase PectinaseArginine

dshydrolaseHypersensibilit

sur tabac

Ia P. syringae + - - - +

Ib P. delphini - - - - +

II P. viridiflava - - + - +

III P. cichorii - + - - -

IV a P. marginalis + + + + -

IV b P. fluorescens - + + + -

V a P. tolaasii - + - + -

V b P. fluorescens + + - + -

Lgende :

Levane

Oxydase

Pectinase

Arginine dshydrolase

Hypersensibilit dutabac

Polymrisation du fructose en polyfructose (levane).

Dtermination de la prsence de lenzyme cytochrome Coxydase.

Dtermination de la prsence de pectinases (substrat utilis :lacide polygalacturonique).

Transformation de larginine (acide amin) par largininedshydrolase.

Mise en vidence du pouvoir pathogne dune bactrie par ledesschement des zones dinoculation sur les feuilles de tabac.

API 20E

La galerie API 20E (bioMrieux) est une version miniaturise des testsbiochimiques classiques destins lidentification des Enterobacteriaceae(bactries Gram ngatif et anarobies facultatives) dont font partie les Erwinia.Ce systme regroupe 23 tests biochimiques. Des substrats dshydrats sontcontenus dans des microtubes. Ces substrats sont mis en solution grce laddition dune suspension de la bactrie identifier. la suite dune priodedincubation (24 heures 30oC), permettant la bactrie de ragir avec lessubstrats, les diverses ractions sont notes afin de dterminer le codedidentification compos de 7 chiffres.

Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, le systme API 20E est utilispour lidentification de Erwinia amylovora, agent responsable de la brlurebactrienne chez les plantes de la famille des Rosaceae.

Pour Erwinia amylovora, les principaux codes didentification obtenus avec API20E sont 0005522 et 0007522.

A- INOCULATION DUNE GALERIE API 20E

A partir dune culture pure de 18 24 heures, faire une suspensionbactrienne ayant une concentration de 108 bactries/ml (standardMcFarland No 5) dans 5 ml de saline strile (NaCl 0,85%) un pHentre 5,5 et 7,0.

Bien mlanger la suspension bactrienne au vortex 5-10 secondes.

Contrle de qualit : La suspension bactrienne doit tre utiliser dans les 15minutes suivant sa prparation.

Dposer soigneusement 150 l de la suspension bactrienne danschaque cupule de la galerie en utilisant un embout strile.

Ajouter de nouveau 150 l de la suspension bactrienne aux cupulesCIT, VP et GEL (total = 300 l) par puits.

Aprs linoculation, remplir les cupules ADH, LDC, ODC, H2S et UREdhuile minrale.

Ajouter de leau dans les supports, y dposer la galerie et mettre lecouvercle.

Placer les galeries dans une chambre humide (bote de plastique aveccouvercle contenant un papier humide) et incuber 30oC pendant 18 24 heures.

B- LECTURE DES GALERIES

Faire la lecture des galeries sous une hotte chimique.

Consigner les ractions sur une fiche de rsultats comme celle-ci :

Lgende :

ONPG -

ADH -

LDC -

ODC -

CIT -

H2S -

URE -

TDA -

IND -

VP -

GEL -

Dtermination de la prsence de lenzyme -galactosidaseTransformation de larginine (acide amin) par larginine dshydrolase

Transformation de la lysine (acide amin) par la lysine dcarboxylase

Transformation de lornithine (acide amin) par lornithine dcarboxylase

Utilisation du citrate comme seule source de carbone

Production du sulfure dhydrogne (H2S) partir du thiosulfate (S2O3)

Libration dammoniac partir de lure grce lurase

Formation de lacide indolepyruvique partir du tryptophane (acide amin)grce la tryptophane dsaminase

Formation dindole partir du tryptophane (acide amin)

Formation dactone partir du piruvate de sodium

Liqufaction de la glatine (protine)

GLU (glucose), MAN (mammitol), INO (inositol), SOR (sorbitol), RHA (rhamnose), SAC(sucrose), MEL (mlobiose), AMY (amygdaline), ARA (L+arabinose) - formation dacide la suite de lutilisation dun hydrate de carbone.

Contrle de qualit : Lire et consigner toutes les ractions avant laddition desractifs pour la rduction des nitrates et de lindole car ces ractions dgagentdes produits gazeux qui peuvent interfrer avec les autres preuves de lagalerie. Ne pas replacer le couvercle en plastique aprs laddition des ractifs.

La lecture des galeries se fait gnralement au bas de chaque cupulesauf CIT, IND.

Lire en suivant lordre ci-dessous (consulter le tableau des rsultatsannex cette technique) :

VP - Ajouter 1 goutte dhydroxyde de potassium (40%)Ajouter 1 goutte dalpha-naphtol (6%)Attendre 10 minutes

Pendant ce temps, faire la lecture des autres cupules saufTDA et IND en inscrivant la couleur et la raction (+ ou -)sur une fiche de rsultats.

Lire la raction du VP

GLU - Avant laddition des ractifs, observer sil y a prsencede bulles (+ ou -) qui indiquent une rduction du nitrate ltat gazeux (N2).

Ajouter 2 gouttes dacide sulfanilique (0,8%)Ajouter 2 gouttes de NN-dimethyl-alpha-naphthylamine (0,05%)Attendre 2-3 minutes

Pendant ce temps, faire les ractions TDA et IND.

TDA - Ajouter 1 goutte de chlorure ferrique (10%), lire laraction immdiatement.

IND - Ajouter 1 goutte du ractif de Kovac, lire la ractionimmdiatement.

Lire la raction GLU. Si la raction est ngative, ajouter dela poudre de zinc. Attendre 10 minutes et faire la lecture decette dernire raction.

Exemple dune galerie du systme API 20E avant laddition des ractifs

TABLEAU DES RSULTATS MTHODE DE 18 24 HEURES

RACTIONS

TUBE POSITIVE NGATIVE COMMENTAIRES

ONPG Jaune Incolore

Une teinte jaune ple estsouvent obtenue, laconsidrer comme uneraction ngative.

ADH Rouge ou orange Jaune

LDC Rouge ou orange Jaune

ODC Rouge ou orange Jaune

CIT Turquoise oubleu fonc

Vert ple oujaune

La lecture se fait dans lapartie suprieure de lacupule (en arobie).

H2S Dpt noir Aucun dpt noir

URE Rouge ou orange Jaune

TDA Brun-rouge JauneAjouter 1 goutte de chlorurede fer 10%. Lireimmdiatement la raction.

IND Anneau rouge JauneAjouter 1 goutte du ractifde Kovac. Lire la ractionaprs 2 minutes.

VP Rose fonc ou rouge Incolore ou rose pleAjouter 1 goutte de KOH 40% puis 1 goutte dalpha-naphthol 6%. Lire laraction aprs 10 minutes.

GEL Diffusion du pigment Aucune diffusion,incolore

La rpartition des particulessolides travers la cupuledoit tre considre commeune raction ngative.

RACTIONS

TUBE POSITIVE NGATIVE COMMENTAIRES

GLUMANINOSORRHASACMELAMYARA

Jaune Bleu ou bleu-vert

La fermentation des sucrescommence dans la partie laplus anarobique de lacupule (partie infrieure). Ilfaut lire ces ractions partir de la base de lacupule vers le haut. Unecouleur jaune au fondindique une ractionpositive.

GLU

Rductiondes

nitrates

N2 gazeux (prsence debulles)

Prsence de NO2 (rouge)

Prsence de bulles etcoloration jaune(aprs lajout du ractifzinc

Jaune

Orange (aprs lajout duractif de zinc)

Avant dadditionner lesractifs, observer laprsence de bulles dans lacupule GLU. Ceci indique-rait la rduction des nitratesen gaz (N2).

Ajouter 2 gouttes dacidesulfanilique 0.8% et 2gouttes de NN-dimethyl-alphanaphtylamine 0,5%.Lire la raction aprs 2 ou 3minutes.

Confirmer si la raction estngative en ajoutant de lapoudre de zinc. Lire laraction aprs 3 ou 4minutes.

BIOLOGLes plaques Biolog GN 2 sont utiliss pour identifier les bactries Gram ngatif.Lidentification des bactries est base sur lutilisation de 95 sources de carbone.Une coloration pourpre est produite par la rduction de lindicateur, lettrazolium, en un compos color le formazan.

Reprsentation dune plaque GN 2 de Biolog contenant 95 sources de carbone.

A- INOCULATION DES PLAQUES BIOLOG GN 2

Contrle de qualit : Les plaques Biolog GN doivent tre temprature de lapice (environ 21-22oC) . La suspension bactrienne doit tre utiliser dans les 15minutes suivant sa prparation.

Faire un test oxydase sur les bactries identifier (culture de 18-24heures).

- Oxydase positive : non-entrobactrie- Oxydase ngative : entrobactrie ou non-entrobactrie

Si le test oxydase est ngatif, faire un test oxydation/fermentation partir du glucose. Ce test nous permet de connatre si notre bactrierecherche est une entrobactrie ou une non-entrobactrie.

- Oxydation/fermentation positif : entrobactrie- Oxydation/fermentation ngatif : non-entrobactrie

Contrle de qualit : Il est essentiel de bien dfinir si la bactrie identifier estune entrobactrie ou une bactrie non-entrobactrie car la banque de donnesde Biolog est base sur cette information.

partir dune culture pure de 18 24 heures, utiliser un cotton-tigestrile pour faire une suspension bactrienne dans un tube de 20 mldeau physiologique strile (NaCl 0,85%). La suspension bactriennedoit avoir une transmittance de :

- de 52 % + ou 3 % si une non-entrobactrie- de 63 % + ou 3 % si une entrobactrie

r l'lectrophotomtre ou tubidimtre,lequel doit tre calibrer avec lestubes standards de la compagnieBiolog Inc.

Bien mlanger la suspension bactrienne laide du coton-tige. Si lasuspension bactrienne nest pas homogne (formation damasbactriens) ajouter 3 gouttes de sodium thioglycolate.

Dposer 150 l de la suspension bactrienne par puits.

Placer les plaques Biolog GN 2 dans une chambre humide et incuber24 heures 30oC.

B- LECTURE DES PLAQUES BIOLOG GN 2

Lidentification des bactries par le systme Biolog sappuie sur unebase de donnes contenant les profils dutilisation de 95 sources decarbone par la majorit des espces bactriennes phytopathognes.

Entrer la raction de chaque puits dans le logiciel fourni par lacompagnie Biolog Inc.

Contrle de qualit : Le puits A1 doit tre incolore. Sil est violet, ne pas lire laplaque.

L'oxydation des substrats par labactrie se traduit par lapparitiondune couleur pourpre dans lespuits. En labsence de lutilisationdu substrat, le puits demeureincolore.

C- INTERPRTATION DES RSULTATS

la suite de la saisie des rsultats, sur lutilisation des substrats par labactrie inconnue, le systme informatique Biolog compare ce profil ceux des espces contenues de la base de donnes. Lidentificationest donc ralise en jumelant le profil de la bactrie identifier celuide lespce bactrienne phytopathogne prsentant le plus desimilarit.

Avec le systme Biolog, une identification est valable si le coefficientde similarit est suprieur 0,50. Il est essentiel de considrer cettedonne lors de linterprtation des rsultats pour le diagnostic.

Exemple dune identification ralise par le systme Biolog

TESTS SROLOGIQUES

Lutilisation danticorps pour le diagnostic des maladies bactriennes reprsenteune mthode spcifique et rapide. Au Laboratoire de diagnostic enphytoprotection, les tests srologiques sont utiliss pour dtecter une bactriedirectement dans les tissus vgtaux ou pour identifier une espce bactrienneisole sur milieu de culture glos.

Les anticorps sont des protines produites par le systme immunitaire desvertbrs. Lorsquun antigne (composante trangre) est prsent chez unvertbr, des anticorps sont labors contre celui-ci. Il est possible de produirecommercialement des anticorps destins au diagnostic des maladiesbactriennes. En injectant, dans une souris ou un lapin, une cellule bactrienneou une de ces composantes, des anticorps sont synthtiss contre cet antigne. la suite du prlvement du sang, les anticorps sont purifis et ils peuvent treutiliss pour le diagnostic de lespce bactrienne concerne.Sur une cellulebactrienne, plusieurs sites antigniques sont prsents et chacun induit laproduction danticorps. Linjection dun antigne engendre donc la synthse deplusieurs types danticorps dont lensemble est qualifi danticorps polyclonaux. Ilest possible dobtenir des anticorps ragissant spcifiquement avec un seul siteantignique. Ces anticorps sont dits monoclonaux. La spcificit accrue desanticorps monoclonaux permet de raliser un diagnostic des plus fiable.

TEST SROLOGIQUE ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)

Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, le test ELISA est utilis pouridentifier la bactrie responsable de la tache bactrienne chez le granium soitXanthomonas campestris pv. pelargonii et la bactrie responsable du chancrebactrien chez la tomate soit Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis .Dans ces cas, la bactrie est isole sur milieu de culture et le test ELISA permetdidentifier le pathovar. Pour le Xanthomonas campestris pv. pelargonii et leClavibacter michiganensis subsp. michiganensis, la technique employe est le double antibody sandwich .Dune faon gnrale, cette approche comportequatre tapes soit le recouvrement des puits dune plaque en polystyrne par unanticorps spcifique la bactrie recherche, lajout de la suspensionbactrienne, laddition dun anticorps, spcifique la bactrie recherche, auquelun enzyme a t li (anticorps conjugu) et finalement lajout du substrat delenzyme ainsi que la lecture de la plaque une longueur donde approprie.Dans le prsent cas, lenzyme utilis est la phosphatase alcaline. Laddition dunsubstrat, le p-nitrophnyl phosphate, est alors transform par la phosphatasealcaline en p-nitrophnol lequel est un compos jaune si la bactrie identifierest du Xanthomonas campestris pv. pelargonii ou du Clavibacter michiganensissubsp. michiganensis.

1- RECOUVREMENT DES PUITS

oooooooooooooo ooooooooooooooooo oooooooooooooooooo

Anticorps de recouvrement Incubation Lavages

2- ADDITION DE LANTIGNE

Suspensionbactrienne

oooooooooooooo oooooooooooooooo ooooooooooooooooo

Incubation Lavages

3- ADDITION DE LANTICORPS LI LENZYME (phosphatase alcaline)

oooooooooooooo ooooooooooooooooo ooooooooooooooooo

Anticorps li lenzyme Incubation Lavages

4- ADDITION DU SUBSTRAT (p-nitrophnyl phosphate) ET LECTURE

Substrat Incubation Lecture

TEST BIOLOGIQUE

Le test biologique utilis pour le diagnostic des maladies bactriennes sert diffrencier deux bactries phytopathognes affectant les crucifres soitXanthomonas campestris pv. campestris (nervation noire) et Xanthomonascampestris pv. armoraciae (tache bactrienne). La base de ce test consiste linoculation de plantules de chou et lobservation de symptmes diffrentiels.

A- INOCULATION DE PLANTULES DE CHOU

La distinction entre le Xanthomonas campestris pv. campestris et leXanthomonas campestris pv. armoraciae se fait par linoculation de plantulesde chou au stade premire feuille (environ 8 10 jours aprs le semis).

laide dun scalpel strile, enlever un des cotyldons en ne brisant pas latigelle.

partir dune culture pure de 24 heures, inoculer laide dun cure dentsstrile la tige lendroit o le cotyldon a t excis. Inoculer 3 isolatsdiffrents pour chaque chantillon.

Incuber 24 oC dans un cabinet de croissance ayant une photopriode de 12heures et une humidit relative de 80%.

Inoculer des plantules de chou avec des tmoins : Xanthomonas campestrispv. campestris et Xanthomonas campestris pv. armoraciae.

B- INTERPRTATION DES RSULTATS

Un examen visuel se fait aprs 4, 7 et 14 jours suivant linoculation desplantules de chou avec la bactrie.

Raction de Xanthomonas campestris pv.armoraciae :

Aprs 4 7 jours, des lsions noiresapparaissent le long de la tige au sitedinoculation.

Raction de Xanthomonas campestris pv.campestris :

Aucun symptme avant 10 14 jours.Les symptmes se caractrisent par unjaunissement dbutant habituellement lamarge des feuilles, accompagn dunnoircissement des nervures plus ou moinsimportant selon la virulence de la bactrie.Absence de noircissement de la tigecomme avec Xanthomonas campestris pv.armoraciae

RFRENCE

Alvarez, A.M., A.A. Benedict, C.Y. Mizumoto, J.E. Hunter et D.W. Gabriel. 1994.Serological, pathological, and genetic diversity among strains of Xanthomonascampestris infecting crucifers. Phytopathology 84 : 1449-1457.

IMMUNOFLUORESCENCE

Limmunofluorescence est utilise pour la dtection de Clavibacter michiganensissubsp. sepedonicus dans les tiges ou les tubercules de pomme de terresouponns dtre affects par le fltrissement bactrien. Lutilisation duncompos fluorescent (isothiocyanate de fluorescine) conjugu un anticorpsconstitue la base de cette technique. Cest grce lobservation microscopiquesous une lumire ultraviolet quil est possible de visualiser les bactries. Dans lecas dun chantillon contenant du Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicusles cellules bactriennes mettent une fluorescence vert brillant grce lisothiocyanate de fluorescine.

1- RECOUVREMENT AVEC LANTIGNE

ou

Extraction Incubation dans le tampon Dpt sur lame IMF Scher 50oC Fixer dans lactone

2- ADDITION DE LANTICORPS SPCIFIQUE Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus

Anticorps Incubation, lavages et schage

3- ADDITION DE LANTICORPS CONJUGU LISOTHIOCYANATE DEFLUORESCINE

4- LECTURE AU MICROSCOPE FLUORESCENCE

Les anticorps utiliss sont des anticorps de surface. Nouspouvons voir au microscope la forme rnale de la bactrie quinous parat fluorescente.

TEST DE LA RSISTANCE AU CUIVRE

Le test de la rsistance au cuivre a pour objectif de vrifier si les bactries dugenre Xanthomonas sont sensibles ou rsistantes au cuivre afin dorienter lesproducteurs dans leur intervention au champ pour lutter contre certainesmaladies bactriennes associes au Xanthomonas..

A- PRPARATION DES CULTURES BACTRIENNES

Sur milieu de culture levure peptone glucose agar (LPGA), repiquer 4 coloniesbactriennes isoles afin dobtenir des cultures pures. Diviser la bote de Ptrien 4 quadrants.

Incuber 26o C pendant 24 48 heures.

B- RALISATION DU TEST DE RSISTANCE AU CUIVRE.

Identifier 3 quadrants sur les botes de Ptris du milieu levure peptoneglucose agar (LPGA) et dun milieu cuivre pour les bactries tester.Identifier 2 quadrants pour les tmoins sensible et rsistant au cuivre sur lesmmes milieux.

A partir dune culture pure de 18 24 heures, inoculer la fois un milieu deculture levure peptone glucose agar (LPGA) qui sera notre tmoin decroissance des bactries testes et un milieu cuivre contenant 200 ppm deCuSO4. La croissance sur ce dernier milieu rvlera donc la rsistance de labactrie au cuivre.

Incuber 26o C pour 48 heures.

la suite de lincubation, lire la raction comme suit :

Observation dune croissance sur le milieu cuivre: indique que la bactrieest rsistance au cuivre

Aucune croissance sur le milieu cuivre: indique que la bactrie est sensibleau cuivre.

Il est bien sr toujours important de se rfrer au tmoin positif decroissance.

MILIEUX POUR LA CULTURE DES BACTRIES ET LARALISATION DES TESTS BIOCHIMIQUES

1. MILIEUX GLOSS POUR LA CULTURE DES BACTRIES

MILIEU CCT (milieu diffrentiel pour Erwinia amylovora)

g/L

Sucre de table 100.000

Sorbitol 10.000

Tergitol anionic 7 (solution de 1%) 30.0 ml

Crystal violet (solution de 0.1% dans thanol) 2.0 ml

Nutrient agar 23.000

* Cycloheximide 0.050

Prparer les diverses solutions.

Dissoudre les produits un un sauf la cycloheximide dans 800 ml H2O distille.

Ajouter les diverses solutions aux produits dissous.

Complter 1 litre avec H2O distille.

Striliser 15 minutes 121oC et 15 psi.

* Dissoudre la cycloheximide dans 10 ml H2O distille strile et lajouter lorsquele milieu a atteint 45oC.

Laisser agiter 10 minutes et couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri.

NOTES : Striliser au moins 25 30 minutes si nous prparons 3 litres demilieu.

Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21-22oC) afinde sassurer de la strilit du milieu.

Toujours inoculer le milieu avec une bactrie de rfrence pourconnatre la morphologie des colonies et la vitesse de croissance dela bactrie recherche.

Conserver la noirceur 4oC.

RFRENCE

ISHIMARU, C. and E.J. KLOS, 1984. New medium for detecting Erwiniaamylovora and its use in epidemiological studies. Phytopathology vol. 74: 1342-1345.

MILIEU B DE KING (Kings medium B agar) (milieu diffrentiel pour Pseudomonasfluorescents)

g/L

Protose peptone #3 (Difco) 20.000

Phosphate de K dibasique (K2HPO4) 1.145

Sulfate de Mg (MgSO4.7H2O) 1.500

Agar (Bacto) 15.000

Glycrol 15.0 ml

Dissoudre les produits un un dans 800 ml H2O distille.



Couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri lorsquil a atteint 50oC.


Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21- 22oC) afinde sassurer de la strilit du milieu.



RFRENCES

KING, E.O., M.K. WARD and D.E. RANEY. 1954. Two simple media fordemonstration of pyocyanin and fluorescein. Journal of Laboratory and ClinicalMedicine 44, 301-7.

SHAAD, N.W., 1980. Laboratory guide for identification of plant pathogenicbacteria. P.3.

MILIEU LPGA (milieu Levure Peptone Glucose Agar)

g/L

Glucose 7.000

Peptone (Bacto) 7.000

Extrait de levure 7.000

Agar (Bacto) 15.000


Ajuster le pH entre 7.2 et 7.3.


Striliser 15 minutes 1210C et 15 psi.



Laisser 3 jours 22oC afin de sassurer de la strilit du milieu.



MILIEU MS (Miller-Schroth medium) (milieu diffrentiel pour Erwinia spp.)

g/L

Acide nicotinique 0.500

L-asparagine (en poudre) 3.000



Taurocholate de Na (Difco) 2.500

Mannitol 10.000

Agar (Bacto) 20.000


Lorsque ces produits sont dissout, ajouter :ml/L

Tergitol 7 0.1

Acide nitrilotriactique (soln de 2%) 10.02.0 g ac. nitriloactique1.659 g hydroxyde de K (KOH)dissoudre dans 100 ml H2O distille

Bleu de bromothymol (soln de 0.5%) 9.0

Rouge neutre (soln de 0.5%) 2.5

Hydroxyde de Na (NaOH 1N) 5.0 4 g NaOH/100 ml H2O

*Cycloheximide (soln 1%) 5.0

Prparer les diverses solutions sauf la cycloheximide et les ajouter auxproduits dissouts.

Ajuster le pH environ 7.3.



* Dissoudre la cycloheximide dans 10 ml H2O distille strile et lajouter lorsquele milieu a atteint 45oC.



Laisser 3 jours 22oC afin de sassurer de la strilit du milieu.

Toujours inoculer le milieu avec une bactrie de rfrence pour connatrela morphologie des colonies et la vitesse de croissance de la bactrierecherche.


RFRENCE

MILLER, T.D. and M.N. SCHROTH, 1972. Monitoring the epiphytic population ofErwinia amylovora on pear with a selective medium. Phytopathology 62 : 1175-1182.

2. MILIEUX POUR LA RALISATION DES TESTS BIOCHIMIQUES

MILIEU ARGININE

g/L

Peptone (bacto) 1.000

Chlorure de Na (NaCl) 5.000


Agar (Bacto) 3.000

Rouge phnol (soln de 0.1%)* 10.0 ml

Arginine HCl 10.000

*Dissoudre 0.1g de rouge phnol dans 100 ml dthanol (solution de 0.1%).

Mlanger les autres produits un un dans 800 ml H2O distille ; ajouter lerouge phnol.

NOTE : Ne pas chauffer le milieu, seulement lagiter laide dun barreaumagntique. Il est normal que lagar ne se dissolve pascompltement.

Ajuster le pH 7.1.


Distribuer 3ml de milieu par tube (16 mm) en agitant constamment afin debien rpartir lagar.

Striliser 10 minutes 121oC 15 psi.

NOTE : Il est important de ne pas dpasser le temps de strilisation carlarginine est sensible une strilisation de plus de 10 minutes.

Le milieu sera jaune la sortie de lautoclave et deviendra rose enrefroidissant.

Laisser 5 jours la temprature de la pice (environ 21-22oC) avantde lutiliser.

Toujours inoculer un milieu avec des colonies de rfrences pourconnatre les ractions positive et ngative de ce test.Pseudomonas marginalis (positif) : milieu rose

Pseudomonas viridiflava (ngatif) : milieu jaune orang


RFRENCE

Thornley, M.J., 1960. The differentiation of Pseudomonas from other Gram-negative bacteria on the basis of arginine metabolism. Journal of AppliedBacteriology, 23 : 37-52.

MILIEU LIQUIDE INDOLE (production dindole)

g/L


Chlorure de Na (NaCl) 5.000



Distribuer 3 ml de milieu par tube (16mm).

Striliser lautoclave 15 minutes 121oC et 15 psi.

NOTES : Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21-22oC) afinde sassurer de la strilit du milieu.

Toujours inoculer un milieu avec des colonies de rfrences pourconnatre les ractions positive et ngative de ce test.

Escherichia coli (positif) : prsence dun anneau rouge ensurface aprs laddition du ractif de Kovac

Erwinia amylovora (ngatif) : prsence dun anneau jaune ensurface aprs laddition du ractif de Kovac


RFRENCE

LELLIOTT, R.A., and R.S. DICKEY. 1984. Genus VII. Erwinia Winslow,Broadhurst, Buchanan, Krumweide, Rogers and Smith 1920, 209. Pages 469-476. In Noel R. Krieg and John G. Holt (eds.). Bergeys Manual of SystematicBacteriology. Volume 1. Williams and Wilkins, Baltimore, Md.

MILIEU LEVANE

g/L


D - glucose 2.500

Sucre de table 50.000







Pseudomonas marginalis (positif) : strie saillante et brillante.Prsence dune zone opaque et lumineuse en marge de la strie(observation en dessous de la bote de Ptri).

Pseudomonas viridiflava (ngatif) : strie prostre.


MILIEU METHYL-D-GLUCOSIDE

Solution 1 g/L

Phosphate de K monobasique (KH2PO4) 4.000


Chlorure dammonium (NH4Cl) 2.000

Solution 2 g/L

Agar (Bacto) 30.000

Acide casamino (Difco) 2.000

Solution 3 g/100ml


Solution 4 g/100ml

methyl-d-glucoside 20.000

Solution 5 g/100ml

Sel de tetrazolium (C19H15N4Cl) 1.000

Prparer toutes les solutions avec de H2O distille ; dissoudre les produits un un dans 800 ou 80 ml H2O distille et complter 1 litre ou 100 ml selon lasolution prpare.

Mlanger 500 ml des solutions 1 et 2 (pour obtenir un volume final de 1 litre).


Pendant ce temps, striliser lautoclave : 1.0 ml de la solution 350.0ml de la solution 42.0 ml de la solution 5

20 minutes 121oC et 15 psi.

Laisser refroidir les 3 solutions striles. Ajouter ces solutions striles aux deuxpremires lorsque le milieu aura atteint 45oC.




Erwinia carotovora subsp. atroseptica (positif) : gros pointsbourgognes

Erwinia carotovora subsp. carotovora (ngatif) : Petits pointsbourgognes avec contour blanc


RFRENCE

DYE, D.W., 1968. A taxonomic study of the genus Erwinia. I. The amylovora group. N.Z.J. Sci. 11: 590-607.

MILIEU PECTINASE (activit pectinolytique des Erwinia)

Agar (Bacto) 15.000 g pour 519 ml H2O distille

Extrait de levure 1.000 g pour 20 ml H2O distille

Sulfate dammonium ((NH4)2SO4) 5.0 ml(soln de 20%)

Glycrol (soln de 87%) 5.0 ml

* Acide polygalacturonique (soln de 2%) 250.0 ml

* Tampon phosphate 0.1 M pH 8.0 200.0 mlNaH2PO4 0.640 gNa2HPO4 12.930 gdissoudre dans 1 litre H2O distilleajuster le pH 8.0

Acide Casamino (soln de 20%) 10.0 ml

H2O distille 100.0 ml

Sulfate de Mg (MgSO4.7H2O) 1M 1.0 ml24.648 g / 100 ml H2O distille

Prparer les diverses solutions.

Dissoudre lagar et lextrait de levure dans H2O distille.

Ajouter les diverses solutions sauf lacide polygalacturonique (2%) et letampon phosphate (0.1M) aux produits dissouts.

NOTE : Ajout le sulfate de Mg en dernier.


*Pendant ce temps, striliser lautoclave lacide polygalacturonique (2%) et letampon phosphate (0.1M) 15 minutes 121oC et 15 psi.

Laisser refroidir les solutions striles et les ajouter au milieu lorsque celui-ciaura atteint 45oC.



Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21- 22oC) afinde sassurer de la strilit du milieu.


Erwinia carotovora subsp. atroseptica (positif) : prsencedun halo blanc (zone de prcipitation) aprs ladditiondactate de cuivre.

Erwinia amylovora (ngatif) : absence dun halo aprsladdition dactate de cuivre.


MILIEU PH (milieu Pectine Hildebrand) (activit pectinolytique desPseudomonas)

g/L

Bleu de bromothymol 0.015

Chlorure de Ca (CaCl2.2H2O) (soln de 10%) 10.0 ml

Acide polygalacturonique 22.000

Agar (Bacto) (soln de 4%)* 100.0 ml

Dissoudre dans lordre les 3 premiers produits un un dans 800 ml H2Odistille bouillante en maintenant une agitation constante (doit bouillir trsfortement pour dissoudre lacide polygalacturonique).

Ajuster le pH 8.4 avec du NaOH 1N.



* Dissoudre 4 g. dagar dans 100 ml H2O distille ; striliser lautoclave 15minutes 121oC et 15 spi.

Aprs strilisation, ajuster de nouveau le pH 8.4.

Ajouter la solution strile dagar 4%.

Couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri lorsque le milieu est un peurefroidi.

NOTES : Laisser 5 jours la temprature de la pice (environ 21-22oC avantde lutiliser.


Erwinia carotovora subsp. carotovora (positif) :dpression du milieu entourant le point dinoculation

Erwinia amylovora (ngatif) : aucune dpression


RFRENCE

HILDEBRAND, D.C., 1971. Pectate and pectin gels for differentiation ofPseudomonas sp. and other bacterial plant pathogens. Phytopathology 12 :1430-1436.

BOUILLON TRANSFORMATION DU SUCROSE EN SUBSTANCES RDUCTRICES (RS)

g/L

Sucrose 40.000


Extrait de buf 5.000


Ajuster le pH 7.0.


Distribuer 3 ml de milieu par tube (16 mm).




Erwinia carotovora subsp. atroseptica (positif) : milieu jauneaprs laddition du ractif de Bndict et incubation dans eauchaude.

Erwinia carotovora subsp. carotovora (ngatif) : milieu bleuaprs laddition du ractif de Bndict et incubation dans eauchaude.


RACTIF DE BENEDICT (ractif ajout pour la rduction du sucrose)

g/L

Citrate de Na (Na3C6H5O7.2H2O) 173.0

Carbonate de Na (Na2CO3) 85.5

Sulfate de Cu (CuSO4.5H2O) 17.3



NOTES : Travailler sous la hotte car il y aura dgagement de gaz.

Conserver la noirceur (bouteille ambre) la temprature de la

pice (environ 21-22oC)

RFRENCE

SCHAAD, N.W., 1988. Laboratory Guide for Identification of Plant PathogenicBacteria, 2nd Edition. The American Phytopathological Society.p.53.

3. MILIEUX GLOSS POUR LA DTECTION DE LA RSISTANCEAUX PRODUITS ANTIPARASITAIRES

MILIEU CUIVRE (milieu pour la rsistance des Xanthomonas au cuivre)

g/L


Sulfate de Cu (CuSO4) 0.200




Couler 18 20 ml de milieu par bote de Ptri.


Laisser 3 jours la temprature de la pice (environ 21-22oC) afinde sassurer de la strilit du milieu.

Toujours inoculer le milieu avec une bactrie de rfrence pourconnatre la sensibilit de la bactrie au cuivre : Xanthomonascampestris vesicatoria (rsistante).


RFRENCE

STALL R.E., 1994. University of Florida, Plant pathology department, Institute offood and agricultural sciences.

TESTS POUR LIDENTIFICATION DES BACTRIESPHYTOPATHOGNES

ARGININE DSHYDROLASE

Le test arginine dshydrolase sert dterminer si la bactrie transforme larginine (acideamin) par lenzyme arginine dshydrolase.

laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture arginineavec la bactrie identifier (culture de 18-24 heures).

Ajouter environ 1 cm dhuile minrale strile.

Incuber 26oC pour 24 48 heures.

la suite de lincubation, lire la raction obtenue.

Raction positive :

le milieu demeure rose

Raction ngative :

le milieu devient jauneorang

CATALASE

Le test catalase sert dmontrer si la bactrie possde lenzyme catalase servant dcomposer le peroxyde dhydrogne (H2O2).

Dans un couvercle dune bote de Ptri ou sur une lame, dposer une gouttede peroxyde dhydrogne 3%.

laide dun cure-dent prendre la bactrie identifier (culture de 18-24heures) et la dposer dans la solution de peroxyde dhydrogne.

Attendre environ 2 minutes et lire la raction obtenue :

Raction positive :

prsence de bulles rvlantle dgagement doxygne

Raction ngative :

absence de bulle

HYPERSENSIBILIT SUR LE TABAC

Le test dhypersensibilit du tabac sert mettre en vidence le pouvoir pathogne dunebactrie par le desschement des zones dinoculation sur les feuilles de tabac.

Dans un tube contenant 2 ml deau physiologique strile (NaCl 0,85%), faireune suspension bactrienne ayant une concentration de 108 bactries/ml(standard McFarland No 5) de la bactrie identifier (culture de 18-24heures).

Utiliser un plant de tabac White Burley ayant 5 6 feuilles. Inoculer unefeuille par bactrie identifier ou pour chaque tmoin (bactrie nonpathogne et bactrie pathogne).

laide dune seringue tuberculine de 1 ml injecter la suspension bactriennedans lespace intercellulaire le long de la nervure centrale ou dune nervuresecondaire. Linoculation de la suspension bactrienne se fait sur la faceinfrieur de la feuille.

Laisser le plant la temprature de la pice pour une priode de 24 48heures.

Aprs 24 ou 48 heures lire la raction obtenue.

Raction ngative :aucun changement dans lacouleur et laspect du tissu

Raction positive :La zone foliaire inocule avec

la bactrie devientlgrement translucides et aun aspect humide. Par la

suite, les tissus sasschentet prennent une coloration

brun clair beige

Contrle de qualit : Un jaunissement ou un brunissement de la zone foliaireinocule nest pas une raction positive.

LEVANE

Le test levane sert dterminer si la bactrie polymrise le fructose en polyfructose.

laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture levane parstries avec la bactrie identifier (culture de 18-24 heures).

Incuber 26oC pour 48 heures.


Raction positive : Strie partiellement saillante et luisante(vue du dessus).

Prsence dune zone opaque etluisante en marge de la strie

(vue du dessous).

Raction ngative :

strie prostre

MTHYL-GLUCOSIDE

Le test Mthyl-glucoside sert dterminer si la bactrie peut crotre enprsence de cette seule source de carbone.

laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture mthyl-D-glucoside par points en dposant des amas de la bactrie identifier (culturede 18-24 heures).


la suite de lincubation, lire la raction obtenue :

Raction positive :gros points bourgognes

Raction ngative :petits points bourgognes avec unimportant pourtour blanc

OXYDASE

Le test oxydase (bioMrieux) permet de mettre en vidence la prsence de lenzymecytochrome C oxydase.

Sur un papier filtre strile, dposer un disque doxydase imprgn dedimthyl-para-phnylne diamine.

Humidifier le disque avec quelques gouttes deau distille strile. Un excsdeau peut nuire la lecture.

laide dun cure-dent prendre la bactrie identifier (culture de 18-24heures) et la dposer sur le disque.

Lire la raction dans les 30 secondes.

Raction ngative :

absence de coloration

Raction positive :

prsence dune colorationrose ple violet

OXYDATION/FERMENTATION

Le API OF Medium (bioMrieux) est destin tudier le mtabolisme oxydatif oufermentatif des bactries. La faible teneur en peptone et la forte concentrationen glucose permettent dutiliser le API OF Medium pour vrifier si la bactrie peututiliser le glucose en prsence et en absence doxygne la suite de lutilisationdu glucose, il y a formation dacide.. Lacidification du milieu fait virer lindicatifcolor le bleu de bromothymol, lequel passe du vert au jaune.

Dposer les tubes identifis dans un bcher de 250 ml.

Ajouter de leau (environ 75 ml).

Faire bouillir sur une plaque chauffante jusqu ce que le contenu des tubesdevienne liquide.

Contrle de qualit : Laisser revenir les tubes temprature de la pice avant deles inoculer. Si le liquide est trop chaud, les bactries seront dtruites.

Casser lextrmit du tube laide du capuchon de plastique.

Inoculer le milieu avec la bactrie identifier (culture de 18-24 heures) en seservant dune anse inoculer strile.

Ajouter environ 1 cm dhuile minrale strile.

Replacer le capuchon de plastique sur le tube.


la suite de lincubation, lire la raction obtenu :

Raction ngative :(mtabolisme oxydatif)

le milieu reste vert

Raction positive :(mtabolisme fermentatif)

le milieu devient jaune

PECTINASE (ERWINIA)

Le test pectinase sert dterminer lactivit pectinolytique dune bactrie, cest--dire sielle peut dgrader la pectine contenu dans le milieu de culture.

laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture pectinase(milieu servant mesurer lactivit pectinolytique des Erwinia) par points, endposant des amas de la bactrie identifier (culture de 18-24 heures).


la suite de lincubation, ajouter suffisamment dactate de cuivre (7,5%)pour recouvrir les points dinoculation (environ 5 ml).

Attendre environ 5 minutes et lire la raction obtenue:

Raction ngative :absence dun halo blanc

Raction positive :prsence dun halo blanc(zone de prcipitation)

PECTINASE (PSEUDOMONAS)

Le test pectinase sert dterminer lactivit pectinolytique dune bactrie, cest--dire sielle peut dgrader la pectine contenu dans le milieu de culture.

laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture PectineHildebrand (milieu servant mesurer lactivit pectinolytique desPseudomonas) par points en dposant des amas de la bactrie identifier(culture de 18-24 heure).



Raction positive: prsence dune dpression du milieuentourant le point dinoculation

Raction ngative : absence dune dpression

PRODUCTION DINDOLE

Le test indole sert dterminer si la bactrie produit de lindole partir du tryptophane(acide amin).

laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture liquideindole (production dindole) avec la bactrie identifier (culture de 18-24heures).


la suite de lincubation, ajouter 3 gouttes du ractif de Kovac (bioMrieux)sous la hotte chimique.

Lire immdiatement la raction obtenue:

Raction positive :

prsence dun anneau rougeen surface

Raction ngative :

prsence dun anneau jauneen surface

TRANSFORMATION DU SUCROSE

Le test sucrose sert dterminer si la bactrie transforme le sucrose en substancesrductrices.

laide dune anse inoculer strile, inoculer le milieu de culture liquide RS(transformation du sucrose en substances rductrices) avec la bactrie identifier (culture de 18-24 heures).


la suite de lincubation, ajouter 2,5 ml du ractif de Bndict.

Dposer les tubes dans un bcher de 250 ml.

Ajouter de leau (environ 75 ml) et amener bullition sur une plaquechauffante.

Au changement de couleur du tmoin positif (couleur jaune apparaissant), lirela raction obtenue :

Raction ngative :

le milieu restebleu-vert

Raction positive :

le milieu devientjaune

Documents

Ensemencement d'Une Galarie API 20