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Contrôle du métabolisme

2. Régulation de voies métaboliques


Contrôle des voies métaboliques

Il y a deux sortes de contrôle métabolique :

1) Contrôle intrinsèque (ou interne) qui implique la régulation de l'activité

enzymatique par des concentrations des métabolites (allostérie)

• Ceci représente la forme de contrôle la plus souvent rencontrée chez les

procaryotes

Dans les organismes multicellulaires, le métabolisme doit répondre à des

besoins de l'organisme entier et donc un niveau de contrôle supplémentaire doit

être ajouté

2) Contrôle extrinsèque à travers des hormones et stimulation nerveuse

• Ces types de signaux agissent généralement par des seconds messagers

pour cibler les activités des enzymes

➢ cAMP, Ca2+, inositol 1,4,5-P, diacylglycerol

Contrôle du flux métabolique

Expérimentalement, il a été constaté que les vitesses de synthèse et

dégradation de chaque intermédiaire d'une voie métabolique (exemple : la

glycolyse) sont arrangées de façon à maintenir chaque intermédiaire à une

concentration constante. Le flux (taux), J, des intermédiaires est constant.

Dans un système ouvert comme un organisme vivant, selon Prigogine un

expert en système thermodynamique de non-équilibre, le flux constant représente

l'efficacité thermodynamique maximale.

Génération du flux

Les voies métaboliques consistent en une série d'étapes. Le flux de

métabolites étant constant à travers une série de réactions, il suffit de considérer le

flux dans une seule étape réactionnelle.

Le flux de métabolites J dans une seule réaction est la différence entre la

vitesse de la réaction en avant, vf et celle du retour vr, donc

J = vf - vr

À l'équilibre, il n'y a pas de flux, J = 0, même si vf et vr sont très larges.

Quand la réaction est très loin de l'équilibre, vf - vr > 0, le flux dépend

essentiellement de la réaction direction avant et J vf.

Glycolysis.pdf

Glycolysis.pdf


Le flux à travers une voie à l’état stationnaire est constant et il est déterminé

par l'étape ou les étapes les plus lentes ou vitesse limitante. Par conséquent, le

contrôle du flux dans une voie métabolique exige que

1) l'étape contrôlant le flux réponde au besoin métabolique de l'organisme.

2) les changements en flux, répondant au besoin métabolique de l'organisme,

soient communiqués à travers la voie.

La vitesse des réactions enzymatiques varie avec le flux

Le schéma d’une réaction, A ⇌ B, qui est catalysée enzymatiquement et qui

répond à un changement de flux dans la réaction, S A, qui la précède est :

• Le flux, J, à travers la réaction A ⇌ B doit être identique à celle de

l'étape limitante précédente et est égal à vf - vr.

Si le flux de l'étape limitante augmente par J, l'augmentation doit être

communiquée à l'étape suivante par une augmentation en vf (vf) afin de rétablir

l'état stationnaire, donc J = vf .

La réponse du système au changement fractionnel en flux est obtenue

ensuite par manipulation algébrique en divisant l’équation précédente par J

et en la multipliant par vf/vf ; donc

• Ce résultat décrit de façon explicite la relation entre le changement

fractionnel de flux, J / J, à travers l’étape limitante, et vf /vf, le

changement fractionnel de la vitesse de la réaction suivante

rf

f

f

ff

f

f

vv

v

v

v

J

v

v

v

J

J

S P A ⇌ B vf

vr

J J

vitesse limitante


Dans les conditions physiologiques, on a souvent [A] < KM, donc l’équation

Michaelis-Menten devient :

A

A donc , et

f

f

M

f

MAXf

M

f

MAXf

v

v

K

AVv

K

AVv

Dans ce cas le changement fractionnel en vitesse est égal au changement

fractionnel en concentration de substrat

Le lien entre le changement fractionnel en flux et le changement fractionnel en

concentration de substrat qui est nécessaire à communiquer ce changement en flux

est donc :

rf

f

vv

v

A

A

J

J

La quantité, vf / (vf - vr), représente la sensibilité du changement fractionnel

en flux par rapport au changement fractionnel en concentration de substrat. Elle

indique la réversibilité de la réaction et détermine si la réaction est proche du point

d'équilibre.

Dans une réaction irréversible, vr 0 donc vf / (vf - vr) 1. La réaction

répond donc de façon presque directe à un changement fractionnel en flux

par un changement fractionnel en substrat.

Au fur et à mesure que la réaction approche l’équilibre, vf s’approche de vr et

vf / (vf - vr) ∞. La réaction répond donc à un changement fractionnel en

flux par un changement fractionnel en concentration plus petite vu le grand

facteur de sensibilité.

Par conséquent, la capacité d’une réaction à communiquer le changement en

flux augmente au fur et à mesure que la réaction atteint l’équilibre.


Étape limitante du contrôle du flux métabolique

Le flux métabolique à travers une voie est dépendant des vitesses des étapes

les plus lentes. Les produits de l'étape limitante, par définition, sont enlevés avant

que la réaction puisse produire un équilibre. Cette réaction est donc loin de

l'équilibre et possède une enthalpie libre très négative.

Dans le régime d’une réaction loin de son équilibre (vf >> vr), le changement

fractionnel du flux, J/J, n'est pas très sensible au changement fractionnel en

changement de concentration, [A]/[A].

On a constaté expérimentalement dans certaines voies que le flux varie par

des facteurs atteignant plus de 100 tandis que les variations en [substrat] sont

moins importantes.

Près de l’équilibre, il existe la possibilité que des changements en [substrat]

puissent communiquer des changements importants en flux à d'autres étapes

réactionnelles dans la voie. Mais puisque les étapes limitantes sont loin de

l'équilibre, il doit exister d'autres mécanismes qui gèrent le flux de l'étape

limitante

➢ En effet, la variation seule en substrat liée à une étape limitante

n’explique pas les faits expérimentaux.

Le flux à travers une étape réactionnelle limitante d'une voie peut être

affecté par plusieurs mécanismes :

1) le contrôle allostérique

2) la modification covalente - interconversion des enzymes

3) les cycles de substrat

4) le contrôle génétique

Les mécanismes 1-3 répondent rapidement à des stimuli externes (secondes à

minutes).


Détection des mécanismes contrôlants

1) Identification de l’étape limitante d'une voie.

• Il s’agit de la comparaison entre les G′s, mais pas les G0′s, des

réactions afin de déterminer lesquelles influencent l'équilibre; l'équilibre

est atteint si G′ ≈ 0. Il faut mesurer in vivo les concentrations des

réactants de l’enzyme pour cette fin.

• Mesure expérimentale de l'effet d'un inhibiteur de la réaction spécifique

sur le flux de la voie.

➢ Le plus similaire le changement fractionnel de l'activité de l'enzyme

inhibée et le changement fractionnel du flux indiquent que l'enzyme

en question est contrôlante.

2) Détermination in vitro des effecteurs allostériques d'une enzyme catalysant

une réaction limitante.

3) Validation expérimentale in vivo de la concentration des régulateurs

possibles d’une enzyme afin de déterminer si les changements en

concentration sont cohérents avec le mécanisme de contrôle proposé.

Amplification du signal et son contrôle

Une facette importante des voies métaboliques est l’amplification du signal

et le contrôle de ceci. Le signal initial peut être un changement en concentration de

substrat ou d'autres ligands.

Il y a deux sortes de mécanisme d'amplification du signal :

i) Cycles de substrats (aussi connu sous le nom de cycles futiles)

Considérons les réactions suivantes catalysées par les enzymes Ei:

Si les enzymes, E2 et E-2, sont actifs en même temps, le résultat est un cycle

futile apparent.

A B C D ⇌ ⇌ E1

E2

E-2

E3


Exemple - le cycle futile entre D-fructose-6-P et D-fructose 1,6-P

La réaction est catalysée par 6-phosphofructokinase (PFK-1) et la réaction

par fructose-bisphosphatase (FBPase-1 ≡ F16Pase).

Si les deux enzymes sont actifs en même temps, il y a une hydrolyse de

l'ATP.

• L'importance de ce cycle est que les deux réactions peuvent être

contrôlées séparément et donc, le flux à travers cette étape est :

J = vnet = vréaction 1 - vréaction 2

Ce type de contrôle dans une voie métabolique la rend plus sensible et plus

précise.

Afin de montrer ceci, il faut noter que les réactions 1 et 2 sont fortement

influencées par [AMP].

Une augmentation de 4 X en [AMP] change l'activité maximale de PFK (vf)

de 10% à 90% et en même temps décroît l'activité de F16Pase (vr) de 90% à

10%.

D-fructose-6-P ⇌ ⇌

D-glucose-6-P D-fructose 1,6-P triose-P

Mg2+

ATP ADP

Pi H2O


Puisque l'activité totale de PFK est dix fois plus grande que celle de F16Pase

in vivo, si l’activité totale de PFK est 100 unités arbitraires, l’activité

maximale de F16Pase est donc 10 unités.

Par contre, à faibles [AMP], les activités de PFK sont à 10% maximales

tandis que celles de F16Pase sont à 90% maximales.

➢ Le flux aux [AMP] faibles est donc :

Jfaible = vf (faible) - vr (faible) = 10 - 9 = 1.

➢ Aux [AMP] hautes, le flux devient :

Jhaute = vf (haute) - vr (haute) = 90 - 1 = 89.

Le cycle de substrat peut donc amplifier l’effet de [AMP] sur la vitesse nette de

la phosphorylation de F6P.

Sans le cycle de substrat, l’augmentation de quatre fois en [AMP] augmente

le flux net d'un facteur 9.

Avec le cycle de substrat, la même augmentation en [AMP] provoque un

changement de Jhaute/Jfaible = 89 / 1 ≈ 90 en flux net.

Il faut noter que si un cycle de substrat possède une fonction régulatrice, ceci

n’a pas comme but d’augmenter le flux maximal dans une voie, mais plutôt de

minimiser le flux d’une voie.

Le cycle de substrat est le prix que les cellules de muscle doivent payer

pour être capables de changer de façon rapide, passant d'un état de repos où

le recyclage est maximal à un état d'activité maximale où le recyclage est

nettement moindre.


Le diabète et les cycles de substrats

Le diabète est l’une des maladies les plus répandues dans le monde entier, et

l'incidence de cette maladie continue à se développer. Le diabète noninsuline-

dépendant, ou le type 2, représente 90% de tous les diabétiques et est estimé pour

affecter environ 6% de la population des Etats-Unis. Les caractéristiques de la

maladie incluent l’hyperglycémie de jeûne et les niveaux exagérés de glucose. Les

complications du diabète type 2 incluent la rétinopathie, la néphropathie, la

neuropathie, et la maladie cardiaque coronarienne et sont censées être déclenchées

par la glycation excessive de protéine (modification protéique par réaction avec de

glucose), qui résulte en des niveaux excessifs du glucose en circulation.

Des études cliniques ont été effectuées pour définir le défaut primaire qui

cause les niveaux de jeûne élevés de glucose sanguin observés dans les diabétiques

de type 2. Les résultats ont suggéré que le rendement hépatique excessif de glucose

soit une cause principale. Le rendement hépatique de glucose dérive de la

dégradation du glycogène hépatique (glycogénolyse) et de la synthèse du glucose

des fragments 3-carbones tels que le pyruvate (gluconéogenèse). Le flux

gluconéogénique s'est avéré excessif dans les diabétiques de type 2.

La gluconéogenèse est une voie fortement réglée et bien comprise. La

fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase-1) est une enzyme exprimée principalement

dans le foie et le rein et est l'une des enzymes limitantes du flux gluconéogénique

hépatique.

Dans le diabète, le manque (type 1) ou la résistance (type 2) à l'insuline

modifie le patron d'expression génique dans le foie, tel que chacun des trois

enzymes contrôlant la gluconéogenèse (PEPCK, FBPase-1, et G6Pase)

est « upregulated ». Le diabétique surexprime ces enzymes gluconéogéniques, tout

en « downregulating » l'expression des gènes glycolytiques des enzymes opposés

(voir la figure de la voie Embden-Meyerhof-Parnas du métabolisme intermédiaire

hépatique sur la page suivante). Par conséquent, les cycles de substrats sont

rétablis pour augmenter la production nette de glucose (gluconéogenèse) aux

dépens de l'utilisation de glucose (glycolyse) ou du stockage (glycogenèse).

L'activité F16BPase du foie a été montrée pour être élevée dans les modèles

animaux insuline-déficients et insuline-résistants du diabète, accentuant

l'importance de cet enzyme dans la régulation du glucose sanguin et faisant de lui

une cible pour l'inhibition par une drogue.


Voie du métabolisme intermédiaire hépatique

Les cycles de substrats

Glucose

Glucose 6-P

Glu-6-Pase GK

PFK-1 FBPase-1

Fructose 1, 6-P2

PK

Lactate, alanine

Pyruvate

PEP

OAA

PEPCK

Fructose 6-P

Les niveaux d’expression des enzymes contrôlant la gluconéogenèse et les

enzymes opposés dans les cycles de substrat sont modifiés chez le diabétique.

Les flèches bleues montrent l’augmentation en [enzymes], les rouges une

diminution en [enzymes]. Il y a une production excessive de glucose hépatique.

Abréviations :

GK, glucokinase ; OAA, oxaloacétate ;

PEP, phosphoénol-pyruvate ; PEPCK, PEP carboxykinase ;

PFK-1, phosphofructokinase ; Pi, phosphate inorganique ;

PK, pyruvate kinase


ii) Cycle interconvertible

Il s’agit d’un contrôle de l'activité enzymatique par une modification covalente

qui est réversible.

Un cycle interconvertible peut donner lieu à une grande amplification du

signal initial à condition que les activités des enzymes qui catalysent les

modifications soient rigoureusement contrôlées.

• Le meilleur exemple est celui de phosphorylase où il s'agit de la

conversion de la forme inactive b à la forme active a.

• Les séquences d'événements qui donnent lieu à la modification phos b en

a peuvent être retracées jusqu'à la surface des cellules.

Ces événements peuvent être renversés par des activités des phosphatases

qui elles-mêmes sont sujettes à des régulations.

Amplification d'un signal métabolique, cycle interconvertible

La glycogène synthase et la glycogène phosphorylase sont interconverties de

façon enzymatique entre deux formes cinétiques et allostériques différentes par une

série de réactions connues sous le nom de cascades cycliques.

L'interconversion entre les formes enzymatiques moins actives et plus

actives implique des réactions distinctes en modification covalente de ces enzymes

et qui elles-mêmes sont catalysées de façon enzymatique.

Mécanisme d’activation par phosphorylation

Liaison

hormonale

Activation de

l’adenylate cyclase

[cAMP] ↑

Dégradation

de glycogène

Activation de la

cAMP-dependante

protéine kinase

Conversion de la

phosphorylase b en

phosphorylase a

Activation de la

phosphorylase

kinase


Exemple : Contrôle de la

glycogenèse en muscle

par modification

réversible

R2C2

cAMP-dependante

protéine kinase

(inactif)

2C

cAMP-dependante

protéine kinase

(actif)

⇌ cAMP

+ R2(cAMP)4

ATP ADP

Pi H2O

ATP ADP

Pi H2O

ATP ADP

Pi H2O

ATP ADP

Pi H2O

(αβγδ)4

phosphorylase

kinase b

(αβγδ)4

phosphorylase

kinase a

Autres

kinases

Glycogène

phosphorylase

b

Glycogène

synthase a

Phosphoprotéine

phosphatase 1

(inactif)

Phosphoprotéine

phosphatase

inhibiteur-1 b

Système de phosphorylation

Système de déphosphorylation

Ca2+

Glycogène

phosphorylase

a

Glycogène

synthase b

Phosphoprotéine

phosphatase

inhibiteur-1 a

Phosphoprotéine

phosphatase

inhibiteur-1 a

P P

P P

P

P

Phosphoprotéine

phosphatase-1

(actif)


Puique les enzymes responsables des modifications et des démodifications sont

elles-mêmes modifiées de façon catalytique par d'autres enzymes, ceci mène aux

avantages suivants :

1) Réponse à un grand nombre de stimuli allostériques différents

2) Plus de souplesse en ce qui concerne le contrôle

3) Potentiel énorme en amplification dans leurs réponses à des variations en

[effecteur]

(a) F et R sont les enzymes de modification et de démodification respectivement. Elles sont

transformées de façon allostérique de leurs conformations inactives à leurs conformations

actives par la liaison de leurs effecteurs respectifs, e1 et e2. L’enzyme cible, E, est plus actif

dans la forme modifiée, Ea, que dans la forme non-modifiée, Eb. (b) Les réactions décrivant

l’interconversion entre les formes actives et inactives de l’enzyme cible, E.

Exemple d’une amplification par une cascade enzymatique monocyclique

a)

b)

Moins actif

Plus actif

Moins actif

Plus actif

Moins actif

Plus actif

ATP + + + ADP

+ + +

kf

K1

ATP ADP

H2O

OH

Eb

e1 F ⇌ F • e1

K2

e2 R ⇌ R • e2

Pi

F • e1

OH

Eb ⇌

OH

Eb• ATP • F • e1 F • e1 Ea

P

+

R • e2 Ea

P Kr

⇌ Ea • R • e2

P kr

R • e2

OH

Eb Pi

Ea

P

Kf


Cette amplification découle du fait que les enzymes qui modifient et

démodifient les enzymes cibles sont elles-mêmes sujettes à des contrôles

allostériques et qu’un petit changement en concentration d’un effecteur allostérique

de l'enzyme de modification va provoquer un changement important dans la

concentration de l’état modifié et va activer l'enzyme cible.

Le mécanisme d’amplification le plus simple implique une cascade

enzymatique monocyclique montrée par la figure de la page précédente.

La cascade sert à amplifier un changement relativement petit en [e1],

l'effecteur allostérique de l'enzyme de modification F, dans un plus grand

changement en [Ea] / [E]T, la fraction de l'enzyme E sous forme active.

• La réaction de déphosphorylation dans la cascade permet d’amplifier la

sensibilité d'un système à l’effecteur allostérique.

Le traitement mathématique d'une cascade monocyclique est, de façon

générale, assez compliqué et il est résumé par :

Cette relation en (a) possède la même forme que l'équation Michealis-

Menten en (b) qui décrit l'effet de [substrat] sur la vitesse, vo / [E]T d’une réaction

enzymatique.

(a) Relation entre la fraction de l’enzyme totale, ET, en état plus actif,

[Ea], et la concentration de l’effecteur e1, [e1]. Les symboles sont définis par

rapport à la cascade monocyclique décrite précédemment. (b) Relation

Michaelis-Menten de l’enzyme, E, en présence de son substrat, S. Les

symboles sont définis par rapport une réaction unimoléculaire.

(b)

11

f

Tf

22r

2Tr

22r

2Tr

1

f

Tf

22r

2Tr

f

Tf

T

a

eK

K

Fk

eKK

eRk

eKK

eRk

e

K

Fk

eKK

eRk

K

Fk

E

E

][][

][

][][

][(a)

][

][

][

20

SK

Sk

E

v

MT


Le KM apparent qui est défini par l’équation représente par analogie, le KM, dans la

réaction enzymatique qui correspond à la concentration du substrat où la vitesse est

de la moitié maximale, et donc ici représente la [e1] exigée pour que la moitié d’E

soit dans la forme active

Cette équation démontre que la conversion de l’enzyme, E, en état moitié

plus actif dépend d’une série de constantes incluant K1 qui est la constante

de dissociation de l’effecteur, e1, avec l’enzyme F.

• La concentration de e1 afin de convertir la moitié F en forme active est K1

puisque [e1] = K1 lorsque [F·e1] = [F]

L'amplification de l'effet allostérique d'un effecteur e1 correspond à une

situation où un petit effet sur l'enzyme F provoque un plus grand effet sur l'enzyme

E.

Donc ça prend moins de e1 pour convertir E dans sa forme active par rapport

à la conversion de F en sa forme active

Si on définit facteur d'amplification A par le ratio entre K1 (concentration de e1

pour convertir 50% FT en forme plus active) et Kmapp (la concentration apparente de

e1 pour convertir 50% ET en forme active), on obtient la relation suivante :

2

221 1eRkK

eKKFk

K

KA

Trf

rTf

app

M

En substituant les constantes de vitesse et d’équilibre ainsi que les

concentrations pour les valeurs suivantes – arbitraires, mais réalistes : kf =

2kr, Kr = 2Kf, [F]T = 2 [R]T et K2 = 2e2 on a :

25

][

][241

22][221

2

2

2

22

eKRk

eKRk

eRkK

eeKRkA

fTr

fTr

Trf

fTr

• Avec ce choix de paramètres, il y a une amplification de 25 fois de l'effet

de e1 sur E par l’intermédiaire de F; l’amplification sera encore plus

grande s'il y a plus de différence entre les paramètres d'avant et de retour.

1

22

2

22

2

][][

][

K

K

Fk

eKK

eRk

eKK

eRk

K

f

Tf

r

Tr

r

Tr

app

M


Il faut noter que s'il s'agit d'une cascade bicyclique, l'amplification sera

encore plus importante.

Les activités de la glycogène synthase et celle de la glycogène

phosphorylase sont toutes deux contrôlées par des cascades bicycliques.

F1 et F2 sont les enzymes de modification tandis que R1 et R2 les enzymes de

démodification. F1, R1 et R2 sont transformés de façon allostérique de leurs

conformations inactives à leurs conformations actives par la liaison de leurs

effecteurs respectifs, e1, e2 et e3. L’enzyme cible, E, est plus actif dans la forme

modifiée, Ea, que dans la forme non-modifié, Eb.

Exemple d’une amplification par une cascade enzymatique bicyclique

ATP

ATP

ADP

H2O

ADP

e1 F1 ⇌ F1 • e1

e2 R1 ⇌ R1 • e2

Pi

R2 ⇌ R2 • e3

H2O Pi

e3

F2a

P OH

F2b

OH

Eb

P

Ea


Exemple récapitulatif : La glycogenèse hépatique et musculaire

La signalisation physiologique est enclenchée par l’epinéphrine

• la voie de signalisation dépend du récepteur « GPCR » adrénergique β2

➢ la voie contient sept étapes distinctes de signalisation dont cinq sont

des étapes d’amplification

• par ce fait, à partir d’une molécule d’epinéphrine des centaines de

millions de molécules de glucose-6-P sont générées

- voir l’insertion bas-gauche de la figure

Le mécanisme d’amplification consiste en :

A. La liaison par

l’hormone au

récepteur

B. L’interaction

du récepteur

avec protéine

Gs, catalyse

d’échange de

GTP – GDP et

activation Gsα

C. La liaison de

GTP-Gsα active

l’adenylate

cyclase

D. [cAMP]

augmente et par

conséquent

activant la protéine kinase A (PKA)

E. La phosphorylation de phosphorylase kinase (PK) par PKA

F. Ca2+ stimule la PK complétant ainsi son activation

G. PK à son tour phosphoryle la phosphorylase b, produisant ainsi la

phosphorylase a

H. La phosphorylase a dégradé le glycogène en glucose-1-P, qui est converti en

Glucose-6-P

À noter que chaque réaction est réversible, cAMP est dégradé par PDE (Ca/CM

dépendante) tandis que la protéine phosphatase 1 (PP1) inactive la PK et la

phosphorylase a


Dans le cas de la stimulation expérimentale par l'hormone adrénaline, le

changement en [cAMP] est très faible.

Cependant, chaque molécule de protéine kinase A peut activer un grand

nombre de molécules de phosphorylase kinase et donc un très grand nombre

de molécules de phosphorylase va rapidement hydrolyser le glycogène.

• On estime que 50% de phosphorylase b est convertie en phos a avec une

augmentation de seulement 1% dans [cAMP] et ceci se fait 2 secondes

après l'addition de l'hormone.

Critères de contrôle des voies métaboliques

Il y a plusieurs critères qui aident à détecter de façon expérimentale les

enzymes susceptibles d’être des points de contrôle d’une voie métabolique :

I. L'activité de l'enzyme en question dans un lysat approprié.

Les conditions de l'essai doivent correspondre à celles retrouvées in vivo.

Principe : Contrôle par l'enzyme présent en faible activité totale tandis que les

enzymes présents en hautes activités totales sont probablement moins contrôlants.

• Exemple : l’hexokinase et la 6-phosphofructokinase ont des activités

«faibles» dans un lysat tandis que le triose phosphate isomérase possède

une «haute» activité.

II. Pour décider si une réaction est à l'équilibre in vivo, il faut mesurer les

concentrations intracellulaires des métabolites en question et comparer le

rapport de concentrations Γ par rapport à la constante d’équilibre, Keq.

Aux fins de comparaison, Keq doit être déterminée pour des conditions

présentes dans la cellule. Donc des conditions de pH et de force ionique

physiologique et la température correspondante in vivo

• Pour la réaction catalysée par la 6-phosphofructokinase

Mg2+

F6P + ATP ⇌ FBP + ADP

Le rapport des concentrations intracellulaires est :

Γ = [FBP][ADP] / [F6P][ATP]

= 20 µM x 1.3 mM / 90 μM x 11.5 mM = 0.025

➢ La constante d’équilibre par contre est ~ 1200 dans les conditions

physiologiques, ce qui suggère que la réaction soit très loin de

l'équilibre in vivo


Figure. Les variations en pourcentage

de 13 métabolites glycolytiques du

cerveau de souris pendant les 25

premières secondes après la

décapitation. L’âge des souris étaient de

10 jours et elles ont été anesthésiées par

phénobarbital. Les valeurs sont basé sur

les moyennes de huit souris à temps

zéro et de quatre souris à chaque

intervalle de temps suivant.

Ref : Lowry OH et al. Effect of

ischemia on known substrates and

cofactors of the glycolytic pathway in

brain. J Biol Chem.1964; 239:18-30.

• Par contraste, la réaction catalysée par l’adenylate kinase

Mg2+

ATP + AMP ⇌ 2 ADP

Γ = [ADP]2 / [ATP][AMP] = 1.32 / 11.5 x 0.17

Γ = 0.85 et la constante d'équilibre = 0.44 pour cette réaction.

➢ Donc la réaction est proche de l'équilibre.

La problématique dans cette approche, c’est la mesure précise des

concentrations intracellulaires.

L’approche expérimentale, actuellement, ne peut pas tenir compte des

variations en concentrations de métabolites entre les compartiments cellulaires

et ayant d’équilibres différents dans ces compartiments cellulaires.

III. Détermination des points de contrôle par perturbation de la voie métabolique

Dans ce cas, le système biologique est perturbé (inhibiteur, activateur, anoxie,

etc.) et les changements de concentration des métabolites sont mesurés.

Le théorème de «cross-over» (croisement) indique que suivant une perturbation

d'une voie métabolique, les variations en concentrations de métabolite, avant et

après une enzyme de contrôle, ont des signes différents.

• Par exemple dans le cas d'anoxie du cerveau de souris, il y a une réduction

en glucose-6-P et fructose-6-P et une augmentation dans les concentrations

de Fru-P2 et triose phosphates.

➢ Donc «cross-over» entre Fru-6-P et Fru-P2 démontrant que l'anoxie a

activé la PFK-1 puisque les concentrations de ses substrats sont réduites

et les concentrations de ses produits sont augmentées.


IV. Par modelage mathématique, afin de reproduire une valeur expérimentale

Il s’agit de déterminer d’abord tous les paramètres cinétiques pour les

substrats, les produits et les inhibiteurs des enzymes dans une voie.

Ensuite les équations de vitesses décrivant la variation de la concentration de

chaque métabolite avec le temps dans une voie sont résolues de façon simultanée

afin de calculer les concentrations de tous les métabolites en fonction du temps.

Cette approche a été utilisée avec succès pour modeler les concentrations de

métabolites dans la voie glycolytiques chez les érythrocytes.

Avec les puissances des moyennes de calcul toujours croissantes, cette

approche est en train de se répandre pour traiter les voies métaboliques plus

compliquer et en interaction avec d’autres voies.


Exemples de contrôle métabolique

Régulation de la glycolyse : Il y a deux points majeurs de contrôle

correspondant aux réactions catalysées par l’hexokinase et la 6-

phosphofructokinase.

Il y a également la possibilité que les réactions catalysées par la pyruvate

kinase et celle de l’aldolase ne sont pas à l'équilibre in vivo. Cependant, l’activité

de la pyruvate kinase est très élevée dans le muscle, laissant entrevoir son pouvoir

régulateur.

Cas de la régulation par l'activité de 6-phosphofructokinase (PFK-1)

Le comportement cinétique de l'enzyme est le suivant :

À des concentrations faibles de F6P, les hautes concentrations

physiologiques d'ATP sont inhibitrices – voir (a).

L'inhibition se fait à travers la liaison de l’ATP à un site distinct du site actif

impliquant une inhibition allostérique et en stabilisant l’état T.

Par contre, le F6P se lie à l’état R de préférence; donc la courbe de vitesse à

faible [ATP] est hyperbolique – voir (b).

Cette inhibition à haute [ATP] est augmentée par le citrate, mais

contrecarrée par AMP, ADP, Pi et F-1,6-P

• Ces derniers composés s’accumulent lors de la dégradation d'ATP.

v0

(a)

[ATP]

Haute [F6P]

Faible [F6P] + AMP

Faible [F6P]

Faible [ATP]

Haute [ATP] inhibitrice

[F6P]

v0

[ ] physiologique

(b)


Hypothèse 1 Selon les données, l'interprétation la plus simple suggère que la

[ATP] contrôle l'activité de 6-phosphofructokinase et par conséquent le flux dans

la voie glycolytique.

➢ Donc lorsque [ATP] est élevée, l'enzyme est plutôt inhibée et la

production de l'ATP décroît.

Ceci prédit qu'il y a des changements importants de l'ATP in vivo afin

d'expliquer les changements de l'activité enzymatique.

• Cependant les mesures des [ATP] des muscles du vol d'une mouche

(«calliphore») n'ont démontré qu'une légère baisse en

concentration d’ATP (~10%) même si le flux de métabolites

augmente 100x.

➢ Conclusion : La variation en ATP n'est pas

suffisante pour expliquer l'augmentation importante dans le

flux métabolique.

Hypothèse 2 Il était suggéré que les effets de l'ATP puissent être contrecarrés

par les métabolites ADP et AMP.

Ces métabolites sont liés par la réaction catalysée par l’adenylate kinase, à

l'équilibre in vivo

Mg2+

ATP + AMP ⇌ 2 ADP

Puisque [ATP] > [ADP] et [AMP] in vivo, un petit changement en ATP

produit un grand changement en ADP et AMP

Les changements en AMP augmentent par 2.5x dans les muscles en vol chez

cette mouche

• La nouvelle suggestion est donc que l'activité PFK est contrôlée par une

combinaison des changements en ATP, AMP, ADP et autres métabolites

comme Pi

➢ Malheureusement le comportement cinétique de l'enzyme rend cette

suggestion peu probable

Hypothèse 3 Une autre interprétation des données a été basée sur la notion du

cycle des substrats.

Lorsque le muscle est en repos, la [AMP] est faible. Dans ces conditions, la

vitesse de transformation de F6P en FBP, catalysée par PFK, est basse et elle est

opposée à la conversion de FBP en F6P, catalysée par fructose-bisphosphatase


➢ Résultat : un flux net faible à travers la voie.

Cependant quand le muscle doit travailler, [ATP] ↓ et [AMP] ↑, dans ce cas,

la PFK est activée et la fructose-bisphosphatase devient inhibée.

• Ceci permet un flux net important qui, à partir d'une augmentation de

[AMP] 2.5x, peut augmenter le flux 250x, selon les calculs en utilisant

les données physiologiques.

Révision Contrôle du flux glycolytique par la fructose-2,6-bisphosphate

À partir de 1980, il était devenu évident que la régulation par les nucléotides

adénines n'était pas suffisante pour expliquer le flux glycolytique lorsque la

compartimentalisation et l'état de protonation étaient pris en considération

La découverte du fructose-2,6-bisphosphate (F26P) comme régulateur de

l'activité de PFK-1 surtout dans le foie a attiré beaucoup l’attention.

• Le F26P active la PFK-1 à des niveaux de concentration de 0.1 μM

➢ L'activation est synergique avec AMP.

• Le F26P est aussi un inhibiteur puissant de FBPase-1 du foie et agit d'une

façon synergique avec AMP dans l'inhibition

La synthèse (à partir de F6P) et la dégradation du F26P (en F6P) sont

catalysées par une activité kinase et une activité phosphatase présente dans la

même enzyme et appelée PFK-2/FBPase-2.

Ces activités sont contrôlées par la phosphorylation réversible impliquant la

protéine kinase A et la protéine phosphatase 2A.

• En raison de ses actions antagoniques sur les enzymes PFK-1 et FBPase-

1, le F26P joue un rôle crucial dans le contrôle des voies hépatiques

opposées, soient la glycolyse et la gluconéogenèse.

• Voir la figure suivante résumant le rôle de F26P dans le foie


Voie du métabolisme intermédiaire hépatique

Régulation des activités de PFK-2/FBPase-2

Abréviations :

Gly-3-P, glyceraldehyde-3-P ; OAA, oxaloacétate ;

PEP, phosphoénol-pyruvate ; PEPCK, PEP carboxykinase ;

Pi, phosphate inorganique ; PK, pyruvate kinase

PKA, protéine kinase A ; PP2A, protéine phosphatase 2A

La régulation des activités de la cible PFK-2/FBPase-2, de 6-phospho-fructo-1-

kinase (PFK-1) et de fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase-1), aussi bien que la

régulation de PFK-2/FBPase-2 lui-même par l'intermédiaire des effecteurs et

de la modification covalente sont montrées.

Glucose

Glucose 6-P

Glu-6-Pase GK

PFK-1 FBPase-1

Fructose 1 6-P2

Fructose 2 6-P2

K K K K

B B B B

Fructose 6-P

PKF-2/FBPase-2

PKA Citrate Gly-3-P

PEP

Gly-3-P Pi

PP2A

+

+

-

PK

Lactate, alanine

Pyruvate

PEP

OAA

+

PEPCK


Dans le foie, [F26P] mais pas celle d’ATP, d’AMP ou du citrate module la

production de glucose hépatique (≡ HGP) à travers un mécanisme de

phosphorylation réversible montré dans la figure ci basse.

C terminus

Protéine kinase A Protéine phosphatase 2A

HGP

[F-2,6-P2 ]

1B

K

La phosphorylation de Ser32 (indiqué par le cercle jaune) active la bisphosphatase

et inhibe la kinase. La déphosphorylation du même résidu produit les effets

opposés. Le rapport d’activité kinase/bisphosphatase (K/B) module le niveau

hépatique de fructose-2,6-bisphosphate (F26P) comme indiqué, qui à son tour gère

la production hépatique de glucose (HGP). Le glucagon stimule la protéine kinase

A cAMP dépendante, et le glucose stimule la protéine phosphatase 2A xylulose-5-

P dépendante.

N t

erm

inu

s

1B

K

HGP

[F-2,6-P2 ] P

P

K

K ≡ kinase B ≡ Bisphosphatase

K

K

K

B

B

B

B

Régulation des activités enzymatiques bifonctionnelles de la PFK-2/FBPase-2

par phosphorylation réversible


La présence de F26P indique que le niveau de glucose est haut et que la

gluconéogenèse est arrêtée

La présence de glucagon provoquera une chute de [F26P] et par conséquent

favorise la gluconéogenèse

Son rôle de stimulateur puissant de la glycolyse est cohérent avec la

présence de la F26P dans tous les tissus dépendants de la glycolyse.

➢ Le système enzymatique bifonctionnel, PFK-2/FBPase-2, est trouvé

dans pratiquement chaque tissu ou cellule eucaryote étudiée.

• Diverses isoformes de cette enzyme sont exprimées de façon

différentielle dans des tissus.

Dans le cœur, la concentration de F26P devient élevée lors de

l’augmentation de la charge de travail, ou après stimulation avec de

l'adrénaline ou de l'insuline.

• Ces facteurs augmentent les niveaux de F26P en activant la kinase de

PFK-2/FBPase-2 à travers un mécanisme impliquant la phosphorylation

de trois résidus conservés (Ser466, Thr475, et Ser483) par des protéine

kinases spécifiques.

La position de PFK2/FBPase2 dans la voie glycolytique

lui confère un fort pouvoir de régulation

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