TRAVAUX ORIGI NAUX Mddecine et Maladies Infectieuses - 1 9 8 8 - 1 - 9 6 1 6

ETUDE DE LA SURVIE DE BACILLUS SUBTILIS, PSEUDOMONAS AERUGINOSA ET STAPHYLOCOCCUS

AUREUS DANS L'ETHANOL EN FONCTION DU TEMPS, DU TITRE ALCOOLIQUE ET DU pH*

par D. LEPAUX** et M.F. BLECH***

RESUME L'6thanol est largement utilis6 comme antiseptique, pour la desinfection des mains ou avant une injection, par exemple. La survie de trois germes:

Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus dans 1'6thanol a et6 etudi6e en function du temps de contact, du t i tre alcoolique et du pH. Les essais ont 6re realises dans le cadre d'un plan factoriel. Les bact6ries survivantes ont ete numerees apr~s f i l t rat ion sur membrane des 6chantillons, rin~age de la membrane ~ I'eau distillee st6rile, ensemencement de celle-ci sur g61ose Mueller Hinton et incubation 24 heures 37°C. Les resultats ont et~ analys~s et compar6s par regression polynomiale et analyse de variance. Pseudomonas aeruginosa s'est r6v616 plus sensible que Staphylococcus aureus lui m6me plus sensible que Bacillus subtilis. La courbe d' inact ivat ion des germes est biphasique avec une forte diminution du nombre de germes avant 12 minutes. L'inactivation est multipliee par un facteur deux Iorsque le t i tre alcool ique varie de 30 ° 60 ° et de 60 ° ~ 90 °. Le pH est 6galement un facteur important : I'ethanol a 90 ° et de pH 7 n'est pas plus efficace que I'ethanol ~ 60 ° et de pH 8,5 sur B. subtilis. II y a, de plus, des interactions entre ces facteurs 6tudi6s. Les conditions optimales pour obtenir une bonne d6sinfection sont d'util iser de I'ethanol ~ 90°~ pH acide (5,5) ou alcalin (8,5).

Mots-cl6s : Ethanol - Antiseptique - pH - Bac. subtil is - Ps. aeruginosa - St. aureus

INTRODUCTION ET O B J E C T I F S DE L'ETUDE

L'6thanol est utilis6 en milieu hospitalier comme antiseptique (ou d6sinfectant) : c'est-h-dire selon les normes AFNOR de la s6rie T 72 comme agent capable d'abaisser de 5 puissances de 10 le niveau de contamination bactdrienne et]ou virale des tis- sus vivants (ou des surfaces inertes) ou comme vecteur d'autres antiseptiques (ou d6sinfectants).

*Re~u le 1.4.1987. Acceptation d6finitive le 20.9.1987. **Laboratoire de Microbiologie, Centre des Sciences de l'Environnement, 1 rue des R6collets, F-57000 Metz. ***Service d'Hygi~ne hospitali6re, Centre Hospital ier Universitaire Nancy-Brabois, B.P. 184, F-54505 Vandoeuvre Cedex.

Enfin, t'6thanol rentre 6galement dans la compo- sition de nomt)reuses pr6parations ni ant isep- tiques, ni d6sinfectantes ; il est alors utilis6 pour ses propri6tds solvantes, par exemple. L'6thanol un titre donn6 est pr6par6 par mouillage, c'est-h- dire dilution d'un alcool de titre sup6rieur par de l'eau distillde ou d6min6ralis6e, dont la Pharma- cop6e Fran~aise (8~me 6d.) ne pr6voit pas qu'elle suit st6rile. Aussi une contamination bact6rienne est-elle possible lors du mouillage de l'alcool et la pr6sence des germes contaminants dans l'6thanol a d6jh 6t6 constatde. Suite h une 6tude de l'efficacit6 d'une s6quence sa- yon non antiseptique + 6thanol dans le lavage des mains, il a 6t6 constat6 (1) que l'efficacit6 de cette s6quence 6tait function de la na ture du savon utilis6. Or le principal facteur distinctif entre ces savons 6tait le ptI.

I1 ressort de l 'analyse bibliographique que l'6thanol a sur les bact6ries une action g6n6rale propre h tous les antiseptiques qui se traduit par une modifica- tion de la dynamique de croissance voire une action bact6ricide sur les cellules mises ~ son contact dans un milieu nutr i t i f ou non. Ainsi une inhibition de la croissance d'Escherichia coli pour des concentra- tions d'6thanol 6gales ou sup6rieures h 0,8 M a 6t6 d6montr6e (4). Inversement pour des concentrations faibles (0,2 M), i l n'y a pas d'effet toxique notable (8). L'6thanol peut m6me 6tre utilis6 comme source de carbone pour la croissance bact6rienne (16). L'inhibition de la croissance est donc apparemment dose d6pendante (5, 6). Toutefois, il a 6t6 constat6 (8, 15) que l'6thanol h concentration sup6rieure ou 6gale ~ 21,5 M 6tait moins actif que l'6thanol h 15,2 M. De plus, le facteur temps est comme pour route ac t ion d 'un a n t i s e p t i q u e , un p a r a m ~ t r e c16. L'aetivit6 baet6ricide de l'6thanol, particuli6rement marqu6e dans les premi6res secondes de contact (15) augmente avec le temps de contact (3, 8, 10, 15).

I1 ressort de la litt6rature, assez pauvre sur ce sujet, que les bact6ries sont d iversement sensibles l'action de l'6thanol (7, 8, 3). En ce qui concerne les 6tudes compara t ives d 'act ivi t6 bact6r ic ide de l'6thanol avec d'autres substances antiseptiques, la bibliographic est encore plus restreinte. L'6thanol es t p lus ef f icace que le savon o r d i n a i r e et l 'hexochloroph6ne (11) et les savons non ant i- septiques, h condition d'6tre utilis6 seul (1).

Pour ces raisons, ce travail avai t pour objectif d'6tudier la survie dans l'6thanol de trois germes (Bacillus subt i l is , Pseudomonas aeruginosa et Staphylococccus aureus) en fonc t ion du t i t r e alcoolique (30 ° - 5,4 M ; 60 ° - 11,3 M e t 90 ° - 18,6 M) et du pH (5,5 ; 7 et 8,5). Les germes pr6c6demment cit6s ont 6t6 re tenus d'une part afin de pouvoir 6tudier un germe h Gram n6gatif et deux germes Gram positif, dont un poss6dant une forme sporul6e; d'autre part parce que Pseudomonas aeruginosa et S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s son t les l e a d e r s de l 'hospitalisme infectieux.

M A T E R I E L ET M E T H O D E S

Bact6r ies

Les souches suivantes ont 6t6 utilis6es :

- Bacillus subtilis : souche de laboratoire ; code analytique API n ° 277 7701 55. - Pseudomonas aeruginosa : souche nosocomiale ; code analytique API n ° 105 457. - Staphylococcus aureus : souche nosocomiale ; code analytique API n ° 673 6153.

La souche de Bacillus subtilis a 6t6 fournie par le Laboratoire de Microbiologie de la Facu l t6 de Pharmacie de Nancy. Les souches de Pseudomonas aeruginosa et S taphy lococcus aureus ont 6t6 fournies par le Service d 'Hygi6ne du C.H.U. de Nancy-Brabois. Des souches nosocomilales ont 6t6 retenues afin d'6tre dans des conditions proches de la r6alit6 hospitali6re.

Les germes, apr6s culture en bouillon trypticase soja (Biom6rieux, r6f. 51151) (24 heures h 37 ° ) e t repiquage sur g61ose Mueller Hinton (BioM6rieux, r6f. 51861) (24 heures h 37°C), ont 6t6 mise en suspension dans un milieu lact6 (Bacto Skim Milk, r6f. 0032-01-1) et lyophyl is6s ( l y o p h i l i s a t e u r Hetofrig). Au fur et h mesure des besoins, les germes lyophilis6s ont 6t6 mis en culture dans un bouillon trypticase soja (24 heures h 37°C), puis repiqu6s sur g61ose Mueller Hinton (24 heures h 37°C). Les souches repiqu6es sur g61ose Mueller Hinton ont 6t6 utilis6es au cours des exp6rimentations.

P r6pa ra t i on des i n o c u l u m s

Les inocu lums ont 6t6 p r6par6s h p a r t i r de s u s p e n s i o n s b a c t d r i e n n e s d a n s de l ' e a u physiologique st6rile (NaC1 0,9 %) filtr6es sur toile h bluter 48 lam (Monyl r6f. 48 HC) pour 61iminer les agr6gats bact6riens. Les densit6s bact6riennes ont 6t6 ajust6es h environ 100 germes/0,1 h 0,5 ml par dilution au 1/10 ° de ces suspensions dans de l 'eau physiologique et par r6f6rence h des courbes 6talon pr6alablement 6tablies et expr imant la dens i t6 optique mesur6e h 620 nm (spec t rophotom6tre Uvikon 810) en fonction de la concentrat ion en germes.

Solut ions 6thano l iques

L'6thanol utilis6 pour p r6pare r les diff6re.ntes solutions 6tait h 95 ° (Coop6ration Pharmaceutique Franqaise), conforme aux normes de la Phamacop6e Franqaise (86me 6d).. I l a 6t6 mouill6 h trois titres d i f f6 ren t s (30, 60, 90°), c o n f o r m 6 m e n t /t la Pharmacop6e Franqaise (86me 6d), avec de l 'eau distill6e st6rilis6e par autoclavage 20 mi'hutes h 120°C. Le ptt des solutions d'6thanol h 95 °, 90°et 60 °

10:

est de 4,9 ; le pH de l'6thanol ~ 30 ° est de 5,6. Les pH ont 6t6 ajust6s A partir du pH initial avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium de dens±t6 1,38 (Rectapur Prolabo code 28224296), dilu6e au 1/10 ° ou au 1/100 °. Les pH ont 6t6 mesur6s ~ t'aide de papier indicateur (Lyphan n ° 665,8 ; n ° 667,8 et n ° 671,8) avec une approximation de + 0,2. Les solut ions 6thanol iques ont 6t6 s t6r i l i s6es par f i l tration sur membrane en n i t ra te de cellulose porosit6 0,2 pm, diam6tre 47 mm (Whatmam, cat. 7182004). La fi l tration a 6t6 effectu6e sous vide dans un syst~me st6rilisable (Nalg6ne cat. 300- 4000). Un contr61e de s t6r i l i t6 a 6t6 effectu6 c o n f o r m 6 m e n t ~ la P h a r m a c o p 6 e F r a n q a i s e (106me 6d.) : filtration, rin~age de la membrane et e n s e m e n c e m e n t de celle-ci en mi l ieu l iquide trypticase soja.

M6thodes de quan t i t i f i ca t i on

Numdration par inclusion en milieu gdlosd : elle a 6t6 effectu6e par incorporation de 1 ml de solution 6thanolique ou de 1 ml d'eau distill6e t6moin, dans de la g61ose maintenue en surfusion, en boite de P6tri de diam~tre 90 ram, st6rile, ~ usage unique. Une fois solidifi6es, les boites de g61ose ont 6t6 raises ~ incuber ~ 37°C. La num6ra t ion a 6t6 effectu6e par lecture ~ 24 heures puis & 48 heures. Les r6sul ta ts ont 6t6 exprim6s sous forme de moyenne ari thm6tique ou g6om6trique accompa-

gn6e de son 6cart type en unit6s formant colonies (UFC) + 6cart-type (o) calcul6 par rapport /~ la moyenne des r6p6titions

Filtration sur membrane et culture sur mi l ieu gdlosd Mueller Hinton : la fi l tration a 6t6 effectu6e sur une rampe fonctionnant sous vide cr66 ~ la trompe ~ eau, les 6chant±lions ont 6t6 filtr6s sur les membranes pr6c6demment d6crites. La fi l tration a 6t6 suivie de 3 rinqages successifs de la membrane par de l 'eau distill6e st6rile (3 x 30 ml), a f in d'61iminer l'6thanol r6siduel. La membrane a 6t6 d6pos6e sur une boite de Petri de diam6tre 50 mm, st6rile, ~ usage unique contenant de la g61ose Mueller Hinton et mise ~ incuber /t 37°C. La num6ration a 6t6 effectu6e par lecture ~ 24 heures puis ~ 48 heures. Les r6sultats ont 6t6 exprim6s en UFC _+ o.

P R O T O C O L E

Dans les essais appliqu6s syst6matiquement aux trois germes : Bacillus subtil is, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus, ont 6t6 6valu6s : l'effet du temps de contact (0 h 72 mi- nutes) , du titre alcoolique (30 °, 60 ° et 90 °) et du pH (5,5 ; 7 et 8,5). Au temps t = 0, six tubes (Bio- M6rieux r6f. 92002) contenant 10 ml d'6thanol ont 6t6 contain±ntis selon les cas avec 0,1 h 0,5 ml d'ino- culum contenant environ 100 microorganismes. Le

TABLEAU 1 Q u a n t i f i c a t i o n p a r f i l t r a t i o n s u r m e m b r a n e de Baci l lus sub t i l i s a p r ~ s c o n t a c t a v e c l ' 6 thanoh R6su l t a t s UFC ± o/10 ml) r a p p o r t 6 s / l une c o n t a m i n a t i o n ini t ia le de 100 ge rmes

Temps degr6s 12 mn 24 mn 36 mn 48 mn 60 mn 72 mn

pH

30 ° 100,- 54,4 51,1 61,3 47,6 72,6 66,2 + 37,1 ± 26,6 ± 8,- 4- 21,3 ± 11,5 ± 20,2 ± 41,1

5,5 60 ° 100,- 43,8 42,3 33,3 34,2 41,1 38,7 _ 34,6 ± 18,5 4- 20,6 ± 29,3 - 19,8 ± 22,8 ± 21,1

90 ° 100,- 28,1 25,8 29,1 31,8 15,2 16,6 ± 27,- ± 6,3 - 14,- ± 15,5 ± 15,5 4- 3,5 ± 5,9

30 ° 100,- 60,- 58,3 57,5 59,2 56,2 64,7 4- 30,7 ± 9,- +- 21,4 _+ 12,- ± 15,1 ± 5,2 4- 18,1

7 60 ° 100,- 65,8 44,4 34,3 36,7 47,1 41,3 ± 30,6 ± 24,6 --- 10,9 ± 20,5 --. 21,6 ± 24,3 ± 21,-

90 ° 100,- 57,3 40,1 42,4 36,8 31,8 35,3 ± 26,4 ± 21,9 ± 9,5 4- 10,4 +_ 12,1 - 8,7 4- 8,9

30 ° 100,- 62,7 50,5 66,1 53,7 58,3 60,7 ± 12,1 ± 28,5 4- 6,1 ± 14,6 ± 13,3 4- 16,8 ± 15,2

8,5 60 ° 100,- 47,- 37,8 38,8 37,5 29,6 29,6 ± 40,7 ± 10,7 ± 26,- ± 22,2 - 7,2 ± 9,2 ± 18,4

90 ° 100,- 26,1 16,9 18,7 16,1 13,4 14,9 ± 42,- ± 16,1 ± 14,6 ± 13,7 ± 20,9 ± 12,6 ± 11,3

11

volume de l 'inoculum 6tait fonction de la derisit6 bact6rienne initiale. Le niveau de contamination a 6t6 contr616 pa r n u m 6 r a t i o n (3 boi tes ) pa r 4

inclusion en milieu g61os6 Mueller Hinton. Apr~s | 12, 24, 36, 48, 60, 72 minutes de contact, chacun 10 des six tubes a 6t6 trait6 selon la m6thode d6crite au § pr6c6dent. I Chaque exp6rience a 6t6 r6p6t6e 3 lois. Un plan factoriel d'exp6rience a 6t6 construi t de fa~on a pouvoir analyser les r6sultats par une m6thode de r6gression et d'adopter un module math6matique. De plus pour chacun des germes test6s, des courbes donnant Y = n o m b r e de germes pr6sents apr~s contact avec l'6thanol en fonction du temps ont 6t6 o trac6es pour chaque titre alcoolique et chaque pH. ~.10~ o La contaminat ion des solutions 6thanoliques par +~ exa c t e me n t 100 ge rmes 6rant impossible , les r6sultats ont 6t6 rapport6s a une contaminat ion "~ in i t ia le de 100 germes grace h la num6ra t ion contr61e effectu6e a tO. Les diff6rentes s6ries ont 6t6 compar6es a l'aide du test de Student (2).

R E S U L T A T S

E x p o s 6 d e s r 6 s u l t a t s o b t e n u s d a n s l e s d i f f6 r e n t e s s6r ies

Bacillus subtilis Les r6sultats rapport6s h une contamination ini- tiale de 100 germes sont rassembl6s dans l e ta- bleau I, pr6sent6s sous forme de courbe (Figure 1). Apr6s contact avec l '6thanol a 30 ° la courbe de survie est biphasique. Elle d6croit rap idement jusqu'a 12 minutes, puis lin6aire, elle t raduit une pr6sence constante au niveau de 65% (soit un abaissement de 0,18 log) jusqu'a 72 minutes. Quel que soit le pH test6 (5,5; 7 ou 8,5) les r6sul ta ts peuven t 6tre consid6r6s comme ident iques par rapport au test de Student. Apr~s contact avec l'6thanol a 60 ° le nombre de germes d6croit g r a d u e l l e m e n t pour a t t e i n d r e environ 35 % a 72 minutes (soit un abaissement de 0,4 log). Les r6sul ta ts peuvent 6tre consid6r6s comme identiques, quelque soit le pH test6, par rapport au test de Student. Apr~s contact avec l'6thanol a 90 ° le nombre de germes d6croit plus fortement et la diff6rence de surv ie en fonc t ion du pH a pu ~tre mise en 6vidence entre pH 5,5 et pH 7 et entre pH 7 et pH 8,5 mais non entre pH 5,5 et 8,5 pour un intervalle de confiance de 95 %. A 72 minutes, environ 35 % (soit un abaissement de 0,4 log) de germes ont 6t6

F I G U R E 1 Quan t i f i ca t ion p a r f i l t r a t ion su r m e m b r a n e de Bacillus sub t i l i s a p r ~ s c o n t a c t a v e c

r6 thano l . pll 5,5 (. ), 7 (x,-- .-- ,) et 8,5 ([-1, - - - )

d6nombr6s a pH 7 contre environ 15 % a pH 5,5 ou 8,5 (soit un abaissement de 0,82 log). Sur Bacillus subtilis, l ' inactivation produi te par l'6thanol h 90 ° et pll 7 n'est pas sup6rieure h celle produite par l'6thanol h 60 ° et pH 5,5. Pour Pseudomonas aeruginosa aucun germe n'a 6t6 mis en 6vidence, quels que soient le t i tre de l'alcool et le pH test6s, ce, m6me a 12 minutes.

Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus a 6t6 mis en 6vidence apr~s contact avec l'6thanol a 30 ° (Figure 2) mais non apr~s con tac t avec l '6 thanol a 60 ° ou a 90 ° . L'ensemble des r6sultats, obtenus avec l '6thanol a 30 ° et rapport6s a une contamination init iale de 100 germes sont pr6sent6s dans le tableau If:

12:.

L'influence du pH a 6t6 raise en 6vidence par le test de Student avec un intervalle de confiance ~ 95% pour un pH var iant de 5,5 & 7 et de 7 ~ 8,5 mais non de 5,5 ~ 8,5. A pH 8,5 et pH 5,5 aucun germe n'a 6t6 retrouv6 respectivement ~ 60 et 72 minutes. Par contre & pH 7 Staphylococcus aureus a encore 6t6 mis en 6vidence ~ 72 minutes. Le nombre de ger- mes retrouv6 est de l'ordre de 1% (correspondant un abaissement de 2 log).

100

o

. J

o v--

"-10 o +1

U -

/

/

i

i

/

!J

9o

F I G U R E 2 Quant i f i ca t ion par f i l t ra t ion sur m e m b r a n e d e Staphy lococcus aureus a p r ~ s c o n -

tact avec l '6thanol pH 5,5 (. ), 7 (x,. , ,) et 8,5 ([-71 - - - - - - )

A n a l y s e de var iance et expres s ion d 'un modU- le p o l y n o m i a l

Les figures 1 et 2 i l lustrant les r6sultats respecti- vement obtenus sur Bacillus subtilis et Staphylo-

coccus aureus et les rdsul ta ts nuls obtenus sur Pseudomonas aeruginosa montrent que routes les variables (temps, n a t u r e de la bac t6r ie , t i t r e a lcool ique , pH) i n f l u e n t su r les c i n 6 t i q u e s d'inactivation des micro-organismes.

La m6thode de r6gression utilis6e, a impos6 de ne tenir compte que des r6sultats obtenus sur Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus (les r6su l ta t s n u l s o b t e n u s sur P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a provoquen t une in6gal i t6 des va r i ances ) . La r 6 g r e s s i o n m u l t i p l e a donn6 une 6 q u a t i o n exprimant Y = hombre de germes quantifi6 apr6s contact avec l'6thanol en fonction de chacune des variables 6tudi6es (X2 = nature de la bact6rie, X3 = titre alcoolique, X4 = pH) et des interactions entre ces variables.

Le mod6le n'est applicable qu'au domaine 6tudi6. I1 n'est pas extrapolable ~ des temps sup6rieurs h 72 minutes ni ~ des pIl sup6rieurs h 8,5 ou inf6rieurs h 5,5. I1 n'est pas possible, non plus, de l 'appliquer h d'autres souches bact6riennes que celle 6tudi6es. I1 permet , par con t r e , d ' e s t i m e r des p o i n t s i n t e r m 6 d i a i r e s non tes t6s comme le m o n t r e l'exemple du tableau III (quantification de Bacillus subtilis apr~s contact avec l'6thanol h 70 ° h pH 5,5). Pour cet exemple ]'6thanol h 70 ° a 6t6 retenu car co r r e spondan t au t i t r e de l ' 6 t h a n o l modi f i6 couramment utilis6 en milieu hospitalier.

L'analyse de variance a permis de conclure que les r6sultats des exp6rimentations ne sont pas dus au hasard et que les variables 6tudi6es ont eu une influence sur le r6sultat, le plus important 6rant le temps X1. Apr6s le temps, se s i tuen t par ordre d6croissant d'importance : la nature de la souche X2, le ti tre alcoolique X3 et le pH X4.

L 'analyse de variance a permis 6 g a l e m e n t de d6montrer qu'il existe des interactions ent re les diff6rentes variables (9).

DISCUSSION

Nos r6sultats sont en accord avec la plupart des auteurs cit6s (1, 3, 8, 10, 15) pour l 'influence du temps, du titre et de la nature de la souche.

Outre le fait que le module n'est valable que pour le domaine test6, il a l 'inconv6nient de ne pas pren-

13:

T A B L E A U I I Q u a n t i f i c a t i o n p a r f i l t r a t i o n s u r m e m b r a n e d e Staphylococcus aureus a p r ~ s c o n t a c t a v e c

l '6 thanol h 30 ° (UEC + o/10 ml). R6sultatS rapport6s h u n e c o n t a m i n a t i o n ±nit±ale de 100 g e r m e s

Temps 0 12 mn 24 mn 36 ma 48 mn 60 mn 72 mn

pH

5,5 100,- 54,- 38,8 9,1 2,4 1,3 0

± 21,5 ± 3,8 ± 8,8 ± 2,5 ± 1,2 ± 1,4

16,2 7 100,- 66,9 50,9 28,0 7,9 0,7

± 11,7 - 5,1 ± 7,3 ± 15,9 :i: 3,5 ± 2,- ± 1,I

8,5 100,- 30,1 0,8 0,8 0,3 0 0

± 20,4 ± 1,3 ± 1,3 ± 17,8 ± 0,7

T A B L E A U I I I Q u a n t i f i c a t i o n de Bacillus subtilis apr/~s c o n t a c t a v e c l ' 6 t h a n o l A 70 ° et p H 5,5 : r 6 s u l t a t s o b t e n u s par a p p l i c a t i o n du modble p o l y n o m i a l et rapport6s h u n e c o n t a m i n a t i o n ±nit±ale de 100 germes . Les r6sul tats son t d o n n 6 s c o m p a r a t i v e m e n t aux r6sultats t h 6 o r i q u e s et e x p 6 r i m e n t a u x

o b t e n u s apr~s c o n t a c t avec l '6thanol a 60 ° et 90 ° h pH 5,5. A p p l i c a t i o n de l ' 6quat ion :

Y - 38 ,17 - 18,18X1 - 17,47X2 + 4, 68 (X12 - 4) - 12 ,61X 3 - 1,83 (X13 - 7X1) - 2 , 8 4 X I X 2 + 0,69 (X14 -9,57X12 + 10,29) - 11,22 (X42 - 0,67)

+ 2 ,52X1X2X3 + 8, 67 (X32 - 0,67).- 18,24 (X32 - 0,67) (X42 - 0,67) + 4,53 X2X 3

+ 0 ,99 (X12 - 4) X 2 + 4 ,70X2XaX4 + 6,54X2 (X42 - 0,67) - 0,65 (X13 - 7XI ) X 3

Ethanol 60 °

Ethanol 70 °

Ethanol 90 °

R6sultats th6oriques

R6sultats exp6rimentaux

R6sultats th6oriques

R6sultats th6oriques

Resultats exp6rimentaux

100

100

100

100

100

TEMPS (MINUTES)

12

43

44

39

33

28

24 36

33 39

42 33

28 35

21 28

26 29

48

41

34

38

31

32

60

35

41

31

23

15

72

36

39

28

15

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d r e Pseudomonas aeruginosa en c o m p t e . Ce lu i - c i a u r a i t p r o b a b l e m e n t 6t6 m i s e n 6 v i d e n c e h d e s t e m p s e x p 6 r i m e n t a u x i n f 6 r i e u r s h 12 m i n u t e s (8, 3). D e s t e m p s i n f 6 r i e u r s h 12 m i n u t e s n ' o n t p a s 6t6 t e s t 6 s p o u r d e s m o t i f s t e c h n i q u e s ( la f i l t r a t i o n en e l l e m 6 m e d e m a n d e u n c e r t a i n t e m p s ) , s t a t i s t i q u e s ( les d i f f 6 r e n t s t e m p s d e v a i e n t 6 t re r 6 g u l i 6 r e m e n t e s p a c 6 s ) e t a u s s i p a r c e q u ' u n d e s ob jec t i f s de c e t t e 6 t u d e 6 t a i t l a s u r v i e 6 v e n t u e l l e des g e r m e s d a n s l ' 6 t h a n o l e t c e t o b j e c t i f i m p o s a i t donc de p r e n d r e d e s t e m p s de c o n t a c t a s s e z longs .

I1 s e r a i t h a s a r d e u x de g 6 n 6 r a l i s e r ~t Pseudomonas aeruginosa c o m m e ~ d ' a u t r e s g e r m e s n o n t e s t 6 s l ' e f f e t p H o b s e r v 6 s u r Bacil lus subt i l is e t Staphylococcus aureus.

T o u t e f o i s nos r 6 s u l t a t s , q u a n t ~ l ' e f f e t p H , v o n t d a n s le s e n s de ceux de B l e c h e t a l . , (1) q u i o n t 6 tu - di6 u n e f lo re t o t a l e in vivo. P o u r ceux-c i , l ' e f f i c a c i t 6 du l a v a g e d e s m a i n s p a r u n e s 6 q u e n c e s a v o n + 6 t h a n o l e s t s u p 6 r i e u r e l o r s q u e u n p H d u s ~ v o n e s t n e u t r e ou ac ide , c o m p a r a t i v e m e n t h u n p H a l c a l i n .

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I1 faut c e p e n d a n t t en i r compte que le pH de l '6thanol est n a t u r e l l e m e n t acide. Le pH d 'un m61ange ~ part ies 6gales de savon de pH 9 avec de l '6thanol ~t 90 ° n'est pas alcalin mais proche de la neutral i t6 et le pH d'un m61ange h parties 6gales de savon neutre et d'6thanol h 90 ° est acide.

C O N C L U S I O N S

Dans cette 6tude Bacillus subtilis s'est r6v616 le germe le plus na ture l lement r6sistant h l'6thanol et Pseudomonas aeruginosa le plus sensible.

Nos essais ont d6montr6 que le t i t re alcoolique et le pH influen~aient la cin6tique d' inactivation des germes par l'6thanol. L'exploitation s ta t is t ique a 6galement permis de m e t t r e en 6v idence des interactions entre les diff6rents facteurs 6tudi6s.

D'une faqon g6n6rale, cet te 6tude m o n t r e que l'activit6 d'un antiseptique est susceptible d '6tre in f luenc6e pa r les c o n d i t i o n s du m i l i e u en p a r t i c u l i e r par le ptI e t q u ' e n c o n s 6 q u e n c e l'efficacit6 d'un antiseptique d6pend des conditions d'utilisation. Ainti tout m61ange d'un ant isept ique ~t une s u b s t a n c e a n t i s e p t i q u e ou non e s t hasardeux.

REMERCIEMENTS

Les auteurs remercient J.C. Block et F. Bois.

SUMMARY S T U D Y O F T H E S U R V I V A L O F BACILLUS SUBTILIS, PSEUDO- MONAS AERUGINOSA A N D STAPHYLOCOCCUS AUREUS I N

E T H A N O L D E P E N D I N G ON C O N T A C T TIME, A L C O H O L C O N C E N T R A T I O N AND p H

Ethanol is widely used as an antiseptic for hands desinfection or before in ject ions by example. However its efficiency is control led by several factors as bacterial sort, contact time, alcohol concentration and pH. Then survival o f three microorganisms in ethanol : Baci l lus subt i l is , Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus has been s tud ied according to alcohol concentration, contact t ime and pH. The surviving bacteria were counted after membrane f i l t rat ion of the samples. Af ter the ethanol f i l tration, membrane has been washed with sterile dist i l led water and incubated on Muel le r H in ton agar medium at 37°C for 24 hours. Results were analysed and compared using a polynomial regression model and ANOVA variance analysis. Pseudomonas aeruginosa was more sensitive than Staphylococcus aureus and Bac i l lus sub t i l i s respectively to the e thanol action. Bacterial inactivation kinetics were greatly improved when contact t ime increases especially between 1 and 12 minutes and by a factor o f two when alcoholic concentrat ion increases from 5,4 M to 11,3 M and from 11,3 M to 18,6 M. pH is an important factor too. 18,6 M ethanol with a pH of 7 in no more eff icient than 11,3 ethanol wi th a pH o f 8,5 on Baci l lus subt i l is. From that study it can be shown that the four studied factors (bacterial sort, contact time, alcohol concentrat ion and pH) interact great ly and the op t ima l situation (i.e. the best desinfection) is obtained with 18,6 M ethanol and acidic (5,5) or basic (8,5) pH.

Key-words : Ethanol - Antiseptic- pH - Bac. subt i l i s - Ps. aerug inosa - St. aureus.

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B I B L I O G R A P H I E

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11 M I T T E R M A Y E R H., R O T T E R M. - Vergleich der W i r k u n g yon Wasser einigen Detergent ien und Athyla lkohol au fd ie t rans ien te Flora der H~nde. Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt., 1975, 160, 163-172.

12 Pharmacop~e Franfaise - Monographie Alcool ~thylique 95 °. 8ame 6dition, 1965, 76-77.

13 Pharmacop~e Franfaise - Densim~trie , Atcoom~trie. 8~me 6dition, 1965,1472-1481.

14 Pharmacop~e Franfaise - ContrSle de s ter i l i tY. 10brae ~dition, 1985, V 2-1.

15 PHILIP B., PRICE M.D. - Reevalua t ion ofe thyla lcohol as a germicid. Arch. Surgery, 1950, 60,492-502.

16 RYABUKOT T.A., P A S K E V I C H T.F. - G r o w t h a n d biomass accumulat ion of Pseudomonas s t r a ins in n u t r i e n t media with ethanol. Mikrobiologia, 1979, 48, 854-857.

ANALYSE DE LIVRE

MALADIES INFECTIEUSES par S. Cronberg, J. Beytout, M. Rey.

Coll. "Abrdges de Medecine ", Paris, Masson ddit., 1987, 464 pp., 15 fig.

Ce nouvel abrege des maladies infectieuses est une adaptation du manuel su~dois de Stig Cronberg, destinee au public m~dical et paramedical de culture fran~aise. S'ecartant des formes acad~miques, se voulant pragmatique et concret sans pour autant priver le lecteur des donn~es fondamentales indispensables a la comprehension des faits et des attitudes, cet ouvrage s'efforce surtout de r~pondre aux besoins des praticiens confront~s aux probl~mes infectieux les plus divers, que ceux-ci soient quotidiens ou rares, qu'ils soient autochtones ou exotiques.

Les quatre parties de I'ouvrage correspondent a quatre abords diff6rents de la pathologie infectieuse. Apres une presentation de I'histoire naturelle des infections, et des moyens de lutte, le lecteur trouvera une description de chacune des infections specifiques, puis une description des antibiotiques et des autres agents anti-infectieux ; la derni~re partie apporte une r~capitulation, pour chacun des grands syndromes, des attitudes diagnostiques et therapeutiques.

L.M.

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