Etude des interactions matiere organique dissoute ...ori-oai.u-bordeaux1.fr/pdf/2009/DE_PERRE_CHLOE_2009.pdf · 4 dans les ports du Bassin. En parlant de promenade, je remercie aussi

Université Bordeaux 1

Les Sciences et les Technologies au service de l’Homme et de l’environnement

N° d‘ordre : 3933

THÈSE

PRÉSENTÉE A

L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES

Par Chloé DE PERRE

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR SPÉCIALITÉ : CHIMIE ANALYTIQUE ET ENVIRONNEMENT

ÉTUDE DES INTERACTIONS MATIÈRE ORGANIQUE DISSOUTE – CONTAMINANTS ORGANIQUES DANS

L’ENVIRONNEMENT AQUATIQUE

Directrices de recherche : Édith PARLANTI et Hélène BUDZINSKI Soutenue le : 16/12/2009 Devant la commission d‘examen formée de : M. BENOIT Pierre, Chargé de recherche INRA AgroParisTech, Thiverval-Grignon Rapporteur Mme BUDZINSKI Hélène, Directeur de recherche CNRS, Université Bordeaux 1 Mme DERENNE Sylvie, Directeur de recherche CNRS, Université Pierre et Marie Curie Rapporteur Mme PARLANTI Édith, Chargée de recherche CNRS, Université Bordeaux 1 Mme PATUREAU Dominique, Directeur de recherche INRA, Narbonne Examinateur M. SCHMITTER Jean-Marie, Professeur, Université Bordeaux 1 Examinateur

3

REMERCIEMENTS

Je voudrais tout d‘abord remercier les membres du jury d‘avoir accepté d‘évaluer mon travail

et d‘avoir lu les 300 pages de mon manuscrit. J‘ai apprécié vos remarques justes et constructives.

Un très grand merci aussi à mes directrices de thèse pour m‘avoir encouragée à faire cette

thèse, pour m‘avoir encadrée afin que j‘arrive au bout de ces 3 ans avec des résultats à présenter et

aussi pour m‘avoir soutenue pour « l‘après thèse ». Merci aussi pour m‘avoir envoyée en congrès ici

et là pour m‘habituer à faire des oraux, sinon je crois que je ne serais vraiment pas venue à ma

soutenance. Le problème, maintenant, c‘est qu‘après la gaufre de l‘oral à Lyon, la crêpe de Saint

Tropez et la gaufre géante caramel-Nutella (merci Marie-Ange et Édith) de la soutenance, les bonnes

habitudes se sont installées et je ne pourrai pas faire d‘oraux sans réconfort chocolaté !

Je voudrais aussi remercier Anne-Marie Dorthe du groupe NSysA pour son aide et ses

précieux conseils concernant la pratique et la théorie des plans d‘expériences. À ce propos, merci

Hélène de m‘avoir appris que ces outils bien utiles existaient et d‘avoir eu l‘idée de cette collaboration,

c‘était une bonne idée.

Je remercie également Christian Béchemin pour nous avoir accueillis à l‘Ifremer de la

Tremblade afin de récupérer les échantillons d‘algues, pour les mesures de TOC du mois d‘août

dernier (d‘ailleurs je ne remercie pas notre analyseur de TOC qui, malgré mes mots doux, m‘a laissé

tomber quand il ne fallait pas) et aussi pour sa contribution essentielle à la crêpe de Saint Tropez,

finalement elle était bien tombée la tempête de janvier…

Ensuite, je remercie tous les membres du LPTC, permanents, doctorants et stagiaires, qui ont

croisé ma route en licence, master ou thèse et qui ont contribué au bon déroulement de ces travaux,

que ce soit pour les manips ou pour la vie de tous les jours ; ainsi que les membres de l‘ISM qui nous

simplifient parfois bien la vie (je pense surtout à Virginie, Fabrice…).

Je remercie plus particulièrement Karyn pour m‘avoir appris tout ce que je sais sur la SPME-

GC-MS et MS/MS et Hélène pour m‘avoir fait confiance et laissée bidouiller ses « joujoux ». D‘ailleurs,

j‘en profite aussi pour remercier tous les gens (Karyn, Fabienne, Marie-Ange…) qui se sont arrachés

les cheveux avec moi pour essayer de comprendre pourquoi les machines, des fois, n‘en font qu‘à

leur tête.

Merci aussi à Alexia, c‘est génial de travailler avec toi, les journées de dur labeur auraient pu

paraître interminables mais ta bonne humeur et nos fous rires ont fait des manips des moments très

agréables et en plus, on a finalement réussi à les écrire ces publis ! Alors, voisine de Cayac, j‘espère

que t‘oublieras pas ta cops de SPME et qu‘un jour on pourra retravailler ensemble. Merci aussi de

t‘être roulée dans la vase pour moi (ainsi que Fred, Ninette, Nath, and Co…) et de m‘avoir promenée

4

dans les ports du Bassin. En parlant de promenade, je remercie aussi Hélène et Karyn pour le tour de

bateau pour mon anniversaire, c‘est pas tout le monde qui a l‘honneur de se lever à 4h du mat pour

ses 24 ans… et le ponton à essence, c‘était quelque chose !!

Je remercie aussi Julien pour son aide précieuse à la réalisation des dernières manips.

Je remercie aussi tous les thésards pour leur soutien moral, leur bonne humeur, leurs blagues

pas toujours drôles et des fois leurs bons conseils qu‘ils soient scientifiques ou non. Merci aussi à

Ninette pour m‘avoir fait goûter sa cuisine libanaise maison, Alexia pour sa soupe patates-chorizo et

Fred pour m‘avoir permis de faire de la raclette au camembert. Finalement, c‘est des mauvaises

langues ceux qui disent que j‘aime rien !

Je remercie aussi Marie-Ange qui est arrivée pile poil au bon moment pour me réconforter à

coup de chocolat et de piscine, faut bien ça pour survivre à la rédaction d‘une thèse ! Et encore merci

pour la méga gaufre, j‘ai mis 5 jours à la manger mais j‘ai relevé le défi !

Nearly last but not least at all, merci Caroline pour tout !! Sans toi, j‘aurais sans doute

abandonné avant la fin mais vu qu‘on a réussi à finir, faut croire que nos thérapies de groupe du midi

ont bien marché ! Maintenant, je sais pas comment on va faire pour la suite, mais va falloir qu‘on

trouve un boulot dans le même labo (ceci est bien un appel à toi lecteur de ces remerciements et

potentiel recruteur…). Je ne vais pas m‘étendre plus sur ce paragraphe, j‘aurais encore 10 pages à

écrire à ce sujet mais on m‘a déjà fait remarquer que mon manuscrit était assez long… Donc pour

conclure, désolée pour les miettes !!

Et enfin, je remercie toute ma famille qui m‘ont toujours encouragée et soutenue et je pense

que, maintenant que vous savez ce que c‘est qu‘une thèse, vous êtes bien contents de ne pas en

avoir fait ! Mais comme chaque famille a son lot de fous, fallait bien que je me dévoue… Quoi qu‘il en

soit, je remercie mes parents de m‘avoir permis de faire les études que je voulais et surtout de m‘avoir

fait rabâcher le charabia de mes cours de chimie orga, n‘est-ce pas maman ?

Pour terminer, je remercie tous ceux que j‘ai involontairement oubliés…

5

TABLES DES MATIERES

Liste des abréviations ______________________________________________ 9

Liste des tableaux ________________________________________________ 11

Liste des figures __________________________________________________ 12

Introduction ______________________________________________________ 15

Chapitre 1 : synthèse bibliographique ________________________________ 19

I. La contamination organique : comportement et devenir dans l‘environnement___________ 21

II. La matière organique _______________________________________________________ 25

III. Les interactions matière organique - contaminants organiques ______________________ 28

IV. Contexte et problématique de ces travaux de thèse _______________________________ 30

IV.1. Choix des composés et contexte de l‘étude _________________________________ 30

IV.1.1. Les HAP dans l‘environnement aquatique ______________________________ 30

IV.1.1.1. Sources, distribution et devenir des HAP _____________________________ 30

IV.1.1.1.1. Propriétés physico-chimiques des HAP __________________________ 30

IV.1.1.1.2. Source des HAP et distribution dans l‘environnement aquatique _______ 31

IV.1.1.1.3. Dégradation des HAP dans l‘environnement aquatique ______________ 32

IV.1.1.1.4. Toxicité des HAP ____________________________________________ 32

IV.1.1.2. Interactions des HAP avec la matière organique _______________________ 33

IV.1.1.2.1. Effet de la composition de la MOD sur les interactions avec les HAP ___ 33

IV.1.1.2.2. Effet de la structure de la MOD sur les interactions avec les HAP ______ 34

IV.1.1.2.3. Effet des propriétés des contaminants organiques __________________ 35

IV.1.1.2.4. Effet des facteurs environnementaux ____________________________ 36

IV.1.1.2.4.1. Effet du pH _____________________________________________ 36

IV.1.1.2.4.2. Effet de la force ionique ___________________________________ 38

IV.1.1.2.4.3. Effet de la concentration en COD ___________________________ 38

IV.1.1.2.4.4. Effet de la température ___________________________________ 39

IV.1.1.2.4.5. Effet de la luminosité _____________________________________ 39

IV.1.1.2.5. Nature des interactions HAP-MOD ______________________________ 39

IV.1.1.2.6. Linéarité des interactions HAP-MOD ____________________________ 40

IV.1.1.2.7. Cinétique des interactions HAP-MOD ____________________________ 41

IV.1.2. Les substances pharmaceutiques ____________________________________ 42

IV.2. Techniques analytiques disponibles _______________________________________ 45

IV.3. Objectifs de l‘étude ____________________________________________________ 47

6

Chapitre 2 : matériels et méthodes ___________________________________ 49

I. Techniques de dosage des contaminants organiques dans l‘eau _____________________ 51

I.1. Techniques usuelles d‘extraction__________________________________________ 51

I.1.1. L‘extraction liquide-liquide (LLE) ________________________________________ 51

I.1.2. L‘extraction sur phase solide (SPE) _____________________________________ 52

I.1.3. La micro-extraction sur phase solide (SPME) ______________________________ 52

I.1.3.1. Analyse des contaminants organiques _______________________________ 53

I.1.3.1.1. Principe et fonctionnement _____________________________________ 53

I.1.3.1.2. Choix de la fibre ______________________________________________ 54

I.1.3.1.3. Nature du revêtement _________________________________________ 55

I.1.3.1.4. Dosage par SPME ____________________________________________ 57

I.1.3.2. Étude des interactions avec la MOD ________________________________ 57

I.2. Méthodes d‘analyses chromatographiques __________________________________ 58

I.2.1. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS)

__________________________________________________________________ 58

I.2.2. Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) 61

I.2.3. Quantification par chromatographie couplée à la spectrométrie de masse _______ 62

II. Techniques de caractérisation et de fractionnement de la MOD ______________________ 62

II.1. L‘absorption UV-visible _________________________________________________ 63

II.1.1. Principe de l‘absorption UV-visible ____________________________________ 63

II.1.2. Présentation du spectrophotomètre ___________________________________ 64

II.2. La spectrofluorimétrie __________________________________________________ 65

II.2.1. Présentation du spectrofluorimètre ____________________________________ 65

II.2.2. Caractérisation de la MOD __________________________________________ 66

II.2.3. Étude des interactions avec les contaminants ___________________________ 68

II.3. Mesure du COD _______________________________________________________ 72

II.4. La dialyse ____________________________________________________________ 73

II.4.1. Principe de la dialyse ______________________________________________ 73

II.4.2. Matériel utilisé ____________________________________________________ 74

III. Calculs des coefficients de distribution eau-MOD (KDOC) ____________________________ 76

III.1. Par SPME ___________________________________________________________ 76

III.2. Par extinction de fluorescence ____________________________________________ 78

IV. Les échantillons de matière organique dissoute (MOD) ____________________________ 80

IV.1. L‘acide humique Aldrich _________________________________________________ 80

IV.2. Les MOD naturelles ____________________________________________________ 81

IV.3. La MOD issue de culture algale___________________________________________ 84

V. Plans d‘expériences ________________________________________________________ 85

7

Chapitre 3 : articles _______________________________________________ 91

Publication n°1 ________________________________________________________________ 95

Publication n°2 _______________________________________________________________ 109

Publication n°3 _______________________________________________________________ 141

Publication n°4 _______________________________________________________________ 167

Publication n°5 _______________________________________________________________ 191

Publication n°6 _______________________________________________________________ 211

Chapitre 4 : synthèse des résultats _________________________________ 237

I. Développement de la SPME-GC-MS et MS/MS pour l‘analyse des HAP (publications n°1 et 2)

_______________________________________________________________________ 239

I.1. Développement de la SPME ____________________________________________ 239

I.2. Développement de la GC ______________________________________________ 240

I.3. Développement de la MS et MS/MS ______________________________________ 240

I.4. Quantification par SPME-GC-MS et MS/MS ________________________________ 241

I.5. Comparaison SPME/LLE/SPE ___________________________________________ 243

I.6. Application de la SPME-GC-MS et MS/MS à des échantillons environnementaux __ 244

I.7. Développement de la SPME-GC-MS pour l‘étude des interactions HAP-MOD _____ 245

II. Étude des interactions HAP – acide humique Aldrich (publication n°3) ________________ 248

II.1. Interactions HAP – acide humique Aldrich étudiées par SPME-GC-MS ___________ 248

II.2. Interactions HAP – acide humique Aldrich étudiées par extinction de fluorescence _ 250

II.3. Effet de la température sur les interactions _________________________________ 251

II.4. Interactions HAP – acide humique Aldrich étudiées par dialyse _________________ 252

III. Effets des paramètres environnementaux sur les interactions HAP – MOD (publication n°4) _

_______________________________________________________________________ 252

III.1. Effet de la nature de la MOD sur les interactions HAP-MOD ___________________ 253

III.2. Effet de la salinité sur les interactions HAP-MOD ____________________________ 255

III.3. Effet de la concentration en HAP sur les interactions HAP-MOD ________________ 255

III.4. Effet du pH et de la concentration en COD sur les interactions HAP-MOD ________ 256

III.5. Effet du pH et de la concentration en COD sur les propriétés optiques de la MOD __ 256

III.5.1. Acide humique Aldrich ____________________________________________ 256

III.5.2. MOD d‘origine algale ______________________________________________ 257

III.5.3. MOD d‘eau de rivière _____________________________________________ 258

IV. Étude des interactions HAP – MOD dans le milieu naturel (publication n°5)____________ 258

IV.1. Développement des extractions d‘eaux interstitielles _________________________ 258

IV.2. Dosage des HAP dans les eaux interstitielles du Bassin d‘Arcachon _____________ 261

IV.3. Caractérisation de la MOD des eaux interstitielles du Bassin d‘Arcachon _________ 261

8

IV.4. Étude des interactions HAP-MOD dans les eaux interstitielles du Bassin d‘Arcachon 262

V. Étude des interactions substances pharmaceutiques – MOD (publication n°6) _________ 264

V.1. Caractérisation des échantillons de MOD __________________________________ 265

V.2. Développement de la SPME-GC-MS _____________________________________ 265

V.3. Étude des interactions benzodiazépines-MOD ______________________________ 267

V.3.1. Par SPME-GC-MS _______________________________________________ 267

V.3.2. Par extinction de fluorescence ______________________________________ 268

Conclusion et perspectives ________________________________________ 279

Bibliographie ____________________________________________________ 285

Annexes techniques ______________________________________________ 299

9

LISTE DES ABREVIATIONS

H : variation d‘enthalpie

2D : deux dimensions

3D : tridimensionnel

Abs270 : absorbance spécifique à 270 nm

Ace : acénaphtène

Acy : acénaphtylène

An : anthracène

BaA : benzo[a]anthracène

BaP : benzo[a]pyrène

BbF : benzo[b]fluoranthène

BCF : bioconcentration factor

BeP : benzo[e]pyrène

BIX : biological index

BkF : benzo[k]fluoranthène

BNT : benzo[b]naphto[1,2-d]thiophène

BP : benzo[ghi]pérylène

Chrys : chrysène

COD : carbone organique dissous

D : debye

Da : dalton

DahA : dibenzo[ah]anthracène

DBT : dibenzothiophène

DVB : divinylbenzène

EEM : excitation-emission matrix

ESI : electrospray ionization

Flu : fluorène

Fluo : fluoranthène

FT-ICR-MS : fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry

GC : gas chromatography

HAP : hydrocarbures aromatiques polycycliques

HIX : humification index

HPLC : high performance liquid chromatography

Ifremer : Institut français de recherche pour l'exploitation de la mer

IHSS : international humic substances society

IP : indéno[1,2,3-cd]pyrène

IS : internal standard

IUPAC : international union of pure and applied chemistry

KD : coefficient de partage phase solide – phase liquide

http://www.iupac.org/dhtml_home.html

10

KDOC : coefficient de distribution eau – carbone organique dissous

KOC : coefficient de distribution eau – carbone organique

KOW : coefficient de partage octanol – eau

LC : liquid chromatography

LLE : extraction liquide - liquide

LOD : limit of detection

m/z : rapport masse sur charge

MOD : matière organique dissoute

MRM : multiple reaction monitoring

MS : mass Spectrometry

MS/MS : spectrométrie de masse en tandem

N : naphtalène

NPOC : non purgeable organic carbon

PA : polyacrylate

PCB : polychlorobiphényles

PDMS : polydiméthylsiloxane

PEG : polyéthylène glycol

Per : pérylène

Phe : phénanthrène

POCIS : polar organic chemical integrative sampler

ppb : partie par billion

PPSP : produits pharmaceutiques et de soins personnels

ppt : partie par trillion

PTFE : polytétrafluoroéthylène

Pyr : pyrène

REACH : enregistrement, évaluation et autorisation des substances chimiques

SIM : selected ion monitoring

SIR : selected ion recording

SPE : solid phase extraction

SPM : suspended particulate matter

SPMD : semi-permeable membrane device

SPME : solid phase microextraction

SUVA : specific UV absorption

uma : unité de masse atomique

US-EPA : United States – Environmental protection agency

UV : ultraviolet

11

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Liste non exhaustive des grandes classes de contaminants organiques et leurs propriétés

physico-chimiques. _______________________________________________________________ 23

Tableau 2. Principales constantes d‘équilibres permettant de définir le comportement d‘un composé.

_______________________________________________________________________________ 24

Tableau 3. Paramètres physico-chimiques de quatre HAP. ________________________________ 31

Tableau 4. Propriétés physico-chimiques du diazépam et de la carbamazépine. _______________ 45

Tableau 5. Fluorophores majeurs de l‘eau de mer. ______________________________________ 67

Tableau 6. Composition élémentaire de l‘acide humique commercial. ________________________ 80

Tableau 7. Paramètres physico-chimiques des eaux naturelles concentrées. __________________ 82

Tableau 8. Caractéristiques des micro-algues Isochrysis galbana. __________________________ 85

Tableau 9. Matrice des essais du plan factoriel complet 24. ________________________________ 87

Tableau 10. Matrice des essais du plan factoriel complet 24, seules les interactions d‘ordre 2 sont

représentées. ____________________________________________________________________ 88

Tableau 11. Matrice des essais d‘un plan fractionnaire 24-1

. ________________________________ 89

Tableau 12. Valeurs des indices et des rapports calculés par spectroscopies pour les échantillons

correspondant aux points centraux des plans d‘expériences. _____________________________ 254

Tableau 13. Effet des paramètres environnementaux sur les interactions HAP-MOD et sur les

propriétés optiques de la MOD. _____________________________________________________ 255

Tableau 14. Indices d‘absorption UV-visible et de fluorescence des différents types de MOD. ____ 265

Tableau 15. Extinctions de fluorescence et valeurs de KDOC obtenues pour les différents médicaments

en présence des différents types de MOD. ____________________________________________ 269

12

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Présence de la matière organique et interactions entre les différents compartiments au sein

du milieu aquatique. ______________________________________________________________ 24

Figure 2. Schéma du cycle de la MO et des transferts de carbone. __________________________ 26

Figure 3. Composition moyenne de la MOD aquatique issue d‘eaux douces. __________________ 27

Figure 4. Structures des HAP. _______________________________________________________ 31

Figure 5. Schéma des structures possibles de la MOD dues aux variations de pH. _____________ 37

Figure 6. Schéma de principe de la SPME couplée à la GC-MS. ____________________________ 54

Figure 7. Schéma de l‘extraction par des phases absorbantes vs adsorbantes. ________________ 55

Figure 8. Exemples de revêtements commerciaux. ______________________________________ 55

Figure 9. Schéma des équilibres entre contaminants libres et associés à la MOD a) non modifiés par

la SPME, b) modifiés par une extraction excessive des contaminants libres par la fibre. _________ 58

Figure 10. Différents modes d‘un triple quadripôle. ______________________________________ 60

Figure 11. Transitions électroniques entre orbitales moléculaires. ___________________________ 63

Figure 12. Diagramme de Perrin-Jablonski. ____________________________________________ 65

Figure 13. Exemples de spectres 3D de MOD obtenus par spectrofluorimétrie. ________________ 67

Figure 14. Schéma du trajet optique dans la cuve dans le spectrofluorimètre. _________________ 72

Figure 15. Procédé de séparation des HAP libres des HAP associés à la MOD par dialyse. ______ 73

Figure 16. Dispositifs expérimentaux de dialyse possibles pour l‘étude des interactions contaminants-

MOD. __________________________________________________________________________ 74

Figure 17. Photo du dispositif de dialyse. ______________________________________________ 75

Figure 18. Suivi du nettoyage des sacs à dialyse par spectrofluorimétrie. _____________________ 75

Figure 19. Spectres de fluorescence du dialysat et du rétentat pour un témoin (eau ultrapure à

l‘intérieur et à l‘extérieur du sac à dialyse) après 48h d‘immersion, excitation = 277 nm. ___________ 76

Figure 20. Carte des prélèvements de l‘eau douce et de l‘eau marine ________________________ 81

Figure 21. Fractions d‘ultrafiltration des échantillons concentrés de La Réole et de Toulon. _______ 82

Figure 22. Carte des prélèvements du Bassin d‘Arcachon. ________________________________ 83

Figure 23. Carte des prélèvements dans les ports d‘Arcachon et de La Teste. _________________ 84

Figure 24. Chromatogramme des HAP séparés et analysés par GC-MS. ____________________ 240

Figure 25. Quantification d‘une eau ultrapure supplémentée en HAP par SPME-GC-MS sur deux

systèmes différents. ______________________________________________________________ 242

Figure 26. Limites de détection par SPME-GC-MS et SPME-GC-MS/MS. ___________________ 243

Figure 27. Comparaison des techniques d‘extraction SPME, LLE et SPE. ___________________ 244

Figure 28. Variabilité de la SPME-GC-MS et contribution de chaque élément. ________________ 246

Figure 29. Comparaison des aires obtenues par SPME-GC-MS avec et sans MOD pour le naphtalène

d8, après normalisation par la concentration en naphtalène d8. ___________________________ 246

Figure 30. Comparaison de la quantification par SPME-GC-MS par les différents étalonnages. __ 248

Figure 31. Représentation de Stern-Volmer des interactions HAP - acide humique Aldrich. ______ 249

Figure 32. Isothermes d‘association des HAP avec la MOD dans 2 mélanges de 19 HAP. ______ 249

13

Figure 33. Suivi de la cinétique des interactions par extinction de fluorescence. _______________ 250

Figure 34. Effet de la température d‘extraction sur les KDOC mesurés par SPME-GC-MS. _______ 251

Figure 35. Spectres de fluorescence des 4 bandes α‘, γ, β et α des 3 MOD étudiées par la méthode

des plans d‘expériences. __________________________________________________________ 253

Figure 36. Valeurs moyennes des log KDOC pour les échantillons correspondant aux points centraux (n

= 5) des plans d‘expériences pour les 3 types de MOD. _________________________________ 254

Figure 37. Comparaison des aires des HAP avec et sans étape de centrifugation pour des tubes à

centrifuger en polypropylène. ______________________________________________________ 259

Figure 38. Rendements en HAP après l‘étape de centrifugation. ___________________________ 260

Figure 39. Concentrations en HAP quantifiées lors de l‘extraction d‘eau ultrapure selon le protocole

d‘extraction des eaux interstitielles. __________________________________________________ 260

Figure 40. Corrélation entre les log KDOC et les log KOW des HAP présents dans les eaux interstitielles

du Bassin d‘Arcachon ____________________________________________________________ 262

Figure 41. Corrélations entre les KDOC et le HIX, le pourcentage d‘aromaticité, le rapport ‘/[COD] et le

rapport / dans les eaux interstitielles du Bassin d‘Arcachon. ____________________________ 263

Figure 42. Extinction de fluorescence de la MOD par les HAP pour les échantillons du port d‘Arcachon

et de l‘île aux oiseaux. ____________________________________________________________ 264

Figure 43. Spectres d‘extinction de fluorescence des HAP par la MOD pour l‘échantillon de l‘île aux

oiseaux. _______________________________________________________________________ 264

Figure 44. Rendements de quantification des benzodiazépines par SPME-GC-MS d‘un pseudo-

inconnu à 2 µg.L-1

par différents étalonnages (fibre Carbowax-DVB 65 µm, n = 3). ___________ 267

Figure 45. Spectres de fluorescence des blancs a) carbamazépine et b) diazépam pour des

concentrations de 200 µg.L-1

. ______________________________________________________ 268

Figure 46. Spectres de fluorescence a) théorique eau marine + carbamazépine, b) expérimental eau

marine + carbamazépine, c) théorique eau marine + diazépam, d) expérimental eau marine +

diazépam. _____________________________________________________________________ 270

Figure 47. Spectres de fluorescence a) théorique eau interstitielle + carbamazépine, b) expérimental

eau interstitielle + carbamazépine, c) théorique eau interstitielle + diazépam, d) expérimental eau

interstitielle + diazépam. __________________________________________________________ 271

Figure 48. Spectres de fluorescence a) théorique acide humique Aldrich + carbamazépine, b)

expérimental acide humique Aldrich + carbamazépine, c) théorique acide humique Aldrich +

diazépam, d) expérimental acide humique Aldrich + diazépam. ____________________________ 272

Figure 49. Évolution de l‘intensité de fluorescence des eaux de mer et interstitielle en fonction de la

concentration en médicaments pour les bandes α (en haut), α‘ (au milieu) et γ (en bas). ________ 274

Figure 50. Évolution de l‘intensité de fluorescence de l‘acide humique Aldrich en fonction de la

concentration en médicaments pour les bandes α (en haut) et α‘ (en bas). ___________________ 276

15

Introduction

Introduction

17

Depuis quelques années, des suivis environnementaux se sont avérés nécessaires afin de

progresser dans la compréhension des origines et des conséquences de la présence des polluants

chimiques dans l‘environnement. La préoccupation actuelle est due au fait que de plus en plus de

molécules sont synthétisées à des fins industrielles, agricoles, domestiques ou thérapeutiques et que

l‘on ignore pour beaucoup d‘entre elles les effets à moyen et long termes sur la flore et la faune.

Certes, la règlementation REACH (enRegistrement, Évaluation et Autorisation des substances

CHimiques) est une avancée dans ce domaine puisqu‘elle a notamment comme but le recensement et

le contrôle des substances extrêmement préoccupantes (cancérigènes, mutagènes, toxiques pour la

reproduction, persistantes et accumulables dans les tissus biologiques, perturbateurs endocriniens)

(http://www.developpement-durable.gouv.fr/IMG/pdf/DP_Reach_cle55acde.pdf). Cependant cette

règlementation ne concerne qu‘environ 30 000 substances utilisées, importées ou synthétisées par

des industriels à hauteur d‘au moins une tonne par an (face aux 100 000 substances mises sur le

marché avant 1981 et actuellement utilisées pour lesquelles pas ou peu d‘informations sont

disponibles) et beaucoup de molécules sont libérées involontairement dans l‘environnement par des

processus non contrôlés (combustion incomplète, sous-produits de réaction…).

Certains contaminants, comme les métaux lourds ou les polluants organiques, se retrouvent

alors à l‘état de traces dans tous les compartiments de l‘environnement, et notamment dans les

milieux aquatiques puisque mers et océans sont les réceptacles ultimes de ces composés. Ces

contaminants sont recherchés dans l‘environnement aquatique afin d‘établir un état des lieux dans le

but d‘atteindre un bon état des eaux en 2015, comme le prévoit la Directive Cadre sur l‘Eau de 2000

(http://europa.eu/legislation_summaries/agriculture/environment/l28002b_fr.htm). Celle-ci définit une

liste de substances prioritaires qui constituent un risque important pour le milieu aquatique et instaure

des mesures de contrôle et des normes de qualité. Les États membres sont ainsi tenus d‘analyser ces

substances chimiques dans leurs eaux de surface, souterraines et côtières.

Les contaminants organiques sont d‘autant plus difficiles à analyser qu‘ils sont nombreux

(plusieurs centaines), avec des propriétés chimiques très variées. De plus, ils sont présents sous

forme de mélanges au sein de matrices souvent très complexes. La teneur de ces composés dans les

différents environnements aquatiques a donné lieu à de nombreuses publications, mais la mesure

d'une concentration en contaminants dans un environnement donné peut s'avérée insuffisante pour

prédire l'impact sur les organismes. En effet, un contaminant pourra être plus ou moins disponible

pour les organismes en fonction de sa spéciation, c‘est-à-dire la ou les formes physico-chimiques

dans lesquelles il se trouve (Suffet et al. 1994). Plusieurs paramètres peuvent conditionner la

spéciation des contaminants organiques, la quantité de particules dans l‘eau par exemple ou la

présence de matière organique. Cette dernière peut influencer le comportement et le devenir des

contaminants (Chiou et al. 1986, Haitzer et al. 1998, Khetan et Collins 2007). Il est donc essentiel de

s‘intéresser à la matière organique et aux interactions qu‘elle peut avoir avec les contaminants afin de

mieux comprendre leur comportement dans l‘environnement aquatique. A l'heure actuelle, peu

d'études ont été réalisées sur les interactions entre la matière organique des eaux de surface et les

http://www.developpement-durable.gouv.fr/IMG/pdf/DP_Reach_cle55acde.pdf

http://europa.eu/legislation_summaries/agriculture/environment/l28002b_fr.htm

Introduction

18

contaminants organiques. Ceci est dû d'une part à la difficulté d'extraction de cette matière organique

des eaux en raison de sa faible concentration et donc à sa caractérisation rendue de ce fait

compliquée. D'autre part, la nature organique des deux partis (contaminants et matière organique)

rend difficile l‘étude de leurs interactions puisque l‘étude de l‘un peut être « gênée » par l‘autre et les

équilibres modifiés.

Ces travaux de thèse avaient donc pour but de développer des outils analytiques permettant

une étude fiable des interactions entre la matière organique et les contaminants organiques et

d‘essayer de comprendre les phénomènes mis en jeu dans ces interactions.

Le premier chapitre synthétise l'état des connaissances actuelles concernant la matière

organique, les contaminants organiques, les interactions entre les deux, ainsi que les différentes

techniques permettant leur étude. Le deuxième chapitre (matériels et méthodes) présente les outils

analytiques et les méthodes de calculs nécessaires à cette étude, ainsi que des informations sur les

matières organiques utilisées. Les résultats obtenus sont présentés dans un troisième chapitre sous la

forme d‘articles. Les deux premières publications reprennent les principaux développements de la

Micro-Extraction sur Phase Solide (SPME) appliquée au dosage des Hydrocarbures Aromatiques

Polycycliques (HAP) dans les eaux, ainsi qu‘une comparaison avec les techniques les plus

couramment utilisées. Les publications suivantes sont plus spécifiques aux interactions des

contaminants organiques avec la matière organique. La troisième publication présente les

développements de trois techniques analytiques développées pour l‘étude des interactions entre les

HAP et l‘acide humique Aldrich ainsi que la comparaison des résultats obtenus et les implications

analytiques et environnementales des interactions. La quatrième publication est l‘application de plans

d‘expériences à l‘identification des facteurs environnementaux intervenant dans les interactions entre

les HAP et la matière organique. La cinquième publication est l‘application environnementale pour

l‘étude des interactions des HAP dans un milieu aquatique naturel, le Bassin d‘Arcachon. Enfin, la

sixième publication s‘intéresse aux interactions de la matière organique avec des substances

pharmaceutiques. Pour finir, une synthèse des résultats est faite dans le quatrième chapitre avant la

conclusion et les perspectives.

19

Chapitre 1 : synthèse bibliographique


21

I. La contamination organique : comportement et devenir dans l’environnement

Les composés organiques dans l‘environnement sont issus de nombreuses sources :

industrielles, agricoles, domestiques et naturelles, qui peuvent être directes ou indirectes, ponctuelles

ou diffuses. Il existe des centaines de milliers de contaminants organiques et leur présence dans

l‘environnement est initialement conditionnée par leur origine. En effet, les bassins versants agricoles

sont généralement plus contaminés en pesticides et en substances issues des épandages de boues

(produits pharmaceutiques et de soins personnels (PPSP), phtalates et parfois polychlorobiphényles

(PCB) ou hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)) (Dichtl et al. 2007). Les régions fortement

urbanisées montrent en plus des contaminations reliées à des phénomènes de combustion de façon

générale (trafic routier, chauffage, incinérateurs…) et les zones industrialisées peuvent être

fréquemment contaminées en produits et sous-produits de synthèse (solvants, détergents…)

(http://rsde.ineris.fr/). Les concentrations d‘un milieu dépendent donc fortement des habitudes

agricoles, urbaines et industrielles de la région. Il existe également des sources de « pollution »

d‘origine naturelle comme les volcans ou les incendies. Les mers et les océans sont le réceptacle final

des contaminations organiques terrestres et peuvent également être le réceptacle initial

d‘hydrocarbures (naufrages de pétroliers, transport maritime et navigation de plaisance), de pesticides

(peintures anti-salissures des bateaux) (Voulvoulis 2006) ou encore de déchets directement rejetés

(eaux usées de bateaux par exemple). Le compartiment atmosphérique est quant à lui le vecteur de

bon nombre de ces composés et participe également à leur dissémination sur toute la surface de la

planète, même aux endroits les plus éloignés des sources.

Tous les compartiments environnementaux (air, eau et sols) peuvent donc être plus ou moins

contaminés. Pour relativiser néanmoins, il est nécessaire de savoir que ces contaminants sont

généralement présents à l‘état de traces, sauf en cas de pollution ponctuelle accidentelle, à des

concentrations inférieures au ppt (partie par trillion, soit ng.L-1

en solution aqueuse) jusqu‘à la dizaine

ou centaine de ppb (partie par billion, soit µg.L-1

en solution aqueuse). Cependant, même à de très

faibles concentrations, certains de ces composés peuvent avoir des effets toxiques à court ou moyen

terme sur les organismes aquatiques ou plus généralement sur tous les êtres vivants. Certains HAP,

par exemple, peuvent s‘avérer cancérigènes, d‘autres contaminants, comme les alkylphénols ou les

hormones de synthèse ont des effets sur le système endocrinien et peuvent perturber la reproduction

à des concentrations inférieures au ng.L-1

(Carlsson et al. 2006). De plus, les contaminants

organiques ont la faculté de pouvoir être dégradés par des phénomènes physiques, chimiques et/ou

biologiques. Ainsi la photodégradation, la biodégradation ou encore l‘hydrolyse sont les principaux

processus de dégradation permettant l‘élimination des contaminants organiques dans

l‘environnement. Ces mécanismes mènent rarement à une dégradation totale (transformation en CO2,

H2O et minéraux uniquement) mais le plus souvent à des produits de dégradation qui peuvent être

plus toxiques ou plus persistants que la molécule initiale. Pour les contaminants qui se dégradent peu,

une préoccupation supplémentaire est due à leur persistance puisqu‘ils peuvent être transportés sur

de longues distances et ne sont pas dégradés lors de leur ingestion par les organismes vivants et

peuvent s‘accumuler tout au long de la chaîne alimentaire (bioaccumulation et bioamplification).

http://rsde.ineris.fr/


22

Une fois émis dans l‘environnement, les contaminants ont des comportements différents selon

leurs caractéristiques physico-chimiques, qui sont très variables selon la classe de composés mais

aussi au sein d‘une même classe (Tableau 1). De plus, leurs produits de dégradation (métabolites) ont

également des comportements différents des molécules parentes. De par cette grande variabilité de

composés et de comportements, le devenir des contaminants dans l‘environnement est très difficile à

appréhender. Cependant, la connaissance de certaines propriétés physico-chimiques importantes

mises en relation avec le comportement des composés permet de comprendre les phénomènes qui

contrôlent leur devenir et de les catégoriser.

La solubilité aqueuse d‘un composé, par exemple, permet de déterminer son affinité avec les

eaux naturelles alors que la pression de vapeur saturante permet de connaître sa volatilité à l‘équilibre

entre la phase gazeuse et la phase dissoute. Ces données permettent donc de prévoir la répartition

des contaminants entre la phase aqueuse et la phase gazeuse. L‘affinité d‘un composé pour la phase

organique, mesurée généralement grâce au coefficient de partage octanol-eau (KOW) (Tableau 2),

permet d‘appréhender la capacité de ce composé à se concentrer (bioconcentration) et à s‘accumuler

(bioaccumulation) dans les organismes. Cette capacité à pénétrer dans les êtres vivants est régie par

de nombreux autres facteurs tels que la taille et la configuration spatiale des contaminants, les

propriétés physico-chimiques du milieu, le fonctionnement biologique des organismes…

L‘accumulation d‘un composé dans un organisme ne peut donc pas être simplement décrite par ses

propriétés hydrophobes. Parallèlement, le caractère hydrophobe des contaminants implique

également une répulsion vis-à-vis de l‘eau et un fort KOW implique généralement une préférence pour

la phase solide par rapport à la phase liquide. La phase solide dans l‘environnement est représentée

par les sols, les sédiments mais aussi les particules dans la colonne d‘eau ou dans l‘air. Il existe

également une constante, le KD, qui permet de décrire l‘équilibre entre la phase liquide et la phase

solide (Tableau 2). Mais là encore, les phénomènes sont plus complexes qu‘une simple relation

linéaire entre le KOW et le KD. En effet, il a été montré que cet équilibre est fortement dépendant de la

concentration en matière organique contenue dans la phase solide (Schwarzenbach et al. 1993). Ce

paramètre est d‘ailleurs tellement important que Mader et al. (1997) ont montré que dès lors qu‘une

surface minérale contient une très faible proportion de carbone organique (< 1 %), les interactions des

contaminants hydrophobes avec la phase solide sont entièrement dépendantes des propriétés de la

matière organique. Pour refléter ce phénomène, le KD peut être corrigé de la fraction organique

contenue dans la phase solide étudiée, c‘est le coefficient de partition eau – carbone organique (KOC).

De la même façon, le KDOC est le coefficient de partition eau – carbone organique dissous, donc dans

la phase aqueuse.

Log Kow

Solubilité dans l‘eau (mg.L

-1)

Constante de Henry à 20 °C (Pa.m

3.mol

-1)

BCF (L.kg

-1)

Temps ½ vie (jours) dans

l‘eau

Concentrations déjà mesurées

dans l‘eau

Toxicité de certains composés

HAP (de Maagd et al. 1998,

Abrajano et al. 2003) 3-6,7 3.10

-4 -30 0,001-45 27-98000 0,5h-stable 0,01-100 ng.L

-1

Écotoxicité, Cancérogénèse

polychlorodibenzodioxines (Schäfer et al. 2002, Liu et al.

2008)

5,4-13,4

7,4.10-8

à 5,5.10-4

0,1-10 700-

26000 0,8-1,5 an 0,001-0,5 µg.L

-1

Écotoxicité, perturbation

endocrinienne, cancérogénèse

PCB (Schäfer et al. 2002,

Sinkkonen et Paasivirta 2000) 4,1-6,8 0,01-0,2 19-202 4,4-6,2

60 jours-30 ans

0,1-50 ng.L-1


endocrinienne

polybromodiphényléthers (de

Wit 2002, Rahman et al. 2001, Watanabe et Sakai 2003, Costa et al. 2008, Kuramochi et al. 2007,

Kuivikko et al. 2007)

5,9-10 10-6

-0,4 0,8-6,8 18000-108 0,5-900 h < 0,1 µg.L

-1


endocrinienne, neurotoxicité

alkylphénols, sulfonates alkylés linéaires (David et al.

2009, Ying 2006, Yamamoto et al. 2003, Zhang et al. 2009)

1,6-4,5 5-12 3-4 20-1300 1-60 2-40.106

pg.L-1


endocrinienne

PPSP, hormones synthétiques (Comerton et al.

2007, Yamamoto et al. 2003, Schwaiger et al. 2004, Lin et al.

2006, Jürgens et al. 2002 )

(-1,4)-5,1

0,02-105 2.10

-6-0,02 0,3-2732 1h-9 jours 200 ng.L

-1


endocrinienne

pesticides (Comerton et al.

2007, Boti et al. 2007) 0,07-7,4

2.10-6

-13000 6.10-9

- 30 1-5900 0,4-stable 1-6000 ng.L

-1


endocrinienne

phtalates (Schwarzenbach et al.

1993, Yamamoto et al. 2003, Schäfer et al. 2002, Carr et al.

1997, Lertsirisopon 2009, Chen et al. 2007)

1,5-4,6 0,2.10-3

-10 0,1-0,2 à 25°C 1-387 1,5-1600 40 µg.L-1


endocrinienne

alcanes chlorés 1,5-2,5 2900-8500 40-98 4,5-2 1 h-5 jours < 200 pg.L-1

Cancérogénèse

possible

Tableau 1. Liste non exhaustive des grandes classes de contaminants organiques et leurs propriétés physico-chimiques (bases de données INERIS, INRS).


24

Tableau 2. Principales constantes d’équilibres permettant de définir le comportement d’un composé.

Tous les compartiments environnementaux sont donc en interaction les uns avec les autres et

sujets à des phénomènes complexes régis par des équilibres à différents niveaux. D‘autre part, la

présence des macromolécules formant la matière organique naturelle ou anthropique, influence, de la

même façon que pour les KD, tous les équilibres au sein de ces compartiments (Figure 1).

KOW Coefficient de partage

octanol - eau eaul' dans composé du ionConcentrat

octanoll' dans composé du ionConcentratKOW

KD

Coefficient de partage entre

phase solide et phase liquide

eaul' dans composé du ionConcentrat

solide phase la dans composé du ionConcentratKD

KOC

Coefficient de partition eau –

carbone organique dans les

sédiments

KOC = KD / fOC

où fOC est la fraction de carbone organique contenue dans la

phase solide.

KDOC

Coefficient de partition eau –

matière organique dissoute

dans l‘eau

[COD]C

CK

libre

MODDOC

avec CMOD, la concentration dans l‘eau des composés fixés

sur la MOD, Clibre la concentration dans l‘eau des composés

véritablement dissous (« libres ») et [COD] la concentration en

Carbone Organique Dissous (COD).

Figure 1. Présence de la matière organique et interactions entre les différents compartiments au sein du milieu

aquatique.

Colonne d’eau

Sols

Sédiments

Atmosphère

Mise en solutionVolatilisation

Adsorption et

désorption

Transformation

photochimique

Transformation

chimique

Transformation

biologique et

microbiologique

Bioaccumulation et

métabolisationPhase

dissoute

Phase

particulairecolloïdes

= matière organique

Colonne d’eau

Sols

Sédiments

Atmosphère

Mise en solutionVolatilisation

Adsorption et

désorption

Transformation

photochimique

Transformation

chimique

Transformation

biologique et

microbiologique

Bioaccumulation et

métabolisationPhase

dissoute

Phase


Phase

dissoute

Phase


= matière organique


25

Avant d‘essayer de comprendre pourquoi la matière organique est si importante pour le

devenir des contaminants, il est essentiel d‘essayer de comprendre ce qu‘est la matière organique.

II. La matière organique

La matière organique naturelle est un ensemble de macromolécules provenant de la

dégradation de débris animaux et végétaux ainsi que de la production primaire du phytoplancton dans

les eaux naturelles. On ne considère donc pas dans cette définition la matière organique vivante et les

composés fabriqués par l‘homme. Dans les océans, on estime à environ 89 % la part de matière

organique dissoute (MOD) en solution dans l‘eau, à 9 % celle de la matière organique particulaire

(matière organique associée aux particules et détritus), à 2 % celle du phytoplancton et à moins d‘1 %

celle du zooplancton et des bactéries, en masse de carbone organique (Duursma et Dawson 1981).

La matière organique « non vivante » représente donc près de 98 % du carbone organique total dans

des environnements tels que les océans.

Dans tous les compartiments environnementaux, l‘état dynamique de la matière organique

rend son étude difficile du fait qu‘elle subit sans cesse des cycles de synthèse biologique,

métabolisation et décomposition. Dans l‘environnement aquatique, la matière organique est

majoritairement synthétisée par le phytoplancton puis utilisée comme nutriments par d‘autres espèces

qui peuvent la métaboliser puis l‘excréter sous une autre forme (Figure 2). Dans les eaux profondes

ou plus généralement dans les zones aphotiques, la production par les bactéries devient majoritaire

(Duursma et Dawson 1981). Une troisième zone de production de la matière organique dans les eaux

naturelles est l‘interface eau-sédiment où elle subit des transformations biologiques ou chimiques

lentes (Duursma et Dawson 1981). La matière organique est également émise par dégradation des

organismes animaux ou végétaux, que ce soit dans les milieux aquatiques ou terrestres. La matière

organique fraîchement produite par la matière vivante (phytoplancton, bactéries, micro-organismes…)

est généralement appelée matière organique récente en opposition à la matière organique plus

humifiée (ancienne) issue de multiples étapes de dégradation de cette matière organique.


26

Comme chaque débris organique est constitué de nombreuses molécules organiques

(protéines, lipides, sucres) de composition et de concentration différentes et comme leur dégradation

dépend de nombreux facteurs physiques, chimiques et biologiques, un nombre infini de molécules

différentes constitue cette matière organique. De la même façon, la matière organique peut être

synthétisée par des espèces différentes et par de multiples voies ; elle est donc constituée de

mélanges différents selon son origine, sa localisation ou sa période d‘étude. Pour ces raisons, il est,

de nos jours, impossible de caractériser de façon exhaustive toutes les molécules qui composent la

matière organique. Généralement, celle-ci est caractérisée par des techniques d‘observation,

d‘extraction et/ou de caractérisation élémentaire. Les plus utilisées sont les techniques

spectroscopiques (UV-visible, infrarouge, résonance magnétique nucléaire, spectrofluorimétrie…), les

techniques de séparation par la taille (dialyse, ultrafiltration, nanofiltration…), les techniques de

séparation par affinité avec des résines (XAD 8, XAD 2…), les analyses élémentaires (carbone,

oxygène, azote…) et les techniques d‘identification moléculaire (spectrométrie de masse). Ces

techniques permettent d‘obtenir des informations sur certaines propriétés globales des échantillons de

matière organique (taux de carbone, d‘oxygène, caractère hydrophobe ou hydrophile, taille moyenne

des macromolécules…) mais ne permettent pas l‘identification de molécules autres que les molécules

les plus simples (sucres, lipides, protéines). D‘autre part, des techniques comme la résonance

magnétique nucléaire et l‘infrarouge qui permettent l‘accès aux informations structurales et

fonctionnelles de la MOD, sont difficilement applicables à l‘environnement aquatique et surtout marin

(à cause de la présence des sels) de par la faible quantité de matériel disponible. Récemment, une

Figure 2. Schéma du cycle de la matière organique et des transferts de carbone (d’après Harvey 2006).


27

technique a été développée, la spectrométrie de masse haute résolution à transformée de Fourier

(FT-ICR-MS), dans le but d‘obtenir les masses des macromolécules avec une grande précision et

ainsi d‘en déduire leur formule brute (Hertkorn et al. 2007). Même si cette technique marque un grand

pas dans la caractérisation de la matière organique, la complexité de cette dernière est telle qu‘il est

tout de même difficile de traiter les informations obtenues, c‘est-à-dire des milliers de masses

moléculaires brutes. Toutes ces techniques permettent par contre de déterminer certaines propriétés

de la matière organique telles que sa concentration, son origine (aquatique ou terrestre) ou son stade

de dégradation grâce à l‘étude de sa composition.

Concernant la composition moyenne de la MOD, il a été montré que les molécules simples

(acides aminés, sucres…) représentent environ seulement 20 % de la matière organique aquatique et

que les 80 % restants sont des macromolécules complexes difficilement analysables. La MOD

présente dans les eaux douces est constituée en moyenne de 80 % d‘acides hydrophobes ou

hydrophiles, le reste étant des molécules neutres ou basiques (Figure 3).

neutres

hydrophilesneutres

hydrophobes

bases

hydrophiles

bases

hydrophobes

acides

hydrophiles

acides

hydrophobes

Figure 3. Composition moyenne de la MOD aquatique issue d’eaux douces, d’après Perdue et Ritchie (2003).

La majeure partie des acides hydrophobes, en tout cas pour les eaux douces car les eaux

marines ont été beaucoup moins étudiées, est composée d‘acides humiques (insolubles à pH < 2,

minoritaires) et d‘acides fulviques (solubles à tous les pH, majoritaires), regroupés sous le terme de

substances humiques. Ces composés sont des macromolécules amphiphiles de poids moléculaire

supérieur à 500 Da (1 Dalton (Da) = 1 g.mol-1

) présents sous forme de mélange hétérogène. Les

substances humiques sont souvent considérées comme la portion de la MOD la plus influente sur le

transport et le comportement des polluants organiques et inorganiques (Pan et al. 2008). Cependant,

cette hypothèse tient du fait que pendant longtemps seules les substances humiques étaient étudiées

et non la MOD dans son ensemble. Or, des études ont montré que les substances humiques ne sont

pas les seules responsables des interactions avec certains contaminants (Akkanen et al. 2005a,

Kukkonen et al. 1990) même si elles sont souvent isolées et étudiées séparément du reste de la

MOD. Les substances humiques sont issues de multiples étapes de dégradation de la MOD fraîche et

sont caractéristiques de la MOD plus mature, dite humifiée (Duursma et Dawson 1981). Ces


28

substances sont également appelées matière organique réfractaire, en raison de leur faible (mais non

nulle) biodégradabilité et de leur faible réactivité chimique (Duursma et Dawson 1981). Le caractère

acide des substances humiques est dû à la présence de groupements carboxyliques et de

groupements acides hydrophiles (surtout les OH phénoliques) (Perdue et Ritchie 2003). Les acides

humiques et les acides fulviques présentent des propriétés différentes. Les acides humiques ont une

masse moléculaire plus grande, une aromaticité et un taux de carbone plus importants, un taux

d‘oxygène et une acidité plus faibles que les acides fulviques (Perdue et Ritchie 2003). De par la

nature et la composition de ces substances humiques, et plus généralement des macromolécules de

la MOD, il est possible de déterminer l‘origine et « l‘âge » de la MOD. En effet, la MOD a des

caractéristiques qui diffèrent selon la façon dont elle a été produite : dans des rivières, des lacs, des

océans ou dans des environnements terrestres et par des algues, des bactéries ou par décomposition

de détritus. On peut ainsi distinguer la MOD autochtone (fabriquée directement dans le milieu étudié)

de la MOD allochtone (fabriquée ailleurs puis transportée dans le milieu étudié) puisque,

généralement, moins la MOD est humifiée (dégradée), plus elle est récente et autochtone.

Les propriétés physiques et chimiques de la MOD sont donc très variables d'un site à l'autre et

dans le temps, notamment selon la saison. Par exemple, l'été est propice à une grande productivité

primaire dans les lacs et une part significative de la MOD est due aux exsudats et aux produits de

décomposition du phytoplancton (Thacker et al. 2005). Généralement, dans des milieux aquatiques

naturels, les teneurs en carbone organique dissous (COD) varient en moyenne de 0,3 à 2 mg.L-1

dans

les eaux salées, sont d‘environ 10 mg.L-1

dans les rivières et les lacs, et peuvent aller jusqu‘à

15 mg.L1

dans des eaux souterraines (Akkanen 2002). Toutefois, les concentrations en COD sont

très variables et peuvent être largement supérieures (Akkanen 2002). Ces concentrations, même si

elles sont le plus souvent assez faibles, sont tout de même largement supérieures à celles des

contaminants et on peut donc aisément comprendre que ces macromolécules aient un rôle sur le

comportement des contaminants organiques dans les milieux aquatiques.

III. Les interactions matière organique - contaminants organiques

Les contaminants organiques dont les interactions avec la matière organique ont été les plus

étudiées sont les HAP, les PCB et quelques autres composés hydrophobes

(polybromodiphényléthers, polychlorodibenzodioxines, pesticides) mais les composés hydrophiles ont

fait l‘objet de très peu d‘études. La matière organique peut interagir avec les composés organiques

par différents types de liaison et d‘adsorption, comme les échanges d‘ions, les transferts de charges,

les liaisons hydrogène, les liaisons covalentes ou les interactions hydrophobes (forces de Van der

Waals) (Haitzer et al.1998). Le type d‘interaction dépend du type de contaminant et du type de MOD.

Par exemple, il pourrait se former des liaisons covalentes entre les amines aromatiques et les

quinones présentes dans la matière organique (Doll et al. 1999). Les interactions des contaminants

hydrophobes sont le plus souvent décrites comme des mécanismes d‘association non spécifiques

avec les structures hydrophobes de la matière organique (Doll et al. 1999). Elles peuvent également


29

être plus spécifiques et orientées (interactions - par exemple) et elles sont le plus souvent

réversibles (Wijnja et al. 2004, McCarthy et Jimenez 1985, Kopinke et al. 2000).

Ces interactions dépendent aussi des paramètres physico-chimiques de la solution comme le

pH ou la force ionique. Il apparaît que, généralement, pour les contaminants apolaires non ioniques,

leur association avec la matière organique augmente quand le pH diminue ou que la force ionique

augmente, contrairement aux composés polaires non ioniques pour lesquels l‘association diminue

pour ces paramètres (Lee et Farmer 1989). En effet, une augmentation du pH pourrait ioniser les

groupements acides des substances humiques et les rendre plus polaires, affaiblissant ainsi les

interactions hydrophobes avec les contaminants apolaires (Jota et Hassett 1991). Alors que pour les

composés polaires, l‘augmentation des interactions lorsque le pH augmente pourrait s ‗expliquer par

le fait que ces interactions ne seraient pas de nature hydrophobe mais plutôt de type liaisons

hydrogène ou mettant en jeu des processus donneur-accepteur d‘électrons (Lee et Farmer 1989).

D‘autre part, le pH, la force ionique, la concentration en ions métalliques et en MOD peuvent modifier

la conformation spatiale des macromolécules, formant ou supprimant ainsi des sites favorables à

l‘association avec les contaminants (Pan et al. 2008).

De plus, selon la composition de la matière organique, sa capacité à former des liaisons est

différente : par exemple, les acides hydrophobes ont plus d‘interactions avec les HAP que les autres

fractions de la MOD (Kukkonen et al. 1990). De plus, les acides fulviques contenant plus de

groupements fonctionnels oxygénés et moins de noyaux aromatiques, ont une nature plus polaire et

moins hydrophobe que les acides humiques. Les acides humiques auront donc tendance à former des

interactions plus fortes avec les contaminants organiques hydrophobes (Lee et Farmer 1989, Jota et

Hassett 1991, Chiou et al. 1986).

Cependant, la plupart des études sont souvent limitées aux substances humiques et la MOD

n‘est que rarement étudiée dans son ensemble ; il est donc difficile de faire l‘état de l‘art des

connaissances concernant les interactions entre les contaminants et la MOD dans son ensemble.

De nombreux facteurs peuvent donc contrôler l‘association des composés avec la matière

organique et ainsi jouer sur le comportement (transport, dégradation, toxicité…) des contaminants

dans l‘environnement. Il a été démontré que la MOD est un facteur important à considérer pour la

compréhension des processus qui contrôlent le transport, le comportement et l‘effet biologique des

contaminants hydrophobes dans les systèmes aquatiques (McCarthy et Jimenez 1985, Carter et

Suffet 1982, Landrum et al. 1984, Akkanen et al. 2005a, Simpson et al. 2004). En effet, la présence

de la matière organique pourrait augmenter la solubilité aqueuse (Chiou et al. 1986), réduire la

volatilisation (Yates et al. 1997), modifier les vitesses et les produits de dégradation (Chiron et al.

2006, Wang et al. 1995), altérer la bioconcentration et avoir un effet sur la toxicité des contaminants

organiques (Haitzer et al. 1998, Bejarano et al. 2005).


30

IV. Contexte et problématique de ces travaux de thèse

IV.1. Choix des composés et contexte de l’étude

Dans ces travaux, nous avons choisi de nous intéresser aux interactions entre les

contaminants organiques et la MOD. La MOD représente généralement les macromolécules de la

matière organique qui ne sont pas retenues par un filtre à 0,45 µm. Cette limite, même largement

utilisée, est totalement arbitraire (Duursma et Dawson 1981). Dans cette étude, nous avons choisi

comme limite 0,7 µm pour des raisons purement techniques, afin d‘utiliser des filtres en fibre de verre

qui limitent la contamination en carbone organique et la perte à la fois de MOD et de contaminants

lors de la filtration. La MOD est donc ici constituée de macromolécules dissoutes et de colloïdes,

définis par l‘Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée (IUPAC) comme les molécules et

particules de tailles comprises entre 1 nm et 1 µm (Filella 2009).

En ce qui concerne les contaminants organiques, les HAP ont été choisis pour l‘étude des

interactions avec les contaminants hydrophobes et ce pour plusieurs raisons. Tout d‘abord, ces

composés sont ubiquitaires et toxiques et donc d‘intérêt au niveau environnemental. De plus, cette

classe de contaminants regroupe de nombreuses molécules apolaires composées uniquement de

noyaux aromatiques mais ayant des caractères hydrophobes différents selon le nombre de cycles

aromatiques. Ces composés sont étudiés depuis de nombreuses années au laboratoire et leur

analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) est

donc connue et validée. D‘autre part, beaucoup de travaux ont été faits avec ces composés à travers

le monde et leurs interactions avec la MOD sont donc assez bien documentées, ce qui permet la

validation de nos outils avant d‘orienter nos travaux. Dans un second temps, des contaminants plus

polaires et également de fort intérêt environnemental ont été étudiés : les substances

pharmaceutiques. Ces contaminants sont présents dans de nombreux environnements aquatiques et

peuvent aussi s‘avérer toxiques. Bien que cette classe de composés regroupe de nombreuses

molécules (plusieurs milliers), leurs interactions avec la MOD n‘ont été que faiblement étudiées et

leurs comportements dans l‘environnement aquatique sont encore mal connus.

IV.1.1. Les HAP dans l’environnement aquatique

IV.1.1.1. Sources, distribution et devenir des HAP

IV.1.1.1.1. Propriétés physico-chimiques des HAP

Les HAP sont des composés plans à base de carbone et d'hydrogène qui comprennent

plusieurs noyaux benzéniques (Figure 4).


31

Naphtalène** Acénaphtylène Acénaphtène Fluorène

Phénanthrène

Anthracène ** Fluoranthène** Pyrène Chrysène

Benzo(a)anthracène Benzo(b)fluoranthène** Benzo(k)fluoranthène **

Benzo(a)pyrène** Dibenz(a,h)anthracène Benzo(g,h,i)pérylène**

Cancérigène*

Cancérigène*Cancérigène*

Indéno(1,2,3-cd)pyrène **

Benzo(e)pyrène

Dibenzothiophène

Pérylène

S

Cancérigène*

Cancérigène*

Cancérigène*

PotentiellementCancérigène*

Les HAP sont apolaires et hydrophobes. Leur caractère hydrophobe augmente avec le

nombre de cycles aromatiques, alors que leur solubilité et leur volatilité diminuent (Tableau 3).

Tableau 3. Paramètres physico-chimiques de quatre HAP.

IV.1.1.1.2. Source des HAP et distribution dans l’environnement aquatique

Les HAP peuvent avoir une origine naturelle ou anthropique. Ils sont principalement produits à

des températures à partir de 500 °C par combustion incomplète de la matière organique (incendies,

moteurs à combustion, chauffage, industries…), ces HAP sont dits pyrolytiques. Ils sont également

présents dans le pétrole brut (HAP pétrogéniques) et peuvent être introduits dans l‘environnement par

des suintements naturels ou accidentellement lors du transport de produits pétroliers.

Composé Masse molaire

(g.mol-1

)

Log

KOW

Solubilité à 25 °C

(mg.L-1

)

Tension de vapeur à

25 °C (Pa)

Phénanthrène 178 4,6 1,2 9,1.10-2

à 20 °C

Fluoranthène 202 5,1 0,3 1,2.10-3

Chrysène 228 5,7 2.10-3

8,4.10-5

Benzo[a]pyrène 252 6,0 3.10-3

7,3.10-7

Figure 4. Structures des HAP, * : selon la directive 2009/2/CE de la Commission du 15 janvier 2009, ** :

substances prioritaires de la directive européenne 2455/2001/CE.


32

Les HAP ont été détectés dans tous les compartiments environnementaux (air, eau, sols et

sédiments) (Menzie et al. 1992). Émis principalement par voies atmosphériques, les HAP peuvent

avoir un temps de résidence dans l'atmosphère assez long en s'adsorbant à des particules fines (< 1-

3 µm) et rester suffisamment longtemps dans l'atmosphère pour être dispersés à des centaines voire

des milliers de kilomètres de leur lieu de formation et/ou d‘émission (Abrajano et al. 2003). Les HAP

atteignent les eaux de surface principalement par retombées atmosphériques, mais aussi par les

effluents urbains et industriels (Srogi 2007). En effet, les effluents urbains ne passent pas tous

systématiquement par une station de traitement et les effluents traités ne permettent pas l‘élimination

complète de tous les HAP (Abrajano et al. 2003). De par l‘augmentation de l‘activité photolytique qui

les dégrade l‘été et l‘augmentation de fuels fossiles pour le chauffage qui les produit l‘hiver, les

quantités de HAP atmosphériques sont généralement plus élevées l‘hiver que l‘été (Abrajano et al.

2003), et cette tendance se retrouve également au niveau des écoulements urbains (Srogi 2007). Une

fois dans l'environnement aquatique et à cause de leur propriété hydrophobe, ils s'associent

rapidement aux particules en suspension dans l'eau et sont déposés sur les sédiments. La vitesse

d‘incorporation aux sédiments est contrôlée par le taux de sédimentation, la bioturbation et les

échanges sédiment-colonne d‘eau (Abrajano et al. 2003). Du fait de cette interface eau-sédiment et

du passage de la phase particulaire à la phase dissoute, il est également important de considérer les

concentrations en HAP dans les eaux interstitielles et dans la colonne d‘eau. Les concentrations en

HAP varient généralement entre 2 et 50 ng.L-1

dans les eaux de surface, entre 0,2 et 7 ng.L-1

dans les

eaux souterraines, entre 1 et 10 ng.L-1

dans les eaux potables et entre 3 µg.kg-1

(site considéré

comme propre) et 200 mg.kg-1

(site pollué) dans les sédiments (pour la somme de 8 HAP :

benzo[a]anthracène, chrysène, benzo[b]fluoranthène, benzo[k]fluoranthène, benzo[a]pyrène,

indéno[1,2,3-cd]pyrène, dibenzo[ah]anthracène et benzo[ghi]pérylène) (Menzie et al. 1992).

IV.1.1.1.3. Dégradation des HAP dans l’environnement aquatique

Les transformations chimiques comme l'hydrolyse, les réactions redox et les réactions

d'élimination ne sont pas des voies de dégradation dominantes des HAP dans les systèmes

aquatiques peu profonds (Abrajano et al. 2003). De par leur aromaticité et leurs liaisons chimiques

conjuguées, les HAP peuvent être sujets à la photodégradation dans l'atmosphère et dans la zone

photique de la colonne d'eau (Abrajano et al. 2003). Par ailleurs, la biodégradation est peut-être le

mécanisme de réaction le plus important pour la dégradation des HAP dans les environnements

aquatiques. La dégradation bactérienne (aérobie ou anaérobie) a été reconnue comme le mécanisme

le plus proéminant pour éliminer les HAP des environnements contaminés, même si les HAP de hauts

poids moléculaires semblent plus résistants aux processus de dégradation bactérienne et tendent à

persister plus longtemps dans les environnements contaminés (Abrajano et al. 2003).

IV.1.1.1.4. Toxicité des HAP

Il existe plusieurs dizaines de HAP dont la toxicité est très variable : certains sont faiblement

toxiques, alors que d‘autres, comme le benzo[a]pyrène, sont des cancérigènes reconnus depuis


33

plusieurs années (Figure 4). Les HAP légers sont moins toxiques mais généralement plus nombreux

et peuvent réagir avec d‘autres polluants pour former des dérivés plus toxiques (Srogi 2007). Il est

donc nécessaire de prendre en compte la présence de plusieurs de ces HAP dans les études de

toxicité. Par conséquent, plusieurs HAP ont été répertoriés comme substances prioritaires par la

directive cadre européenne sur l‘eau de 2000 (Figure 4).

IV.1.1.2. Interactions des HAP avec la matière organique

En ce qui concerne les interactions entre les HAP et la matière organique, beaucoup de

travaux ont été faits avec de la matière organique provenant de sols ou de particules et moins avec de

la MOD. La matière organique a en effet la capacité de s‘adsorber à la matière minérale contenue

dans les sols, les sédiments ou les particules en suspension dans la colonne d‘eau. Elle peut alors

être responsable des interactions plus fortes des contaminants envers ces phases solides et favoriser

leur présence dans ces compartiments. Les mesures de KOC peuvent se faire aisément par filtration

ou centrifugation puisqu‘il est uniquement nécessaire de séparer les HAP de la phase solide de ceux

de la phase liquide (Laor et Rebhun 2002). Alors que pour l‘étude des interactions avec la MOD, il est

nécessaire de quantifier uniquement les HAP en phase liquide mais il faut pouvoir identifier ceux qui

sont effectivement dissous dans l‘eau (sous forme libre) de ceux qui sont associés à la MOD. Les

mesures des KOC sont donc généralement plus faciles à obtenir que celles des KDOC. D‘autre part, la

matière organique est beaucoup plus concentrée dans les sols que sous forme dissoute dans les

eaux naturelles ce qui complique la caractérisation de la MOD et donc la compréhension des

phénomènes à l‘origine des interactions avec les contaminants.

IV.1.1.2.1. Effet de la composition de la MOD sur les interactions avec

les HAP

Les interactions des HAP avec la MOD dépendent en grande partie de la composition de

celle-ci et notamment de la quantité de macromolécules hydrophobes. En effet, la fraction hydrophile

de la MOD, constituée essentiellement de groupements fonctionnels hydroxyles et acides

carboxyliques, n‘interagit pas avec les HAP ; plus cette fraction représente une part importante de la

MOD, plus les interactions avec les HAP sont faibles (McCarthy et al. 1989). Il a été montré que le

benzo[a]pyrène a des interactions plus fortes avec la fraction hydrophobe acide de la MOD, qui est

constituée de plus grosses molécules et qui est enrichie en structures aromatiques et en groupements

fonctionnels acides (McCarthy et al.1989). Ceci peut être expliqué par plusieurs causes. Tout d‘abord

des facteurs électroniques peuvent intervenir. En effet, le benzo[a]pyrène est un composé riche en

électrons qui peut donner ses électrons via des transferts de charges vers des composés déficients

en électrons comme les acides hydrophobes (McCarthy et al. 1989). Cependant, les facteurs

électroniques n‘expliquent pas toute leur réactivité. En effet, en plus des interactions avec la fraction

hydrophobe acide (avec une faible densité électronique), le benzo[a]pyrène peut également avoir des

affinités avec la fraction hydrophobe neutre (riche en électrons) de la MOD (Akkanen et Kukkonen

2001). Ceci explique également que ce contaminant puisse avoir plus d‘affinités avec la MOD que


34

d‘autres composés, même plus hydrophobes, si ceux-ci n‘ont des affinités qu‘avec une seule fraction

de la MOD. Par exemple le tétrachlorobiphényle (PCB tétrachloré), électrophile, interagit

essentiellement avec la fraction neutre donc ses interactions sont forcément plus faibles que s‘il

interagissait aussi avec la fraction acide (qui est généralement majoritaire dans la MOD d‘eaux

douces) (McCarthy et al. 1989). La configuration spatiale de la MOD peut également être importante

et il semblerait que les acides hydrophobes favorisent également les interactions hydrophobes avec le

benzo[a]pyrène en permettant d‘ouvrir les structures de la MOD grâce à leurs fonctions acides et à la

répulsion entre leurs charges lorsqu‘ils sont déprotonés (McCarthy et al. 1989). Ces structures plus

ouvertes pourraient contribuer à la partition des HAP en créant des cavités hydrophobes dans la MOD

plus accessibles pour les solutés, et les groupements polaires à l‘interface eau-MOD pourraient

diminuer la tension de surface et promouvoir les liaisons hydrogène pour augmenter la partition du

benzo[a]pyrène dans la MOD (McCarthy et al. 1989). Enfin, la polarité de la MOD et sa composition

moléculaire peuvent également être importantes. Ainsi, l‘augmentation de la fraction de la MOD

hydrophobe neutre aliphatique faiblement polaire n‘augmente pas l‘intensité des interactions avec le

benzo[a]pyrène (McCarthy et al. 1989). De la même façon, de Paolis et Kukkonen (1997) ont montré

que les interactions benzo[a]pyrène - MOD diminuent quand la polarité (rapport (O+N)/C) de la MOD

augmente. D‘autre part, plus la MOD est oxydée (faible rapport H/O), plus les interactions sont faibles

(De Paolis et Kukkonen 1997). Les interactions sont donc plus fortes avec de la MOD plus humifiée

(plus mature) qu‘avec des molécules plus récentes (De Paolis et Kukkonen 1997). Ceci explique que

les HAP aient des affinités plus fortes avec les acides humiques qu‘avec les acides fulviques, qui sont

plus polaires et moins hydrophobes (Lou et al.2006, Perminova et al. 1999, De Paolis et Kukkonen

1997).

IV.1.1.2.2. Effet de la structure de la MOD sur les interactions avec les

HAP

Quelque soit la nature chimique des interactions, il semblerait que l‘aromaticité et la taille de la

MOD soient les facteurs les plus importants gouvernant les interactions HAP-MOD (Chin et al. 1997,

Perminova et al. 1999, Kopinke et al. 2001). McCarthy et al. (1989) ont montré une forte relation

linéaire entre la force des interactions du benzo[a]pyrène et l‘absorbance spécifique (Abs270),

considérée comme un bon indicateur de l‘aromaticité de la MOD. De la même façon, Chin et al.

(1997) ont montré une relation linéaire entre le KDOC du pyrène et l‘absorptivité molaire de la MOD (ou

coefficient d‘extinction molaire) à 280 nm qui est corrélée à l‘aromaticité et à la masse moléculaire

moyenne de la MOD. Les noyaux aromatiques jouent un rôle important dans les interactions HAP –

MOD (Perminova et al. 1999, Gauthier et al. 1987) mais il semblerait que l‘environnement des

molécules aromatiques soit également important. Les HAP auraient en effet les affinités les plus fortes

avec les MOD présentant des structures aromatiques les plus disponibles, c‘est-à-dire celles qui

auraient une orientation coplanaire avec les HAP (Perminova et al. 1999). Ceci pourrait alors être

interprété par des interactions donneur-accepteur d‘électrons entre la MOD et les HAP déjà décrites.


35

La taille des macromolécules joue également un rôle dans les interactions avec la MOD.

D‘après Raber et Kögel-Knabner (1997), ce rôle serait d‘ailleurs prépondérant sur celui du caractère

hydrophobe de la MOD, pour des macromolécules issues de composts. D‘après Chin et al. (1994), il

semblerait que les molécules les plus petites n‘aient pas la taille et la flexibilité suffisantes pour se

replier et former des domaines hydrophobes favorables aux interactions, mais Raber et Kögel-

Knabner (1997) ont montré que même les macromolécules inférieures à 1000 Da pouvaient interagir

avec les HAP. Perminova et al. (2009) ont trouvé une corrélation positive entre la force des

interactions HAP-MOD et la taille des macromolécules de MOD mais uniquement tant que la taille

n‘excède pas 15 kDa. Ils ont attribué cette cassure de linéarité à l‘hétérogénéité de la MOD et aux

différences structurelles existantes entre les différentes MOD. Chin et al. (1997) ont trouvé que cette

corrélation était linéaire mais ont étudié des MOD n‘allant que jusqu‘à 4000 Da et de même origine

(aquatique). McCarthy et al. (1989) ont trouvé une relation directe entre le KDOC du benzo[a]pyrène et

la taille des macromolécules de MOD d‘eaux souterraines et de surface mais avec une linéarité plus

faible (R² = 0,58). Une forte corrélation négative (R² > 0,9) a été observée entre les interactions des

HAP et des MOD d‘eaux naturelles avec le rapport d‘absorbance A254/A400 (absorbance à 254 nm sur

celle à 400 nm, Akkanen et al. 2004). Ce rapport d‘absorbance est généralement anti-corrélé à la taille

des macromolécules mais est à prendre avec précaution puisque la relation entre les paramètres

spectroscopiques et la structure de la MOD varie avec l‘origine de la MOD et les constituants

inorganiques de l‘échantillon (comme les nitrates ou le fer) qui peuvent modifier les spectres

d‘absorbance (Akkanen et al. 2004). Il est difficile de définir l‘effet de la taille des macromolécules

uniquement alors que, de par la complexité des phénomènes de dégradation de la MOD, plusieurs

caractéristiques physico-chimiques évoluent conjointement. Par exemple, pour les différents types de

MOD d‘origine terrestre étudiés par Perminova et al. (1999), les petites macromolécules ont un

pourcentage de carbone aromatique plus élevé et les grosses molécules ont un pourcentage de

carbone oxygéné plus important. Par contre, Chin et al. (1994) qui travaillaient sur des MOD d‘origine

aquatique avaient une corrélation positive entre taille des macromolécules et aromaticité. Il s‘avère de

toute façon impossible de trouver des MOD dont un seul paramètre serait variable comme la taille ou

l‘aromaticité sans faire varier la polarité ou le caractère hydrophobe par exemple puisque beaucoup

de paramètres changent en même temps et ne peuvent pas être décorrélés (Georgi et Kopinke 2002).

Ainsi, il est difficile d‘étudier l‘effet d‘un seul paramètre indépendamment des autres avec des MOD

naturelles.

IV.1.1.2.3. Effet des propriétés des contaminants organiques

De la même façon que les interactions sont dépendantes des propriétés de la MOD, elles le

sont aussi des propriétés des contaminants. Pour les contaminants apolaires comme les HAP, leur

caractère hydrophobe est le principal facteur de leurs interactions avec la MOD (Pan et al. 2007a). Il a

été montré que les HAP ont des interactions plus fortes avec la MOD que d‘autres contaminants

organiques hydrophobes (composés chlorés et alcanes) de même KOW (Georgi et Kopinke 2002).

Ceci est peut-être dû à l‘affinité particulière des HAP pour les parties aromatiques de la MOD ou à la

gêne stérique qui peut avoir lieu avec les molécules chlorées (Georgi et Kopinke 2002). Concernant


36

les HAP, une relation linéaire a souvent été observée entre les KDOC et les KOW. Par exemple, Georgi

et Kopinke (2002) donnent comme équation log KDOC = (0,91 0,05) log KOW + (0,2 0,2) (R² = 0,976)

avec l‘acide humique commercial Roth ; pour McCarthy et Jimenez (1985), les deux coefficients KDOC

et KOW sont à peu près égaux.

IV.1.1.2.4. Effet des facteurs environnementaux

Outre les propriétés de la MOD et des HAP, les paramètres physico-chimiques du milieu

environnemental peuvent influencer la nature et la force des interactions.

IV.1.1.2.4.1. Effet du pH

L‘un des facteurs environnementaux le plus étudié pour ses effets sur les interactions est le

pH. Quelques divergences de résultats ont pu être observées, dues notamment aux différences entre

les MOD étudiées. D‘après Kopinke et al. (2001), avec l‘acide humique commercial (Roth), il n‘y aurait

pratiquement aucun effet du pH sur les interactions avec les HAP, alors que ces interactions

augmentent lorsque le pH diminue pour des macromolécules assez petites (2000 Da) et des

substances humiques aquatiques naturelles. De la même façon, Lou et al. (2006) ont montré que le

KDOC du benzo[a]pyrène augmente quand le pH diminue pour des acides humiques et fulviques de

référence (échantillons issus de la rivière Suwannee commercialisés par la Société Internationale des

Substances Humiques (IHSS)) et de la MOD aquatique naturelle (issue d‘eau douce). Le même

phénomène a été observé pour le pyrène, l‘anthracène et le pérylène avec les mêmes substances

humiques de référence de l‘IHSS (Schlautman et Morgan 1993). Contrairement à Kopinke et al.

(2001), Pan et al. (2007a) ont montré que la sorption des HAP avec des acides humiques de sols et

commerciaux augmente quand le pH diminue. Pour de la MOD estuarienne (issue de la colonne d‘eau

et de sédiments), une variation de pH entre 5 et 8 n‘a que faiblement affecté les interactions

benzo[a]pyrène - MOD (De Paolis et Kukkonen 1997).

La différence entre les effets du pH sur la MOD peut s‘expliquer en partie par le fait qu‘il a déjà

été montré que les acides humiques commerciaux (Aldrich par exemple) sont composés de

macromolécules beaucoup plus grosses que celles des échantillons naturels (Chin et al. 1994) et

qu‘ils ne sont pas de bons modèles de MOD aquatique en ce qui concerne leurs propriétés et leur

réactivité (Chin et al. 1997). D‘autre part, l‘acide humique Aldrich est plus apolaire que les substances

humiques naturelles tandis que celles des sols sont moins polaires que les substances humiques

aquatiques (Chin et al. 1997).

Puisque des composés apolaires comme les HAP sont à priori peu sensibles aux variations

de pH, une modification de la force des interactions lors des variations de pH est certainement due à

une modification de la conformation de la MOD (Pan et al. 2007a). Dans des conditions de pH neutre

et basique, les groupements carboxyles et hydroxyles de la MOD sont déprotonés. Les

macromolécules sont donc globalement chargées négativement, ce qui provoque des répulsions intra-


37

et intermoléculaires et leur donne une conformation plus allongée et ouverte (Pan et al. 2007a,

Baalousha et al. 2006, Pan et al. 2008). À ces pH, Pan et al. (2007a) ont supposé la coexistence de

microenvironnements hydrophobes entourés de groupements trop polaires ou trop petits pour interagir

avec les HAP et de sites hydrophobes compacts ou discrets permettant les interactions. À des pH

acides, les groupements carboxyles et hydroxyles sont protonés et la neutralité des macromolécules

est conservée ; les macromolécules peuvent donc se replier sur elle-même (Pan et al. 2007a, Pan et

al. 2008). Les microenvironnements hydrophobes discrets peuvent s‘agréger en plus grandes régions

hydrophobes, voire prendre une conformation de type micelle et les macromolécules former un

ensemble plus compact (Figure 5) ; ce qui pourrait expliquer que les interactions avec les HAP soient

plus fortes à pH acide. Les grosses macromolécules possèderaient déjà une capacité suffisante à

créer des cavités hydrophobes par le repli intramoléculaire et leur conformation et leurs interactions

avec les contaminants seraient donc moins disposées aux variations de pH (Kopinke et al. 2001). De

plus, les interactions - entre noyaux aromatiques des HAP et de la MOD seraient plus favorables à

pH acide (Pan et al. 2007a).

1. 2. 4. 1. Effet de la force ionique

Région hydrophobe repliée

Région hydrophobe discrète

Structure de type micelle

Figure 5. Schéma des structures possibles de la MOD dues aux variations de pH (d’après Pan et al. 2007a), les

régions entourées en rouge sont les régions pouvant interagir avec les HAP, le fond coloré représente les

molécules d’eau.


38

IV.1.1.2.4.2. Effet de la force ionique

Les ions en solutions peuvent également modifier les interactions HAP-MOD. Akkanen et

Kukkonen (2001) ont montré que le pyrène et le benzo[a]pyrène s‘associaient à la MOD naturelle (Lac

de Finlande) ou de référence (acide fulvique nordique) d‘autant plus que la dureté de l‘eau

(concentrations en ions Ca2+

et Mg2+

) est faible. Pan et al. 2008 ont noté une augmentation du KDOC

du pyrène avec l‘augmentation de la force ionique (Al3+

). Schlautman et Morgan (1993) ont observé

une diminution du KDOC pour l‘anthracène, le pyrène et le pérylène lorsque la concentration en NaCl

augmente. D‘autre part, ils ont remarqué un faible effet des cations Ca2+

, mais qui dépendait du pH.

La salinité et plus généralement la force ionique des eaux naturelles ont un effet sur la solubilité

aqueuse des contaminants. En effet, les ions présents dans ces eaux (Na+, K

+, Cl

-…) se lient

fortement à l‘eau lors de leur dissolution, la rendant alors moins disponible pour la dissolution des

composés apolaires neutres, c‘est « l‘effet de sel » (Schwarzenbach et al. 1993). Cette diminution de

la solubilité des contaminants lors de l‘augmentation de la force ionique peut donc entraîner une

diminution de la fraction dissoute des HAP et favoriser leur association avec la MOD. Ce phénomène

peut donc expliquer, au moins en partie, l‘augmentation des KDOC parfois observée lorsque la force

ionique augmente. D‘autre part, une modification de la conductivité a également un effet sur la

conformation de la MOD. Généralement, même si cet effet dépend des ions en présence, il a été

rapporté une agrégation des macromolécules à force ionique plus élevée, donnant l‘impression d‘une

augmentation de la taille de la MOD (Baalousha et al. 2006). Cependant, au-delà d‘une certaine

concentration en ions, la taille de la MOD tend à diminuer à cause de la condensation de ces agrégats

(Baalousha et al. 2006). La modification de la conformation de la MOD pourrait alors influencer les

KDOC en favorisant ou en empêchant l‘accessibilité à certains sites de la MOD favorables aux

interactions avec les HAP. Ces phénomènes d‘agrégation et de condensation seraient dus aux

cations dissous qui pourraient permettre de neutraliser les charges négatives de la MOD observées à

pH neutre ou basique (Baalousha et al. 2006). Le type de cations joue également un rôle important

sur la conformation de la MOD : les cations monovalents (Na+) ont un effet plus faible que les cations

divalents (Ca2+

), qui sont capables de neutraliser plus de charges négatives sur la MOD (Baalousha et

al. 2006).

IV.1.1.2.4.3. Effet de la concentration en COD

La concentration en MOD est également importante pour les interactions avec les HAP.

Plusieurs études ont montré que le KDOC peut diminuer quand la concentration en MOD augmente

(McCarthy et Jimenez 1985, Landrum et al. 1984, Pan et al. 2008). Pan et al. (2008) ont observé une

agrégation des macromolécules lorsque la concentration en MOD augmente ; celle-ci serait due à la

diminution de la distance intermoléculaire et au manque d‘espace dans la solution, et pourrait

expliquer la modification du KDOC.


39

IV.1.1.2.4.4. Effet de la température

La température a également un effet sur les interactions HAP-MOD, même si celui-ci est plus

faible que celui des autres facteurs précédemment développés (Lüers et ten Hulscher 1996, Raber et

Kögel-Knabner 1997). Lüers et ten Hulscher (1996) ont observé des interactions plus faibles lors de

l‘augmentation de la température pour le fluoranthène, le benzo[b]fluoranthène, le

benzo[k]fluoranthène, le benzo[a]pyrène, le benzo[ghi]pérylène et l‘indéno[1,2,3-c,d] pyrène avec de

la MOD d‘eau naturelle. Les KDOC diminuent en moyenne de 20 à 30 % lors d‘une augmentation de

10 °C (Lüers et ten Hulscher 1996). Raber et Kögel-Knabner (1997) ont obtenu des KDOC pour le

benzo[k]fluoranthène et le benzo[a]pyrène en présence de MOD de composts légèrement supérieurs

(5 - 15 %) à 5 °C par rapport à 30 °C mais la différence n‘est pas statistiquement significative.

L‘influence de la température peut également s‘expliquer par la modification de la solubilité des HAP

dans l‘eau, ainsi une augmentation de la température expliquerait une diminution du KDOC (Lüers et

ten Hulscher 1996). L‘intérêt aussi d‘étudier l‘effet de la température sur les interactions est lié au fait

que le calcul des KDOC à différentes températures permet également d‘avoir des informations sur la

thermodynamique des interactions. La variation d‘enthalpie molaire (H) des interactions est de -2 à -

4 kJ.mol-1

dans les travaux de Raber et Kögel-Knabner (1997), indiquant que les interactions sont

faibles et dirigées par l‘entropie, comme c‘est le cas pour les interactions hydrophobes. Lüers et ten

Hulscher (1996) ont calculé des H allant de -18 kJ.mol-1

pour le fluoranthène à -41 kJ.mol-1

pour le

benzo[ghi]pérylène, indiquant des interactions plus fortes.

IV.1.1.2.4.5. Effet de la luminosité

La lumière peut également jouer un rôle sur les interactions. En effet, la photodégradation de

la MOD, de par la modification de ses propriétés (aromaticité, taille moléculaire, caractère

hydrophobe), influence les interactions avec le benzo[a]pyrène (Lou et al. 2006). Elle peut aussi

modifier les propriétés du milieu comme le pH (par production de photoproduits acides ou basiques),

les concentrations en dioxygène et en COD, ce qui modifie également les interactions avec les HAP

(Lou et al. 2006)

IV.1.1.2.5. Nature des interactions HAP-MOD

L‘étude des facteurs et des propriétés influençant les interactions HAP-MOD ont donc permis

d‘émettre des hypothèses sur leurs mécanismes au niveau moléculaire. Les interactions HAP-MOD

sont donc souvent décrites comme des interactions faibles de type Van der Waals entre un dipôle

instantané et un dipôle induit (Georgi et Kopinke 2002, Gauthier et al. 1987, Schlautman et Morgan

1993). La faculté d‘induire un moment dipolaire à une molécule dépend de sa polarisabilité et celle-ci

est augmentée avec le nombre de liaisons C=C (Gauthier et al. 1987). La polarisabilité de la MOD

serait donc augmentée avec le nombre de noyaux aromatiques rendant les forces de Van der Waals

avec les HAP d‘autant plus fortes. L‘augmentation de la polarisabilité avec le nombre de noyaux

aromatiques étant également valable pour les HAP, il est logique d‘observer des interactions plus


40

fortes avec les HAP les plus lourds. D‘autre part, le fait que les HAP aient peu d‘affinité avec l‘eau

s‘ajoute aux forces de Van der Waals et ces deux phénomènes sont généralement regroupés sous le

terme d‘interactions hydrophobes (Gauthier et al. 1987). Wijnja et al. (2004) ont également suggéré

l‘existence d‘interactions - (appelées aussi transferts de charges) entre le phénanthrène (donneur

d‘électron ) et certains groupements de la MOD (accepteurs d‘électrons comme des quinones ou

des cations aromatiques azotés). Ce type d‘interactions avait également été suggéré par McCarthy et

al. (1989) pour le benzo[a]pyrène. Ces interactions spécifiques, orientées et plus fortes que les

interactions de Van der Waals pourraient donc amplifier les effets des interactions hydrophobes entre

HAP et MOD.

IV.1.1.2.6. Linéarité des interactions HAP-MOD

Même si les interactions entre HAP et MOD ont fait l‘objet de plusieurs études, peu d‘entre

elles ont entrepris de les étudier quantitativement (Georgi et Kopinke 2002). Ceci est dû d‘une part à

la difficulté d‘obtenir des résultats avec des incertitudes faibles et d‘autre part à l‘influence importante

de la technique analytique sur les résultats (Georgi et Kopinke 2002). D‘un point de vue quantitatif,

deux hypothèses s‘affrontent concernant les mécanismes des interactions HAP-MOD. Généralement,

les interactions des contaminants organiques hydrophobes avec la MOD sont considérées comme

dues à des phénomènes de partition entre l‘eau et la MOD (Georgi et Kopinke 2002). Ce modèle de

partition est supporté par des observations d‘associations à la MOD non compétitives, des isothermes

linéaires (linéarité entre les concentrations libres et associées à la MOD) et de faibles enthalpies de

liaison (Georgi et Kopinke 2002, McCarthy et Jimenez 1985). D‘après Georgi et Kopinke (2002),

même si les HAP peuvent interagir spécifiquement avec certaines parties de la MOD (comme les

noyaux aromatiques), ceci n‘empêche pas le concept du modèle de partition, qui suppose que quelles

que soient les concentrations en contaminants, le nombre de sites d‘association sur la MOD est

toujours en excès.

Pour Laor et Rebhun (2002), le modèle de partition et l‘hypothèse d‘un excès de sites

disponibles sur la MOD ne sont pas suffisants pour expliquer les interactions HAP-MOD. De par

l‘observation d‘isothermes non linéaires, ils ont suggéré que les interactions seraient de nature plus

spécifique vis-à-vis de certains sites hydrophobes de la MOD. Ils ont essayé d‘expliquer cette non-

linéarité par des biais analytiques mais plusieurs travaux ont obtenu les mêmes résultats par des

techniques de concepts différents (extinction de fluorescence, complexation-floculation, séparation sur

phase inverse), laissant penser que l‘observation de cette non-linéarité n‘est pas due aux méthodes

analytiques (Landrum et al. 1984, Laor et Rebhun 2002, Pan et al. 2007a). Des isothermes non

linéaires impliquent une distribution hétérogène des énergies d‘association des sites de la MOD, la

présence de phénomènes de compétition entre contaminants de propriétés similaires et des

hystérèses de sorption/désorption (Pan et al. 2007a). Akkanen et al. (2005a) ont supposé que les

sites de la MOD disponibles pour les interactions ont pu être saturés dans leur expérimentation

puisqu‘ils travaillaient à forte concentration de contaminants (environ 600 ng.L-1

) par rapport au milieu

naturel, ce qui laisserait supposer que les interactions pourraient tout de même être linéaires à des


41

concentrations naturelles. Borisover et al. (2006) ont également observé cette saturation de la MOD

par le pyrène mais ils étaient en présence de très fortes concentrations en HAP (20 - 100 µg.L-1

).

D‘autre part, la linéarité des interactions des contaminants avec la MOD est souvent étudiée dans des

systèmes « monosolutés », alors que les échantillons naturels ne sont jamais constitués uniquement

d‘un seul composé ; ainsi la compétition due à la présence d‘autres contaminants n‘a été que peu

étudiée et pourrait provoquer la non-linéarité des interactions. Pan et al. (2007a) ont mis en évidence

la compétition entre le phénanthrène et le pyrène pour des acides humiques issus de sols et

commerciaux dissous dans l‘eau. De plus, plusieurs études ont montré une diminution, parfois non

significative, du KDOC avec l‘augmentation de la concentration en MOD (McCarthy et Jimenez 1985,

Landrum et al. 1984, Pan et al. 2008). Ceci peut être dû à un changement de la configuration de la

MOD comme décrit plus haut mais une autre hypothèse peut être avancée : puisque les sites

spécifiques ont normalement des énergies plus fortes et sont limités en nombre, un plus fort

pourcentage de contaminants serait associé à ces sites spécifiques à faible plutôt qu‘à forte

concentration en solutés, ce qui résulterait en une diminution des interactions après l‘ajout de MOD à

cause de la compétition pour ces sites (Pan et al. 2007a). Un autre critère pouvant confirmer la non-

linéarité est la non-réversibilité des interactions (Akkanen et al. 2005a). Contrairement à McCarthy et

Jimenez (1985), Pan et al. (2007a) ont montré des isothermes de sorption différentes de celles de

désorption impliquant des interactions plus fortes pendant la désorption que pendant la sorption. Ceci

pourrait confirmer la non-linéarité et s‘expliquer par un changement de conformation de la MOD une

fois associée au HAP, la MOD serait alors plus compacte (Pan et al. 2007a). Des résultats similaires

avec une désorption en deux étapes (une lente et une rapide) avaient également été obtenus pour le

benzo[a]pyrène par Akkanen et al. (2005a). Il est également possible que la partition et l‘association

avec des sites spécifiques peuvent avoir lieu en même temps sur des sites différents de la MOD.

Malgré ces observations, les interactions sont le plus souvent modélisées par des isothermes

linéaires ; il faut donc rester prudent car si elles sont effectivement non linéaires, le rôle de la MOD

pourrait être sous-estimé lors de l‘extrapolation des données à plus fortes concentrations (Laor et

Rebhun 2002).

IV.1.1.2.7. Cinétique des interactions HAP-MOD

Concernant la cinétique des interactions HAP-MOD, celle-ci a été mesurée par différentes

techniques et semble très rapide (1-10 min) (McCarthy et Jimenez 1985, Schlautman et Morgan 1993,

Poerschmann et al. 1997). Certaines études ont cependant montré des temps d‘interaction beaucoup

plus longs, par exemple Li et Lee (2000) ont montré que les temps d‘équilibre étaient plutôt de 5 à 7

jours. Généralement, les mesures faites par micro-extraction sur phase solide (SPME) ou extinction

de fluorescence donnent des temps d‘équilibre très courts contrairement aux autres méthodes comme

la dialyse ou la séparation sur phase inverse. Les études d‘interactions entre les contaminants et la

matière organique issue de sols ou sédiments montrent généralement qu‘il y a deux composantes

cinétiques qui entrent en jeu : une première, rapide et une deuxième plus lente, pendant laquelle les

composés migreraient vers les sites moins accessibles (McCarthy et Jimenez 1985). Cependant,


42

McCarthy et Jimenez (1985) ont suggéré qu‘en solution il n‘y ait qu‘une composante rapide (ou une

rapide et une très rapide) car en solution les sites de la MOD seraient beaucoup plus proches et plus

facilement accessibles que dans des sédiments par exemple. Mais le fait que selon la technique le

résultat est différent conforte peut-être l‘hypothèse d‘une cinétique en deux étapes, où l‘étape lente ne

serait observable que si l‘on étudie les interactions sur de très longues périodes.

De nombreux travaux ont permis l‘avancée de la connaissance des interactions HAP-MOD

mais beaucoup de questions restent encore aujourd‘hui sans réponse. L‘étude des interactions entre

les HAP et la MOD ont donc pris une place importante dans ces travaux de thèse mais nous voulions

également nous intéresser aux interactions avec des contaminants organiques moins hydrophobes et

surtout plus solubles. De nombreux contaminants organiques polaires et peu hydrophobes sont

présents dans l‘environnement aquatique et peuvent, même sans être bioaccumulables, poser des

problèmes de toxicité. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux substances

pharmaceutiques et plus précisément à la classe des benzodiazépines. Ces composés sont des

molécules neutres, plus polaires et moins hydrophobes que les HAP qui peuvent être présentes dans

l‘environnement naturel.

IV.1.2. Les substances pharmaceutiques

Les substances pharmaceutiques font l‘objet de plus en plus d‘études en ce qui concerne leur

présence dans l‘environnement. En effet, le développement de techniques analytiques très sensibles

a permis la détection de nombreuses molécules actives que ce soient des médicaments ou leurs

métabolites issus de dégradations biologiques, chimiques ou physiques. Les médicaments sont issus

de la médecine humaine et vétérinaire et sont continuellement consommés en grandes quantités.

Chaque année, plus de 3 milliards de boîtes de médicaments sont vendues en France rien qu‘aux

officines (http://www.afssaps.fr/Afssaps-media/Publications/Bilans) et près de 1350 tonnes

d‘antibiotiques seraient destinés à un usage vétérinaire, dont 93 % pour les animaux destinés à la

consommation humaine (http://www.anmv.afssa.fr).

Ces substances, une fois consommées, sont en grande partie transformées au sein des

organismes et excrétées sous la forme de métabolites ou sous leur forme initiale (Khetan et Collins

2007). Les molécules destinées à la médecine humaine sont concentrées dans les effluents

hospitaliers et les eaux usées. Certaines de ces molécules ne sont pas dégradées par les stations de

traitement et atteignent les systèmes aquatiques naturels où elles sont diluées et donc présentes à de

faibles concentrations (généralement de l‘ordre du ng.L-1

dans les eaux). Les molécules à usage

vétérinaire sont concentrées dans les eaux de rejets d‘aquaculture et dans les lisiers d‘animaux

d‘élevages et peuvent également atteindre le milieu naturel via les rivières ou après épandages

agricoles. Les sols, les eaux souterraines et de surface et in fine les eaux destinées à la

consommation peuvent donc contenir des traces de molécules actives (Khetan et Collins 2007).

http://www.afssaps.fr/Afssaps-media/Publications/Bilans


43

A cause de leur mode d‘action spécifique et du fait que ces composés sont fabriqués

intentionnellement pour avoir un effet sur les humains, mammifères ou autres vertébrés, les résidus

des produits pharmaceutiques peuvent être aussi, voire même plus, dangereux pour la santé humaine

que ceux des pesticides, qui sont créés pour affecter les mauvaises herbes, les champignons et les

invertébrés (Cleuvers 2003). Au-delà de problèmes spécifiques à certaines classes de composés,

comme le développement d‘antibiorésistance ou la destruction de bactéries des systèmes de

traitements dus aux antibiotiques, certaines molécules peuvent s‘avérer toxiques pour les organismes

à des concentrations faibles, de l‘ordre de celles que l‘on retrouve dans les systèmes aquatiques

naturels. La toxicité la plus probable à ces concentrations est la perturbation endocrinienne. Celle-ci

est due à la présence de produits chimiques qui ont la capacité d‘interférer sur le système hormonal et

de causer des dysfonctionnements de la croissance et de la reproduction des organismes (Khetan et

Collins 2007).

Cette toxicité a généralement lieu à de très faibles concentrations en contaminants d‘où

l‘intérêt croissant pour des analyses de plus en plus sensibles et permettant l‘analyse simultanée d‘un

maximum de composés. L‘une des difficultés quant à l‘analyse des substances pharmaceutiques est

due à la diversité physico-chimique de ces molécules. En effet, elles peuvent être plus ou moins

hydrophobes, voire hydrophiles, neutres ou chargées (négativement et/ou positivement) selon les

conditions du milieu. Certaines d‘entre elles peuvent être facilement dégradées ce qui complique leur

analyse mais également leur extraction. D‘autre part, cette diversité de composition augmente la

diversité de comportements dans le milieu environnemental puisque les molécules ont soit plus

d‘affinités pour les sols soit pour les eaux et donc leur transport et leur distribution peuvent être

différents selon leurs caractéristiques physico-chimiques. De plus, comme les médicaments sont

rejetés dans l‘environnement via des boues ou des solutions riches en COD, l‘association avec ce

dernier pourrait faciliter leur transport dans l‘eau et modifier leur sorption avec les sols (Carmosini et

Lee 2009). Cependant, face aux difficultés analytiques et au récent intérêt pour ces substances, le

manque de données concernant leur comportement et leurs interactions possibles avec la matière

organique est assez important.

Il a été montré que la matière organique a la capacité de modifier la dégradation des

substances pharmaceutiques (Chiron et al. 2006, Doll et Frimmel 2005). Toutefois, la modification de

la dégradation est généralement due à une diminution de la photodégradation par effet de filtre interne

en présence de matière organique ou à une augmentation d‘espèces réactives issues de la matière

organique photodégradée mais aucune interaction directe entre composés et matière organique n‘a

pu être mise en évidence dans ces études.

Quelques études ont montré que certaines substances pharmaceutiques peuvent s‘adsorber

sur des sols et des sédiments (Tolls 2001, Stein et al. 2008, Pan et al. 2009). Alors que certains

médicaments pourraient s‘accumuler dans les sédiments, d‘autres se trouveraient uniquement dans la

phase aqueuse, et ceci dépendrait de la nature physico-chimique des substances pharmaceutiques et


44

des sols et sédiments (Tolls 2001, Löffler et al. 2005, Gielen et al. 2009). Ces interactions avec les

sols seraient dues en grande partie à la fraction minérale mais au-delà d‘un certain pourcentage de

carbone organique (9 % pour l‘antibiotique oxytétracycline), c‘est ce dernier qui dominerait les

phénomènes d‘interaction (Pan et al. 2009). Il est donc probable que, comme pour les HAP, des

interactions aient lieu entre la matière organique et les substances pharmaceutiques. Cependant,

Tolls (2001) a mis en évidence une grande variabilité des KD pour différentes classes de molécules

pharmaceutiques et différents sols, et cette variabilité était tout aussi importante même après la

normalisation par la fraction organique contenue dans le sol (calcul des KOC). Les valeurs de KOC pour

certains médicaments à usage vétérinaire et différents sols varieraient de 17 à 770 000 L.kg-1

(Tolls

2001). Ainsi, la fraction organique n‘aurait pas autant d‘importance pour la sorption des médicaments

que pour les HAP et cette sorption dépendrait également de la taille des particules minérales et des

conditions environnementales (e. g. pH). L‘effet de la matière organique serait en fait plus important et

même dominant pour les composés neutres comme la carbamazépine contrairement aux

médicaments possédant des charges au pH environnemental (Gielen et al. 2009). D‘autre part,

Carmosini et Lee (2009) ont suggéré que les macromolécules les plus petites (< 1000 Da) et

généralement les plus polaires pourraient interagir avec les médicaments polaires chargés alors que

les plus grosses macromolécules, de par leur capacité à former des cavités hydrophobes,

interagiraient préférentiellement avec les contaminants apolaires.

Maskaoui et al. (2007) ont montré que certains médicaments pouvaient interagir avec la

matière organique colloïdale et ont calculé les KDOC de ces composés (de 54 500 mL.g-1

pour la

carbamazépine à 754 000 mL.g-1

pour la mébévérine) par ultrafiltration. Bai et al. (2008) ont montré

que la carbamazépine pouvait interagir avec des substances humiques grâce à l‘extinction de

fluorescence. Ils ont obtenu des KDOC variant d‘environ 11 000 2000 à 465 000 20 000 mL.g-1

selon le type de MOD et ont donc conclu que la MOD pouvait avoir un rôle important sur le

comportement de la carbamazépine dans l‘environnement aquatique. Moeder et al. (2000) ont montré

une réduction des aires obtenues par SPME-GC-MS pour l‘ibuprofène et le paracétamol en présence

d‘acides humiques. Même s‘ils attribuent cette diminution à la modification de la cinétique d‘extraction

des contaminants à cause de la présence de MOD, la diminution pourrait également indiquer une

diminution de la forme libre de ces contaminants.

De par la polarité des substances pharmaceutiques, on peut supposer que les interactions

avec les sols ou la matière organique sont dues à des liaisons hydrogène, des réactions acido-

basiques ou plus généralement électrostatiques (Stein et al. 2008). Maskaoui et al. (2007) ont

également montré une corrélation positive entre les interactions et le KOW de certains médicaments

(propranolol, sulfaméthoxazole, mébévérine, carbamazépine, indométacine, diclofénac, acide

méclofénamique), ainsi qu‘avec la taille de ces composés. Ceci confirme donc l‘importance du

caractère hydrophobe des contaminants et de leur taille pour leurs interactions avec la matière

organique. Il semblerait donc que les contaminants polaires puissent réagir de la même façon que les

HAP avec la matière organique, avec en plus des interactions dues à leur polarité avec les parties


45

plus polaires de la MOD. Cependant, il semblerait que les interactions soient fortement dépendantes

des médicaments puisque l‘étude bibliographique de Tolls (2001) n‘a pas montré de relations entre le

KOC et le KOW pour des substances pharmaceutiques vétérinaires.

Afin d‘étudier les interactions entre les substances pharmaceutiques et la MOD, nous avons

choisi d‘utiliser des médicaments sous forme neutre à pH environnemental puisque leurs interactions

pourraient être plus fortes (Gielen et al. 2009). Ces molécules offrent également la possibilité de les

analyser par GC-MS. Nous avons ainsi sélectionné des molécules appartenant à la classe des

benzodiazépines : la carbamazépine et le diazépam (Tableau 4). Le diazépam est un antidépresseur

fréquemment utilisé en médecine humaine et pourrait l‘être encore davantage. En effet, les

antidépresseurs sont de plus en plus utilisés dans notre société et la dépression pourrait être la

deuxième maladie dans le monde d‘ici 2020 (Khetan et Collins 2007). Le diazépam agit sur le

système nerveux central, il a des propriétés anxiolytiques, sédatives et un effet relaxant sur les

muscles (Nunes et al. 2005, Khetan et Collins 2007). La carbamazépine est l‘un des antiépileptiques

les plus utilisés (Nghiem et al. 2006). Après chaque ingestion, 3 % de cette molécule sont excrétés

inchangés et c‘est le composé pharmaceutique le plus persistant détecté dans l‘environnement

(Khetan et Collins 2007, Brun et al. 2006, Nghiem et al. 2006). C‘est pourquoi cette molécule est

retrouvée fréquemment dans les cours d‘eau et a déjà été observée au niveau du µg.L-1

dans des

effluents de station d‘épuration et dans des eaux de surface (Lam et Mabury 2005). De plus, ces deux

composés ont un fort intérêt environnemental puisque leurs toxicités vis-à-vis de certains organismes

aquatiques ont été démontrées individuellement ou en présence d‘autres composés (Oetken et al.

2005, Cleuvers 2003, Nunes et al. 2005).

IV.2. Techniques analytiques disponibles

Plusieurs techniques peuvent être utilisées pour l‘étude des interactions entre les

contaminants organiques et la MOD : des méthodes spectroscopiques (e. g. spectrofluorimétrie), des

méthodes séparatives (e. g. dialyse, ultrafiltration) ou des techniques basées sur des affinités avec

une phase organique (e. g. échantillonneurs passifs, micro-extraction sur phase solide,

Composé Formule

Masse

molaire

(g.mol-1

)

Moment

dipolaire (D)

Solubilité

(mg.L-1

)

pKa

(20 °C)

Log

KOW

Diazépam

284,7 3,26 50 3,3 2,99

Carbamazépine 236 1,67 17,7 < 1-13,9 2,45

Tableau 4. Propriétés physico-chimiques du diazépam et de la carbamazépine (Luo et al. 1998, Machatha et

Yalkowsky 2004, Li et al. 2005, Sila-On et al. 2008, Comerton et al. 2007, Cleuvers 2003, Löffler et al. 2005).


46

chromatographie sur phase inverse). Les techniques utilisées sont généralement soit appropriées à

l‘étude de la MOD et on regarde l‘effet de l‘ajout de contaminant, soit appropriées à l‘étude des

contaminants et on regarde l‘effet de l‘ajout de MOD. Les techniques les moins invasives sont les

techniques spectroscopiques puisque l‘échantillon n‘est pas modifié, il est juste observé. Pour les

autres techniques, il y a introduction d‘outils ou de phase dans le milieu, ce qui peut perturber

l‘équilibre contaminant - MOD de façon plus ou moins marquée. Les techniques les plus anciennes et

toujours utilisées sont l‘extinction de fluorescence (Gauthier et al. 1986, Pan et al. 2007b), la dialyse

(Carter et Suffet 1982, Akkanen et al. 2005a) et la séparation sur phase inverse (Landrum et al. 1984,

Brown et Peake 2003). Plus récemment, la micro-extraction sur phase solide (SPME) a montré son

adéquation pour ces études (Poerschmann et al. 1997) et encore plus récemment, les

échantillonneurs passifs ont permis de mettre en évidence ces interactions mais ne sont qu‘au début

de leur développement (Tusseau-Vuillemin et al. 2007). Les échantillonneurs passifs sont constitués

d‘une phase liquide (e.g. les SPMD (Semi-Permeable Membrane Device)) ou solide (e.g. les POCIS

(Polar Organic Chemical Integrative Sampler)) qui, par diffusion, permettent la concentration des

contaminants organiques initialement présents dans un milieu aqueux. Les phases absorbantes ou

adsorbantes étant entourées de membranes, ces échantillonneurs ne capteraient que les

contaminants libres dans l‘eau et pas ceux associés à la MOD ou aux particules. Ces outils pourraient

donc permettre la quantification de la fraction libre des contaminants directement dans le milieu

naturel et donc in fine le calcul des KDOC. D‘autres techniques peuvent également être utilisées,

comme l‘augmentation de solubilité aqueuse (Chiou et al. 1986), la floculation (Laor et Rebhun 1997),

l‘électrophorèse capillaire (Lucio et Schmitt-Kopplin 2006), la microcalorimétrie (Hesketh et al. 1996)…

Parmi toutes ces techniques, toutes présentent des inconvénients plus ou moins majeurs. Par

exemple, avec la technique de floculation, la matière organique ainsi que les contaminants associés

sont précipités par l‘ajout de cations polyvalents puis séparés de la phase aqueuse ; on peut

cependant aisément supposer que l‘ajout de ces cations modifie l‘équilibre préexistant entre

contaminants et matière organique. La séparation sur phase inverse modifie également les équilibres

puisque les résultats sont systématiquement surestimés par cette technique par rapport à d‘autres qui

sont inertes vis-à-vis des équilibres comme la dialyse (Kukkonen et Pellinen 1994). Le principe de la

dialyse est la séparation de la matière organique de la phase aqueuse permettant d‘isoler les HAP

librement dissous dans l‘eau de ceux associés à la matière organique. Cette séparation est faite grâce

à une membrane de seuil de coupure adapté et la force motrice de la séparation est la diffusion, ce

qui permet de ne pas modifier les équilibres. Cependant, la dialyse, comme l‘ultrafiltration présente

d‘autres inconvénients puisque les contaminants organiques hydrophobes s‘adsorbent sur les

membranes causant la perte de certains composés et rendant l‘analyse des contaminants libres plus

difficile (Woolgar et Jones 1999, Heringa et Hermens 2003). Les techniques qui semblent les plus

prometteuses sont l‘extinction de fluorescence et la SPME de par leur simplicité d‘utilisation et leurs

nombreux avantages tels que rapidité, nécessité de faibles volumes d‘échantillons et coût

relativement faible.


47

IV.3. Objectifs de l’étude

De par leur présence dans l‘environnement et leur toxicité vis-à-vis de certains organismes,

l‘étude du comportement des HAP et des médicaments, et plus particulièrement l‘étude de leurs

interactions avec la MOD, nous a paru très intéressante à mettre en œuvre. Les HAP semblent être

de bons modèles du comportement des contaminants hydrophobes alors que les médicaments

pourraient permettre d‘étoffer les connaissances concernant les interactions entre la MOD et les

contaminants organiques plus hydrophiles.

Avant de s‘intéresser aux interactions entre les contaminants organiques et la MOD, il a

d‘abord été nécessaire de choisir les outils analytiques les plus appropriés à cette étude et de les

développer (publications n°1 et 2), avant de pouvoir compléter les connaissances déjà bien avancées

à ce sujet. Trois techniques nous ont paru les plus appropriées : la SPME, l‘extinction de fluorescence

et la dialyse. Ces techniques ont dans un premier temps dû être développées pour l‘étude des

interactions des HAP avec la MOD commerciale afin de pouvoir valider les outils par comparaison

avec les données de la littérature (publication n°3). Une fois ces techniques développées, elles ont

permis l‘étude des interactions HAP-MOD pour différents types de MOD dans différentes conditions

environnementales dans le but d‘améliorer les connaissances quant aux mécanismes intervenant

dans ces interactions (publication n°4 et 5).

Après l‘étude des interactions sur des échantillons dont les propriétés physico-chimiques

étaient en grande partie contrôlées au laboratoire, le but ultime était de pouvoir appliquer les outils

développés à l‘étude des interactions directement dans le milieu naturel (publication n°5). Le site du

Bassin d‘Arcachon a été choisi dans cet objectif car plusieurs projets ont déjà permis de mettre en

évidence une faible contamination ubiquitaire en HAP. D‘autre part, les eaux interstitielles, à l‘interface

entre le sédiment et la colonne d‘eau, sont intéressantes pour l‘étude des interactions HAP-MOD

puisque les HAP et la MOD s‘y trouvent en quantités plus importantes que dans la colonne d‘eau.

Ainsi les interactions HAP-MOD dans cette zone de transition pourraient conditionner en partie le rôle

de source ou de puits de contaminants du sédiment vis-à-vis de la colonne d‘eau. L‘étude des

interactions HAP-MOD dans les eaux interstitielles pourraient donc permettre de mieux appréhender

le rôle de la MOD sur la distribution des HAP dans le Bassin d‘Arcachon.

Les techniques analytiques développées pour les HAP ont ensuite été transférées à l‘étude

des interactions entre les substances pharmaceutiques et la MOD (publication n°6). L‘étude des

interactions entre les benzodiazépines et la MOD en est à ses débuts et le but de ces travaux de

thèse était donc d‘étudier les interactions de la carbamazépine et du diazépam avec des MOD

commerciales et naturelles de différentes origines et de développer les outils analytiques nécessaires

afin (1) d‘établir si oui ou non il y a interactions, (2) le cas échéant, de quantifier ces interactions, et

enfin (3) de déterminer quelles fractions caractéristiques de la MOD sont mises en jeu dans ces

interactions.

49

Chapitre 2 : matériels et méthodes


51

Dans cette partie, seuls sont détaillés les échantillons, les principes des techniques et les

moyens opératoires, les spécificités des outils et des contaminants étant donnés dans les articles du

chapitre 3 et dans les annexes techniques.

Ces travaux de thèse se caractérisent par l‘utilisation de plusieurs outils analytiques pour

divers objectifs. Les techniques d‘extraction et d‘analyse des contaminants organiques qui ont permis

leur quantification sont détaillées dans une première partie. Les techniques spectroscopiques qui ont

été utilisées pour la caractérisation de la MOD sont explicitées dans une seconde partie. Certaines

des techniques utilisées ont été adaptées à l‘étude des interactions entre les contaminants organiques

et la MOD. Les formules nécessaires aux calculs des coefficients de partition permettant la

quantification des interactions contaminants organiques – MOD sont données dans une troisième

partie. Les échantillons utilisés sont détaillés dans une quatrième partie. Enfin, la méthodologie des

plans d‘expériences est expliquée dans une cinquième partie.

I. Techniques de dosage des contaminants organiques dans l’eau

Le dosage des contaminants organiques dans des matrices environnementales complexes se

fait en plusieurs étapes : tout d‘abord les contaminants sont extraits de leur matrice environnementale

puis sont analysés (par spectrométrie de masse par exemple) après avoir été séparés par

chromatographie en phase gazeuse ou en phase liquide. De plus, pour certains échantillons, il est

nécessaire d‘ajouter une étape de purification afin d‘isoler au mieux le contaminant.

I.1. Techniques usuelles d’extraction

I.1.1. L’extraction liquide-liquide (LLE)

Plusieurs techniques peuvent être utilisées pour extraire les contaminants organiques d‘un

milieu aqueux. La technique la plus ancienne et la plus simple est l‘extraction liquide-liquide.

L‘extraction liquide-liquide est un procédé physique permettant la séparation d‘un ou plusieurs

constituants en utilisant leur différence de solubilité dans deux liquides non miscibles. Pour l‘extraction

des HAP dans l‘eau, un solvant organique non miscible avec l‘eau et ayant une forte affinité pour les

HAP est utilisé : le dichlorométhane. Après décantation, seule la phase organique contenant les HAP

est récupérée puis séchée pour enlever les traces d‘eau restantes (protocole donné dans l‘annexe

technique n°1). Cette technique nécessite des quantités de solvant assez importantes et devient

rapidement laborieuse en présence de nombreux échantillons ou de volumes d‘eau importants (> 1L).

Du fait des faibles concentrations en contaminants organiques dans l‘environnement aquatique, il est

apparu nécessaire de développer une technique permettant l‘analyse de gros volumes d‘eau ; c‘est

ainsi que l‘extraction sur phase solide ou SPE a vu le jour.


52

I.1.2. L’extraction sur phase solide (SPE)

La SPE est aujourd‘hui la technique la plus utilisée pour l‘extraction d‘échantillons aqueux

environnementaux (Hennion 1999). De par son facteur de concentration très important (plusieurs litres

d‘eau peuvent être ramenés à quelques µL de solvant), la SPE permet l‘analyse d‘échantillons ayant

des concentrations en composés d‘intérêt de l‘ordre du ng.L-1

sans difficulté.

Le principe de la SPE repose sur l‘affinité des contaminants avec une phase adsorbante

solide et l‘utilisation de différents mélanges de solvants pour ne récupérer que les contaminants

désirés, sans les impuretés de la matrice. La grande sélectivité de la SPE est également un avantage

par rapport à l‘extraction liquide-liquide.

Il existe de nombreuses phases adsorbantes, la première et la plus utilisée pendant

longtemps est la silice greffée C18. Cette phase permet l‘extraction sans difficulté particulière des

analytes apolaires à moyennement polaires (Hennion 1999). Les analytes ioniques ou ionisables

peuvent être extraits par des phases de paires d‘ions ou d‘échanges d‘ions. Il existe également des

cartouches en adsorbant dit mixte. Ce sont généralement des cartouches de phase inverse contenant

des groupements ioniques (par exemple échangeur de cations – phase inverse pour Oasis® MCX).

Ces phases sont généralement utilisées pour l‘extraction de molécules pharmaceutiques contenant

des groupements azotés basiques qui peuvent être protonés à faible pH (e. g. NH4+) (Hennion 1999).

La phase adsorbante est prise entre deux filtres au sein de la cartouche. Pour que le rendement

d‘extraction soit optimal, la phase doit, dans un premier temps, être conditionnée avec le passage de

solvant qui permet d‘activer les sites d‘adsorption. Ensuite l‘échantillon est transféré dans la cartouche

à un débit ni trop lent ni trop rapide (environ 5-10 mL.min-1

) pour que les interactions avec la phase

aient le temps de se faire. Selon l‘échantillon, il peut être nécessaire de faire une étape de lavage

pour enlever des impuretés de la matrice. De plus en plus, cette étape est réalisée lors de l‘élution en

utilisant des solvants et des mélanges de solvants assez sélectifs pour ne retenir que les analytes

sans les impuretés. L‘éluat est ensuite injecté en chromatographie en phase liquide ou en phase

gazeuse tel quel ou après reconcentration. La SPE peut également être automatisée et couplée à la

chromatographie (Hennion 1999).

Les conditions opératoires utilisées dans ces travaux pour l‘extraction par SPE des HAP et

des substances pharmaceutiques sont données dans les annexes techniques n°2 et 3

respectivement.

I.1.3. La micro-extraction sur phase solide (SPME)

La SPME a été introduite au début des années 1990 dans le but de faciliter la préparation de

l‘échantillon et l‘extraction des contaminants à la fois en laboratoire et sur le terrain (Lord et Pawliszyn

2000). Depuis, de nombreuses améliorations ont vu le jour et la SPME peut aujourd‘hui être


53

automatisée, couplée à des chromatographes en phase gazeuse ou en phase liquide et de nombreux

contaminants peuvent être analysés grâce à cette technique.

I.1.3.1. Analyse des contaminants organiques

La SPME est une méthode d‘extraction sans solvant, automatisable et sensible du fait de sa

capacité à concentrer les composés et de sa méthode d‘injection (limites de détection de l‘ordre du

ng.L-1

). Elle permet de réduire la durée de l‘analyse de manière significative en combinant l‘extraction,

la concentration et l‘injection dans un chromatographe en un processus simple. Son coût est

également réduit de par la faible verrerie nécessaire et la réutilisation d‘une même fibre pour plusieurs

échantillons.

I.1.3.1.1. Principe et fonctionnement

Une fibre de silice fondue enrobée d‘un revêtement en polymère est plongée dans un

échantillon où les analytes vont se distribuer entre la fibre et l‘échantillon jusqu‘à atteindre un équilibre

(Lord et Pawliszyn 2000). La fibre est ensuite retirée de l‘échantillon puis introduite généralement dans

l‘injecteur d‘un chromatographe en phase gazeuse, où les analytes sont désorbés thermiquement et

entraînés sur la colonne du chromatographe (Figure 6). Une interface permettant le couplage de la

SPME avec la chromatographie en phase liquide a plus récemment été développée dans le but

d‘analyser également les contaminants non volatils et thermiquement instables. Cette interface permet

à la fibre d‘être introduite dans la chambre de désorption du chromatographe à pression ambiante

ainsi que l‘introduction d‘un solvant de désorption, l‘ensemble pouvant être chauffé pour faciliter la

désorption (Lord et Pawliszyn 2000). On trouve aussi des applications où la fibre est désorbée par

exposition à du solvant et où l‘extrait est ensuite analysé par chromatographie en phase liquide ou en

phase gazeuse. Ce mode de désorption est notamment employé lorsque la SPME est utilisée en

mode manuel et non en automatique (Durjava et al. 2007, Ter Laak et al. 2006 a et b, Cornelissen et

al. 2008).


54

I.1.3.1.2. Choix de la fibre

La SPME doit sa sensibilité et sa sélectivité en grande partie à la nature du polymère qui

constitue la fibre. Il existe aujourd‘hui près de 50 sortes de fibres SPME si l‘on tient compte des

calibres d‘aiguille, de la conception de l‘assemblage du polymère et du polymère lui-même qui sont

disponibles. Les premières fibres automatisables commercialisées sont constituées de silice avec le

polymère greffé directement dessus. Elles ont de bonnes capacités d‘adsorption mais elles sont

fragiles et peuvent casser facilement lors de l‘introduction de la fibre dans le septum de l‘échantillon

ou lors de l‘injection. Pour améliorer la durabilité des fibres, il est nécessaire que le cœur de la fibre

soit rétracté dans l‘aiguille lors de ces moments où une forte pression peut être exercée sur la fibre.

Cependant, même l‘aiguille rétractée, la pression peut être telle que l‘aiguille contenant le cœur de la

fibre se courbe et finisse par se casser. C‘est pourquoi des aiguilles d‘un diamètre plus important avec

un cœur de fibre plus gros ont été conçues, ce sont les fibres de gauge 23 (contre 24 pour les

premières). Les fibres de gauge 24 dépassent rarement les 100 cycles d‘extraction alors que celles

qui sont plus épaisses dépassent généralement les 300 cycles. De plus, les fibres de plus gros calibre

sont compatibles avec un injecteur sans septum (comme le système Merlin Microseal), qui permet

d‘éviter la perforation du septum lors de l‘injection et donc un stress supplémentaire sur la fibre et une

perte de morceaux de septum vers la colonne (Pawliszyn et Pedersen-Bjergaard 2006). Afin

d‘améliorer encore plus la durabilité des fibres, un nouvel assemblage composé d‘une fine couche de

polymère souple entre la silice et le revêtement a vu le jour. Cette configuration appelée StableFlex

Figure 6. Schéma de principe de la SPME couplée à la GC-MS.


55

permet une meilleure souplesse du cœur de la fibre (Gonçalves et Alpendurada 2002). Plus

récemment, des fibres en métal ont vu le jour ; celles-ci sont encore plus résistantes grâce à l‘alliage

flexible et inerte qui compose l‘aiguille et le cœur de la fibre (au lieu de la silice) (Pawliszyn et

Pedersen-Bjergaard 2006). Pour ces différentes sortes de fibres, les paramètres qui ont le plus

d‘importance pour l‘extraction restent la nature du polymère et son épaisseur.

I.1.3.1.3. Nature du revêtement

La nature du revêtement détermine le mécanisme d‘extraction des analytes de l‘échantillon :

soit de l‘absorption, soit de l‘adsorption. Les revêtements absorbants sont des polymères liquides,

principalement des gommes qui agissent un peu comme des éponges, où les analytes vont se répartir

à l‘intérieur et à l‘extérieur (Figure 7). Les revêtements adsorbants sont généralement poreux et

retiennent les analytes soit par interactions avec la surface (grâce à des interactions - par exemple),

soit par piégeage dans les pores (Lord et Pawliszyn 2000).

Il existe plusieurs polymères commerciaux (Figure 8), certains sont absorbants (e.g.

polydiméthylsiloxane ou PDMS, polyacrylate ou PA) et d‘autres sont adsorbants (e.g. divinylbenzène

ou DVB). Les polymères poreux sont greffés sur des polymères absorbants et il peut y avoir plusieurs

revêtements adsorbants sur une même fibre. Toutes ces combinaisons permettent une grande

sélectivité vis-à-vis de l‘analyte.

Figure 8. Exemples de revêtements commerciaux.

(petits

pores)

(grands pores) (petits pores)

Figure 7. Schéma de l’extraction par des phases absorbantes vs adsorbantes (Lord et Pawliszyn 2000).

PEG DVB PDMS

CH2 CH2 O

n n

Si

CH3

CH3

O

n


56

Pour choisir le polymère adapté à l‘analyte et à l‘échantillon, il faut prendre en compte

plusieurs paramètres : la masse moléculaire de l‘analyte et sa polarité mais aussi sa concentration et

la complexité de l‘échantillon. En effet les petites molécules migrent plus facilement vers le polymère

et sont moins retenues que les grosses molécules. Pour les molécules inférieures à 150 uma (unités

de masse atomique), il est préférable d‘utiliser un revêtement adsorbant si elles sont présentes à de

très faibles concentrations. Pour les molécules plus grosses, il est généralement conseillé d‘utiliser

des phases absorbantes. Cependant, la forme et la configuration des molécules sont également

importantes. Des molécules avec des structures planes non substituées peuvent interagir avec le

revêtement par des interactions -. Par exemple, les HAP qui ont une structure assez rigide due à

leurs noyaux aromatiques, ont de fortes interactions et se comportent comme si leurs masses

moléculaires étaient 30 à 50 uma supérieures (Shirey 2007). Le contraire se produit pour des

molécules fortement substituées, et ce d‘autant plus que le substituant est électronégatif. Pour les

HAP, il peut donc être intéressant d‘utiliser des polymères contenant du DVB, mais si les interactions

avec l‘adsorbant sont trop fortes, les analytes se désorbent mal et la sensibilité est de ce fait diminuée

(Shirey 2007). Avec des polymères plus épais, la désorption est plus lente mais la sensibilité est

souvent meilleure (Lord et Pawliszyn 2000). En plus de la taille des molécules, il faut tenir compte de

leur polarité. Les molécules polaires inférieures à 80 uma sont préférentiellement extraites avec un

polymère PDMS-carboxène (Shirey 2007). Les autres analytes polaires peuvent être facilement

extraits avec des fibres en PA. Une fibre en PA permet également d‘extraire des composés moins

polaires mais aromatiques, pour lesquels elle a de bonnes affinités. Récemment, un revêtement en

polyéthylène glycol (PEG) a été développé pour l‘extraction très sélective de composés polaires et

donnerait de meilleurs résultats que le PA ou le carbowax-DVB, jusque là les plus utilisés pour ces

molécules (http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/ Supelco /Product_Information_Sheet/

t407068.Par.0001.File.tmp/t407068.pdf). La fibre PDMS 100 µm, elle, ne convient pas aux composés

polaires. Pour les polymères poreux (les polymères adsorbants), il faut prendre en compte le fait qu‘ils

ne conviennent qu‘à de faibles concentrations en analytes, pour des temps d‘extraction courts, pour

éviter les phénomènes de compétition entre analytes (Lord et Pawliszyn 2000). Leur capacité est très

limitée et leur gamme linéaire assez faible ; ces polymères ne conviennent donc généralement qu‘à

des matrices propres ou de composition constante. Pour les mêmes raisons, un mélange complexe

contenant des composés inconnus ou des gammes de concentrations très différentes pour plusieurs

analytes doit plutôt être extrait à l‘aide d‘une phase absorbante (Lord et Pawliszyn 2000).

Il faut donc faire un compromis entre de nombreux paramètres pour choisir la fibre la plus

appropriée. Le développement de la SPME ainsi que la comparaison avec les deux autres techniques

d‘extraction détaillées précédemment (LLE et SPE) pour l‘extraction des HAP sont développés dans

les publications n°1 et 2. Les conditions d‘extraction par SPME sont données dans l‘annexe technique

n°4.

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/


57

I.1.3.1.4. Dosage par SPME

Lorsque l‘équilibre entre les composés et la fibre est atteint et tant que les paramètres

d‘échantillonnage (agitation, température…) sont attentivement contrôlés et parfaitement

reproductibles, la quantité d‘analytes extraits par la fibre est proportionnelle à la concentration du

composé dans l‘échantillon (Lord et Pawliszyn 2000). Le rendement d‘extraction varie également avec

le temps d‘extraction de façon linéaire jusqu‘à ce qu‘un plateau soit atteint, représentatif de l‘équilibre

entre les composés et la fibre ou d‘une saturation de cette dernière. Afin de diminuer le temps

d‘analyse, il est possible de se placer à un temps d‘immersion inférieur à la durée nécessaire pour

atteindre cet équilibre, s‘il est parfaitement reproductible, et de conserver la linéarité entre la

concentration en analytes de l‘échantillon et le signal obtenu après analyse (Lord et Pawliszyn 2000).

I.1.3.2. Étude des interactions avec la MOD

L‘un des avantages de la SPME est qu‘elle permet d‘obtenir plusieurs informations

simultanément lors d‘un dosage. En effet, il a été montré que la SPME n‘extrait que les analytes sous

forme libre dans l‘eau (Porschmann et al. 1998, King et al. 2004, Poerschmann et al. 1997). Donc

théoriquement si la SPME est calibrée avec des solutions aqueuses de concentrations connues en

analytes, la quantification par étalonnage externe fournira uniquement les valeurs des concentrations

en analytes libres dans l‘échantillon. Par ailleurs, l‘étalonnage interne permet de déterminer la

concentration totale en analytes dans l‘échantillon. En effet, si des étalons internes sont ajoutés à

l‘échantillon en quantité connue avant l‘extraction et s‘ils se comportent comme les composés étudiés,

les quantités d‘analytes totales pourront être déterminées par comparaison avec les résultats obtenus

pour les étalons internes (Porschmann et al. 1998, King et al. 2004, Poerschmann et al. 1997). Le

choix des étalons internes est donc très important : ceux-ci doivent avoir un comportement le plus

proche possible des analytes. Les isotopes correspondants aux composés à doser (par exemple des

molécules contenant des atomes de 2H au lieu des

1H) sont à priori les meilleurs étalons internes

possibles puisque les molécules ont les mêmes propriétés chimiques mais des masses différentes.

Les étalons internes deutérés et les composés natifs devraient donc se comporter de la même façon

dans l‘échantillon vis-à-vis de la MOD mais leur différenciation lors de l‘analyse pourra se faire par

spectrométrie de masse (qui permet l‘identification des molécules selon leur masse). La quantification

par SPME des HAP en présence de MOD et l‘utilisation des différents étalonnages sont développées

dans la publication n°3.

A partir de la concentration totale en contaminants (contaminants libres + contaminants

associés à la MOD) et de la concentration en contaminants libres, il sera aisé d‘en déduire les

quantités de contaminants piégés sur la MOD. De plus, il semblerait que, si le volume de l‘échantillon

est assez important (10 mL) devant le volume de la fibre (PDMS 100 µm : 0,612 µL), la SPME puisse

extraire les analytes sans changer significativement leur concentration dans l‘échantillon (Hawthorne

et al. 2005, Porschmann et al. 1998). Ceci est très intéressant et nécessaire pour l‘étude des

interactions étant donné que si la SPME extrait trop de contaminants libres, il peut se créer un


58

déséquilibre entre les contaminants libres et associés à la MOD puisque ces derniers vont alors

essayer de se dissocier pour combler le vide créé en contaminants libres dans l‘échantillon (Figure 9).

Figure 9. Schéma des équilibres entre contaminants libres et associés à la MOD a) non modifiés par la SPME, b)

modifiés par une extraction excessive des contaminants libres par la fibre.

Pour être quantitative, la SPME, dans ces travaux, a été utilisée en couplage avec la

chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse simple ou en tandem.

I.2. Méthodes d’analyses chromatographiques

Étant donnée la complexité des échantillons naturels, tant au niveau de la présence de

multiples contaminants que de la charge matricielle, il est nécessaire de différencier les analytes pour

permettre leur identification. Les analytes pouvant être nombreux mais à de faibles concentrations

dans les échantillons naturels, des méthodes robustes et sensibles comme la chromatographie

doivent être utilisées. La chromatographie, qu‘elle soit en phase liquide ou en phase gazeuse, permet

la séparation d‘analytes à des niveaux traces avec une bonne résolution et l‘identification des

composés grâce au couplage avec des techniques analytiques telles que la spectrométrie de masse

par exemple.

I.2.1. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-

MS)

Après l‘extraction des composés, la chromatographie en phase gazeuse couplée à la

spectrométrie de masse (GC-MS) est un bon outil pour la quantification de composés organiques peu

polaires à l‘état de traces. Le rôle du chromatographe est de séparer les composés présents dans

l‘extrait. La chromatographie en phase gazeuse est réservée à l‘analyse de composés volatils ou

volatilisables et thermiquement stables. Le chromatographe en phase gazeuse est constitué de trois

modules : un injecteur, une colonne capillaire qui sépare les composés selon leur polarité et un

détecteur. Le détecteur utilisé dans cette étude est un spectromètre de masse.

Dans le cadre de ces travaux, l‘injecteur est une chambre de vaporisation. Cette chambre est

constituée d‘un insert ou liner en verre qui permet un transfert directement vers la colonne, d‘un

septum qui permet de l‘isoler de l‘extérieur et d‘un plancher qui permet de faire l‘interface avec la


59

colonne. Lors de l‘injection de l‘échantillon, les analytes et le solvant sont instantanément vaporisés

de par les températures très élevées de l‘injecteur (généralement entre 230 et 280 °C). Une fois

vaporisées, les molécules sont entraînées en tête de colonne par un gaz vecteur (ici de l‘hélium).

Lorsque les échantillons analysés sont faiblement concentrés, tout ce qui est injecté est transféré vers

la colonne, c‘est le mode « splitless » (sans division). Ce mode est généralement utilisé pour les

analyses de contaminants traces afin d‘obtenir une sensibilité maximale. Lorsque des échantillons

sont très concentrés, on préfèrera utiliser le mode « split » (avec division) où seule une fraction de

l‘échantillon est entraînée vers la colonne. Une fois en tête de colonne, les molécules se

recondensent puisqu‘elles sont alors soumises à des températures beaucoup plus faibles (10 – 20 °C

inférieure à la température d‘ébullition du solvant) autour de 50 – 60 °C. A partir de là, un gradient de

température est appliqué dans le four pendant le temps nécessaire à ce que tous les composés

présents dans l‘échantillon aient traversé la colonne. Les colonnes utilisées sont généralement des

colonnes capillaires qui sont des tubes creux et étroits en silice dont la paroi interne est recouverte

d‘une phase stationnaire. La polarité de cette phase impose la sélectivité de la séparation puisque

selon la polarité des analytes, ceux-ci interagissent plus ou moins longtemps avec la phase et les

temps de rétention dans la colonne sont ainsi différents d‘un composé à un autre. La phase

stationnaire utilisée dans ces travaux est en silice greffée 5 % méthyl 95 % phényl polysiloxane. Cette

phase hydrophobe permet la séparation et l‘élution des composés les moins hydrophobes en premier

puisque ceux-ci ont moins d‘affinité avec la phase stationnaire.

La sortie de la colonne est directement reliée au spectromètre de masse qui est utilisé ici

comme détecteur. Le spectromètre de masse permet l‘identification et la quantification des analytes. Il

existe de nombreux types de spectromètres de masse ; tous ont en commun trois éléments : une

source, un analyseur et un détecteur. La source permet la production des ions à partir des molécules

introduites. La technique d‘ionisation la plus largement utilisée est l‘ionisation par impact électronique :

un filament est chauffé suffisamment pour fabriquer des électrons qui sont ensuite accélérés par un

champ électrique de 70 V. Ces électrons ont alors la possibilité d‘entrer en collision et d‘interagir avec

les analytes présents sous forme gazeuse provoquant ainsi leur ionisation. L‘analyseur sépare ensuite

les ions produits par la source en fonction de leur rapport masse sur charge (m/z) grâce à un champ

électrique et/ou magnétique. Les analyseurs les plus courants sont le quadripôle, l‘analyseur à temps

de vol et le piège ionique. Dans ces travaux, toutes les analyses ont été effectuées avec un

quadripôle. Celui-ci tient son nom des quatre barreaux cylindriques parallèles qui le composent.

Chaque barreau opposé est chargé au même potentiel, ce qui permet de créer un champ électrique

hyperbolique, et la variation de ce potentiel permet de modifier les trajectoires des ions qui diffèrent

selon leur rapport m/z. En sortie du quadripôle, le rôle du détecteur est triple : détecter les ions

proportionnellement à leur nombre, transformer le signal ionique en signal électronique et amplifier le

courant correspondant pour le rendre détectable par l‘électronique du système.

Pour l‘analyse quantitative avec un quadripôle, le spectromètre de masse est utilisé en mode

« Selected Ion Monitoring » (SIM) : seuls les ions caractéristiques des analytes étudiés d‘un rapport


60

m/z donné sont détectés. Les autres ions vont heurter les électrodes ou les parois internes du

spectromètre ; ils se déchargent et sont entraînés par le système de pompage. Le gain en sensibilité

est important car le mode SIM augmente le signal associé à la détection des analytes tout en

diminuant le bruit de fond du système. Pour améliorer la sélectivité et la sensibilité, il est possible

d‘utiliser la spectrométrie de masse en tandem en couplant plusieurs analyseurs ou en utilisant un

piège ionique. Seul le triple quadripôle a été utilisé et sera détaillé ici. Le triple quadripôle, comme son

nom l‘indique, est constitué de trois quadripôles : le premier (Q1) permet de sélectionner un ou

plusieurs ions (les ions précurseurs), le deuxième (Q2) est en fait une cellule de collision qui permet

de fragmenter les ions sélectionnés et le troisième (Q3) est l‘analyseur qui détecte les ions fils produits

(ou ions fragments). Un triple quadripôle peut s‘utiliser dans différents modes selon le but de l‘analyse

(Figure 10).

Le mode « spectre des ions précurseurs » permet de rechercher les ions précurseurs qui

donnent un ion fils spécifique. Le mode « spectre des ions fragments » permet d‘identifier tous les ions

fils produits lors d‘une fragmentation d‘un ion précurseur spécifique. Le mode « spectre de perte de

neutres » permet de déterminer par un balayage approprié (décalage de Q1 par rapport à Q3 = masse

du neutre recherché) les ions précurseurs produisant une perte de masse (perte neutre) spécifique

lors de la fragmentation. Le mode « MRM » (Multiple Reaction Monitoring) permet de sélectionner

différents ions précurseurs spécifiques des analytes dans Q1 et des ions fils caractéristiques dans Q3.

Ce mode fait de la MS/MS la technique la plus sensible et la plus sélective pour quantifier des

analytes dans une matrice complexe puisque le bruit de fond observé avec un simple quadripôle en

mode SIM est quasiment éliminé. Le mode « spectre des ions fragments » est utilisé pour définir les

meilleurs ions fils d‘un ion précurseur spécifique d‘un composé qui seront choisis dans le mode MRM

pour les analyses quantitatives. En choisissant bien les ions fragments, les analytes ayant un même

ion précurseur (e.g. ion moléculaire) peuvent ainsi être différenciés.

Les conditions expérimentales des analyses par GC-MS et GC-MS/MS sont données dans les

annexes n°5 et 6 respectivement. Le développement de la spectrométrie de masse en tandem ainsi

Figure 10. Différents modes d’un triple quadripôle (d’après

http://www.waters.com/webassets/cms/category/media/detail_page_images/Quattro_micro_GC_detail_2.jpg).

Mode Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Mode Spectre des ions fragments

Mode Spectre des ions précurseurs

Mode Spectre des pertes neutres constantes


61

que son application au dosage des HAP dans des matrices environnementales chargées font l‘objet

des publications n°1 et 2.

Alors que la GC-MS est utilisée pour l‘analyse des HAP, les médicaments, après extraction

par SPE, sont analysés par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse

(LC-MS). En effet, même si les substances pharmaceutiques étudiées peuvent être analysées par

GC-MS, comme c‘est le cas après la SPME, la LC-MS apporte une meilleure sensibilité et est donc

utilisée après la SPE.

I.2.2. Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-

MS)

De la même façon que pour la GC-MS, la LC-MS est composée d‘un injecteur, d‘une colonne

qui permet la séparation des analytes et d‘un détecteur qui est un spectromètre de masse. La

différence réside dans le fait que la phase mobile n‘est pas un gaz inerte mais une phase liquide

(mélange de solvants) qui interagit, comme la phase stationnaire, avec les analytes. L‘appareillage est

de ce fait différent puisque l‘échantillon n‘a pas besoin d‘être vaporisé lors de son injection ; d‘autre

part des pompes sont nécessaires pour forcer le passage de la phase mobile à travers la colonne et

celle-ci doit pouvoir supporter le passage de solvants à hautes pressions. Le mode d‘ionisation en

sortie de colonne et avant l‘analyse par spectrométrie de masse est également différent puisque

l‘échantillon est alors en phase liquide. La configuration chromatographique utilisée dans ces travaux

est décrite dans l‘annexe 7.

Dans ces travaux, l‘extrait organique est injecté en mode automatique dans une boucle

d‘injection, qui permet l‘injection d‘un volume exact. La phase mobile est polaire en mode gradient

d‘élution (mélange de solvants de composition variable au court de l‘analyse). La phase stationnaire

est apolaire (chromatographie dite de phase inverse) ; la colonne est remplie de microsphères

poreuses de silice greffé de groupements C18 (groupements diisobutyloctadécylsilanes). Les

composés les plus polaires sortent donc en premier de la colonne dans cette configuration. La LC a

été utilisée couplée à un triple quadripôle de même fonctionnement que celui utilisé en GC-MS/MS

mais avec une source d‘ionisation différente. En effet, en sortie de colonne, l‘échantillon a été nébulisé

(divisé en très fines gouttelettes) à pression atmosphérique par la technique d‘ionisation par

électronébuliseur ou ESI (de l‘anglais electrospray ionization). Une fois formées, les gouttelettes sont

portées à un potentiel élevé (positif ou négatif selon si l‘on étudie les ions positifs ou négatifs) qui leur

confère une charge. Après le passage d‘un gaz sec (N2), les molécules de solvant contenues dans les

gouttelettes s‘évaporent provoquant une augmentation progressive de leur densité de charge (rapport

z/m très grand) et leur explosion en plus petites gouttelettes et ainsi de suite jusqu‘à transformation

des analytes en ions moléculaires très chargés. Ceux-ci sont ensuite prêts à être analysés par le

spectromètre de masse.


62

I.2.3. Quantification par chromatographie couplée à la spectrométrie de masse

La quantification est généralement effectuée par étalonnage interne. Les étalons internes sont

introduits dans l‘échantillon lors de l‘extraction et subissent donc les mêmes étapes de préparation de

l‘échantillon que les composés natifs. Les étalons internes sont choisis selon plusieurs critères

essentiels : ils doivent avoir un comportement physico-chimique semblable aux composés recherchés,

être absents des échantillons naturels et ne pas provoquer d‘interférences avec les analytes. Les

étalons internes les plus adaptés sont des isotopes stables (souvent des composés perdeutérés) des

analytes recherchés. Les étalons internes utilisés dans cette étude sont donnés dans l‘annexe

technique n°8.

Par étalonnage interne, les contaminants sont quantifiés en comparant les aires obtenues sur

les chromatogrammes avec celles obtenues pour les composés étalons introduits en quantités

connues. Cet étalonnage est basé sur la formule suivante :

Ai = Ki Ci (2.1)

où : Ai = aire du pic chromatographique de l‘analyte i

Ci = concentration de l‘analyte i

Ki = le facteur de réponse de l‘analyte i

Ce facteur de réponse propre à l‘analyte peut être déterminé relativement à un étalon interne

(Ae = Ke Ce), ce qui conduit à la formule suivante :

Ce

Ci

Ke

Ki

Ae

Ai (2.2)

Grâce à une solution de référence contenant les HAP et les étalons en quantités connues, le

coefficient de réponse Ki/Ke du système peut être déterminé. Il suffit ensuite d‘utiliser sa valeur pour

retrouver les concentrations des échantillons par la formule :

Ki

Ke

Ae

AiCeCi (2.3)

II. Techniques de caractérisation et de fractionnement de la MOD

La caractérisation précise des macromolécules qui composent la MOD étant à ce jour

impossible, la MOD est généralement étudiée par des techniques de dosage élémentaire (carbone,

oxygène, azote…) et des techniques spectroscopiques. Ces dernières sont très utilisées pour la

caractérisation de la MOD issue des milieux aquatiques car elles sont assez sensibles pour permettre

l‘étude de faibles volumes où la MOD est présente à l‘état de traces. Même si toutes les

macromolécules ne possèdent pas de propriétés optiques, l‘étude des chromophores et des

fluorophores permet de connaître quelques propriétés globales sur la composition de la MOD. Dans

ces travaux, la spectroscopie d‘absorption UV-visible a été utilisée pour la détermination rapide (en

quelques minutes) des propriétés générales de la MOD chromophorique et l‘acquisition de spectres

de fluorescence a permis une étude plus précise de la MOD.


63

II.1. L’absorption UV-visible

II.1.1. Principe de l’absorption UV-visible

La MOD possède de nombreux groupements fonctionnels appelés chromophores. Ces

molécules absorbent des photons de radiations UV et visible (généralement d‘environ 250 à 500 nm)

qui vont les exciter à des niveaux d‘énergie électronique plus élevés. Ces excitations électroniques

observées pour la MOD correspondent à des énergies d‘environ 250 à 500 kJ.mol-1

, caractéristiques

des transitions électroniques * et n*, les autres étant généralement trop énergétiques pour

être observées à ces longueurs d‘onde (Figure 11). Ces transitions électroniques peuvent donc avoir

lieu uniquement dans des molécules pourvues d‘électrons (doubles et triples liaisons, noyaux

aromatiques) et/ou d‘hétéroatomes possédant des électrons non liants.

Certaines molécules contenant des hétéroatomes ne sont cependant pas observables à ces

longueurs d‘onde comme par exemple les électrons non liants de l‘oxygène des fonctions éthers et

alcools. Ainsi, le méthanol étant transparent sur la gamme de longueurs d‘onde observées, il a été

utilisé comme solvant de dissolution des contaminants dans ces travaux. Les transitions électroniques

de différents groupements fonctionnels ayant des énergies différentes, il est théoriquement possible

de déterminer les chromophores présents dans l‘échantillon selon la longueur d‘onde de l‘absorbance.

Cependant, l‘environnement des atomes subissant l‘excitation électronique peut modifier les

longueurs d‘onde ainsi que la valeur de l‘absorbance. La présence de certains substituants et surtout

la conjugaison peuvent augmenter les longueurs d‘onde et l‘absorbance des molécules. Ainsi, les

molécules aromatiques ont des absorbances plus importantes et sont déplacées vers les grandes

longueurs d‘onde lorsque le nombre de noyaux aromatiques conjugués augmente. L‘une des

principales caractéristiques que le spectre d‘absorption peut permettre de déterminer est donc

l‘aromaticité d‘un échantillon. Certaines longueurs d‘onde ont ainsi été utilisées pour caractériser la

MOD. Par exemple, l‘aromaticité d‘un échantillon est souvent corrélée aux absorbances entre 270 et

280 nm (Perdue et Ritchie 2003, Thomsen et al. 2002). D‘autres auteurs utilisent l‘absorbance à 254

nm (Akkanen et al. 2005b, Borisover et al. 2006). De façon générale, les composés aromatiques

polycycliques, phénoliques et acides benzoïques absorbent entre 250 et 280 nm (Lepane et al. 2004).

Cependant, l‘absorbance dépend entre autre de la concentration de l‘échantillon et donc il n‘est pas

possible de comparer les absorbances de différents échantillons entre elles. En effet, d‘après la loi de

Beer-Lambert, on a :

Figure 11. Transitions électroniques entre orbitales moléculaires.

énerg

ie n*

*

n*

*

*

*

(liante)

* (antiliante)

(liante)

* (antiliante)

n (non liante)

UV-visible


64

cεI

IlogA λ

T

Oλ (2.4)

où A est l‘absorbance à la longueur d‘onde , IO est l‘intensité du rayonnement incident, IT est l‘intensité lumineuse transmise, λ

est la longueur du chemin optique parcouru dans l‘échantillon (en cm), c est la concentration de l‘échantillon (en mol.L-1) et

est le coefficient d‘extinction molaire à la longueur d‘onde (en L.mol-1.cm

-1).

Pour comparer les échantillons entre eux, on peut donc calculer les coefficients d‘extinction

molaire aux longueurs d‘onde choisies pour s‘affranchir de la concentration de l‘échantillon et de la

largeur de la cuve. Deux paramètres sont généralement utilisés pour caractériser l‘aromaticité d‘un

échantillon : le SUVA (équation 2.5) et le pourcentage d‘aromaticité (équation 2.6) (Chin et al. 1994) :

100[COD]

AbsSUVA 254 (2.5)

où Abs254 est l‘absorbance à 254 nm et [COD] est la concentration en COD en mg.L-1

.

6,74[COD]

Abs0,05é(%)aromaticit 280 (2.6)

où Abs280 est l‘absorbance à 280 nm et [COD] est la concentration en COD en mol.L-1

.

Des rapports d‘absorbances peuvent également être utilisés. Par exemple, le rapport appelé

E4/E6 équivalent à l‘absorbance à 465 nm divisée par l‘absorbance à 665 nm est souvent utilisé pour

caractériser la taille moyenne des macromolécules, puisque certains auteurs ont noté une diminution

du rapport E4/E6 lorsque la taille moyenne des macromolécules augmente (Thomsen et al. 2002). Un

autre rapport est souvent utilisé, E2/E3 (l‘absorbance à 250 nm divisée par l‘absorbance à 365 nm), qui

augmente quand l‘aromaticité diminue (Thomsen et al. 2002). La principale difficulté de l‘étude de la

MOD par cette technique repose sur le fait qu‘elle est constituée d‘une multitude de composés avec

des bandes d‘absorption élargies en raison de la superposition des transitions électroniques et que les

spectres sont de ce fait très mal résolus.

II.1.2. Présentation du spectrophotomètre

Le spectrophotomètre UV-visible utilisé (Jasco V-560) est équipé d‘un tube à décharge au

deutérium (190 à 350 nm) et d‘une lampe à incandescence à filament de tungstène (330 à 900 nm),

d‘un double monochromateur (réseau plan) pour la sélection des longueurs d‘onde et d‘un

photomultiplicateur (qui permet de transformer l‘intensité lumineuse reçue en un signal électrique)

comme détecteur. Bien que l‘appareil fonctionne en mode double faisceau, il est utilisé en mode

simple faisceau : le signal de référence (cuve + solvant) n‘est pas acquis simultanément avec

l‘échantillon mais avant l‘échantillon et soustrait manuellement afin d‘utiliser exactement la même cuve

dans les deux acquisitions.


65

II.2. La spectrofluorimétrie

L‘énergie absorbée par les chromophores de la MOD peut être utilisée par celle-ci dans des

réactions photochimiques, transférée à d‘autres constituants des eaux naturelles, ou rejetée dans

l‘environnement sous forme de chaleur (absorbance) ou à des longueurs d‘onde plus grandes

(fluorescence) (Figure 12) (Perdue et Ritchie 2003).

II.2.1. Présentation du spectrofluorimètre

Le spectrofluorimètre utilisé est un Fluorolog FL3-22 SPEX de Jobin Yvon. La source

lumineuse est une lampe à arc xénon d‘une puissance de 450 Watts qui émet un rayonnement de 240

à 850 nm avec un spectre continu de 240 à 600 nm. L‘appareil est équipé de doubles

monochromateurs à l‘excitation et à l‘émission qui permettent d‘obtenir d‘excellentes résolution et

sensibilité. La fluorescence est observée à 90 ° par rapport au faisceau incident et détectée par un

photomultiplicateur. Le compartiment échantillon est thermostaté à 20 °C. Les conditions

expérimentales sont détaillées dans l‘annexe technique n°9.

Lors d‘analyses de fluorescence, il est nécessaire de corriger le signal obtenu afin de

s‘affranchir de certains signaux dus à la diffusion de la lumière et des déviances dues à l‘appareillage.

La diffusion Rayleigh est le phénomène dominant, elle résulte de collisions élastiques (donc sans

échange d‘énergie) entre les photons et les molécules. La longueur d‘onde d‘émission de la raie

Rayleigh est donc située à la longueur d‘onde d‘excitation. Les spectres d‘émission ont tous été

acquis à des longueurs d‘onde d‘émission supérieures d‘au moins 10 nm à la longueur d‘onde

d‘excitation pour s‘affranchir de la raie Rayleigh. La diffusion Raman est un phénomène d‘intensité

Figure 12. Diagramme de Perrin-Jablonski.

CI

CI

CIS

CIS

1S1

1S0

3S1

3S2

Absorption Fluorescence

Phosphorescence

Absorption

Triplet-triplet

CI : conversion interne CIS : croisement inter-système


66

plus faible et n‘est observable que pour les molécules de solvant, mais les raies Raman peuvent être

beaucoup plus intenses que les bandes de fluorescence dues aux échantillons. Il est donc nécessaire

de faire un spectre du blanc (uniquement le solvant dans les mêmes conditions que l‘échantillon) pour

soustraire les raies Raman du spectre de l‘échantillon. Pour l‘étude des MOD naturelles, les raies

Raman ne sont parfois pas totalement compensées par la soustraction du blanc qui est effectué avec

de l‘eau ultrapure qui n‘a pas les mêmes paramètres physico-chimiques que les échantillons.

L‘appareillage est lui aussi responsable de certaines modifications des spectres de fluorescence qu‘il

est nécessaire de corriger pour pouvoir les comparer entre eux. En premier lieu, l‘intensité de la lampe

varie avec sa durée de fonctionnement. Le signal acquis est donc systématiquement corrigé par le

signal de la lampe seule pris comme référence afin de s‘affranchir des fluctuations de son émission

(acquisition en mode S/R). Les spectres tridimensionnels obtenus ont ensuite tous été convertis en

unités Raman (normalisation par la bande Raman de l‘eau, Huguet et al. 2009). D‘autre part, les

spectres de fluorescence sont déformés du fait que plusieurs éléments de l‘appareil ont des propriétés

qui dépendent de la longueur d‘onde : intensité de la lampe, rendements des monochromateurs

d‘excitation et d‘émission, trajet optique, réponse du photomultiplicateur (Valeur 2004). Pour permettre

des analyses quantitatives, il est donc nécessaire d‘appliquer des facteurs de correction

instrumentaux qui sont fournis par le fabricant. Enfin, tous les spectres de fluorescence permettant la

caractérisation de la MOD et l‘étude des interactions avec les substances pharmaceutiques ont été

acquis dans des conditions de faible absorbance (< 0,1) afin de limiter l‘effet de filtre interne. En effet,

à plus forte absorbance, il peut se produire une atténuation du faisceau d‘excitation et/ou d‘émission

due à une concentration excessive en fluorophores ou en chromophores qui absorbent le

rayonnement, faussant la valeur des intensités de fluorescence.

II.2.2. Caractérisation de la MOD

Les propriétés de fluorescence de la MOD permettent d‘obtenir des informations sur la

structure et les propriétés générales des macromolécules. Cette technique est beaucoup plus sensible

et les spectres de fluorescence sont beaucoup mieux structurés que les spectres d‘absorption. La

fluorescence est ainsi l‘une des techniques les plus sensibles qui permettent de caractériser la MOD à

partir d‘un échantillon aqueux de faible volume sans nécessité de concentration ou d‘extraction. Pour

caractériser la MOD, la fluorescence tridimensionnelle (3D) est généralement utilisée. Cette technique

consiste à accumuler les spectres d‘émission acquis pour plusieurs longueurs d‘onde d‘excitation. Le

spectre 3D obtenu est interprété par la présence de pics et de rapports d‘intensité caractéristiques. En

effet, l‘étude de substances humiques par émission/excitation de fluorescence montre que deux pics

sont des fluorophores quasi-universels et sont présents dans pratiquement tous les échantillons

d‘eaux naturelles (Sun et al. 2007). Ils sont notés α et α‘ (Figure 13 et Tableau 5). D‘autres

fluorophores peuvent être présents dans les eaux et peuvent renseigner sur la composition ou

l‘origine de la MOD (Tableau 5).


67

250280

310340

370

400

260310360410460510560610660 émission (nm)

250

280

310

340

370

400

260310

360410

460510

560610

660 émission (nm)

'

'

Inte

nsité

de flu

oresc

en

ce

Pics Longueur d’onde

d’excitation (nm)

Longueur d’onde

d’émission (nm) Type de composés

α 330 - 350 420 - 480 Substances humiques

α‘ 250 - 260 380 - 480 Substances humiques + matériel récent

β 310 - 320 380 - 420 Matériel récent

γ 270 - 280 300 - 320 Tyrosine, tryptophane ou protéines

Tableau 5. Fluorophores majeurs de l’eau de mer (Parlanti et al. 2000).

La fluorescence tridimensionnelle permet de mettre en évidence la signature des acides

humiques et des acides fulviques. Par exemple, le pic α est bien défini pour les acides fulviques mais

représente plus un épaulement pour les acides humiques (Sierra et al. 2005, Thacker et al. 2005).

Pour les acides fulviques, les intensités relatives entre les pics α et α‘ ne varient pas beaucoup d‘un

échantillon à l‘autre (Sierra et al. 2005). De plus, à concentrations égales, les intensités de

fluorescence des acides fulviques sont plus importantes que celles des acides humiques (Sierra et al.

2005). Ceci est dû à la grande proximité des groupes aromatiques dans les acides humiques. En effet,

dans les molécules de masses molaires importantes la probabilité de désactivation des états excités

par extinction interne est plus grande, ce qui diminue l‘intensité de fluorescence et déplace les

maxima vers les grandes longueurs d‘onde (Sierra et al. 2005). Une forte intensité de fluorescence est

donc, en général, associée à des composés de faible masse moléculaire, faiblement condensés et de

degré aromatique faible (Sierra et al. 2005).

Les corrélations entre les caractéristiques de fluorescence et l‘origine, l‘âge et la

biodisponibilité de la matière organique ont été assez largement étudiées. Cependant, peu de travaux

ont été réalisés sur l‘identification d‘une corrélation entre les caractéristiques de fluorescence de la

MOD aquatique et le comportement d‘association des contaminants organiques. Sun et al. (2007) ont

montré qu‘il existait une relation négative entre le log KOC et l‘indice de fluorescence Iα/Iα‘ pour des

Figure 13. Exemples de spectres 3D de MOD obtenus par spectrofluorimétrie.


68

perturbateurs endocriniens, montrant une corrélation entre les interactions et l‘aromaticité des

substances humiques.

Dans ces travaux, la spectrofluorimétrie a été utilisée pour la caractérisation de la MOD par

fluorescence tridimensionnelle (publications n°4, 5 et 6) et a également été utilisée pour l‘étude des

interactions entre les contaminants organiques et la matière organique par extinction de fluorescence

(publications n°3 et 6).

II.2.3. Étude des interactions avec les contaminants

L‘extinction de fluorescence peut être utilisée pour l‘étude des interactions dans le cas où au

moins l‘une des deux entités impliquées est fluorescente et si les interactions provoquent une

diminution de cette fluorescence. L‘extinction de fluorescence observée peut alors avoir deux origines.

Elle peut être statique si l‘extinction de fluorescence est due à la formation d‘un complexe non

fluorescent à l‘état fondamental ou dynamique si l‘extinction est due à des collisions d‘un inhibiteur sur

les fluorophores à l‘état excité.

Lors d‘une extinction dynamique, l‘énergie acquise par le fluorophore est alors perdue lors de

sa collision avec un inhibiteur. Le fluorophore voit alors son temps de vie de fluorescence diminuer

avec une vitesse de désexcitation qui peut s‘écrire sous la forme :

v = kq [F] [I] (2.7)

avec [F] la concentration en fluorophore, [I] la concentration d‘inhibiteur et kq la constante bimoléculaire d‘inhibition exprimée en

M-1.s

-1.

Lorsque l‘inhibiteur est en excès devant le fluorophore, le processus peut être considéré du

premier ordre avec une constante de vitesse kq [I] (Valeur 2004, Albani 2001).

Le rendement quantique de fluorescence est le rapport des constantes de vitesse des photons

émis sur la somme des constantes de vitesse de désexcitation du fluorophore. En absence d‘inhibiteur

il s‘écrit :

iscir

rF

kkk

k

(2.8)

avec kr la constante de vitesse de désexcitation par émission de fluorescence, ki par émission de chaleur et kisc par changement

d‘un état singulet vers un état triplet.

En présence d‘inhibiteur, il faut également prendre en considération les processus

collisionnels et le rendement quantique devient :

]I[kkkk

k

qiscir

r)I(F

(2.9)

Si l‘on écrit le rapport des rendements quantiques avec et sans inhibiteur, on a :


69

]I[kkkk

11

kkk

]I[kkkkq

isciriscir

qiscir

)I(F

F

(2.10)

Or le temps de vie de l‘état excité (avant le retour à l‘état fondamental), qui est appelé ici

temps de vie de fluorescence, en absence d‘inhibiteur, est égal à :

iscir0

kkk

1

(2.11)

Il s‘en suit donc l‘équation suivante, appelée équation de Stern-Volmer :

]I[K1]I[k1 SV0q)I(F

F

(2.12)

où KSV est la constante de Stern-Volmer.

D‘autre part, le rendement quantique de fluorescence est également le rapport entre l‘intensité

de fluorescence émise (IF) par rapport à l‘intensité de lumière absorbée. Il s‘écrit donc :

T0

FF

II

I

(2.13)

avec I0 l‘intensité incidente et IT l‘intensité transmise, donc non absorbée.

D‘après la loi de Beer-Lambert (2.4), on a :

c3,20T eII (2.14)

Ce qui conduit, lorsque l‘absorbance est faible (< 0,1), à :

0c3,2

00T Ic3,2)e1(III (2.15)

D‘après l‘équation (2.13), on a donc une relation linéaire entre IF et F :

F0F Ic3,2I (2.16)

En présence d‘inhibiteur, l‘équation suivante peut être utilisée pour exprimer les processus

d‘extinctions collisionnels :

]I[K1]I[k1I

I

I

ISV0q

0

)I(F

F

)I(

0

)I(F

F

(2.17)

si I est l‘intensité de fluorescence en présence d‘inhibiteur et I0 en absence d‘inhibiteur, et F(I), (I) sont F, 0 en présence

d‘inhibiteur.

De cette équation, il en ressort que plus le temps de vie de fluorescence est grand, plus la

probabilité de collision avec l‘inhibiteur est grande. La valeur de la constante KSV, qui dépend de 0,

peut donc indiquer la probabilité qu‘un processus de collision ait lieu. Dans des échantillons étudiés à

l‘équilibre avec l‘air (comme c‘est souvent le cas), le dioxygène peut être responsable d‘une extinction

dynamique de la fluorescence (Danielsen et al. 1995). La valeur de la constante d‘extinction

bimoléculaire (kq) pour le dioxygène dans un milieu aqueux homogène est de l‘ordre de 1010

M-1

.s-1

.

Or, cette valeur est la valeur maximale trouvée de kq en solution aqueuse et toute valeur largement

supérieure indique une probabilité nulle d‘extinction de type dynamique (Puchalski et al. 1992).


70

L‘extinction dynamique de la fluorescence, même si elle doit être prise en compte lors des

expériences, ne renseigne pas sur les interactions entre les contaminants et la MOD. Seule

l‘extinction statique, obtenue par formation de complexes non fluorescents provoquant l‘atténuation de

l‘intensité de fluorescence de la MOD ou du contaminant, informe sur les interactions (Gauthier et al.

1986). La formation de complexes entre fluorophores et inhibiteurs peut être décrite par l‘équation

suivante :

fluorophore + inhibiteur fluorophore - inhibiteur (2.18)

On a alors la constante d‘association suivante :

[I][F]

[FI]

r][inhibiteure][fluoropho

]inhibiteurre[fluorophoKa

(2.19)

avec [FI] la concentration en complexes formés et [F] la concentration en fluorophores qui n‘interagissent pas avec l‘inhibiteur.

Si la fluorescence de l‘inhibiteur est négligeable devant celle des fluorophores, on a [FI] + [F] =

[F]0 avec [F]0 la quantité totale de fluorophore présent dans l‘échantillon. Comme le complexe FI ne

fluoresce pas, on peut écrire :

1)[F]

[F](

[I]

1

[I][F]

[F][F]

[I][F]

[FI]K 00

a

(2.20)

Comme les concentrations sont proportionnelles aux intensités de fluorescence, on a :

]I[K1I

Ia

0 (2.21)

On voit ici que l‘on obtient une équation de la forme de celle de Stern-Volmer (2.17) et qu‘en

traçant le rapport des intensités de fluorescence en fonction de la concentration en inhibiteur, il n‘est

pas possible de différencier l‘extinction dynamique de l‘extinction statique. Or il est nécessaire, dans le

cas de l‘étude des interactions contaminants-MOD, de savoir la nature de cette extinction. L‘extinction

dynamique est souvent très mineure et ne pose généralement pas de problème, mais elle peut

introduire une non-linéarité entre l‘extinction observée et la concentration en inhibiteur (Zimmermann

et al. 1999). En effet, lorsque les extinctions statique et dynamique ont lieu conjointement, l‘équation

de Stern-Volmer ne représente plus une relation linéaire entre les rapports d‘intensité de fluorescence

et la concentration en inhibiteur mais se trouve sous la forme (Puchalski et al. 1992) :

2SDSD

O ]I[KK[I])KK(1F

F (2.22)

avec KD, la constante d‘extinction dynamique et KS, la constante d‘extinction statique.

Lorsque l‘équation de Stern-Volmer est linéaire, l‘extinction est donc soit dynamique soit

statique, mais pas les deux. La nature de l‘extinction de fluorescence peut être déterminée par la

mesure du temps de vie de la fluorescence (Zimmermann et al. 1999, Doll et al. 1999). En effet, dans

le cas d‘une extinction statique de fluorescence où un complexe non fluorescent est formé à l‘état

fondamental, la durée de vie de l‘état excité des fluorophores non complexés est inchangée,

contrairement au cas de l‘extinction dynamique, comme le montre l‘équation 2.17. Il est également


71

possible de calculer la valeur kq de la constante bimoléculaire et la comparer à la valeur maximale

qu‘elle peut prendre pour une extinction de fluorescence par collision (1010

M-1

.s-1

).

Dans le cas des interactions entre MOD et contaminants, la constante Ka est équivalente au

KDOC. L‘étude peut donc se faire en regardant l‘extinction du signal de fluorescence de la MOD

(fluorophores) lors d‘ajout de contaminants (inhibiteurs). Pour certains contaminants organiques

comme les HAP regarder l‘extinction de la fluorescence de ces contaminants (fluorophores) lors

d‘ajout de MOD (inhibiteurs) est plus pertinent puisque ces composés ont des rendements quantiques

de fluorescence beaucoup plus importants. L‘intensité de fluorescence est alors inversement

proportionnelle à la concentration en MOD ajoutée (Herbert et al. 1993), ce qui permet de déterminer

la capacité complexante de la MOD sans devoir séparer les contaminants de la MOD. Pour les

contaminants non fluorescents, l‘avantage lorsque l‘on regarde l‘extinction de fluorescence de la

MOD, c‘est que l‘on peut savoir quelles bandes de fluorescence de la MOD sont les plus impliquées

dans les interactions ; par contre si l‘interaction a lieu entre les contaminants et la partie de la MOD

non fluorescente, il n‘y a pas d‘extinction de fluorescence et les interactions ne sont donc pas visibles.

Alors que lorsque l‘on regarde l‘extinction de fluorescence des HAP, celle-ci pourra être observée

même si les interactions se font avec les parties non fluorescentes de la MOD, par contre on ne

pourra pas savoir quelles parties de la MOD sont impliquées dans les interactions.

Cette technique d‘extinction de fluorescence peut être compliquée par des difficultés

expérimentales, notamment par l‘effet de filtre interne. En effet, l‘atténuation due à un excès de

chromophores ou de fluorophores dans l‘échantillon peut être perçue comme un processus

d‘extinction mais ce n‘en est pas un, c‘est l‘effet de filtre interne (Gauthier et al. 1986). Des corrections

peuvent être faites en prenant en compte la géométrie de la cuve et les caractéristiques d‘absorption

de la solution. Dans les travaux présentés ici, les corrections mathématiques ont été faites selon

l‘équation développée par MacDonald et al. (1997) qui permet de corriger les effets de filtre interne à

l‘excitation et à l‘émission :

ΔyA

yAem

ΔxA

xAex

obs

corr

em

em

ex

ex

101

10Δy2,3A

101

10Δx2,3A

F

F

(2.23)

avec Fcorr, la fluorescence corrigée de l‘effet de filtre interne, Fobs, la fluorescence observée sans correction, Aex, l‘absorbance à

la longueur d‘onde d‘excitation, Aem, l‘absorbance à la longueur d‘onde d‘émission, x et y, les largeurs des faisceaux en cm,

x et y les distances dues à la géométrie de la cuve et des faisceaux en cm (Figure 14).

Cependant cette correction mathématique est inexacte et ne peut être utilisée lorsque le

facteur de correction est supérieur à 3 (Parker 1968).


72

II.3. Mesure du COD

Pour mesurer la concentration en MOD dans un échantillon, il faut procéder à l‘analyse

élémentaire des éléments les plus présents dans la MOD (oxygène, carbone, hydrogène, azote,

phosphore). Les analyses élémentaires de l‘hydrogène et de l‘oxygène ne peuvent être conduites que

sur des échantillons secs, qui doivent donc être concentrés s‘il s‘agit d‘eaux naturelles, avant d‘être

lyophilisés ou évaporés (Perdue et Ritchie 2003). Les mesures de carbone organique, d‘azote et de

phosphore dans les systèmes aquatiques sont beaucoup plus aisées car elles peuvent être faites

directement sur des échantillons d‘eau sans isoler la MOD. Le Carbone Organique Dissous (COD)

étant le composé majoritaire de la MOD devant l‘azote et le phosphore, il est généralement utilisé pour

quantifier la MOD présente dans les eaux naturelles.

Les teneurs en COD ont été mesurées à l‘aide d‘un appareil Shimadzu TOC-V CSN par la

mesure du carbone organique non purgeable (NPOC). L‘analyse du COD comporte ici trois étapes

principales:

- L‘acidification et le dégazage de l‘échantillon (air synthétique) permettent de transformer

le carbone inorganique (CO2 en équilibre avec l‘air, CaCO3, H2CO3, HCO3-) en CO2 qui est évaporé.

- L‘oxydation du carbone restant (organique) dans l‘échantillon sous forme de CO2 lors de

son passage dans un four à haute température (680 °C) en présence d‘un catalyseur à base de

platine.

- L‘analyse quantitative du CO2 formé grâce à un détecteur infrarouge.

La quantification est obtenue par étalonnage externe grâce à une gamme appropriée de

concentrations différentes, la molécule organique standard utilisée étant l‘hydrogénophtalate de

potassium.

Figure 14. Schéma du trajet optique dans la cuve dans le spectrofluorimètre.

faisceau d‘excitation

y

x

cuve

y

y

x x

fais

ceau

d‘é

mis

sio

n


73

II.4. La dialyse

La MOD peut également être caractérisée par la taille des macromolécules qui la compose.

Ainsi, plusieurs techniques peuvent être utilisées pour le fractionnement par la taille de la MOD :

l‘ultrafiltration, la dialyse, le fractionnement par flux-force, la chromatographie d‘exclusion stérique…

Dans ces travaux, la dialyse a été utilisée mais uniquement dans le but d‘étudier les interactions entre

les contaminants et la MOD.

II.4.1. Principe de la dialyse

La dialyse permet la séparation physique de molécules en solution selon un critère de taille.

L‘échantillon de MOD est placé dans un sac à dialyse, qui est en fait une membrane, lui-même plongé

dans de l‘eau ultrapure. La taille des pores de la membrane est choisie en fonction de la taille des

composés à séparer sachant que les seuils de coupure disponibles s‘étendent de 100 Da à 100 kDa.

Par diffusion, les molécules plus petites que le seuil de coupure peuvent traverser la membrane

jusqu‘à l‘obtention d‘un équilibre en concentrations de part et d‘autre de la membrane ; alors que les

grosses molécules ne traversent pas la membrane et restent piégées dans le sac à dialyse

(compartiment alors appelé le rétentat) (Spohn et al. 2005). Sous agitation, l‘équilibre entre le rétentat

et le dialysat est atteint plus rapidement mais cela peut mettre plusieurs jours (McCarthy et Jimenez

1985, Spohn et al. 2005). Cette technique permet donc le fractionnement de la MOD selon la taille des

molécules, mais n‘est pas souvent utilisée dans ce but car c‘est une méthode longue qui ne permet

pas de concentrer les macromolécules de l‘échantillon.

L‘intérêt de la dialyse est cependant majeur dans l‘étude des interactions avec les

contaminants. En choisissant bien le seuil de coupure, on peut en effet, par le même principe, séparer

les contaminants libres qui peuvent traverser la membrane des contaminants associés à la MOD, qui

sont retenus dans le rétentat (Figure 15). En quantifiant ensuite les contaminants dans le dialysat

(contaminants libres) et dans le rétentat (contaminants libres et associés à la MOD), les constantes

d‘association des contaminants avec la MOD peuvent être calculées.

Pour étudier les interactions entre contaminants et MOD, plusieurs configurations peuvent être

utilisées. Pour un échantillon naturel contenant à la fois de la MOD et des contaminants, l‘échantillon

est soit placé dans le sac à dialyse et celui-ci immergé dans de l‘eau ultrapure (schéma 3 Figure 16),

Figure 15. Procédé de séparation des HAP libres des HAP associés à la MOD par dialyse.

Rétentat Dialysat

membrane

contaminant-

MOD

contaminant

MOD


74

Eau

Eau + contaminant

Eau + MOD

Eau

Eau + contaminant + MOD

Eau + MOD

Eau + contaminant

1 3

4


Eau + contaminant

Eau + contaminant


5 6

2


soit le contraire (schéma 4 Figure 16), un sac à dialyse rempli d‘eau immergé dans l‘échantillon (si ce

dernier a un volume suffisant). Pour des échantillons ne contenant que de la MOD ou fabriqués en

laboratoire, de multiples configurations sont possibles. La MOD peut être placée dans le sac à dialyse

puis, soit la solution de contaminants est ajoutée dans le sac (schéma 3 Figure 16), soit le sac est

plongé dans une solution contenant des contaminants dissous dans de l‘eau pure (sans MOD)

(schéma 1 Figure 16). Le contraire est également faisable, avec les contaminants dans le sac qui est

plongé dans une solution de MOD (schéma 2 Figure 16). On peut aussi mettre des contaminants dans

les deux compartiments pour atteindre l‘équilibre plus rapidement (schémas 5 et 6 Figure 16). La

configuration la plus utilisée en laboratoire (McCarthy et Jimenez 1985, De Paolis et Kukkonen 1997)

est l‘ajout de la solution de MOD dans le sac, lui-même immergé dans une solution aqueuse de

contaminant (schéma 1 Figure 16). Sachant que le volume du sac à dialyse est généralement 10 à

100 fois inférieur au volume extérieur, cette configuration permet de ne pas trop diluer la concentration

en contaminant dans le dialysat, d‘utiliser un volume d‘échantillon de MOD assez faible et une

quantification plus aisée des contaminants dans le rétentat.

La dialyse est donc une méthode assez simple à mettre en œuvre mais elle doit ensuite être

couplée à des techniques d‘extraction et de quantification des contaminants.

II.4.2. Matériel utilisé

La dialyse a été effectuée au moyen de sacs de 10 mL Spectra/Por Biotech CE (membrane

en ester de cellulose) fermés aux extrémités par un fil de coton noué (en haut) et un nœud avec la

membrane (en bas) (Figure 17). Des premiers essais avec des pinces en nylon aux extrémités avaient

montré une adsorption complète des HAP sur ces dernières, ces pinces n‘ont donc pas été utilisées.

Les expériences effectuées par cette technique sont décrites dans la publication n°3.

Figure 16. Dispositifs expérimentaux de dialyse possibles pour l’étude des interactions contaminants-MOD.


75

Les différents composants de la MOD présentent une masse moléculaire comprise entre

quelques centaines et 100 000 Da. Des sacs à dialyse avec des seuils de coupure de 1000 Da sont le

plus souvent utilisés dans la littérature, ils ont donc été testés. Cependant, une perte de la MOD allant

de 5 à 50 % a déjà été observée dans la littérature (Carter et Suffet 1982, Kukkonen et Pellinen 1994)

donc des sacs de seuil de coupure de 500 Da ont également été testés afin de retenir un maximum de

MOD sans bloquer le passage des HAP. Les sacs sont commercialisés dans une solution de

conditionnement à 0,1 % d‘azide de sodium et ont donc dû être rincés abondamment pour éliminer cet

agent de conservation avant de commencer les expériences. Plusieurs solvants de lavage ont été

testés parmi ceux supportés par la membrane en ester de cellulose. Un mélange eau - éthanol (90 -

10) et un mélange eau - HCl (95 - 5) n‘ont pas permis d‘améliorer significativement le lavage par

rapport à l‘eau ultrapure simple (Figure 18).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

320 370 420 470

longueurs d'onde d'émission (nm)

inte

nsit

é d

e f

luo

rescen

ce

(u

nit

és a

rbit

rair

es)

eau-EtOH

eau

eau-HCl

Figure 18. Suivi du nettoyage des sacs à dialyse par spectrofluorimétrie.

Figure 17. Photo du dispositif de dialyse. Le sac à dialyse est ici rempli de fluorescéine, le plomb utilisé sur la

photo s’est avéré inutile pour garder le sac vertical et n’a pas été utilisé dans les expériences avec les

contaminants.


76

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

290 340 390 440 490

longueurs d'onde d'émission (nm)

inte

nsit

é d

e f

luo

rescen

ce

(u

nit

és a

rbit

rair

es)

dialysat

rétentat

Finalement les sacs ont donc été rincés abondamment à l‘eau chaude et à l‘eau froide du

robinet pendant 30 min puis rincés à l‘eau ultrapure et enfin laissés dans un bécher d‘eau ultrapure

toute la nuit précédant l‘expérience. Toutefois, ce lavage ne permet pas de faire disparaître la bande

de fluorescence observable aux longueurs d‘onde d‘émission de 320 à 400 nm présente dans les

blancs (sac à dialyse rempli d‘eau immergé dans l‘eau) (Figure 19).

III. Calculs des coefficients de distribution eau-MOD (KDOC)

À partir des données obtenues par SPME-GC-MS ou par extinction de fluorescence, il est

possible de calculer les coefficients de distribution eau – MOD (KDOC). Les valeurs de ces coefficients

peuvent être calculées de plusieurs façons selon la technique analytique utilisée.

III.1. Par SPME

Pour la quantification des HAP libres et totaux en SPME, un étalonnage préliminaire à

l‘injection des échantillons est nécessaire. En effet, l‘étalonnage interne permet de quantifier la

concentration totale en HAP dans l‘échantillon alors que l‘étalonnage externe permet la quantification

de la fraction libre. D‘autre part, un troisième étalonnage a été développé (voir publication n°3) pour la

détermination de la fraction libre car il s‘est avéré que l‘étalonnage externe donnait des résultats

variables. L‘étalonnage en question est basé sur le principe de l‘étalonnage interne ; la concentration

en HAP libre est obtenue par comparaison des aires avec un étalon ajouté en quantité connue sauf

qu‘au lieu d‘utiliser l‘étalon deutéré correspondant au HAP dosé, un étalon qui n‘a pas d‘interaction

avec la MOD est utilisé. Le naphtalène deutéré a été employé comme étalon de la fraction dissoute

puisque celui-ci n‘interagit avec aucune des MOD étudiées dans ces travaux. L‘utilisation de ce

pseudo-étalonnage interne permet alors de s‘affranchir de certaines variations dues au système

SPME-GC-MS et diminue ainsi la variabilité sur la mesure des HAP libres.

Figure 19. Spectres de fluorescence du dialysat et du rétentat pour un témoin (eau ultrapure à l’intérieur et à

l’extérieur du sac à dialyse) après 48h d’immersion, excitation = 277 nm.


77

Le calcul des coefficients de réponse des fractions libres et totales en HAP s‘effectue comme

expliqué dans le paragraphe I.2.3. à partir de solutions aqueuses contenant les HAP natifs et les

étalons internes en quantités connues extraites par SPME-GC-MS. Au début du développement, ces

étalons étaient fabriqués en triplicat sur une gamme de concentrations en HAP natifs allant de 0,1 à 1

µg.L-1

, ce qui permettait également de tracer la droite de calibration pour l‘étalonnage externe. Après

quelques tests, il s‘est avéré que les coefficients de réponse étaient, à la variabilité des triplicats près

(5 - 40 %), équivalents pour toute la gamme de concentrations étudiées et que l‘étalonnage interne

par rapport au naphtalène deutéré était plus reproductible que l‘étalonnage externe. Finalement, ces

étalons ont donc été injectés à une seule concentration (autour de 50 - 100 ng.L-1

) en début et en fin

de séquence en dupliquât, et parfois en milieu de séquence lorsque le nombre d‘échantillons à étudier

était trop élevé ( 15).

Grâce à ces étalonnages, toutes les données nécessaires au calcul des KDOC peuvent être

obtenues. En effet,

[COD][HAP]

[HAP]K

libre

MODDOC (2.24)

où : [HAP]libre est la concentration dans l‘eau des HAP libres calculée par étalonnage externe ou interne avec le

naphtalène deutéré comme étalon,

[COD] est la concentration en COD mesurée par l‘analyseur de carbone,

[HAP]MOD est la concentration dans l‘eau des HAP fixés sur la MOD, obtenue par différence entre [HAP]totale (calculée

par étalonnage interne) et [HAP]libre.

Lorsque l‘on étudie la partition des HAP en augmentant la concentration en MOD sans

modifier la concentration totale de HAP, il est également possible d‘utiliser l‘équation de type Stern-

Volmer (2.25). Cette équation, issue de quelques réarrangements de l‘équation donnant le KDOC

(2.24), offre l‘avantage de calculer ce dernier sans utiliser la concentration en HAP associé à la MOD

mais plutôt la concentration totale en HAP qui est mesurée directement en SPME.

][][

][CODK

HAP

HAPDOC

libre

totale 1 (2.25)

Il suffit alors de reporter [HAP]totale/[HAP]libre pour chaque concentration en COD sur une droite

dont l‘ordonnée à l‘origine est égale à 1 et le coefficient directeur est le KDOC.

Il est aussi possible, et c‘est ce qui a été fait pour les substances pharmaceutiques, de

comparer les aires obtenues par SPME-GC-MS en absence et en présence de MOD. En effet, cela

revient à utiliser l‘étalonnage externe et donc la concentration en contaminant libre, d‘un coté, en

présence de MOD, et de l‘autre, sans MOD. Comme sans MOD tous les contaminants sont sous

forme libre, la concentration en contaminant libre est égale à la concentration totale de contaminants,

ce qui conduit à l‘équation 2.26. Cependant, cette technique pose le problème pour l‘échantillon sans

MOD de reproduire une solution aqueuse identique à l‘échantillon en termes de propriétés physico-

chimiques et n‘est utilisable que dans le cas d‘ajout artificiel de contaminant puisqu‘il doit être ajouté


78

en quantité connue dans les deux échantillons. Néanmoins, cette technique peut être utilisée lorsque

les étalons internes échangés isotopiquement (2H ou

13C) correspondants aux analytes recherchés ne

sont pas disponibles.

][CODKaires

airesDOC

avecMOD

sansMOD 1 (2.26)

III.2. Par extinction de fluorescence

Par cette méthode, comme pour la dernière technique de calcul par SPME, il n‘est pas

nécessaire de connaître les concentrations des fractions libre et totale en contaminants pour calculer

le KDOC. Lorsque les interactions HAP-MOD sont étudiées, la fluorescence des HAP étant largement

dominante, l‘extinction de fluorescence des HAP causée par l‘introduction de MOD est observée.

D‘après l‘équation de type Stern-Volmer sur l‘extinction de fluorescence (2.21), il existe une relation

linéaire entre la concentration en MOD et la fluorescence de l‘échantillon (Herbert et al. 1993) :

][CODKF

FDOC10 (2.27)

avec F0 la fluorescence du contaminant en l‘absence de MOD, F la fluorescence du contaminant en présence de MOD à

différentes concentrations, KDOC le coefficient de partition et [COD] la concentration en carbone organique dissous.

Lorsque l‘extinction de fluorescence est observée pour différentes concentrations en MOD, il

suffit donc de reporter F0/F pour chaque concentration en COD sur une droite dont le coefficient

directeur donne le KDOC.

Cette équation n‘est cependant utilisable que si plusieurs hypothèses sont respectées. D‘une

part, la fluorescence des HAP doit être largement supérieure à celle de la MOD. En effet, il est

nécessaire de soustraire la fluorescence du blanc MOD seule de la fluorescence du mélange HAP +

MOD afin de n‘utiliser que la variation de fluorescence du HAP. Or, étant donné que seuls les

fluorophores libres ont la capacité de fluorescer, la formation de complexes HAP-MOD peut induire

une diminution de la fluorescence de la MOD de la même façon que pour les HAP. Le signal à

soustraire (blanc MOD libre) peut donc être légèrement différent de l‘échantillon de MOD sans HAP

(blanc MOD total). Or, il n‘est pas possible de déterminer la part de « MOD libre » et seul le signal de

la « MOD totale » peut être soustrait, impliquant une erreur sur la mesure de F qui sera d‘autant plus

grande que le signal de la MOD est éteint et que la fluorescence de la MOD représente une part

importante de la fluorescence totale de l‘échantillon. D‘autre part, il est nécessaire que la

concentration en COD soit en excès devant les HAP afin de pouvoir supposer que la concentration en

COD libre est environ égale à la concentration en COD totale. Il est alors possible d‘utiliser la valeur

de concentration en COD mesurée, sans correction de la fraction associée aux HAP, pour tracer la

droite de Stern-Volmer (Gauthier et al. 1986). Cette équation n‘est donc utilisable que si l‘inhibiteur est

en large excès devant le fluorophore étudié et si la fluorescence de l‘inhibiteur reste négligeable

devant celle du fluorophore.


79

Pour l‘étude des interactions entre la MOD et les substances pharmaceutiques, le fluorophore

(la MOD) est en excès devant l‘inhibiteur (le médicament étudié) et ce dernier, bien que faiblement

fluorescent, peut présenter des intensités de fluorescence non négligeables par rapport à celle de la

MOD. Il est donc dans ce cas nécessaire de prendre en considération la fluorescence de l‘inhibiteur et

la diminution de son intensité lors de la formation de complexe avec la MOD. Dans ce cas, on peut

écrire que, sans interaction, la fluorescence du mélange MOD + médicament serait :

medMOD FFF (2.28)

avec F, la fluorescence théorique sans interaction, FMOD, la fluorescence de la MOD seule et Fmed la fluorescence du

médicament seul.

En présence d‘interaction, la fluorescence de l‘échantillon (mélange MOD + médicament) est

de la forme :

med(MOD)MOD(med)medMOD FFFbFaF (2.29)

avec F, la fluorescence mesurée de l‘échantillon, a, le coefficient d‘extinction de fluorescence de la MOD, b le coefficient

d‘extinction de fluorescence du médicament avec a et b < 1 pour une extinction de fluorescence, FMOD(med), la fluorescence de la

MOD en présence de médicament et Fmed(MOD) la fluorescence du médicament en présence de MOD.

La diminution de fluorescence due à la formation du complexe MOD-médicament non

fluorescent s‘écrit donc de la forme :

FFFFF medMOD (2.30)

L‘équation du KDOC peut donc s‘écrire :

librelibre

medMODDOC

[med][MOD]

FFFK

(2.31)

avec [MOD]libre la concentration en MOD non associée au médicament et [med]libre la concentration en médicaments non

associés à la MOD.

Étant donné que seule la fluorescence du mélange et celle des fluorophores et inhibiteurs pris

séparément sont mesurables, il est impossible de déterminer directement [MOD] libre et [med]libre. Pour

approximer ces valeurs, il est donc nécessaire de faire des hypothèses supplémentaires. On peut

ainsi supposer que l‘extinction de la fluorescence de la MOD est environ égale à celle du

médicament ; ceci revient à dire que a b dans l‘équation 2.29. Cette hypothèse peut être éloignée

des faits puisqu‘elle implique que les mêmes proportions de fluorophores de la MOD et du

médicament sont impliquées dans les interactions. Cependant, cette hypothèse reste plus proche de

la réalité que si l‘on considérait que b = 0 (hypothèse que l‘on fait pour les interactions HAP – MOD).

On peut alors poser :

med

med(MOD)

MOD

MOD(med)

medMOD F

F

F

F

FF

F

(2.32)

La concentration en MOD libre dans le mélange est alors proportionnelle à FMOD(med) et la

concentration en médicament libre peut être obtenue par l‘équation suivante :


80

totalmedMOD

libre [med]FF

F[med]

(2.33)

avec [med]total la concentration totale en médicaments dans l‘échantillon.

À partir des relations 2.32 et 2.33, l‘équation du KDOC (2.29), après quelques réarrangements

mathématiques, peut s‘écrire :

totalMOD2

2medMOD

3medMOD

DOC[med]

1

FF

)F(FF)F(FK

(2.34)

Le KDOC peut donc être calculé grâce à cette équation pour chaque concentration en

médicament, mais il peut également être retrouvé en reportant le rapport des fluorescences pour

chaque concentration en médicament sur une droite dont le coefficient directeur donne le KDOC.

IV. Les échantillons de matière organique dissoute (MOD)

Dans ces travaux, divers types de MOD ont été étudiés dans le but de corréler les propriétés

des macromolécules aux valeurs de KDOC obtenues pour les différents contaminants organiques. De la

MOD commerciale a été utilisée afin de comparer les résultats obtenus avec ceux décrits dans la

littérature (notamment pour les interactions avec les HAP, publication n°3) et pour donner un point de

comparaison pour les études à venir en ce qui concerne les interactions avec les substances

pharmaceutiques (publication n°6). Ensuite, les interactions ont été étudiées avec différentes sortes

de MOD d‘origine naturelle.

IV.1. L’acide humique Aldrich

Pour le développement analytique, de l‘acide humique Aldrich technique en poudre a été

utilisé. Celui-ci est en effet utilisé par de nombreuses équipes à travers le monde et a été repris ici par

souci de comparaison des résultats, même s‘il n‘est pas représentatif de la MOD aquatique naturelle.

Sa composition élémentaire donnée par le fournisseur pour les éléments principaux est détaillée dans

le Tableau 6.

Tableau 6. Composition élémentaire de l’acide humique commercial.

Les interactions ont été étudiées à partir de différentes solutions mères à différentes

concentrations d‘acide humique mais celles-ci ont toujours été préparées de la même façon. Une

Éléments Composition

carbone 39,0 %

sodium 8,7 %

hydrogène 4,6 %

calcium 1,4 %


81

certaine quantité de poudre de cet acide humique a été pesée dans une petite barquette d‘aluminium

transférée ensuite dans une bouteille remplie d‘eau ultrapure. L‘eau ultrapure est obtenue par

purification grâce à des cartouches d‘osmose inverse, un module d‘électrodésionisation ainsi qu‘une

filtration à 0,22 µm. Cette eau ultrapure a des concentrations en COD inférieures à 5 µg.L-1

, une

conductivité à 25 °C d‘environ 0,056 µS.cm-1

et une quantité de particules (> 0,22 µm) inférieure à 1

particule.mL-1

. Pour homogénéiser la solution aqueuse d‘acide humique, la bouteille a été placée 10 -

15 min dans un bain ultrasons puis cette solution a été filtrée sur un filtre en fibre de verre GF/F à 0,7

µm. La teneur en COD a ensuite été mesurée pour chaque solution mère.

IV.2. Les MOD naturelles

Deux échantillons naturels concentrés ont été utilisés dans les études d‘interaction entre la

MOD et les substances pharmaceutiques. Ces échantillons ont été utilisés après concentration de la

MOD par osmose inverse ou nanofiltration, qui sont des techniques permettant de séparer les

molécules d‘eau des macromolécules avec un minimum de perte de ces dernières. L‘un des

échantillons provient d‘une eau marine, prélevée à Toulon en Mai 2006 et l‘autre d‘une eau douce

prélevée à La Réole dans la Garonne en février 2007 (Figure 20).

Figure 20. Carte des prélèvements de l’eau douce et de l’eau marine.

Pour l‘échantillon de La Réole, 332 L d‘eau ont été filtrés à 0,45 µm puis concentrés par

osmose inverse et ramenés à 3 L. Les 940 L prélevés à Toulon ont également été filtrés à 0,45 µm

mais en raison de la forte salinité de la Méditerranée (environ 38), l‘échantillon a d‘abord été

concentré par nanofiltration en maintenant une salinité constante par diafiltration (nanofiltration en

ajoutant de l‘eau ultrapure) et ensuite concentré par osmose inverse. La nanofiltration des 940 L a

permis de concentrer la MOD pour obtenir 32 L d‘échantillon à salinité 10,2. Enfin ces 32 L ont été

ramenés à 10,5 L par osmose inverse. Les paramètres physico-chimiques de ces échantillons après

concentration sont reportés dans le Tableau 7.


82

Tableau 7. Paramètres physico-chimiques des eaux naturelles concentrées (Huguet, 2007).

Juste après concentration, les échantillons de La Réole et de Toulon ont été ultrafiltrés pour

connaître les proportions en COD par fraction de taille des molécules. L‘échantillon de Toulon était

formé majoritairement de petites molécules (80 % du COD représentait des molécules plus petites

que 1000 Da) alors que l‘échantillon de La Réole était formé majoritairement de macromolécules plus

grosses (Figure 21).

Des eaux interstitielles provenant de sédiments du Bassin d‘Arcachon ont également été

étudiées dans le cadre de ces travaux. Ces eaux ont été utilisées pour l‘étude des interactions HAP-

MOD par SPME-GC-MS grâce au dosage des HAP naturellement présents dans ces échantillons en

parallèle de l‘étude de la MOD. En effet, les eaux interstitielles contenant généralement des teneurs

en COD plus fortes que la colonne d‘eau, c‘est certainement à cette interface sédiment-eau que les

interactions entre contaminants et MOD sont les plus intéressantes à étudier. D‘autre part, certaines

de ces eaux interstitielles ont été utilisées comme matrice pour l‘étude des interactions MOD-

substances pharmaceutiques. Contrairement aux HAP qui sont ubiquitaires dans l‘environnement, les

médicaments ne sont pas présents dans les sédiments du Bassin d‘Arcachon et ont été ajoutés

directement dans les eaux interstitielles pour leur étude par extinction de fluorescence. Les sédiments

ont été prélevés à sec au moment de la basse mer à différents endroits du Bassin d‘Arcachon (Figure

22) et dans les ports de La Teste et d‘Arcachon (Figure 23). Les eaux interstitielles ont été extraites

par centrifugation (9000 g, 11 min, 15 °C) puis filtrées sur filtres en fibre de verre GF/F 0,7 µm. Leur

MOD a été caractérisée par spectrofluorimétrie tridimensionnelle, absorption UV-visible et analyseur

de carbone. Ces échantillons font l‘objet de la publication n°5 où leur prélèvement et leur composition

en MOD, HAP et les interactions HAP-MOD sont développés. Leurs interactions avec les substances

pharmaceutiques sont quant à elles développées dans la publication n°6.

La Réole après concentration par

osmose inverse Toulon après concentration par nanofiltration/osmose inverse

pH 7,2 7,8

Salinité 4,0 25,7

[COD] en mg.L-1

111,0 0,6 30,4 0,4

29%

20%26%

7%18%

Rétentat 3 kDa

Rétentat 1 kDa Rétentat 500 Da

Filtrat 500 Da

Pertes

9% 9%

29%53%

Filtrat 500 Da

Rétentat 500 Da

Rétentat 1 Kda

Rétentat 3 kDa

Toulon La Réole

Figure 21. Fractions d’ultrafiltration des échantillons concentrés de La Réole et de Toulon (Huguet, 2007).


83

Figure 22. Carte des prélèvements du Bassin d’Arcachon (adaptée de l’Ifremer).

Toujours sur le Bassin d‘Arcachon, une eau de rivière a également été utilisée pour l‘étude

des interactions avec les HAP. L‘échantillon prélevé provient du canal de La Hume, au sud du Bassin

d‘Arcachon (Figure 22). L‘échantillon était assez concentré en COD (> 10 mg.L-1

) car le prélèvement a

été effectué juste après la tempête de janvier 2009 et le lessivage des sols a certainement entraîné

beaucoup de MOD d‘origine terrestre dans le milieu aquatique. La caractérisation de cet échantillon

ainsi que ses interactions avec les HAP sont décrites dans l‘article n°4.


84

Extérieur du

port

Chantier

naval

3

1

2

4

Port d‘Arcachon Port de La Teste

Figure 23. Carte des prélèvements dans les ports d’Arcachon et de La Teste.

IV.3. La MOD issue de culture algale

Les interactions HAP-MOD ont également été étudiées en présence de MOD issue de culture

algale. En effet, la production de MOD autochtone par le phytoplancton étant majoritaire en milieu

aquatique, il nous a paru intéressant d‘utiliser cette MOD d‘origine algale pour l‘étude des interactions.

C‘est ainsi le moyen d‘avoir des échantillons composés majoritairement de MOD récente (non ou peu

humifiée) et suffisamment concentrés en COD, ce qui est très difficile à trouver dans un milieu naturel.

En effet, à l‘approche des océans où la composante autochtone domine sur la composante terrestre

de la MOD, l‘effet de dilution est tel qu‘il est très difficile d‘avoir des concentrations en COD

supérieures à quelques mg.L-1

.

Des échantillons d‘algues ont été prélevés à la station de l‘Ifremer de La Tremblade puis filtrés

au laboratoire pour enlever les algues et ne garder que la phase dissoute (< 0,7 µm). Les micro-

algues étudiées étaient de type Isochrysis galbana (Tableau 8). Ces micro-algues sont cultivées en

écloserie et servent à l‘alimentation des larves de bivalves d‘intérêt commercial. Dans le milieu

naturel, ces algues sont à la base de l‘alimentation du zooplancton, des poissons et des bivalves. La

croissance des algues se caractérise par une phase de croissance exponentielle, puis une phase

stationnaire et enfin une phase de décroissance (dégradation) sachant que les échantillons prélevés

étaient tous en phase de croissance exponentielle (Robert et His 1987). La culture utilisée n‘était pas

en milieu stérile donc il est possible qu‘une partie de la MOD ait une origine bactérienne.


85

Forme schématique

Classe Haptophycée

Durée de la phase de

croissance exponentielle Environ 11 jours

Couleur jaune

Taille moyenne 4,5 µm

Tableau 8. Caractéristiques des micro-algues Isochrysis galbana (Robert et His 1987).

Les interactions avec les HAP de cette MOD algale ainsi que de l‘acide humique Aldrich et de

l‘eau de rivière ont été étudiées au moyen des plans d‘expériences pour décrire les effets des

paramètres physico-chimiques sur ces interactions. Les résultats obtenus font l‘objet de l‘article n°4.

V. Plans d’expériences

L‘étude de l‘effet de différents facteurs environnementaux sur les interactions HAP-MOD a été

réalisée grâce aux plans d‘expériences. Habituellement, lors de l‘étude de plusieurs facteurs sur la

réponse d‘un système, il est généralement conseillé de ne faire varier que ce facteur en veillant à

garder tous les autres constants et ensuite, par le biais d‘autres expériences, de faire varier les autres

facteurs chacun leur tour. Cette façon de procéder permet d‘être sûr de l‘effet qui est responsable de

la réponse observée mais si l‘étude nécessite un nombre important de facteurs, le nombre

d‘expériences nécessaires peut vite devenir considérable. D‘autre part, l‘effet d‘un facteur gardé

constant peut modifier l‘effet du facteur qui varie et ainsi fausser les résultats. C‘est pour cela que les

plans d‘expériences sont très utiles et de plus en plus utilisés dans tous les secteurs d‘activité. Cette

méthodologie est basée sur des outils mathématiques et statistiques pour proposer les meilleures

expérimentations possibles dans le but de rechercher et d‘étudier des facteurs influents. Les objectifs

principaux de ces méthodes sont la réalisation d‘un minimum d‘expériences (économie de coût et de

temps) avec la meilleure précision possible sur les résultats. Le principe pour y parvenir est de faire

varier les niveaux de tous les facteurs à la fois pour chaque expérience, mais de manière raisonnée. Il

est ainsi possible de diminuer le nombre d‘expériences tout en étudiant un nombre de facteurs

important, de détecter les interactions entre les facteurs, d‘obtenir de meilleures précisions sur les

résultats et de les modéliser (Goupy 1988).

Dans cette étude (cf publication n°4), nous avons choisi d‘étudier quatre facteurs majeurs (cf

chapitre 1 – paragraphe IV.1.1.2.4.) - la salinité, le pH, la concentration en COD et la concentration en

HAP – et leurs effets sur les interactions HAP-MOD ; la réponse observée est donc la valeur du KDOC

pour chaque HAP et chaque expérience. Le domaine expérimental observé a été choisi pour être le

plus représentatif possible des conditions environnementales mais avec des concentrations en HAP

permettant leur quantification par SPME-GC-MS. Nous avons donc fait varier la salinité de 0 à 30

(pour mimer une eau douce et une eau de mer), le pH de 5 à 9 (valeurs de pH extrêmes dans le milieu


86

naturel), la concentration en HAP de 100 à 1000 ng.L-1

(chacun) et la concentration en COD d‘environ

1 à 15 ou 30 mg.L-1

. Les concentrations en HAP sont assez élevées par rapport aux concentrations

environnementales usuelles et permettent ainsi d‘observer un bon signal aux plus fortes

concentrations en MOD pour les HAP ayant le plus d‘interactions. Un facteur de 10 entre la plus faible

et la plus forte concentration en HAP permet cependant d‘observer les effets sur une gamme assez

importante. Les concentrations en COD sont très variables dans l‘environnement et ont été choisies

de façon à ce que la plus faible concentration en COD permette de mettre en évidence des

interactions et que la plus forte concentration permette l‘étude sur une gamme assez importante.

Des plans d‘expériences du 1er

degré ont été utilisés car ceux-ci permettent de traiter environ

80 % des problèmes et peuvent être aisément complétés par quelques expériences pour obtenir des

plans du 2nd

degré si nécessaire. Les plans du 1er

degré sont basés sur l‘hypothèse de linéarité de

l‘effet des facteurs sur la gamme de variation étudiée. On peut ainsi étudier un facteur en définissant

son niveau bas (plus petite valeur possible) et son niveau haut (valeur maximale du facteur) et en

supposant qu‘entre les deux niveaux la variation est linéaire, sachant que cette linéarité peut aisément

être vérifiée par l‘ajout de points intermédiaires judicieusement choisis. Nous avons donc choisi

d‘utiliser un plan factoriel complet à deux niveaux et quatre facteurs, noté 24, puisque seules 2

4, soit

16 expériences sont nécessaires. La stratégie des plans factoriels complets consiste à choisir les

points aux extrêmités du domaine expérimental. La matrice des essais peut ainsi être établie (Tableau

9).


87

Numéro de l‘essai Facteur 1

salinité

Facteur 2

pH

Facteur 3

[HAP]

Facteur 4

[COD]

1 -1 -1 -1 -1

2 +1 -1 -1 -1

3 -1 +1 -1 -1

4 +1 +1 -1 -1

5 -1 -1 +1 -1

6 +1 -1 +1 -1

7 -1 +1 +1 -1

8 +1 +1 +1 -1

9 -1 -1 -1 +1

10 +1 -1 -1 +1

11 -1 +1 -1 +1

12 +1 +1 -1 +1

13 -1 -1 +1 +1

14 +1 -1 +1 +1

15 -1 +1 +1 +1

16 +1 +1 +1 +1

Niveau -1 0 5 100 1

Niveau +1 30 9 1000 12

Tableau 9. Matrice des essais du plan factoriel complet 24.

Cette matrice permet de quantifier les valeurs des effets de chaque facteur (Efacteur) par la

somme des réponses de chaque essai affectées des signes + ou – de la colonne qui est attribuée au

facteur étudié normalisée par le nombre de réponses. Par exemple, pour l‘acénaphtène (Ace) la

valeur de l‘effet moyen de la salinité est donnée par :

)YYYYYYYYYYYYYYYY(16

1E 16151413121110987654321 Acesalinité,

Il est également possible de calculer la moyenne des réponses par l‘introduction d‘une

colonne avec uniquement des +1 et, de la même façon, l‘introduction de colonnes interactions permet

de quantifier les interactions entre les facteurs. Les signes de ces colonnes sont obtenus par

multiplication des +1 et -1 des facteurs considérés pour chaque essai. Ainsi la matrice des effets

obtenue permet le calcul des interactions entre 2, 3 ou 4 facteurs. Les interactions sont notées 12, 13,

123, etc pour les interactions entre les facteurs 1 et 2, 1 et 3, 1 et 2 et 3, etc (Tableau 10). Par

exemple, pour l‘acénaphtène (Ace), l‘effet des interactions entre la salinité et le pH est donné par la

relation suivante :

)YYYYYYYYYYYYYYYY(16

1E

16151413121110987654321 12,Ace

KDOC (Ace) KDOC (Acy)…

Y1 Y‘1

Y2 Y‘2

Y3 Y‘3

Y4 Y‘4

Y5 Y‘5

Y6 Y‘6

Y7 Y‘7

Y8 Y‘8

Y9 Y‘9

Y10 Y‘10

Y11 Y‘11

Y12 Y‘12

Y13 Y‘13

Y14 Y‘14

Y15 Y‘15

Y16 Y‘16


88

Numéro de

l‘essai Moyenne

Interaction

12

Interaction

13

Interaction

14

Interaction

23

Interaction

24

Interaction

34

1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

2 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1

3 +1 -1 +1 +1 -1 -1 +1

4 +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1

5 +1 +1 -1 +1 -1 +1 -1

6 +1 -1 +1 -1 -1 +1 -1

7 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1

8 +1 +1 +1 -1 +1 -1 -1

9 +1 +1 +1 -1 +1 -1 -1

10 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1

11 +1 -1 +1 -1 -1 +1 -1

12 +1 +1 -1 +1 -1 +1 -1

13 +1 +1 -1 -1 -1 -1 +1

14 +1 -1 +1 +1 -1 -1 +1

15 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1

16 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

Diviseurs 16 16 16 16 16 16 16

Effets Emoyen E12 E13 E14 E23 E24 E34

Tableau 10. Matrice des essais du plan factoriel complet 24, seules les interactions d’ordre 2 sont représentées.

Pour diminuer encore plus le nombre d‘expériences, il est possible d‘utiliser les plans

factoriels fractionnaires. Dans notre cas, nous avons utilisé un plan 24-1

, qui revient à faire 8 essais.

Les plans factoriels fractionnaires sont dérivés des plans complets mais avec une hypothèse

supplémentaire qui est que les interactions de troisième ordre ou supérieur entre les facteurs sont

négligeables. Ainsi pour passer d‘un plan complet 24 à un plan fractionnaire 2

4-1, la colonne de

l‘interaction d‘ordre plus élevé (ici interaction 123) devient la colonne du quatrième facteur. Ici, nous

avons décidé que le facteur concentration en COD serait donc attribué à la colonne interaction 123,

sachant que ce choix de facteur est sans effet sur les résultats puisque l‘attribution de cette colonne à

un autre facteur reviendrait uniquement à changer le numéro de l‘expérience. On dit alors que le

facteur concentration en COD est aliasé. Le plan factoriel est donc réécrit en partant de trois facteurs

(plan complet 23) avec la colonne interaction 123 correspondant au quatrième facteur (Tableau 11).

On peut d‘ailleurs remarquer que ce plan fractionnaire est en fait composé des essais 1, 4, 6, 7, 10,

11, 13 et 16 du plan complet 24. Les autres essais forment le plan fractionnaire complémentaire et

donc faire deux plans fractionnaires 24-1

revient à faire un plan complet 24. On peut donc effectuer un

premier plan fractionnaire et en cas de doute effectuer son plan complémentaire pour confirmer les

résultats.


89

Numéro de

l‘essai

Facteur 1

salinité

Facteur 2

pH

Facteur 3

[HAP]

Interaction

12

Interaction

13

Interaction

23

Interaction

123

[COD]

1‘ -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1

2‘ +1 -1 -1 -1 -1 +1 +1

3‘ -1 +1 -1 -1 +1 -1 +1

4‘ +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1

5‘ -1 -1 +1 +1 -1 -1 +1

6‘ +1 -1 +1 -1 +1 -1 -1

7‘ -1 +1 +1 -1 -1 +1 -1

8‘ +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

Tableau 11. Matrice des essais d’un plan fractionnaire 24-1

.

Afin de vérifier l‘hypothèse de linéarité des effets des facteurs, des essais correspondants aux

points centraux ont été effectués ; ainsi une valeur de 0 (en valeur centrée réduite) pour tous les

facteurs a été utilisée, soit une salinité de 15, un pH de 7, une concentration en HAP d‘environ 550

ng.L-1

et une concentration en COD d‘environ 7 mg.L-1

. Si les valeurs expérimentales des points

centraux correspondent aux valeurs théoriquement calculées à partir du plan factoriel, c‘est que

l‘hypothèse de linéarité est vérifiée. En outre, ces essais ont été réalisés en quintuplât afin d‘établir la

variabilité de l‘analyse et injectés intercalés dans les 8 essais afin d‘établir si une dérive de l‘appareil

ou des échantillons a pu intervenir entre le début et la fin de l‘analyse de tous les échantillons.

Une fois tous les effets calculés, il est nécessaire de définir ceux qui sont significatifs pour

déduire les facteurs influents et les interactions entre les facteurs. Pour cela, il est nécessaire de

connaître l‘erreur E commise sur la valeur de l‘effet, que l‘on calcule grâce aux statistiques et aux

points centraux. Pour ces points, il s‘agit dans un premier temps de calculer la variance (s²) sur les

valeurs de KDOC pour les 5 points obtenus :

1

n

KKs

MDOCiDOC )²(²

,, (2.35)

avec KDOC,M la valeur moyenne du KDOC, KDOC,i la valeur du KDOC pour le point central i et n le nombre de points centraux.

L‘intervalle de confiance est décrit par :

n

stE 9750, (2.36)

avec t0,975 = 2,776 pour 4 degrés de liberté d‘après la loi de Student.

Les seuls effets à considérer sont ceux dont la valeur absolue |E| est supérieure à E.

On remarquera que l‘utilisation dans les plans factoriels de +1 et -1 pour la définition des

niveaux hauts et bas implique ici l‘utilisation de valeurs dites centrées réduites. Les valeurs


90

expérimentales ne pouvant en pratique être exactement égales aux valeurs théoriques et donc

équivalentes à des -1 ou +1, un logiciel de traitement de données pour les plans d‘expériences,

Modde 5.0 (Umetrics), a été utilisé. Celui-ci permet l‘introduction directe des valeurs expérimentales et

les corrections matricielles nécessaires sont faites automatiquement.

91

Chapitre 3 : articles

Chapitre 3 : articles

93

Ce chapitre regroupe les principaux résultats sous forme d‘articles en français ou en anglais.

Ils sont ici précédés d‘un résumé en français.

Les deux premiers articles reprennent le développement de la micro-extraction sur phase

solide (SPME) appliquée au dosage des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) en solution

aqueuse. Le premier est écrit en français et le second, en anglais. Il s‘agissait de comparer les

résultats avec deux autres techniques plus couramment utilisées pour l‘extraction d‘eaux naturelles :

l‘extraction liquide-liquide et l‘extraction sur phase solide. Ces techniques d‘extraction ont été utilisées

en couplage avec la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse, simple ou en

tandem. Les développements analytiques effectués ont pu être validés grâce au dosage d‘une eau

ultrapure supplémentée en HAP puis appliqués à des eaux de matrice chargée d‘intérêt

environnemental.

Les articles suivants s‘intéressent plus particulièrement aux interactions entre les

contaminants organiques et la matière organique dissoute (MOD). Le troisième article s‘intéresse aux

interactions des HAP avec la MOD. Elles ont été étudiées grâce à trois techniques qui ont dû faire

l‘objet d‘un développement analytique préliminaire. La SPME-GC-MS, l‘extinction de fluorescence et la

dialyse ont ainsi due être optimisées pour l‘application à l‘analyse de la spéciation des HAP en

présence de MOD. Dans cet article, les interactions ont été étudiées en présence d‘acide humique

commercial et de un ou plusieurs HAP. On a pu ainsi comparer les valeurs des coefficients de

partition eau-MOD (KDOC) pour les HAP obtenus par les différentes techniques et en présence de

différents mélanges de HAP et de MOD.

Le quatrième article reprend les résultats de l‘étude des facteurs physico-chimiques

influençant les interactions HAP-MOD. Les interactions ont été étudiées avec de l‘acide humique

Aldrich, une eau de rivière et de la MOD d‘origine algale. Les valeurs des KDOC ont été calculées par

SPME-GC-MS et la spectrofluorimétrie tridimensionnelle et l‘absorption UV-visible ont été utilisées

pour la caractérisation de la MOD.

Le cinquième article est l‘application de la SPME-GC-MS à l‘étude des interactions entre les

HAP et la MOD d‘eaux interstitielles du Bassin d‘Arcachon.

Le dernier article s‘intéresse aux interactions entre les substances pharmaceutiques et la

MOD. Ces interactions ont été étudiées pour des benzodiazépines en présence de MOD commerciale

et naturelles par SPME-GC-MS et par extinction de fluorescence.

Chapitre 3 : article n°1

95

Intérêt de la micro-extraction sur phase solide couplée à la

chromatographie en phase gazeuse et à la spectrométrie de masse

pour l’analyse des hydrocarbures aromatiques polycycliques dans

les eaux

Chloé de Perre, Alexia Crespo, Ninette Abou Mrad, Karyn Le Ménach, Farouk Jaber, Édith Parlanti,

Hélène Budzinski

Résumé

La micro-extraction sur phase solide (SPME) a été étudiée dans le but d‘améliorer les

techniques de dosage conventionnelles généralement utilisées pour l‘analyse des HAP dans les eaux

(extractions liquide-liquide ou sur phase solide). Cette technique a été développée puis appliquée à

l‘analyse de matrices complexes telles que des eaux de station d‘épuration. Ceci a permis de mettre

en évidence les nombreux avantages de la SPME ; elle permet notamment une analyse rapide,

performante et à faible coût des HAP dissous dans différents échantillons aqueux. Cette technique

semble donc très prometteuse pour des suivis environnementaux.

Publication n°1, SPECTRA ANALYSE n° 266, Janvier-Février-mars 2009, 28-35.


96

I. Introduction

Les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) forment une grande classe de

composés organiques qui peuvent présenter de fortes toxicités (mutagènes, cancérigènes ; figure 1).

Figure 1. Les 16 hydrocarbures aromatiques polycycliques listés comme substances prioritaires par l’union

européenne et l’agence américaine de l’environnement. (*Selon la classification de l’Agence Internationale de la

Recherche sur le Cancer).

Ils sont issus de la lente maturation de la matière organique dans le milieu sédimentaire

profond (pétrole) et de la combustion incomplète de la matière organique (gaz d‘échappements, feux

de forêt) ; ils sont présents de manière ubiquiste dans les différents compartiments environnementaux

(eaux, sédiments, sols, atmosphère, biota). Ce sont des molécules hydrophobes qui sont donc

généralement présentes à l‘état de traces (de l‘ordre du ng.L-1

) dans les eaux naturelles (1). Leur

biodisponibilité via la phase dissoute peut s‘avérer toutefois préoccupante, notamment pour les

organismes filtreurs (1). L‘analyse de ces composés à l‘état de traces dans les eaux requiert ainsi des

techniques fiables et sensibles. Les HAP contenus dans les échantillons sont généralement extraits

de la matrice aqueuse par les techniques dites d‘« extraction liquide-liquide » (LLE) et d‘« extraction

sur phase solide » (SPE) (figure 2) puis transférés vers des solvants organiques afin de pouvoir être

dosés au moyen d‘appareillages analytiques tels que les couplages chromatographie en phase

gazeuse / spectrométrie de masse (GC-MS).


97

Figure 2. Vue d’ensemble sur les différentes techniques d’extraction des HAP contenus dans des eaux.

Malgré leurs sensibilités satisfaisantes, ces techniques présentent des limites lorsqu‘elles sont

utilisées en routine dans le cadre de suivis environnementaux à haute fréquence : manipulations

relativement lourdes et délicates, nombre d‘échantillons limités, consommation importante de solvants

organiques... Janusz Pawliszyn (Université de Waterloo, Canada) a développé au début des années

1990 la technique de micro-extraction sur phase solide (SPME) qui permet de réduire la durée et le

coût de l'analyse et de gagner en fiabilité de manière significative en combinant l'extraction, la

concentration, et l'injection dans un chromatographe en un processus unique et automatisé (figure 2).

Cette technique consiste à immerger dans un échantillon une fibre de silice fondue enrobée d‘un

polymère, opération au cours de laquelle les analytes vont se distribuer entre la fibre et l‘échantillon

par adsorption et/ou absorption (2). La fibre est ensuite retirée de l‘échantillon et introduite dans

l‘injecteur d‘un chromatographe en phase gazeuse (GC), dans lequel les analytes sont désorbés


98

thermiquement et entraînés vers la colonne chromatographique. De nos jours, il existe de

nombreuses sortes de fibres (différentes natures et épaisseurs de polymères, différentes gauges de

seringue…), permettant ainsi une meilleure sélectivité et sensibilité des analytes recherchés.

Cependant, une phase d‘optimisation de la technique s‘avère nécessaire pour déterminer les

meilleurs paramètres d‘extraction (fibre, insert d‘injection du chromatographe, température et temps

d‘extraction, couplage GC et spectromètres de masse simple (MS) et en tandem (MS/MS)).

Les travaux reportés ici mettent en évidence l‘intérêt de la SPME et de son couplage aux

systèmes GC-MS et GC-MS/MS, pour l‘analyse des eaux, et notamment pour l‘analyse de matrices

complexes telles que des eaux de station d‘épuration.

II. Matériels et méthodes

1. Instrumentation : micro-extraction sur phase solide

L‘extraction des HAP par SPME se fait généralement avec des fibres en polydimétylsiloxane

(PDMS) et en polydimétylsiloxane-divinylbenzène (PDMS-DVB) (3,4). Les revêtements absorbants

(type PDMS) sont des polymères liquides, où les analytes se répartissent à l‘intérieur et à l‘extérieur.

Les revêtements adsorbants (type DVB) sont généralement poreux et retiennent les analytes soit par

interactions avec la surface (grâce à des interactions - par exemple), soit par piégeage dans les

pores (2). Ces deux types de phase (PDMS 100 µm, PDMS-DVB 65µm) ont été étudiés afin de

déterminer la fibre la plus performante pour l‘analyse des HAP ; un troisième revêtement combinant

l‘absorbance de la phase Carbowax®, qui est habituellement employée pour l‘analyse des molécules

hydrophiles, à l‘adsorbance des phases DVB a été testé afin de comparer les pouvoirs

d‘absorption/adsorption entre les différents revêtements. Les fibres PDMS 100 µm ont été testées

avec deux épaisseurs d‘aiguilles (gauges 23 et 24). Les fibres de gauge 23 sont les plus épaisses et

sont utilisées avec un système d‘injection sans septum pour éviter l‘entraînement de morceaux de

septum lors de la pénétration dans l‘injecteur du GC. Toutes les fibres ont été achetées chez Supelco

et sont employées en mode automatique grâce à un CTC Combi PAL associé au GC-MS/MS.

2. Instrumentation : système chromatographique et spectromètre de masse

La séparation et la quantification des HAP ont été effectuées à l‘aide d‘un système

chromatographe en phase gazeuse / spectromètre de masse Agilent 6890N / Quattro micro Waters

Micromass équipé d‘une colonne HP-5MSI constituée d‘une phase 5 % phényl- 95 %

méthylpolysiloxane (30 m x 0,25 mm d.i. ; 0,25 µm de phase ; Agilent technologies), soumise à un

débit constant d‘hélium (1,3 mL.min-1

, pureté 6.0 ; Linde Gas Aquitaine). Une rampe de température

du four a été programmée à chaque analyse afin d‘obtenir une bonne séparation de la plupart des

HAP en une durée relativement courte (25 minutes) : 60 °C pendant 2 min, augmentation à 150 °C à

une vitesse de 20 °C.min-1

jusqu‘à 150 °C, augmentation jusqu‘à 250 °C à 15 °C.min-1

et


99

augmentation jusqu‘à 310 °C à 10 °C.min-1

et maintien à 310 °C pendant 3 min. Au niveau de

l‘injecteur, deux sortes d‘insert ont été testées : un insert spécialement conçu pour la SPME (d.e. 6,5

mm, d.i. 0,75 mm, Supelco ; Bellefonte, USA) et un insert classiquement utilisé pour l‘injection liquide

en GC (d.e. 6,5 mm, d.i. 4 mm, Gooseneck Splitless, siltek désactivé, Restek; Lisses, France).

L‘influence de différentes températures d‘injecteur (250 °C / 270 °C) sur la sensibilité de la technique a

été testée. Le spectromètre de masse a été utilisé en ionisation électronique (70 eV) en modes SIR

(Selected Ion Recording) et MRM (Multiple Reaction Monitoring). Les ions m/z recherchés sont ceux

correspondants aux masses moléculaires des HAP natifs et deutérés en mode SIR. En mode MRM,

un développement préalable en mode « daughter » (recherche d‘ions fils majoritaires et des énergies

de collision correspondantes) a permis de déterminer les meilleures transitions des ions précurseurs

aux ions fils (Tableau I).

Transition

MRM Ecoll

(eV) Transition MRM

Ecoll

(eV)

Naphtalène 128>128 15 Naphtalène d8 136>136 10

128>102 15 136>108 10

Acénaphtylène 152>152 20 Acénaphtylène d8 160>160 20

152>151 21 160>158 15

Acénaphtène 154>153 20 Acénaphtène d10 164>162 10

154>152 27 164>160 25

Fluorène 166>165 20 Fluorène d10 176>174 15

166>164 35 176>172 25

Dibenzothiophène 184>184 14 Dibenzothiophène d8 192>192 15

184>152 14

Phénanthrène 178>178 14 Phénanthrène d10 188>188 18

178>152 14 188>160 18

Anthracène 178>178 14 Anthracène d10 188>188 18

178>152 14 188>160 18

Fluoranthène 202>202 20 Fluoranthène d10 212>212 20

202>200 20 212>208 27

Pyrène 202>202 20 Pyrène d10 212>212 20

202>200 20 212>208 27

2,1Benzonaphtothiophène 234>234 20

234>202 25

Benzo(a)Anthracène 228>228 20 Benzo(a)Anthracène d12 240>240 18

228>226 23 240>236 18

Chrysène 228>228 20 Chrysène d12 240>240 18

228>226 23 240>236 18

Benzo(b,k)Fluoranthène 252>252 25 Benzo(b)Fluoranthène d12 264>264 25

252>250 30 264>260 25

Benzo(a)Fluoranthène 252>252 25

252>250 30


100

Benzo(e)Pyrène 252>252 25 Benzo(e)Pyrène d12 264>264 25

252>250 30 264>260 25

Benzo(a)Pyrène 252>252 25 Benzo(a)pyrène d12 264>264 25

252>250 30 264>260 25

Pérylène 252>252 25 Pérylène d12 264>264 25

252>250 30 264>260 25

Indéno(1,2,3-cd)Pyrène 276>276 25 Indéno(1,2,3-cd)Pyrène d12 288>288 25

276>274 45 288>284 30

Benzo(g,h,i)Pérylène 276>276 25 Benzo(g,h,i)Pérylène d12 288>288 25

276>274 45 288>284 30

Dibenzo(a,h)Anthracène 278>278 25 Dibenzo(a,h)Anthracène d14 292>292 25

278>276 27 292>288 30

Tableau I. Transitions MRM et énergies de collision (Ecoll) utilisées en GC-MS/MS.

3. Produits chimiques et échantillons

Des composés standards - cristaux de puretés comprises entre 97 et 99 % (21

composés natifs / 19 composés deutérés ; CIL, BCR, Aldrich ou Promochem), ont été utilisés pour

préparer micro-gravimétriquement des solutions dans l‘éthanol. La solution de HAP natifs a été

utilisée pour enrichir de l‘eau ultrapure à des concentrations désirées (entre 10 et 30 ng.L-1

) lors du

développement de la méthode et lors des analyses en routine (contrôle qualité du bon état du

système d‘analyse). Les HAP sont quantifiés par la méthode de l‘étalonnage interne grâce à l‘ajout en

quantité connue de la solution de HAP deutérés, ceux-ci ayant des comportements similaires à leurs

homologues natifs. L‘ensemble des solutions préparées est caractérisé et validé au moyen d‘une

solution de HAP certifiée (SRM2260a, NIST Gaithersburg, MA, USA).

Lors du développement de la méthode, des eaux enrichies en HAP à environ 50 ng.L-1

ont été

quantifiées en SPME, SPE et LLE. Le protocole de la SPE est le suivant : les cartouches (Bond Elut

C18, 200 mg, 3 mL ; Varian) ont été nettoyées et conditionnées avec 2 3 mL de dichlorométhane, 3

mL d‘éthanol et 2 x 3 mL d‘eau ultrapure Milli-Q® (Millipore). Cent mL d‘échantillon ont ensuite été

élués et les cartouches ont été séchées sous vide pendant une heure. L‘élution des composés a été

effectuée avec 3 3 mL de dichlorométhane. Pour la LLE, 30 mL d‘échantillon ont été extraits avec 3

5 mL de dichlorométhane puis le séchage s‘est fait sur Na2SO4 (Fluka). Les extraits organiques SPE

et LLE ont été évaporés sous flux d‘azote et les échantillons ont été repris dans une centaine de

microlitres d‘isooctane avant d‘être injectés en GC-MS. Pour les deux techniques, des étalons

internes sont ajoutés lors de l‘extraction pour la quantification des HAP et deux autres HAP deutérés

sont ajoutés avant l‘injection en GC pour quantifier les rendements de la manipulation dans son

ensemble (le volume final avant injection est inférieur à 200 µL).


101

L‘application aux échantillons a été réalisée sur des matrices complexes (charge importante

en matières et contaminants organiques/inorganiques, en interférents divers, microorganismes...)

provenant d‘une station d‘épuration. Les échantillons ont été filtrés sur filtre GF/F (0,7µm ; Whatman)

au laboratoire puis 10 mL de chaque échantillon ont été transférés et pesés dans des flacons SPME.

20 µL de solution d‘étalons internes ont ensuite été ajoutés. Avant chaque série d‘échantillons, des

flacons d‘eau ultrapure enrichie en HAP natifs et HAP deutérés en concentrations connues sont

extraits afin de déterminer les coefficients de réponse du système SPME-GC-MS (ou MS/MS) entre

les HAP et leurs deutérés nécessaires à la quantification des HAP dans les échantillons.

III. Résultats et discussion

1. Développement analytique

En premier lieu, il a fallu déterminer la fibre la plus appropriée. Pour cela, les limites de

détection ont été calculées pour des eaux enrichies en HAP avec les différentes fibres (figure 3).

Figure 3. Comparaison des limites de détection obtenues pour différentes fibres.

La fibre la plus sensible (limites de détection les plus faibles) est la carbowax-DVB. La PDMS-

DVB présente une sensibilité équivalente pour les HAP légers mais les limites de détection des HAP

au-delà du phénanthrène sont nettement plus importantes. La PDMS 100 µm a une sensibilité

généralement intermédiaire. Il semblerait donc que le DVB facilite l‘adsorption des HAP légers mais le

carbowax semble meilleur que le PDMS pour les HAP les plus lourds. Cependant, les polymères

poreux ne conviennent qu‘à des matrices relativement propres avec des concentrations en analytes

assez faibles pour éviter les phénomènes de compétition entre analytes. Un mélange complexe doit


102

préférentiellement être extrait à l‘aide d‘une phase absorbante (2). Pour les matrices complexes telles

que les eaux de station d‘épuration, il semble donc que le polymère PDMS (absorbant) soit le meilleur

choix. Concernant l‘épaisseur de l‘aiguille, il n‘y a pas de grandes différences entre les deux testées

mais la fibre de gauge 23 est plus solide et sa variabilité est meilleure, ceci étant peut-être dû au fait

que cette fibre est utilisée avec un injecteur sans septum qui permet d‘améliorer le bruit de fond.

L‘influence des autres paramètres d‘extraction et de désorption a ensuite été déterminée en

utilisant une fibre PDMS 100 µm 23g. Les paramètres optimums sont un temps d‘extraction de 60 min

à 40 °C, une température de désorption de 270 °C, un insert SPME et une analyse en mode SIR

(figure 4).

Figure 4. Limites de détection obtenues avec différents paramètres d’extraction, de désorption et d’analyse

(fibre PDMS 100 µm 23g).

Dans ces conditions, les limites de détection sont de l‘ordre ou inférieur au ng.L-1

, ce qui

permet une quantification aisée de nombreux échantillons naturels et une analyse complète en 1h30

par échantillon. Certains paramètres comme la température d‘extraction ou le type d‘insert n‘ont que

peu d‘effet sur l‘analyse mais la température de l‘injecteur peut jouer un grand rôle, notamment sur la

désorption des HAP les plus lourds. Le mode MRM n‘apporte pour ces composés, dans le cas d‘une

eau artificielle, aucune amélioration de la sensibilité mais pourrait apporter une sélectivité

supplémentaire pour les matrices chargées. Lors de l‘application aux échantillons, un insert liquide a

été finalement utilisé car il permet un basculement aisé des modes injection liquide – SPME, ce qui

permet de vérifier continuellement l‘état du système GC-MS par l‘injection d‘une solution de référence

en mode liquide.


103

Afin de valider l‘outil et de déterminer sa justesse et sa répétabilité, un échantillon d‘eau

ultrapure a été analysé en triplicats par SPME (avec les paramètres optimums), SPE et LLE. De plus,

la reproductibilité de la SPME a été testée par l‘utilisation d‘un deuxième système SPME-GC-MS

(Agilent 6890 couplé à un spectromètre de masse 5972) dans les mêmes conditions d‘injection, de

chromatographie et d‘analyse. La Figure 5 montre que la SPME permet une bonne quantification des

eaux.

Figure 5. Comparaison des techniques d'extraction SPME, SPE et LLE des HAP en phase dissoute.

Les rendements moyens sur tous les HAP sont de 88 et 84 % pour la SPME (respectivement

en mode MS et en mode MS/MS), contre 72 % pour la SPE et 81 % pour la LLE. La justesse de la

SPME est donc légèrement supérieure à celle des deux autres techniques ; sa répétabilité est

également excellente : 3 % de variabilité en mode MS et 6 % en mode MS/MS. Là où la SPME

semble apporter un grand avantage par rapport aux deux autres techniques, c‘est sur la quantification

des HAP légers. En effet, par SPE et LLE, l‘étape d‘évaporation qui suit l‘extraction est très délicate

pour ces composés qui ont un faible point d‘ébullition (naphtalène par exemple) ; elle introduit alors

des pertes de composés sur certains échantillons et mène ainsi à une plus faible répétabilité.

L‘utilisation d‘étalons internes permet théoriquement de pallier ce problème, mais si les pertes sont

trop importantes, la quantification peut être faussée. De par la simplification des étapes lors de la

SPME, la variabilité sur la quantification est alors inférieure à 5 %. D‘autre part, l‘utilisation d‘un

système SPME-GC-MS ou d‘un autre n‘entraîne pas de grandes différences pour la quantification des

HAP, la technique semble donc assez reproductible.


104

2. Applications aux échantillons

Quatre échantillons d‘une même station d‘épuration ont été analysés par SPME-GC-MS et

MS/MS en entrée et à différents points de la station. Du fait de l‘excellente reproductibilité obtenue sur

les eaux enrichies en HAP, les échantillons n‘ont pas été analysés en triplicat. D‘après les

chromatogrammes obtenus (figure 6a), il semblerait que la SPME extrait une partie de la matrice mais

qu‘une partie de celle-ci est « éliminée » dans le mode MRM. En effet, le bruit de fond est beaucoup

plus important dans les échantillons que dans les eaux enrichies en HAP, et dans les deux cas, il est

plus faible en mode MRM qu‘en mode SIR. Des interférents du naphtalène et du fluorène ont pu ainsi

être éliminés en mode MRM dans l‘échantillon d‘entrée de station d‘épuration (matrice la plus

chargée), permettant d‘identifier et de confirmer la présence de ces deux HAP (figure 6b). La

présence de ces interférents a en outre entraîné la surestimation de la quantification du naphtalène

lors de l‘analyse en mode SIR (tableau II) ; l‘analyse en mode MRM apporte ainsi une sélectivité et un

gain de confiance supplémentaires dans le cas de cet échantillon. Cependant, ce dernier mode

d‘analyse ne peut être appliqué que sur des échantillons suffisamment concentrés en HAP car il est

moins sensible que le mode SIR (tableaux II et III).


105

A)

B)

Figure 6. A) Chromatogrammes obtenus pour des eaux artificielles et naturelles par SPME-GC-MS et MS/MS.

B) Avantage du mode MRM par comparaison avec le mode SIM lors de la présence d’interférents

Limites de détection (ng.L-1

) entrée de station d'épuration point interne 1 point interne 2 point interne 3

SIR MRM SIR MRM SIR MRM SIR MRM

Naphtalène Interférence 40 9 7 5 4 4 3

Acénaphtylène nd nd nd nd nd nd nd nd

Acénaphtène Interférence 7 3 nd 1 nd 1 nd

Fluorène 15 20 3 7 1 2 1 nd

Phénanthrène 20 30 7 6 3 3 2 2

Anthracène 1 1 nd nd nd nd nd nd

Dibenzothiophène 3 2 1 nd 1 nd nd nd

Fluoranthène 6 5 2 3 1 1 1 nd

Pyrène 8 8 4 4 2 2 3 4

Benzo(a)anthracène 2 1 nd nd nd nd nd nd

Chrysène 5 3 1 nd 2 nd 1 3

2,1 Benzonaphtothiophène 3 nd nd nd nd nd nd nd

Benzo(b,k)fluoranthène 8 6 nd nd nd nd nd nd

Benzo(e)pyrène nd nd nd nd nd nd nd nd

Benzo(a)pyrène nd nd nd nd nd nd nd nd

Pérylène nd nd nd nd nd nd nd nd

Benzo(g,h,i)pérylène nd nd nd nd nd nd nd nd

Indéno(1,2,3-cd)pérylène nd nd nd nd nd nd nd nd

Dibenz(a,h)anthracène nd nd nd nd nd nd nd nd

nd : non détecté

Tableau II. Quantification des eaux de station d'épuration par SPME GC-MS et SPME GC-MS/MS.


107

Limites de détection (ng.L-1

) eau ultrapure enrichie mode

SIR

eau ultrapure enrichie mode

MRM

eau station d'épuration mode

SIR

eau station d'épuration mode

MRM

Naphtalène

0,2-0,5 0,5-3 0,5-7 1-5

Acénaphtylène

Acénaphtène

Fluorène

Phénanthrène

Anthracène

Dibenzothiophène

Fluoranthène

Pyrène

Benzo(a)anthracène 0,5-0,9 0,5-0,7 3 6-8

Chrysène

Benzo(b,k)fluoranthène

0,1-1 2-6 5-42 19-46

Benzo(e)pyrène

Benzo(a)pyrène

Pérylène

Benzo(g,h,i)pérylène

Indéno(1,2,3-cd)pérylène

Dibenz(a,h)anthracène

Tableau III. Limites de détection par SPME GC-MS et SPME GC-MS/MS.

IV. Conclusion

Le développement de la SPME couplée à la GC-MS et à la MS/MS a permis de mettre en

évidence l‘intérêt de cette technique d‘analyse des HAP dissous par rapport aux méthodologies

conventionnelles. La simplicité de mise en œuvre, le gain de temps et le coût (facteurs 2 à 3) sont des

avantages considérables dès lors que des suivis environnementaux haute fréquence sont envisagés

(tableau IV). L‘avantage de cette technique est également l‘amélioration de la fiabilité de l‘analyse ;

réduire le nombre d‘étapes de préparation permet d‘abaisser les risques de contamination des

échantillons ou de perte et dégradation de composés.

La SPME pouvant s‘appliquer à différentes classes de composés organiques, elle semble

devenir actuellement l‘outil de choix pour le suivi ponctuel de la qualité des eaux d‘environnements

marins ou continentaux, des eaux destinées à la consommation, ainsi que des eaux à matrice

complexe. Elle offre ainsi la perspective de pouvoir fournir une méthode d‘extraction et d‘analyse

multi-résidus, ciblant de la sorte simultanément plusieurs classes de polluants organiques.


108

Estimations LLE SPE SPME

Durée manipulation 8h pour 1-5 échantillons

6-8h pour 1-12 échantillons

< 5 min par échantillon

Nombre d‘étapes de manipulation

6 6 1

Volume solvant 300 ml par échantillon 20 ml par échantillon 0

Durée analyse 1h 1h 2h

Materiel et appareillage

Verrerie spécifique Phase séchante

Gaz Petit appareillage de

laboratoire GC-MS

Petite verrerie Cartouches d‘extraction

Gaz Petit appareillage de

laboratoire GC-MS

Petite verrerie Fibres d‘extraction

GC-MS

Coût total +++ ++ +

Tableau IV. Estimations des coûts et temps des différentes analyses.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier la région Aquitaine pour le soutient apporté aux travaux

décrits dans cet article.

Bibliographie

(1) Neff, J.M., (1979) Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in the aquatic environment – sources, fates

and biological effects. Applied Science Publishers LTD, Essex, England, ISBN 0-85334-832-4.

(2) Lord, H. & Pawliszyn, J., (2000) Evolution of solid-phase microextraction technology (review),

Journal of Chromatography A 885, 153–193.

(3) Cam, D., Gagni, S., Lombardi, N. & Punin M.O., (2004) Solid-Phase Microextraction and Gas

Chromatography–Mass Spectrometry for the Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in

Environmental Solid Matrices, Journal of Chromatographic Science 42, 329-335.

(4) Aguinaga N., Campillo N., Vinas P. & Hernandez-Cordoba M., (2007) Determination of 16

polycyclic aromatic hydrocarbons in milk and related products using solid-phase microextraction

coupled to gas chromatography–mass spectrometry, Analytica Chimica Acta 596, 285–290.


109

Analysis of PAH traces in water: development and application of

off-line solid phase extraction and on-line solid phase

microextraction coupled to gas chromatography-mass

spectrometry methodologies

Alexia Crespo, Chloé de Perre, Ninette Abou Mrad, Karyn Le Ménach, Edith Parlanti, Hélène

Budzinski

Abstract

Solid phase extraction (SPE) and microextraction (SPME) were investigated in order to

improve methodologies used for the monitoring of PAH contamination in waters. These methods were

performed and applied in the case of marine waters, as well as in higher dissolved organic matter

content waters. Both methodologies allow to perform accurate and sensitive (below and around ng per

liter) analyses of dissolved PAHs, which is highly interesting when considering European quality

benchmarks for drinking and environmental waters (2 - 2000 ng.L-1

; EU, 2005). Whereas the two

methodologies present different advantages and limitations, SPME appears to be an easier, lower

time- and solvent-consuming and cheaper tool. SPME presents a stronger robustness for di- to tetra-

PAHs, but is limited for heavier PAHs that were better detected with SPE. Quantification via an

internal standard procedure is essential for both methods. Environmental monitoring strategy based

on spot sampling is not anymore limited by analytical capacities, and high frequency sampling may

henceforth be performed. Moreover, no more filtration and other preparation would be necessary to

achieve a good total PAH quantification in water, making SPME a promising tool.

Publication n°2


110

Analyse des HAP traces dans l’eau : développement et application

de l’extraction sur phase solide et de la micro-extraction sur phase

solide couplée à la chromatographie en phase gazeuse et à la

spectrométrie de masse

Résumé

L‘Extraction (SPE) et la Micro-Extraction sur Phase Solide (SPME) ont été développées dans

le but d‘améliorer les techniques utilisées pour la surveillance des Hydrocarbures Aromatiques

Polycycliques (HAP) dans les eaux naturelles. Ces méthodes ont été appliquées à des eaux marines

ainsi qu‘à des échantillons aqueux plus concentrés en matière organique dissoute. Ces deux

techniques ont permis des mesures justes et sensibles (inférieures ou de l‘ordre du ng.L-1

) des HAP

dissous, ce qui est très intéressant étant donné les normes de qualité européennes pour les eaux

potables et environnementales (2 - 2000 ng.L-1

; UE, 2005). Alors que les deux techniques présentent

des avantages et des inconvénients, la SPME est plus simple à mettre en œuvre, faible

consommatrice de temps et de solvant et meilleure marché. La SPME présente une forte robustesse

pour les HAP di- à tétra-aromatiques mais les HAP de plus hauts poids moléculaires sont plus

aisément détectés par SPE. La quantification par étalonnage interne est essentielle pour les deux

méthodes. De par ces outils, la stratégie de surveillance environnementale n'est plus limitée par les

capacités d'analyse et l'échantillonnage à haute fréquence peut désormais être réalisé. En outre, la

filtration ainsi que les autres préparations de l‘échantillon pourraient ne plus être nécessaires pour

atteindre un bon dosage des HAP totaux dans l'eau, faisant de la SPME un outil très prometteur.


111

I. Introduction

Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) are organic compounds constituted by at least two

fused condensed rings coming from combustion processes as well as from petrogenic material input.

They show toxic properties, and some of them have well-known carcinogen potency

(benzo(a)anthracene, benzo(a)pyrene; International Agency for Cancer Research). PAHs are present

in every environmental compartment from air, soil, sediment, water and biota. Their ubiquity and

toxicity make them a class of pollutants declared as priority concern by the European Union and the

United States Environmental Protection Agency (US-EPA). PAH physico-chemical properties can be

summarized by their strong hydrophobicity and their low aqueous solubility, as well as by their relative

high stability in natural environments. These properties show however some slight variations among

the PAH class depending on their molecular weight. These physico-chemical properties dictate PAH

presence and transfer in and through environmental compartments. PAHs are thus mainly present in

solid phases rather than in an aqueous medium. They are generally present at trace levels (few ng per

liter) in the dissolved phase of continental or marine water (Law et al., 1997; Fernandes et al., 1997;

Maldonado et al., 1999; Mitra and Bianchi, 2003; Olivella, 2006); greater concentrations (about a

hundred of ng to a hundred of µg per liter) have however been observed in extremely contaminated

areas (Maskaoui et al., 2002; Luo et al., 2004). Although dissolved PAHs are at trace level in water,

their monitoring in natural waters is needed since they represent part of the bioavailable fraction

besides particulate PAHs for filtering marine organisms, and more particularly in low turbid biotope

(Baumard et al., 1999). European water quality benchmarks for human consumption are 10 ng.L-1

for

benzo(a)pyrene and 100 ng.L-1

for the other di- to hexa-aromatic PAHs (Directive 98/83/CE, 1998).

European environmental quality standards are from 2 ng.L-1

for heavier PAHs to 1 200 (marine coast)

and 2 400 (continental water) ng.L-1

for the lightest PAH naphthalene (EU, 2005). Environmental

monitoring of dissolved PAH contamination requires thus sensitive and robust methodology.

Solvent extraction (also known as liquid-liquid extraction, LLE) is a widely used methodology

consisting in transferring PAHs from water to an organic solvent thanks to agitation and mixing of both

phases. Because of the greater affinity of PAHs for solvent than for water, the extraction is highly

efficient, as well as robust. The interest of this methodology is however highly limited when

considering the high solvent consumption, the heavy and non automatic manipulations, and the low

number of samples that can be extracted in a series. Dissolved PAH environmental monitoring cannot

thus be reasonably based on this methodology, and requires more efficient techniques in terms of

management and minimizing costs. We have thus focused on off-line solid phase extraction (SPE)

and on-line microextraction (SPME) techniques which were developed for the analyses of organics in

water in the 80‘s and early 90‘s respectively (Junk and Richard, 1988; Arthur and Pawliszyn, 1990).

The SPE principle is based on the water percolation through a cartridge filled with an appropriate

sorbent on which PAHs are retained and concentrated. PAHs are then eluted with organic solvent,

concentrated and analyzed thanks to various analytical instrumentations. The advantage of SPME is

the possibility to perform the extraction on-line of the chromatographic apparatus. A fiber covered with


112

an appropriate sorbent is immersed into an aqueous sample and extracts PAHs from water under

agitation and heating. PAHs are then usually desorbed from the fiber sorbent into the chromatograph

injector, thermally when coupled with gas chromatography. In this study, SPE and SPME coupled with

Gas Chromatography and Mass Spectrometry (GC-MS) were investigated with the objective to get

efficient tools for PAH environmental monitoring. Sensitivity and robustness are required criteria.

Developments were undertaken thanks to spiked waters since no certified aqueous matrices are

available. They were then applied and compared for the analysis of marine waters, as well as for more

complex matrices (high dissolved organic matter (DOM) content). Analyses of non-filtered waters were

also investigated with SPME in order to determine the ability to dose simultanously dissolved and

particulate PAHs, or at least to manage the determination of PAH concentration with the minimum of

manipulation (no filtration). Environmental monitoring may also require to store samples temporarily,

so that their storage conditions were optimized.

II. Experimental

II.1. Reagents

Di- to hexa-aromatic native PAHs (21) and perdeuterated PAHs (19) standard solutions were

prepared by micro-gravimetric weighing (0.1 µg; Sartorius, Palaiseau, France) of crystals

(Naphthalene (N): 99%, Aldrich; Acenaphthylene (Acty): > 99%, Aldrich; Acenaphthene (Acte): 99%,

Aldrich; Fluorene (Fe): 99%, Aldrich; Dibenzothiophene (DBT): 99%, Acros organics; Phenanthrene

(Phe): 98%, Aldrich; Anthracene (An): 98%, Labosi Fisher scientific; Fluoranthene (Fluo): 99%,

Aldrich; Pyrene (Pyr): > 99%, Fluka; Benzo(b)naphtho(1,2-d)thiophene (2,1 BNT): 99%, Aldrich;

Benzo(a)anthracene (BaA): 99%, Aldrich; Chrysene (Chrys): 98%, Aldrich; Benzo(b)fluoranthene

(BbF): 99%, Aldrich; Benzo(k)fluoranthene (BkF): 98%, Aldrich; Benzo(a)fluoranthene (BaF):

European Community Bureau of Reference BCR; Benzo(e)pyrene (BeP): 99%, Aldrich;

Benzo(a)pyrene (BaP): 97%, Aldrich; Perylene (Per): > 99%, Aldrich; Indeno(1,2,3-cd)pyrene (IP):

99.3%, PAH research intitute; Benzo(g,h,i)perylene (BP): 99.7%, Promochem; Dibenz(a,h)anthracene

(DahA): 97%, Aldrich, Fluka; N d8: > 98%, EGA-CHEMIE; Acty d8: 98%, Promochem CIL; Acte d8:

99%, Promochem CIL; Fe d10: 98%, Promochem CIL; DBT d8: 99%, MSD isotopes; Phe d10: 98%,

Promochem CIL; An d10: 98%, Promochem CIL; Fluo d10: 99.2%, MSD isotopes; Pyr d10: 98%, MSD

isotopes; BaA d12: 98%, Promochem CIL; Chrys d12: MSD isotopes; BbF d12: 98%, Promochem CIL;

BeP d12: 98%, Promochem CIL; BaP d12: 98%, Promochem CIL; Per d12: 99.5%, MSD isotopes; IP

d12: > 98%, Promochem CIL; BP d12: 98%, Promochem CIL; DahA d14: 98%, Promochem CIL).

Crystals were dissolved in ethanol (HPLC reagent grade, Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Spain) or

isooctane (HPLC grade, Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Spain) to have individual solutions of

around 100 µg.g-1

, which were thereafter mixed and diluted with the appropriate solvent when

required. All prepared standard solutions were characterized and validated thanks to certified native

PAH solutions (SRM2260a in toluene, NIST Gaithersburg, MA, USA). Ultrapure water (Milli-Q®,

Millipore, Molsheim, France) was used for SPE and SPME analytical developments.


113

PAHs were quantified with the internal standard (IS) method; each PAH was quantified with its

perdeuterated homologue or with a perdeuterated isomer (Table 1). For SPME analyses,

perdeuterated homologues were always used (except 2,1 BNT and BaF) in order to have similar

behavior to the one of native compounds. In case of LLE and SPE, two additional perdeuterated PAHs

(pyrene d10, benzo(b)fluoranthene d12) were added at the end of the protocol in order to evaluate

recovery of internal standards. Response factors between PAHs and their internal standards were

determined both at the beginning and at the end of the liquid or SPME analytical sequences thanks to

internal standard and certified PAH solutions (diluted in isooctane for liquid injections and in water for

SPME). The values of response factors ranged around 0.6 - 0.8 (margin error < 5%) for native

compounds relatively to perdeuterated quantification standards, and around 1.0 for these latter

relatively to recovery perdeuterated ones.

Table 1. Lists of perdeuterated PAHs used in SPE and SPME techniques (m/z are given for each compound).

II.2. Materials

High grade borosilicated glassware was used. All glassware was cleaned with alkaline

detergent (Franklab, Saint Quentin en Yvelines, France), rinsed with acid (< 25% acetic acid;

Franklab, Saint Quentin en Yvelines, France) and heated at 450 °C for 6 hours. Glassfiber filters were

heated at 450 °C for 6 hours and then stored in aluminum paper before use. A blank sample was

extracted for each series of LLE and SPE to check the contamination brought by the glassware and

the laboratory environment; it was performed without extraction of ultrapure water. By SPME, blanks

Native PAHs (quantification ions)

Perdeuterated standards (quantification ions)

SPE

SPME Quantification of Native PAHs

Recovery of internal standards

Solvent Isooctane or ethanol Isooctane Ethanol

N (128) Nd8 (136) Pyr d10 (212) Nd8 (136) Acty (152) Phe d10 (188) Pyr d10 (212) Acty d8 (160) Acte (154) Phe d10 (188) Pyr d10 (212) Acte d8 (162) Fe (166) Phe d10 (188) Pyr d10 (212) Fe d10 (176)

DBT (184) DBT d8 (192) Pyr d10 (212) DBT d8 (192) Phe (178) Phe d10 (188) Pyr d10 (212) Phe d10 (188) An (178) An d10 (188) Pyr d10 (212) An d10 (188)

Fluo (202) Fluo d10 (212) Pyr d10 (212) Fluo d10 (212) Pyr (202) Fluo d10 (212) Pyr d10 (212) Pyr d10 (212)

2,1BNT (234) Chrys d12 (240) BbF d12 (264) Chrys d12 (240) BaA (228) Chrys d12 (240) BbF d12 (264) BaA d12 (240)

Chrys+Triph (228) Chrys d12 (240) BbF d12 (264) Chrys d12 (240) B(b,j,k)F (252) BeP d12 (264) BbF d12 (264) BbF d12 (264)

BaF (252) BeP d12 (264) BbF d12 (264) BeP d12 (264) BeP (252) BeP d12 (264) BbF d12 (264) BeP d12 (264) BaP (252) BaP d12 (264) BbF d12 (264) BaP d12 (264) Per (252) BeP d12 (264) BbF d12 (264) Per d12 (264) IP (276) BP d12 (288) BbF d12 (264) IP d12 (288)

D(ah,ac)A (278) BP d12 (288) BbF d12 (264) DahA d14 (292) BP (276) BP d12 (288) BbF d12 (264) BP d12 (288)


114

were performed thanks to empty flasks which allow to verify the good desorption of the fiber and that

no contamination occurs from one sample to the following one.

Analytical balances with a 0.1 mg precision (Sartorius, Palaiseau, France) were used, except

for compound crystals (0.1 µg precision), and large volumes of water (> 0.5 L: 0.1 g precision;

Sartorius, Palaiseau, France). Verification of the analytical balance calibration was achieved each

week with standard weights (Mettler Toledo, Viroflay, France) and autocalibration are daily

programmed.

II.3. Recovery experiments with spiked water

Ultrapure water was spiked with a native PAH solution (v/v 2‰ for SPME; 0.1‰ for SPE) in

order to obtain concentrations ranging from 10 to 50 ng.L-1

for recovery experiments of SPE and

SPME methodologies, as well as for routine check. Spiked samples were then manually shaken, put

into an ultrasonication bath for 5 minutes and shaken again in order to enhance solubilization of the

ethanol solution and homogenization. A similar procedure was used to spike samples with

perdeuterated internal standards for SPE and LLE methodologies. For SPME, samples were

homogenized thanks to a vortex after the addition of internal standards.

II.4. Water sample preparation and conservation

Water samples were collected in three different environments – in a marine lagoon (Arcachon

Bay, South West coast of France) that offered clean matrix samples, in a tributary of this lagoon (to

have freshwater containing organic materials) and in a wastewater treatment plant that allowed to

study complex matrices (high dissolved organic matter concentration, potential interferences…). The

samples were filtered through GF/F glassfiber filters (0.7 µm; Whatman, Maidstone, England) on the

day of the collection. SPE extractions were performed on the day after collection and were stored at 4

°C for the night before. For SPME, 10 mL of samples were weighted in SPME flasks (AlphaMOS,

Toulouse, France) on the day of the collection and 20 µL of a perdeuterated PAH solution (7 ng.g-1

of

ethanol) were gravimetrically added at the same time. Non-filtered water was also extracted thanks to

SPME.

In order to determine the allowed time between sampling and SPME analyses, conservation

tests in a greater time scale were performed by SPME. Filtered and non-filtered natural and spiked

marine waters were conditioned in SPME flasks and were stored for seven days at different conditions

of temperature (22 °C/4 °C/-20 °C), with or without addition of methanol and formol (2‰) and with or

without internal standards. The spiked marine waters were prepared by adding 80 µL of native PAH

ethanol solution to 600 mL (v/v 0.1‰ ethanol) of each filtered or non-filtered water. Ten milliliters were

then taken from spiked water bottles, transferred and weighted in SPME flasks; 20 µL of

perdeuterated PAH solution were directly weighted in SPME samples (v/v 2‰ ethanol).


115

A comparative test between SPE and SPME was performed on a high dissolved organic

carbon (DOC) and PAH concentration water. Four liters of high DOC (11.5 mg.L-1

) river water were

spiked in a bottle with 80 µL of native PAHs (v/v 0.006‰). After dissolution steps, 250 mL were

transferred into SPE bottles and SPME flasks where internal standards were added (80 µL, v/v 0.04‰

for SPE).

After standard solution (ethanol) addition, all spiked (native or deuterated PAH) samples were

shaken, put into an ultrasonication bath for 5 minutes and shaken again (manually or with vortex for

SPE and SPME samples respectively).

II.5. Off-line extraction procedures

For SPE, several cartridges were tested: C18 sorbent (200 mg/3 mL; Bond Elut C18, Varian,

Les Ulis, France), C18 combined with NH2 (PAH Aqua, Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Holland)

and ion exchange sorbent (Strata SAX 200 mg/3 mL, Phenomenex, Le Pecq, France). SPE C18

stationary phase was conditioned with sequential elutions of 23 mL of dichloromethane (Acros

Organics, Geel, Belgium), 13 mL of methanol (Lichrosolv, Merck, Darmstadt, Germany) and 23 mL

of ultrapure water. One liter of environmental samples was percolated through the sorbent thanks to

polytetrafluoroethylene (PTFE) tubes at a flow rate of 10 mL.min-1

; in the case of spiked water, 100 mL

were extracted. C18 sorbents were then dried for one hour under vacuum in a manifold system

(Supelco, Lyon, France) at 10 mmHg. PAH compounds were then desorbed with 33 mL of

dichloromethane at a flow rate of 1 mL.min-1

. In order to quantify native PAHs, the addition of

perdeuterated PAHs was tested either dissolved in ethanol and added directly to aqueous samples, or

dissolved in isooctane and added to the organic elution fraction at the end of the extraction.

For LLE, 1L of environmental water or 30 mL of spiked water were extracted with 380 mL or

35 mL of dichloromethane respectively; the perdeuterated PAH solution was weighed in vials and

then transferred into water samples before the extraction. Organic extracts were then dried with

sodium sulfate anhydrous (Fluka, > 99.0%; Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) and concentrated

using a rotary evaporator. Both SPE and LLE extracts were concentrated to 100 µL under a stream of

nitrogen (purity 4.5, Lindegas, Saint-Priest, France) for spiked samples and of argon (purity 5.0

Lindegas, Toulouse, France) for environmental waters. The solution of recovery internal standards

(pyrene d10 and benzo(b)fluoranthene d12) were then gravimetrically added to the extracts.

II.6. On-line solid phase microextraction

Solid phase microextractions were performed with absorbent 100 µm polydimethylsiloxane

(PDMS) fibers (Supelco, Bellefonte, USA) since it is recognized to be the most appropriate phase for

PAH extraction (Cam et al., 2004; Aguinaga et al., 2007; De Perre et al., 2009 in preparation). Fibers

of 23 gauge and a septum-less system injector (Merlin Microseal, Supelco, Bellefonte, USA) were


116

preferentially used since they were more resistant and allow to avoid septum coring through the gas

chromatography injector (Pawliszyn and Pedersen-Bjergaard 2006). Microextractions were performed

automatically with a Combipal (CTC Analytics, Zwingen, Switzerland) linked with gas chromatography

coupled with mass spectrometry (GC-MS). Different time durations and extraction temperatures were

compared in order to optimize the analysis of PAHs at trace concentrations in water. During analytical

development, samples were analyzed in triplicates (three flasks, each extracted once) that were

crossed throughout the sequence. Environmental samples were analyzed in triplicates for preliminary

tests, and then, because of good reproducibility, just one sample (one extraction) was analyzed for

routine use. As quantification is based on internal standard method and as SPME extracts only a few

percent of the total analyte amount (Heringa and Hermens 2003), samples can be re-extracted if

necessary; the sample re-extraction may however be limited if compounds are present at trace levels.

II.7. Gas chromatography-mass spectrometry instrumentation

Two GC-MS were used: a GC Agilent 6890 (Massy, France) coupled with a Quattro microTM

Micromass® mass spectrometer (MS Technologies, Waters, Manchester, UK) and a GC Agilent 6890

(Massy, France) coupled with an Agilent 5972 mass selective detector, equipped respectively with an

HP-5MSI and an HP-5MS column (5% phenyl- 95% methylpolysiloxane; 30 m 0.25 mm i.d.; 0.25 µm

sorbent; Agilent technologies, J&W Scientific, USA). A ramp of temperatures was programmed during

GC run: 60 °C for 2 minutes, increase to 150 °C at 20 °C.min-1

, increase to 250 °C at 15 °C.min-1

,

increase to 310 °C at 10 °C.min-1

and 310 °C for 3 minutes. The carrier gas was helium (1.3 mL.min-1

,

6.0 grade; Lindegas, Toulouse, France) and the injector was in splitless mode; the purge flow to split

vent was 60 mL.min-1

after 1.5 min and the gas saver was set at 20 mL.min-1

after 10 min. A specific

SPME liner (e.d. 6.5 mm, i.d. 0.75 mm; Supelco, Bellefonte, USA) and a classical liner (e.d. 6,5 mm,

i.d. 4 mm, Gooseneck splitless, Siltek deactivated, Restek, Lisses, France), as well as different

injector temperatures (250 °C and 270 °C) were tested to improve PAH trace analysis. Both the mass

spectrometers were used in electronic impact mode (energy of ionization of 70 eV) in SIR mode

(Single Ion Recording); the MRM mode (Multiple Reaction Monitoring) was also tested for Quattro

MicromassTM

one in order to evaluate the benefit of tandem mass spectrometry in case of complex

matrices. The MRM parameters are described in Table 2.

Control cards (reference standards in isooctane for liquid injection; spiked waters for SPME)

were analyzed before and after liquid or SPME analysis sequences in order to control response

factors and the sensitivity of the instrumentation.


117

Transition

MRM Ecoll (eV)

Transition

MRM Ecoll (eV)

Naphthalene 128>128 15 Naphthalene d8 136>136 10

Acenaphthylene 152>152 20 Acenaphthylene d8 160>160 20

Acenaphthene 154>153 20 Acenaphthene d10 164>162 10

Fluorene 166>165 20 Fluorene d10 176>174 15

Dibenzothiophene 184>184 14 Dibenzothiophene d8 192>192 15

Phenanthrene 178>178 14 Phenanthrene d10 188>188 18

Anthracene 178>178 14 Anthracene d10 188>188 18

Fluoranthene 202>202 20 Fluoranthene d10 212>212 20

Pyrene 202>202 20 Pyrene d10 212>212 20

2,1Benzonaphtothiophene 234>234 20

Benzo(a)Anthracene 228>228 20 Benzo(a)Anthracene d12 240>240 18

Chrysene 228>228 20 Chrysene d12 240>240 18

Benzo(b,k)Fluoranthene 252>252 25 Benzo(b)Fluoranthene d12 264>264 25

Benzo(a)Fluoranthene 252>252 25

Benzo(e)Pyrene 252>252 25 Benzo(e)Pyrene d12 264>264 25

Benzo(a)Pyrene 252>252 25 Benzo(a)pyrene d12 264>264 25

Perylene 252>252 25 Perylene d12 264>264 25

Indeno(1,2,3-cd)Pyrene 276>276 25 Indeno(1,2,3-cd)Pyrene d12 288>288 25

Benzo(g,h,i)Perylene 276>276 25 Benzo(g,h,i)Perylene d12 288>288 25

Dibenzo(a,h)Anthracene 278>278 25 Dibenzo(a,h)Anthracene d14 292>292 25

Table 2. MRM parameters (Ecoll: collision energy).

III. Results and Discussion

III.1. Development of off-line SPE methodology in spiked ultrapure water

III.1.1. Recovery experiments with spiked ultrapure water: loss of heavy PAHs

Even though C18-bonded silica is not very selective sorbent, it has been shown to be efficient

and thus is the most used for PAH extraction (Kiss et al., 1996; Urbe and Ruana, 1997; Marcé and

Borrull, 2000; Li and Lee, 2001; Busetti et al., 2006). So these cartridges were used for the

development of SPE, as well as dichloromethane, which is a good solvent of extraction of organic

compounds, and especially for PAHs, frequently used in LLE and SPE methodologies (Kiss et al.,

1996; Urbe and Ruana, 1997; Røe Utvik et al., 1999). LLE allowed to validate spiked water

preparation since this extraction was shown to be accurate for the quantification of PAHs in aqueous

samples (mean recoveries > 85%). Figure 1 shows native PAH recoveries for SPE protocol. Good

recoveries (65-110%) are obtained for tri- to tetra-aromatic PAHs, except for acenaphthylene whose

average recovery does not exceed 15%. Recoveries of naphthalene are highly variable through

extraction series (0-70%); the sorbent drying and organic eluent evaporation are critical steps that may

cause its loss due to it high volatility. Heavy compounds show lower recoveries (40-110%) and higher

variability (10-55%) with SPE technique. Recent literature reports similar low recovery values for

heavy PAHs extracted by SPE (Kiss et al., 1996; Urbe and Ruana, 1997; Marcé and Borrull, 2000;


118

Busetti et al., 2006). Their stronger hydrophobicity relative to low molecular weight PAHs seems to be

responsible for their loss before and during extraction. Different tests were performed in order to

assess the way of loss, and to improve the protocol; they are described in the following parts.

0

20

40

60

80

100

120

140

NAct

yAct

e FePhe

An

Fluo

Pyr

BaA

Chry

sBbF

BeP

BaP P

er IP

Dah

ABP

SP

E r

eco

very

(%

)

Figure 1. Native PAH recoveries for spiked ultrapure water extracted with SPE for various series of analyses.

(the different symbols represent various series of analyses during several months)

III.1.2. Cause of acenaphthylene and heavy PAH losses

Penta- to hexa-aromatic PAHs are known to present a greater affinity for glass- and plastic-

ware than for water (Busetti et al., 2006), and therefore they are ones of the most difficult compounds

to extract by SPE. In order to underline the way of loss of heavy PAHs, as well as of acenaphthylene,

different tests were done:

- The sorption efficiency on C18 was assessed by LLE re-extraction of SPE extracted water,

- The efficiency of the C18-sorbed PAH desorption step was evaluated by additional eluents

(dichloromethane and other solvents),

- The PAH loss adsorbed on glass and/or tubes was quantified by rinsing bottle glass and PTFE

percolation tubes with dichloromethane followed by a drying step with sodium sulfate

anhydrous of the solvent eluent.

LLE extractions have shown that less than 5% of heavy PAHs are dosed in SPE extracted water

and a change of SPE elution solvents (methanol, hexane, ethylacetate or toluene instead of

dichloromethane; data not shown) or enhancing solvent volumes do not improve PAH desorption

(Figure 2a). Adsorption on and desorption of PAHs from C18 sorbent are thus highly efficient. Around

25 to 45% of penta- and hexa-aromatic PAHs are however found adsorbed on bottle glass.


119

a/

b/

Figure 2. Losses of (a) native PAHs and (b) perdeuterated PAHs during solid phase extraction of spiked

ultrapure water.

Losses of penta- and hexa-aromatic PAHs are clearly due to glass sorption, and not to the

SPE efficiency itself. Heavy PAHs are generally well analyzed by LLE thanks to bottle rinsing with

organic solvent, which allows to desorb all glass-adsorbed compounds. A similar practice cannot be

performed in the SPE protocol, unless a sodium sulfate anhydride drying step of the solvent eluent is

added. This experiment was performed and quantification was better for most of PAHs but not

improved (for naphthalene and acenaphthylene) and even worse for other PAHs (phenanthrene,

benzo(a)pyrene and indeno(1,2,3-cd)pyrene). Moreover, the interest of SPE methodology resides in

its easy and reduced number of preparation steps that allow to limit hazardous contamination of the


120

samples as well as losses of compounds at each step. Therefore, this additional step was finally not

performed in routine analyses.

These tests do not allow to determine the acenaphthylene way of loss. Acenaphthylene is

present neither in glass surface nor in extracted water. No residual traces are found in sorbent after

elutions. Acenaphthylene is however well-dosed with the LLE protocol. Moreover the lightest PAH (i.e.

naphthalene) does not show a similar pattern, so evaporation of this compound cannot explain its

entire loss. In the literature, acenaphthylene recoveries range however with those of naphthalene,

acenaphthene and fluorene (Kiss et al., 1996; Li and Lee, 2001; Busetti et al., 2006; Werres et al.,

2009). Similar losses of acenaphthylene were also sometimes observed in our laboratory during solid

matrix extractions (assisted by microwave). It may be due to photodegradation during extraction since,

contrary to the literature (Busetti et al., 2006), we did not use amber glassware during the extractions.

A better quantification of acenaphthylene could have been achieved with the addition of perdeuterated

acenaphthylene in samples, which might compensate for the loss. However, because of the loss,

detection limits stay around ten-fold lower than for other PAH ones.

III.1.3. Avoiding heavy PAH underestimations: addition of organic modifier in

water samples

Numerous studies have reported that adding organic modifier in water samples can allow to

avoid the heavy PAH loss phenomenon (Kiss et al., 1996; Urbe and Ruana, 1997; Busetti et al.,

2006); organic solvent may enhance solubility of hydrophobic PAHs and reduce their glass adsorption.

Kiss et al. (1996) consider moreover the necessity to keep octadecyl chains of SPE sorbent activated.

The type and amount of organic modifier should however be well chosen in order to limit breakthrough

volume decrease for lighter compounds (Kiss et al., 1996). In our work, fractions of 5 and 10% of

isopropanol (2-PrOH, Scharlau Chemie, Barcelona, Spain) were added to water since this solvent has

been reported to be efficient by Kiss et al. (1996) and Busetti et al. (2006). Losses due to glass/tube

adsorption, as well as prematurely or lower desorption from the sorbent, were also evaluated for 2-

PrOH supplemented water. Heavy PAHs are effectively better desorbed from bottle glass (residual

traces on glass are < 10% with 10% 2-PrOH addition), whereas they are curiously not present at

greater proportions neither in organic elution fraction nor in extracted water (Figure 3). Moreover, the

effect of the addition of isopropanol is not so beneficial as expected: native PAH recoveries decrease

from 45 to 30% with increasing proportions of solvent. PAHs desorbed from glass thanks to

isopropanol are not found in the different parts/elements of the system. One can presume that glass-

desorbed compounds may have not been sorbed on and may have been prematurally eluted from the

C18 sorbent because of the 2-PrOH traces. However, the residual PAH amounts in extracted waters

being at trace level, the differences between each case (with and without 2-PrOH) are not sufficiently

high to be significant.


121

Figure 3. Effect of isopropanol addition to PAH spiked water.

III.1.4. Avoiding heavy PAH losses: addition of internal standards

When native and perdeuterated PAHs (9 internal standards; see Table 1) are added

simultaneously to water, excellent recoveries (> 90%) for native PAHs (quantified with perdeuterated

compounds) are obtained. The addition of internal standards in water seems thus to balance efficiently

the sorption of bottle glass. Bercaru et al. (2006) observed similar improvement of native PAH

quantification thanks to the addition of internal standards. We observed however an average 40% loss

of heavy perdeuterated PAHs that were quantified with final step recovery standards (Table 1; Figure

2b). Native and perdeuterated compounds are thus lost simultaneously and the quantification of the

native ones is correct.

III.2. Development of on-line SPME/GC-MS methodology in spiked ultrapure water

III.2.1. Optimization of extraction conditions

Several parameters need optimization to have a selective and sensitive SPME analysis. In

order to determine the best parameters, the detection limits were compared with different extraction

temperatures and times, desorption temperatures, liners… As regards extraction time, the longer it is,

the better the sensitivity but the advantage of the rapidity is lost. The gain in sensitivity and

repeatability from 30 min to 60 min of extraction was major, particularly for heavy PAHs which are less

present in the dissolved phase. So an extraction time of 60 min was chosen which allows the

quantification of one sample in 1h30 (1h for extraction – 30 min for desorption/analysis). The

extraction temperature was also shown to modify sensitivity and repeatability which were improved at


122

40 °C in comparison with 30 °C (Figure 4a), so the first temperature was used. We did not try to

exceed 40 °C not to evaporate the lightest PAHs.

a/

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

N

Ac

ty

Ac

te Fe

DB

T

Ph

e

An

Flu

o

Py

r

Ba

A

Ch

rys

2,1

BN

T

Bb

F

Ba

F

Be

P

Ba

P

Pe

r

IP BP

Da

hA

De

tec

tio

n l

imit

(n

g.L

-1)

Temperature of extraction: 30°C

Temperature of extraction: 40°C

b/

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

N

Acty

Acte Fe

Ph

e

An

DB

T

Flu

o

Py

r

BaA

Ch

rys

2,1

BN

T

Bb

F

BaF

BeP

BaP

Pe

r

IP BP

Dah

A

De

tec

tio

n l

imit

(n

g.L

-1)

Injector temperature: 270°C

Injector temperature: 250°C

Figure 4. Optimization of temperature of a/ extraction and b/ desorption by SPME (n = 3).

a/ Conditions of analysis: PDMS 100 µm; septum-less system injector; SPME liner; extraction time of 60 min,

injector temperature of 250 °C.

b/ Conditions of analysis: PDMS 100 µm; septum-less system injector; SPME liner; extraction time of 60 min,

temperature extraction of 30 °C.


123

III.2.2. Optimization of desorption conditions

Once the optimization of extraction done, the parameters of the injector system were

investigated. Even though desorption is a fast phenomenon (Lord and Pawliszyn 2000), the desorption

time was programmed to be 30 min in order to condition the fiber between each sample. A

conditioning temperature of 250 °C was advised by the supplier but desorption at 270 °C provided

better efficiency (Figure 4b) so this temperature was used for conditioning and desorption. The shape

of inserts can also affect the analysis; narrow inserts were advocated by authors (e.g. Lord and

Pawliszyn 2000) but our tests did not show any improvement compared with splitless liners (results

not shown). As liquid injections of control PAHs were performed before each SPME series to check

the GC-MS system, classical liners were preferentially used in order to be able to do these liquid

injections in the automatic mode.

III.2.3. Performance of SPME for spiked ultrapure water - comparison with LLE

and SPE

Based on spiked ultrapure water, excellent sensitivities are achieved by LLE, SPE and SPME

since detection limits are relatively homogeneous and < 1 ng.L-1

for di- to hexa-aromatic PAHs

(analyzed in SIR mode; Table 3). These values are highly interesting since PAH concentrations in low

impacted natural water generally range over a few ng per liter.


124

a/

b/ Table 3. Detection limits (signal/noise = 3) for SPE and SPME methodology for a/ spiked waters and b/ filtered

natural waters. Marine water DOC < 2 mg.L-1

; river water DOC = 11.5 mg.L-1

; wastewater DOC = 23 mg.L-1

.

Detection limits for natural waters were determined thanks to perdeuterated compounds.

Spiked ultrapure water Detection limits (ng.L

-1)

LLE &

SIR mode

SPE &

SIR mode

SPME &

SIR mode

SPME &

MRM mode

Naphthalene

0.1 – 3 0.2 – 2 0.2 - 0.5 0.5 - 3

Acenaphthylene

Acenaphthene

Fluorene

Phenanthrene

Anthracene

Dibenzothiophene

Fluoranthene

Pyrene

Benzo(a)anthracene 0.2 - 0.3 0.1 - 0.2 0.5 - 0.9 0.5 - 0.7

Chrysene

Benzo(b,k)fluoranthene

0.2 - 0.7 0.3 - 0.8 0.1 - 1 2 - 6

Benzo(e)pyrene

Benzo(a)pyrene

Perylene

Benzo(g,h,i)perylene

Indeno(1,2,3-cd)perylene

Dibenz(a,h)anthracene

Natural waters Detection limits (ng.L

-1)

Marine water SPE

& SIR mode

Marine water SPME

& SIR mode

River water SPE

& SIR mode

River water SPME

& SIR mode

Wastewater SPME

& SIR mode

Wastewater SPME

& MRM mode

Naphthalene

0.1 - 0.8 0.2 - 0.5 0.1-0.7 0.1 0,5-7 1-5

Acenaphthylene

Acenaphthene

Fluorene

Phenanthrene

Anthracene

Dibenzothiophene

Fluoranthene

Pyrene

Benzo(a)anthracene 0.2 – 0.3 0.5 - 1 0.2 0.5 - 1 3 6-8

Chrysene

Benzo(b,k)fluoranthene

0.3 - 0.5 0.5 - 1 0.2-0.4 0.5 - 1 5-42 19-46

Benzo(e)pyrene

Benzo(a)pyrene

Perylene

Benzo(g,h,i)perylene

Indeno(1,2,3-cd)perylene

Dibenz(a,h)anthracene


125

The good robustness of analytical methodologies is highly essential to get high accuracy for

any series of analysis. SPE and SPME robustness are thus compared. The robustness of SPE and

SPME was controlled via spiked ultrapure water samples, added to each series of natural samples.

Robustness of SPE is based on PAH quantification recovery results, whereas detection limits are used

in SPME. Critical points are physical losses of compounds by SPE, and losses of instrumentation

sensitivity for SPME. Control cards of SPE are shown in Figure 5a for a compound by aromaticity

class. They illustrate a good robustness (variability = 5-20%; except for Acte and BaA: 27-32%) of the

SPE method for tri- to penta-aromatic PAHs, whereas high variability is obtained for the lightest

compounds (N, Acty) and the heaviest ones (hexa-aromatic PAHs). For lighter compounds, the drying

of the sorbent and/or evaporation of the organic eluent are the critical steps where they may be lost.

Low robustness for SPE analysis of heavy PAHs is due to glassware adsorption as previously shown.

The SPME technique presents good robustness (variability = 5-30%) for PAHs with molecular

weight less or equal to 202 g.mol-1

, whereas detection limits of heavier compounds vary greatly with

time (mean variability = 65%; Figure 5b). This technique shows excellent reproducibility as tested with

another GC-MS instrument (data not shown). In order to maintain a good sensitivity of SPME, daily

check ups are required, as well as frequent cleaning of injector system. SPME does not require days

of technical manipulations, but needs frequent short periods for instrumentation controls and cares.


126

0

20

40

60

80

100

120

140

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Series of SPE extraction

Re

co

ve

ry (

%)

Hexa-Aromatic

DahA

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Reco

very

(%

)

Penta-Aromatic

Per

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Reco

very

(%

)

Penta-Aromatic PAH

BbF

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Reco

very

(%

)

Tetra-Aromatic PAH

Fluo

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Reco

very

(%

)

Tri-Aromatic PAH

Fe

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Reco

very

(%

)

Di-aromatic PAH

Napht

0

20

40

60

80

100

120

140

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Re

co

ve

ry (

%)

Hexa-Aromatic

DahA

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Reco

very

(%

)

Penta-Aromatic

Per

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Reco

very

(%

)

Penta-Aromatic PAH

BbF

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Reco

very

(%

)

Tetra-Aromatic PAH

Fluo

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Reco

very

(%

)

Tri-Aromatic PAH

Fe

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Reco

very

(%

)

Di-aromatic PAH

Napht

a/

b/

0

2

4

6

8

10

NAct

yAct

e Fe P

he A

nDBT

Flu

o P

yrBaA

Chry

s

2,1B

NT

BbF

BaF

BeP

BaP P

er IP BP

Dah

A

Dete

cti

on

lim

it (

ng

.L-1

)

0 fiber cycle - day 140 fiber cycles - day 1180 fiber cycles - day 20100 fiber cycles - day 22120 fiber cycle - day 23

Figure 5. Robustness of a/ SPE and b/ SPME methodologies (with spiked ultrapure water).


127

III.2.4. Performance of SPME-GC-MS and MS/MS for samples with complex

matrix

Once SPME was developed and validated on spiked ultrapure water, analyses of complex

matrix samples were investigated. Indeed, the advantage with on-line SPME-GC-MS is the possibility

to play on three tools (SPME, GC and MS) to achieve the sensitivity and selectivity needed. Indeed,

even though SPME can be highly selective with the use of the appropriate fiber polymer, PDMS

absorbs more compounds than the desired analytes. So, in order to achieve a better selectivity (and

potentially a better sensitivity), analyses were also performed thanks to tandem mass spectrometry.

Thus, the MRM mode has been tested as an alternative tool to limit matrix interferences.

PAHs are not highly fragmentable molecules, so the molecular ions are still predominant after collision

chamber. The MRM method is thus based on transitions parent ions towards daughter ions

corresponding to molecular ions towards molecular ions. The interest of this mode is to decrease

noise and interferences in complex matrix chromatograms. Optimal collision energies are determined

by a compromise between wanted noise decrease and unwanted signal fragmentations and range

from 15 eV for lighter PAHs to 25 eV for heavier ones (Table 2). As it could be predicted, a loss of

sensitivity is obtained with this mode (in comparison with the SIR mode), but detection limits range

between 0.5 and 6 ng.L-1

for spiked ultrapure water. However, in these samples, noise and

interferences were very low and could not be decreased more but the MRM mode should be more

interesting in the case of complex matrix samples.

Thus the use of the MRM mode was investigated on wastewater samples. According to Figure

6, SPME extracts a part of the matrix but this latter is mostly eliminated thanks to the MRM mode.

Indeed, the background noise is higher for wastewaters than for spiked ultrapure waters and in both

cases is lower in the MRM mode. Interferences of naphthalene and fluorene have therefore been able

to be removed from the most charged matrix of wastewaters allowing to confirm the presence of these

two PAHs. These interferences have caused overestimation of naphthalene when quantified by the

SIR mode, showing that the MRM mode brings additional selectivity for very complex matrix. However,

this last mode can only be applied in the case of high PAH concentrated samples since detection

limits are far higher (Table 3). Consequently, the use of combined MS and MS/MS modes in the same

analysis may thus be very useful to quantify PAHs with the first mode and to confirm the ions thanks to

the second one.

SPME-GC-MS was then used to quantify PAHs in natural waters and compared to SPE. As

samples contained little or medium concentrations of DOM, the MRM mode was not used. Moreover,

the effect of DOM on SPE was investigated thanks to affluent water samples.


128

Quattro Micro GC 12-Jul-200800:01:34Ki 4

Time5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00

%

0

100

08alexia580 6: MRM of 8 Channels EI+ TIC

5.00e4

Eau enrichie en HAP

- MRM

50 000

Quattro Micro GC 11-Jul-200817:47:10Eau STEP 4

Time6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00

%

0

100

08alexia574 3: SIR of 8 Channels EI+ TIC

5.00e6

Entrée station

d‘épuration - SIR

5 000 000


Time5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00

%

0

100


5.00e5

Entrée station

d‘épuration - MRM

500 000


Time6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00

%

0

100


5.00e5

Eau enrichie en HAP -

SIR

500 000


Time5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00

%

0

100


5.00e4

Eau enrichie en HAP

- MRM

50 000


Time5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00

%

0

100


5.00e4

Eau enrichie en HAP

- MRM

50 000


Time6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00

%

0

100


5.00e6

Entrée station


5 000 000


Time6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00

%

0

100


5.00e6

Entrée station


5 000 000


Time5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00

%

0

100


5.00e5

Entrée station


500 000


Time5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00

%

0

100


5.00e5

Entrée station


500 000


Time6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00

%

0

100


5.00e5


SIR

500 000


SIR

500 000

Spiked ultrapure water

SIR

Wastewater

SIR

Spiked ultrapure water

MRM

Wastewater

MRM

a/

MRM

SIR

Naphthalene d8

Naphthalene

Naphthalene d8

Naphthalene

Naphtalène d8

Naphtalène

MODE MRM

MRM

SIR

Fluorene d8

Fluorene

Fluorene d8

Fluorene

b/

Figure 6. Interest of analysis in the MSMS mode in the case of complex matrices: a/ total ion current windows

for SIR or MRM modes, b/ ion or transition recording windows.

III.2.5. Performance of SPE and SPME-GC-MS with low and high DOM samples

Whereas it seems preferable to add internal standards directly into spiked waters for SPE (see

3.1.4), it is not obvious that such a practice may provide accurate data in case of natural samples.


129

Indeed, PAH partition between water and glassware or matter may be different when compounds are

naturally present or if they are spiked in water through an organic medium. In order to check the

accuracy of IS spiking in natural waters, comparative extraction tests via SPE and SPME were

performed on natural aqueous matrices.

In order to deconvoluate the potential negative effects of glass adsorption from DOM

interactions, purifications on NH2 sorbent (thanks to ―PAH aqua‖ cartridges) and with ionic exchanges

(―SAX‖) were also tested. Indeed, these sorbents could bring a more efficient PAH extraction since

amino groups of SAX and NH2 sorbents could remove negatively charged humic material (Jacobsen et

al. 2004).

Firstly, high DOM and high PAH content water was required in order to observe maximal

effects. River water containing 11.5 mg.L-1

of dissolved organic carbon was used. However, since the

water presents only traces of light PAHs (< 1 ng.L-1

from di- to tetra-PAHs), it was unavoidable to

increase PAH concentration at around ten ng of PAH per liter. We thus opted to spike natural matrices

but with respect to our objectives to minimize the ratio water/ethanol (v/v 0.006‰). That is why a large

volume of natural water (4L) was spiked thanks to a small volume of ethanol dissolved PAH solution

and then aliquots of this sample were transferred into SPE and SPME flasks before addition of IS. In

this manner, the different samples are better homogenized and similar each other even if they are not

fully in agreement with nominal concentration. This technique is another guarantee to reduce ethanol

trace effects and better mimic natural PAHs. For SPE, perdeuterated PAHs were added into water

with a volume ratio around 0.04‰.

This comparative test allowed us to observe a good accuracy of SPME characterization

relatively to spiked theoretical concentration, whereas from 40 to 60% of overestimation were obtained

with SPE (data not shown). These overestimations were inferred to the loss of internal standards (40-

60%) without losing native PAHs. The water/ethanol volume ratio influences thus greatly the partition

of native or perdeuterated standards between water and glass surfaces, since it is the only different

parameter between native and IS spiking. Increasing ethanol percentage in water seems thus to

promote the formation of an organic layer on the water surface that may migrate by capillarity and/or

evaporation to bottle glass. Since similar volume ratios cannot be technically respected for spiking IS

in natural water and as native PAHs are not lost during SPE, IS should therefore be added to SPE

organic eluents. Moreover, SPE quantification was not improved with purification on NH2 (PAH aqua

sorbent) or ionic exchange (SAX sorbent) (discrepancy in accuracy < 10%; data not shown). We have

also tested the extraction of samples whose equilibrium between PAH and DOM should be achieved

(IS spiking the day before the SPE; De Perre et al., in preparation, Bercaru et al. 2006) but without any

improvement in quantification. We can thus conclude that PAH interactions with DOM have lower

effects than PAH glass adsorption on SPE efficiency.


130

Secondly, as natural waters have low concentrations of PAHs, their SPE analysis requires to

extract a higher volume of water than for spiked water. Therefore, breakthrough effect was

investigated on spiked natural matrices. No breakthrough effect is observed on PAH recoveries

(variability < 1%; data not shown) for 1- to 4-liter samples with low DOC content (< 2 mg.L-1

); this is an

expected result since the strong hydrophobicity of PAHs and their affinity for octadecyl chains make

them strongly adsorbed to the sorbent (Marcé and Borrull, 2000). In case of PAH trace levels, large

volumes of samples can thus be extracted.

SPE and SPME methodologies were finally applied and compared in the case of marine

waters with low DOM/PAH content (Figure 7). For SPE, internal standards were added in the organic

elution fraction in order to validate the accuracy of this method. SPE and SPME characterizations are

highly consistent. Heavy PAHs could moreover be detected thanks to SPE, whereas they were not

with SPME. With the addition of internal standards at the end of the extraction, marine waters were

therefore accurately quantified.

0

1

2

3

4

5

NAct

yAct

e FePhe

An

DBT

Fluo

Pyr

BaA

Chry

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ph

2,1B

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BaP P

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A

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n (

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.L-1

)

Eau n°1: dosage SPE Eau n°1: dosage SPME-GC-MS

Eau n°2: dosage SPE Eau n°2: dosage SPME-GC-MS

SPE sample 1

SPE sample 2

SPME sample 1

SPME sample 2

Figure 7. Characterization of PAH contamination of two different marine waters (n = 3 for each) by SPE and

SPME.

Chrys+Triph = Chromatographic co-elution of chrysene and triphenylene.

B(b,k,j)F = Chromatographic co-elution of benzo(b)fluoranthene, benzo(k)fluoranthene and

benzo(j)fluoranthene isomers.

D(ah,ac)A = Chromatographic co-elution of dibenz(ah)anthracene and dibenz(ac)anthracene.

Water PAH contamination screening requires sample filtration in order to quantify on the one

hand dissolved PAHs and on the other hand those adsorbed on suspended particulate matters (SPM).

Both fractions of PAHs could not be simultaneously analyzed until recently. With the objectives to limit

steps, and thus potential compound losses and costs, Werres et al. (2009) developed a disk SPE

protocol for non-filtered waters allowing to extract at the same time both dissolved and particulate


131

PAHs without any problem of clogging of the disk. Furthermore, since SPME extracts free analytes

only, the extraction of a non-filtered sample could provide both freely dissolved (by external

calibration) and total PAH concentrations (thanks to the addition of internal standards) in the same

analysis; it might at least allow to manage the determination of the PAH dissolved concentration with a

minimum of manipulation. We thus preliminarily investigated whether this technique might provide an

interesting and easier alternative to off-line SPE. Two different marine waters were thus extracted by

SPME, and comparisons were made between characterizations of filtered and non-filtered fractions

(Figure 8). SPM PAH concentrations were analyzed by microwave extraction (procedure of Letellier et

al. (1999)) on dried GF/F filters.

Filtered and non-filtered water characterizations are similar for di- and tri-aromatic PAHs,

which is coherent with their low content on SPM relatively to heavier PAHs. For tetra-aromatic PAHs,

slightly higher concentrations are observed when waters have high SPM content and are not filtered.

This result suggests that IS are partitioned between dissolved and solid phases allowing to dose a part

of SPM (about 10%) and dissolved PAHs simultaneously. This may be due to PAH equilibrium time

between water and particulates which could be not achieved leading to an underestimation of total

PAH concentrations. However, light dissolved PAHs can be analyzed without filtration, when SPM

content is relatively low; with higher SPM content, a part of particulate PAHs are simultanously dosed

and cause an overestimation. Moreover, heavy PAHs could not be detected by SPME because of

detection level limitations (> 15 ng.L-1

). Indeed, internal standards, like native PAHs, have a far greater

affinity for the particulate rather than for the dissolved phase, so it is necessary to add a high amount

of compounds to obtain a detectable signal by SPME, increasing the detection limit. These results

allow moreover to highlight the gap between light/heavy native PAH concentrations in some SPM

samples (factors 100 to 2,000), suggesting the need to spike at different level concentrations the

various perdeuterated PAHs in order to respect the linearity range.

Because SPME has shown its advantages in terms of low time-consuming and high

sensitivity, its application to field monitoring studies offers the possibility to increase the number of

samples. However, even if SPME is a fast analytical technique, the accumulation of many samples

could occur and, as extractions cannot always be performed on the day of collection, their storage

may become a necessity. Moreover, whereas SPE and LLE extracts can be stored in organic solvent

before analyses, it is not possible for SPME. Thus, the best conditions to preserve aqueous samples

were investigated for a week.


132

a/

0

2

4

6

8

10

NA

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Act

e Fe

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-1)

Filtered marine water SPMENon filtered marine water SPMEParticulate matter of marine water Sample 1: SPM 1-10 mg.L

-1

b/

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10

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30

NA

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300

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PA

H i

n S

PM

(n

g.L

-1)

Filtered marine water SPMENon filtered marine water SPMEParticulate matter of marine water Sample 2: SPM > 10 mg.L

-1

Figure 8. SPME on filtered and non-filtered natural waters and comparison to PAH concentration of suspended

particulate matter (SPM) (microwave extraction; Letellier et al., 1999), a/ for low SPM content water and b/ high

SPM content water. PAH concentrations on SPM are described by the right y axis. PAH concentrations of

filtered and non-filtered waters (obtained by SPME) are described by the left y axis.

III.3. Optimization of preservation conditions of marine waters

Because of their organic nature, environmental aqueous samples are delicate matrices that

may evolve with time, especially during their storage between sampling time and analyses. Most


133

PAHs can undergo abiotic and biotic degradations owing to oxidation, light radiations or the presence

of micro-organisms. Moreover, these degradations can be direct or indirect; these latter occurring

when organic or mineral matter is first affected and these changes affect PAHs. The most hydrophobic

PAHs can also be lost by adsorption on glass surface and the lightest ones by evaporation. In order to

prevent such phenomena, water samples are generally stored under cooling and opaque conditions

just after collection, during the transport and before analyses. Some chemical treatments may also be

performed to improve conservation like poisoning, acidification or addition of an organic modifier.

First, the storage of filtered and non-filtered (Figure 9) spiked marine water samples in SPME

flasks was investigated at different temperatures (4 °C and -20 °C). Internal standards were added

before storage for some samples (called « with IS ») and on the day of analysis (48h or 7d after initial

time) for the others (called « without IS »). The storage without IS shows a loss of most PAHs after 2

days whatever the temperature. Indeed, storage without IS induces an underestimation of the

concentration ranging from 10 to 35% for filtered and non-filtered waters, except for heavy PAHs in

non-filtered waters stored at -20 °C. The addition of IS before storage (at 4 and -20 °C) improved

quantification of lighter PAHs (from Acty to Pyr) for filtered and non-filtered waters (underestimation

usually < 10%). However, for the heaviest PAHs, an over-estimation occurs especially for non-filtered

samples and/or storage at -20 °C. Naphthalene, the lightest PAH, shows a particular pattern. It is

slightly overestimated at 4 °C without IS and the addition of IS does not improve the quantification.

Moreover, whatever the moment of IS addition, underestimation occurs at -20 °C.

Aqueous samples were stored in SPME flasks in the dark and were directly analyzed without

any manipulation (except IS addition). Despite this storage condition, as shown by results on samples

without IS, a certain amount of all PAHs (until 35%) is lost within 48h; likely owing to

degradation/photolysis. Despite the low number of studies and discrepancies between experimental

designs, experimental PAH half-lives in an aqueous medium range from a few minutes (for most of the

heaviest PAHs) to a few days under simulated solar radiations in the aqueous medium (Kochany and

Maguire, 1994; Bertilsson and Widenfalk, 2002; Huang et al., 1995; Jacobs et al., 2008). In our study,

BaP, An and maybe DahA (its high variability requires caution for this compound) present a higher

extent of losses than other compounds. These compounds figuring among the most reactive PAHs

(Zepp and Schlotzhauer, 1979; cited by Payne and Phillips, 1985), they may be lost by

photodegradation. However, all other PAHs are lost in a quite similar percentage; the

photodegradation cannot thus fully explain the observed patterns. We can also presume that glass

adsorption (for heavy PAHs) and volatilization (for the lightest ones) may be responsible for losses.

Furthermore, freshly added perdeuterated PAHs (just before analysis) may not be at equilibrium (with

glass, dissolved and particulate matter) as well as 48h and 7d aged native PAHs so the correction

thanks to IS cannot be complete and underestimation of native PAHs occurs. Deuterated PAHs are

added to water by the means of an ethanol solution (v/v 2‰) that may increase their aqueous

solubilities; they may be thus less exposed to glass adsorption than native PAHs that were not directly

spiked in SPME flasks, and whose ethanol/water volume ratio is greatly lower (0.1‰). Native PAHs


134

may also be trapped in matter and/or ―strongly‖ adsorbed on glass; increasing deuterated PAH

solubility with ethanol may induce lower affinity for matter. However underestimations are not

generally higher for non-filtered waters relatively to filtered ones. Since the particulate content in

marine water is relatively low (< 5 mg.L-1

), its influence on equilibrium time may be low.

a/

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

NAct

yAct

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An

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Filtered T+48h; with IS; 4°C Non-filtered T+48h; with IS; 4°CFiltered T+7d; with IS; 4°C Non-filtered T+7d; with IS; 4°CFiltered T+7d; with IS; -20°C Non-filtered T+7d; with IS; -20°C

b/

-50

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es

tim

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(%

)

Filtered T+48h; without IS; 4°C Non-filtered T+48h; without IS; 4°CFiltered T+7d; without IS; 4°C Non-filtered T+7d; without IS; 4°CFiltered T+7d; without IS; -20°C Non-filtered T+7d; without IS; -20°C

Figure 9. Error quantification for filtered and non-filtered samples a/stored without IS and b/initially spiked with

IS: expressed as percentage difference between Tx and T0 concentrations. T0 analyses were realized just after IS

spiking; perdeuterated PAH equilibrium between dissolved phase and matter was therefore not achieved.


135

When IS are immediately spiked in samples before storage, partitions of deuterated and native

PAHs are more equal between each other. Therefore, no underestimation is done on the quantification

of PAHs at T48h and T7d. However, the underestimation occuring at T0 causes an over-estimation of

PAHs in samples ―with IS‖, especially for heavy PAHs, in the presence of particles and at -20 °C,

which are the less favorable conditions to achieve equilibrium quickly. Consequently, the over-

estimation of PAHs when IS are added before the storage is only apparent and to have an accurate

quantification, it is necessary to add IS just after the sampling and to wait for equilibrium before

analyses.

Therefore, the best conditions are the addition of IS before the storage in the dark and at 4 °C

since it allows quantification with errors less than 10% even after 7 days. However, the storage of non-

filtered samples is unadvisable, especially for heavy PAH quantification. These conditions were tested

on non-spiked marine water in order to determine their benefit at trace level. The results have shown

that quantification errors on tri- to tetra-aromatic PAHs are below 0.5 ng.L-1

(for filtered and non-filtered

samples) but naphthalene is largely overestimated for filtered waters (+200%). Moreover, the use of

an organic modifier has been tested but there is no benefit to add methanol or formol to aqueous

samples. As a preliminary test in our laboratory showed a loss of most sensitive PAHs (Acty, An, BaA,

BaP, Per) in acid waters at pH 3 (Figure 10) during SPME extraction (PDMS 100 µm), acidification of

samples was not considered here to be a useful method to store them and has not been tested.

However, the PAH loss seems to be a particular case observed with PDMS 100 µm since PAH

abundances do not change at pH 3 with PDMS-DVB. Finally, since samples waiting for extraction for a

few hours on the GC rack may evolve, conservation in ambient conditions (22 °C, natural light) has

also been investigated. Natural light in the GC room was however greatly reduced thanks to

permanent UV filters on window glass and curtains. The ambient temperature was maintained at

22 °C (± 2 °C) thanks to air conditioning. When samples are waiting on the GC rack, losses of tri- to

tetra-PAHs are lower than 1 ng.L-1

for filtered waters but higher for non-filtered water (< 5 ng.L-1

).

These losses may not induce error on quantification when they are IS spiked, but will influence

detection limits. Since detection limits are lower than 0.7 ng.L-1

, one can consider that better storage

conditions on the GC rack are not required if samples are waiting for less than one day in these

ambient conditions.


136

BaA Chrys Acty Phe An BbF

+

BkF

BePBaP

Per

a/

b/

c/

BaA Chrys Acty Phe An BbF

+

BkF

BePBaP

Per

a/

b/

c/

Figure 10. Chromatogram of several PAHs extracted a/ with a PDMS 100 µm fiber at pH 7, b/ with a PDMS-

DVB 65 µm fiber at pH 3, c/ with a PDMS 100 µm fiber at pH 3.

IV. Conclusion

SPE and SPME are two efficient methodologies available to dose dissolved PAHs in an

aqueous medium. Good accuracy and sensitivity were demonstrated for both, although each one

shows some limitations. Although SPME shows greater limitations for heavy PAH analysis than SPE

does, this technique offers an easy and accurate tool highly interesting for environmental monitoring.

The efficiency of the methods is based on the use of perdeuterated homologues or isomers as internal

standards that well mimic partition of native PAHs between water and matter. Furthermore, the

selectivity of SPME was high but can be improved by coupling to tandem mass spectrometry, making

analyses of very complex matrices possible. Regarding SPE, it is interesting to note that, contrary to

expectations, the addition of internal standards can disturb the quantification which is more accurate

when they are added after the extraction. Moreover, the presence of DOM did not modify the

extraction and the use of purifying cartridges is not necessary for river waters of intermediate

dissolved organic matter content (around 10 mg.L-1

of carbon).

With the objectives to simplify methodology and to gain on accuracy and analysis cost,

preliminary tests of non-filtered water analyses were performed. Even though the analysis of total

heavy PAHs in water requires further developments to improve their sensitivity, the efficiency of SPME

to dose total low molecular weight PAHs in both dissolved and particulate phases has been shown.

SPME offers thus a remarkable tool able to dose accurately dissolved major PAHs in waters. After

further improvements, this tool could be able to dose total concentrations from light to heavy PAHs

without any sample preparation. Moreover, if analyses need a delay, SPME samples can be simply

stored at 4 °C for one week thanks to the initial addition of these perdeuterated compounds. SPME


137

requires however recurrent instrumentation controls and cares. SPE provides moreover an accurate

alternative tool.

Acknowledgements

“Région Aquitaine‖, ORQUE program, ANR Emestox, CPER A2E are acknowledged.

Literature

Arthur C. L. & Pawliszyn J. (1990) Solid phase microextraction with thermal desorption using fused

silica optical fibers. Analytical Chemistry 62(19), 2145-2148.

Baumard P., Budzinski H., Garrigues P., Narbonne J. F., Burgeot T., Michel X. & Bellocq J.

(1999) Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) burden of mussels (Mytilus sp.) in different

marine environments in relation with sediment PAH contamination, and bioavailability. Marine

Environmental Research 47(5), 415-439.

Bercaru O., Ulberth F., Emons H. & Vandecasteele C. (2006) Accurate quantification of PAHs in

water in the presence of dissolved humic acids using isotope dilution mass spectrometry.

Analytical and Bioanalytical Chemistry 384(5),1207-1213.

Bertilsson S. & Widenfalk A. (2002) Photochemical degradation of PAHs in freshwaters and their

impact on bacterial growth - influence of water chemistry. Hydrobiologia 469, 23-32.

Busetti F., Heitz A., Cuomo M., Badoer S. & Traverso P. (2006) Determination of sixteen polycyclic

aromatic hydrocarbons in aqueous and solid samples from an Italian wastewater treatment

plant. Journal of Chromatography A 1102(1-2), 104-115.

Fernandes M. B., Sicre M. A., Boireau A. & Tronczynski J. (1997) Polycyclic aromatic hydrocarbon

(PAH) distributions in the Seine River and its estuary. Marine Pollution Bulletin 34(11), 857-

867.

Huang X. D., Dixon D. G. & Greenberg B. M. (1995) Increased Polycyclic Aromatic Hydrocarbon

Toxicity Following Their Photomodification in Natural Sunlight: Impacts on the Duckweed

Lemna gibba L. G-3. Ecotoxicology and Environmental Safety 32(2), 194-200.

Jacobs L.E., Weavers L. K. & Chin Y.-P. (2008) Direct and indirect photolysis of polycyclic aromatic

hydrocarbons in nitrate-rich surface waters. Environmental Toxicology and Chemistry 27,

1643-1648.

Jacobsen A. M., Halling-Sørensen B., Ingerslev F. & Honoré Hansen S. (2004) Simultaneous

extraction of tetracycline, macrolide and sulfonamide antibiotics from agricultural soils using

pressurised liquid extraction, followed by solid-phase extraction and liquid chromatography-

tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A 1038(1-2), 157-170.

Junk G. A. & Richard J. J. (1988) Solid phase extraction on a small scale. Journal of research of the

National Bureau of Standards 93(3), 274-276.

Kiss G., Varga-Puchony Z. & Hlavay J. (1996) Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in

precipitation using solid-phase extraction and column liquid chromatography. Journal of


138

Chromatography A 725(2), 261-272.

Kochany J. & Maguire R. J. (1994) Abiotic transformations of polynuclear aromatic hydrocarbons

and polynuclear aromatic nitrogen heterocycles in aquatic environments. The Science of The

Total Environment 144(1-3), 17-31.

Law R. J., Dawes V. J., Woodhead R. J. & Matthiessen P. (1997) Polycyclic aromatic hydrocarbons

(PAH) in seawater around England and Wales. Marine Pollution Bulletin 34(5), 306-322.

Letellier M., Budzinski H., Bellocq J. & Connan J. (1999) Focused microwave-assisted extraction of

polycyclic aromatic hydrocarbons and alkanes from sediments and source rocks. Organic

geochemistry 30(11), 1353-1365.

Li N. & Lee H. K. (2001) Assessment of colloid formation and physical state distribution of trace

polycyclic aromatic hydrocarbons in aqueous samples. Analytical Chemistry 73(21), 5201-

5206.

Lord H. & Pawliszyn J. (2000) Evolution of solid-phase microextraction technology. Journal of

Chromatography A 885(1-2), 153-193.

Luo X., Mai B., Yang Q., Fu J., Sheng G. & Wang Z. (2004) Polycyclic aromatic hydrocarbons

(PAHs) and organochlorine pesticides in water columns from the Pearl River and the Macao

harbor in the Pearl River Delta in South China. Marine Pollution Bulletin 48(11-12), 1102-

1115.

Maldonado C., Bayona J. M. & Bodineau L. (1999) Sources, Distribution, and Water Column

Processes of Aliphatic and Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in the Northwestern Black Sea

Water. Environmental Science and Technology 33(16), 2693-2702.

Marcé R. M. & Borrull F. (2000) Solid-phase extraction of polycyclic aromatic compounds. Journal of


Maskaoui K., Zhou J. L., Hong H. S. & Zhang Z. L. (2002) Contamination by polycyclic aromatic

hydrocarbons in the Jiulong River Estuary and Western Xiamen Sea, China. Environmental

Pollution 118(1), 109-122.

Mitra S. & Bianchi T. S. (2003) A preliminary assessment of polycyclic aromatic hydrocarbon

distributions in the lower Mississippi River and Gulf of Mexico. Marine Chemistry 82(3-4), 273-

288.

Olivella M. À. (2006) Polycyclic aromatic hydrocarbons in rainwater and surface waters of Lake

Maggiore, a subalpine lake in Northern Italy. Chemosphere 63(1), 116-131.

Pawliszyn J. & Pedersen-Bjergaard S. (2006) Analytical Microextraction: Current Status and Future

Trends. Journal of Chromatographic Science 44(6), 291-307.

Payne J. & Phillips C. (1985) Photochemistry of petroleum in water. Environmental Science and

Technology 19(7), 569-579.

Røe Utvik T. I., Durell G. S. & Johnsen S. (1999) Determining produced water originating polycyclic

aromatic hydrocarbons in North Sea waters: comparison of sampling techniques. Marine

Pollution Bulletin 38(11), 977-989.

European Union (EU) (1998) Water framework directive 98/83/CE.

European Union (EU) (2005) Common implementation strategy for the water framework directive:


139

envionmental quality standards (EQS), substance data sheet, Priority substance No.28:

Polycyclic Aromatic Compounds.

Urbe I. & Ruana J. (1997) Application of solid-phase extraction discs with a glass fiber matrix to fast

determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in water. Journal of Chromatography A

778(1-2), 337-345.

Werres F., Balsaa P. & Schmidt T. C. (2009) Total concentration analysis of polycylic aromatic

hydrocarbons in aqueous samples with high suspended particulate matter content. Journal of

Chromatography A 1216(12), 2235-2240.


141

Development of Solid-Phase Microextraction (SPME) and its

Application to the Study of Dissolved Organic Matter (DOM) -

Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH) Interactions in Aquatic

Environment

Chloé de Perre, Karyn Le Ménach, Fabienne Ibalot, Edith Parlanti, Hélène Budzinski

Abstract

SPME-GC-MS was developed for the study of interactions between PAHs and DOM. After the

determination of the best conditions of extraction, the tool was applied to spiked water to calculate the

dissolved organic carbon – water distribution coefficient (KDOC) in presence of different mixtures of

PAHs and Aldrich humic acid. For the first time, KDOC values of 18 PAHs were calculated thanks to

SPME-GC-MS and fluorescence quenching; they were in agreement with the ones available in the

literature. Competition between PAHs, deuterated PAHs and DOM was shown, pointing out the non-

linearity of PAH-DOM interactions.

Publication n°3


142

Développement de la Micro-Extraction sur Phase Solide (SPME) et

application à l’étude des interactions Matière Organique Dissoute

(MOD) - Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) dans

l’environnement aquatique

Résumé

La SPME-GC-MS a été développée dans le but d‘étudier les interactions entre les HAP et la

MOD. Après la détermination des conditions optimales d‘extraction, l‘outil a été appliqué à des eaux

supplémentées afin de quantifier les coefficients de partition eau – carbone organique dissous (KDOC)

en présence de différents mélanges de HAP et d‘acide humique Aldrich. Pour la première fois, des

valeurs de KDOC ont été calculées pour 18 HAP grâce à la SPME-GC-MS et/ou à l‘extinction de

fluorescence ; les valeurs obtenues étaient de l‘ordre de grandeur de celles disponibles dans la

littérature. Des phénomènes de compétition entre les HAP, les HAP deutérés et la MOD ont pu être

mis en évidence, ainsi que la non-linéarité des interactions HAP-MOD.


143

I. Introduction

Natural organic matter is a complex mixture of macromolecules originating from the biological

and chemical degradation of plants or animals. In aquatic systems, organic macromolecules smaller

than 0.45 µm constitute the Dissolved Organic Matter (DOM). This fraction is well known for being

able to modify the distribution (Haitzer et al. 1998, Yates et al. 1997), the bioavailability (Akkanen et al.

2001), the degradation (Seibel et al. 1996, Wang et al. 1995) or the toxicity (Haitzer et al. 1998) of

organic compounds, and particularly of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs). PAHs are

hydrophobic organic compounds coming mainly from petroleum and incomplete combustion of organic

matter. They are introduced into surface waters via atmospheric fallout, municipal effluents, leaching

or by oil spills. They are of concern for the environment since some of them are mutagenic or

carcinogenic (Abrajano et al. 2003).

To quantify the impact of DOM on the PAH fate, it is necessary to study the strength of

interactions occurring between them. A few techniques can be used to study the interactions between

DOM and PAHs, each of them with advantages and drawbacks. One of them, the fluorescence

quenching, does not require the separation of free compounds from those associated with DOM.

However, this technique seems to be hardly applicable to natural environment (Gauthier et al. 1986).

Other techniques, in particular extraction or separation methods, can be used associated with

analytical techniques: dialysis, ultrafiltration, reverse phase chromatography or more recently Solid-

Phase Microextraction (SPME). However, reverse phase chromatography was shown to disturb the

equilibrium (Kukkonen and Pellinen 1994), ultrafiltration and dialysis could raise sorption problems for

hydrophobic compounds due to adsorption on the membrane that makes it difficult to analyze free

analytes (Woolgar and Jones 1999, Heringa and Hermens 2003). SPME seems to be the most

promising technique since it appears to be faster, more sensitive and simple than other techniques

and it is solvent free (Lord and Pawliszyn 2000, Heringa and Hermens 2003). SPME was developed

by Pawliszyn at the beginning of the 1990s. It consists in a fiber coated with a polymer that adsorbs or

absorbs analytes in a liquid, solid or gas sample. Then analytes are transferred into a liquid or gas

chromatograph before being analyzed after thermal or solvent desorption.

The aim of this study was to develop SPME coupled to Gas Chromatography and Mass

Spectrometry (GC-MS) and to compare it with dialysis and fluorescence quenching methodologies to

get to know the applicability domain of these three techniques and to characterize interactions

between DOM and PAHs.


144

II. Materials and methods

II.1. Organic compounds

Four PAHs (phenanthrene, fluoranthene, chrysene, benzo[a]pyrene) were used as model

compounds for analytical developments and their corresponding perdeuterated PAHs as internal

standards for quantitative calibration in SPME (Table 1).

PAHs Purity

(%) Supplier m/z

Deuterated PAHs

Isotopic purity

(%) Supplier m/z

Naphthalene (N) 99+ Aldrich 128 N d8 98 EGA-Chemie 136

Acenaphthylene (Acy) 99+ Aldrich 152 Acy d8 98 Promochem (CIL) 160

Acenaphthene (Ace) 99 Aldrich 154 Ace d10 99 Promochem (CIL) 164

Fluorene (Flu) 99+ Aldrich 166 Flu d10 98 Promochem (CIL) 176

Dibenzothiophene (DBT) 99 Acros 184 DBT d8 99 MSD Isotopes 192

Phenanthrene (Phe) 99 Aldrich 178 Phe d10 98 CIL 188

Anthracene (An) 98 Labosi 178 An d10 98 CIL 188

Fluoranthene (Fluo) 99 Aldrich 202 Fluo d10 99.2 MSD Isotopes 212

Pyrene (Pyr) 99+ Fluka 202 Pyr d10 98 CIL 212

Benzo[a]anthracene (BaA) 99 Aldrich 228 BaA d12 98 Promochem (CIL) 240

Chrysene (Chrys) 99+ Fluka 228 Chrys d12 98 MSD Isotopes 240

Benzo[b]fluoranthene (BbF) 99 Aldrich 252 BbF d12 98 CIL 264

Benzo[k]fluoranthene (BkF) 98 Aldrich 252 BkF d12 98 Promochem (CIL) 264

Benzo[e]pyrene (BeP) 99 Aldrich 252 BeP d12 98 CIL 264

Benzo[a]pyrene (BaP) 97 Aldrich 252 BaP d12 98 CIL 264

Perylene (Per) 99+ Aldrich 252 Per d12 99.5 MSD Isotopes 264

Indeno[1,2,3-cd]pyrene (IP) 99 Promochem 276 IP d12 98+ Promochem (CIL) 288

Benzo[g,h,i]perylene (BP) 99.7 Promochem 276 BP d12 98 CIL 288

Dibenz[a,h]anthracene (DahA)

97 Aldrich 278 DahA d14 98 Promochem (CIL) 292

Table 1. Model compounds and internal standards

After development, interactions were studied for the 19 PAHs listed in Table 1. Solutions of

PAHs were prepared in ethanol and then 50 µL of a solution of 25 µg.g-1

were added to 1L of ultrapure

water (MilliQ, Millipore, Molsheim, France) to get an aqueous solution of 1 µg.L-1

for each PAH. To

have a good homogenization of this aqueous solution, it was ultrasonicated for 5 min but no magnetic

agitation was performed to avoid the adsorption of PAHs on the stirring bar (that could reach 20% for

BaP, results not shown). These aqueous solutions were experimentally characterized thanks to Liquid-

Liquid Extraction (LLE) with dichloromethane followed by GC-MS analysis. Deuterated PAHs were

dissolved in ethanol at a concentration of 250 ng.g-1

and diluted in ethanol if necessary. Solvents used

were ethanol absolute HPLC grade (Scharlau Chemie S.A, Sentmenat, Spain) and dichloromethane

for residue and pesticide analysis (Acros Organics, Geel, Belgium).


145

DOM used for this study was Aldrich humic acid (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Germany). This humic acid was added to 500 mL of pure water to obtain an aqueous solution of DOM

and then this latter was filtered on a GF/F (Whatman, Maidstone, England) glass fiber filter (0.7 μm).

The concentrations of Dissolved Organic Carbon (DOC) were measured using a Shimadzu TOC-V

CSN (Shimadzu, Duisburg, Germany). Several aqueous solutions of Aldrich humic acid were prepared

for the experiment but all were around 11 mg.L-1

and then characterized precisely.

II.2. Experimental protocols and analytical tools

II.2.1. SPME-GC-MS

SPME analyses of the 10 mL spiked water samples were performed with commercially

available PDMS (polydimethylsiloxane) and PDMS-DVB (divinylbenzene) coated fibers from Supelco

(Bellefonte, USA). Different sizes of PDMS coating were compared (7 µm and 100 µm) and various

parameters (extraction and desorption times, temperature, liner type…) had to be optimized. After the

immersion of the fiber in the sample, it was immediately desorbed into the GC-MS injection port.

Analyses were performed in automated mode thanks to a Combipal (CTC Analytics, Zwingen,

Switzerland).

The GC was an Agilent 6890 model (Agilent Technologies, Massy, France) equipped with a

mass selective detector, model 5972, with an energy of ionization of 70 eV (electronic impact). The

column used was a HP-5MS ((5%-phenyl)-methylpolysiloxane; 30 m 0.25 mm i.d.; 0.25 µm film;

Agilent Technologies, Chromoptic, Courtaboeuf, France). Both SPME and direct liquid injection (after

LLE) were performed in the pulsed splitless mode - the pulse pressure was 30 psi for 1 min, after 2

min the purge flow to split vent was 55 mL.min-1

and the gas saver was set at 20 mL.min-1

after 15 min

- and the inlet temperature was 250 °C. The carrier gas was helium (purity 5.6, Linde Gas, Toulouse,

France) with a constant flow rate of 1.3 mL.min-1

and a linear velocity of 42 cm.s-1

. The column

temperature was held initially at 60 °C for 2 min, increased to 150 °C at 20 °C.min-1

, then to 250 °C at

15 °C.min-1

and to 310 °C at 10 °C.min-1

and finally held on for 3 min. For the determination of PAHs,

GC/MS was operated in the Selected Ion Monitoring (SIM) acquisition mode and only the molecular

ions were sought (Table 1). A dwell time of 80 ms was used for each ion and the scan rate was 1.31

cycle.s-1

.

Interactions between PAHs and the dissolved Aldrich humic acid were first studied by

changing the concentration of DOM (ranging from 0 to 5.5 mg.L-1

of DOC) and keeping the total

concentration of PAHs constant (1 µg.L-1

of each) by both SPME and fluorescence quenching. Natural

waters can be more concentrated in DOC since concentrations usually vary from 0.5 to 50 mg.L-1

,

depending on the source of DOM (Haitzer et al. 1998). However, commercial humic acid was shown

to have stronger interactions with PAHs than natural waters (Durjava et al. 2007), so a high

concentration of Aldrich humic acid was not necessary and caused troubles in fluorescence analysis


146

due to the ―inner filter effect‖. All samples contained the same volume of water, of solvent and the

same concentration of PAHs; only the concentration of DOM varied. Then, the concentration of DOM

was kept constant (3 mg.L-1

of DOC) whereas the concentrations of PAHs varied from 0.01 to 1 µg.L-1

(by SPME only). To quantify the free and total concentrations, standards were made with spiked

waters at known concentrations of PAHs and deuterated PAHs to calculate the response factors using

the SPME-GC-MS for the various studied PAHs. As these aqueous standards provided the same

response factors on the range 0.1 - 1 µg.L-1

, they were eventually made at only one concentration (50

- 100 ng.L-1

). Two aqueous standards were extracted at the beginning and at the end of each SPME-

GC-MS sequence and the mean value of the four response factors was used. Moreover, before each

sequence, the sensitivity of the GC-MS system was checked thanks to manual direct liquid injection of

deuterated PAHs.

Because pH can play an important part in the nature and the force of interactions between

DOM and PAHs (Schlautman and Morgan 1993), it was controlled for all experiments and it slightly

varied from 6.8 to 7.1 between the lowest and the highest Aldrich humic acid concentrations.

II.2.2. Fluorescence analysis

Interactions were also studied by analysis of the quenching of PAH fluorescence thanks to the

addition of DOM to the samples. Indeed, the fluorescence quenching technique is based here on the

decrease of PAH fluorescence when DOM is added, due to the formation of a non-fluorescent PAH-

DOM complex (static quenching) (Gauthier et al. 1986).

Absorption measurements were recorded with a Jasco V-560 spectrophotometer (Jasco,

France) equipped with deuterium and tungsten iodine lamps and fluorescence spectra with a

Fluorolog FL3-22 spectrofluorometer (Jobin Yvon, France) equipped with a xenon lamp (450 W).

Analyses were made with 1 cm quartz cells (Hellma, France). All the fluorescence spectra were

obtained at a constant temperature of 20 °C, with an integration time of 0.5 s, an increment of 1 nm,

excitation and emission band paths of 4 nm and in the Sc/R mode (the sample signal (S) is

automatically multiplied by the emission correction (c) factors and normalized by the lamp reference

signal (R)).

The samples used were at the same concentrations of PAHs and DOM as the SPME ones but

PAHs were studied individually because of the fluorescence emission spectra overlapping in mixture.

Moreover, fluoranthene was replaced by pyrene since the fluorescence intensity of fluoranthene is low

and overlaps with Aldrich humic acid fluorescence and SPME showed that these two compounds have

a similar fate in terms of interactions. For each PAH, the fluorescence spectrum was registered for the

sample with DOM and PAH, and so was the sample with DOM only. These two samples were strictly

identical in their composition and concentration of DOM but one was spiked with 15 µL of EtOH

whereas the other was spiked with 15 µL of one PAH dissolved in EtOH (weighed to find out the exact


147

PAH concentrations). After that, the two spectra were subtracted to recover only the PAH spectrum

and to eliminate DOM fluorescence background. Finally, the spectra of PAHs were normalized to a

PAH concentration of 1 µg.L-1

to be able to compare spectra for exactly the same PAH concentrations.

Before the interaction study, the best excitation and emission wavelengths were determined for each

PAH; excitation/emission couples were 251/347 nm for phenanthrene, 230/373 nm for pyrene,

269/400 nm for chrysene and 296/405 nm for benzo[a]pyrene. These wavelengths were chosen to

maximize their intensities and to minimize the overlap with Aldrich humic acid fluorescence. In addition

to the fluorescence analysis, the UV-visible absorption of the samples was measured to know the

absorbance values at excitation and emission wavelengths to correct the ―inner filter effects‖, as

described by MacDonald et al. (1997) in their mathematical correction. The correction factors varied

from 1 to 2.3 depending on the compound and the DOM concentration and were thus less than the

maximal factor of 3 recommended by Parker (1968).

Additionally, fluorescence quenching was also used to determine the equilibrium time of PAH-

DOM interactions. Analyses of phenanthrene and benzo[a]pyrene fluorescence in presence of 1

mg.L1

of DOC were compared at different times during a 24h period and it appeared that equilibrium

was reached in less than 5h for both PAHs without any agitation (Figure 1). Therefore, in order to be

sure all the experiments were performed at the equilibrium point, each sample was agitated manually

for a few seconds and then left in the dark at 4°C overnight before fluorescence quenching and SPME

analyses.

0

20

40

60

80

100

120

0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 1650

time (min)

Flu

ore

sc

en

ce

in

ten

sit

y (

%)

Phe BaP

Figure 1. Time course of quenching of phenanthrene and benzo[a]pyrene fluorescence.

Fluorescence intensity is expressed in percentage in relation to the fluorescence at t = 0 min, [Phe] = 2 µg.L-1

with [COD] = 1.5 mg.L-1

, [BaP] = 1 µg.L-1

with [COD] = 0.8 mg.L-1

.


148

II.2.3. Dialysis experiment

The third technique used to study the interactions was dialysis coupled to an extraction of

PAHs by LLE and an analysis by GC-MS for quantification. The dialysis membranes were in cellulose

ester (Spectra/Por Biotech, wet in 0.1% sodium azide, Spectrum Europe, the Netherlands) with

molecular weight cut-offs of 500 and 1000 Da. The membranes were cut and washed before use.

Many solvents (ultrapure water, EtOH 10% or HCl 5%) were tested in order to get the best blank but

neither EtOH nor HCl improved the dialysis bag cleaning (regarding fluorescence intensity due to

membrane bleeding). Consequently, the membranes were rinsed thoroughly and soaked overnight in

ultrapure water and then rinsed thoroughly again. After that, they were knotted and filled either with 10

mL of the sample and plunged into a 500 mL bottle of ultrapure water, or with 10 mL of MilliQ water

and plunged into 500 mL of sample. First, the sample was made with only ultrapure water spiked with

PAHs at 1 µg.L-1

in order to determine the time required to achieve equilibrium of PAH concentrations

inside and outside the bag. To study interactions with DOM, this latter was added to PAHs in the

dialysis bag. Once the equilibrium is reached, free PAHs are theoretically in the same concentration

inside and outside the bag whereas DOM-bound PAHs are only in the bag. Thus, the concentration of

bound PAHs is equal to the difference between the total concentration of PAHs inside the bag and the

concentration outside the bag. During all the dialysis experiments, the samples were agitated thanks

to a shaking table.

II.3. Experimental precautions

All the glassware, after a careful cleaning with detergent (TFD 7, Franklab, France) and rinsing

with ultrapure water, was heated at 450 °C overnight before using it for PAH analyses and it was also

rinsed with ultrapure water before DOC and spectrofluorometry analyses. For the SPME and LLE

experiments, blanks were made to check the PAH ambient pollution and to be aware of a possible

contamination of the samples. In SPME, blanks were performed by extracting an empty flask for 10

seconds to check the good desorption of the previous analysis. Generally, blanks represented less

than 1% of the PAH areas of samples. For spectrofluorometry experiments, blanks of ultrapure water

were made to test the cleanness of cells and to correct spectra for the Rayleigh and Raman scattering

bands.

II.4. KDOC calculations

In order to study the interactions of PAHs with DOM, it is necessary to define the partition

coefficient of PAHs. First, we assumed that PAHs can interact with DOM in this way:

PAHDOMPAHDOM (1). So, the equilibrium coefficient, also called partition coefficient, was

[DOM][PAH]

PAH][DOMKDOM

or

free

DOMDOM

[DOM][PAH]

[PAH]K with DOM[PAH] the concentration of PAHs bound

to DOM, free[PAH] the concentration of freely dissolved PAHs in water and [DOM] the concentration of


149

DOM in water. However, DOM concentration is hard to quantify, so the DOC concentration was used

and the partition coefficient took the shape of free

DOCDOC

[DOC][PAH]

[PAH]K (2).

SPME-GC-MS and dialysis-LLE-GC-MS give free and total PAH concentrations, so [PAH]DOC

was deduced by the equation : [PAH]DOC = [PAH]total – [PAH]free (3). It follows the Stern-Volmer

equation: 1[DOC]K[PAH]

[PAH]DOC

free

total (4). To be able to compare KDOC values with other studies, they

were expressed in mL.g-1

.

With the technique of fluorescence quenching, PAH concentrations were not calculated. The

intensities of PAHs in absence and in presence of DOM were used to calculate the KDOC by means of

the Stern-Volmer equation: 1[DOC]KF

FDOC

0 (5), with F0 the fluorescence intensity of PAHs

without DOM and F in presence of DOM.

III. Results and discussion

III.1. Optimization of SPME-GC-MS conditions

First, optimizations of the SPME-GC-MS were performed with 4 PAHs (phenanthrene,

fluoranthene, chrysene, benzo[a]pyrene). As far as the fiber is concerned, a non polar PDMS coating

is recommended for the analysis of non polar compounds in a complex matrix. For the more polar

compounds, PDMS-DVB can improve the fiber capacity of retention thanks to - interactions with

aromatic DVB. Moreover, the fiber thickness is also important since the thicker the coating is, the more

sensitive it is. Three kinds of fiber have therefore been tested: PDMS 100 µm, PDMS-DVB 65 µm and

PDMS 7 µm and then PDMS 100 µm with a thicker gauge (23g instead of 24g) and one with the core

in metal alloy (instead of fused silica). The thicker gauge fibers and the metal alloy one were tested

since they should reduce breakage of the fibers thanks to the better solidity and flexibility of the needle

respectively. Moreover, these kinds of fiber are advised to be used with a septum-less seal (Merlin

Microseal system), so that no problem of septum coring can occur (Pawliszyn and Pedersen-

Bjergaard 2006). The areas of GC-MS peaks (obtained with the same extraction time) are reported in

Figure 2.


150

0E+00

1E+05

2E+05

3E+05

Phe Fluo Chrys BaP

GC

-MS

are

as

All the fibers tested were neither new nor too old (between 25 and 70 extractions had already

been performed with them). Indeed, the newest fibers (25- and 30-extractions) appeared to be the

least reproducible for heavy PAHs. The optimum age appeared to be about 50 extractions: they

seemed less reproducible before and less sensitive after 130 - 150 extractions, or 200 - 250 for the

PDMS 100 µm 23g. The most sensitive fibers were the PDMS 100 µm 23g and 24g but the 23g

benefited from a longer durability. Contrary to expectations, the metal alloy fiber was far less sensitive

than the other PDMS 100 µm ones. It seemed to be due to a bad desorption of compounds since the

fiber blanks represent up to 20% in the area of the samples at 0.1 µg.L-1

(instead of < 1% for the fused

silica PDMS fibers). Moreover, an increase of desorption temperature from 250 °C to 280 °C did not

solve these problems of contaminated blanks. Therefore, the classical PDMS 100 µm 23g fiber was

kept for the extraction of samples since it provided good sensitivity and reproducibility for all PAHs.

After the choice of the fiber, it was necessary to choose the most appropriate liner. Actually,

two sorts of injectors can be employed: standard GC or SPME ones. Indeed, narrower inserts

especially made for SPME should increase the linear flow around the fiber, resulting in an efficient

removal of desorbed compounds (Lord and Pawliszyn 2000). Nevertheless, a few studies have shown

that direct injection (DI) inserts improve the transfer of sample molecules onto the chromatographic

column even for SPME analysis (Ouyang et al. 2005). Therefore, these two kinds of inserts were

tested. There was no significant difference between the two inserts when comparing the average

areas but chromatographic peaks seemed to be a little thinner with the SPME liner so this latter was

finally chosen.

Once the fiber and injector determined, it was necessary to find out the best conditions of

extraction. First, the most important factor is the extraction time. This parameter has been tested from

Figure 2. Sensitivity and reproducibility with different fibers. Extraction time = 30 min, [PAH] = 1 µg.L-1

, n=3.

: PDMS 100 µm 24g, : PDMS 100 µm 23g, : metal alloy PDMS 100 µm 23g, : PDMS-DVB 65 µm 24g,

: PDMS 7 µm 24g.


151

10 to 300 min and no equilibrium between PDMS and water was achieved. However, the duration of

fiber immersion can be lower than the time necessary to reach an equilibrium between the sample and

the fiber if it is perfectly reproducible (Lord and Pawliszyn 2000). A short time of extraction can thus be

applied and is advised for interaction studies (Ramos et al. 1998), but a longer extraction time

provides a better sensitivity. A compromise was done with an immersion time of 30 min, which made it

possible to obtain a sufficient sensitivity for a good quantification of analytes and a relatively short time

of analysis.

As the influence of temperature on the PAH-DOM equilibrium is not negligible (Lüers and Ten

Hulscher 1996), a temperature of 40 °C was chosen and maintained constant through all experiments.

Desorption of the absorbed compounds by the fiber in the GC injector also plays an important part on

analytical performance. Indeed, it is necessary that all absorbed compounds be desorbed from the

fiber, on the one hand, to obtain the best possible sensitivity and on the other hand, not to distort the

successive extractions. The time necessary for a complete desorption is short (a few minutes) when

the temperature of the injector is rather high (Lord and Pawliszyn 2000). However, in order to

condition the fiber before each extraction, this one was maintained in the injector for 30 min at 250 °C

while compounds were eluted from GC column and analyzed during the GC run. Thus, each sample

was analyzed in one hour (30 min of extraction and 30 min of desorption-analysis). As regards the

temperature of desorption, no statistical difference was observed between 250 and 270 °C (results not

shown), even though variability seemed to be a little bit better at 270 °C. However, the variability in

SPME-GC-MS areas can be due to several factors: variability of the fiber sensitivity, variability of the

GC-MS, variability of the sample concentration during the time of analysis… This last variability may

be due to evaporation (especially for light PAHs) or adsorption and photodegradation during the

SPME analysis, since the samples can be left on the tray for more than 24h. Setkova et al. (2007)

suggested placing an aluminum foil on the top of the septum as a barrier layer to minimize or eliminate

evaporation. Tests were made but no true enhancement of recoveries and reproducibility were

observed (results not shown). So the variability of concentrations in the flasks may be due not only to

evaporation and a loss less than 5% was considered satisfactory without any aluminum foil. To

determine which part of the system was responsible for the variability, the same solution of PAHs was

diluted in isooctane and injected directly into the GC-MS in automated mode (n = 27). It appeared that

the variability of the GC-MS system was from 5 to 15% (increasing with the molecular weight of

PAHs). It was also shown that the sensitivity of the fiber tends to decrease within time so the fiber

variability needs also to be taken into account. Finally, a SPME sequence had usually variabilities on

areas from 10 to 35% for phenanthrene to benzo[a]pyrene with a PDMS 100 µm fiber, a concentration

of 1µg.L-1

per PAH, an extraction time of 30 min and a SPME liner.

After determining the best parameters for the SPME of these four PAHs, the limits of detection

(LOD) were measured with a 10 ng.L-1

solution of 19 PAHs using the expression:


152

LOD = noise

signal = 3 (Table 2). These limits of detection were satisfactory since all of them were lower

than 10 ng.L-1

and consequently this technique could be applied to some natural samples.

Table 2. Limits of detection of PAHs by SPME-GC-MS. PDMS 100 µm fiber, extraction time = 30 min, n = 3.

To quantify PAHs by SPME, two methods can be used. On the one hand, a calibration curve

can be drawn with different known PAH concentrations in ultrapure water; it is the external calibration.

On the other hand, deuterated standards of known concentrations can be added to the samples to

deduce the analyte concentrations. In DOM-PAH interaction studies, the internal standards can be

used to quantify the total analyte concentrations (free and DOM-bound analytes) since the internal

standards that were in our case perdeuterated PAHs have the same behavior in presence of DOM as

the corresponding analytes (Figure 3), while external calibration can be used to quantify the free

analytes (Poerschmann et al. 1997). Moreover, the use of deuterated internal standards allows to

decrease the variabilities on quantification to 5-10%, even for heavy PAHs like benzo[a]pyrene. That is

why it would be interesting to be able to use internal calibration to quantify free analytes. Hawthorne et

al. (2005) suggested using a deuterated standard that would not bind DOM to quantify the freely

dissolved concentrations. Indeed, this compound would have the same behavior towards SPME

whatever the quantity of DOM and so the possible variation of its chromatographic area would only be

due to the analytical technique. Naphthalene-d8 was chosen to be this standard because its response

was the same with or without DOM (Figure 3). These three calibrations (external, internal with

corresponding perdeuterated PAHs and internal with naphthalene d8) were validated on spiked waters

quantified as if the concentrations of PAHs were unknown. To do that, the recoveries were calculated

(ratios of calculated concentrations to theoretical concentrations) for the four PAHs. They ranged from

90 to 110% (variabilities of 2-8%), from 100 to 120% (variabilities of 6-14%) and from 60 to 75%

(variabilities of 10-15%) for internal with corresponding perdeuterated PAHs, internal with naphthalene

d8 and external calibrations respectively (n = 10).

PAH ng.L-1

PAH ng.L-1

N 2.3 0.5 BaA 2 1

Acy 1.9 0.1 Chrys 2 1

Ace 1.1 0.3 BbF + BkF 5 2

Flu 2.0 0.1 BeP 2 1

Phe 0.7 0.2 BaP 4 2

An 1.1 0.3 Per 4 3

DBT 1.9 0.2 IP 9 4

Fluo 1.9 0.6 BP 7 3

Pyr 2.0 0.6 DahA 8 4


153

0E+00

1E+06

2E+06

3E+06

4E+06

5E+06

6E+06

7E+06

BaA

Ch

rys

Bb

F +

Bk

F

BeP

BaP Per IP BP

Dah

A

KD

OC (

L.k

g-1

)

0,0E+00

2,0E+05

4,0E+05

6,0E+05

8,0E+05

1,0E+06

1,2E+06

1,4E+06

Acy

Ace

Flu

Ph

e

An

DB

T

Flu

o

Py

r

KD

OC (

L.k

g-1

)

30 min extraction

120 min extraction

0

20

40

60

80

100

120

N Phe Fluo Chrys BaP

%

native PAHs

deuterated PAHs

III.2. DOM – PAH interaction studies

III.2.1. By SPME

According to Oomen et al. (2000), two conditions have to be fulfilled to perform freely

dissolved contaminant quantification by SPME: 1) the freely dissolved concentrations should not be

depleted by the SPME extraction; 2) the matrix should not interfere with the analyte uptake by the

fiber. To check that an extraction time of 30 min did not disturb the PAH-DOM equilibrium, an

extraction time of 120 min was applied. Indeed, a longer immersion of the fiber could shift bounded

PAHs to the free fraction because of depletion of freely dissolved PAHs (Oomen et al. 2000, Gomes et

al. 2009). For identical samples and conditions, KDOC values obtained with an extraction of 30 min

were lower than the ones at 120 min of extraction (Figure 4). However, statistical tests (two sample t-

test, Origin Pro 7.5) showed that this difference was significant only for the three heaviest PAHs at p =

0.05.

A shift of PAHs to the free fraction would result in an overestimation of free PAHs and thus an

underestimation of the KDOC values at 120 min of extraction. The KDOC values obtained were actually

the opposite. Consequently, the PAH-DOM equilibrium was not more disturbed with 120 min than with

30 min of extraction, so it could be assumed that it was not or slightly modified at 30 min. Furthermore,

Figure 3. Ratios (expressed in %) of areas between samples with 20 mg.L-1

of DOM (Aldrich Humic acid) and

in absence of Aldrich humic acid for native and deuterated PAHs. Extraction time = 30 min, PDMS 100 µm

fiber, n=3.

Figure 4. KDOC with 30 and 120 min extraction, [DOC] = 3.6 mg.L-1

, [PAH]total = 100-200 ng.L-1

each, n=3.


154

lower KDOC values at 30 min of extraction could be explained by either an underestimation of the free

fraction at 120 min or an overestimation at 30 min. The first hypothesis could be the result of a

blocking of the PAH absorption by the fiber due to absorption or adsorption of DOM on it. However, as

adsorption is a fast phenomenon, it is unlikely to be higher at 120 min than at 30 min of extraction.

Moreover, according to Urrestarazu Ramos et al. (1998), the binding of DOM to the fiber would result

in an overestimation of the free fraction because of the extra amount of chemical associated with the

humic acids that are bound to the fiber. Absorption/adsorption of DOM could increase with the time of

extraction, like for PAHs, but it would let suppose that the fiber would be saturated with DOM to

obstruct the PAH absorption at 120 min, which is unlikely to occur. The second hypothesis of an

overestimation of the free fraction with a 30 min extraction seems more realistic. It could be explained

by an increase of PAH kinetics towards the fiber when DOM is added which could result in an

overestimation of the free fraction since we were not in sample-fiber equilibrium condition (Haftka et al.

2008). This hypothesis can be supported thanks to the comparison of GC-MS areas obtained with 30

and 120 min of extraction, with and without DOM. Indeed, for compounds which have achieved

equilibrium within 30 min, areas are the same at 30 and 120 min of extraction, whereas for the other

compounds, areas are higher after 120 min than after 30 min. Therefore, the higher the ratio area at

120 min over area at 30 min (A120/A30), the farther from the equilibrium at 30 min. As this fact is true in

absence as well in presence of DOM, the comparison of the ratios A120/A30 with and without DOM

allows to determine if the presence of DOM affects the kinetics of PAH absorption by the fiber. Indeed,

if DOM enhances PAH absorption as described by Haftka et al. (2008), equilibrium is reached faster in

presence of DOM and thus the ratio A120/A30 is lower in presence than in absence of DOM. The Figure

5 illustrates this hypothesis and shows that the bigger the A120/A30 ratio without DOM, the higher the

overestimation at 30 min of extraction.

Extraction

time (min)

Percentage of extractable

contaminants

100

30 120

with DOM

without DOM

a

b

a : overestimation at 30 min

b : overestimation at 120 min

0Extraction

time (min)

Percentage of extractable

contaminants

100

30 120

with DOM

without DOM

a

b

a : overestimation at 30 min

b : overestimation at 120 min

0

For a concentration of Aldrich humic acid of 3.5 mg.L-1

of C and a total concentration of PAHs

of 100 - 200 ng.L-1

each, the overestimation of free PAHs was calculated to be lower than 5% for

PAHs with m/z from 128 to 166, from 10 to 20% for m/z from 178 to 228, from 30 to 45% for m/z 252

and from 75 to 90% for the three heaviest PAHs. However, when KDOC values are calculated thanks to

Figure 5. Schema of PAH absorption by SPME in presence and in absence of DOM with increasing extraction

time (adapted from Haftka et al. 2008)


155

equations 2 and 3, so with the difference between the total and the freely dissolved PAH

concentrations, the lower the free PAH concentrations, so the stronger the interactions, the lower the

error on the bounded PAH fraction. Therefore, the heavier the PAHs are, the higher the error on the

free fraction is and the lighter the PAHs are, the higher the error on the bounded fraction is.

Consequently errors due to the presence of DOM on KDOC values are nearly the same for every PAH

and a little lower on medium PAHs. Nevertheless, this error remains acceptable since no statistically

significant differences between 30 and 120 min were shown. So we have chosen an extraction time of

30 min for the following studies of interactions, especially since being at sample-fiber equilibrium is

impossible for heavy PAHs because it can be necessary to extract during several days (Poerschmann

2000) and this must disturb the PAH-DOM equilibrium.

To study interactions between PAHs and Aldrich humic acid, KDOC values were measured for

each of the four PAHs, individually, in a mixture of 4 PAHs (Phe, Fluo, Chrys, BaP) and in a mixture of

19 PAHs using equation 4 and the Stern-Volmer graph. The most unexpected result was obtained by

the comparison of KDOC values for each PAH individually with the corresponding ones in both mixtures.

For the 4 PAHs studied, KDOC values were slightly higher or equivalent when the contaminant was

alone in the sample in comparison with the mixture of 4 PAHs and generally lower in the mixture of 19

PAHs (Table 3).

Constant total PAH concentration Constant DOM concentration

PAH separately 4 PAHs together 19 PAHs together 19 PAHs 19 PAHs with light PAHs more abundant than heavy ones

Log KDOC R² Log KDOC R² Log KDOC R² Log KDOC R² Log KDOC R²

Phe 4.2 ± 0.1(8) 0.53 4.3 ± 0.1(9) 0.55 3.7 ± 0.4(9) 0 3.4 ± 0.1(6) 0.73 4.5 ± 0.1(6) 0.84

Fluo 4.9 ± 0.1(9) 0.06 5.0 ± 0.1(9) 0.77 4.6 ± 0.1(9) 0.68 4.0 ± 0.1(7) 0.87 4.9 ± 0.1(8) 0.98

Pyr 4.6 ± 0.1(9) 0.66 4.3 ± 0.1(7) 0.96 4.9 ± 0.1(8) 0.95

Chrys 5.4 ± 0.1(9) 0.78 5.5 ± 0.1(9) 0.91 5.3 ± 0.1(9) 0.89 4.9 ± 0.1(8) 0.97 5.2 ± 0.1(8) 0.74

BaP 6.7 ± 0.1(9) 0.93 6.4 ± 0.1(9) 0.93 6.2 ± 0.1(9) 0.95 5.7 ± 0.1(8) 0.94 6.3 ± 0.1(8) 0.96

Table 3. Log KDOC for five PAHs calculated thanks to Stern-Volmer equations for experiments with constant

total PAH concentration and isotherm equations with constant DOM concentrations; the number of points is

indicated in brackets. Stern-Volmer graphs were used when possible (with variation of DOM concentrations) to

minimize error on KDOC values. Indeed, as it is not necessary to subtract the free concentration from the total

concentration of PAHs in the Stern-Volmer equation, the error is minimized in comparison with isotherm

graphs.

For phenanthrene, which was the PAH the less associated to DOM, the decrease of

interactions in presence of 19 PAHs was such that the addition of 20 mg.L-1

of DOM did not cause a

significant decrease of the free fraction of phenanthrene. The effect of the presence of PAHs was all

the more significant that the PAH was heavy (Figure 6 for benzo[a]pyrene).


156

These results showed that competition must occur between PAHs towards DOM since no

competition or saturation occurred in the PDMS fiber at the studied PAH concentration. This

conclusion was comforted by another experiment: chrysene-DOM interactions were studied thanks to

Stern-Volmer plots for this PAH individually but in one series, a mixture of 5 deuterated PAHs was

added whereas in the other series, a mixture of 19 deuterated PAHs was added. Log KDOC values

were 5.4 0.1 in the first series and 5.1 0.1 in the second one. This finding shows that the effect of

the presence of other PAHs and maybe of other contaminants can thus be significant for the

quantification of interactions. Moreover, it also shows that the addition of deuterated standards, which

is necessary for the internal quantification of total PAH concentrations, can disturb PAH-DOM

equilibrium, so the internal standards must be added at the lowest concentrations as possible. Pan et

al. (2007a) also found that competition occurs between PAHs by studying the behavior of pyrene with

and without phenanthrene. However, the concentrations in their work (100 µg.L-1

and 1000 µg.L-1

for

pyrene and phenanthrene respectively) and to a lesser extent in this study were high (1 µg.L-1

for 19

native PAHs and 19 deuterated PAHs in our case) and not representative of natural environments

since usually PAHs are far less concentrated and the light PAHs are more present in water than the

heavier ones. So, to confirm the competition between PAHs, it was undertaken to study the evolution

of KDOC when the concentration of DOM remained constant (around 3.5 mg.L-1

) while the

concentration of PAHs varied on a wide scale (8 triplicates from 10 to 1000 ng.L-1

, mixture of 19

PAHs). Moreover, the comparison between the presence of 19 PAHs at the same concentrations and

another series with concentrations of heavy PAHs lower than light PAHs was also performed to bring

information about the interactions in natural environments. To make the comparison between the two

series possible, total concentrations of benzo[a]pyrene were kept strictly the same (8 triplicates from

0.02 - 0.8 µg.L-1

) in both cases (PAHs at the same concentrations versus light PAHs more

concentrated than heavy PAHs) while light PAHs were approximately tenfold more concentrated and

heavier PAHs fourfold less concentrated. These two series supported the theory of competition since

Figure 6. Stern-Volmer graph for benzo[a]pyrene, [PAH] = 1 µg.L-1

each, n=3. : benzo[a]pyrene only, : 4

PAH mixture, : 19 PAH mixture, 2LR = R² for the linear fit and

2NLR = R² for the non-linear fit

0 1 2 3 4 5 60

5

10

15

20

25

30

R2

NL= 0,97

R2

NL= 0,97

R2

L= 0,95

R2

L= 0,93

R2

NL= 0,97

[Ba

P] t

ota

l/[B

aP

] fre

e

[DOC] (mg/L)

R2

L= 0,93


157

all of each PAH had KDOC values higher when light PAHs were more abundant than heavy ones with a

factor of about 10 for phenanthrene and 2 to 4 for fluoranthene, chrysene and benzo[a]pyrene KDOC

values (Table 3). Moreover, for these 2 series and the Stern-Volmer plots, it seemed that a plateau

was formed at high concentrations of PAH and DOC (Figure 6). A decrease of partition coefficient with

humic acid concentration was previously reported by Carter and Suffet (1982) and Landrum et al.

(1984) while interactions were studied thanks to dialysis and reverse phase techniques respectively.

They attributed their results to possible conformational differences of the humic acids altering the

pollutant binding and/or competition of the humics for binding sites on other humics. These

conclusions could also explain our results in addition to the competition between PAHs themselves

towards DOM. The non linear trends of interaction were also demonstrated by the Stern-Volmer

graphs since non linear fitted better than linear curves, even though quite large uncertainties (Figure

6). However, if we used linear fits to calculate KDOC values to compare them with literature values, they

appear to be in good agreement for phenanthrene and pyrene with commercial humic acids (Table 4).

However, data about heavier PAHs were not reported in literature and cannot be discussed.

Table 4. log KDOC values for commercial humic acids in this study and in literature, FQ = fluorescence

quenching

As shown by many papers (Burkhard 2000, Mott 2002), the DOM-PAH partition coefficient and

the hydrophobicity of PAHs are well correlated. In this study, the relationships obtained are the

following: log KDOC = 0.9 0.1 log KOW for both series with all PAHs in the same proportions and log

KDOC = 1.0 0.1 log KOW with light PAHs more abundant (Figure 7), which are in good agreement with

the relationships from the literature (Burkhard 2000, Mott 2002).

This study (with linear fits)

Perminova

et al. (1999)

Gauthier

et al.

(1987)

Doll et al. (1999) Kopinke et al.

(2000)

Humic acid Aldrich Aldrich Aldrich Aldrich Roth

Technique FQ R² SPME FQ FQ FQ SPME FQ SPME

Phe 4.51 ± 0.03 0.93 3.3-4.5 5.11 ± 0.03 4.02 ± 0.03 4.7 ± 0.1 4.3 ± 0.1

Fluo 4.0-4.9 5.26 ± 0.05

Pyr 5.48 ± 0.01 0.99 4.3-4.9 5.36 ± 0.06 5.02 5.5 ± 0.1 4.9 ± 0.1

Chrys 6.03 ± 0.01 0.99 4.9-5.5

BaP 6.87 ± 0.02 0.95 5.7-6.7


158

y = 1.01x (dashed line)

R2 = 0.97

y = 0.92x (straight line)

R2 = 0.94

y = 0.91x (dotted line)

R2 = 0.85

2

3

4

5

6

7

3 4 5 6 7 8

log KOW

log

KD

OC

III.2.2. By fluorescence quenching

The Stern-Volmer equations were plotted for the four PAHs according to equation 5 - with the

corrected fluorescence (Fcorr) instead of the fluorescence F- to calculate the KDOC. It appeared that,

for the four PAHs, the ratio F0/Fcorr increased linearly with DOM concentrations (Figure 8).

The KDOC values and regression coefficients are given in Table 4. The good regression

coefficients (R² 0.93) of the linear fits imply that the observed quenching is either static or dynamic,

but not both (Borisover et al. 2006). Indeed, the quenching can also be dynamic if a quencher collides

Figure 7. Correlation between DOM-PAH partition coefficients and hydrophobicity of PAHs. : constant

[DOC] (fitted by dotted line),: constant [PAHs] (fitted by straight line), : constant [DOC] with light PAHs

more abundant (fitted by dashed line)

Figure 8. Stern-Volmer graph of the PAH fluorescence quenching. : phenanthrene, : pyrene, : chrysene, :

benzo[a]pyrene


159

with the fluorophore during the lifetime of its excited state and nonradiatively deactivates this state

(Gauthier et al. 1986). Usually, this quenching occurs with dioxygen molecules which have a diffusion

rate in water of 1010

M-1

.s-1

(Albani 2007). Consequently, the bimolecular quenching rate constant (Kq)

was calculated for each PAH and compared with the molecular oxygen Kq value. To do that, it is

necessary to know both the molecular mass of the quencher and the lifetime fluorescence of PAHs in

the absence of a quencher. A value of 4000 Da was used for the average molecular weight of Aldrich

humic acid (Pitois et al. 2008), and the fluorescence decay times used were the ones measured by

Karlitschek et al. (1998) in aqueous samples. It follows that Kq were here from 3.5 1012

to 1.1 1015

M-1

s-1

, which are largely more than the maximal Kq observed for dioxygen in aqueous solution. As a

result, the observed quenching is confirmed to be static quenching, due to the formation of a complex

between PAHs and Aldrich humic acid and interaction appeared to be linear for each PAH. The KDOC

values are in the same range as the ones found in the literature by the same technique for the same

commercial humic acid (Table 4), but the comparison remains difficult, especially for heavy PAHs, for

which very few or no data are available.

III.2.3. By dialysis

Dialysis was first performed with PAHs in ultrapure water only (without DOM) to check the time

necessary to achieve equilibrium in PAH concentrations inside and outside the bag. The problem was

that the mass recoveries after 48h were very low: from 1 (BaP) to 8% (Phe) when PAHs were added

outside the bag and from 0 (BaP) to 50% (Phe) when they were added inside the bag. So extractions

of the two compartments, the membrane and the inner surface of the bottles were made. The results

showed that more than 90% of PAHs were generally adsorbed on the dialysis membrane.

Another test was performed with naphthalene at high concentration (6.7 mg.L-1

) added inside

the bag to check the equilibrium time and the adsorption rate by fluorescence (instead of LLE-GC-

MS). Results showed that after 24h the naphthalene concentrations were pretty much the same inside

and outside the bag and the fluorescence intensities were equivalent to initial intensities divided by the

dilution factor. This showed that the adsorption of naphthalene was negligible, but, because of the

high concentration of naphthalene, to be significant the loss should be approximately 1 µg (which is

equivalent to a decrease of 1% of fluorescence intensity). However, at environmental concentrations,

a 1 µg adsorption could represent an important loss and recoveries could be very bad. Nevertheless,

for the heavier PAHs, this test at high concentrations was not possible due to the aqueous solubility of

compounds which is less than 10 µg.L-1

for chrysene and benzo[a]pyrene. In these conditions, it

seemed impossible to continue any studies of interactions of PAHs with DOM with this technique at

environmentally relevant concentrations.


160

III.2.4. Comparison of techniques

Among the three techniques studied here, dialysis was the least useful for the study of the

interactions of DOM with PAHs because of adsorption problems of PAHs on the membrane. Many

works have been done with PAHs by dialysis but most of the time PAHs were quantified by

radioactivity (de Paolis and Kukkonen 1997, Akkanen and Kukkonen 2001, Lou et al. 2006), which is a

more sensitive technique than a traditional liquid-liquid extraction and a GC-MS analysis. Moreover,

concentrations of PAHs were rarely in the range of the ones found in natural waters (Landrum et al.

1984, Akkanen et al. 2005). Dialysis may thus be applicable to the study of DOM-PAH interactions but

not in environmental conditions (in terms of PAH concentrations) and only with light PAHs.

The fluorescence quenching is a high-performance technique for the study of interactions

between PAHs and DOM. It is a very useful technique since it is fast, needs only small quantities of

sample, requires neither separation between PAHs and DOM nor calculation of free and total PAH

concentrations. Nevertheless, it is limited to low DOM concentrations because of the inner filter effect.

Furthermore, the stronger the interactions, the faster the PAH fluorescence is inhibited; so the most

hydrophobic PAHs cannot be studied with a high concentration of DOM (more than 3 mg.L-1

of DOM

inhibited totally the benzo[a]pyrene fluorescence). On the other hand, the lightest interactions (e.g.

phenanthrene) were fully visible with this technique and the regression coefficient of the Stern-Volmer

equation was quite good.

Fluorescence quenching and SPME seem to be the best techniques but only SPME is able to

analyze the interactions on samples directly taken from the field (without DOM or PAH addition).

Indeed, by fluorescence quenching, it is necessary to know the fluorescence intensity of PAHs in the

presence and absence of DOM, so PAHs have to be added to natural DOM to calculate the KDOC

values. Whereas, with SPME, it is possible to calculate the KDOC values of PAHs ―naturally‖ present in

the environmental samples. Moreover, the sensitivity of SPME is far better than that of fluorescence

quenching, especially for PAHs which have strong interactions, since a signal was obtained for 1

µg.L-1

of BaP in presence of 5 mg.L-1

of DOC in SPME-GC-MS but not with the fluorescence

technique. Last but not least, fluorescence quenching is mainly applicable to fluorescent contaminants

given that for other compounds, the quenching of DOM fluorescence can occur only if the complex

contaminant-DOM is formed with fluorescent groups of DOM.

As far as KDOC values are concerned, the ones measured by fluorescence quenching are

generally higher than the ones calculated by other methods (Doll et al. 1999, Kopinke et al. 2000).

This was also shown in this study when individual PAHs with linear approximations were used for the

calculation of the KDOC value by SPME. However, if we consider only the first part of the Stern-Volmer

curve (before the plateau), the KDOC values (ranging from 4.5 to 6.8) are closer to fluorescence

quenching ones (ranging from 4.51 to 6.87, Table 4). The linearity of interactions observed with

fluorescence quenching is hard to explain whereas the non-linearity was shown for SPME in the same


161

conditions. The addition of deuterated standards in SPME samples could justify the slight differences

of KDOC values with fluorescence quenching and perhaps the modification of the linearity. To confirm

this, it would be necessary to analyze samples without deuterated PAHs to study interactions by

SPME, but without internal standards the total PAH concentrations could not be measured accurately

and the free PAH concentrations could not be calculated thanks to deuterated naphthalene, which

help to improve the reproducibility of data. The non-linearity observed by fluorescence quenching can

also be due to the insensitivity of Ster-Volmer plot to detect non-linearity since Pan et al. (2007b) have

shown that an apparently linear Stern-Volmer plot does not necessarily reflect a linear interaction

between PAHs and DOM. Moreover, higher values of KDOC measured by spectrofluorometry could be

due to the temperature since fluorescence spectra were acquired at 20 °C while SPME measurements

were performed at 40 °C. Unfortunately, SPME could not be used at 20 °C and fluorescence spectra

could not be acquired at 40 °C due to technical limitations with our apparatus. However, SPME at

30 °C showed an increase of KDOC values in comparison with measurements at 20 °C; therefore

temperature could partly explain the discrepancies.

IV. Conclusion

In this study three techniques for the study of PAH-DOM interactions were developed and,

except for dialysis experiments, allowed the comparison of KDOC values obtained for the same

samples. SPME appeared to be the most appropriate tool to study interactions between organic

contaminants and DOM: it is fast, sensitive, solvent free, permits the study of PAH-DOM interactions

in great detail since it does not disturb interaction equilibrium. Moreover, this technique requires only a

few milliliters of samples and no separation of free and bound contaminants is required; thus it is

easily applicable to environmental samples. The fluorescence quenching is also useful to the study of

interactions but its application to natural samples is less easy. Finally, these two techniques are well

complementary since SPME is more adapted to the study of strong interactions with low PAH and high

DOC concentrations while the fluorescence quenching is helpful for weak interactions and high PAH

and low DOC concentrations. These techniques permitted the calculation of many KDOC values for 18

PAHs and it was the first time for some of them (especially for heavy PAHs).

This study showed that competition occurs between PAHs, deuterated PAHs and DOM, and

thus maybe with other contaminants potentially present in samples. Therefore, the conditions of

concentrations of PAHs, deuterated PAHs and DOM are very important to take into consideration

when studying PAH-DOM interactions, which implies that the comparison between different studies

require detailed information about sample conditions.


162

Acknowledgements

"Region Aquitaine", FEDER, ORQUE program (CPER) and INSU (IMOTOX project) are

acknowledged for financial support and the French Ministry of Research for the PhD grant of C. de

Perre.

References

Abrajano Jr, T.A., Yan, B., Song, J., Bopp, R., O'Malley, V., Heinrich, D.H. & Karl, K.T. (2003)

9.13 High-Molecular-Weight Petrogenic and Pyrogenic Hydrocarbons in Aquatic

Environments. In Treatise on Geochemistry, Vol. 9, pp. 1-50. Oxford: Pergamon.

Akkanen, J. & Kukkonen, J.V.K. (2001) Effects of water hardness and dissolved organic material on

bioaivalability of selected organic chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry 20(10),

2303-2308.

Akkanen, J., Penttinen, S., Haitzer, M. & Kukkonen, J.V.K. (2001) Bioavailability of atrazine, pyrene

and benzo[a]pyrene in European river waters. Chemosphere 45(4-5), 453-462.

Akkanen, J., Lyytikäinen, M., Tuikka, A. & Kukkonen, J.V.K. (2005) Dissolved organic matter in

pore water of freshwater sediments: Effects of separation procedure on quantity, quality and

functionality. Chemosphere 60(11), 1608-1615.

Albani, J.R. (2007) Principles and Applications of Fluorescence Spectroscopy. Blackwell Publishing.

Borisover, M., Laor, Y., Bukhanovsky, N. & Saadi, I. (2006) Fluorescence-based evidence for

adsorptive binding of pyrene to effluent dissolved organic matter. Chemosphere 65(11), 1925-

1934.

Burkhard, L.P. (2000) Estimating Dissolved Organic Carbon Partition Coefficients for Nonionic

Organic Chemicals. Environmental Science and Technology 34(22), 4663-4668.

Carter, C.W. & Suffet, I.S. (1982) Binding of DDT to dissolved humic materials. Environmental

Science and Technology 16(11), 735-740.

De Paolis, F. & Kukkonen, J. (1997) Binding of organic pollutants to humic and fulvic acids: influence

of pH andthe structure of humic material. Chemosphere 34(8), 1693-1704.

Doll, T.E., Frimmel, F.H., Kumke, M.U. & Ohlenbusch, G. (1999) Interaction between natural

organic matter (NOM) and polycyclic aromatic compounds (PAC) – comparison of

fluorescence quenching and solid phase micro extraction (SPME). Fresenius' Journal of

Analytical Chemistry 364(4), 313-319.

Durjava, M.K., ter Laak, T.L., Hermens, J.L.M. & Struijs, J. (2007) Distribution of PAHs and PCBs to

dissolved organic matter: High distribution coefficients with consequences for environmental

fate modeling. Chemosphere 67(5), 990-997.

Gauthier, T.D., Shane, E.C., Guerin, W.F., Seitz, W.R. & Grant, C.L. (1986) Fluorescence

quenching method for determining equilibrium constants for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons

binding to dissolved humic materials. Environmental Science and Technology 20, 1162-1166.


163

Gauthier, T.D., Seitz, W.R. & Grant, L. (1987) Effects of structural and compositional variations of

dissolved humic materials on Pyrene Koc values. Environmental Science and Technology

21(3), 243-248.

Gomes, R., Nogueira, R., Oliveira, J., Peixoto, J. & Brito, A. (2009) Determination of total and

available fractions of PAHs by SPME in oily wastewaters: overcoming interference from NAPL

and NOM. Environmental Science and Pollution Research 16(6), 671-678.

Haftka, J.J.H., Parsons, J.R., Govers, H.A.J., Ortega-Calvo, J-J. (2008) Enhanced kinetics of Solid-

Phase Microextraction and biodegradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in the

presence of Dissolved Organic Matter. Environmental Toxicology and Chemistry 27(7), 1526-

1532.

Haitzer, M., Hoss, S., Traunspurger, W. & Steinberg, C. (1998) Effects of dissolved organic matter

(DOM) on the bioconcentration of organic chemicals in aquatic organisms – a review-.

Chemosphere 37(7), 1335-1362.

Hawthorne, S.B., Grabanski, C.B., Miller, D.J. & Kreitinger, J.P. (2005) Solid-Phase

Microextraction Measurement of Parent and Alkyl Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in

Milliliter Sediment Pore Water Samples and Determination of KDOC Values. Environmental


Heringa, M.B. & Hermens, J.L.M. (2003) Measurement of free concentrations using negligible

depletion-solid phase microextraction (nd-SPME). TrAC Trends in Analytical Chemistry 22(9),

575-587.

Karlitschek, P., Lewitzka, F., Bünting, U., Niederkrüger, M. & Marowsky, G. (1998) Detection of

aromatic pollutants in the environment by using UV-laser-induced fluorescence. Applied

Physics B: Lasers and Optics 67(4), 497-504.

Kopinke, F.-D., Georgi, A. & Mackenzie, K. (2000) Sorption and Chemical Reactions of PAHs with

Dissolved Humic Substances and Related Model Polymers. Acta Hydrochimica et

Hydrobiologica 28(7), 385-399.

Kukkonen, J. & Pellinen, J. (1994) Binding of organic xenobiotics to dissolved organic

macromolecules: comparison of analytical methods. The Science of the Total Environment

152, 19-29.

Landrum, P.F., Nihart, S.R., Eadie, B.J. & Gardner, W.S. (1984) Reverse-phase separation method

for determining pollutant binding to Aldrich humic acid and dissolved organic carbon of natural

waters. Environmental Science and Technology 18(3), 187-192.

Lord, H. & Pawliszyn, J. (2000) Evolution of solid-phase microextraction technology. Journal of


Lou, T., Xie, H., Chen, G. & Gagne, J.-P. (2006) Effects of photodegradation of dissolved organic

matter on the binding of benzo(a)pyrene. Chemosphere 64(7), 1204-1211.

Lüers, F. & ten Hulscher, T.E.M. (1996) Temperature effect on the partitioning of Polycyclic Aromatic

Hydrocarbons between natural organic carbon and water. Chemosphere 33(4), 643-657.


164

MacDonald, B.C., Lvin, S.J. & Patterson, H. (1997) Correction of fluorescence inner filter effects and

the partitioning of pyrene to dissolved organic carbon. Analytica Chimica Acta 338(1-2), 155-

162.

Mott, H.V. (2002) Association of hydrophobic organic contaminants with soluble organic matter:

evaluation of the database of Kdoc values. Advances in Environmental Research 6(4), 577-

593.

Oomen, A.G., Mayer, P. & Tolls, J. (2000) Nonequilibrium Solid-Phase Microextraction for

Determination of the Freely Dissolved Concentration of Hydrophobic Organic

Compounds: Matrix Effects and Limitations. Analytical Chemistry 72(13), 2802-2808.

Ouyang, G., Chen, Y., Setkova, L. & Pawliszyn, J. (2005) Calibration of solid-phase microextraction

for quantitative analysis by gas chromatography. Journal of Chromatography A 1097(1-2), 9-

16.

Pan, B., Ghosh, S. & Xing, B. (2007a) Nonideal Binding between Dissolved Humic Acids and

Polyaromatic Hydrocarbons. Environmental Science and Technology 41(18), 6472-6478.

Pan, B., Xing, B., Liu, W., Xing, G. & Tao, S. (2007b) Investigating interactions of phenanthrene with

dissolved organic matter: Limitations of Stern-Volmer plot. Chemosphere 69(10), 1555-1562.

Parker, C.A. (1968) Photoluminescence of solutions. Amsterdam - London - New York: Elsevier

Publishing Company.

Pawliszyn, J. & Pedersen-Bjergaard, S. (2006) Analytical Microextraction: Current Status and

Future Trends. Journal of Chromatographic Science 44(6), 291-307.

Perminova, I., Grechishcheva, N. & Petrosyan, V. (1999) Relationships between Structure and

Binding Affinity of Humic Substances for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: Relevance of

Molecular Descriptors. Environmental Science and Technology 33, 3781-3787.

Pitois, A., Abrahamsen, L.G., Ivanov, P.I. & Bryan, N.D. (2008) Humic acid sorption onto a quartz

sand surface: A kinetic study and insight into fractionation. Journal of Colloid and Interface

Science 325(1), 93-100.

Poerschmann, J., Zhang, Z., Kopinke, F.D. & Pawliszyn, J. (1997) Solid Phase Microextraction for

Determining the Distribution of Chemicals in Aqueous Matrices. Analytical Chemistry 69(4),

597-600.

Poerschmann, J. (2000) Sorption of hydrophobic organic compounds on nonpolar SPME fibers and

dissolved humic organic matter - Part III: Application of the solubility parameter concept to

interpret sorption on solid phase microextraction (SPME) fiber coatings. Journal of

Microcolumn Separations 12(12), 603-612.

Schlautman, M.A. & Morgan, J.J. (1993) Effects of aqueous chemistry on the binding of polycyclic

aromatic hydrocarbons by dissolved humic materials. Environmental Science and Technology

27(5), 961-969.

Seibel, F., Heidenreich, S. & Frimmel, F.H. (1996) Interactions of humic substances and polycyclic

aromatic hydrocarbons (PAHs) during the biodegradation of PAHs. Acta Hydrochimica et

Hydrobiologica 24(6), 260-266.


165

Setkova, L., Risticevic, S., Linton, C.M., Ouyang, G., Bragg, L.M. & Pawliszyn, J. (2007) Solid-

phase microextraction-gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry utilized for the

evaluation of the new-generation super elastic fiber assemblies. Analytica Chimica Acta

581(2), 221-231.

Urrestarazu Ramos, E., Meijer, S.N., Vaes, W.H.J., Verhaar, H.J.M. & Hermens, J.L.M. (1998)

Using Solid-Phase Microextraction To Determine Partition Coefficients to Humic Acids and

Bioavailable Concentrations of Hydrophobic Chemicals. Environmental Science and

Technology 32(21), 3430-3435.

Wang, C.X., Yediler, A., Peng, A. & Kettrup, A. (1995) Photodegradation of phenanthrene in the

presence of humic substances and hydrogen peroxide. Chemosphere 30(3), 501-510.

Woolgar, P.J. & Jones, K.C. (1999) Studies on the Dissolution of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons

from Contaminated Materials Using a Novel Dialysis Tubing Experimental Method.

Environmental Science and Technology 33(12), 2118-2126.

Yates, L.M.I., Engerbretson, R.R., Haakenson, T.J. & Wandruszka, R.V. (1997) Immobilization of

aqueous pyrene by dissolved humic acid. Analytica Chimica Acta 356, 295-300.


167

Factorial designs for better understanding of the interactions

between Dissolved Organic Matter (DOM) and Polycyclic Aromatic

Hydrocarbons (PAHs)

Chloé de Perre, Karyn Le Ménach, Anne-Marie Dorthe, Christian Béchemin, Edith Parlanti, Hélène Budzinski

Abstract

Dissolved organic matter (DOM) in aquatic environments is well known to play an important

role in the fate of organic pollutants. In this study, the role of environmental parameters (salinity, pH,

DOM and contaminant concentrations) on interactions between DOM and 15 Polycyclic Aromatic

Hydrocarbons (PAHs) was investigated. Three different DOM types were used: Aldrich humic acid, a

sample from a river and DOM coming from algae culture to model respectively humified terrigenous

DOM, aquatic DOM with mainly fulvic acids and fresh material. The partitioning coefficients (KDOC) of

each pollutant to DOM were calculated thanks to Solid Phase Microextraction coupled to Gas

Chromatography and Mass Spectrometry (SPME-GC-MS). DOM samples were characterized by their

optical properties by means of excitation-emission matrix (EEM) spectroscopy and UV-visible

absorption. Full and fractional factorial designs were performed to correlate environmental parameters

to KDOC values and optical properties of DOM.

It was shown that the strength of interactions highly depends on DOM origin and structure and

on type of PAHs. Humification and aromaticity of DOM were not the driving factors of interactions and

fresh material of aquatic DOM could have stronger interactions with PAHs than humified aquatic fulvic

acids. Salinity was not an important factor since it modified significantly neither KDOC values nor optical

properties of DOM. On the contrary, pH and DOC concentrations could strongly affect interactions and

had appeared to be interrelated for some samples. PAH concentration was shown to affect

interactions: KDOC values tended to decrease at high concentrations of PAHs. A negative correlation

was found between KDOC variations and E4/E6 ratio variations (the ratio of absorbance at 465 nm (E4)

over at 665 nm (E6)), especially for low molecular weight PAHs. A stronger relationship was also

observed between KDOC variations and ‘/ fluorescence intensity ratio variations.

Publication n°4


168

Plans d’expériences appliqués aux interactions Matière Organique

Dissoute (MOD) – Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP)

Résumé

La Matière Organique Dissoute (MOD) joue un rôle important sur le devenir des polluants

organiques dans l‘environnement aquatique. Dans cette étude, le rôle des paramètres

environnementaux (salinité, pH, concentrations en MOD et en contaminants) sur les interactions entre

la MOD et 15 composés appartenant à la classe des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP)

a été examiné. Trois sortes de MOD ont été utilisées : de l‘acide humique Aldrich, un échantillon d‘eau

de rivière et de la MOD provenant d‘une culture algale ; ceci afin de modéliser respectivement le

comportement de la MOD terrigène humifiée, de la MOD d‘origine aquatique contenant

majoritairement des acides fulviques et du matériel organique récent. Les coefficients de partition eau

– carbone organique dissous (KDOC) ont été calculés pour chaque polluant grâce à la Micro-Extraction

sur Phase Solide couplée à la Chromatographie en phase Gazeuse et à la Spectrométrie de Masse

(SPME-GC-MS). Les propriétés optiques des échantillons de MOD ont été caractérisées au moyen de

la spectrofluorimétrie tridimensionnelle et de l‘absorption UV-visible. Des plans d‘expériences

factoriels complets et fractionnaires ont été utilisés pour corréler les paramètres environnementaux

aux valeurs de KDOC et aux propriétés optiques de la MOD.

Il a été montré que la force des interactions dépend fortement de l‘origine et de la structure de

la MOD et également du type de HAP. L‘humification et l‘aromaticité de la MOD n‘étaient pas les

facteurs contrôlant les interactions et le matériel frais de la MOD aquatique pourraient avoir des

interactions plus fortes avec les HAP que les acides fulviques humifiés. La salinité ne s‘est pas avérée

être un facteur important puisque ni les KDOC ni les propriétés optiques de la MOD n‘ont été

significativement modifiés. Par contre, le pH et les concentrations en Carbone Organique Dissous

(COD) pourraient affecter fortement les interactions et pourraient être interdépendants pour certains

échantillons. Il a été montré que les concentrations en HAP pouvaient affecter les interactions : les

KDOC ont tendance à diminuer à fortes concentrations en HAP. Une corrélation négative a été mise en

évidence entre les variations des KDOC et celles des rapports E4/E6 (rapport de l‘absorbance à 465 nm

(E4) sur celle à 665 nm (E6)) et ‘/ (rapport d‘intensités de fluorescence des maxima des bandes ‘

et ).


169

I. Introduction

Natural aqueous environments are constituted of water but also of many organic and inorganic

compounds which have a natural or anthropogenic origin. The behavior of contaminants in water can

be influenced by the presence of ions, organic matter or other contaminants. Organic matter, which is

composed for an important part of macromolecules coming from animal and vegetable degradation,

has been shown to be fundamental in the study of transport and fate of pollutants. Indeed, the

presence of these organic macromolecules can modify the transport, bioavailability, degradation or

toxicity of inorganic or organic contaminants by interacting with them (Haitzer et al. 1998, Wang et al.

1995, Bejarano et al. 2005). In order to improve the comprehension of these interactions, the study of

properties of the organic matter is essential on the one hand, and the measurement of the

contaminant partition has to be the most accurate as possible on the other hand. The study of these

interactions faces multiple challenges since both analysis of organic matter and analysis of

contaminants need appropriate advanced tools and on top of that, these analyses should not modify

or interfere with the interactions. This challenge is far more complicated when these interactions are

applied to organic contaminants, which are of the same nature as organic matter. To complicate

matters further, organic matter and contaminants are both present at trace levels (of the order of

mg.L-1

and ng.L-1

respectively) in aquatic environments. So, the use of sensitive and reliable tools is a

strong necessity.

In this paper, we focused on the study of the effect of environmental parameters on the

strength of interactions between Dissolved Organic Matter (DOM) and Polycyclic Aromatic

Hydrocarbons (PAHs). We aimed at highlighting environmental parameters which influence these

interactions and at understanding how they modify interactions and/or DOM properties. To achieve

this knowledge, UV-visible spectrophotometry and Excitation-Emission Matrix (EEM) spectroscopy

were used for the characterization of DOM and PAHs were analyzed by Solid Phase Microextraction

(SPME) coupled to Gas Chromatography and Mass Spectrometry (GC-MS). EEM spectroscopy is a

powerful tool for the study of natural DOM at trace levels because of its high sensitivity and the low

sample volume needed. For the same reasons, SPME-GC-MS was chosen for the analysis of PAHs,

especially since it allows the quantification of both freely dissolved and DOM-bound PAH

concentrations simultaneously, with a negligible disturbance of the equilibrium DOM-PAH

(Poerschmann et al. 1997, Heringa and Hermens 2003, de Perre et al. 2009).

Among all the parameters that can be involved in the fate of organic contaminants, a few of

them were shown to have an effect on their interactions with DOM. For instance, the presence of

divalent and trivalent cations was demonstrated to influence interactions between pyrene and

hydrophobic acids (Polubesova et al. 2007). Schlautman and Morgan (1993) observed a decrease of

KDOC of pyrene and anthracene when salinity increased and this diminution depended on pH and

humic substances. Gauthier et al. (1986) found an opposite effect of salinity on pyrene-DOM

interactions and a small effect of pH contrary to Pan et al. (2007) who observed a significant influence


170

of pH on PAH-DOM interactions. DOM properties (aromaticity, polarity, molecular weight, spatial

conformation, concentration…) were also shown to affect these interactions (Perminova et al.1999,

Pan et al. 2008a, Kopinke et al. 2001). Contaminant properties are also important since usually more

hydrophobic PAHs are considered to have stronger interactions with DOM (McCarthy and Jimenez

1985, Georgi et Kopinke 2002). However Akkanen et al. (2001) showed that the behavior of PAHs

could be more complex in natural waters since they found stronger interactions for pyrene than for

benzo[a]pyrene with some specific samples. It was shown that the modification of contaminant-DOM

interactions by environmental parameters was usually due to a modification of DOM structure

(Schlautman and Morgan 1993, Pan et al. 2008a). Therefore, many parameters were found to affect

the interactions between PAHs and DOM but they were usually studied separately and by considering

only one or two molecules as model of all PAHs. In this paper, we got interested in the study of the

effect of four parameters (salinity, pH, DOM and PAH concentrations) on the interaction of 15 PAHs

with commercial and natural DOM with different properties.

In order to deal with so many factors, factorial designs were applied. Factorial designs are

mathematical models that allow to decrease the number of experiments to study simultaneously a

large set of factors that can affect the response of a system. Some of them offer the possibility to

document the effect of several factors, to determine interactions between these factors and to assess

the linearity of the effects.

II. Materiel and methods

Three different samples of DOM were investigated: Aldrich humic acid (AHA), river water (RW)

and DOM coming from algae culture (AC). Aldrich humic acid was dissolved in ultrapure water (MilliQ,

Millipore, Molsheim, France) at high concentration (around 50 mg.L-1

). The river water was sampled in

the La Hume canal (located in Arcachon Bay, South West of France) two days after a storm. The third

DOM was sampled from marine unicellular algae (Isochrysis galbana) cultures which were used as

food for larvae of bivalves. The water sample was collected at the end of the exponential phase of

growth period to have a maximum of fresh macromolecules. As this culture was not sterile, it was

possible that AC had also a low bacterial content. Every sample was filtered thanks to 0.7 µm GF/F

filters (Whatman, Maidstone, England) and then diluted to the appropriate DOC concentrations.

Fifteen PAHs were studied: acenaphthylene (Acy), acenaphthene (Ace), fluorene (Flu),

dibenzothiophene (DBT), phenanthrene (Phe), anthracene (An), fluoranthene (Fluo), pyrene (Pyr),

benzo[a]anthracene (BaA), chrysene (Chrys), benzo[b]fluoranthene (BbF), benzo[k]fluoranthene

(BkF), benzo[e]pyrene (BeP), benzo[a]pyrene (BaP), perylene (Per). Their 15 perdeuterated

analogues were used for the internal quantification as well as deuterated naphthalene (N d8). Native

and deuterated compounds were purchased from Aldrich (for Acy, Ace, Flu, Phe, Fluo, BaA, BbF,

BkF, BeP, BaP, Per, DahA), Promochem (for IP, BP, Acy d8, Ace d10, Flu d10, BaA d12, BkF d12, IP

d12, DahA d14), Cambridge Isotope Laboratories (for Phe d10, An d10, Pyr d10, BbF d12, BeP d12,


171

BaP d12, BP d12), MSD Isotopes (for DBT d8, Fluo d10, Chrys d12, Per d12), Acros (for DBT), EGA-

Chemie (for N d8), Fluka (for Pyr and Chrys) and Labosi (for An) with high isotopic and chemical

purities (≥ 97%). Solutions of native and deuterated PAHs were prepared in ethanol absolute from

HPLC grade (Scharlau Chemie, Sentmenat, Spain). Native PAHs were mixed together at high

concentrations (around 3 µg.g-1

of ethanol) and diluted at several concentrations so that the same

amount of solvent (20 µl) was added to the water samples (35 ml) to produce different PAH

concentrations. The deuterated PAHs were added at the same proportions to have a concentration

around 100 ng.L-1

of each PAH in each sample. After this addition, samples were sonicated for a few

minutes to have a good homogenization.

Before the addition of native and deuterated PAHs, DOM samples were diluted in tap water,

salinity was adjusted thanks to a NaCl (AnalaR Normapur, VWR Prolabo, Leuven, Belgium) solution

(70 g.L-1

) and pH was adjusted thanks to NaOH (Baker analysed, Baker, Deventer, Holland) and HCl

(HCl 37%, AnalaR Normapur, VWR Prolabo, Leuven, Belgium) solutions (0.1 M). Tap water was used

since stabilization of pH values during several hours in MilliQ water was not possible. Moreover,

sufficient concentrations of DOM were used so that DOM naturally present in tap water was not

significant. Salinity, conductivity and pH were checked with the help of a multi-parameter instrument

(340i, WTW, Weilheim, Germany) and DOC concentrations were measured using a TOC-V CSN

(Shimadzu, Duisburg, Germany).

Fractions of samples without PAHs were studied by EEM spectroscopy and UV-visible

spectrophotometry. The spectrofluorometer used was a Fluorolog FL3-22 (Jobin-Yvon, France)

equipped with a xenon lamp (450 W). Samples were contained in a 1 cm path length fused silica cell

thermostated at 20 °C. All the fluorescence spectra were acquired with an integration time of 0.5 s, an

emission wavelength increment of 1 nm, excitation and emission band paths of 4 nm in ratio mode

(S/R) (the signal was automatically normalized by the lamp reference signal). EEM spectra were

performed with emission spectra from 260 to 700 nm at excitation wavelengths from 250 to 410 nm

with an increment of 10 nm. Each spectrum was corrected for the background fluorescence of

ultrapure water, instrumentally corrected and expressed in Raman units as already described by

Huguet et al. (2009). A Jasco V-560 spectrophotometer (Jasco, France) equipped with deuterium and

tungsten iodine lamps was used to measure characteristic wavelength absorbances of DOM and to

avoid inner filtering effect during fluorescence analyses (Huguet et al. 2009): every sample with a

maximum absorbance higher than 0.1 was appropriately diluted. UV-visible spectra were acquired

between 210 and 700 nm at 200 nm.min-1

and also corrected for the absorption background of

ultrapure water.

SPME analyses of 10 mL samples were performed with commercially available PDMS

(polydimethylsiloxane) 100 µm 23g coated fibers from Supelco (Bellefonte, USA). The parameters

optimized for the PAH analyses were an extraction temperature of 40 °C, a desorption temperature of

270 °C and an extraction time of 30 min (de Perre et al. 2009). The GC was an Agilent 6890 model


172

(Agilent Technologies, Massy, France) equipped with a mass selective detector, model 5972 operated

under electronic impact (EI 70 eV). The column used was a (5% phenyl)-methylpolysiloxane (30 m

length, 0.25 mm internal diameter, 0.25 µm film thickness; Agilent Technologies, Chromoptic,

Courtaboeuf, France). Analyses were performed with an injector equipped with a septum-less system

(Merlin Microseal) and a SPME insert in the pulsed splitless mode (with a pulse pressure of 30 psi for

1 min, after 2 min the purge flow to split vent was 55 mL.min-1

and the gas saver was set at 20

mL.min-1

after 15 min). The carrier gas was helium (purity 5.6, Linde Gas, Toulouse, France) with a

flow rate of 1.3 mL.min-1

and linear velocity of 42 cm.s-1

. The column temperature was held initially at

60 °C for 2 min, increased to 150 °C at 20 °C.min-1

then to 250 °C at 15 °C.min-1

and to 310 °C at

10 °C.min-1

and finally held on for 3 min. During the GC-MS analysis and the decrease of the GC oven

temperature (30 min), the SPME fiber was maintained in the injector port to be conditioned before

each extraction. The first conditioning of the fiber was performed in split mode (with a ratio of 100:1

and a flow of 129 mL.min-1

) in order to protect the column. For the determination of PAHs, GC-MS

analysis was used in the Selected Ion Monitoring (SIM) acquisition mode and only the molecular ions

were sought. A dwell time of 80 ms was used for each ion and the scan rate was 1.31 cycle.s-1

.

To quantify free and total PAH concentrations, spiked waters were made with known

concentrations of native and deuterated PAHs to calculate the response factors of the SPME-GC-MS.

Total PAH concentrations were quantified by internal calibration with perdeuterated standards

corresponding to each PAH and the free PAHs were quantified by internal calibration regarding

naphthalene d8 (de Perre et al. 2009), which did not interact with any of the three DOM samples

(results not shown). Two spiked ultrapure waters were analyzed before the samples and two at the

end of the series in order to verify the stability of the system. Before extraction of each series, the GC-

MS system was previously checked by means of a manual direct liquid injection of PAH solutions into

the system.

Full and fractional factorial designs were used to plan experiments. Four factors (salinity, pH,

PAH concentration and DOC concentration) were investigated simultaneously thanks to fractional

factorial designs that meant 8 samples (24-1

) (Table 1) were prepared for AHA and RW. For AHA, 8

other samples were made to confirm results of the first series. Indeed, a full factorial design 24 is

composed of a series of 16 samples which can be divided in two fractional designs 23-1

which should

give the same results. Therefore, for AHA, the complementary fractional design was performed and

results of the first one were confirmed so this kind of design appeared to be sufficient to describe the

observed phenomena.


173

X1 X2 X3 X1X2X3=X4

sample number salinity pH [PAH] (ng.L-1

) [DOC] (mg.L-1

)

1 0 5 100 1a 2

b

2 30 5 100 12a 15

b

3 0 9 100 12a 15

b

4 30 9 100 1a 2

b

5 0 5 1000 12a 15

b

6 30 5 1000 1a 2

b

7 0 9 1000 1a 2

b

8 30 9 1000 12a 15

b

Central point 15 7 550 6.5a 8.5

b

Table 1. Theoretical experiences of the 24-1

fractional factorial design applied to a RW and

b AHA.

Regarding AC, as the salinity was already high in the sample (around 32), it was not possible

to study this factor so a full factorial design was used with only three factors, that represented 8

samples (23) (Table 2).

X1 X2 X3

sample number pH [DOC] (mg.L-1

) [PAH] (ng.L-1

) salinity

1 5 8 100 32

2 9 8 100 32

3 5 34 100 32

4 9 34 100 32

5 5 8 1000 32

6 9 8 1000 32

7 5 34 1000 32

8 9 34 1000 32

Central point 7 21 2000 32

Table 2. Theoretical experiences of the 23 full factorial design applied to AC.

In addition to the 8 samples of each design, central points were made and were extracted

every two samples along the series to quantify the variability of the system and to determine the

significance of the results. The factors were studied with parameter values chosen to be

representative and environmentally realistic (Table 1 and Table 2). Theoretical values were

experimentally checked and the measured values were used for the calculation. The responses were

the DOM-water partition coefficient (KDOC) of each PAH which was calculated as follows:

][][

][][

DOCPAH

PAHPAHK

free

freetotalDOC

(1)

(with [PAH]total, the total concentration of PAHs, [PAH]free, the concentration of free PAHs and [DOC], the DOC concentration.)


174

In order to correlate effects of factors on the interactions and their effects on DOM, several

characteristic fluorescence and absorbance indices or ratios were also used as responses. As these

measurements were performed before the addition of PAHs, the factor concentration of PAHs was not

involved and these designs were full factorial designs for each DOM. The software Modde 5.0

(Umetrics) was used for the data processing.


III.1. DOM sample characterization

In this study, several indices and ratios coming from UV-visible absorption and

spectrofluorometry measurements were used to characterize DOM. The fluorescence spectra of the

three DOM types are given in the Figure 1. Several characteristic bands of fluorescence are observed

on EEM spectra: the α‘ (Ex/Em = 250/380-480 nm) and α (Ex/Em = 370/420-480 nm) bands, which

are characteristic of humic material, the γ band (Ex/Em = 280/330 nm) which is composed of protein-

like material and the β band (Ex/Em = 310/400 nm), which is characteristic of autochthonous material

production related to biological activity (Parlanti et al. 2000). Relative contributions of these bands

were determined thanks to ratios of maximum fluorescence intensity: α‘/α, β/α and γ/α. Three indices

were also calculated for fluorescence measurements. First, the humification index (HIX), introduced by

Zsolnay et al. (1999), is the ratio of area from 435 to 480 nm over area from 300 to 345 nm for an

excitation wavelength of 250 nm. HIX increases with aromaticity, size of macromolecules, complexity

and condensation of macromolecules (Kalbitz et al. 2003, Huguet et al. 2009). According to Huguet et

al. (2009), this index allows to determine DOM origin: a value less than 4 was shown to characterize a

biological or aquatic origin whereas a value higher than 16 indicated a strong humic character or an

important terrigenous contribution. The f450/f500 ratio introduced by McKnight et al. (2001) was also

used. It is calculated as the ratio of fluorescence intensity at 450 nm over 500 nm with an excitation

wavelength of 370 nm. This index allows the distinction between autochthonous aquatic DOM (with a

value around 1.9 for aquatic and microbial sources) and allochthonous aquatic DOM (with a value

around 1.3 for terrestrial and soil sources). Due to a shift in fluorescence emission spectra towards

longer wavelength, this index varies with aromaticity, molecular weight and flocculation of DOM

(Huguet et al. 2009). The third index used was the recent autochthonous contribution (BIX) introduced

to determine the presence of the β fluorophore (Huguet et al. 2009). It is calculated as the ratio of the

fluorescence intensity at 380 nm over the intensity at 430 nm, with an excitation wavelength of 310

nm. Its values are shown to be higher than 1 for biological or aquatic bacterial DOM and around 0.6-

0.7 for DOM with low autochthonous component.


175

Figure 1. EEM and plot fluorescence spectra, a) AHA, b) RW, c) AC, with pH = 9 and maximal DOC

concentrations. EEM fluorescence intensities are expressed in Raman units.

Some UV-visible parameters were also calculated. Aromaticity is usually described as the

absorbance between 250 and 280 nm (Thomsen et al. 2002, Lepane et al. 2004). Here, the

aromaticity percentage was calculated thanks to equation (2) introduced by Chin et al. (1994):

6.74[DOC]

Absyaromaticit 280 (2)

a)

b)

c)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660emission (nm)

250280310340

370400

260310360410460510560610660 emission (nm)

250280310340

370400

260310360410460510560610660 emission (nm)

6.8-76.4-6.86-6.45.6-65.2-5.64.8-5.24.4-4.84-4.43.6-43.2-3.62.8-3.22.4-2.82-2.41.6-21.2-1.60.8-1.20.4-0.80-0.4

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660emission (nm)

250280310340

370400

260310360410460510560610660 emission (nm)

2.03-2.11.96-2.031.89-1.961.82-1.891.75-1.821.68-1.751.61-1.681.54-1.611.47-1.541.4-1.471.33-1.41.26-1.331.19-1.261.12-1.191.05-1.120.98-1.050.91-0.980.84-0.910.77-0.840.7-0.770.63-0.70.56-0.630.49-0.560.42-0.490.35-0.420.28-0.350.21-0.280.14-0.210.07-0.140-0.07

250280310340

370400

260310360410460510560610660 emission (nm)

2.03-2.11.96-2.031.89-1.961.82-1.891.75-1.821.68-1.751.61-1.681.54-1.611.47-1.541.4-1.471.33-1.41.26-1.331.19-1.261.12-1.191.05-1.120.98-1.050.91-0.980.84-0.910.77-0.840.7-0.770.63-0.70.56-0.630.49-0.560.42-0.490.35-0.420.28-0.350.21-0.280.14-0.210.07-0.140-0.07

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660emission (nm)


176

(with Abs280, the absorbance at 280 nm and [DOC], the DOC concentration in mol.L-1

.)

In the same manner, the SUVA was calculated to characterize aromaticity thanks to equation

(3):

100[DOC]

AbsSUVA 254 (3)

(with Abs254, the absorbance at 254 nm and [DOC], the DOC concentration in mg.L-1

.)

Two ratios of absorbance were also used: E2/E3 ratio (Abs254/Abs365) and E4/E6 ratio

(Abs465/Abs665). The E2/E3 ratio usually increases when aromaticity and molecular weight decrease

(Thomsen et al. 2002) and was observed to be higher than 3.5 for fulvic acids and less than 3.5 for

humic acids (Minero et al. 2007). E4/E6 is shown to increase when molecular weight decreases or

oxygen content in DOM increases (Thomsen et al. 2002). A few studies have found E4/E6 values less

than 5 for humic acids and higher than 6 for fulvic acids (Chen et al. 2002, You et al. 1999).

The EEM spectrum of AHA is characteristic of very mature humic substances: fluorescence

bands are shifted towards long wavelengths meaning it is composed of large macromolecules and

numerous aromatic components, HIX is very high (47.5) and the f450/f500 ratio < 0.5 shows a terrestrial

origin. UV-visible parameters support these results and give an aromaticity around 48%. The E2/E3

and E4/E6 ratios of 2.4 and 4.6 respectively confirm the humic acid predominance (Minero et al. 2007,

Chen et al. 2002).

The EEM spectrum of AC is characteristic of recent marine DOM composed essentially of

fresh material as shown by a high γ band and the presence of a β band. The α and α‘ bands are also

present but their intensities are lower. HIX is very low (1.1) and the γ/α ratio of about 7 confirms the

recent origin. Even though the f450/f500 index is higher than in AHA sample, its value is 1.3 for AC which

would indicate a terrestrial origin for McKnight et al. (2001). However, they developed this index to

determine the origin of fulvic acids so their index values do not seem to be applicable to AC but can be

used as a comparison tool. The aromaticity of the sample is around 9%. Surprisingly, the E4/E6 ratio is

lower (1.6) than the one of AHA meaning a higher size of macromolecules. However, as the DOC

concentration is high (around 34 mg.L-1

), aggregation of macromolecules could explain this low value

(Pan et al. 2008a). The E2/E3 ratio of about 2.6 also indicates the predominance of humic acids over

fulvic acids.

RW is intermediate between the two other samples. RW seems to have partly a terrestrial

origin as shown by its high HIX value (10.3) but this DOM is less humified than AHA. It is confirmed by

its aromaticity of 24% and a E2/E3 ratio of about 4.2 characteristic of fulvic acids. Its E4/E6 ratio (4.3)

indicates smaller macromolecules than the ones of AC and of the same size as the ones of AHA.

However, this ratio may not be appropriated to describe the nature of DOM in natural waters since this

sample, according to its origin, must be essentially composed of fulvic acids, even though a value less

than 5 was obtained. So far studies of E4/E6 variations have focused mostly on soil organic matter and


177

0

100000

200000

300000

400000

500000

phenanthrene fluoranthene chrysene benzo[a]pyrene

GC

are

as/[

PA

H]

pH 5 pH 6 pH 7

pH 8 pH 9

0

50000

100000

150000

200000


GC

are

as/[

PA

H]

salinity 0 salinity 5 salinity 15 salinity 25 salinity 35

references could not be adapted to natural waters. RW is also composed of fresh material since a

band appears even though the / ratio remains low (0.6). BIX also confirms the low recent

macromolecule contribution since its value is around 0.5 while it is 0.3 for AHA and 1 for AC.

For fluorescence intensities and ratios, only visible bands will be discussed thereafter: α‘, α

and α‘/α for AHA, α‘, α, γ, γ/α and α‘/α for RW and α‘, α, γ, β, β/α, γ/α and α‘/α for AC.

In parallel to the characterization of DOM samples, interactions of each DOM type with PAHs

were studied thanks to the calculation of KDOC values. However, before free and total PAH

concentration measurements, it was necessary to know the effect of pH and salinity on SPME without

DOM.

III.2. Optimization of SPME-GC-MS

As regards the SPME-GC-MS, it is important to study the effect of physico-chemical

parameters like salinity or pH on the PAH extraction to quantify correctly PAHs and their interactions

with DOM. Experiments were made to know the effect of pH and salinity at environmental relevant

values on the extraction of 4 PAHs (phenanthrene, fluoranthene, chrysene and benzo[a]pyrene).

According to Figure 2, salinity cannot be ignored since an increase of salinity from 0 to 35 (in

concentration of NaCl) causes a significant increase of areas for PAHs. An increase of areas with

salinity can be explained by the salting-out effect well-known for hydrophobic compounds which would

be more adsorbed or absorbed by the fiber when water molecules are less available for their

dissolution (Schwarzenbach et al. 1993, Li et al. 2006). As far as pH is concerned, its influence seems

to be less obvious since a variation from 5 to 9 does not show any significant tendency (Figure 2).

Figure 2. Effect of pH and salinity on PAH extraction, [PAH] = 500 ng.L-1

for pH, [PAH] = 1 µg.L-1

for salinity,

n = 3.

Although salinity and to a lesser extent pH have been proved to influence the extraction by

SPME, PAHs and deuterated PAHs are affected in the same manner (Figure 3) and consequently,

internal calibration can be performed in conditions of pH and salinity differing from the ones of the

samples to analyze. Indeed, relative response coefficients for quantification of both total and free PAH

concentrations are the same whatever the conditions of the sample. So the use of internal calibration


178

for the quantification of free PAH concentrations instead of external calibration is in this case very

useful as it is not necessary to adjust salinity in calibration spiked waters.

Figure 3. Response factors at different salinities for total PAH concentration (on the left) and free PAH

concentration quantifications (on the right), [PAH] = 1 µg.L-1

, n = 3.

III.3. Factor effects on PAH-DOM interactions

III.3.1. Effect of DOM origin

First, KDOC values of the three DOM types were compared (Figure 4). Most of average KDOC

values are higher for AHA than for the other DOM samples. It was already shown that commercial

humic substances have stronger interactions with PAHs than natural DOM (Perminova et al. 1999,

Durjava et al. 2007).

0

1

2

3

4

5

6

7

Acy

Ace

Flu

Ph

e

An

DB

T

Flu

o

Pyr

Ba

A

Ch

ry

Bb

F+

BkF

Be

P

Ba

P

Pe

r

log

KD

OC

AHA RW AC

Figure 4. Average log KDOC with the three DOM for each PAH for central points.

Whereas high molecular weight (HMW) PAHs have stronger interactions with AC than with

RW, it is the contrary for low molecular weight (LMW) PAHs. Moreover, for HMW PAHs, KDOC values

are only twofold higher for AHA than for AC while they are twentyfold higher for AHA than for RW.

Therefore, even though very humified DOM (AHA) has stronger interactions with PAHs, the degree of

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9


Re

spo

nse

fac

tors

PA

H/d

eu

tera

ted

PA

H

salinity 0

salinity 35

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8


Re

spo

nse

fac

tors

PA

H/d

eu

tera

ted

nap

hth

ale

ne

salinity 0

salinity 35


179

humification and aromaticity of DOM are not the driving factors for interactions with PAHs, especially

for HMW ones, and it seems that fresh material could also play a major role in these interactions. This

is unexpected since several studies observed a correlation between KDOC and aromaticity descriptors

(Perminova et al. 1999, Chin et al. 1997, Gauthier et al. 1987). However, more recently, a few studies

corroborated our results (Kopinke et al. 2001, Hur and Schlautman 2003). They attributed the increase

in KDOC values for pyrene with decreasing aromaticity to the increase of aliphatic content of DOM

which could enhance the sorption potential for PAHs in DOM. Kopinke et al. (2001) also suggested

that the flexibility of substituents and the inter- and intramolecular formation of hydrophobic domains

could enhance interactions with PAHs. Unfortunately, these hypotheses cannot be verified in our study

since aliphatic chains cannot be described by optical parameters.

Regarding effects of environmental parameters, it was necessary to use factorial design

results to understand complex phenomena that occurred. The factorial designs used were not adapted

to a perfect modeling of the studied effects since for this purpose, many more samples would have to

be performed and fitted. However these simple experiments were useful to better understand how

environmental parameters affect interactions and how these latter depend on PAH nature, which is

very rarely studied. Despite the simplicity of these models, they have given acceptable results: the

linearity hypothesis seems to be relevant on the studied range since most of central points fit with

models and R² of correlations between environmental parameters and KDOC values range from 0.3 to

0.9 depending on DOM and PAHs (with R² usually better for HMW PAHs, results not shown).

III.3.2. Effect of salinity

A variation of salinity between 0 and 30 did not influence significantly either KDOC values or

DOM characteristic parameters calculated as well by UV-visible absorption as by spectrofluorometry

(results not shown). The only exception is an effect of salinity on AHA aromaticity but it may be an

artifact since only this parameter is modified significantly while HIX or E2/E3 are not. In the literature,

several effects were reported. Tremblay et al. (2005) observed an increase of suspended particulate

matter - water partition coefficient for phenanthrene and fluoranthene when salinity increased. They

attributed these results to the ―salting-out‖ effect that changes PAH aqueous solubility. Gauthier et al.

(1986) also observed an increase of KDOC values for pyrene, phenanthrene and anthracene with

increasing concentration of NaCl. While Schlautman and Morgan (1993) found opposite effects with

Suwannee River humic substances and pyrene and perylene, and attributed them to the modification

of the organic matter structure caused by salt ions. Although Baalousha et al. (2006) demonstrated

that ionic strength could modify the macromolecule size, our results confirm that these changes do not

influence optical properties of DOM as previously found (Han and Guo 2008, Fu et al. 2004).

Moreover, in our experiments, it is possible that the effect of salinity on DOM structure was too low to

be observed and was compensated by the small enhancement of PAH water solubility to lead to

apparent constant KDOC values for all PAHs.


180

III.3.3. Effect of PAH concentration

In these experiments, PAH concentrations have significant effects on KDOC values for AC but

neither for AHA nor RW. These results for AHA contradict the ones of a previous study (de Perre et al.

2009) but the concentrations used here (100 to 1000 ng.L-1

) are in a narrower range which

corresponds to the linear domain in the previous work. For AC, the studied range is larger (100 to

2000 ng.L-1

) and PAH concentration effects are observed: whatever pH and DOC concentration, an

increase of PAH concentration causes a decrease of KDOC values. These results comfort the

hypothesis of competition of PAHs towards specific association sites of DOM suggested in the

previous work.

III.3.4. Effect of pH and DOC concentration

DOC concentrations and pH were studied together because their effects on interactions could

be interrelated. Although their effects are dependent on DOM origin and PAH structure (Figure 5), the

same tendency is observed for the 3 DOM samples. Globally, a decrease of DOC concentration leads

to an increase of KDOC values for LMW PAHs and a pH variation from 9 to 5 causes an increase of

KDOC values for HMW PAHs. For AHA, the effect of DOC concentration on LMW PAH interactions is

observed from acenaphthylene to pyrene and is independent on pH while the effect of pH on HMW

PAH interactions is observed from benzo[a]anthracene to perylene and is independent on DOC

concentration. For RW, the same effects are observed but pH affects KDOC values from phenanthrene

to perylene and DOC concentration affects all PAH interactions. Moreover, pH and DOC concentration

effects are dependent on each other (Figure 5b): KDOC values increase when DOC concentration

decreases especially at low pH whereas KDOC values increases when pH decreases only for low DOC

concentration. As regards AC, the effects on interactions are dependent on PAH concentrations. At

low PAH concentrations, all KDOC values depend on DOC concentration and not on pH whereas at

high PAH concentrations, they are very low and almost independent on pH and DOC concentrations.


181

Figure 5. Normalized coefficients of effects of pH and DOC concentration on KDOC values for a) AHA, b) RW

and c) AC.

a)

b)

c)


182

Similar tendency of increasing KDOC values when pH decreases has already been observed in

several studies. Schlautman and Morgan (1993) observed an increase of KDOC of pyrene, anthracene

and perylene when pH decreased for reference humic and fulvic acids (Suwannee River, IHSS). Pan

et al. (2007) have shown a decrease of KDOC values for pyrene and phenanthrene with Aldrich humic

acid for a pH variation from 4 to 11. However, Kopinke et al. (2001) observed that almost no effect of

pH occurred on KDOC values for pyrene with commercial humic acid (Roth) whereas they observed an

increase of interactions when pH decreases for small molecules (2000 Da) and natural aquatic humic

substances. This suggestion could explain why, for natural samples, RW is the most sensitive sample

to pH variations since it is of natural aquatic origin and is composed of smaller macromolecules than

AC (according to E4/E6 parameter).

As pH cannot modify PAH solubility, the modification of partition should only be the result of

modifications of DOM properties and/or structure, usually known to be due to protonation of some

DOM functional groups (Pan et al. 2007, Schlautman and Morgan 1993). According to Zhu et al.

(2004), several modifications of DOM due to protonation could explain an increase of PAH association

with pH decrease. For instance, the protonation of ring substituents of DOM could enhance

hydrophobicity and strength of π-H-bond and π-π interactions between DOM and PAHs (Zhu et al.

2004). The fact that HMW PAHs (which are the most hydrophobic and the strongest π-donor PAHs)

are more influenced by pH could corroborate these hypotheses. Actually, for AHA, only interactions

with stronger π-donor PAHs are affected by pH, indicating that AHA should be composed mainly of

functional groups which have a more π-acceptor character (protonated aromatic amines for example)

than the ones of RW (carboxylic acids for example).

In order to better understand the effect of pH on interactions we investigated the effect of pH

on DOM. Interpretation of modification of DOM properties thanks to optical parameters is complicated

by the fact that sometimes similar parameters gave opposite results. For instance, a decrease of pH

causes a decrease of aromaticity and/or molecular weight of AHA according to the increase of E2/E3

ratio but an increase of aromaticity according to the SUVA and the aromaticity percentage (Figure 6).

Moreover, the E4/E6 ratio, which is inversely proportional to molecular weight, did not vary significantly

so it can be supposed that the variation of E2/E3 was not due to a modification of the size of

macromolecules. Therefore, it is hard to determine if pH affects aromaticity. Moreover, as no other

effect on AHA optical properties is observed with variation of pH while KDOC values of HMW PAHs

increase, it might be assumed that interactions of HMW PAHs occurred with slightly or not

absorbent/fluorescent functional groups of AHA. As regards the two other DOM types, contrary to pH

effect on KDOC values, a pH variation from 9 to 5 affects AC optical properties greatly and to a lesser

extent RW fluorescence (Figure 6). The four characteristic fluorescence bands of AC have a lower

intensity as pH decreases whereas for RW only the band is modified. The fluorophores of the AC

bands might be of the same nature as the ones of the band of RW but different from the ones of

other bands of RW and AHA. The influence of pH on AC fluorescent bands and on the band of RW

could be explained by the bigger proportion of ionizable groups in these fluorophores and especially


183

phenolic groups. Indeed, the higher the content of phenolic hydroxyl, the greater would be the

dependence of the fluorescence intensity on pH (Senesi 1990). Phenolic groups become more acidic

in the excited state than in the ground state (Parker 1968) so their fluorescence would mainly come

from their ionized form. Thus, when pH decreases their protonation increases and their fluorescence

intensity decreases. Inversely, aromatic carboxylic acids and aromatic ketones are more strongly

basic in the excited state (Parker 1968) and their protonated form would be mainly responsible for

their fluorescence. That is why an addition of protons should modify their fluorescence intensity only to

a lesser extent. As AC is mainly composed of protein-like compounds (γ band) and non-humified fresh

materials, phenolic groups could have been the major fluorophores of this sample. Given that PAH

interactions with this DOM do not depend on pH, we can suggest that phenolic groups are not

involved in association with PAHs. Even though we have shown that the main fluorophores of this

DOM are not responsible for interactions, this sample has stronger interactions with PAHs than RW.

Therefore, non pH-dependent functional groups could be involved in these interactions with AC such

as ketone, aldehyde, ester, amido or quinone groups (Zhu et al. 2004).

Figure 6. Effect of pH on optical properties of DOM. = depends on DOC concentrations.

Moreover, given that KDOC values of AC are highly dependent on DOC concentration, we can

suppose that the variations of interactions are due to DOM structure modifications. Indeed, for this

sample, the fluorescence intensities of the α‘, α and β bands (corrected by DOC concentrations) are

higher when the sample is diluted (Figure 7). That could be due to collisions at high DOC

concentration since the greater proximity of fluorophores could have enhanced the probability of

deactivation of excited states and quenched the fluorescence (Senesi 1990). This high proximity of

macromolecules also seems to have caused agglomeration effect with an increase in DOC

concentration. Indeed, a rise in macromolecule size is pointed out thanks to E2/E3 and E4/E6 ratios.


184

This aggregation, even at high pH, could be explained by the reduced free space for the movement of

macromolecules and the decrease of intermolecular distance (Pan et al. 2008a). Furthermore, the

decrease of the f450/f500 ratio with an increase of DOC concentration is due to a significant shift of the α

band of 15-20 nm towards longer wavelengths, confirming a higher size of macromolecules. This

agglomeration could be unfavorable for LMW PAHs by hindering their access to DOM association

sites, causing a decrease of KDOC values at high DOC concentrations.

-1,50

-1,00

-0,50

0,00

0,50

1,00

1,50AC RW AHA

α‘/α

β/α

γ/α

α‘/[D

OC

]

α/[

DO

C]

β /[D

OC

]

γ /[D

OC

]

HIX

BIX

f 45

0/f

50

0

E2/E

3

E4/E

6

aro

ma

ticity %

SU

VA

Figure 7. Effect of DOC concentration on optical properties of DOM. = depends on pH.

The same effects seem to occur with AHA, but, maybe because of its larger and more

humified macromolecules composition, this aggregation seems to have enhanced aromaticity and

complexity of DOM (as shown by SUVA and HIX). However, this modification of aromaticity did not

enhance interactions with PAHs, even for the most hydrophobic of them.

As regards RW, E2/E3 and E4/E6 ratios are higher at higher DOC concentration, meaning a

decrease in macromolecule size likely owing to intramolecular withdrawal (Pan et al. 2008a). This

withdrawal could reduce available binding sites for PAHs and explain low KDOC values of all PAHs at

high DOC concentration. At high pH, f450/f500 shows an increase of macromolecule size which could

mean that macromolecules get closer despite their ionization due to the reduced free space (Pan et al.

2008a). The most favorable configuration of this DOM sample for interactions with PAH is thus

reached at low pH (macromolecules in the protonated form) and at low DOC concentrations (with no

or low intramolecular withdrawal).

Consequently, it is hard to conclude about effects of pH and DOC concentration on DOM

given that it depends on DOM origin and PAHs. Moreover, the characterization of DOM by just


185

spectroscopic techniques complicates the understanding of interactions since environmental

parameters can affect DOM but not its optical properties and thus these effects could not be observed

in this study.

We tried to point out a relationship between the variations of KDOC values and optical

parameters of DOM due to environmental parameters modification but independently of the factor

causing the modification. It appears that a few correlations can be made but they depend on DOM

origin. The three ratios affected the most in the same manner as KDOC values among the ones

observed are E2/E3, E4/E6 and ‘/ (Figure 8). The best correlations for the three DOM studied

together (to model the behavior of an unknown sample, Figure 8d) are a positive relationship between

variations of KDOC values and the ones of ‘/ (R = 0.5 to 1), and a negative relationship between

variations of KDOC values and the ones of E4/E6 but the latter is better for LMW PAHs (R = -0.2 to -0.7

from Ace to Pyr and R = -0.1 to -0.4 from BaA to Per). The variations of E2/E3 ratio fits well the ones of

KDOC values of HMW PAHs with AHA but are slightly related to KDOC values in an unknown sample

(represented here by the three DOM types together model). This low relationship between E2/E3 and

KDOC variations suggests that an increase of aromaticity and/or complexity of DOM due to

environmental parameter modifications does not modify significantly the strength of interactions with

PAHs. This result is confirmed by other parameters like HIX, SUVA and aromaticity percentage which

variations are not correlated with KDOC variations. This could be surprising since E2/E3 seems to be

related to KDOC values (KDOC values are higher for samples with lower E2/E3, i.e. AHA and AC). But it

could mean that modifications of absorbance properties of DOM due to environmental factors does not

change DOM capacity to interact with PAHs whereas the E2/E3 value initially measured in the sample

would be more representative of the structure of DOM and of its interaction capacities. As for E4/E6, its

variations seem to be better correlated to KDOC variations, especially for LMW PAHs: interactions

seem to be stronger when E4/E6 decreases owing to environmental parameters. Indeed, the decrease

of interactions due to condensation of large macromolecules and the increase of interactions owing to

aggregation of smaller macromolecules could be well described by this ratio. This positive correlation

between molecular weight of DOM and KDOC values of PAHs has already been underlined in literature

with other analytical techniques for the size measurement of DOM (Chin et al. 1997, Kopinke et al.

2001, Pan et al. 2008b). Therefore, it confirms both the relationship between PAH interaction strength

and size of DOM (at least for LMW PAHs) and the correlation between E4/E6 with macromolecule size.

Last but not least, the best correlation seems to occur with the ‘/ ratio which suggests that

modifications of humic substance optical properties due to environmental factors cause modifications

of the strength of interactions. However, this is especially true for natural aquatic DOM (Figure 8b and

c) since only low correlations occur for AHA (Figure 8a). Moreover, the variations of KDOC values are

independent of / ratio variations, even for AC, although recent macromolecules play an important

role on interactions with PAHs, especially with HMW PAHs (as shown by high KDOC values for these

compounds with AC).


186

IV. Conclusion

This study showed that interactions of PAHs with DOM are very complex and depend on many

factors. Some of them have no effect on interactions, such as salinity, while some others highly affect

KDOC values such as pH and DOC concentrations. Nevertheless, interactions and environmental factor

effects have been shown to depend on PAHs and DOM origin and structure and appear to be difficult

to apprehend. Indeed, in this study three different DOM were studied and three different complex

behaviors were pointed out, so the phenomena that occur in natural waters should be a challenge to

model. However, it would be interesting to investigate the relationships between KDOC values and

optical properties of DOM, and especially for E4/E6 and ‘/, for more various natural DOM types to

eventually conclude on a correlation applicable to natural waters. Moreover, it was shown that

environmental parameters can modify optical properties and interaction capacities of DOM but the

modification of DOM optical properties does not obligatory change interaction strength and the

modification of KDOC values are not always due to a change in optical properties. Finally, a (voluntary

Ace

Acy

Flu

Phe

An

DB

T

Flu

o

Pyr

BaA

Chry

Bb,k

F

BeP

BaP

Per

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ace

Acy Flu

Phe

An

DB

T

Flu

o

Pyr

BaA

Chry

BbF

BeP

BaP

Per

Investigation: la hume_Kdoc_UV_fluo (PLS, comp.=2)

Normalized Coefficients

N=13 Cond. no.=2.3321

DF=9 Y-miss=0

E2/3

E4/6

a'/a

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ace

Acy Flu

Phe

An

DB

T

Flu

o

Pyr

BaA

Chry

BbF

BeP

BaP

Per

Investigation: isochrysis_Kdoc_UV_fluo (PLS, comp.=2)


N=13 Cond. no.=2.2196

DF=9 Y-miss=0

E2/3

E4/6

a'/a

-1.00

-0.80

-0.60

-0.40

-0.20

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Ace

Acy Flu

Phe

An

DB

T

Flu

o

Pyr

BaA

Chry

BbF

BeP

BaP

Per

Investigation: 3mod_Kdoc_UV_fluo (PLS, comp.=3)


N=47 Cond. no.=2.9175

DF=43 Y-miss=0

E2/3

E4/6

a'/a

b)

c) d)

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ace

Acy Flu

Phe

An

DB

T

Flu

o

Pyr

BaA

Chry

BbF

BeP

BaP

Per

Investigation: Aldrich_Kdoc_UV_fluo (PLS, comp.=2)


N=21 Cond. no.=1.3075

DF=17 Y-miss=0

E2/3

E4/6

a'/a

Ace

Acy

Flu

Phe

An

DB

T

Flu

o

Pyr

BaA

Chry

Bb,k

F

BeP

BaP

Per

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

Ace

Acy

Flu

Phe

An

DB

T

Flu

o

Pyr

BaA

Chry

Bb,k

F

BeP

BaP

Per

Ace

Acy

Flu

Phe

An

DB

T

Flu

o

Pyr

BaA

Chry

Bb,k

F

BeP

BaP

Per

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

a) E2/E3 E4/E6 ‘/

Figure 8. Normalized coefficients of the three effects the most related to KDOC values, a) AHA, b) RW, c) AC,

d) 3 DOM types in the same model.


187

or involuntary) modification of concentration or pH of DOM samples cannot be ignored regarding

modifications of optical properties and behavior towards PAHs that must have occurred.

Acknowledgements

We gratefully acknowledge Céline Vérité (Ifremer) for the dissolved organic carbon analyses,

Raphaël Brizard and Jean Christophe Billy (Laboratoire Génétique et Pathologie (LGP), La

Tremblade) for the algae cultures and Julien Noui for his technical help. "Region Aquitaine", INSU

(IMOTOX project), FEDER, CPER du Poitou Charentes and ORQUE program (CPER) are also

acknowledged for financial support and the French Ministry of Research for the PhD grant of Chloé de

Perre.

Literature

Akkanen, J., Penttinen, S., Haitzer, M. & Kukkonen, J.V.K. (2001) Bioavailability of atrazine, pyrene

and benzo[a]pyrene in European river waters. Chemosphere 45(4-5), 453-462.

Baalousha, M., Motelica-Heino, M. & Coustumer, P.L. (2006) Conformation and size of humic

substances: Effects of major cation concentration and type, pH, salinity, and residence time.

Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 272(1-2), 48-55.

Bejarano, A.C., Chandler, G.T. & Decho, A.W. (2005) Influence of natural dissolved organic matter

(DOM) on acute and chronic toxicity of the pesticides chlorothalonil, chlorpyrifos and fipronil

on the meiobenthic estuarine copepod Amphiascus tenuiremis. Journal of Experimental

Marine Biology and Ecology 321(1), 43-57.

Chen, J., Gu, B., LeBoeuf, E.J., Pan, H. & Dai, S. (2002) Spectroscopic characterization of the

structural and functional properties of natural organic matter fractions. Chemosphere 48(1),

59-68.

Chin, Y.P., Aiken, G.R. & O'Loughlin, E. (1994) Molecular weight, polydispersity, and spectroscopic

properties of aquatic humic substances. Environmental Science and Technology 28(11),

1853-1858.

Chin, Y.P., Aiken, G.R. & Danielsen, K.M. (1997) Binding of Pyrene to Aquatic and Commercial

Humic Substances: The Role of Molecular Weight and Aromaticity. Environmental Science

and Technology 31(6), 1630-1635.

De Perre, C., Le Ménach, K., Budzinski, H., Parlanti, E., (2009) Development of Solid-Phase

Microextraction (SPME) and its Application to the Study of Dissolved Organic Matter (DOM) -

Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH) Interactions in Aquatic Environment. In preparation.




Fu, P., Wu, F. & Liu, C. (2004) Fluorescence Excitation-Emission Matrix Characterization of a

Commercial Humic Acid Chinese Journal of Geochemistry 23(4), 309-318.


188




Gauthier, T.D., Seltz, W.R. & Grant, C.L. (1987) Effects of structural and compositional variations of

dissolved humic materials on pyrene Koc values. Environmental Science and Technology

21(3), 243-248.

Georgi, A. & Kopinke, F.-D. (2002) Validation of a modified Flory-Huggins concept for description of

hydrophobic organic compound sorption on dissolved humic substances. Environmental

Toxicology and Chemistry 21(9), 1766-1774.



Chemosphere 37(7), 1335-1362.

Han, Y. & Guo, W. (2008) Factors influencing analysis of chromophoric dissolved organic matter in

estuarine waters by excitation emission matrix spectroscopy (EEMS). Huanjing Kexue Xuebao

/ Acta Scientiae Circumstantiae 28(8), 1646-1653.



575-587.

Huguet, A., Vacher, L., Relexans, S., Saubusse, S., Froidefond, J.M. & Parlanti, E. (2009)

Properties of fluorescent dissolved organic matter in the Gironde Estuary. Organic

Geochemistry 40(6), 706-719.

Hur, J. & Schlautman, M.A. (2003) Using selected operational descriptors to examine the

heterogeneity within a bulk humic substance. Environmental Science and Technology 37(5),

880-887.

Kalbitz, K., Schmerwitz, J., Schwesig, D. & Matzner, E. (2003) Biodegradation of soil-derived

dissolved organic matter as related to its properties. Geoderma 113(3-4), 273-291.

Kopinke, F.-D., Georgi, A. & Mackenzie, K. (2001) Sorption of Pyrene to Dissolved Humic

Substances and Related Model Polymers. 1. Structure-Property Correlation. Environmental


Lepane, V., Leeben, A. & Malashenko, O. (2004) Characterization of sediment pore-water dissolved

organic matter of lakes by high-performance size exclusion chromatography. Aquatic

Sciences 66(2), 185-194.

Li, Q., Xu, X., Sen-Chun, L. & Wang, X. (2006) Determination of trace PAHs in seawater and

sediment pore-water by solid-phase microextraction (SPME) coupled with GC/MS. Science in

China Series B: Chemistry 49(6), 481-491.

McCarthy, J.F. & Jimenez, B.D. (1985) Interactions between polycyclic aromatic hydrocarbons and

dissolved humic material: binding and dissociation. Environmental Science and Technology

19(11), 1072-1076.


189

McKnight, D.M., Boyer, E.W., Westerhoff, P.K., Doran, P.T., Kulbe, T. & Andersen, D.T. (2001)

Spectrofluorometric characterization of dissolved organic matter for indication of precursor

organic material and aromaticity. Journal Limnology and Oceanography 46(1), 38-48.

Minero, C., Lauri, V., Falletti, G., Maurino, V., Pelizzetti, E. & Vione, D. (2007) Spectrophotometric

characterisation of surface lakewater samples: Implications for the quantification of nitrate and

the properties of dissolved organic matter. Annali di Chimica 97(10), 1107-1116.

Pan, B., Ghosh, S. & Xing, B. (2007) Nonideal Binding between Dissolved Humic Acids and


Pan, B., Ghosh, S. & Xing, B. (2008a) Dissolved organic matter conformation and its interaction with

pyrene as affected by water chemistry and concentration. Environmental Science and

Technology 42(5), 1594-1599.

Pan, B., Ning, P. & Xing, B. (2008b) Part IV - Sorption of hydrophobic organic contaminants.

Environmental Science and Pollution Research 15(7), 554-564.

Parlanti, E., Worz, K., Geoffroy, L. & Lamotte, M. (2000) Dissolved organic matter fluorescence

spectroscopy as a tool to estimate biological activity in a coastal zone submitted to

anthropogenic inputs. Organic Geochemistry 31(12), 1765-1781.






597-600.

Polubesova, T., Sherman-Nakache, M. & Chefetz, B. (2007) Binding of Pyrene to Hydrophobic

Fractions of Dissolved Organic Matter: Effect of Polyvalent Metal Complexation.




27(5), 961-969.

Schwarzenbach, R.P., Gschwend, P.M. & Imboden, D.M. (1993) Environmental Organic Chemistry

New York: J. Wiley & Sons.

Senesi, N. (1990) Molecular and quantitative aspects of the chemistry of fulvic acid and its

interactions with metal ions and organic chemicals. Part II. The fluorescence spectroscopy

approach. Analytica Chimica Acta 232, 77-106.

Thomsen, M., Dobel, S., Lassen, P., Carlsen, L., Bügel Mogensen, B. & Erik Hansen, P. (2002)

Reverse quantitative structure-activity relationship for modelling the sorption of esfenvalerate

to dissolved organic matter: A multivariate approach. Chemosphere 49(10), 1317-1325.

Tremblay, L., Kohl, S.D., Rice, J.A. & Gagné, J.P. (2005) Effects of temperature, salinity, and

dissolved humic substances on the sorption of polycyclic aromatic hydrocarbons to estuarine

particles. Marine Chemistry 96(1-2), 21-34.


190



You, S.-J., Yin, Y. & Allen, H.E. (1999) Partitioning of organic matter in soils: effects of pH and

water/soil ratio. The Science of The Total Environment 227(2-3), 155-160.

Zhu, D., Hyun, S., Pignatello, J.J. & Lee, L.S. (2004) Evidence for pi-pi electron donor-acceptor

interactions between pi-donor aromatic compounds and pi-acceptor sites in soil organic matter

through pH effects on sorption. Environmental Science and Technology 38(16), 4361-4368.

Zsolnay, A., Baigar, E., Jimenez, M., Steinweg, B. & Saccomandi, F. (1999) Differentiating with

fluorescence spectroscopy the sources of dissolved organic matter in soils subjected to

drying. Chemosphere 38(1), 45-50.


191

Interactions between Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) and

Dissolved Organic Matter (DOM) in pore waters from Arcachon Bay

Chloé de Perre, Karyn Le Ménach, Hélène Budzinski, Edith Parlanti

Abstract

Interactions between Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) and Dissolved Organic Matter

(DOM) were investigated in pore waters from Arcachon Bay (South West coast of France). Solid

Phase Microextraction coupled to Gas Chromatography and Mass Spectrometry (SPME-GC-MS) was

used to quantify free and total concentrations of PAHs in pore waters extracted from marine sediments

coming from the Bay and two harbors. Thanks to Dissolved Organic Carbon (DOC) concentrations, it

was possible to calculate KDOC values (DOC - water partition coefficient) for each PAH naturally

abundant in samples. These values ranged from around 5000 to 25000 mL.g-1

for pyrene and

fluoranthene which were the most present PAHs having interactions with DOM. Pore waters were also

characterized by UV-visible absorption and Excitation-Emission Matrix (EEM) spectrofluorometry to

find out relationships between KDOC values and DOM characteristics. It appeared that the most

reactive DOM types were the ones with high γ fluorescence band intensity and the lowest HIX and

aromaticity. A lower correlation with the α‘/α ratio was also observed. Fluorescence quenching

experiments were also performed and confirmed these observations.

Publication n°5


192

Interactions Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) –

Matière Organique Dissoute (MOD) dans des eaux interstitielles du

Bassin d’Arcachon

Résumé

Les interactions entre les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) et la Matière

Organique Dissoute (MOD) ont été examinées dans des eaux interstitielles du Bassin d‘Arcachon

(côte au sud-ouest de la France). La Micro-Extraction sur Phase Solide couplée à la Chromatographie

en phase Gazeuse et à la Spectrométrie de Masse (SPME-GC-MS) a été utilisée pour quantifier les

concentrations en HAP libres et totaux dans des eaux interstitielles extraites de sédiments marins

provenant de la lagune et de deux ports. Grâce aux concentrations en Carbone Organique Dissous

(COD), il a été possible de calculer les coefficients de partition eau – carbone organique dissous

(KDOC) des HAP naturellement présents dans les échantillons. Ces valeurs s‘échelonnaient entre 5000

et 25000 mL.g-1

pour le pyrène et le fluoranthène qui étaient les HAP les plus présents ayant des

interactions avec la MOD. Les eaux interstitielles ont également été caractérisées par absorption UV-

visible et spectrofluorimétrie tridimensionnelle dans le but de dégager une relation entre les KDOC et

les caractéristiques de la MOD. Il est apparu que les échantillons de MOD les plus réactifs étaient

ceux dont la fluorescence de la bande γ était la plus intense et dont le degré d‘humification (HIX) et

l‘aromaticité étaient les plus faibles. Une plus faible corrélation avec le rapport d‘intensités des

maxima de fluorescence α‘/α a aussi été observé. Des expériences d‘extinction de fluorescence ont

également été menées et ont confirmé ces observations.


193

I. Introduction

The Arcachon Bay, France, has been regularly monitored for many years for its organic and

inorganic contamination to understand consequences on the environment of the increasing

urbanization, industrialization and agricultural activities (Baumard et al. 1998, Devier et al. 2005). The

economic interest of this area is mainly based on activities connected to aquatic environment such as

tourism, fishing and oyster-farming, so to maintain its quality is essential. The pollution of the aquatic

environment in this area is mainly due to boat presence and functioning (for yachting, fishing, oyster-

farming, tourism…) (Baumard et al. 1998, Devier et al. 2005), catchment area agricultural activities

which bring pesticides to the bay through rivers (Manaud et al. 1997), and to a minor extent, industrial

and urban inputs (Manaud et al. 1997). It has already been shown that sediments contain relatively

low levels of polychlorinated biphenyls (PCBs), dichlorodiphenyltrichloroethane and metabolites

(DDTs) and trace metals, whereas they can be more contaminated by Polycyclic Aromatic

Hydrocarbons (PAHs) and organotin compounds (Devier et al. 2005, Baumard et al. 1998). In this

study, we have focused on the PAH pollution which is mainly pyrolytic and related to anthropogenic

activities (Baumard et al. 1998).

Arcachon Bay is characterized by exchange of marine waters coming from the Atlantic Ocean

( 150-450 106 m

3 per tide) and freshwaters coming from more than 10 rivers (annual freshwater

inputs around 109 m

3, with 80% of continental water coming from the Leyre river in South-East of the

Bay), resulting in quite high terrestrial inputs (Manaud et al. 1997). Natural and, to a minor extent,

anthropogenic organic matter is present in the Bay due to allochthonous (continental (5000 tons per

year) and oceanic (174000 tons per year) organic matter) and autochthonous (40000 tons per year)

inputs (Manaud et al. 1997). In sediments, autochthonous organic matter is predominant and comes

from a high primary production (plankton) and from the large development of seagrass (Zostera noltii)

in intertidal areas (El Ghobary 1983, Auby and Labourg 1996). On account of its ability to bind

contaminants and to modify their transport, their distribution, their availability and their toxicity (Chiou

et al. 1986, Yates et al. 1997, Haitzer et al. 1998), organic matter is an essential component to

consider for the study of contaminant fate in natural environments.

Arcachon Bay sediments can be rich in organic matter (0.1 to 5% of organic carbon,

depending on the particle size, Deltreil 1969) and interstitial waters can play an important role in the

fate of organic matter and contaminants for many reasons. Indeed, pore waters are at the water-

sediment interface and thus are an exchange area between sediments and the water column. Organic

matter and hydrophobic contaminants adsorbed to sediments can be dissolved in pore waters before

being transported to the water column by diffusion, bioturbation or physical movements due to tides or

waves. Sediments and pore waters can thus be considered as a reservoir and a source of carbon and

hydrophobic contaminants in aquatic environments.


194

In pore waters, concentrations of PAHs and Dissolved Organic Matter (DOM) are usually

higher than in the water column and thus the interactions between themselves could be significant.

Indeed, PAHs were shown to interact with natural DOM (Akkanen et al. 2005, King et al. 2007) and

therefore rich DOM pore waters could be the place of such interactions and could cause modifications

of the fate, transport and distribution of PAHs in aquatic environments.

Interactions between DOM and organic contaminants are not easily studied given that the

separation of these two organic entities is quite difficult without the modification of organic contaminant

– DOM equilibrium. Many techniques are usually used for these studies (fluorescence quenching,

dialysis…) but the most applicable to natural aquatic environments seems to be Solid Phase

Microextraction (SPME). Indeed, this technique allows both trace quantification of PAHs and study of

their interactions with DOM in the same analysis (Hawthorne et al. 2005). The addition of PAHs or

DOM to the sample is not necessary as it is with the fluorescence quenching methodology. Moreover,

only a small sample (10 ml) is necessary to the quantification of PAHs that makes easier the analysis

of pore waters which generally requires a large amount of sediment to extract small water volumes.

The goals of this study were to quantify PAHs and PAH – DOM interactions by SPME-GC-MS

in pore waters extracted from sediments coming from the Arcachon Bay. At the same time, DOM was

characterized by UV-visible absorption and excitation-emission matrix (EEM) spectrofluorometry in

order to try to understand the role of DOM properties on the interactions with PAHs.

II. Materials and Methods

Arcachon Bay is situated in the South-West coast of France and covers an area of 155 km² at

high tide and around 40 km² at low tide (El Ghobary 1983), depending on the amplitude of the tide.

The intertidal area has a very heterogeneous sedimentation and it is frequent to find sand, muddy

sand and mud in the same zone. Muddy sand and mud samplings were privileged since the organic

matter and interstitial water contents vary inversely with the particle size (Deltreil 1969, King et al.

2007).


195

Figure 1. Map of Arcachon Bay (adapted from Ifremer).

Surface sediments were collected at low tide in 2008 and 2009 in several places of Arcachon

Bay (Figure 1). Sediments from two harbors were also sampled, first from the Arcachon harbor (Arc)

which is a marina, fishing harbor and boat construction place and others in the La Teste harbor (Ltt)

which is mainly used for oyster-farming activities. In the Arcachon harbor, sediments were sampled in

two places: one inside the harbor as far as possible from the entrance and near the shipbuilding, the

other was sampled in a small area outside of the main harbor dedicated to small boats. The four Ltt

samples were sampled at different places more or less near the slipway or the entrance. Samples

were put into aluminum containers for the transportation back to the laboratory and stored at 4 °C if

necessary less than 24h until the pore water extraction. Sediments were first centrifuged (thanks to a

Universal 32R centrifuge, Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Germany) at 9000 g during 11 min at 15 °C

and the extracted water was then filtered through precombusted glass fibre filters (GF/F, 0.7 µm,

Whatman, Maidstone, England). Akkanen et al. (2005) showed that a high centrifugation speed

(20 000 g) resulted in higher KDOC values for pyrene but was sediment nature dependent. Inversely, a

too slow centrifugation does not provide a good separation of particulate and dissolved phases which

can cause clogging and hinders the permeation of macromolecules through the filter. Consequently, a

compromise was made and a speed of 9000 g was used and filters were changed regularly to avoid


196

clogging. Literature does not describe the centrifugation process of pore waters in terms of tube type.

It appeared here that it could be a very important parameter to take into consideration for hydrophobic

contaminants. Indeed, adsorption of heavy PAHs can achieve 90% for polypropylene tubes (Corning,

Fisher Scientific, Illkirch, France) and 45% for polycarbonate Nalgene ones (Fisher Scientific, Illkirch,

France) depending on the sample volume and PAH concentrations. The best solution seemed to be

the use of glass tube but they appeared to be far more breakable, so the Nalgene tubes were finally

chosen in this study.

One part of the water (a triplicate of 10 ml when possible) was spiked with deuterated PAHs at

30 ng.L-1

and directly analyzed by SPME-GC-MS. Native and deuterated compounds were purchased

from Aldrich (for N, Acy, Ace, Flu, Phe, Fluo, BaA, BbF, BkF, BeP, BaP, Per, DahA), Promochem (for

IP, BP, Acy d8, Ace d10, Flu d10, BaA d12, BkF d12, IP d12, DahA d14), Cambridge Isotope

Laboratories (for Phe d10, An d10, Pyr d10, BbF d12, BeP d12, BaP d12, BP d12), MSD Isotopes (for

DBT d8, Fluo d10, Chrys d12, Per d12), Acros (for DBT), EGA-Chemie (for N d8), Fluka (for Pyr and

Chrys) and Labosi (for An) with high isotopic and chemical purities (≥ 97%). The other part of the

sample (at least 10 ml, depending on the moisture of the sediment) was kept for the characterization

of DOM: Dissolved Organic Carbon (DOC) concentration measurements, UV-visible absorption and

Excitation-Emission Matrix (EEM) spectrofluorometry. Until analyses, pore waters were stored at 4 °C

in dark without poisoning or acidification. It was observed that DOM precipitated after only a few days

so spectroscopic measurements were performed as soon as possible. Absorption measures were

made with a Jasco V-560 spectrophotometer (Jasco, France) and EEM fluorescence spectra with a

Fluorolog FL3-22 spectrofluorometer (Jobin-Yvon-SPEX, France). Fluorescence spectra were

obtained after subtraction of ultrapure water (MilliQ, Millipore) blank spectrum and instrumental

corrections (detailed in Huguet et al. 2009a) and were expressed in Raman units (normalization by the

area of Raman band of ultrapure water). Several ratios and indices of absorbance and fluorescence

intensity were used to characterize DOM: SUVA (specific UV-absorption which is the ratio of

absorbance at 254 nm over DOC concentration expressed in L.mg-1

.M-1

), E2/E3 (absorbance at 254

nm over absorbance at 365 nm) which increases inversely with aromaticity, E4/E6 (absorbance at 465

nm over absorbance at 665 nm) which increases when average molecular weight decreases and

polarity increases (Thomsen et al. 2002). Aromaticity percentages were also calculated (aromaticity %

= 0.05 × (Abs280/COD) + 6.74, Chin et al. (1994)), as well as fluorescence band intensity ratios and

indices (Table 1).


197

Bands Excitation

wavelengths (nm)

Emission

wavelengths (nm) Component type Ratios

α 370 420-480 Humic-like f450/f500

α' 250-260 380-480 Humic-like + recent

materials HIX, α‘/α

α'‘ 340 420-480 Humic-like α/α‘‘

β 310-320 380-420 Marine humic-like β/α, BIX

γ 280 330 Protein-like γ/α

Table 1. Major fluorophores of seawater. HIX is the humification index calculated as the ratio of areas between

emission wavelengths 435 nm and 480 nm over area between emission wavelengths 300 nm and 345 nm for

excitation at 250 nm (Zsolnay et al. 1999), f450/f500 is the ratio of intensity at 450 nm over intensity at 500 nm for

excitation at 370 nm (McKnight et al. 2001).

DOC concentrations were measured thanks to a TOC-V CSN (Shimadzu, Duisburg,

Germany). Correlations between KDOC values and DOM characteristic ratios were investigated thanks

to Excel (Microsoft Office) and Modde 5.0 (Umetrics).

The development of SPME-GC-MS applied to the study of PAH – DOM interactions was

previously described in de Perre et al. (2009a). Briefly, the SPME fiber was a polydimethylsiloxane

(PDMS) 100 µm 23-gauge (Supelco, Bellefonte, USA) for septumless injection system (Merlin

Microseal). The extraction and desorption times were both 30 min. The extraction temperature was

40 °C and the desorption one was 270 °C. The first sample extracted was an empty flask and was

desorbed at 270 °C during 30 min in split mode to condition the fiber. The GC was an Agilent 6890

model (Agilent Technologies, Massy, France) equipped with a mass selective detector, model 5972

operated under electronic impact (EI 70 eV). The column used was a (5% phenyl)- methylsiloxane (30

m length, 0.25 mm internal diameter, 0.25 µm film thickness; Agilent Technologies, Chromoptic,

Courtaboeuf, France). Sample analyses were performed in the pulsed splitless mode (with a pulse

pressure of 30 psi for 1 min, a purge flow to split vent of 55 mL.min-1

after 2 min and the gas saver set

at 20 mL.min-1

after 15 min) and the carrier gas was helium (5.6 purity grade, Linde Gas, Toulouse,

France) with a flow rate of 1.3 mL.min-1

. The column temperature was held initially at 60 °C for 2 min,

increased to 150 °C at 20 °C.min-1

, then to 250 °C at 15 °C.min-1

and to 310 °C at 10 °C.min-1

to be

finally held on for 3 min. GC-MS analysis was used in the Selected Ion Monitoring (SIM) acquisition

mode and only the molecular ions were sought. A dwell time of 80 ms was used for each ion and the

scan rate was 1.31 cycle.s-1

. Before each series of samples, 1 µL of a solution of native and

deuterated PAHs dissolved in isooctane (HPLC grade, Scharlau Chemie, Sentmenat, Spain) was

injected manually to check the GC-MS system. Extraction of ultrapure water was also done in parallel

with sediments extractions to have blanks representative of the glassware and laboratory

contamination. All the glassware was calcinated overnight at 450 °C before use.


198

The effect of physico-chemical parameters like salinity or pH on the SPME was important to

decorrelate from the effect on the interactions. Like previously shown (de Perre et al. 2009b), salinity

modifies the extraction of PAHs but the use of internal standards for the quantification of free and total

concentrations corrects the overestimation which could occur with an external calibration. As

explained in a previous work, it is possible to use an internal standard that does not interact with the

sample matrix to quantify free PAHs while total PAH concentrations can be quantified thanks to their

corresponding deuterated PAHs (de Perre et al. 2009a). Deuterated naphthalene was shown to be

appropriate to be this internal standard of free PAHs with Aldrich humic acid and also with the pore

waters of this study. Eventually, it is possible to calculate the DOM-bound PAH fraction and thus KDOC

(water-DOC partitioning coefficient) for each PAH, with the help of standard calibration samples in

ultrapure water.


III.1. DOM point of view

The opening of Arcachon Bay to the ocean is characterized by sandy sediments that do not

contain pore water since no fine particle can be deposited due to turbulence from oceanic waters.

Therefore, the more we go upstream and the more we move away from channels, the higher is the

fine particle proportion in sediments and thus the bigger are the pore water and organic carbon

contents. That‘s why, no water from Be sediments could be extracted and only a small volume of

water could be extracted from Gb from a large amount of sediments which were sampled in a muddy

area not representative of the site that was particularly sandy. Cp, although not on the opening to the

ocean, was also too sandy to extract water. In this way, the main constraint of this study was the

recovery of sufficient volume of water even though SPME and DOC analyses could be performed with

only a few dozens of milliliters each. Thus, except for Gb, only muddy samples were extracted and

studied. Physico-chemical parameters and DOC concentrations of pore waters are given in Table 2.


199

pH salinity [DOC] (mg.L-1

) (n=3)

Gb (march 2008) 7.4 31.9 11.4 0.1

Io (march 2008) 7.4 30.8 12.8 0.1

Te (march 2008) 7.6 29.8 10.2 0.1

Lj (march 2008) 7.5 30.9 8.0 0.1

As (july 2008) 8.0 33.5 35.2 0.4

Cy (july 2008) 7.6 28.5 19.2 0.2

Ag (july 2008) 7.3 22.3 21.2 0.2

An (july 2008) 7.0 31.0 23.2 0.2

Lj (december 2008) 7.6

24.6

10.6 0.3

Te (december 2008) 7.7 27.4 16.1 0.2

Io (december 2008) 7.6 28.3 11.0 0.1

Arc – shipbuilding (may 2009) 7.9 29.0 14.9 0.3

Arc – exterior (may 2009) 7.8 27.4 26.5 0.5

Ltt – point 1 (may 2009) 7.6 25.3 16.7 0.3

Ltt – point 2 (may 2009) 7.5 27.0 13.4 0.1

Ltt – point 3 (may 2009) 7.6 24.7 13.1 0.5

Ltt – point 4 (may 2009) 7.2 27.5 10.7 0.3

Table 2. Physico-chemical properties of pore waters.

Four different types of EEM spectra are obtained and given in Figure 2. Indeed, pore waters

from the Bay can be classified in four different categories. The first is representative of the sample Gb

only and presents a high and well-resolved band which has already been observed for algae culture

(Parlanti et al. 2000). The value of the f450/f500 ratio introduced by McKnight et al. (2001) (Table 1) is

2.1 for Gb, showing an aquatic or microbial origin whereas all the other samples have a ratio between

1.1 and 1.3 (terrestrially derived DOM). The second type of DOM is representative of As and An

samples, which come from the northeastern part of the Bay. These two samples have high and ‘

bands but their / ratio is lower than in other samples, which can mean a more humified DOM. This is

confirmed by the shift of fluorescence to longer wavelengths, characteristic of bigger macromolecules,

and the humification index (HIX) (introduced by Zsolnay et al. 1999) which describes the maturation

degree of DOM in soils. Indeed, HIX values for these two samples are the highest of the lagoon

samples even though their values remain low: 5.7 for As and 7.6 for An while between 1.3 and 4.5 for

other samples (Table 3). According to Huguet et al. (2009a), HIX values less than 4 are representative

of marine waters and HIX values rise with the humification level of DOM (> 16 for strong humic

character), meaning that As and An DOM may partly come from rivers with more terrestrial

contribution.


200

As (July 2008)

Io (March 2008)

250280310

340370

400260310360410460510560610660 emission (nm)

250280310

340370

400260310360410460510560610660 emission (nm)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660emission (nm)

'

Gb (March 2008)

'

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660emission (nm)

250280310

340370

400260310360410460510560610660 emission (nm)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660 emission (nm)

250280310

340370

400260310360410460510560610660 emission (nm)

Io (December 2008)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660emission (nm)

250

320

390 260310360410460510560610660 emission (nm)

0-0.2 0.2-0.4 0.4-0.6 0.6-0.8 0.8-1 1-1.2 1.2-1.4 1.4-1.6 1.6-1.8 1.8-22-2.2 2.2-2.4 2.4-2.6 2.6-2.8 2.8-3 3-3.2 3.2-3.4 3.4-3.6 3.6-3.8 3.8-44-4.2 4.2-4.4 4.4-4.6 4.6-4.8 4.8-5 5-5.2 5.2-5.4 5.4-5.6 5.6-5.8 5.8-6

DOM type 1

DOM type 2

DOM type 3

DOM type 4


201

Figure 2. EEM and contour plot fluorescence spectra of Arcachon Bay pore waters.

I/[COD] / f450/f500 HIX ’/ /’’ SUVA Log

KDOC

Gb 1.7 2.4 2.1 1.3 1.1 2.0 2.6 4.3

Io (march) 1.6 4.8 1.3 1.5 2.1 1.0 2.8 4.3

Te (march) 1.1 6.8 1.2 1.3 2.4 0.9 1.9 4.3

Lj 1.3

4.7 1.2 1.9 2.4

0.9

3.1

4.0

As 1.6 1.5 1.1 5.7 2.6 0.8 2.2 4.0

Cy 1.1 3.1 1.1 2.8 2.5 0.9 3.1 4.2

Ag 1.1 3.1 1.2 2.6 2.3 0.8 4.5 4.3

An 1.7 0.9 1.2 7.6 2.7 0.8 10.7 3.9

Te (december) 0.7 3.2 1.3 2.1 2.0 1.0 1.1 4.2

Io (December) 0.7 3.1 1.2 2.3 2.3 0.9 1.5 4.1

Arc - ship

Arc-ext

1.4 1.5 1.1 5.5 2.5 0.9 1.3 4.2

Arc - ext 4.1 0.4 1.1 14.4 2.5 0.8 6.9 3.8

Ltt - 1 3.2 0.6 1.1 11.8 2.5 0.8 9.1 4.0

Ltt - 2 1.5 2.0 1.1 4.2 2.6 0.8 5.0 4.2

Ltt - 3 2.6 0.9 1.1 8.2 2.5 0.9 7.1 4.1

Ltt - 4 0.6 1.5 1.1 5.5 2.5 0.9 6.0 4.3

Table 3. EEM intensity ratios, SUVA and log KDOC values for fluoranthene (KDOC expressed in mL.g-1

).

The two previous samples, as well as Cy and Ag samples, have a high content in DOC

(around 20-35 mg.L-1

) and high fluorescence intensities. However, Cy and Ag are more similar to the

third type of DOM, including also Io (March), Te (March and December) and Lj (March). This type of

DOM is characterized by a ‘/ ratio of 2-2.5 and a / ratio between 3 and 7 meaning a high

biological and algal contribution with a lower content of humic substances. This indicates that this

DOM is recent and may come from an algal bloom (especially for sediments sampled in early spring).

The fourth type of DOM (Lj and Io of December) has actually the same characteristics as the third one

but with lower fluorescence intensities. However, DOC concentrations are not so low (10-15 mg.L-1

)

for these samples so it seemed that organic carbon is more composed of non-fluorescent

macromolecules than the third type.

As regards harbor interstitial waters, DOM samples are mainly of terrestrial origin. Their EEM

spectra are of two sorts (Figure 3). The first type of spectra is obtained for the sample at the exterior of

Arcachon harbor and the point 1 of La Teste harbor. These spectra have intensity twofold higher than

the most intense of Arcachon Bay pore waters, a high HIX (14 and 12 respectively) meaning a strong

terrestrial origin of DOM, confirmed by a very low band and a / ratio around 0.5. The other spectra

have lower but still high HIX (between 4 and 8), a higher band with a / ratio between 0.9 and 2 and

intensities are far lower. Even though these DOM seems to be from terrestrial origin, characteristics of

an autochthonous origin are also represented. Actually, for Ltt samples, it appears that the farthest

from the sea the DOM was sampled, the biggest the and ‘ intensities are, so the biggest the

terrestrial contribution is. It seems that, even though the harbor is recovered by water at high tide and


202

completely dry at low tide, the oceanic contribution of DOM is very low in relation to the terrestrial

inputs into the harbor.

Figure 3. EEM and contour plot fluorescence spectra of harbor pore waters.

III.2. Total PAH concentration point of view

In parallel, all pore waters were extracted and analyzed by SPME-GC-MS to quantify free and

total PAH concentrations; the measures were performed on one replicate to triplicates depending on

the volume available per sample. All samples contained between 20 and 50 ng.L-1

in total PAH

concentrations with maximum individual concentrations of 20 ng.L-1

, except for the sample from

Arcachon harbor near the shipbuilding which contained a total PAH concentration of about 120 ng.L-1

with a maximal individual concentration of 50 ng.L-1

. The most present PAHs are usually naphthalene,

fluoranthene, pyrene and phenanthrene, as shown in Figure 4 for Cy sample, which is representative

of the PAH distribution of total concentrations in most of the samples studied. The results obtained for

the majority of the samples confirm those obtained by King et al. (2007) and Srogi (2007) who found

that major PAHs present in pore water are four-ring ones and naphthalene whereas five- and six-ring

250280

310340

370

400

260310360410460510560610660 emission (nm)

11.6-12 11.2-11.6 10.8-11.2

10.4-10.8 10-10.4 9.6-10

9.2-9.6 8.8-9.2 8.4-8.8

8-8.4 7.6-8 7.2-7.6

6.8-7.2 6.4-6.8 6-6.4

5.6-6 5.2-5.6 4.8-5.2

4.4-4.8 4-4.4 3.6-4

3.2-3.6 2.8-3.2 2.4-2.8

2-2.4 1.6-2 1.2-1.6

0.8-1.2 0.4-0.8 0-0.4

Shipbuilding (May 2009)

Exterior harbor (May 2009)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660emission (nm)

250280

310340

370

400

260310360410460510560610660 emission (nm)

0-0.2 0.2-0.4 0.4-0.6 0.6-0.80.8-1 1-1.2 1.2-1.4 1.4-1.61.6-1.8 1.8-2 2-2.2 2.2-2.42.4-2.6 2.6-2.8 2.8-3 3-3.23.2-3.4 3.4-3.6 3.6-3.8 3.8-44-4.2 4.2-4.4 4.4-4.6 4.6-4.8

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660emission (nm)


203

PAHs are rarely observed. In this study, five-ring PAHs were detected (at detection limits) only in

upstream samples in summer (As, Cy, An, Ag) and in the Arc shipbuilding sample. This may be

because a part of heavier native PAHs were expected to be lost due to inevitable adsorption on

centrifugation tubes, as well as their low solubility in water. Moreover, the limits of detection of heavy

PAHs in pore waters by SPME-GC-MS were rather high (around 10-20 ng.L-1

); this was because of

the high content of organic carbon which can interact strongly with heavy PAHs and make them

undetectable by SPME, since it extracts free analytes only (Poerschmann et al. 1997). However, no

other analytical technique allows the quantification of such PAH concentrations in a 10 ml sample and

it makes SPME-GC-MS a useful tool to quantify PAH interactions with DOM in natural aquatic

environments.

Figure 4. PAH concentrations in Cy sample (representative of the majority of other samples) and in Arc sample

near Shipbuilding.

Shipbuilding (n=3) - May 2009

0

10

20

30

40

50

60

NAcy

Ace Flu

Phe A

nDBT

Fluo

Pyr

BaA

Chr

ys

BbF

+ B

kFBeP

BaP P

er IP BP

Dah

A

co

nc

en

tra

tio

ns

(n

g/L

) total concentrations

free concentrations

Cassy (n=3) - July 2008

0

2

4

6

8

10

12

NAcy

Ace Flu

Phe A

nDBT

Fluo

Pyr

BaA

Chr

ys

BbF

+ B

kFBeP

BaP P

er IP BP

Dah

A

co

ncen

trati

on

(n

g/L

) total concentrations

free concentrations

(ng

.L-1

) (n

g.L

-1)


204

The very concentrated Arc sample has a different composition of PAHs since no light PAHs

are observed but only fluoranthene, pyrene, chrysene, benzo[e]pyrene and benzo[b,k]fluoranthene

could be quantified (Figure 4). Moreover, the concentration of pyrene is fivefold higher than the

fluoranthene one while in all other samples these two compounds are approximately in the same

amounts. This sediment may have been contaminated by petrogenic PAHs since this origin of

contamination provides high ratios of pyrene / fluoranthene and chrysene / benzo[a]anthracene (Soclo

et al. 2000). But the absence of low molecular weight PAHs can also underline a pyrolytic source.

III.3. PAH-DOM interactions point of view.

From naphthalene to fluorene, the total and the free PAH concentrations are usually the same,

meaning that no interaction occurred with pore water DOM (Figure 4). Phenanthrene shows little or no

interaction depending on the sample and fluoranthene, pyrene and heavier PAHs, when they are

present, have interactions with DOM in most of the studied samples. It seems that a relationship

occurs between PAH hydrophobicity and KDOC values, however the lack of naturally present high

molecular weight PAHs in natural waters does not allow to conclude.

When SPME-GC-MS is performed on samples at trace concentrations (near the detection

limits), standard deviations can be high, especially with external calibration. For some samples, the

differences between total and free concentrations of PAHs were thus lower than the uncertainty of

these two measures. But as this technique was shown to be very accurate on the average measure (n

= 3), even though precision could be low, KDOC values were calculated as long as free concentrations

were lower than total concentrations. KDOC values range from 6500 ml.g-1

for Arc exterior in May to

22000 mL.g-1

for Gb in March for fluoranthene, which is, with pyrene, the only PAH present in every

sample. For both of these PAHs, their KDOC values are in the same range and the ones for pyrene vary

from 5000 ml.g-1

to 25000 mL.g-1

, with extreme values for the same samples as fluoranthene. As

expected (Perminova et al. 1999, Durjava et al. 2007), these KDOC values are lower than the ones with

Aldrich humic acid (de Perre et al. 2009a) but they are in the same range as the ones found by King et

al. (2007) in estuary pore waters for several PAHs and Akkanen et al. (2005) in lake pore waters for

pyrene.

No strong relationship comes out to correlate KDOC values and characteristic parameters of

DOM (Table 4). The strongest correlation is obtained with HIX values but it is a negative correlation,

contrary to what was shown by Hur and Kim (2009) for pyrene and sediment humic substances.

However, in their study, HIX values are positively correlated to the molecular weight of DOM, and that

whatever the sources (stream or reservoir). Here, the size of macromolecules could not be measured

but E4/E6 (negatively correlated with average size of DOM) was calculated for each sample. These two

parameters are not correlated (R = 0.3), that implies either macromolecules with a high HIX are not

the largest ones, or E4/E6 is not a good descriptor for the average size of these DOM. The first

supposition could be assumed since it has already been shown that the smallest macromolecules can


205

have higher HIX values than larger macromolecules in marine samples (Huguet et al. 2009b). But

there is not any relationship between KDOC values and E4/E6 ratios anyway (R = -0.25). Actually, HIX

values correlate more with DOM aromaticity (calculated from absorbance at 280 nm) and SUVA

(calculated from absorbance at 254 nm), with R = 0.7. Thus it seems that, for these pore waters, KDOC

of pyrene and fluoranthene increases when HIX and aromaticity of DOM decrease.

Table 4. Correlation coefficients (R) between EEM and UV-visible absorption parameters and KDOC of

fluoranthene and pyrene.

Many papers have shown that KDOC values of PAHs increase with DOM aromaticity, which is

described as well by the molar absorptivities (λ = 280 nm) (Chin et al. 1997), as by the humification

index (Hur and Kim 2009) or 13

C NMR descriptors (Perminova et al. 1999). However, in these studies,

none of the DOM samples have a marine origin, that might explain the discrepancy with our results.

Furthermore, a few studies have also shown that aromaticity is not always the driving factors for

interactions with PAHs and DOM with high aromaticity can have the lowest KDOC values (Kopinke et al.

2001, Hur and Schlautman 2003, de Perre et al. 2009b). Moreover, as our samples were

characterized only by spectroscopic analyses, it can be supposed that measures about aromaticity

have been distorted because of the presence of inorganic species. Indeed, Weishaar et al. (2003)

have shown that iron and nitrate ions can absorb light at 250 – 280 nm and influence SUVA

measurements. Because some of our samples were particularly colored, the hypothesis of the

presence of inorganic iron ions is pointed out. Consequently, samples with high absorbance at 250 –

280 nm might not be the most aromatic ones but the highest iron concentrated.

The γ/α and Iγ/[DOC] ratios are also correlated to KDOC of pyrene and fluoranthene, with R

0.6-0.7. This means that KDOC increases when the intensity of the γ band in relation to other bands is

higher, independently from the DOC concentration. This fluorescence band does not seem to be the

KDOC Fluo KDOC Pyr

’/ -0.55 -0.56

0.58 0.70

/’’ 0.51 0.50

’/[DOC] -0.57 -0.72

/[DOC] -0.24 -0.37

/[DOC] 0.62 0.65

[DOC] -0.53 -0.28

HIX -0.71 -0.85

E4/E6 -0.12 -0.25

Aromaticity (%) -0.49 -0.65

SUVA -0.49 -0.66

E2/E3 0.22 0.51


206

most reactive in the study of Hur and Kim (2009) and a negative correlation between this band and

KDOC of perylene has been observed by Holbrook et al. (2005). This might be explained by the

composition of the γ band. Indeed, γ fluorophores, although they are known to be protein-like, are

different depending on their origin. It is very likely that in the pore waters of our study, the γ band has

an algal and/or seagrass origin. While in the two other studies previously cited, the γ band could have

a microbial origin and thus different fluorophores, even though their fluorescence is in the same area.

Moreover, a previous work (de Perre et al. 2009b) has confirmed the γ fluorophore reactivity towards

PAHs. In this earlier study, the reactivity of DOM coming from Isochrysis galbana cultures has been

investigated and it has been established that the presence of recent macromolecules could increase

KDOC values, especially for heavier PAHs.

Moreover, the strong reactivity of the γ band might have been responsible for the negative

correlation between KDOC and HIX values. Indeed, a high fluorescence in the Ex = 250 nm/ Em = 300-

345 nm area, due to high γ fluorescence intensity, causes a decrease of HIX values. Consequently,

the strong relationship between KDOC and HIX can only be explained by either a negative correlation

between KDOC and the degree of maturation of DOM or a positive correlation with γ band fluorescence

intensity.

In order to understand the reactivity of fulvic and humic acids of DOM, it would be wiser here

to study the relationships between KDOC values and α, α‘ band intensities. Actually, a moderate

negative correlation is observed with these bands and also with the α‘/α ratio (R -0.6 for both PAHs).

The results about α‘/α ratio agree with our previous observations for natural waters (de Perre et al.

2009b) where we found higher KDOC values for natural DOM with the lowest α‘/α ratio. In order to

compare our results to literature, we introduced the ‘‘ fluorescence band (Table 1) and investigated

the relationship between KDOC values and the α/α‘‘ ratio. The positive correlation for this ratio

corroborates the results of Hur and Kim (2009) who have found the same relationship between KDOC

values and HLF/FLF (humic-like fluorescence over fulvic-like fluorescence) intensity ratio, which

corresponds to our α/α‘‘ ratio. However, the existence of such relationships must be used with care

since in this study, except for Gb sample, α, α‘ band intensities and α‘/α, α/α‘‘ ratios are situated in a

narrow range, contrary to γ band intensity, γ/α ratio and HIX (Table 3).

In order to confirm the existence of interactions between pore water DOM and PAHs, as well

as the effect of the presence of macromolecules originated from γ fluorescence band, fluorescence

quenching experiments were performed. The quenching of DOM fluorescence was investigated with

addition of a mixture of several PAHs. Fluorescence spectra were acquired at Ex = 250 nm / Em = 260

– 600 nm and Ex = 280 nm / Em = 290 – 600 nm for two DOM: one with a very low γ band and a high

α‘ band (Arc, exterior) and the other with a γ band higher than the α‘ one (Io, december 2009). A

fluorescence quenching has been observed for Io for the α‘ and γ bands with concentrations of PAHs

ranging from 10 to 100 ng.L-1

each. As for the Arc sample, the quenching of α‘ band was lower.

However, even though these experiments confirmed the higher interactions for DOM of marine origin,


207

fluorescence quenching of DOM by PAHs is not the most appropriate technique for Io since PAH

fluorescence is higher than the DOM one. But, when regarding the quenching of PAHs by DOM

addition, it is not possible to determine which band is responsible for the reactivity with PAHs, and the

quenching observed is due to overall DOM and thus is higher. Indeed, for Io, a quenching of about 5-

10% of ‘and bands has been observed with addition of 100 ng.L-1

of each PAH, while a quenching

from 15 to 30% (depending on the fluorescence band of PAHs) of PAH fluorescence has been

observed with the same amount of DOM and contaminants.

IV. Conclusion

SPME-GC-MS has been proved to be a very appropriate tool that allows the quantification of

PAHs at trace concentrations as well as the determination of KDOC values for PAHs. Contrary to other

techniques for the study of PAH-DOM interactions, it is not necessary to add PAHs to the sample

which is a great advantage for environmental applications and field studies.

In the studied pore waters, interactions of DOM with PAHs have been shown to be DOM origin

dependent and are stronger for samples with high contribution of fresh material related to biological

activity (high fluorescence band) and negatively correlated with HIX and the ‘/ ratio of DOM.

Moreover, these results have been confirmed by fluorescence quenching which demonstrates the

accuracy of SPME-GC-MS.

This study has also pointed out that concentrations of average and high molecular weight

PAHs in the dissolved phase can be highly underestimated if their DOM associated fraction is not

taken into account.

Acknowledgements


acknowledged for financial support, the French Ministry of Research for the PhD grant of C. de Perre

and J. Noui for his technical help.

Literature

Akkanen, J., Lyytikäinen, M., Tuikka, A. & Kukkonen, J.V.K. (2005) Dissolved organic matter in



Auby, I. & Labourg, P.-J. (1996) Seasonal Dynamics of Zostera Nolti Hornem. in the Bay of Arcachon

(France). Journal of Sea Research 35(4), 269-277.

Baumard, P., Budzinski, H. & Garrigues, P. (1998) PAHs in Arcachon Bay, France: Origin and

biomonitoring with caged organisms. Marine Pollution Bulletin 36(8), 577-586.


208

Chin, Y.-P., Aiken, G. & O'Loughlin, E. (1994) Molecular Weight, Polydispersity, and Spectroscopic

Properties of Aquatic Humic Substances. Environmental Science and Technology 28(11),

1853-1858.




Chiou, C.T., Malcolm, R.L., Brinton, T.I. & Kile, D.E., (1986) Water solubility enhancement of some

organic pollutants and pesticides by dissolved humic and fulvic acids. Environmental Science

and Technology 20, 502-508.

De Perre, C., Le Ménach, K., Budzinski, H. & Parlanti, E. (2009a) Development of Solid-Phase

Micro Extraction (SPME) and its Application to the Study of Dissolved Organic Matter (DOM) -

Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH) Interactions in Aquatic Environment. In preparation

De Perre, C., Dorthe, A-M., Noui, J., Le Ménach, K., Budzinski, H. & Parlanti, E. (2009b) Factorial

designs to better understand interactions between Dissolved Organic Matter (DOM) and

Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs). In preparation

Deltreil, J.-P. (1969) Observations sur les sols ostreicoles du Bassin d'Arcachon (Observations on

oyster farm beds in Arcachon Bay). Revue des Travaux de l'Institut des Pêches Maritimes

33(3), 343-349.

Devier, M.-H., Augagneur, S., Budzinski, H., Menach, K.L., Mora, P., Narbonne, J.-F. &

Garrigues, P. (2005) One-year monitoring survey of organic compounds (PAHs, PCBs, TBT),

heavy metals and biomarkers in blue mussels from the Arcachon Bay, France. Journal of

Environmental Monitoring 7(3), 224-240.

Durjava, M., ter Laak, T.L., Hermens, J.L.M. & Struijs, J. (2007) Distribution of PAHs and PCBs to



El Ghobary, H. (1983) Diagénèse précoce en milieu littoral et mobilité des éléments métalliques.

Université Bordeaux 1, France.



Chemosphere 37(7), 1335-1362.



Milliliter Sediment Pore Water Samples and Determination of KDOC Values. Environmental


Holbrook, R.D., Breidenich, J. & DeRose, P.C. (2005) Impact of Reclaimed Water on Select Organic

Matter Properties of a Receiving Stream Fluorescence and Perylene Sorption Behavior.


Huguet, A., Vacher, L., Relexans, S., Saubusse, S., Froidefond, J.M. & Parlanti, E. (2009a)




209

Huguet, A., Vacher, L., Saubusse, S., Ibalot, F. & Parlanti, E. (2009b) New insights into the size

distribution of fluorescent dissolved organic matter in estuarine waters. Submitted to Organic

Geochemistry.

Hur, J. & Kim, G. (2009) Comparison of the heterogeneity within bulk sediment humic substances

from a stream and reservoir via selected operational descriptors. Chemosphere 75(4), 483-

490.

King, A.J., Readman, J.W. & Zhou, J.L. (2007) Behaviour of polycyclic aromatic hydrocarbons in

dissolved, colloidal, and particulate phases in sedimentary cores. International Journal of

Environmental Analytical Chemistry 87(3), 211-225.

Manaud, F., Bouchet, J-M., Deltreil, J-P, Maurer, D. & Trut, G. (1997) Etude intégrée du Bassin

d‘Arcachon – Tome 2. Ifremer. Direction de l‘environnement et de l‘aménagement littoral.



organic material and aromaticity. Limnology and Oceanography 46(1), 38-48.









597-600.

Soclo, H.H., Garrigues, P. & Ewald, M. (2000) Origin of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) in

Coastal Marine Sediments: Case Studies in Cotonou (Benin) and Aquitaine (France) Areas.

Marine Pollution Bulletin 40(5), 387-396.

Srogi, K. (2007) Monitoring of environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons: a review.

Environmental Chemistry Letters 5(4), 169-195.




Weishaar, J.L., Aiken, G.R., Bergamaschi, B.A., Fram, M.S., Fujii, R. & Mopper, K. (2003)

Evaluation of Specific Ultraviolet Absorbance as an Indicator of the Chemical Composition and

Reactivity of Dissolved Organic Carbon. Environmental Science and Technology 37(20),

4702-4708.







211

Interactions between benzodiazepines and dissolved organic

matter

Chloé de Perre, Julien Noui, Karyn Le Ménach, Hélène Budzinski, Edith Parlanti

Abstract

Although ―emerging‖ contaminants are more and more monitored in aquatic environments,

their fate in natural systems are still little studied, especially regarding Dissolved Organic Matter

(DOM) effect on their distribution. Interactions between pharmaceuticals and DOM were investigated

thanks to Solid Phase Microextraction coupled with Gas Chromatography and Mass Spectrometry

(SPME-GC-MS) and three-dimensional Excitation-Emission Matrix (EEM) spectroscopy.

Pharmaceuticals studied were carbamazepine and diazepam which belong to the benzodiazepine

class. Several DOM samples were used: Aldrich humic acid, marine, river and pore waters. Results

show weak interactions between these pharmaceuticals and DOM which are significant when

analyzed by fluorescence quenching but not by SPME. Interactions have been shown to be dependent

on pharmaceuticals and DOM origin but also on observed fluorescence peaks. Interactions seem to

be correlated with hydrophobicity (especially for diazepam) and size of macromolecules (especially for

carbamazepine) but not with DOM aromaticity.

Publication n°6


212

Interactions entre les benzodiazépines et la matière organique

dissoute

Résumé

Bien que les contaminants « émergents » soient de plus en plus surveillés dans

l‘environnement aquatique, leur devenir dans les systèmes naturels demeure peu étudié, surtout en

ce qui concerne l‘effet que la Matière Organique Dissoute (MOD) peut avoir sur leur distribution. Les

interactions entre les substances pharmaceutiques et la MOD ont été examinées par Micro-Extraction

sur Phase Solide couplée à la Chromatographie en phase Gazeuse et à la Spectrométrie de Masse

(SPME-GC-MS) et par spectrofluorimétrie tridimensionnelle. Les médicaments étudiés ici sont la

carbamazépine et le diazépam qui appartiennent à la classe des benzodiazépines. Plusieurs

échantillons de MOD ont été utilisés : de l‘acide humique Aldrich et des eaux naturelles marine, de

rivière et interstitielle. Les résultats ont montré des interactions faibles entre ces composés

pharmaceutiques et la MOD, qui sont significatives lorsqu‘elles sont mesurées par extinction de

fluorescence mais pas par SPME. Il a été montré que les interactions sont dépendantes des

médicaments, de l‘origine et de la structure de la MOD, mais aussi du fluorophore observé. Il

semblerait que les interactions soient corrélées au caractère hydrophobe (surtout pour le diazépam) et

à la taille des macromolécules (surtout pour la carbamazepine) mais pas avec l‘aromaticité de la

MOD.


213

I. Introduction

Organic contaminants are well known to be present in aquatic environments but more

recently, thanks to improvements in analytical techniques, ―new‖ organic contaminants were measured

at non negligible concentrations in different aquatic systems. Among these ―emerging‖ contaminants,

there are pharmaceuticals. These organic compounds come from veterinary and human uses and are

frequently found in aquatic environments (Halling-Sørensen et al. 1998). Once ingested, they are

totally or partially metabolized and excreted in their original and/or conjugated form via urine or feces

(Brun et al. 2006, Khetan and Collins 2007). These compounds are usually carried by domestic waste

streams to municipal sewage treatment plants or sometimes to the receiving water without treatment

(Moeder et al. 2000, Brun et al. 2006). Even if they go through wastewater treatment plants, some of

these molecules are not removed and are expelled unchanged into aquatic environments (Nghiem et

al. 2006, Moeder et al. 2000, Brun et al. 2006). Even though studies of the behavior of

pharmaceuticals in wastewater treatment plants have been increasing these years, little is known

about their fate once in natural aquatic environments. Moreover, new pharmaceuticals are introduced

everyday on the market and their consumption is increasing constantly; it is particularly true for

antiepileptics and antidepressants, to which carbamazepine and diazepam belong respectively. Both

of these benzodiazepines are of concern for the environment since they are consumed in great

volumes (France is the biggest antidepressant user in Europe) and are prescribed over long periods

(Khetan and Collins 2007). Moreover, these pharmaceuticals can be present for a long time in the

environment since they resist degradation or because their degradation rate is compensated by their

continuous introduction into the environment (Nunes et al. 2005, Nghiem et al. 2006). Besides, little is

known about the chronic toxicity of benzodiazepines and some studies have shown that they may be a

threat for aquatic organisms (Oetken et al. 2005, Quinn et al. 2008, Pascoe et al. 2003).

Consequently, we investigated these two benzodiazepines and their fate in aquatic

environments. In this paper, we studied the interactions of these compounds with the dissolved

organic matter (DOM) of several types of water. Nowadays this topic is not much studied but could be

very important for the knowledge of the fate of pharmaceuticals in natural waters. Indeed, it was

already proven that DOM can interact with organic contaminants and thus modify their behavior, their

bioavailability or their toxicity (e.g. Haitzer et al. 1998, Parikh et al. 2004, Perdue and Wolfe 1982) but

just a few papers focus on pharmaceuticals (e.g. Bai et al. 2008, Maskaoui et al. 2007). Besides, the

paper of Stein et al. (2008) showed that sorption of neutral drugs onto sediments could be due to their

interaction with the natural organic matter fraction of sediments, so similar interactions could be

supposed to occur in the dissolved phase of water.

To reach this understanding about the interactions, a few analytical techniques are available.

One of them, which seems very efficient, is Solid Phase Microextraction (SPME). This tool consists of

a polymer fiber which is plunged into a sample and extracts freely dissolved analytes. The fiber can

then be desorbed directly in the injector of a Gas Chromatograph coupled to Mass Spectrometry (GC-


214

MS) for example. The large variety of available fibers makes this technique a very selective, sensitive

and useful one, and it has proved to be a reliable system for interaction studies (Poerschmann et al.

1997, de Perre et al. 2009). Another appropriate technique is fluorescence quenching which also

allows to characterize interactions between DOM and organic contaminants. This technique is widely

applied to fluorescent Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) while very few studies involve the

fluorescence quenching of DOM by non-fluorescent organic contaminants.

The goals of this study were first to develop SPME-GC-MS for the analysis of carbamazepine

and diazepam and then to apply it to the interactions of these compounds with artificial and natural

DOM. Moreover, fluorescence quenching of DOM by these two compounds was also investigated. By

connecting the interaction behavior with the DOM fluorescence spectra, we also wished to progress in

the knowledge of the relationship between DOM properties and the association with pharmaceuticals.

II. Materials and methods

In order to study DOM with fluorescence characteristics as different as possible, four different

samples of DOM were investigated: Aldrich humic acid, pore water from marine sediments, river water

and marine water. Aldrich humic acid was dissolved in ultrapure water (MilliQ, Millipore, Molsheim,

France) and filtered through 0.7 µm GF/F filters (Whatman, Maidstone, England). The pore water was

extracted by centrifugation (9000 g for 11 min at 15 °C, Universal 32R centrifuge, Hettich Zentrifugen,

Tuttlingen, Germany) from sediment sampled in the Arcachon Bay (South West coast of France)

(Figure 1), and filtered through 0.7 µm GF/F filters too.

Atlantic

Ocean

Mediterranean

Sea

Arcachon Bay

Toulon

La Réole

Atlantic

Ocean

Mediterranean

Sea

Arcachon Bay

Toulon

La Réole

Figure 1. Sampling map.

The marine water was sampled in Toulon (South East coast of France) in the Mediterranean

Sea, filtered through 0.45 µm Polycap (Whatman, Florham Park, USA) and concentrated by

combined nanofiltration/reverse osmosis in order to concentrate DOM without concentrating salts

(Huguet, 2007). The freshwater was sampled in the River Garonne at La Réole (South West of


215

France) and was used after filtration through 0.45 µm Polycap (Whatman, Florham Park, USA) at

natural DOM concentration and after reverse osmosis concentration. This latest concentrated sample

was described in greater details by Huguet et al. (2009). For SPME analyses, DOM samples were

used at concentrations of about 11 mg.L-1

of Dissolved Organic Carbon (DOC) and for quenching

fluorescence studies, concentrations were of about 1-2 mg.L-1

(Table 1). Dilutions were performed

thanks to ultrapure water and physico-chemical parameters were measured for each sample with the

help of a multi-parameter instrument (340i, WTW, Weilheim, Germany) (Table 1). Salinity and pH

values were not expected to affect interactions since, for all quenching experiments, salted samples

were highly diluted so the highest salinity was 2.7 and all pH values were in the same range (Table 1).

In the same manner, for SPME analyses, blanks (pharmaceuticals in ultrapure water) were made at

the same pH and salinity as samples with DOM. Consequently, samples were considered here to be

different essentially because of their DOM chemical and physical properties.

DOM Techniques pH Salinity Conductivity

(mS.cm-1

) [DOC]

(mg.L-1

)

Aldrich humic acid

Fluorescence quenching

6.5 0.0 0.1 0.7

SPME-GC-MS 7.5 0.0 0.02 13.8

River water


7.8 0.0 0.3 2.3

SPME-GC-MS 7.7 0.1 0.8 11.0

Sea water


6.4 0.8 1.9 0.9

SPME-GC-MS 7.6 9.4 16.0 11.4

Pore water


7.5 2.7 5.1 1.7

SPME-GC-MS 7.4 12.0 20.0 3.2

Table 1. Physico-chemical parameters of DOM samples. A few months can have elapsed between fluorescence

quenching and SPME-GC-MS analyses, explaining some discrepancies between salinity and DOC concentration

dilution factors, especially for the pore water (likely due to precipitation of organic matter).

Carbamazepine and diazepam (purities > 99%) were purchased from Sigma (Sigma-Aldrich

Chimie, Lyon, France), carbamazepine d10 (purity of 98.2%) from Cluzeau Info Labo (Sainte Foy La

Grande, France) and diazepam d5 (purity of 98%) from Cambridge Isotope Laboratories (LGC

Standards, Molsheim, France). Native compounds were dissolved in methanol (LiChrosolv gradient

grade for Liquid Chromatography, Merck, Darmstadt, Germany) at a concentration of about 100 µg.g-1

in individual solutions and then mixed when the two compounds were studied simultaneously. These

methanol solutions were added (with or without dilution) to ultrapure water to achieve the needed


216

concentrations in aqueous samples. Deuterated compounds were used as internal standards to

quantify spiked waters.

Aqueous solutions were prepared the day before analyses to let benzodiazepines and DOM

reach equilibrium, since Bai et al. (2008) showed that 12h were sufficient for carbamazepine and

humic substances (isolated from a landfill leachate) whereas Stein et al. (2008) had to wait 24h with

organic matter from sediments.

Concentrations of benzodiazepines were verified in ultrapure water and in the presence of

DOM to validate the process of spiking waters. This verification was performed by Solid Phase

Extraction (SPE) with the following protocol. MCX 3 mL (Oasis Waters, Milford, USA) cartridges were

conditioned and cleaned with 3 mL of ethyl acetate (Multisolvent HPLC grade, Scharlau Chemie,

Sentmenat, Spain) and 3 mL of ultrapure water at pH 2 before samples (10 mL) were eluted (after

addition of internal standards). Cartridges were then dried under vacuum for 30 min to eliminate water.

After that, compounds were eluted with 3 mL of ethyl acetate, 3 mL of ethyl acetate/acetone (50/50)

(Multisolvent HPLC grade, Scharlau Chemie, Barcelona, Spain) and finally 3 mL of

dichloromethane/methanol/ammonium hydroxide (49/49/2) (dichloromethane for residue and pesticide

analysis; NH4OH reagent ACS, Acros Organics, Geel, Belgium). This elution solvent was then

completely evaporated under a gentle nitrogen stream (4.5 quality, Linde Gas, St Priest, France) and

compounds were recovered thanks to methanol. At this point, a third deuterated compound was added

in order to quantify the loss of internal standards during extraction and evaporation: imipramine d4

(99% purity, LGC Standards, Molsheim, France). Samples were stored at -18 °C and were then

diluted in water (methanol/water – 1/9) just before their injection in a Rapid Resolution Liquid

Chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry (RRLC-MS/MS). RRLC analyses were

performed thanks to an Agilent 6410 model (Agilent Technologies, Massy, France) operated under

electrospray ionization (ESI) and triple quadripole. Separation was performed thanks to a Zorbax SB

C18 (50 2.1 mm, 1.8 µm) column (Agilent Technologies, Chromoptic, Courtaboeuf, France) with a

mobile phase flow rate of 0.5 mL.min-1

: Eluent A–ultrapure water, formic acid 0.1%; eluent B–

methanol, formic acid 0.1%; gradient: 0–12 min: 0% B, 12-13 min: 65% B, 13-15 min: 100% B, 15-20

min: 0% B. Compounds were ionized in the positive ion polarity mode and analyzed in the Multiple

Reaction Monitoring (MRM) mode at appropriate m/z transitions (237194 for carbamazepine,

285154 for diazepam, 290154 for diazepam d5 and 28585.7 for imipramine d4).

SPME-GC-MS was used to quantify both total and freely dissolved contaminant

concentrations in the samples in order to describe their interactions with DOM. SPME analyses of 10

mL spiked ultrapure water samples were performed with commercially available PDMS

(polydimethylsiloxane) 100µm, PDMS-DVB (divinylbenzene) 65 µm, PA (polyacrylate) 85 µm,

Carbowax™-DVB 65 µm and PEG (polyethyleneglycol) 60 µm coated fibers from Supelco (Bellefonte,

USA). After immersion of the fiber in the sample, it was immediately desorbed into the GC-MS

injection port. GC-MS areas were compared to determine the best fiber, the optimal extraction time

and injection temperature and effects of pH and salinity. The GC was an Agilent 6890 model (Agilent


217

Technologies, Massy, France) equipped with a 5972 mass selective detector operated under

electronic impact (EI 70 eV). The column used was a (5% phenyl)-methylsiloxane (30 m length, 0.25

mm internal diameter, 0.25 µm film thickness; Agilent Technologies, Chromoptic, Courtaboeuf,

France). SPME analyses were performed in the pulsed splitless mode, the pulse pressure was 30 psi

for 1 min, after 2 min the purge flow to split vent was 55 mL.min-1

and the gas saver was set at 20

mL.min-1

after 15 min. The carrier gas was helium (purity 5.6, Linde Gas, Toulouse, France) with a

flow rate of 1.3 mL.min-1

and linear velocity of 42 cm.s-1

. The column temperature was held initially at

60 °C for 2 min, increased to 280 °C at 20 °C.min-1

and then held on for 6 min, to have an analysis

total time of 19 min. During GC/MS analysis and decreasing of the GC oven temperature (30 min), the

SPME fiber was maintained in the injector port to be conditioned before each extraction. For the

quantification of pharmaceuticals, GC/MS was used in the Selected Ion Monitoring (SIM) acquisition

mode (observed ions were m/z 193 for carbamazepine, m/z 203 for carbamazepine d10, m/z 256 for

diazepam and m/z 261 for diazepam d5). A dwell time of 90 ms was used for each ion and the scan

rate was 1.18 cycle.s-1

.

Interactions between DOM and pharmaceuticals were quantified thanks to the water-DOM

partition coefficient (KDOC) and the assumed following equilibrium:

DOMicalspharmaceutDOMicalspharmaceut (1)

from which the equation of KDOC results:

]][[

][

DOCicalspharmaceut

DOMicalpharmaceutKDOC

(2)

(with [pharmaceutical-DOM] the concentration of complexes formed by pharmaceutical-DOM interactions, [pharmaceuticals] is

the free concentration of pharmaceuticals in the dissolved phase and [DOC] the concentration of Dissolved Organic Carbon

(DOC) which was used to quantify DOM concentrations.)

DOC concentrations were measured thanks to a TOC-V CSN (Shimadzu, Duisburg,

Germany). When measurements of interactions are made by SPME-GC-MS, as this technique

extracts only free analytes, the KDOC equation can be written:

][DOCa

aaK

withDOM

withDOMwithoutDOMDOC

(3)

(with awithoutDOM, the area of pharmaceuticals in the sample without DOM which is proportional to free concentration of

pharmaceuticals in absence of DOM, i.e. the total concentration, and awithDOM which is proportional to free concentration in

presence of DOM.)

This equation underlines the fact that if no interaction occurs in a sample, awithoutDOM and

awithDOM should have the same value. However, this is true only if samples with and without DOM are

strictly identical except for the DOM content (same pH, same salinity…).

The pharmaceutical-DOM interactions were also studied by Excitation Emission Matrix (EEM)

spectroscopy. This technique is based on the fact that stable non-fluorescent complexes can be

formed between DOM fluorophores and organic compounds with the equilibrium previously described


218

(1). As for fluorescent contaminants like Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, their fluorescence

efficiency is higher than the one of DOM so fluorescence quenching of the contaminant is easier to

observe than the one of DOM. However, pharmaceuticals are less fluorescent than DOM, therefore

the DOM fluorescence quenching was observed here. But even though pharmaceuticals have low

fluorescence efficiency, their intensity, especially for diazepam, can achieve 30% of the DOM

fluorescence and thus cannot be ignored or subtracted from DOM fluorescence. Consequently, the

equation 4 in a form similar to the Stern-Volmer equation used for PAHs (Gauthier et al. 1986) cannot

be used here for pharmaceuticals.

10 ][ icalspharmaceutKF

FDOC (4)

(with F0 the fluorescence of DOM without any pharmaceuticals and F the fluorescence of DOM in the presence of

pharmaceuticals but subtracted from drug fluorescence).

Moreover, this equation would suppose that the fluorescence of pharmaceuticals is not

quenched by the presence of DOM, which may be wrong. Therefore, in this case different

assumptions have to be made, that is why we considered that the KDOC equation can be written:

freefree

drugDOM

freefreeDOC

icalspharmaceutDOM

FFF

icalspharmaceutDOM

DOMicalspharmaceutK

][][][][

][

(5)

(with FDOM the fluorescence of DOM alone, Fdrug the fluorescence of pharmaceuticals alone and F the fluorescence of DOM and

pharmaceuticals together, in the same DOM and pharmaceutical concentrations).

The problem of this equation is the determination of [DOM]free and [pharmaceuticals]free since

their fluorescence cannot be differentiated in the mixture. Therefore, the only way is to assume that

their fluorescence is quenched in the same proportions, even though it could be not exactly true.

However, it would be wrong to consider that no quenching or total quenching occur on one entity and

not on the other. Therefore the equation 6 can be written.

drug

drug(DOM)

DOM

DOM(drug)

drugDOM F

F

F

F

FF

F

(6)

(with FDOM(drug) the DOM fluorescence in presence of pharmaceuticals and Fdrug(DOM) the pharmaceutical fluorescence in presence

of DOM).

As FDOM(drug) is proportional to the concentration of free DOM and Fdrug is proportional to the

total concentration of pharmaceuticals in the sample, equations 5 and 6 can be written (after

rearrangements):

totalDOM2

2drugDOM

3drugDOM

DOCticals][pharmaceu

1

FF

)F(FF)F(FK

(7)

(with [pharmaceuticals]total the total concentration of pharmaceuticals measured by SPME-GC-MS).

The spectrofluorometer used was a Fluorolog FL3-22 model (Jobin-Yvon, France) equipped

with a xenon lamp (450 W). All emission fluorescence spectra were acquired with a 1 cm quartz cell

(Hellma, France) thermostated at 20 °C, with an integration time of 0.5 s, an increment of 1 nm,


219

excitation and emission band paths of 4 nm and in the S/R mode (the sample signal (S) is

automatically normalized by the lamp reference signal (R)). Spectra were multiplied by emission

correction factors. EEM spectra were acquired at excitation wavelengths from 250 to 410 nm with an

increment of 10 nm and emission wavelengths ranged from 260 to 700 nm. For each DOM sample

and both pharmaceuticals, a series of EEM fluorescence spectra were acquired: ultrapure water only,

ultrapure water spiked with one pharmaceutical (dissolved in methanol), DOM spiked with the same

pharmaceutical (at the same concentration and amount of methanol) and finally the DOM sample

spiked with the same amount of methanol but without pharmaceuticals. The spectra were corrected for

the background fluorescence of ultrapure water and fluorescence intensity was expressed in Raman

units as already described by Huguet et al. (2009). When interactions were shown to occur, two-

dimensional fluorescence quenching spectra were performed at appropriate wavelengths with

concentrations of pharmaceuticals varying from 2 to 500 µg.L-1

. Linear correlations between

fluorescence quenching and pharmaceutical concentrations were investigated thanks to OriginPro 7.5

(OriginLab corporation, USA).

In order to be in the linearity domain of the spectrofluorometer, quenching analyses were

acquired for samples at 1-2 mg.L-1

of DOC and absorbances were checked to be less than 0.1 at 250

nm (maximal absorbance observed for studied samples: 0.09) thanks to a Jasco V-560

spectrophotometer (Jasco, France) equipped with deuterium and tungsten iodine lamps.

The fluorescence quenching technique is not expected to give the same results as SPME

since only interactions with fluorescent DOM can be seen contrary to SPME experiments. Moreover,

interactions are more visible by SPME with a high amount of DOM added to a minimal concentration

of pharmaceuticals (to maximize the decrease of GC-MS areas), while, by fluorescence quenching,

interactions are better observed when a high amount of pharmaceuticals is added to a low

concentration of DOM (to maximize the decrease of DOM fluorescence). That‘s why concentrated

DOM was used with SPME and high concentrations of pharmaceuticals were used with the

fluorescence quenching technique.


III.1. SPME-GC-MS development

The first step of the SPME-GC-MS development was the determination of the most

appropriate fiber, i.e. the most sensitive and the most reproducible one. The recommended fibers and

the most used ones in the literature for the extraction of benzodiazepines in aqueous matrices (Luo et

al. 1998) were tested: PDMS 100 µm, PDMS-DVB 65 µm, PA 85 µm and Carbowax™-DVB 65 µm.

SPME-GC-MS areas were obtained from solutions of 10-15 µg.L-1

and then normalized to a

concentration of 1 µg.L-1

for comparison. Figure 2 demonstrates that whatever the fiber type,

sensitivity is far better for diazepam than for carbamazepine.


220

Figure 2. Comparison of fibers : (a) PDMS 100 µm, (b) PDMS-DVB 65 µm, (c) PA 85 µm, (d) Carbowax™-

DVB 65 µm, (e) Carbowax™-DVB 70 µm StableFlex™ for a concentration of 1 µg.L-1

of pharmaceuticals, n=3.

This may be partly due to the thermal degradation of carbamazepine into iminostilbene at the

moment of the injection since this compound has been observed on chromatograms at m/z 193

(iminostilbene molecular weight) and this degradation has already been documented (Frigerio et al.

1973). However, the ratio of iminostilbene over carbamazepine in terms of GC-MS areas seems to be

quite constant in the pulsed injection mode and this has been confirmed by the small standard

deviations obtained for carbamazepine areas; so except for the sensitivity loss, this degradation does

not affect analyses. As regards the fiber, we decided to use the Carbowax™-DVB 65 µm one since it

offers the best sensitivity for carbamazepine contrary to the PDMS-DVB one which is not adapted to

this compound, despite its good sensitivity for diazepam. Carbowax™-DVB fibers were also available

in Stableflex type, which makes the fiber more flexible than the original ones and thus minimizes

fiber breakage according to the supplier. This type of fiber was also tested but its sensitivity was lower

than the original one (Figure 2). Consequently, interaction experiments were done with Carbowax™-

DVB 65 µm fibers.

Once the fiber is chosen, it is necessary to evaluate the effect of extraction time to know the

time necessary to achieve equilibrium between the fiber and the sample. Figure 3 shows that this

equilibrium is not reached for diazepam and may be reached for carbamazepine at 120 min of

immersion. A lower time of extraction was chosen (30 min) in order to be at a moment before the

observed fiber-sample equilibrium. This immersion time allows to disturb minimally the

pharmaceutical-DOM equilibrium and to be sure of being at an extraction time not corresponding to a

saturation of the fiber. After that, desorption temperature was investigated. Three temperatures were

tested (200 °C, 220 °C and 250 °C) and desorption was shown to be maximal at 250 °C (results not

shown). These conditions (a Carbowax™-DVB fiber, a 30 min extraction time and a 250 °C desorption

temperature) offer limits of detection in ultrapure water for carbamazepine and diazepam of 0.27 ±

0.08 and 0.09 ± 0.03 µg.L-1

respectively and were thus used for the study of pharmaceutical-DOM

interactions.

0

200

400

600

800

1000

1200

carbamazepine

GC

are

as

a) b) c) d) e)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

diazepam

GC

are

as

a) b) c) d) e)


221

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0

5000

10000

15000

20000

0 20 40 60 80 100 120

carb

amaz

ep

ine

are

as

dia

zep

am

are

as

extraction time (min)

diazepamcarbamazepine

Figure 3. Evolution of pharmaceutical areas with the immersion time of the fiber, [carbamazepine] = 2.4 µg.L-1

-

[diazepam] = 2.6 µg.L-1

, n = 3.

To make sure this tool could also be used for the quantification of pharmaceuticals, internal

standardization was developed and its linearity range was checked. The linearity of SPME-GC-MS

was examined on the range 0-10 µg.L-1

and it followed that areas vary linearly with good correlation

coefficients for both pharmaceutical concentrations (R² = 0.9978 for carbamazepine and 0.9966 for

diazepam, n = 5). Internal calibration recoveries were of 97 and 104% for carbamazepine and

diazepam respectively.

The effects of pH and salinity on SPME were then investigated. Indeed, pH and salts can play

a role in the extraction by modifying the solubility of organic compounds. Only environmental relevant

pH and salinity values were tested (Figure 4 and Figure 5). No significant effect of both of these

parameters was underlined except for carbamazepine which is far less extracted at low pH. So it

seems that these physico-chemical parameters do not interfere with the extraction as long as pH is

higher than 6 and salinity less than 35.


222

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

carbamazepine diazepam

GC

are

as

pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9

Figure 4. Effect of pH on SPME-GC-MS areas, [pharmaceuticals] = 1 µg.L

-1, n = 3.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

carbamazepine diazepam

GC

are

as

0 5 15 25 35

Figure 5. Effect of salinity on SPME-GC-MS areas, [pharmaceuticals] = 1 µg.L

-1, n = 3.

In order to quantify pharmaceuticals in parallel to quenching experiments, SPE and SPME

were used. Actually, SPE was performed to quantify pharmaceuticals in three-dimensional EEM

fluorescence quenching experiments whereas SPME was used for two-dimensional quenching

experiments. Indeed, once SPME was developed, it was easier to use this technique for experiments

with many samples. Two-dimensional quenching experiments provided 21 samples (7 triplicates) for

each DOM type and every contaminant, thus the time saving with SPME is considerable. Before this

quantification by SPME, it was necessary to confirm the linearity and the accuracy of the tool on the

studied range (2-500 µg.L-1

). Unfortunately, Carbowax™-DVB fibers could not be used here since they

were not produced by the supplier anymore, so a PEG fiber (manufactured in order to replace

Carbowax™-DVB fibers) was used instead with the same parameters as with the previous fibers.

Even though the sensitivity with this fiber was lower for carbamazepine (limits of detection of 0.5 ± 0.2

µg.L-1

), it was not a problem as pharmaceutical concentrations were high enough. SPME-GC-MS

areas were reported in relation to pharmaceutical concentrations on the range 2-500 µg.L-1

. The


223

linearity was good for both compounds and slightly better in the range 10-500 µg.L-1

(R² = 0.9963 and

0.9996 for carbamazepine and diazepam respectively, n = 4) than in the range 2-500 µg.L-1

(R² =

0.9948 and 0.9995 for carbamazepine and diazepam respectively, n = 5). This is likely due to the

lower concentration at 2 µg.L-1

which is too close to the detection limit of carbamazepine. Internal

calibration was performed thanks to standards at 100 µg.L-1

which allowed the quantification of

samples from 10 to 500 µg.L-1

with an accuracy from 94 to 103% for carbamazepine and from 99 to

108% for diazepam, with variabilities always less than or equal to 10%. However, samples at 2 µg.L-1

were highly overestimated and their quantification was thus performed thanks to an internal calibration

at 2 µg.L-1

.

III.2. SPE quantification

SPE was performed to confirm pharmaceutical concentrations of spiked waters and to

determine whether the presence of DOM distorted the quantification of benzodiazepines. Indeed,

many studies have already shown that the presence of DOM could cause an underestimation of the

extraction of contaminants by SPE (Li and Lee 2001, Bercaru et al. 2006). DOM could either occupy

binding sites of the SPE sorbent or interact with contaminants making them unable to interact with the

sorbent (Boti et al. 2007, Ibáñez et al. 1996).

SPE was firstly developed on spiked ultrapure water at 2 and 200 µg.L-1

of each

benzodiazepine. Extraction recoveries range from 94 to 107% and accuracy ranges from 80 to 96%.

Repeatability is also very good (variability < 5%, n = 3). Once validated, SPE was performed with each

DOM and every pharmaceutical at 2 and 200 µg.L-1

. Results show that DOM does not interfere with

the extraction since recoveries vary from 75 to 90% and accuracy ranges from 70 to 80% with no

difference between samples with DOM and the ones in ultrapure water. This means that either no

strong enough interaction occurs between DOM and pharmaceuticals or DOM is too little concentrated

to cover bonding sites of the sorbent. Indeed, we worked here with low DOC concentrations (less than

3 mg.L-1

) whereas problems of quantification by SPE are observed in other studies at concentrations

generally above 10 mg.L-1

(Ibáñez et al. 1996, Boti et al. 2007, Bercaru et al. 2006). As regards

pharmaceutical concentrations in samples, they are coherent with the theoretical values meaning that

no or small amounts of contaminants (< 20%) were lost during the experiments (e.g. by adsorption on

glass, degradation or volatilization).

III.3. DOM characterization

Each sample of DOM was characterized by UV-visible absorption spectroscopy and EEM

spectrofluorometry (Table 2 and Figure 6). The four samples were chosen for their different origin and

composition. Aldrich humic acid is well known to be made up of large humified macromolecules and it

was confirmed by both UV-visible absorption and fluorescence measurements. Its HIX (humification

index) was high at nearly 29, which is characteristic of very humified terrestrial material with high


224

molecular weight (Zsolnay et al. 1999, Hur and Kim 2009). This high humification was also confirmed

by a high Iα‘/Iα ratio. Indeed this ratio is usually higher for humic acids than for fulvic acids (Sierra et

al. 2005). UV-visible absorption spectroscopy also confirmed its high aromatic content (around 60%).

DOM E2/E3 E4/E6 % SUVA

aromaticity Iα’/Iα Iγ/Iα HIX f450/f500

Aldrich humic acid

2.6 3.3 61 3.6 0.2 28.7 0.7

Sea water 1.3 1.0 43 2.8 1.4 5.7 1.1

Pore water 3.1 2.1 13 2.6 2.8 2.7 1.2

River water 5.6 15.6 25 2.4 0.3 15.3 1.2

Table 2. Absorption and fluorescence parameters of DOM. E2/E3 was the absorbance at 254 nm over the

absorbance at 365 nm, E4/E6 was the absorbance at 465 nm over the absorbance at 665 nm, % SUVA

aromaticity was the product of 6.5 × SUVA +3.6 with SUVA (L.mg-1

.M-1

) = absorbance at 254 nm / quartz cell

path length (cm) / DOC (mg.L-1

) × 100 cm.M-1

(Potter and Wimsatt 2005), HIX was the humification index

(Zsolnay et al. 1999), f450/f500 was the fluorescence intensity at 450 nm over 500 nm with an excitation

wavelength at 370 nm (McKnight et al. 2001).

This DOM type (Aldrich humic acid) is very different from the three other samples and its

absorption and fluorescence characteristics show a more terrestrial origin than the bulk natural DOM

samples of this study. The river DOM is characterized by a HIX value around 15, likely meaning an

allochthonous origin (Huguet et al. 2009) and an aromatic content around 25%. According to E2/E3

(5.6) and E4/E6 (15.6) values, this sample is mainly composed of fulvic acids (E2/E3 > 3.5 and E4/E6

between 6 and 18.5 for fulvic acids, Minero et al. 2007, You et al. 1999).


225

Figure 6. EEM fluorescence spectra of a) Aldrich humic acid, b) river water, c) pore water and d) sea water.

b)

250280

310

340

370

400

260310360410460510560610660emission (nm)

’

a)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

emission (nm)

’

260310360410460510560610660

250

290

330

370

410

0.00.40.81.21.62.02.42.83.23.64.04.44.85.25.6

émission (nm)

excita

tion (n

m)

5.2-5.6

4.8-5.2

4.4-4.8

4-4.4

3.6-4

3.2-3.6

2.8-3.2

2.4-2.8

2-2.4

1.6-2

1.2-1.6

0.8-1.2

0.4-0.8

0-0.4

c)

250280

310

340

370

400

260310360410460510560610660 emission (nm)

250

280

310

340

370

400

260310

360410

460510

560610

660

emission (nm)

260310360410460510560610660

250

290

330

370

410

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

1.1

1.2

inte

nsité

émission (nm)

excita

tion (n

m)

1.1-1.2

1-1.1

0.9-1

0.8-0.9

0.7-0.8

0.6-0.7

0.5-0.6

0.4-0.5

0.3-0.4

0.2-0.3

0.1-0.2

0-0.1

d)

250

300

350

400

260310360410460510560610660 emission (nm)

250

280

310

340

370

400

260310

360410

460510

560610

660

emission (nm)260310360410460510

560610

660

250

290

330

370

410

émission (nm)

excita

tion (n

m)

0.77-0.84

0.7-0.77

0.63-0.7

0.56-0.63

0.49-0.56

0.42-0.49

0.35-0.42

0.28-0.35

0.21-0.28

0.14-0.21

0.07-0.14

0-0.07

250280

310

340

370

400

260310360410460510560610660 emission (nm)

250

280

310

340

370

400

260310

360410

460510

560610

660

emission (nm)

250

280

310

340

370

400

260310

360410

460510

560610

660

emission (nm)

7.8-8

7.2-7.8

6.6-7.2

6-6.6

5.4-6

4.8-5.4

4.2-4.8

3.6-4.2

3-3.6

2.4-3

1.8-2.4

1.2-1.8

0.6-1.2

0-0.6


226

The two other natural samples have a more marine origin as shown by the presence of a

peak in the fluorescence spectra (Figure 6). This peak is characteristic of recent autochthonous

DOM made up of protein-derived compounds generally coming from algal or bacterial production

(Parlanti et al. 2000, Determann et al. 1998). For the marine sample from the Mediterranean Sea, it

can easily be supposed that the peak has an algal origin since only surface water has been sampled

and bacterial production of DOM is dominant in deeper and more turbid waters. On the contrary, for

the pore water, the peak can have several origins (bacterial, algal, vegetal or benthic origin). Except

for the presence of a γ peak, the seawater sample does not have expected marine water

characteristics (low aromaticity and HIX, high E4/E6 and E2/E3). In fact, it is not surprising because this

sample was conserved for a long time after concentration (three years) before these experiments and

has been humified as confirmed by spectroscopic properties change. Although this sample is

unrepresentative of marine water, its spectrum remains interesting because of its properties of

humified marine DOM. Finally, the pore water exhibits less aromatic character (less than 15%) with

the highest contribution of recent DOM (γ band). The size of its macromolecules should also be quite

high regarding its E4/E6 ratio lower than the ones of the river water and Aldrich humic acid. This could

be explained by the origin of DOM since DOM coming from surface layer sediments is expected to

contain relatively bigger macromolecules than river and sea water (Lepane et al. 2004).

To sum up, very humified material is represented here by Aldrich humic acid, fulvic acids are

represented by the river water, the pore water is characteristic of recent sediment material and the

seawater represents aggregated and humified marine DOM without fresh materials.

III.4. Benzodiazepines-DOM interactions

According to Figure 7, SPME measurements do not show any significant interaction between

both pharmaceuticals and the DOM samples studied.

In order to confirm these results, fluorescence quenching of DOM by both compounds was

also investigated. In this study, we experimentally determined that variabilities on the sample

preparation and on spectral acquisitions were altogether 3% for the α and α‘ bands and 12% for the γ

band. Therefore, we considered a fluorescence quenching as significant if the modification of intensity

was higher than these values.


227

Figure 7. Interactions between pharmaceuticals and DOM measured by SPME-GC-MS, [pharmaceuticals] = 2

µg.L-1

.

A decrease of DOM fluorescence was observed with the addition of pharmaceuticals to some

samples even though precautions were taken to be sure no inner filter effect occurred. The quenching

intensity depends on DOM type, pharmaceuticals and the fluorescence domain observed (Table 3).

Indeed, the quenching intensity can be significant for a fluorescence band of DOM and nonexistent for

another one, suggesting the occurrence of preferential interactions with some kind of fluorophores.

Moreover, contrary to Bai et al. (2008) and like Wang et al. (2006), no wavelength shifts were

observed with the addition of benzodiazepines.

Fluorescence bands

100-(F/(FDOM+Fdrug)) (%) Log KDOC

Carbamazepine Diazepam Carbamazepine Diazepam

Pore water ‘ 6 14 5.07 ± 0.01 5.57 0.01

4 6 4.85 ± 0.01 5.08 0.01

-3 -3 nsi nsi

Sea water ‘ 15 22 5.62 0.01 5.98 0.01

17 25 5.69 0.01 6.01 0.01

38 23 6.36 0.01 5.98 0.01

River water ‘ 1 3 nsi nsi

0 1 nsi nsi

Aldrich humic acid

‘ 6 50 4.99 0.01 6.43 0.01

2 55 nsi 6.56 0.01

Table 3. Percentage of fluorescence quenching and log KDOC values calculated thanks to EEM spectra. F is the

fluorescence intensity of DOM and pharmaceuticals mixed together, FDOM is the fluorescence of DOM alone,

Fdrug is the fluorescence of pharmaceuticals alone, pharmaceutical concentrations were of 200 µg.L-1

, KDOC are

expressed in L.mol-1

, nsi means no significant interaction.

To determine the nature of the quenching (static or dynamic), we first assumed it was due to

collisions between DOM and pharmaceuticals (dynamic quenching) according to the Stern-Volmer

equation:

]Q[K1]Q[K1F

FSV0q

0 (8)

Carbamazepine

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Sea water River water Aldrich HA Pore water

GC

are

as

without DOM with DOM

Diazepam

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Sea water River

water

Aldrich HA Pore water

GC

are

as

without DOM with DOM


228

(with Kq the quenching rate constant, KSV the dynamic quenching constant, 0 the average lifetime of DOM without quencher and

[Q] the concentration of quencher.)

In order to compare the Stern-Volmer equation (8) to the equation describing the static

quenching, the approximate equation (4) was considered. This equation (4) and the equation 7 give

similar results for fluorescence quenching with a systematic error when using equation 4 less than 5%

(except for the band of the sea water with diazepam which reaches 50% and is not considered here),

so equations (8) and (4) can be compared to determine Kq. Average lifetimes of DOM could not be

measured in this study, but if we consider 0 to be in the range 0.1-10 ns (extreme values found in the

literature for DOM (Boyle et al. 2009, Clark et al. 2002)), Kq values range from 7.1012

to 4.1016

L.mol-

1.s

-1. These values are much greater than 10

10 L.mol

-1.s

-1 which is the highest value possible for

dynamic quenching (Puchalski et al. 1992, Wang et al. 2006). Consequently, the quenching observed

must be of a static nature and caused by the formation of a complex between pharmaceuticals and

DOM.

According to Table 3, the addition of one or the other pharmaceutical does not change

significantly α and α‘ band intensities of river water, even with a high concentration of contaminants.

For the other samples, these two bands are quenched in the same amount depending on the sample,

except for carbamazepine with Aldrich humic acid which is not significantly quenched. As regards the

γ peak, for the sea water both contaminants quenched the fluorescence intensity but for the pore

water, not only no fluorescence quenching occurs but the fluorescence intensity is enhanced in the

presence of pharmaceuticals. Nevertheless, this fluorescence enhancement was not significant.

Moreover, in most cases (except for the γ band of sea water with carbamazepine), interactions with

diazepam are stronger than with carbamazepine.

As the KDOC values were obtained for only one pharmaceutical concentration (200 µg.L-1

), the

fluorescence quenching was investigated for each fluorophore thanks to two-dimensional

spectrofluorometry on a larger range of concentrations (2 - 500 µg.L-1

), in order to confirm the previous

results and to study the linearity of interactions. These experiments show that fluorescence intensities

of α and α‘ bands vary rather linearly with pharmaceutical concentrations, except for carbamazepine

with Aldrich humic acid (Table 4). For the γ band, no linear relationship could be observed, but it may

be due to the variability which is higher. Therefore, it is difficult to determine if interactions really occur

between pharmaceuticals and the γ band of DOM. However, even though the low linear correlation for

diazepam and pore water, the fluorescence enhancement of the γ band was also observed, such as it

was in EEM spectrofluorometry. Thus, it might reflect a real tendency for this sample. An

enhancement of the fluorescence of DOM after addition of some organic compound has already been

observed (Boullemant et al. 2007). This might be explained by a change of DOM conformation caused

by the association with organic contaminant. This modification of conformation could obscure the

fluorescence of some functional groups or release some fluorophores and could explain why some


229

fluorescence bands of DOM are quenched while others are enhanced; both cases indicating the

occurrence of interactions.

Fluorescence bands

Carbamazepine Diazepam

Log KDOC (n) R² Log KDOC (n) R²

Pore water ‘ 5.3 0.1 (8) 0.75 5.5 0.1 (7) 0.96

5.2 0.1 (8) 0.63 5.1 0.1 (7) 0.79

5.5 0.1 (8) 0.21 4.6 0.6 (8) 0.39

Sea water ‘ 5.5 0.1 (8) 0.66 5.5 0.1 (8) 0.82

5.2 0.1 (8) 0.76 5.4 0.1 (8) 0.98

5.7 0.2 (8) 0.08 5.8 0.3 (7) 0.02

Aldrich humic acid ‘ 5.3 0.2 (6) 0.09 6.0 0.1 (6) 0.87

5.1 0.2 (6) 0.26 6.0 0.1 (6) 0.79

Table 4. Log KDOC values obtained by fluorescence quenching with variation of pharmaceutical concentrations,

KDOC values are expressed in L.mol-1

, n is the number of experimental points, italicized values represent

fluorescence intensity enhancements.

The results obtained by two-dimensional spectrofluorometry confirm the ones previously

obtained by EEM spectrofluorometry: the marine water has usually stronger interactions with

pharmaceuticals than the pore water but Aldrich humic acid is more strongly associated with

diazepam, unlike carbamazepine. Moreover, diazepam was also shown to interact stronger than

carbamazepine with better correlation coefficients. However, for the sample of Aldrich humic acid with

carbamazepine, while no or only low interaction was observed in EEM spectroscopy at 200 µg.L-1

of

contaminant, strong interaction was shown to occur at 500 µg.L-1

in the two dimensional fluorescence

studies for both α and α‘ bands. If we consider this point to calculate the KDOC values, they were much

higher: 6.5 ± 0.1 (R² = 0.88) for both α and α‘ bands. As a result, it seems that a high minimal

concentration of carbamazepine is needed so that the fluorescence quenching of Aldrich humic acid

can be observed.

Even though both these pharmaceuticals are benzodiazepines, they have different physical

and chemical properties. Both these pharmaceuticals have a polar amide functional group and a

hydrophobic moiety. As regards their spatial configuration, carbamazepine has a lower molecular

volume due to a lower molecular weight but also to a conjugation of its flat aromatic rings. Diazepam,

which also has aromatic rings but not conjugated ones, does not have a flat configuration and

possesses a chlorine atom. From a chemical point of view, diazepam is more hydrophobic but its

dipolar moment is higher (Table 5). Therefore, it could be supposed that diazepam can have stronger

interactions than carbamazepine thanks to hydrophobic interactions with hydrophobic moieties of

DOM and/or to dipole - dipole interactions with polar groups of DOM. Moreover, the aromaticity of

carbamazepine did not improve its interactions with DOM in comparison with diazepam so it can be


230

supposed that hydrophobic interactions are not specific and not driven by aromaticity. Maskaoui et al.

(2007) found a relationship between KDOC values and hydrophobicity and the size of pharmaceuticals

which is mostly confirmed in this study, even though only two compounds were investigated.

As regards DOM composition, fulvic acids do not seem to interact with benzodiazepines since

the river water does not interact significantly with none of the pharmaceuticals. On the contrary, other

DOM samples have interactions with the pharmaceuticals and are made up mainly of humic acids (as

shown by their E2/E3 < 3.5). These results agree with Bai et al. (2008) who have calculated lower log

KDOC values for carbamazepine with fulvic acids (4.43 0.04) than with humic acids (4.82 0.06) for

the ‘ band with EEM spectrofluorometry. Moreover, for these three samples, if we look at α and α‘

bands, interactions of diazepam increase with the aromaticity content and the humification index of

DOM. This could confirm the hydrophobic nature of these interactions. However, for carbamazepine,

which does not interact, at least for concentration less than 200 µg.L-1

, with the most aromatic DOM

(Aldrich humic acid), interactions increase when E2/E3 and E4/E6 ratios decrease. It confirms that the

aromatic rings of carbamazepine, at low concentrations, are not specifically associated with aromatic

moieties of DOM and it could imply that its interactions are stronger with larger macromolecules.

Bai et al. (2008) have suggested that interactions between DOM and carbamazepine are due

to its hydrophobic moiety and its urea moiety. Our results seem to show that interactions of

carbamazepine are not driven by hydrophobicity or polarity of DOM since protein-like macromolecules

(fluorophores of the γ band of pore water for example) and DOM with high aromatic content (Aldrich

humic acid) do not provide stronger interactions: these interactions seem to be only related to the size

of macromolecules.

Very few articles have dealt with interactions between benzodiazepines and DOM studied by

fluorescence quenching. To our knowledge, only Bai et al. (2008) have got interested in interactions

between carbamazepine and humic substances with this technique. For the other benzodiazepine -

DOM interaction studies found in the literature, the comparison is more difficult since DOM

characterization is not performed by EEM spectrofluorometry so KDOC values are not expressed in the

same unit.

Compounds Formula Molar weight

(g.mol-1

) pKa

(at 20 °C) Dipolar

moment (D)

Aqueous solubility (mg.L

-1)

Log KOW

Diazepam

284.7 3.3 3.26 50 2.99

Carbamazepine 236.3 < 1-13.9 1.67 17.7 2.45

Table 5. Physico-chemical properties of pharmaceuticals (Luo et al. 1998, Machatha and Yalkowsky 2004, Li et

al. 2005, Sila-On et al. 2008, Comerton et al. 2007, Cleuvers 2003, Löffler et al. 2005).


231

IV. Conclusion

Weak interactions between benzodiazepines and natural DOM have been underlined thanks

to fluorescence quenching. These interactions have strengths depending on pharmaceuticals, DOM

origin and fluorescence bands. The strongest interactions occur with DOM mainly constituted of humic

acids and diazepam was shown to interact stronger than carbamazepine with every type of DOM

studied. Moreover, these interactions do not seem to be correlated with the aromaticity content of

DOM but to depend on hydrophobicity (especially for diazepam) and the size of macromolecules

(especially for carbamazepine).

To improve our knowledge about the nature of these interactions, it would be interesting to

study them with fractionated DOM. Indeed, an appropriate fractionation of DOM (by size, by

hydrophobicity, by polarity…) would allow to achieve a better understanding of the driving forces of its

interactions with pharmaceuticals. Moreover, it would be possible to study interactions of fractions

which are minor in natural samples but which could have interactions with pharmaceuticals.

Regarding SPME-GC-MS, although it has not highlighted the weak interactions that occur

between benzodiazepines and natural DOM, it remains a technique of choice for rapid, sensitive and

reliable analyses of pharmaceuticals in complex environmental samples.

Last but not least, even though observed interactions with DOM were weak, DOM content of

natural waters should not be neglected when considering the fate of pharmaceuticals in aquatic

environments. Indeed, interactions were observed in this study at low concentrations of DOC and

relatively environmentally representative concentrations of pharmaceuticals. Consequently,

concentrations of free pharmaceuticals could be significantly diminished especially in natural waters

with a high content of DOM.

Acknowledgements


acknowledged for financial support, the French Ministry of Research for the PhD grant of C. de Perre.

Literature

Bai, Y., Fengchang Wu, Congqiang Liu, Jianyang Guo, Pingqing Fu, Wen Li & Xing, B. (2008)

Interaction between carbamazepine and humic substances: a fluorescence spectroscopy

study. Environmental Toxicology and Chemistry 27(1), 95-102.

Bercaru, O., Ulberth, F., Emons, H. & Vandecasteele, C. (2006) Accurate quantification of PAHs in

water in the presence of dissolved humic acids using isotope dilution mass spectrometry.

Analytical and Bioanalytical Chemistry 384(5), 1207-1213.


232

Boti, V.I., Sakkas, V.A. & Albanis, T.A. (2007) Measurement uncertainty arising from trueness of the

analysis of two endocrine disruptors and their metabolites in environmental samples: Part II.

Solid-phase extraction from environmental natural waters. Journal of Chromatography A

1146(2), 148-156.

Boullemant, A., Gagné, J., Fortin, C. & Campbell, P.G.C. (2007) Interactions of hydrophobic metal

complexes and their constituents with aquatic humic substances. Environmental Chemistry

4(5), 323-333.

Boyle, E.S., Guerriero, N., Thiallet, A., Vecchio, R.D. & Blough, N.V. (2009) Optical Properties of

Humic Substances and CDOM: Relation to Structure. Environmental Science and Technology

43(7), 2262-2268.

Brun, G.L., Bernier, M., Losier, R., Doe, K., Jackman, P. & Lee, H.-B. (2006) Pharmaceutically

active compounds in Atlantic canadian sewage treatment plant effluents and receiving waters,

and potential for environmental effects as measured by acute and chronic aquatic toxicity.

Environmental Toxicology and Chemistry 25(8), 2163-2176.

Clark, C.D., Jimenez-Morais, J., Jones, I.I.G., Zanardi-Lamardo, E., Moore, C.A. & Zika, R.G.

(2002) A time-resolved fluorescence study of dissolved organic matter in a riverine to marine

transition zone. Marine Chemistry 78(2-3), 121-135.

Cleuvers, M. (2003) Aquatic ecotoxicity of pharmaceuticals including the assessment of combination

effects. Toxicology Letters 142(3), 185-194.

Comerton, A.M., Andrews, R.C., Bagley, D.M. & Yang, P. (2007) Membrane adsorption of

endocrine disrupting compounds and pharmaceutically active compounds. Journal of

Membrane Science 303(1-2), 267.

De Perre, C., Le Ménach, K., Budzinski, H., Parlanti, E., (2009) Development of Solid-Phase Micro

Extraction (SPME) and its Application to the Study of Dissolved Organic Matter (DOM) -

Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH) Interactions in Aquatic Environment. In preparation

Determann, S., Lobbes, J.M., Reuter, R. & Rullkotter, J. (1998) Ultraviolet fluorescence excitation

and emission spectroscopy of marine algae and bacteria. Marine Chemistry 62(1-2), 137-156.

Frigerio, A., Baker, K.M. & Belvedere, G. (1973) Gas chromatographic degradation of several drugs

and their metabolites. Analytical Chemistry 45(11), 1846-1851.






Chemosphere 37(7), 1335-1362.

Halling-Sørensen, B., Nors Nielsen, S., Lanzky, P.F., Ingerslev, F., Holten Lützhøft, H.C. &

Jørgensen, S.E. (1998) Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in the

environment- A review. Chemosphere 36(2), 357-393.

Huguet, A. (2007) Mise au point de procédés membranaires pour l'étude de la matière organique

dissoute en milieux côtiers. PhD thesis n°3504: Bordeaux 1 University.


233






490.

Ibáñez, M., Picó, Y. & Mañes, J. (1996) Influence of organic matter and surfactants on solid-phase

extraction of diquat, paraquat and difenzoquat from waters. Journal of Chromatography A

727(2), 245-252.

Khetan, S.K. & Collins, T.J. (2007) Human Pharmaceuticals in the Aquatic Environment: A

Challenge to Green Chemistry. Chemical Reviews 107(6), 2319-2364.



Sciences - Research Across Boundaries 66(2), 185-194.

Li, N. & Lee, H.K. (2001) Solid-phase extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons in surface water:

Negative effect of humic acid. Journal of Chromatography A 921(2), 255-263.

Li, X.-H., Cheng, X.-L., Zhang, R.-Z. & Yang, X.-D. (2005) Quantum Chemical Study on Structure-

activity Relationship of Several Kinds of Drugs. Chinese Journal of Structural Chemistry 24(5),

513-520.

Luo, Y., Pan, L. & Pawliszyn, J. (1998) Determination of five benzodiazepines in aqueous solution

and biological fluids using solid-phase microextraction with carbowax/DVB fiber coating.

Journal of Microcolumn Separations 10(2), 193-201.

Löffler, D., Römbke, J., Meller, M. & Ternes, T.A. (2005) Environmental Fate of Pharmaceuticals in

Water/Sediment Systems. Environmental Science and Technology 39(14), 5209-5218.

Machatha, S.G. & Yalkowsky, S.H. (2004) Estimation of the ethanol/water solubility profile from the

octanol/water partition coefficient. International Journal of Pharmaceutics 286(1-2), 111-115.

Maskaoui, K., Hibberd, A. & Zhou, J.L. (2007) Assessment of the Interaction between Aquatic

Colloids and Pharmaceuticals Facilitated by Cross-Flow Ultrafiltration. Environmental Science

and Technology 41(23), 8038-8043.



organic material and aromaticity. Journal Limnology and Oceanography 46(1), 38-48.


Characterisation of Surface Lakewater Samples: Implications for the Quantification of Nitrate

and the Properties of Dissolved Organic Matter. Annali di Chimica 97(10), 1107-1116.

Moeder, M., Schrader, S., Winkler, M. & Popp, P. (2000) Solid-phase microextraction-gas

chromatography-mass spectrometry of biologically active substances in water samples.

Journal of Chromatography A 873(1), 95.


234

Nghiem, L.D., Schafer, A.I. & Elimelech, M. (2006) Role of electrostatic interactions in the retention

of pharmaceutically active contaminants by a loose nanofiltration membrane. Journal of

Membrane Science 286(1-2), 52-59.

Nunes, B., Carvalho, F. & Guilhermino, L. (2005) Acute toxicity of widely used pharmaceuticals in

aquatic species: Gambusia holbrooki, Artemia parthenogenetica and Tetraselmis chuii.

Ecotoxicology and Environmental Safety 61, 413-419.

Oetken, M., Nentwig, G., Löffler, D., Ternes, T. & Oehlmann, J. (2005) Effects of Pharmaceuticals

on Aquatic Invertebrates. Part I. The Antiepileptic Drug Carbamazepine. Archives of

Environmental Contamination and Toxicology 49(3), 353-361.

Parikh, S.J., Chorover, J. & Burgos, W.D. (2004) Interaction of phenanthrene and its primary

metabolite (1-hydroxy-2-naphthoic acid) with estuarine sediments and humic fractions. Journal

of Contaminant Hydrology 72(1-4), 1-22.




Pascoe, D., Karntanut, W. & Müller, C.T. (2003) Do pharmaceuticals affect freshwater invertebrates?

A study with the cnidarian Hydra vulgaris. Chemosphere 51(6), 521-528.

Perdue, E.M. & Wolfe, N.L. (1982) Modification of pollutant hydrolysis kinetics in the presence of

humic substances. Environmental Science and Technology 16(12), 847-852.



597-600.

Potter, B.B. & Wimsatt, J.C. (2005) Method 415.3 - Determination of Total Organic Carbon and

Specific UV Absorbance at 254 nm in source water and drinking water; EPA/600/R-05/055.

pp. 1-56. National Exposure Research Laboratory, Office of Research and Development, U.S.

Environmental Protection Agency.

Puchalski, M.M., Morra, M.J. & Von Wandruszka, R. (1992) Fluorescence quenching of synthetic

organic compounds by humic materials. Environmental Science and Technology 26(9), 1787-

1792.

Quinn, B., Gagné, F. & Blaise, C. (2008) An investigation into the acute and chronic toxicity of eleven

pharmaceuticals (and their solvents) found in wastewater effluent on the cnidarian, Hydra

attenuata. Science of The Total Environment 389(2-3), 306-314.

Sierra, M.M.D., Giovanela, M., Parlanti, E. & Soriano-Sierra, E.J. (2005) Fluorescence fingerprint of

fulvic and humic acids from varied origins as viewed by single-scan and excitation/emission

matrix techniques. Chemosphere 58(6), 715-733.

Sila-On, W., Vardhanabhuti, N., Ongpipattanakul, B. & Kulvanich, P. (2008) Influence of

incorporation methods on partitioning behavior of lipophilic drugs into various phases of a

parenteral lipid emulsion. AAPS PharmSciTech. 9(2), 684-692.


235

Stein, K., Ramil, M., Fink, G., Sander, M. & Ternes, T.A. (2008) Analysis and Sorption of

Psychoactive Drugs onto Sediment. Environmental Science and Technology 42(17), 6415-

6423.

Wang, C., Wu, Q.-H., Wang, Z. & Zhao, J. (2006) Study of the Interaction of Carbamazepine with

Bovine Serum Albumin by Fluorescence Quenching Method. Analytical Sciences 22(3), 435-

438.

You, S-J., Yin, Y.Y., Allen, H.E. (1999) Partitioning of organic matter in soils: effects of pH and

water/rsoil ratio. The Science of the Total Environment 227, 155-160.




237

Chapitre 4 : synthèse des résultats


239

Cette partie a pour but de reprendre les principaux résultats de ces travaux de thèse

développés ou non dans les articles précédents sous forme synthétique.

Cette thèse avait pour objectif de développer des outils analytiques, puis de les appliquer à

l‘étude des interactions entre les contaminants organiques et la Matière Organique Dissoute (MOD).

Les contaminants organiques étudiés ont été les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) et

les substances pharmaceutiques. Plusieurs MOD ont été utilisées afin d‘essayer de comprendre

quelles sont les propriétés qui gouvernent les interactions avec les différents contaminants

organiques.

La micro-extraction sur phase solide (SPME) a été développée pour l‘analyse des HAP en

solution aqueuse. Pour être quantitative, celle-ci a été utilisée en couplage avec la chromatographie

en phase gazeuse et la spectrométrie de masse simple et en tandem (GC-MS et GC-MS/MS).

Chacune de ces trois composantes du système (SPME, GC et MS) a donc fait l‘objet de

développements. Le but dans ces travaux était d‘optimiser la technique pour obtenir les meilleures

sensibilités, reproductibilités et justesses possibles et qu‘elle soit applicable à des échantillons aqueux

de diverses origines et compositions.

I. Développement de la SPME-GC-MS et MS/MS pour l’analyse des HAP (publications n°1 et 2)

I.1. Développement de la SPME

Les principaux paramètres développés pour la SPME ont été le choix de la fibre, les

températures d‘extraction et de désorption ainsi que le temps d‘extraction. Trois sortes de fibres ont

été testées : Carbowax-DVB 65 µm, PDMS 100 µm et PDMS-DVB 65 µm. La fibre en PDMS 7 µm

avait fait l‘objet de tests préliminaires montrant de très faibles sensibilités. En effet, la sensibilité des

fibres augmente avec la taille du polymère et l‘utilisation de fibres d‘épaisseur maximale est donc à

privilégier lorsqu‘il s‘agit d‘obtenir de faibles limites de détection. La fibre la plus sensible pour la

plupart des HAP s‘est avérée être la Carbowax-DVB 65 µm suivie de la PDMS 100 µm. Ceci

s‘explique certainement par une forte affinité avec la phase absorbante Carbowax, ainsi que par les

interactions - qui peuvent avoir lieu entre les HAP et le DVB et qui occasionnent une adsorption

plus efficace sur la fibre. Cependant, le but ici étant d‘analyser des échantillons de matrices pouvant

être très chargées, la fibre PDMS 100 µm a été choisie pour son polymère absorbant. En effet, il est

déconseillé d‘utiliser des polymères adsorbants pour l‘analyse d‘échantillons complexes à cause des

phénomènes de compétition qui provoquent des isothermes d‘adsorption non linéaires, ce qui

complique terriblement la quantification (Lord et Pawliszyn 2000). Les autres paramètres étaient

optimaux pour une température d‘extraction de 40 °C, une température de désorption de 270 °C et un

temps d‘extraction de 60 min (publications n°1 et 2).


240

I.2. Développement de la GC

Les paramètres GC à optimiser sont la température de l‘injecteur, qui est également la

température de désorption de la fibre, le type d‘injecteur et le gradient de température du four.

Concernant l‘injecteur, des inserts adaptés aux injections liquides ont été utilisés car ils permettent de

basculer du mode SPME au mode injection liquide sans changer le système d‘injection et donc les

conditions GC. Ceci est très utile pour le développement analytique puisque des injections liquides de

référence peuvent être faites avant chaque séquence SPME pour vérifier le bon fonctionnement du

système GC-MS en termes de sensibilité. D‘autre part, dans la mesure du possible, les essais

d‘optimisation ont été effectués en triplicat et en « croisé », c'est-à-dire en alternant les conditions

testées afin de s‘affranchir de toute dérive possible du système au cours d‘une même séquence

SPME. En ce qui concerne la température du four du chromatographe, celle-ci a été optimisée pour

permettre la séparation d‘un maximum de HAP et notamment des isomères dans un temps

relativement court (Figure 24). En effet, la fibre restant dans l‘injecteur 30 min après l‘extraction pour

la désorption et son conditionnement, le temps d‘analyse a été optimisé (à environ 20 min) de façon à

ce que, en considérant également le temps de redescente en température du four (environ 5 min), le

temps total n‘excède pas 30 min.

I.3. Développement de la MS et MS/MS

Pour le spectromètre de masse, aucun développement n‘a été fait en mode MS simple, si ce

n‘est un ajustement des coupures d‘ions afin de permettre un nombre maximal d‘acquisitions par pic

chromatographique et un temps maximal d‘acquisition pour chaque ion. La MS simple a été utilisée en

mode SIR (Selected Ion Recording), les ions moléculaires recherchés étant ceux correspondant aux

masses moléculaires de chaque HAP. La spectrométrie de masse en tandem a fait l‘objet de plus de

Figure 24. Chromatogramme des HAP séparés et analysés par GC-MS.

%

Temps (min)


241

développements. Celle-ci a été utilisée en mode MRM (Multiple Reaction Monitoring) avec des

transitions ions précurseurs ions précurseurs et des transitions ions précurseurs ions fils. En

effet, les HAP étant des molécules stables et difficilement fragmentables, les transitions ions

précurseurs ions précurseurs permettent d‘éliminer du bruit toutes les molécules qui sont

fragmentées (en ions fils) tout en conservant un signal maximal pour les HAP. Les deuxièmes

transitions (vers des ions fils différents des ions précurseurs) sont plus spécifiques mais, en raison de

la stabilité des HAP, une forte diminution du signal est observée. Afin de déterminer les transitions

caractéristiques des HAP, les spectres des ions fragments de chaque ion moléculaire ont été acquis

pour des énergies de collision de 5 à 50 eV. Les énergies de collision ont ensuite été affinées à partir

d‘une sélection de spectres d‘ions fragments. Les transitions ont été choisies de façon à maximiser le

signal des ions fils tout en ayant une énergie de collision assez élevée pour réduire le bruit de fond

grâce à la fragmentation des molécules de mêmes ions précurseurs que les HAP mais qui ne se

transforment pas en mêmes ions fils. Ainsi, deux transitions ont été conservées pour la plupart des

HAP (annexe 6) : la transition de quantification, qui donne les sensibilités les plus élevées

(généralement les transitions ions précurseurs ions précurseurs), et la transition de confirmation,

qui apporte une sélectivité supplémentaire mais qui n‘est pas utilisée pour la quantification à cause de

la diminution de sensibilité qu‘elle implique. Par exemple, le phénanthrène (m/z 178) se fragmente

peu et la transition donnant la meilleure sensibilité (transition de quantification, 178 178) permet

d‘éliminer toutes les molécules qui ne donnent pas d‘ions fils à m/z 178. D‘autre part, une deuxième

transition 178 152 (transition de confirmation) peut être observée dans le but de vérifier qu‘il s‘agit

bien du phénanthrène.

I.4. Quantification par SPME-GC-MS et MS/MS

Après le développement des méthodes GC-MS et GC-MS/MS grâce à des solutions de

référence dans l‘isooctane, la SPME a été ajoutée au système afin de valider la technique pour des

eaux ultrapures supplémentées en HAP. Les limites de détection ont ainsi pu être calculées ainsi que

les rendements d‘analyse afin de déterminer la justesse, la variabilité et la reproductibilité de la

technique. Dans les conditions optimales déterminées précédemment, avec un système parfaitement

propre et une fibre en bon état, les limites de détection peuvent être inférieures à 1 ng.L-1

pour tous

les HAP, même les plus lourds (publications n°1 et 2). Ces limites sont très intéressantes car les HAP

sont présents à l‘état de traces (jusqu‘à quelques ng.L-1

) dans les eaux naturelles, surtout les plus

lourds d‘entre eux qui sont les moins solubles. Cependant, chaque fibre SPME d‘une même sorte et

d‘un même lot de fabrication n‘a pas exactement les mêmes sensibilités et celles-ci varient également

avec le nombre d‘extractions effectuées. Le système GC-MS évolue également au fur et à mesure

des analyses, même si les échantillons ont une matrice faiblement chargée et qu‘un contrôle

permanent de la machine est effectué. Ces évolutions à la fois de la SPME et de la GC-MS font que

les limites de détections ont pu être légèrement supérieures mais celles-ci n‘excédaient pas 1 ng.L-1

pour les HAP de faibles à moyens poids moléculaires (du naphtalène au chrysène) et n‘excédaient

pas 5 ng.L-1

pour les HAP de hauts poids moléculaires (≥ 252 g.mol-1

).


242

La quantification a été réalisée par étalonnage interne grâce à l‘utilisation de HAP deutérés

correspondant aux HAP natifs dans la mesure du possible. Ainsi, seuls le 2,1-benzonaphtothiophène

et le benzo[a]fluoranthène ont été quantifiés par rapport au chrysène d12 et au benzo[e]pyrène d12

respectivement. Cet étalonnage a été effectué grâce à des solutions aqueuses de HAP et de HAP

deutérés analysées par SPME-GC-MS pour chaque série d‘échantillons afin de pouvoir calculer les

coefficients de réponses du système pour chaque HAP. Ces coefficients dépendent donc de la

machine mais sont généralement compris entre 0,7 et 1 (en injection liquide directe et en SPME), un

coefficient de 1 signifiant que le HAP et son deutéré se comportent exactement de la même façon tout

au long de l‘analyse. Une valeur de 1 n‘est cependant jamais atteinte étant donné que la pureté des

composés deutérés ne peut pas être de 100 % et qu‘une infime partie des étalons internes ajoutés

sont en fait des composés natifs (≤ 2 % selon la pureté des composés deutérés). Les coefficients de

réponse étaient ici plus faibles avec une moyenne de 0,5 pour tous les HAP. La justesse et la

variabilité de la SPME-GC-MS ont été mesurées sur des eaux ultrapures supplémentées en HAP à

hauteur d‘environ 50 ng.L-1

chacun. Les rendements de quantification étaient en moyenne de 88 9

% pour tous les HAP avec des variabilités inférieures à 5 % (n = 3). La reproductibilité de la technique

a été testée grâce à l‘utilisation d‘un autre système SPME-GC-MS. Sur celui-ci les rendements de

quantification étaient en moyenne de 83 9 % avec là encore des variabilités moyennes inférieures à

5 % et les coefficients de réponse étaient en moyenne autour de 0,6. Les reproductibilités intra- et

inter-machine étaient donc très bonnes (Figure 25).

Figure 25. Quantification d’une eau ultrapure supplémentée en HAP par SPME-GC-MS sur deux systèmes

différents.

Lorsque l‘analyse est effectuée par spectrométrie de masse en tandem, les limites de

détections pour de l‘eau ultrapure supplémentée en HAP sont supérieures à celles obtenues en mode

0

20

40

60

80

100

120

140

N Acty Acte Fe Phe An Fluo Pyr BaA Chrys BbF + BkF

BeP BaP Per IP BP dahA

concentration (ng/L)

GC n°1 eau dopée 1


GC n°1 eau dopée n°3

Concentration théorique




3

Concentration (ng.L-1

)


243

SIR et leur variabilité est également plus importante (55 % de variabilité en mode MRM par rapport

aux 30 % de variabilité en mode SIR) (Figure 26).

Figure 26. Limites de détection par SPME-GC-MS et SPME-GC-MS/MS.

Même si la sensibilité était moins bonne, la quantification par étalonnage interne de l‘eau

ultrapure supplémentée s‘est tout de même avérée satisfaisante avec des rendements moyens de 84

12 % et une variabilité moyenne inférieure à 10 % avec les transitions ions précurseurs ions

précurseurs (publications n°1 et 2). Les autres transitions (ions précurseurs ions fils) n‘ont pas

permis une bonne quantification et n‘ont pu être utilisées ultérieurement que pour des analyses

qualitatives.

I.5. Comparaison SPME/LLE/SPE

La SPME a ensuite été comparée à deux autres techniques plus usuelles d‘extraction

d‘échantillons aqueux: l‘extraction liquide-liquide (LLE) et l‘extraction sur phase solide (SPE), elles

aussi couplées à la GC-MS. Les résultats ont montré que de façon globale les rendements moyens de

quantification étaient équivalents mais légèrement meilleurs par SPME qu‘avec les deux autres

techniques (publications n°1 et 2). Cependant, si l‘on regarde au niveau des composés individuels, la

SPME apporte généralement une meilleure quantification des HAP légers (Figure 27). En effet, les

multiples étapes des extractions LLE et SPE, et notamment la dernière étape de reconcentration du

solvant par évaporation provoque la perte des étalons internes de HAP légers ce qui fausse la

quantification et augmente la variabilité. Pour certains HAP lourds, la quantification s‘avère également

meilleure par SPME.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Lim

ite

s d

e d

éte

ctio

n (n

g/L

)

SIR MRM Précurseur-précurseur MRM précurseur-fils

Lim

ite

s d

e d

éte

cti

on

(n

g.L

-1)


244

Figure 27. Comparaison des techniques d’extraction SPME, LLE et SPE. Les zones entourées illustrent les

différences les plus importantes.

En plus de ses avantages intrinsèques (faibles volumes d‘échantillons, pas d‘utilisation de

solvant, rapidité et automatisation des analyses), la SPME apporte donc également de meilleures

quantifications des HAP dans des matrices aqueuses que la SPE et la LLE.

I.6. Application de la SPME-GC-MS et MS/MS à des échantillons environnementaux

L‘application environnementale de la SPME a été faite sur des eaux de stations d‘épuration ce

qui a permis de mettre en évidence l‘intérêt de la spectrométrie de masse en tandem pour l‘analyse

des HAP dans des matrices complexes. En effet, les résultats développés dans les publications n°1 et

2 ont montré que des composés peuvent interférer avec les HAP et empêcher leur quantification en

mode SIR alors que le mode MRM (transitions ions précurseurs ions précurseurs) a permis de

lever ces interférences et de quantifier les contaminants. Cependant, il est nécessaire que ces

derniers soient en quantité suffisante pour être quantifiés correctement par SPME-GC-MS/MS.

D‘autre part, les limites de détection pour des échantillons aussi matriciellement chargés que des

eaux d‘entrées de station d‘épuration (entre 5 et 40 ng.L-1

selon les HAP) sont plus élevées que dans

l‘eau ultrapure (≤ 1 ng.L-1

). En effet, la matrice et plus particulièrement le matériel organique peut

interagir avec les HAP et les rendre moins disponibles pour la SPME. Or, la quantité de HAP extraite

par SPME est proportionnelle à la concentration en HAP libres et celle-ci peut diminuer en présence

de matière organique. La fraction libre et disponible pour la SPME étant plus faible pour une même

concentration totale en HAP, les limites de détection calculées par rapport à la concentration totale de

HAP s‘en trouvent alors d‘autant plus élevées que les HAP réagissent avec le matériel organique.

Concentration (ng.L-1

)


245

Ceci peut donc être un inconvénient majeur pour la quantification des HAP à l‘état de traces dans les

eaux naturelles mais cela permet à la SPME d‘être un outil tout à fait adapté à l‘étude de ces

interactions entre les contaminants organiques et la matière organique. En effet, la fraction libre des

contaminants est proportionnelle à la quantité extraite par SPME et peut donc être quantifiée grâce à

un étalonnage externe ; alors que l‘ajout d‘étalons internes permet de corriger la perte due aux

interactions et donc de quantifier la totalité des HAP dissous puisque les composés deutérés se

comportent de la même façon vis-à-vis de la matrice que les HAP natifs.

I.7. Développement de la SPME-GC-MS pour l’étude des interactions HAP-MOD

Pour l‘étude des interactions HAP-MOD, les paramètres de la SPME ont été légèrement

modifiés : le temps d‘immersion de la fibre dans l‘échantillon a été réduit à 30 min (au lieu de 60 min)

dans le but de modifier au minimum l‘équilibre HAP-MOD. En effet, plus le temps d‘extraction est long,

plus la quantité de HAP libres extraite est grande et donc plus l‘équilibre entre les HAP libres et

associés à la MOD peut être déplacé vers les HAP libres pour compenser la perte causée par

l‘extraction. Un long temps d‘extraction peut donc causer une surestimation de la fraction libre de

HAP. D‘autre part, un temps d‘immersion de 30 min procure des limites de détection satisfaisantes :

< 1 ng.L-1

pour les HAP de faibles poids moléculaires et < 10 ng.L-1

pour les HAP de hauts poids

moléculaires.

La difficulté majeure dans l‘application de la SPME-GC-MS à l‘étude des interactions

contaminants - MOD est l‘utilisation de l‘étalonnage externe. Alors que l‘étalonnage interne a montré

de très bonnes reproductibilités, l‘étalonnage externe est beaucoup plus variable, et ce pour

différentes raisons. D‘une part, la variabilité intrinsèque à chaque système (SPME, GC et MS) s‘ajoute

lors d‘une analyse et ne peut dans ce cas être compensée par la comparaison d‘aires avec un étalon

interne. D‘autre part, l‘étalonnage externe passe par la réalisation d‘une courbe de calibration en

début de chaque série avec au minimum trois points chacun effectué en triplicat. Ceci, en plus

d‘allonger considérablement le temps d‘analyse par rapport à l‘étalonnage interne, apporte un biais

supplémentaire puisqu‘il s‘est passé au minimum 10h entre le premier étalon et le premier échantillon.

Pendant ce temps, le système GC-MS et la fibre SPME ont pu évoluer, ainsi que les échantillons

(dégradation, évaporation), et la quantification peut alors être faussée surtout pour les séries les plus

longues. En comparant les variabilités des aires obtenues par GC-MS (en injection liquide), puis en

couplage avec la SPME et en analysant les concentrations en HAP d‘échantillons restés 24h en

attente, la variabilité de chaque élément a pu être déterminée (Figure 28). Une variabilité de 10 à 35

% sur une trentaine d‘échantillons est ainsi observée sur les aires obtenues par SPME-GC-MS et

donc sur les quantifications des HAP par étalonnage externe.


246

L‘étalonnage externe n‘est pas indispensable à la quantification de la fraction libre des

contaminants. En effet, comme développé dans la publication n°3, l‘étalonnage par rapport à un

étalon interne qui n‘interagit pas avec la matrice peut être utilisé. Comme le montre la Figure 29, le

naphtalène d8 a pu être utilisé puisque les aires obtenues en présence et en absence de MOD sont

équivalentes, ce qui dénote que la fraction libre reste identique dans les deux cas et que le

naphtalène d8 n‘interagit pas avec la MOD.

La comparaison des différents étalonnages sur une eau ultrapure supplémentée en HAP et en

HAP deutérés (environ 50 ng.L-1

chacun) est donnée Figure 30. Sur une série de 10 échantillons (15h

d‘analyse) quantifiés à partir d‘un étalon en début de séquence, l‘étalonnage externe sous-estime les

Figure 28. Variabilité de la SPME-GC-MS et contribution de chaque élément.

Figure 29. Comparaison des aires obtenues par SPME-GC-MS avec et sans MOD pour le naphtalène d8, après

normalisation par la concentration en naphtalène d8.


247

concentrations de tous les HAP de 20 à 40 %. D‘autre part, si le calcul est effectué à partir de l‘étalon

précédant chaque échantillon, la sous-estimation est inférieure à 10 % pour tous les HAP. Ceci

implique que la mauvaise quantification par étalonnage externe est due à une perte de sensibilité du

système SPME-GC-MS au cours de l‘analyse. Si les aires sont maintenant corrigées par rapport à la

dérive de celles du naphtalène d8, les rendements sont proches de 100 % jusqu‘au pyrène et la

surestimation est d‘environ 20 % au-delà et jusqu‘au pérylène et atteint 60 % pour les 3 HAP les plus

lourds. Cette surestimation s‘explique certainement par le fait que la correction effectuée est d‘autant

meilleure que le HAP a une structure proche de celle du naphtalène d8 ; les HAP de hauts poids

moléculaires ayant un comportement plus éloigné de celui du naphtalène d8 que les HAP de faibles

poids moléculaires. La quantification de la fraction associée à la MOD (concentration totale moins la

fraction libre) peut donc se faire sans problème jusqu‘au pyrène et sera sous-estimée pour les HAP de

plus hauts poids moléculaires. Cependant, même s‘il faut prendre en compte cette surestimation,

celle-ci peut être négligeable dans certaines conditions. En effet, si l‘on considère les interactions

entre le BaP et l‘acide humique Aldrich par exemple, la fraction libre représente moins de 20 % de la

totalité du BaP présent en solution. Une surestimation de cette valeur de 20 % provoque alors une

sous-estimation de la fraction associée à la MOD inférieure à 5 % (100 - 24 = 76 % (valeur calculée)

au lieu de 100 – 20 = 80 % (valeur théorique)). De la même façon, l‘erreur de 60 % sur la mesure du

DahA libre provoque une erreur sur la fraction associée à la MOD inférieure à 1 % car ce dernier a de

très fortes interactions avec la MOD. Finalement, l‘erreur sur la mesure la plus problématique est

située sur les HAP de faibles poids moléculaires qui interagissent peu avec la MOD. Par exemple, la

quantification d‘un HAP dont 90 % seraient sous forme libre, surestimée de 5 %, provoquerait une

sous-estimation de la fraction associée à la MOD de 45 % (100 - 94,5 = 5,5 % (calculée) au lieu de

100 - 90 = 10 % (théorique)). Il faut donc prendre en considération l‘erreur potentielle sur la mesure

sachant que celle-ci est minimisée au maximum grâce à l‘étalonnage par rapport au naphtalène d8

pour la fraction libre, notamment pour les HAP de plus faibles poids moléculaires.


248

II. Étude des interactions HAP – acide humique Aldrich (publication n°3)

II.1. Interactions HAP – acide humique Aldrich étudiées par SPME-GC-MS

Les interactions ont été étudiées dans un premier temps entre 4 HAP (phénanthrène,

fluoranthène, chrysène, benzo[a]pyrène), puis 19 HAP, et l‘acide humique Aldrich en phase aqueuse

par SPME-GC-MS. Les résultats obtenus par ajout croissant de MOD pour une même concentration

en HAP (1 µg.L-1

) sont donnés dans la Figure 31. Il apparait que les pentes (et donc les KDOC) des

droites qui passent au mieux par les points sont d‘autant plus grandes que le HAP est de haut poids

moléculaire et hydrophobe et que le nombre et la quantité de HAP dans l‘échantillon sont faibles. En

effet, pour les composés pris individuellement ou en présence des 3 autres HAP, les KDOC sont plus

forts qu‘en présence de 19 HAP à 1 µg.L-1

chacun. Ceci implique des phénomènes de compétition

entre les HAP vis-à-vis de la MOD et l‘existence de sites spécifiques sur cette dernière s‘associant

plus fortement à certains HAP que d‘autres. Cette hypothèse a été vérifiée grâce à l‘étude des

interactions lors d‘un ajout croissant de HAP pour une même quantité de MOD avec d‘une part un

mélange équimassique de 19 HAP et d‘autre part un mélange des 19 mêmes HAP avec des

concentrations en HAP de faibles poids moléculaires plus importantes, pour mimer les proportions

retrouvées dans le milieu naturel (Figure 32).

Figure 30. Comparaison de la quantification par SPME-GC-MS par les différents étalonnages (n=10).


249

y = 0,0149x + 1R² = 0,527

y = 0,02x + 1R² = 0,5483

y = 0,0046x + 1R² = -0,045

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 1 2 3 4 5 6

[HA

P] t

ota

le/[

HA

P] l

ibre

[COD] en mg/L

Phénanthrène

individuel

mélange 4 HAP

mélange 16 HAP

y = 0,0818x + 1R² = 0,0626

y = 0,0929x + 1R² = 0,7688

y = 0,0374x + 1R² = 0,6749

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 1 2 3 4 5 6

[HA

P] t

ota

le/[

HA

P] l

ibre

[COD] en mg/L

Fluoranthène

individuel

mélange 4 HAP

mélange 16 HAP

y = 0,2671x + 1R² = 0,7837

y = 0,301x + 1R² = 0,9082

y = 0,1797x + 1R² = 0,8864

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 2 4 6 8

[HA

P] t

ota

le/[

HA

P] l

ibre

[COD] en mg/L

Chrysène

individuel

mélange 4 HAP

mélange 16 HAP

y = 4,8142x + 1R² = 0,9276

y = 2,6145x + 1R² = 0,9259

y = 1,4884x + 1R² = 0,9525

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6

[HA

P] t

ota

le/[

HA

P] l

ibre

[COD] en mg/L

Benzo[a]pyrène

individuel

mélange 4 HAP

mélange 16 HAP

y = 2482xR² = 0,267

y = 28583xR² = 0,7614

0,0E+00

5,0E+04

1,0E+05

1,5E+05

2,0E+05

0 1 2 3 4 5[HA

P] M

OD/ [C

OD

] (µ

g/k

g)

[HAP]libre (µg/L)

Phénanthrène

16 HAP équimassique

16 HAP milieu naturel

y = 10324xR² = 0,6652

y = 86110xR² = 0,9598

0,0E+00

5,0E+04

1,0E+05

1,5E+05

2,0E+05

2,5E+05

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5[HA

P] M

OD/ [C

OD

] (µ

g/k

g)

[HAP]libre (µg/L)

Fluoranthène



y = 79529xR² = 0,947

y = 173695xR² = 0,1108

0,0E+00

5,0E+04

1,0E+05

1,5E+05

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0[HA

P] M

OD/ [C

OD

] (µ

g/k

g)

[HAP]libre (µg/L)

Chrysène



y = 488336xR² = 0,8773

y = 2E+06xR² = 0,9312

0,0E+00

5,0E+04

1,0E+05

1,5E+05

2,0E+05

2,5E+05

3,0E+05

3,5E+05

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5[HA

P] M

OD/ [C

OD

] (µ

g/k

g)

[HAP]libre (µg/L)

Benzo[a]pyrène



Figure 31. Représentation de Stern-Volmer des interactions HAP - acide humique Aldrich.

Figure 32. Isothermes d’association des HAP avec la MOD dans 2 mélanges de 19 HAP : ■ avec chaque HAP

en concentration équivalente, avec des concentrations plus abondantes en HAP de faibles poids moléculaires

par rapport aux HAP de hauts poids moléculaires, dans le but de mimer un environnement aqueux naturel.


250

Pour les 4 HAP, les KDOC sont plus grands lorsque les HAP légers sont majoritaires dans le

mélange. Ceci pourrait signifier que les HAP lourds ont des interactions plus fortes et plus spécifiques

avec la MOD et que les HAP légers ne pourraient occuper ces sites qu‘en leur absence. Ainsi dans le

mélange où les HAP lourds sont minoritaires, les 4 HAP pourraient occuper plus de sites sur la MOD

et des sites avec potentiellement des énergies plus fortes donnant alors des valeurs de KDOC plus

élevées. D‘autre part, les courbes qui modélisent au mieux les points dans ces deux figures ne

semblent pas être des droites (voir publication n°3), ce qui irait également dans le sens de la non-

linéarité des interactions.

En considérant l‘impact de la présence des autres HAP sur les interactions avec la MOD, les

expériences par SPME-GC-MS qui suivent ont été réalisées en essayant de garder des

concentrations en HAP deutérés constantes et les plus faibles possibles.

II.2. Interactions HAP – acide humique Aldrich étudiées par extinction de fluorescence

La spectrofluorimétrie a également été utilisée pour quantifier les interactions grâce à

l‘extinction de fluorescence des HAP observée lors d‘ajout croissant de MOD. Cette technique a

également permis la mesure de la cinétique des interactions. La Figure 33 montre que les interactions

atteignent l‘équilibre après quelques heures aussi bien pour les composés lourds que les légers. C‘est

pourquoi tous les échantillons ont été fabriqués la veille de leur analyse.

0

20

40

60

80

100

120

0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 1650

temps (min)

Inte

nsit

é d

e f

luo

rescen

ce (

%) Phe BaP

Figure 33. Suivi de la cinétique des interactions par extinction de fluorescence. L’intensité est exprimée en

pourcentage par rapport au T0. Pour la cinétique du phénanthrène : [Phe] = 2 µg.L-1

et [COD] = 1,5 mg.L-1

,

pour la cinétique du benzo[a]pyrène : [BaP] = 1 µg.L-1

et [COD] = 0,8 mg.L-1

.


251

Comme le montrent les résultats développés dans la publication n°3, les KDOC obtenus par

extinction de fluorescence sont supérieurs à ceux obtenus par SPME. La différence expérimentale

fondamentale entre les deux techniques réside dans la température de l‘échantillon. En effet, lors des

expériences par spectrofluorimétrie, l‘échantillon est thermostaté à 20 °C alors que par SPME

l‘échantillon est thermostaté à 40 °C. Pour des raisons techniques, il n‘a pas été possible d‘augmenter

la température du spectrofluorimètre ni de descendre la température de la SPME en dessous de

30 °C. Cependant, les KDOC ont été mesurés par SPME à 30 °C pour estimer l‘influence de la

température sur les interactions.

II.3. Effet de la température sur les interactions

La Figure 34 montre que la température a un effet important sur les KDOC qui sont en moyenne

le double à 30 °C par rapport à 40 °C.

0E+00

1E+06

2E+06

3E+06

4E+06

5E+06

6E+06

7E+06

8E+06

9E+06

1E+07

N

Acy

Acé Flu

Phe An

DB

T

Fluo Pyr

BaA

Chry

BbF

BeP

BaP Per IP BP

Dah

A

KD

OC (

mL

.g-1

)

30°C

40°C

Grâce à la relation de Van‘t Hoff (4.1), ces expériences peuvent permettre de déterminer les

enthalpies standards de réaction (rH°) caractéristiques des interactions.

12

12

T/1T/1

)K/Kln(RrH

(4.1)

(avec K1 et K2 les constantes d‘équilibre aux températures T1 et T2 respectivement).

Figure 34. Effet de la température d’extraction sur les KDOC mesurés par SPME-GC-MS. Les KDOC du

naphtalène au pyrène ont été multipliés par 10 pour une meilleure visibilité.


252

Les valeurs de rH° pour tous les HAP varient de – 45 à – 120 kJ.mol-1

avec une moyenne de

– 73 kJ.mol-1

. Cette variation d‘enthalpie standard avec la température est supposée être du même

ordre de grandeur mais de sens opposé que la variation d‘enthalpie due à la variation de la solubilité

aqueuse des HAP (Schwartzenbach et al. 1993). En effet, la diminution des interactions avec

l‘augmentation de la température serait directement liée à l‘augmentation de la solubilité des

contaminants dans l‘eau. Quelques articles ont montré que rH° varie environ de – 20 à – 40 kJ.mol-1

et que l‘enthalpie due à la solubilité des HAP dans l‘eau est en moyenne de 38 kJ.mol-1

(He et al.

1995, Lüers et ten Hulscher 1996). Nos valeurs sont supérieures en valeur absolue d‘environ un

facteur 2. Ceci est peut-être dû à l‘utilisation de l‘acide humique Aldrich qui pourrait avoir des

propriétés différentes des autres MOD étudiées dans la littérature (matières organiques issues de

sols, de lave et de sédiments pour les travaux cités précédemment). Il serait imprudent d‘extrapoler

les valeurs de KDOC à 20 °C pour les comparer à celles obtenues par extinction de fluorescence mais il

est tout de même certain qu‘une température plus élevée en SPME provoque une diminution des

KDOC. Celle-ci pourrait donc être responsable des différences entre les deux techniques. D‘autre part,

la présence d‘étalons internes en SPME peut également entraîner une diminution des KDOC par

rapport à la technique de l‘extinction de fluorescence pour laquelle ils ne sont pas présents. En effet,

des effets de compétition avec les HAP ont pu être induits lors de l‘ajout des HAP deutérés diminuant

ainsi les valeurs des KDOC des HAP natifs lors de l‘analyse par SPME-GC-MS.

Nous avons également essayé de développer une troisième technique d‘analyse des

interactions : la dialyse.

II.4. Interactions HAP – acide humique Aldrich étudiées par dialyse

Cette technique aurait pu permettre d‘effectuer des mesures de KDOC à 20 °C et à 40 °C et de

les comparer aux valeurs obtenues avec les deux autres techniques. Cependant, des tests

préliminaires effectués dans le but de déterminer le temps nécessaire aux HAP pour atteindre

l‘équilibre en concentrations des deux côtés de la membrane ont montré une adsorption sur cette

membrane supérieure à 90 % pour les HAP les plus lourds. Des membranes de seuil de coupure plus

élevé (1000 Da au lieu de 500 Da) ont été testées mais n‘ont pas permis l‘amélioration des

rendements ; cette technique n‘a donc pas pu être appliquée à l‘étude des interactions HAP-MOD.

III. Effets des paramètres environnementaux sur les interactions HAP – MOD

(publication n°4)

Les paramètres environnementaux ayant des effets sur les interactions ont été recherchés au

moyen de plans d‘expériences pour différentes sortes de MOD. Quatre paramètres ont été étudiés –

le pH, la salinité, les concentrations en COD et en HAP – pour trois MOD d‘origine différente – l‘acide

humique Aldrich (AHA), une eau de rivière (RW) et de la MOD issue de culture d‘algues (AC). Les

résultats sont rassemblés dans la publication n°4. Ces 3 types de MOD ont été sélectionnés pour


253

leurs propriétés de fluorescence différentes et très typiques de matériel humique fortement humifié

(AHA), d‘eau naturelle composée majoritairement d‘acides fulviques et d‘une faible composante de

macromolécules de type protéines (RW) ainsi que de matériel organique frais d‘origine algale (AC).

Les bandes de fluorescence caractéristiques de ces 3 MOD ont des positions et des valeurs

maximales d‘intensité qui diffèrent fortement (Figure 35).

III.1. Effet de la nature de la MOD sur les interactions HAP-MOD

Dans un premier temps, la force des interactions a été comparée à la nature de la MOD

(Figure 36). Les valeurs moyennes des KDOC montrent, que, comme déjà décrit dans la littérature,

l‘acide humique Aldrich s‘associe plus fortement aux HAP que la MOD d‘origine naturelle. Cependant,

la MOD issue de la culture algale peut également former des interactions assez fortes avec les HAP

les plus lourds (seulement un facteur 2 par rapport aux KDOC de AHA). Quant à l‘eau de rivière, elle a

des interactions un peu plus fortes avec les HAP de plus faibles poids moléculaires que l‘échantillon

AC mais ses interactions restent faibles par rapport à AHA pour tous les HAP (il y a en moyenne un

facteur 15 entre les KDOC de RW et de AHA). Les eaux de rivière étant (d‘après la littérature)

majoritairement composées d‘acides fulviques, ceux-ci interagissent certainement avec les HAP, peut-

être majoritairement avec les plus légers d‘entre eux. Les fortes interactions observées avec la MOD

Bande α' - λexcitation = 250 nm

0E+00

5E+05

1E+06

2E+06

2E+06

3E+06

3E+06

4E+06

270 370 470 570

Longueurs d'onde d'émission (nm)

inte

ns

ité

de

flu

ore

sc

en

ce

AHA

RW

AC

Bande γ - λexcitation = 280 nm

0E+00

5E+05

1E+06

2E+06

2E+06

3E+06

3E+06

300 350 400 450 500


inte

ns

ité

de

flu

ore

sc

en

ce AHA

RW

AC

Bande β - λexcitation = 310 nm

0E+00

2E+05

4E+05

6E+05

8E+05

1E+06

1E+06

320 370 420 470 520 570


inte

ns

ité

de

flu

ore

sc

en

ce AHA

RW

AC

Bande α - λexcitation = 370 nm

0E+00

1E+05

2E+05

3E+05

4E+05

5E+05

6E+05

7E+05

8E+05

9E+05

390 440 490 540 590 640 690


inte

ns

ité

de

flu

ore

sc

en

ce

AHARWAC

Figure 35. Spectres de fluorescence des 4 bandes α’, γ, β et α des 3 MOD étudiées par la méthode des plans

d’expériences. Les intensités sont exprimées en unités arbitraires et ont été normées par la concentration en

COD ; les spectres de AC ont tous été multipliés par 10 pour être visibles sur ces graphes.


254

d‘origine algale montre que le matériel frais et faiblement humifié peut également interagir avec les

HAP, surtout avec les plus lourds.

0

1

2

3

4

5

6

7

Acy

Ace

Flu

Ph

e

An

DB

T

Flu

o

Pyr

Ba

A

Ch

ry

Bb

F+

BkF

Be

P

Ba

P

Pe

r

log

KD

OC

AHA RW AC

Figure 36. Valeurs moyennes des log KDOC pour les échantillons correspondant aux points centraux (n = 5) des

plans d’expériences pour les 3 types de MOD.

Si l‘on compare les KDOC aux valeurs des indices caractéristiques obtenus par spectroscopie

d‘absorption UV-visible, il semblerait que les interactions avec les HAP lourds soient plutôt corrélées

négativement avec le rapport E2/E3 alors que les interactions avec les HAP légers semblent plus

corrélées à l‘aromaticité et/ou à E4/E6. De la même façon pour les indices obtenus par spectroscopie

de fluorescence, les interactions semblent corrélées avec les indices HIX et ‘/ mais les interactions

des HAP lourds semblent augmenter avec les indices / et BIX. Il serait cependant nécessaire

d‘étudier les interactions sur un plus grand nombre d‘échantillons de MOD pour établir une relation

entre les KDOC et les indices caractéristiques de la MOD.

AHA RW AC

’/ 2,9 2,6 2,0

/ 0,1 0,5 9,0

HIX 45,6 11,6 0,9

BIX 0,3 0,5 1,0

f450/f500 0,7 1,0 1,4

E2/E3 2,5 4,5 2,7

E4/E6 4,6 4,4 1,7

% aromaticité 45 25 9

Tableau 12. Valeurs des indices et des rapports calculés par spectroscopies pour les échantillons correspondant

aux points centraux des plans d’expériences.

Les effets des paramètres physico-chimiques environnementaux ont ensuite été examinés

afin d‘essayer de mettre en relation les variations de KDOC avec les variations des indices permettant

la caractérisation des propriétés optiques de la MOD (Tableau 13).


255

Paramètres

environnementaux

Type de

MOD

Effet sur les interactions

HAP-MOD (valeurs des

KDOC)

Effets sur la MOD (valeurs des

indices UV-visible et fluorescence)

+ - + -

pH

AHA HAP lourds E2/E3

RW plupart des

HAP SUVA, HIX, ‘, E2/E3

AC Pas d‘effet significatif E4/E6, SUVA, /,

E2/E3, E4/E6, ’/,

f450/f500

Concentration en

COD

AHA HAP légers E4/E6, SUVA, HIX ‘/, f450/f500

RW tous HAP E2/E3, E4/E6, HIX,

‘, , , f450/f500

SUVA, HIX,

f450/f500, ’/,/,

AC tous HAP

E2/E3, E4/E6,

SUVA, HIX, ‘, ,

Concentration en

HAP

AHA Pas d‘effet significatif

RW Pas d‘effet significatif

AC tous HAP

Salinité

AHA Pas d‘effet significatif Pas d‘effet significatif

RW Pas d‘effet significatif Pas d‘effet significatif

AC Pas d‘effet significatif Pas d‘effet significatif

Tableau 13. Effet des paramètres environnementaux sur les interactions HAP-MOD et sur les propriétés

optiques de la MOD. Les colonnes notées + représentent un effet positif (qui va dans le sens d’une augmentation

de l’effet lors de l’augmentation du paramètre environnemental), les colonnes notées - représentent un effet

négatif (qui va dans le sens d’une diminution de l’effet lors de l’augmentation du paramètre environnemental),

les effets indiqués en italique dépendent de plusieurs paramètres environnementaux simultanément.

III.2. Effet de la salinité sur les interactions HAP-MOD

Pour les 3 types de MOD étudiés, la salinité n‘avait d‘influence ni sur les KDOC ni sur les

paramètres optiques de la MOD (Tableau 13). Dans la littérature, il a déjà été observé une diminution

des KDOC quand la salinité augmente (Schlautman et Morgan 1993) et l‘effet contraire (Gauthier et al.

1986). Le premier avait été attribué à un changement de configuration de la MOD avec la salinité alors

que le deuxième serait plutôt dû à la modification de la solubilité aqueuse des HAP à cause de « l‘effet

de sel ». Il est possible qu‘ici ces deux effets soient très faibles, n‘entraînant de modification visible ni

des interactions ni des propriétés de la MOD.

III.3. Effet de la concentration en HAP sur les interactions HAP-MOD

En ce qui concerne l‘effet de la concentration en HAP, celle-ci n‘a montré une influence sur les

interactions que pour l‘échantillon issu de la culture d‘algue (AC). Ces résultats semblent être en


256

désaccord avec ceux obtenus précédemment pour l‘acide humique Aldrich où une compétition entre

les HAP avait pu être mise en évidence (publication n°3). Cependant, la gamme de concentrations

étudiée par les plans d‘expériences était beaucoup plus étroite et correspondait au domaine linéaire

des résultats précédents, excepté justement pour l‘échantillon AC. Ceci confirmerait donc la non-

linéarité et la compétition des HAP vis-à-vis de la MOD.

III.4. Effet du pH et de la concentration en COD sur les interactions HAP-MOD

Concernant les effets du pH et de la concentration en COD, ceux-ci sont plus complexes

puisqu‘ils dépendent des HAP, de la nature de la MOD et peuvent être interdépendants. D‘un point de

vue général, les KDOC augmentent lorsque la concentration en MOD et le pH diminuent. D‘autre part,

le pH a généralement plus d‘effet sur les HAP de hauts poids moléculaires alors que la concentration

en COD a plus d‘effet sur les HAP de faibles poids moléculaires. Ces observations correspondent

parfaitement au comportement de l‘acide humique Aldrich. Pour l‘eau de rivière, la concentration en

COD a un effet significatif même sur les interactions des HAP les plus lourds et le pH a un effet sur la

plupart des HAP. Pour la MOD d‘origine algale, le pH n‘a d‘effet sur les interactions avec aucun des

HAP.

Le pH et la concentration en COD peuvent difficilement induire une modification des

propriétés des HAP. Les effets de ces paramètres sur les propriétés optiques de la MOD ont donc été

examinés afin de déterminer s‘il existe une corrélation entre les effets sur la MOD et les effets sur les

interactions.

III.5. Effet du pH et de la concentration en COD sur les propriétés optiques de la MOD

III.5.1. Acide humique Aldrich

Une variation de pH de 5 à 9 n‘a modifié que faiblement les propriétés optiques de AHA. Seul

l‘indice spectroscopique E2/E3 a augmenté lors de la diminution du pH, impliquant une diminution de

l‘aromaticité et/ou du poids moléculaire de la MOD. Or les indices correspondant à l‘aromaticité

(SUVA et pourcentage d‘aromaticité calculé à 280 nm) et E4/E6 inversement proportionnel au poids

moléculaire moyen n‘ont pas montré de variation significative. Aucun des indices de fluorescence ne

variant significativement, il a donc été impossible de conclure sur un éventuel effet du pH sur AHA

même si la protonation des macromolécules a contribué à l‘augmentation des KDOC des HAP lourds.

Lors de la dilution de l‘acide humique Aldrich, l‘indice HIX, l‘aromaticité et le rapport E4/E6

diminuent alors que l‘indice f450/f500 augmente. A forte concentration en COD, on peut supposer que,

de par le manque d‘espace disponible entre les macromolécules, celles-ci se sont agglomérées entre

elles augmentant ainsi l‘aromaticité globale des macromolécules. La taille des macromolécules serait

alors plus importante quand la concentration en COD augmente, comme le traduit effectivement la

diminution du paramètre f450/f500 due à un déplacement de la bande vers les plus grandes longueurs


257

d‘onde (caractéristique des molécules de plus hauts poids moléculaires). Seul le rapport E4/E6 montre

une tendance inverse, ce qui laisse penser que cet indice n‘est peut-être pas adapté à la

caractérisation de la structure conformationnelle de la MOD. D‘après les résultats obtenus pour les

interactions, une augmentation de taille et d‘aromaticité de la MOD ne serait pas liée aux interactions

de la MOD avec les HAP de hauts poids moléculaires et serait défavorable aux interactions avec les

HAP de faibles poids moléculaires. Comme l‘a fait penser l‘effet du pH, les HAP n‘ont donc peut-être

pas les interactions les plus fortes avec les noyaux aromatiques. Cette hypothèse peut sembler peu

probable étant donné qu‘un assez grand nombre d‘articles (e. g. Chin et al. 1997, Hur et Kim 2009,

Perminova et al. 1999) a mis en évidence une corrélation positive entre l‘aromaticité et les KDOC des

HAP. Cependant, Kopinke et al. (2001) ont montré que l‘aromaticité n‘était pas le facteur déterminant

pour les interactions avec les HAP et que la flexibilité des macromolécules pourrait être un facteur tout

aussi voire plus important pour ces interactions. Ainsi, l‘agrégation des macromolécules a pu

engendrer une perte de flexibilité de celles-ci, ce qui pourrait avoir engendré une diminution des

valeurs de KDOC.

III.5.2. MOD d’origine algale

Bien que les interactions des HAP avec AC ne soient pas significativement influencées par le

pH, les propriétés optiques de la MOD le sont fortement. Ainsi, les intensités de fluorescence de

toutes les bandes caractéristiques sont fortement diminuées à faible pH ainsi que l‘aromaticité des

macromolécules (traduite par le pourcentage d‘aromaticité et le SUVA). La composition de cette MOD

fraîche est certainement responsable de ces effets qui ne sont observés pour les autres MOD que

pour la bande γ de l‘eau de rivière. Cette bande constituée de macromolécules de type protéines peut

être composée majoritairement de groupes fonctionnels phénoliques, qui sont des molécules très

sensibles aux variations de pH (Senesi 1990). La protonation des groupements phénols pourraient

également expliquer une diminution de l‘aromaticité puisque celle-ci induit une diminution du

coefficient d‘extinction molaire (Goldschmid 1954). Les groupements phénoliques pourraient donc être

les fluorophores majoritaires de l‘échantillon AC mais ne seraient pas les molécules les plus réactives

vis-à-vis des HAP, ce qui expliquerait la faible dépendance des interactions vis-à-vis du pH.

La concentration en COD, quant à elle, modifie les KDOC des HAP de faibles poids

moléculaires de façon significative et a également un effet sur les propriétés optiques de la MOD.

L‘augmentation de la concentration en COD induit une diminution de l‘intensité de fluorescence

indiquant certainement une désexcitation non radiative des états excités par collisions entre les

macromolécules. Les rapports E2/E3 et E4/E6 diminuent quand la concentration augmente, indiquant

une augmentation de la taille des macromolécules ainsi que de l‘aromaticité et/ou une diminution de la

concentration en molécules d‘oxygène. Cependant, étant donné que le SUVA varie dans le sens

opposé, on peut supposer que la variation du rapport E2/E3 est uniquement due au changement de

taille de la MOD. Il est ainsi possible que les macromolécules ayant des groupements oxygénés aient

réagi entre elles pour former des agrégats plus gros contenant moins d‘atomes d‘oxygène et que ces

agrégats soient moins favorables aux HAP de faibles poids moléculaires.


258

III.5.3. MOD d’eau de rivière

Pour l‘eau de rivière, les effets du pH et du COD sont entièrement dépendants l‘un de l‘autre.

Lorsque le pH est faible et la concentration en COD élevée, il semblerait que les macromolécules

soient complètement repliées sur elles-mêmes comme le suggèrent les plus fortes valeurs de E2/E3,

E4/E6, f450/f500 et les variations d‘intensité des bandes de fluorescence. Ce repliement intramoléculaire

pourrait alors défavoriser les interactions avec les HAP quelque soit leur taille. Lorsque la

concentration en COD diminue, toujours à pH faible, les macromolécules pourraient avoir plus de

place pour se développer et présenter des cavités propices aux interactions avec les HAP, puisque

tous les HAP ont des KDOC plus élevés dans ces conditions. Lorsque le pH est élevé, les

macromolécules ionisées empêchent le repliement intramoléculaire mais à forte concentration il est

possible, malgré la répulsion entre les charges, qu‘il y ait une agrégation intermoléculaire comme le

suggère la diminution de l‘indice f450/f500 lorsque la concentration augmente. Cependant, quelle que

soit la structure de la MOD, l‘ionisation des macromolécules engendrerait des valeurs de KDOC

beaucoup plus faibles.

L‘effet des paramètres environnementaux dépend donc fortement de la nature de la MOD et

des HAP étudiés. L‘absorption UV-visible et la fluorescence n‘ont ici pas permis de conclure

formellement sur les effets des paramètres environnementaux sur la structure des macromolécules,

mais les tendances de certains indices caractéristiques ont pu permettre d‘établir certaines

hypothèses qu‘il serait intéressant de vérifier par d‘autres techniques.

IV. Étude des interactions HAP – MOD dans le milieu naturel (publication n°5)

Les interactions HAP-MOD ont ensuite été étudiées directement dans le milieu naturel. Ainsi

ces interactions ont été examinées dans des eaux interstitielles de sédiments du Bassin d‘Arcachon

(publication n°5).

IV.1. Développement des extractions d’eaux interstitielles

L‘étape de centrifugation (9000 g, 11 min, 15 °C), nécessaire pour l‘extraction de l‘eau

contenue dans les sédiments, s‘est avérée être plus problématique que prévu à cause de l‘adsorption

des HAP sur les tubes couramment utilisés avec cette technique. En effet, les rendements ont été

mesurés par SPME-GC-MS pour des tubes à centrifuger en polypropylène sur des eaux

supplémentées à des concentrations en HAP équivalentes à celles que l‘on peut trouver dans les

eaux interstitielles naturelles (environ 10 ng.L-1

par HAP). La Figure 37 montre que les HAP de hauts

poids moléculaires sont perdus lors de l‘extraction et que les HAP de faibles à moyens poids

moléculaires ont des rendements de 10 à 65 %. Afin d‘améliorer ces rendements, plusieurs types de

tubes en verre et en polycarbonate (Nalgène) ont été testés sur des eaux supplémentées en 4 HAP.

Les rendements sont nettement meilleurs, surtout pour les tubes en verre (Figure 38). Cependant, ces

derniers ont posé des problèmes de casse lors de la centrifugation et n‘ont pas pu être finalement


259

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

N

Acy

Ace

Flu

Ph

e

An

DB

T

Flu

o

Pyr

Ba

A

Ch

rys

2,1

BN

T

Bb

F +

BkF

Ba

F

Be

P

Ba

P

Pe

r

IP BP

Da

hA

air

es

SP

ME

-GC

-MS

sans étape de centrifugation

avec étape de centrifugation

utilisés. D‘autre part, comme le montrent les résultats pour les tubes en verre Duran (d‘une

contenance de 50 mL) et Kimble (d‘une contenance de 25 mL) remplis de 20 mL d‘échantillon, plus le

tube est rempli, meilleurs sont les rendements. Ceci a été vérifié sur les tubes Nalgène qui, remplis

de 50 mL d‘eau supplémentée à 60 ng.L-1

, donnent des rendements de 40 à 100 %. Pour un

échantillon de sédiment l‘extraction a été faite grâce à des tubes en verre et des tubes Nalgène et

ces derniers ont montré des rendements allant de 60 à 100 % par rapport à ceux obtenus avec les

tubes en verre. Les tubes Nalgèneont donc été utilisés par la suite pour les échantillons naturels et

ont été bien remplis afin de limiter au maximum l‘adsorption des HAP sur les parois.

Figure 37. Comparaison des aires des HAP avec et sans étape de centrifugation pour des tubes à centrifuger en

polypropylène.


260

0

20

40

60

80

100

120

Phe Fluo Chrys BaP

ren

dem

en

ts (

%)

tubes 50 mL (Duran)

tubes 25 mL (Kimble)

tubes 50 mL (Nalgène)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

N Acy Ace Flu Phe An DBT Fluo Pyr BaA Chrys

ng

.L-1

tube Nalgène

fiole récupératrice

unité de filtration

filtre

bécher contenant l'eau ultrapure

eau ultrapure

Étant donné que les tubes Nalgène ne peuvent pas être calcinés, des blancs faits dans l‘eau

ultrapure ont été réalisés pour vérifier qu‘il n‘y avait pas de contamination en HAP. Chaque étape de

l‘extraction a finalement été examinée et leur apport en HAP est reporté Figure 39.

Il en ressort une contamination faible en HAP de la part des tubes à centrifuger mais

beaucoup plus importante pour les fioles. La contamination globale est d‘ailleurs plus importante que

les concentrations rencontrées dans les échantillons (généralement inférieures à 10 ng.L-1

) et laissent

Figure 38. Rendements en HAP après l’étape de centrifugation. Volume d’eau supplémentée : 20 mL,

concentration en HAP : environ 100 ng.L-1

chacun.

Figure 39. Concentrations en HAP quantifiées lors de l’extraction d’eau ultrapure selon le protocole d’extraction

des eaux interstitielles. Volume d’eau extrait : 200 ml.


261

penser que la réalisation de blancs avec de l‘eau ultrapure, contenant un minimum de HAP légers,

n‘est pas appropriée. Toutefois, une partie des HAP de faibles poids moléculaires retrouvée dans les

échantillons pourrait être due à une contamination de la vaisselle malgré toutes les précautions prises.

Afin de minimiser ces effets, un maximum de sédiment a donc été extrait pour chaque échantillon afin

de maximiser le volume d‘eau interstitielle extraite pour diminuer la contribution en HAP due à la

verrerie.

IV.2. Dosage des HAP dans les eaux interstitielles du Bassin d’Arcachon

Le dosage des HAP dans les eaux interstitielles du Bassin d‘Arcachon a montré une très

faible contamination en HAP pour tous les échantillons issus de divers prélèvements à des moments

et des endroits différents. Les sédiments prélevés dans les ports de La Teste et d‘Arcachon montrent

également de faibles concentrations, sauf celui échantillonné près du chantier naval dans le port

d‘Arcachon. Ce dernier montre d‘ailleurs une composition en HAP originale avec une absence de HAP

de faibles poids moléculaires (suggérant une origine pyrolytique, Soclo et al. 2000) et une

concentration en pyrène largement supérieure à celle du fluoranthène (indiquant une origine

pétrogénique, Soclo et al. 2000). Les autres échantillons semblent majoritairement issus de

phénomènes pyrolytiques (rapport de concentrations fluoranthène / pyrène 1), avec une

prédominance des HAP de 2 à 4 cycles aromatiques due à la meilleure solubilité aqueuse de ces

composés par rapport aux HAP de plus hauts poids moléculaires. D‘autre part, l‘absence de traces

d‘acénaphtylène, de fluorène, de phénanthrène et d‘anthracène dans l‘échantillon du chantier naval

confirme que, malgré les résultats des blancs effectués sur l‘eau ultrapure, la contamination due à la

verrerie n‘est pas significative pour les échantillons naturels.

IV.3. Caractérisation de la MOD des eaux interstitielles du Bassin d’Arcachon

L‘étude des spectres 3D de la MOD a permis de mettre en évidence différentes origines des

macromolécules selon l‘endroit et le moment du prélèvement. La plupart des échantillons ont une

bande γ caractéristique de macromolécules récentes non humifiées et celle-ci est plus intense pour

les échantillons prélevés au printemps. Cette MOD peut avoir une origine végétale due au

phytoplancton et/ou aux herbiers ou une origine microbienne. Certains échantillons ont une très faible

composante γ et sont majoritairement constitués de substances humiques donnant des spectres de

fluorescence caractéristiques de MOD d‘origine terrigène. C‘est notamment le cas des échantillons

prélevés à l‘extérieur du port d‘Arcachon et au niveau de la cale d‘embarquement du port de La Teste.

Les spectres 3D dépendent également de la saison puisque les échantillons prélevés en hiver ont des

spectres moins intenses que ceux prélevés en été. Cependant, la variabilité spatiale étant très

importante, il est difficile de commenter la variabilité temporelle étant donné que les prélèvements

n‘ont pas tous été faits au même endroit d‘une saison à l‘autre.


262

y = 0,483x + 2,1992

R2 = 0,8872

y = 1,0036x - 0,8574

R2 = 0,8442

0

1

2

3

4

5

6

3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7

log Kdoc

log Kow

Les Jacquets

Arès

IV.4. Étude des interactions HAP-MOD dans les eaux interstitielles du Bassin d’Arcachon

La plupart des échantillons ont permis de mettre en évidence des interactions entre la MOD et

les HAP présents initialement dans l‘échantillon. Ces interactions sont surtout visibles pour le

fluoranthène et le pyrène qui étaient présents dans tous les échantillons, alors que les HAP plus

lourds sont toujours en limite de détection lorsqu‘ils sont détectés et les HAP plus légers ont de plus

faibles interactions avec la MOD. Pour certains échantillons dont plusieurs HAP ont pu être détectés, il

a pu être observé une relation linéaire entre les KDOC et les KOW (Figure 40), ce qui implique une

corrélation entre le caractère hydrophobe des HAP et leur affinité pour la MOD naturelle. Une telle

relation avait d‘ailleurs également été observée avec l‘acide humique Aldrich (publication n°3).

Des relations entre les KDOC et les paramètres optiques de la MOD des échantillons ont été

recherchées pour le fluoranthène et le pyrène. La corrélation la plus forte est négative et a été

obtenue entre les KDOC et les valeurs de HIX. Comme précédemment évoqué, il semblerait que les

macromolécules les plus humifiées et les plus aromatiques ne donnent pas les interactions les plus

fortes avec les HAP (Figure 41). Il existe également une corrélation négative entre l‘intensité de

fluorescence de la bande ‘ normalisée par la concentration en COD, confirmant qu‘une plus grande

abondance de substances humiques ne signifie pas que les interactions sont plus fortes et qu‘il

semblerait que ce soit le contraire. La corrélation positive avec le rapport / confirme d‘ailleurs qu‘une

forte contribution en matériel organique frais est favorable aux interactions avec les HAP. Concernant

le rapport ‘/, une faible corrélation négative a été observé avec le KDOC mais tous les points sont

situés sur une gamme très faible de valeurs (2-2,5) sauf Grand Banc (à 1,1) qui semble en grande

partie responsable de la pente négative.

Figure 40. Corrélation entre les log KDOC et les log KOW des HAP présents dans les eaux interstitielles du Bassin

d’Arcachon


263

y = 1573,3x + 10374R² = 0,3337

y = 2306,3x + 9822,6R² = 0,4928

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 1 2 3 4 5 6 7 8

KD

OC

(mL

.g-1

)

/

fluoranthène

pyrène

y = -0,0072x + 19050R² = 0,3201

y = -0,011x + 22828R² = 0,5132

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 5 10 15 20

KD

OC

(mL

.g-1

)

'/[COD]

fluoranthènepyrène

y = -869,56x + 18617R² = 0,499

y = -1266,7x + 21866R² = 0,7277

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 2 4 6 8 10 12 14 16

KD

OC

(m

L.g

-1)

HIX

fluoranthène

pyrène

y = -136,83x + 18416R² = 0,2357

y = -221,69x + 22238R² = 0,4253

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 10 20 30 40 50 60 70 80

KD

OC

(mL

.g-1

)

aromaticité (%)

fluoranthène

pyrène

Il a été vérifié que les faibles valeurs de HIX des échantillons donnant le plus d‘interactions

n‘étaient en fait pas dues à une association avec les HAP. En effet, si l‘association avec les HAP

engendre une diminution de la fluorescence, il est possible que les faibles valeurs de HIX soient dues

à ces interactions et non aux propriétés d‘humification de la MOD. Afin de savoir si les valeurs de HIX

varient lorsque les HAP sont associés à la MOD, des expériences d‘extinction de fluorescence ont été

réalisées sur deux échantillons : l‘un avec un fort HIX et une bande γ peu intense (échantillon

extérieur du port d‘Arcachon de mai 2009) et l‘autre avec un faible HIX et une bande γ très intense (île

aux oiseaux de décembre 2008). Les valeurs de HIX ont été calculées pour des concentrations en

HAP de 10, 50, 100 et 500 ng.L-1

. Même si des interactions ont pu être mises en évidence par

extinction de fluorescence de la MOD lors d‘ajout des HAP, les valeurs de HIX restent constantes :

lors d‘un ajout jusqu‘à 50 ng.L-1

de HAP, les valeurs de HIX varient de 14,4 à 14,2 et de 4,1 à 4,0 pour

les échantillons du port d‘Arcachon et de l‘île aux oiseaux respectivement. A partir de 100 ng.L-1

, la

fluorescence des HAP est largement supérieure à celle de la MOD et il n‘est donc plus possible de

mettre en œuvre cette approche. Les faibles valeurs de HIX des échantillons présentant les

interactions les plus fortes avec les HAP ne seraient donc pas dues à ces interactions mais bien au

degré d‘humification de la MOD.

Ces expériences ont également permis de comparer les résultats de KDOC obtenus par

extinction de fluorescence avec ceux de SPME-GC-MS d‘un point de vue qualitatif en ce qui concerne

l‘effet de la contribution du matériel organique frais et de la bande γ sur la force des interactions.

Même si l‘extinction de fluorescence de la MOD par les HAP était faible pour les deux échantillons,

Figure 41. Corrélations entre les KDOC et le HIX, le pourcentage d’aromaticité, le rapport ’/[COD] et le rapport

/ dans les eaux interstitielles du Bassin d’Arcachon.


264

elle était plus marquée pour l‘échantillon de l‘île aux oiseaux (Figure 42), correspondant à la MOD la

moins humifiée, ce qui confirme les résultats obtenus par SPME-GC-MS. Cependant, pour ce dernier

échantillon, la fluorescence des HAP est supérieure à celle de la MOD assez rapidement lors de

l‘ajout des HAP et il est donc plus approprié de regarder l‘extinction de fluorescence des HAP par la

MOD. La Figure 43 confirme ainsi les interactions assez fortes qu‘il existe entre les HAP et cette

MOD.

V. Étude des interactions substances pharmaceutiques – MOD (publication n°6)

Un deuxième volet de ces travaux a été consacré à l‘étude des interactions de la MOD avec

des substances pharmaceutiques, et plus particulièrement des benzodiazépines. Ces interactions ont

été étudiées par extinction de fluorescence et par SPME-GC-MS. Ces techniques déjà développées

pour les HAP ont dû être adaptées pour leur application aux substances pharmaceutiques.

L‘extraction sur phase solide (SPE) a également été utilisée pour vérifier les concentrations en

médicaments des échantillons par une technique déjà validée. Les interactions benzodiazépines -

MOD ont été étudiées avec quatre types de MOD : l‘acide humique Aldrich, une eau de rivière

(prélevée à La Réole dans la Garonne et concentrée par osmose inverse), une eau marine (prélevée

à Toulon dans la Mer Méditerranée et concentrée par nanofiltration et osmose inverse, Huguet 2007)

et une eau interstitielle (extraite d‘un sédiment marin du Bassin d‘Arcachon).

Figure 42. Extinction de fluorescence de la MOD par les HAP pour les échantillons du port d’Arcachon et de

l’île aux oiseaux. Les concentrations en HAP sont en ng.L-1

.

Figure 43. Spectres d’extinction de fluorescence des HAP par la MOD pour l’échantillon de l’île aux oiseaux.

La longueur d’onde d’excitation est de 250 nm.


265

V.1. Caractérisation des échantillons de MOD

Ces quatre échantillons de MOD ont été caractérisés par spectroscopie UV-visible et

spectrofluorimétrie 3D (Tableau 14). L‘acide humique Aldrich est représentatif de MOD très humifiée

(forte aromaticité, HIX élevé, pas de matériel récent), les acides fulviques sont représentés par l'eau

de rivière dans laquelle ils sont majoritaires (macromolécules plus faiblement aromatiques, de plus

petite taille, très peu de matériel récent), l'eau interstitielle est caractéristique de MOD récente (bande

γ majoritaire, faible aromaticité, macromolécules de taille intermédiaire) et l'eau de mer est ici

représentative de macromolécules marines agrégées et humifiées à faible teneur en matières fraîches

(macromolécules assez grosses, faible bande γ).

MOD E2/E3 E4/E6 %

aromaticité Iα’/Iα Iγ/Iα HIX f450/f500

acide humique Aldrich

2,6 3,3 53 3,6 0,2 28,7 0,7

Eau marine 1,3 1,0 40 2,8 1,4 5,7 1,1

Eau interstitielle

3,1 2,1 14 2,6 2,8 2,7 1,2

Eau de rivière 5,6 15,6 21 2,4 0,3 15,3 1,2

Tableau 14. Indices d’absorption UV-visible et de fluorescence des différents types de MOD.

V.2. Développement de la SPME-GC-MS

La SPME-GC-MS a été développée pour la quantification des concentrations en

carbamazépine et diazépam et la détermination de leur spéciation (fraction libre vs fraction totale en

phase dissoute). De la même façon que pour les HAP, les paramètres optimaux de la SPME-GC-MS

ont été recherchés (fibre la plus sensible, température de désorption, temps d‘immersion). Comme

indiqué dans la publication n°6, les fibres en Carbowax-DVB 65 µm avec une température de

désorption de 250 °C et un temps d‘extraction de 30 min permettent d‘obtenir de bonnes conditions

d‘analyse : des limites de détection de 0,27 ± 0,08 et 0,09 ± 0,03 µg.L-1

ainsi que des variabilités

moyennes de 17 et 11 % sur les aires GC-MS (n = 3) pour la carbamazépine et le diazépam

respectivement. D‘autre part, l‘étalonnage interne par rapport à la carbamazépine d10 et au diazépam

d5 permet de diminuer cette variabilité moyenne à 15 et 5 % pour la quantification des deux

composés natifs. Contrairement aux HAP, l‘utilisation de l‘étalonnage interne par rapport au

naphtalène d8 pour la quantification de la fraction libre d‘analytes n‘apporte ici aucune amélioration

puisque la variabilité moyenne sur la quantification de la carbamazépine et du diazépam augmente

dans ce cas à 23 et 20 % respectivement. Ceci peut aisément s‘expliquer puisque le naphtalène a une

structure chimique différente des benzodiazépines et il doit se comporter différemment tout au long de

l‘analyse (vis-à-vis de la fibre SPME, de la colonne du GC, de la fragmentation par le MS…). Les

phénomènes agissant sur la variabilité analytique du naphtalène ne seraient donc pas les mêmes que


266

ceux agissant sur les benzodiazépines et aucune amélioration de la reproductibilité ne pourrait donc

être apportée par l‘utilisation du naphtalène d8. Pour vérifier la quantification des étalonnages externe

(pour la quantification de la fraction libre) et interne (pour la quantification de la fraction totale), un

échantillon pseudo-inconnu à 2 µg.L-1

a été analysé en triplicat par les deux méthodes. Pour

l‘étalonnage externe, le choix de la gamme étudiée s‘avère être très important. En effet, pour une

gamme d‘étalonnage de 0,2 à 10 µg.L-1

, la quantification du pseudo-inconnu permet l‘obtention de

rendements de 72 et 65 % pour la carbamazépine et le diazépam respectivement (Figure 44). Même

si ces gammes ont des coefficients de corrélation assez bons (R² = 0,9978 et 0,9966, n = 5), les

quantifications à partir de gammes d‘étalonnage de 1 à 10 µg.L-1

sont meilleures : rendements de 80

et 85 % (avec des coefficients de corrélation des droites d‘étalonnage de 0,9973 et 0,9999, n = 3).

Ces résultats montrent donc que pour la quantification d‘un échantillon à une concentration inconnue,

l‘étalonnage externe devra préférentiellement être fait sur deux mesures : la première afin de

déterminer une approximation de la concentration et la deuxième, par l‘utilisation d‘une gamme

d‘étalonnage assez affinée, afin d‘établir la concentration de l‘échantillon. Cependant, dans le cadre

de ces travaux, les échantillons ont été fabriqués en laboratoire. Les concentrations théoriques sont

donc connues et l‘étude des interactions avec la MOD a été faite par comparaison d‘échantillons aux

mêmes concentrations en médicaments mais avec différentes MOD en présence. Dans notre cas, la

quantification par étalonnage externe a donc pu être faite par comparaison des aires du pseudo-

inconnu avec celles d‘un triplicat d‘étalon à une concentration du même ordre. De cette façon, les

rendements obtenus sont de 108 et 98 % respectivement pour la carbamazépine et le diazépam. La

comparaison des aires entre deux échantillons de concentrations de même ordre est donc tout à fait

possible et peut permettre la quantification de la fraction libre avec une bonne justesse. En ce qui

concerne l‘étalonnage interne, les coefficients de réponses entre composés natif et deutéré

correspondant sont les mêmes sur une gamme 0,2 - 10 µg.L-1

(0,6 et 0,8 en moyenne pour la

carbamazépine et le diazépam) avec une variabilité d‘environ 5 %. Les rendements obtenus sur

l‘échantillon pseudo-inconnu à 2 µg.L-1

sont par cette méthode de 97 % pour la carbamazépine et de

104 % pour le diazépam avec des variabilités respectives de 1 et 4 % (Figure 44). L‘étalonnage

interne est donc juste et précis pour une gamme de concentrations assez large et s‘avère être la

méthode la plus adaptée à la quantification d‘un échantillon de concentration inconnue.


267

Figure 44. Rendements de quantification des benzodiazépines par SPME-GC-MS d’un pseudo-inconnu à 2

µg.L-1

par différents étalonnages (fibre Carbowax-DVB 65 µm, n = 3).

Avant l‘étude des interactions, l‘effet du pH et de la salinité ont été étudiés pour des

échantillons aqueux sans MOD pour déterminer si ces paramètres physico-chimiques affectent

l‘extraction par SPME. Les résultats présentés dans la publication n°6 montrent que tant que le pH est

supérieur à 6 et la salinité inférieure à 35, ces paramètres physico-chimiques n‘influencent pas

significativement l‘extraction par SPME. Cependant, afin d‘optimiser au maximum l‘étude des

interactions avec la MOD, les échantillons sans MOD utilisés pour comparer les aires GC-MS à ceux

contenant de la MOD ont été ajustés en pH et salinité.

V.3. Étude des interactions benzodiazépines-MOD

V.3.1. Par SPME-GC-MS

Comme indiqué dans la publication n°6, les aires GC-MS obtenues pour les échantillons sont

semblables à celles obtenues pour les blancs correspondants (eau du robinet ajustée en pH et

salinité) contenant les mêmes quantités de médicaments ; aucune interaction n‘a donc pu être mise

en évidence entre les deux benzodiazépines et les différents types de MOD. En effet, les aires étant

proportionnelles aux concentrations libres d‘analytes, en présence d‘interactions l‘ajout de MOD aurait

entraîné la diminution de la fraction libre de médicaments et les aires des échantillons (avec MOD)

auraient donc été plus faibles que celles des blancs (sans MOD). Deux hypothèses peuvent donc être

avancées : soit il n‘y a aucune interaction entre les deux médicaments et les quatre types de MOD

étudiés, soit les interactions ne sont pas suffisamment fortes pour être observées de façon

significative par cette technique. Afin de déterminer l‘hypothèse la plus probable, l‘extinction de


268

fluorescence a été appliquée à ces échantillons, puisque l‘étude des interactions HAP-MOD avait

montré que les interactions faibles sont plus facilement observées avec cette technique.

V.3.2. Par extinction de fluorescence

Contrairement aux HAP, la carbamazépine et le diazépam fluorescent peu (Figure 45). Il est

donc préférable d‘observer l‘extinction de fluorescence de la MOD lors de l‘interaction de ses

fluorophores avec ces médicaments. L‘inconvénient de cette méthode est qu‘il sera impossible de

mettre en évidence des interactions entre les benzodiazépines et la MOD non fluorescente et qu‘il ne

sera donc pas possible de conclure qu‘aucune interaction n‘a lieu même si aucune extinction de

fluorescence n‘est observée. D‘un autre côté, l‘avantage de cette méthode est la possibilité de mettre

en évidence le type de fluorophore (grâce à l‘utilisation de la spectrofluorimétrie 3D) impliqué dans les

interactions, si interactions il y a, et donc peut-être de pouvoir émettre des hypothèses quant à la

nature de ces interactions.

Figure 45. Spectres de fluorescence des blancs a) carbamazépine et b) diazépam pour des concentrations de 200

µg.L-1

. Les intensités sont indiquées en unités Raman.

260310360410460510

560610

660

250

290

330

370

410

émission (nm)

excita

tion (n

m)

0.77-0.84

0.7-0.77

0.63-0.7

0.56-0.63

0.49-0.56

0.42-0.49

0.35-0.42

0.28-0.35

0.21-0.28

0.14-0.21

0.07-0.14

0-0.07

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

250

280

310

340

370

400

260310360410460510560

610660 émission (nm)

a)

260310360410460510

560610

660

250

290

330

370

410

émission (nm)

excita

tion (n

m)

0.77-0.84

0.7-0.77

0.63-0.7

0.56-0.63

0.49-0.56

0.42-0.49

0.35-0.42

0.28-0.35

0.21-0.28

0.14-0.21

0.07-0.14

0-0.07

250

280

310

340

370

400

260310360410460510560


250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

b)


269

L‘extinction de fluorescence a permis de mettre en évidence des interactions entre certaines

MOD et les contaminants étudiés. Ces interactions dépendent du type de MOD, du type de

fluorophore observé et du médicament (Tableau 15).

Bandes de

fluorescence

100-(F/(FMOD+Fmed)) (%) Log KDOC

Carbamazépine Diazépam Carbamazépine Diazépam

Eau interstitielle

‘ 6 14 5,07 ± 0,01 5,57 0,01

4 6 4,85 ± 0,01 5,08 0,01

-3 -3 ns ns

Eau marine ‘ 15 22 5,62 0,01 5,98 0,01

17 25 5,69 0,01 6,01 0,01

38 23 6,36 0,01 5,98 0,01

Eau de rivière ‘ 1 3 ns ns

0 1 ns ns

Acide humique Aldrich

‘ 6 50 4,99 0,01 6,43 0,01

2 55 ns 6,56 0,01

Tableau 15. Extinctions de fluorescence et valeurs de KDOC obtenues pour les différents médicaments en

présence des différents types de MOD. F = fluorescence MOD + médicament, FMOD = fluorescence de la MOD

seule, Fmed = fluorescence du médicament seul, ns=interaction non significative, les KDOC sont exprimés en

L.mol-1

.

Les interactions en présence sont très faibles puisque mis à part pour l‘échantillon d‘eau

marine, une concentration de 2 µg.L-1

en contaminant n‘a pas permis de modifier significativement

l‘intensité de fluorescence. Cependant, avec des concentrations en médicaments de 200 µg.L-1

, la

plupart des combinaisons MOD - contaminants permettent de mettre en évidence des interactions.

Une variation de l‘intensité de fluorescence n‘a été considérée comme significative qu‘au-delà de 3 %

pour les bandes et ‘, et au-delà de 12 % pour la bande ; ces pourcentages représentant la

variabilité expérimentale (variabilité analytique et variabilité de l‘échantillon cumulées). De ce fait,

aucune interaction n‘a pu être mise en évidence entre l‘eau de rivière et les deux benzodiazépines.

Les valeurs des KDOC ont été calculées pour chaque interaction significative : les log KDOC varient de

4,85 0,01 à 6,56 0,01 et sont très variables selon le type de MOD et pour une même MOD, selon

le type de fluorophore (Tableau 15). Comme le montre la Figure 46, la bande γ, caractéristique du

matériel récent, peut être en partie éteinte par la présence de benzodiazépine pour l‘eau marine alors

qu‘elle n‘est pas du tout diminuée pour l‘eau interstitielle (Figure 47) ; l‘intensité de cette bande

augmente même légèrement (même si cette augmentation n‘est pas significative). Par contre, pour ce

même échantillon d‘eau interstitielle, les intensités des autres bandes de fluorescence diminuent

significativement en présence de médicaments. D‘autre part, les réactivités contaminant – MOD sont

différentes selon le médicament et les interactions sont généralement plus fortes avec le diazépam,

surtout pour l‘acide humique Aldrich (Figure 48).


270

Figure 46. Spectres de fluorescence a) théorique eau marine + carbamazépine, b) expérimental eau marine +

carbamazépine, c) théorique eau marine + diazépam, d) expérimental eau marine + diazépam. Les concentrations

en médicaments sont de 200 µg.L-1


250

290

330

370

410

260310360410460510560610660

inte

nsité

de

flu

ore

scen

ce

émission (nm)

0,77-0,84

0,7-0,77

0,63-0,7

0,56-0,63

0,49-0,56

0,42-0,49

0,35-0,42

0,28-0,35

0,21-0,28

0,14-0,21

0,07-0,14

0-0,07

260310360410460510

560610

660

250

290

330

370

410

émission (nm)

excita

tion (n

m)

0.77-0.84

0.7-0.77

0.63-0.7

0.56-0.63

0.49-0.56

0.42-0.49

0.35-0.42

0.28-0.35

0.21-0.28

0.14-0.21

0.07-0.14

0-0.07

250

280

310

340

370

400

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

a)

250

280

310

340

370

400

260310360

410460

510560


b)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

260310360410460510

560610

660

250

290

330

370

410

émission (nm)

excita

tion (n

m)

0.77-0.84

0.7-0.77

0.63-0.7

0.56-0.63

0.49-0.56

0.42-0.49

0.35-0.42

0.28-0.35

0.21-0.28

0.14-0.21

0.07-0.14

0-0.07

250

280

310

340

370

400

260310360

410460

510560

610660

émission (nm)

d)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

260310360410460510

560610

660

250

290

330

370

410

émission (nm)

excita

tion (n

m)

0.77-0.84

0.7-0.77

0.63-0.7

0.56-0.63

0.49-0.56

0.42-0.49

0.35-0.42

0.28-0.35

0.21-0.28

0.14-0.21

0.07-0.14

0-0.07

250

280

310

340

370

400

260310360

410460

510560


c)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)260310360410460510

560610

660

250

290

330

370

410

émission (nm)

excita

tion (n

m)

0.77-0.84

0.7-0.77

0.63-0.7

0.56-0.63

0.49-0.56

0.42-0.49

0.35-0.42

0.28-0.35

0.21-0.28

0.14-0.21

0.07-0.14

0-0.07


271

Figure 47. Spectres de fluorescence a) théorique eau interstitielle + carbamazépine, b) expérimental eau

interstitielle + carbamazépine, c) théorique eau interstitielle + diazépam, d) expérimental eau interstitielle +

diazépam. Les concentrations en médicaments sont de 200 µg.L-1


250

290

330

370

410

260310360

410460

510560

610660

émission (nm)

260310360410460510560610660

250

290

330

370

410

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

1.1

1.2

inte

nsité

émission (nm)

excita

tion (n

m)

1.1-1.2

1-1.1

0.9-1

0.8-0.9

0.7-0.8

0.6-0.7

0.5-0.6

0.4-0.5

0.3-0.4

0.2-0.3

0.1-0.2

0-0.1

a)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

250

280

310

340

370

400

260310360

410460

510560


c)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

260310360410460510560610660

250

290

330

370

410

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

1.1

1.2

inte

nsité

émission (nm)

excita

tion (n

m)

1.1-1.2

1-1.1

0.9-1

0.8-0.9

0.7-0.8

0.6-0.7

0.5-0.6

0.4-0.5

0.3-0.4

0.2-0.3

0.1-0.2

0-0.1

250

290

330

370

410

260310360410

460510

560610

660 émission (nm)

b)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

260310360410460510560610660

250

290

330

370

410

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

1.1

1.2

inte

nsité

émission (nm)

excita

tion (n

m)

1.1-1.2

1-1.1

0.9-1

0.8-0.9

0.7-0.8

0.6-0.7

0.5-0.6

0.4-0.5

0.3-0.4

0.2-0.3

0.1-0.2

0-0.1

250

280

310

340

370

400

260310360

410460

510560

610660

émission (nm)

d)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

260310360410460510560610660

250

290

330

370

410

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

1.1

1.2

inte

nsité

émission (nm)

excita

tion (n

m)

1.1-1.2

1-1.1

0.9-1

0.8-0.9

0.7-0.8

0.6-0.7

0.5-0.6

0.4-0.5

0.3-0.4

0.2-0.3

0.1-0.2

0-0.1


272

Figure 48. Spectres de fluorescence a) théorique acide humique Aldrich + carbamazépine, b) expérimental acide

humique Aldrich + carbamazépine, c) théorique acide humique Aldrich + diazépam, d) expérimental acide

humique Aldrich + diazépam. Les concentrations en médicaments sont de 200 µg.L-1

. Les intensités sont

indiquées en unités Raman.

250

290

330

370

410

260310360410460510560610

660 émission (nm)

260310360410460510560610660

250

290

330

370

410

0.00.40.81.21.62.02.42.83.23.64.04.44.85.25.6

émission (nm)

excita

tion (n

m)

5.2-5.6

4.8-5.2

4.4-4.8

4-4.4

3.6-4

3.2-3.6

2.8-3.2

2.4-2.8

2-2.4

1.6-2

1.2-1.6

0.8-1.2

0.4-0.8

0-0.4

a)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660émission (nm)

250

280

310

340

370

400

260310360

410460

510560

610660

émission (nm)

c)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

260310360410460510560610660

250

290

330

370

410

0.00.40.81.21.62.02.42.83.23.64.04.44.85.25.6

émission (nm)

excita

tion (n

m)

5.2-5.6

4.8-5.2

4.4-4.8

4-4.4

3.6-4

3.2-3.6

2.8-3.2

2.4-2.8

2-2.4

1.6-2

1.2-1.6

0.8-1.2

0.4-0.8

0-0.4

250

300

350

400

260310360410460

510560


b)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

260310360410460510560610660

250

290

330

370

410

0.00.40.81.21.62.02.42.83.23.64.04.44.85.25.6

émission (nm)

excita

tion (n

m)

5.2-5.6

4.8-5.2

4.4-4.8

4-4.4

3.6-4

3.2-3.6

2.8-3.2

2.4-2.8

2-2.4

1.6-2

1.2-1.6

0.8-1.2

0.4-0.8

0-0.4

250

280

310

340

370

400

260310360

410460

510560

610660

émission (nm)

d)

250

270

290

310

330

350

370

390

410

260310

360410

460510

560610

660

émission (nm)

260310360410460510560610660

250

290

330

370

410

0.00.40.81.21.62.02.42.83.23.64.04.44.85.25.6

émission (nm)

excita

tion (n

m)

5.2-5.6

4.8-5.2

4.4-4.8

4-4.4

3.6-4

3.2-3.6

2.8-3.2

2.4-2.8

2-2.4

1.6-2

1.2-1.6

0.8-1.2

0.4-0.8

0-0.4


273

Comme les valeurs de KDOC ont été obtenues pour seulement une concentration en

médicaments (à 200 µg.L-1

, puisqu‘à 2 µg.L-1

les interactions étaient trop faibles pour être observées),

l‘extinction de fluorescence a été étudiée plus précisément par spectrofluorimétrie 2D pour des

concentrations allant de 2 à 500 µg.L-1

. Ces expériences ont été effectuées pour chaque interaction

précédemment observée dans le but de vérifier les résultats obtenus en 3D et d‘étudier la linéarité de

ces interactions. De ces études en 2D, il en ressort globalement que les bandes de fluorescence α et

α‘ voient leur intensité varier linéairement avec la concentration en médicaments sur la gamme

étudiée (Figure 49). Par contre, l‘intensité de la bande γ semble beaucoup plus variable mais sans

dépendre de la concentration en contaminants. Les résultats obtenus pour les bandes et ‘ des

MOD naturelles confirment ceux observés par spectrofluorimétrie tridimensionnelle, c‘est-à-dire que

l‘eau de mer réagit plus fortement avec les deux contaminants que l‘eau interstitielle, même si la

différence entre les deux MOD est moins marquée de par la plus forte variabilité en 2D. D‘autre part,

les faibles coefficients de corrélation obtenus pour les bandes des deux échantillons naturels et les

deux médicaments (R² de 0,02 à 0,39) laissent penser qu‘il n‘y a pas ou peu d‘interaction avec le

matériel récent de la MOD. Il est intéressant de noter que, bien que non significative, la tendance à

l‘augmentation de l‘intensité de fluorescence de l‘eau interstitielle en présence de diazépam est

également observée par spectrofluorimétrie 2D.


274

Figure 49. Évolution de l’intensité de fluorescence des eaux de mer et interstitielle en fonction de la

concentration en médicaments pour les bandes α (en haut), α’ (au milieu) et γ (en bas). FM0 = intensité de

fluorescence de la MOD seule, Fmed = intensité de fluorescence des médicaments seuls, F = intensité de

fluorescence du mélange médicaments + MOD, les coefficients directeurs des droites de corrélation

correspondent aux KDOC exprimés en L.mol-1

.

’


275

La Figure 50 montre que pour l‘acide humique Aldrich, les interactions ne semblent pas

linéaires. En effet, pour la carbamazépine, l‘ajout de médicaments est sans effet sur la fluorescence

jusqu‘à une certaine concentration, à partir de laquelle la MOD est éteinte. Ceci expliquerait qu‘en

spectrofluorimétrie tridimensionnelle, ces interactions étaient faibles ou non significatives, puisque

certainement étudiées en dessous de ce point limite. En modélisant ces interactions par une droite,

les interactions en présence de faibles concentrations en carbamazépine sont certainement

surestimées, et au contraire sous-estimées à fortes concentrations. Ce phénomène de non-linéarité

pourrait peut-être s‘expliquer par des interactions avec des groupements fonctionnels non

fluorescents de l‘acide humique à faibles concentrations en carbamazépine et une fois tous ces

groupements occupés, la carbamazépine interagirait ensuite avec les groupements fluorescents

(noyaux aromatiques par exemple). Cependant, ceci n‘est pas vérifiable étant donné que les résultats

par SPME n‘ont pas permis de mettre en évidence des interactions entre la carbamazépine et l‘acide

humique Aldrich. D‘autre part, la non-linéarité observée est due aux points correspondant aux deux

échantillons les plus concentrés en carbamazépine. Pour le diazépam, qui a pourtant été fabriqué de

façon indépendante, les deux points les plus concentrés semblent également montrer une rupture de

la linéarité, mais avec un effet opposé par rapport à la carbamazépine, puisqu‘ils entraînent une

diminution du KDOC à plus fortes concentrations. Il est donc possible qu‘à fortes concentrations en

médicaments, un phénomène modifiant la fluorescence ait lieu pour les deux contaminants mais qu‘il

soit visible de façon différente selon le composé. De plus, si l‘on fait abstraction de ces deux points,

les résultats sont beaucoup plus cohérents avec la spectrofluorimétrie tridimensionnelle : interactions

assez fortes pour le diazépam et très faibles voire non significatives pour la carbamazépine.


276

Figure 50. Évolution de l’intensité de fluorescence de l’acide humique Aldrich en fonction de la concentration

en médicaments pour les bandes α (en haut) et α’ (en bas). FM0 = intensité de fluorescence de la MOD seule,

Fmed = intensité de fluorescence des médicaments seuls, F = intensité de fluorescence du mélange médicaments

+ MOD, les coefficients directeurs des droites de corrélation correspondent aux KDOC exprimés en L.mol-1

.

Même si la tendance est plus marquée par spectrofluorimétrie tridimensionnelle, le diazépam

semble s‘associer plus fortement à la MOD pour chaque fluorophore de chaque type de MOD que la

carbamazépine. La carbamazépine est plus petite, plus aromatique mais moins polaire et moins

hydrophobe que le diazépam. Les deux médicaments possèdent un groupement polaire amide

α

α'


277

constitué de deux atomes d‘azote et d‘un atome d‘oxygène et diffèrent essentiellement par leur partie

hydrophobe, qui est plane pour la carbamazépine et constituée d‘un atome de chlore pour le

diazépam. La différence de réactivité des deux molécules est donc très probablement due à leur

partie hydrophobe. D‘autre part, la forme particulière de la partie hydrophobe de la carbamazépine

(noyaux aromatiques conjugués) ne semble pas augmenter la force des interactions avec la MOD

puisque le diazépam est plus réactif. Ceci pourrait donc impliquer que les interactions hydrophobes en

présence ne sont pas spécifiques et que l‘aromaticité du contaminant n‘entre pas (ou peu) en compte.

En ce qui concerne la composition de la MOD, l‘eau de rivière, essentiellement composée

d‘acides fulviques (comme l‘indique le rapport E2/E3 > 3,5, Minero et al. 2007), n‘interagit pas avec les

deux contaminants. Il semblerait donc que ces deux benzodiazépines ne réagissent pas avec les

macromolécules plus petites de type acides fulviques, même si le degré d‘humification est important

(HIX = 15,3). Des interactions avec les autres types de MOD, essentiellement composés d‘acides

humiques, ont pu être mises en évidence pour les deux contaminants. Plus la MOD est aromatique et

humifiée, plus les interactions avec le diazépam sont fortes, et ce pour tous les fluorophores observés.

Pour la carbamazépine, les mêmes observations peuvent être faites pour les MOD naturelles mais

pas pour l‘acide humique Aldrich avec lequel elle n‘interagit pas ou très peu selon le fluorophore,

surtout à faible concentration en carbamazépine. Pour ce contaminant, les valeurs des KDOC sont du

même ordre pour les fluorophores α et α‘ de l‘eau interstitielle et de l‘acide humique Aldrich. Or ces

deux échantillons ont des valeurs d‘indices E2/E3 et E4/E6 très proches (autour de 2-3). De plus, ces

indices pour l‘eau de rivière, qui ne donne pas d‘interactions, ont des valeurs beaucoup plus grandes

(5,6 et 15,6) alors que l‘eau de mer, la plus réactive, donne des valeurs très faibles (autour de 1). Il

semblerait donc que les interactions avec la carbamazépine soient inversement proportionnelles à ces

deux indices et donc d‘autant plus fortes que les macromolécules sont grosses. Alors que pour le

diazépam, les interactions avec la MOD de type acide humique semblent liées à l‘aromaticité de cette

dernière, impliquant certainement un caractère plus hydrophobe de la MOD, mais ne semblent pas

liées à la taille des macromolécules.

Pour conclure, cette étude a permis de mettre en évidence des interactions faibles entre les

benzodiazépines et la MOD. La MOD constituée essentiellement d‘acides fulviques ne semble

s‘associer ni avec le diazépam ni avec la carbamazépine alors que la MOD plus fortement concentrée

en acides humiques semble plus réactive. Il semblerait que les interactions avec le diazépam soient

de nature hydrophobe alors que les interactions avec la carbamazépine semblent avoir un caractère

hydrophobe moins marqué et être essentiellement contrôlées par la taille des macromolécules. Enfin,

ces interactions ont été observées à de faibles concentrations en MOD (quelques mg.L-1

de COD) et

ne doivent donc pas être négligées dans des environnements naturels plus fortement concentrés en

MOD, où la diminution de la fraction libre de ces médicaments pourrait être plus marquée.

279

Conclusion et perspectives

Conclusion

281

Les objectifs de ces travaux de thèse étaient de développer des outils analytiques permettant

une étude fiable des interactions entre la matière organique dissoute et les contaminants organiques

et d‘essayer de comprendre les phénomènes mis en jeu dans ces interactions.

La première partie de ces objectifs a été atteinte grâce au développement de la SPME-GC-

MS et de l‘extinction de fluorescence. Ces deux techniques ont montré leur adéquation à l‘étude des

interactions avec la MOD aussi bien pour les HAP que pour les substances pharmaceutiques. Ces

techniques sont d‘autre part complémentaires puisque la SPME-GC-MS est plus adaptée à l‘étude

des interactions fortes alors que l‘extinction de fluorescence est bien adaptée à l‘étude des

interactions plus faibles. L‘intérêt de cette dernière technique a pu être confirmé pour les contaminants

organiques et pas uniquement pour ceux qui fluorescent. D‘autre part, la SPME-GC-MS est un

excellent outil qui permet non seulement d‘étudier les interactions contaminants organiques – MOD

mais qui permet également la quantification des contaminants à des concentrations traces dans des

échantillons aqueux, même chargés matriciellement. Cette technique possède également un

avantage considérable puisqu‘elle permet l‘étude des interactions contaminants organiques – MOD

directement dans des échantillons naturels, sans qu‘il soit nécessaire d‘ajouter des contaminants ou

de la MOD.

Ces techniques ont ensuite pu aider à la compréhension des phénomènes impliqués dans les

interactions. Les expériences menées sur l‘acide humique Aldrich et les HAP ont montré des

phénomènes de compétition entre les contaminants vis-à-vis de la MOD. Il a ainsi été souligné que

l‘usage d‘étalons internes permettant la quantification des contaminants doit être réfléchi car il peut

entraîner des modifications des interactions mesurées. D‘autre part, la modélisation des interactions

par des isothermes linéaires peut entraîner des sous-estimations ou des surestimations de la fraction

libre puisque sur des gammes importantes de concentrations en HAP ou en MOD, les interactions

sont généralement non linéaires.

La SPME-GC-MS a permis le calcul de KDOC pour de nombreux HAP dans différentes

conditions de concentrations en HAP et en COD avec l‘acide humique Aldrich. Ces valeurs de KDOC

ont permis d‘enrichir la littérature car peu de données sont disponibles, sauf pour quelques HAP très

étudiés (phénanthrène, pyrène, benzo[a]pyrène par exemple). L‘extinction de fluorescence a permis la

mesure de KDOC pour quatre HAP (phénanthrène, pyrène, chrysène, benzo[a]pyrène) alors que les

plus lourds d‘entre eux n‘avaient, à notre connaissance, jamais été calculés par cette technique. Il

pourrait donc être intéressant d‘appliquer cette technique à d‘autres HAP et surtout de les étudier

simultanément comme par SPME. Pour cela cependant, des traitements mathématiques (PARAFAC

par exemple) devront être faits car la fluorescence des HAP se recouvre à certaines longueurs d‘onde

et il est difficile de déconvoluer les spectres, surtout en présence de MOD elle aussi fluorescente.

L‘étude de l‘effet des paramètres physico-chimiques sur les interactions HAP-MOD a révélé

que la salinité n‘a pas d‘impact sur ces interactions, au moins en ce qui concerne les MOD étudiées.

Conclusion

282

Cependant, celles-ci étant de natures très variables (naturelles, commerciales, humifiées, fraîches…),

il est très probable que la salinité soit l‘un des facteurs les moins influents sur les interactions des HAP

avec la plupart des types de MOD. Le pH et la concentration en COD sont, semble-t-il, des

paramètres plus importants mais leur impact dépend fortement du type de MOD et de HAP. Une

diminution du pH et de la concentration en COD est généralement favorable aux interactions avec les

trois types de MOD étudiés mais les effets de ces paramètres peuvent être différents en ce qui

concerne les propriétés optiques de la MOD. Ceci peut s‘expliquer par le fait que les macromolécules

fluorescentes observées ne sont pas de même nature selon le type de MOD et que l‘effet de la

protonation et de la dilution de la MOD ne peut être visible que sur les chromophores et les

fluorophores, qui ne sont pas forcément les macromolécules qui interagissent avec les HAP. Afin de

mieux comprendre ce qu‘il se passe au niveau de la conformation des macromolécules, il serait donc

intéressant de pouvoir étudier l‘effet des paramètres physico-chimiques grâce à des techniques

permettant l‘observation (ou la description) de toutes les macromolécules, même celles qui

n‘absorbent pas dans l‘UV-visible (par microscopie par exemple).

L‘application de la SPME-GC-MS à l‘étude des interactions HAP-MOD dans les eaux

interstitielles du Bassin d‘Arcachon a permis de mettre en évidence des associations entre MOD et

HAP présents naturellement dans les eaux interstitielles. Ainsi, les HAP présents dans

l‘environnement aquatique du Bassin d‘Arcachon, généralement d‘origine pyrolytique, peuvent voir

leurs concentrations dans la colonne d‘eau augmenter à cause de la MOD. En effet, même si les HAP

sont majoritairement présents dans les sédiments en raison de leur faible solubilité aqueuse, leurs

interactions avec la MOD dans l‘eau interstitielle peuvent favoriser leur migration vers la colonne d‘eau

et ainsi augmenter leur mobilité. D‘autre part, ces effets ont pu être observés pour la plupart des

échantillons, aussi bien dans les ports que dans les zones intertidales du Bassin, et ce, quelles que

soient la nature et l‘origine de la MOD présente.

L‘applicabilité de la SPME au milieu naturel est un formidable atout qui pourrait aider à la

compréhension des interactions grâce à la possibilité d‘étudier les interactions HAP-MOD dans de

nombreux milieux naturels et cela de façon aisée. En couplage avec l‘analyse de la MOD, il pourrait

ainsi peut-être se dégager des relations entre les KDOC et les propriétés de la MOD. En effet, même si

ceci a été initié dans ces travaux, les échantillons naturels utilisés étaient en nombre trop faible et

avec des propriétés trop peu différentes pour qu‘il se dégage une corrélation marquée qui soit valable

pour tous les échantillons.

Les échantillons du Bassin d‘Arcachon ainsi que ceux utilisés pour les études avec la MOD

d‘origine algale ont permis de mettre en évidence l‘importance du matériel organique récent pour les

interactions avec les HAP. En effet, il a pu être observé une corrélation négative avec l‘humification de

la MOD et une corrélation positive avec l‘intensité de la bande (macromolécules de type protéines)

pour les échantillons d‘eaux interstitielles. D‘autre part, la MOD d‘origine algale, pour laquelle cette

bande est largement majoritaire, a montré des interactions plus fortes avec les HAP lourds qu‘une eau

Conclusion

283

de rivière où cette bande n‘est pas présente. Ces observations ont donc permis de souligner

l‘importance du matériel récent par rapport au caractère humifié et aromatique de la MOD et

supportent également l‘hypothèse avancée par Kopinke et al. (2001) sur le fait que les petites chaînes

aliphatiques, grâce à leur flexibilité, pourraient interagir fortement avec les HAP.

Concernant les interactions substances pharmaceutiques – MOD, il a été suggéré que les

interactions avec la carbamazépine sont principalement corrélées avec la taille des macromolécules

alors que celles du diazépam seraient mieux corrélées à leur caractère hydrophobe. Ces conclusions

pourraient éventuellement être confirmées ou infirmées grâce à l‘étude des interactions envers des

macromolécules fractionnées selon leur caractère hydrophobe ou leur taille. D‘autre part, il serait

intéressant d‘étudier les interactions sur un plus grand nombre d‘échantillons de MOD afin de pouvoir

documenter plus précisément l‘effet de l‘origine et de la composition de la MOD sur les interactions

avec les médicaments.

Il pourrait aussi être intéressant d‘améliorer la SPME-GC-MS pour l‘analyse des substances

pharmaceutiques pour essayer de détecter leurs interactions avec la MOD, même si elles sont faibles.

Il faudrait pour cela pouvoir diminuer la variabilité ainsi que les limites de détection, ce qui permettrait

également de pouvoir l‘appliquer à des milieux aqueux environnementaux. Pour cela, la spectrométrie

de masse en tandem pourrait être utilisée ainsi que le couplage à la chromatographie liquide. D‘autre

part, la plupart des substances pharmaceutiques étant faiblement hydrophobes et pouvant être

ionisées au pH environnemental, cette dernière méthode permettrait de pouvoir étendre l‘étude des

interactions à l‘ensemble des médicaments. En parallèle, la dialyse pourrait être développée pour ces

substances, car, même si les contaminants hydrophobes comme les HAP posent des problèmes

d‘adsorption, les substances plus hydrophiles devraient être moins problématiques et il serait alors

possible de comparer les trois techniques pour la détermination des KDOC.

285

Bibliographie

Bibliographie

287

Abrajano Jr, T.A., Yan, B., Song, J., Bopp, R., O'Malley, V., Heinrich, D.H. & Karl, K.T. (2003)

9.13 High-Molecular-Weight Petrogenic and Pyrogenic Hydrocarbons in Aquatic

Environments. In Treatise on Geochemistry, Vol. 9, pp. 1-50. Oxford: Pergamon.

Action Nationale de Recherche et de Réduction des Rejets de Substances Dangereuses dans

les Eaux, Ministère de l‘Écologie, de l‘Énergie, du Développement durable et de la Mer,

Circulaire du 05/01/09 [en ligne], annexe 1, <http://rsde.ineris.fr/>, mise à jour du 28.05.2009

(consulté le 01.09.09)

Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments – Agence Nationale du Médicament

Vétérinaire (Afssa-ANMV), Suivi des ventes de médicaments vétérinaires contenant des

antibiotiques en France en 2007 [en ligne], février 2009, <http://www.anmv.afssa.fr/>, mise à

jour du 01/10/2009 (consulté le 01.10.09)

Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé (Afssaps), Analyse des ventes de

médicaments aux officines et aux hôpitaux en France données 1997-2007 (29.04.2009), 9ème

édition [en ligne], <http://www.afssaps.fr/Afssaps-media/Publications/Bilans> (consulté le

01.09.09)

Akkanen, J. & Kukkonen, J.V.K. (2001) Effects of water hardness and dissolved organic material on

bioaivalability of selected organic chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry 20(10),

2303-2308.

Akkanen, J. (2002) Does dissolved organic matter matter? - Implications for bioavailability of organic

chemicals. In Department of Biology: University of Joensuu.

Akkanen, J., Vogt, R. & Kukkonen, J.K. (2004) Essential characteristics of natural dissolved organic

matter affecting the sorption of hydrophobic organic contaminants. Aquatic Sciences -

Research Across Boundaries 66(2), 171.

Akkanen, J., Tuikka, A. & Kukkonen, J.V.K. (2005a) Comparative Sorption and Desorption of

Benzo[a]pyrene and 3,4,3',4'-Tetrachlorobiphenyl in Natural Lake Water Containing Dissolved

Organic Matter. Environmental Science and Technology 39(19), 7529-7534.

Akkanen, J., Lyytikäinen, M., Tuikka, A. & Kukkonen, J.V.K. (2005b) Dissolved organic matter in



Albani, J.R. (2001) Absorption et fluorescence. Principes et applications. Londres - Paris - New-York:

Editions TEC&DOC.

Baalousha, M., Motelica-Heino, M. & Coustumer, P.L. (2006) Conformation and size of humic

substances: Effects of major cation concentration and type, pH, salinity, and residence time.

Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 272(1-2), 48-55.

Bai, Y., Fengchang Wu, Congqiang Liu, Jianyang Guo, Pingqing Fu, Wen Li & Xing, B. (2008)

Interaction between carbamazepine and humic substances: a fluorescence spectroscopy

study. Environmental Toxicology and Chemistry 27(1), 95-102.

Bejarano, A.C., Chandler, G.T. & Decho, A.W. (2005) Influence of natural dissolved organic matter

(DOM) on acute and chronic toxicity of the pesticides chlorothalonil, chlorpyrifos and fipronil

http://rsde.ineris.fr/

http://www.afssaps.fr/var/afssaps_site/storage/original/application/bf1436c1cc9ffd8e8d8771ab85c410dc.pdf

http://www.afssaps.fr/var/afssaps_site/storage/original/application/bf1436c1cc9ffd8e8d8771ab85c410dc.pdf

http://www.afssaps.fr/Afssaps-media/Publications/Bilans

Bibliographie

288

on the meiobenthic estuarine copepod Amphiascus tenuiremis. Journal of Experimental

Marine Biology and Ecology 321(1), 43-57.

Borisover, M., Laor, Y., Bukhanovsky, N. & Saadi, I. (2006) Fluorescence-based evidence for

adsorptive binding of pyrene to effluent dissolved organic matter. Chemosphere 65(11), 1925-

1934.

Boti, V.I., Sakkas, V.A. & Albanis, T.A. (2007) Measurement uncertainty arising from trueness of the

analysis of two endocrine disruptors and their metabolites in environmental samples: Part II.

Solid-phase extraction from environmental natural waters. Journal of Chromatography A

1146(2), 148-156.

Brown, J.N. & Peake, B.M. (2003) Determination of colloidally-associated polycyclic aromatic

hydrocarbons (PAHs) in fresh water using C18 solid phase extraction disks. Analytica Chimica

Acta 486(2), 159-169.

Brun, G.L., Bernier, M., Losier, R., Doe, K., Jackman, P. & Lee, H.-B. (2006) Pharmaceutically

active compounds in Atlantic canadian sewage treatment plant effluents and receiving waters,

and potential for environmental effects as measured by acute and chronic aquatic toxicity.

Environmental Toxicology and Chemistry 25(8), 2163-2176.

Carlsson, C., Johansson, A.-K., Alvan, G., Bergman, K. & Kühler, T. (2006) Are pharmaceuticals

potent environmental pollutants? Part I: Environmental risk assessments of selected active

pharmaceutical ingredients. Science of The Total Environment 364(1-3), 67-87.

Carmosini, N. & Lee, L.S. (2009) Ciprofloxacin sorption by dissolved organic carbon from reference

and bio-waste materials. Chemosphere 77(6), 813-820.

Carr, K.H., Coyle, G.T. & Kimerle, R.A. (1997) Bioconcentration of [14C]butyl benzyl phthalate in

bluegill sunfish (Lepomis macrochirus). Environmental Toxicology and Chemistry 16(10),

2200-2203.

Carter, C.W. & Suffet, I.S. (1982) Binding of DDT to dissolved humic materials. Environmental


Chen, J.A., Li, X., Li, J., Cao, J., Qiu, Z., Zhao, Q., Xu, C. & Shu, W. (2007) Degradation of

environmental endocrine disruptor di-2-ethylhexyl phthalate by a newly discovered bacterium,

Microbacterium sp. strain CQ0110Y. Applied Microbiology and Biotechnology 74(3), 676-682.

Chin, Y.P., Aiken, G.R. & O'Loughlin, E. (1994) Molecular weight, polydispersity, and spectroscopic

properties of aquatic humic substances. Environmental Science and Technology 28(11),

1853-1858.




Chiron, S., Minero, C. & Vione, D. (2006) Photodegradation Processes of the Antiepileptic Drug

Carbamazepine, Relevant To Estuarine Waters. Environmental Science and Technology

40(19), 5977-5983.

Cleuvers, M. (2003) Aquatic ecotoxicity of pharmaceuticals including the assessment of combination

effects. Toxicology Letters 142(3), 185-194.

Bibliographie

289

Comerton, A.M., Andrews, R.C., Bagley, D.M. & Yang, P. (2007) Membrane adsorption of

endocrine disrupting compounds and pharmaceutically active compounds. Journal of


Cornelissen, G., Pettersen, A., Broman, D., Mayer, P. & Breedveld, G.D. (2008) Field testing of

equilibrium passive samplers to determine freely dissolved native polycyclic aromatic

hydrocarbon concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry 27(3), 499-508.

Costa, L.G., Giordano, G., Tagliaferri, S., Caglieri, A. & Mutti, A. (2008) Polybrominated diphenyl

ether (PBDE) flame retardants: environmental contamination, human body burden and

potential adverse health effects. Acta Biomed 79, 172-183.

Danielsen, K.M., Chin, Y.P., Buterbaugh, J.S., Gustafson, T.L. & Traina, S.J. (1995) Solubility

enhancement and fluorescence quenching of pyrene by humic substances: the effect of

dissolved oxygen on quenching processes. Environmental Science and Technology 29, 2162-

2165.

David, A., Fenet, H. & Gomez, E. (2009) Alkylphenols in marine environments: Distribution

monitoring strategies and detection considerations. Marine Pollution Bulletin 58(7), 953-960.

De Maagd, P.G.-J., ten Hulscher, D.T.E.M., van den Heuvel, H., Opperhuizen, A. & Sijm, D.T.H.M.

(1998) Physicochemical properties of polycyclic aromatic hydrocarbons: aqueous solubilities,

n-octanol/water partition coefficients, and Henry's law constants. Environmental Toxicology

and Chemistry 17(2), 251-257.

De Paolis, F. & Kukkonen, J. (1997) Binding of organic pollutants to humic and fulvic acids: influence

of pH andthe structure of humic material. Chemosphere 34(8), 1693-1704.

De Wit, C.A. (2002) An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere

46(5), 583-624.

Dichtl, N., Rogge, S. & Bauerfeld, K. (2007) Novel Strategies in Sewage Sludge Treatment. CLEAN

- Soil, Air, Water 35(5), 473-479.

Doll, T.E., Frimmel, F.H., Kumke, M.U. & Ohlenbusch, G. (1999) Interaction between natural

organic matter (NOM) and polycyclic aromatic compounds (PAC) – comparison of

fluorescence quenching and solid phase micro extraction (SPME). Fresenius' Journal of

Analytical Chemistry 364(4), 313-319.

Doll, T.E. & Frimmel, F.H. (2005) Photocatalytic degradation of carbamazepine, clofibric acid and

iomeprol with P25 and Hombikat UV100 in the presence of natural organic matter (NOM) and

other organic water constituents. Water Research 39(2-3), 403-411.




Duursma, E.K. & Dawson, R. (1981) Marine organic chemistry. Evolution, composition, interactions

and chemistry of organic matter in seawater. Amsterdam - Oxford - New York: Elsevier

Oceanography Series.

Bibliographie

290

Europa, le portail de l’union européenne, Directive-cadre dans le domaine de l'eau [en ligne],

<http://europa.eu/legislation_summaries/agriculture/environment/l28002b_fr.htm>, mise à jour

du 18.04.2008 (consulté le 01.09.09)

Filella, M. (2009) Freshwaters: which NOM matters? Environmental Chemistry Letters 7(1), 21-35.




Gauthier, T.D., Seitz, W.R. & Grant, L. (1987) Effects of structural and compositional variations of

dissolved humic materials on Pyrene Koc values. Environmental Science and Technology

21(3), 243-248.

Georgi, A. & Kopinke, F.-D. (2002) Validation of a modified Flory-Huggins concept for description of

hydrophobic organic compound sorption on dissolved humic substances. Environmental

Toxicology and Chemistry 21(9), 1766-1774.

Gielen, G.J.H.P., Heuvel, M.R.v.d., Clinton, P.W. & Greenfield, L.G. (2009) Factors impacting on

pharmaceutical leaching following sewage application to land. Chemosphere 74(4), 537-542.

Goldschmid, O. (1954) Determination of phenolic hydroxyl content of lignin preparations by ultraviolet

spectrophotometry. Analytical Chemistry 26(9), 1421-1423.

Gonçalves, C. & Alpendurada, M.F. (2002) Comparison of three different poly(dimethylsiloxane)-

divinylbenzene fibres for the analysis of pesticide multiresidues in water samples: structure

and efficiency. Journal of Chromatography A 963(1-2), 19-26.

Goupy, J. (1988) La Méthode des plans d'expériences: optimisation du choix des essais et de

l'interprétation des résultats. Paris: Dunod.



Chemosphere 37(7), 1335-1362.

Harvey, H. (2006) Sources and Cycling of Organic Matter in the Marine Water Column. In Marine

Organic Matter: Biomarkers, Isotopes and DNA, pp. 1-25.



Milliliter Sediment Pore Water Samples and Determination of KDOC Values. Environ


He, Y., Yediler, A., Sun, T. & Kettrup, A. (1995) Adsorption of fluoranthene on soil and lava: Effects

of the organic carbon contents of adsorbents and temperature. Chemosphere 30(1), 141.

Hennion, M.-C. (1999) Solid-phase extraction: method development, sorbents, and coupling with

liquid chromatography. Journal of Chromatography A 856(1-2), 3-54.

Herbert, B.E., Bertsch, P.M. & Novak, J.M. (1993) Pyrene Sorption by water-soluble organic carbon.




575-587.

http://europa.eu/legislation_summaries/agriculture/environment/l28002b_fr.htm

Bibliographie

291

Hertkorn, N., Ruecker, C., Meringer, M., Gugisch, R., Frommberger, M., Perdue, E., Witt, M. &

Schmitt-Kopplin, P. (2007) High-precision frequency measurements: indispensable tools at

the core of the molecular-level analysis of complex systems. Analytical and Bioanalytical

Chemistry 389(5), 1311-1327.

Hesketh, N., Jones, M.N. & Tipping, E. (1996) The interaction of some pesticides and herbicides

with humic substances. Analytica Chimica Acta 327, 191-201.

Huguet, A. (2007) Mise au point de procédés membranaires pour l'étude de la matière organique

dissoute en milieux côtiers. Thèse n°3504 : Université Bordeaux 1.






490.

INERIS (Institut National de l'EnviRonnement industriel et des rISques), fiches de données

toxicologiques et environnementales des substances chimiques [en ligne],

<http://www.ineris.fr/index.php?module=cms&action=getContent&id_heading_object=3>,

dernière mise à jour le 10.07.09 (consulté le 01.09.09)

INRS (Institut National de Recherche et de Sécurité), bases de données [en ligne], fiches

toxicologiques, <http://www.inrs.fr/>, mise à jour du 12.10.09 (consulté le 14.10.09)

Jota, M.A.T. & Hassett, J.P. (1991) Effects of environmental variables on binding of a PCB congener

by dissolved humic substances. Environmental Toxicology and Chemistry 10, 483-491.

Jürgens, M. D., Holthaus, K. I. E., Johnson, A. C., Smith, J. J. L., Hetheridge, M. & Williams, R. J.

(2002) The Potential for Estradiol and Ethinylestradiol Degradation in English Rivers.

Environmental Toxicology and Chemistry, 21(3), 480–488.

Khetan, S.K. & Collins, T.J. (2007) Human Pharmaceuticals in the Aquatic Environment: A

Challenge to Green Chemistry. Chemical Reviews 107(6), 2319-2364.

King, A.J., Readman, J.W. & Zhou, J.L. (2004) Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in

water by solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry. Analytica

Chimica Acta 523(2), 259-267.

Kopinke, F.-D., Georgi, A. & Mackenzie, K. (2001) Sorption of Pyrene to Dissolved Humic

Substances and Related Model Polymers. 1. Structure-Property Correlation. Environmental


Kuivikko, M., Kotiaho, T., Hartonen, K., Tanskanen, A. & Vähätalo, A. V. (2007) Modeled Direct

Photolytic Decomposition of Polybrominated Diphenyl Ethers in the Baltic Sea and the Atlantic

Ocean. Environmental Science and Technology 41, 7016-7021.

Kukkonen, J., McCarthy, J.F. & Oikari, A. (1990) Effects of XAD-8 fractions of dissolved organic

carbon on the sorption and bioavailability of organic micropollutants. Archives of


http://www.ineris.fr/index.php?module=cms&action=getContent&id_heading_object=3

http://www.inrs.fr/

Bibliographie

292

Kukkonen, J. & Pellinen, J. (1994) Binding of organic xenobiotics to dissolved organic

macromolecules: comparison of analytical methods. The Science of the Total Environment

152, 19-29.

Kuramochi, H., Maeda, K. & Kawamoto, K. (2007) Physicochemical properties of selected

polybrominated diphenyl ethers and extension of the UNIFAC model to brominated aromatic

compounds. Chemosphere 67, 1858–1865.

Lam, M.W. & Mabury, S.A. (2005) Photodegradation of the pharmaceuticals atorvastatin,

carbamazepine, levofloxacin, and sulfamethoxazole in natural waters. Aquatic Sciences -

Research Across Boundaries 67(2), 177-188.

Landrum, P.F., Nihart, S.R., Eadie, B.J. & Gardner, W.S. (1984) Reverse-phase separation method

for determining pollutant binding to Aldrich humic acid and dissolved organic carbon of natural

waters. Environmental Science and Technology 18(3), 187-192.

Laor, Y. & Rebhun, M. (1997) Complexation-Flocculation: A New Method To Determine Binding

Coefficients of Organic Contaminants to Dissolved Humic Substances. Environmental Science

and Technology 31(12), 3558-3564.

Laor, Y. & Rebhun, M. (2002) Evidence for Nonlinear Binding of PAHs to Dissolved Humic Acids.


Lee, D.Y. & Farmer, W.J. (1989) Dissolved organic matter interaction with napropamide and four

other nonionic pesticides. Journal of Environmental Quality 18, 468-474.



Sciences - Research Across Boundaries 66(2), 185-194.

Lertsirisopon, R., Soda, S., Sei, K. & Ike, M. (2009) Abiotic degradation of four phthalic acid esters

in aqueous phase under natural sunlight irradiation. Journal of Environmental Sciences 21(3),

285-290.

Li, N. & Lee, H.K. (2000) Tandem-Cartridge Solid-Phase Extraction Followed by GC/MS Analysis for

Measuring Partition Coefficients of Association of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons to Humic

Acid. Analytical Chemistry 72(21), 5272-5279.

Li, X.-H., Cheng, X.-L., Zhang, R.-Z. & Yang, X.-D. (2005) Quantum Chemical Study on Structure-

activity Relationship of Several Kinds of Drugs. Chinese Journal of Structural Chemistry 24(5),

513-520.

Lin, A. Y-C., Plumlee M. H. & Reinhard M. (2006) Natural Attenuation of Pharmaceuticals and

Alkylphenol Polyethoxylate Metabolites during River Transport: Photochemical and Biological

Transformation. Environmental Toxicology and Chemistry, 25(6), 1458–1464.

Liu, Y., Peng, P., Li, X., Zhang, S. & Ren, M. (2008) Polychlorinated dibenzo-p-dioxins and

dibenzofurans (PCDD/Fs) in water and suspended particulate matter from the Xijiang River,

China. Journal of Hazardous Materials 152, 40–47.

Löffler, D., Rombke, J., Meller, M. & Ternes, T.A. (2005) Environmental Fate of Pharmaceuticals in

Water/Sediment Systems. Environmental Science and Technology 39(14), 5209-5218.

Bibliographie

293

Lord, H. & Pawliszyn, J. (2000) Evolution of solid-phase microextraction technology. Journal of


Lou, T., Xie, H., Chen, G. & Gagne, J.-P. (2006) Effects of photodegradation of dissolved organic

matter on the binding of benzo(a)pyrene. Chemosphere 64(7), 1204-1211.

Lucio, M. & Schmitt-Kopplin, P. (2006) Modeling the binding of triazine herbicides to humic

substances using capillary electrophoresis. Environmental Chemistry Letters 4(1), 15-21.

Lüers, F. & ten Hulscher, T.E.M. (1996) Temperature effect on the partitioning of Polycyclic Aromatic

Hydrocarbons between natural organic carbon and water. Chemosphere 33(4), 643-657.

Luo, Y., Pan, L. & Pawliszyn, J. (1998) Determination of five benzodiazepines in aqueous solution

and biological fluids using solid-phase microextraction with carbowax/DVB fiber coating.

Journal of Microcolumn Separations 10(2), 193-201.

MacDonald, B.C., Lvin, S.J. & Patterson, H. (1997) Correction of fluorescence inner filter effects and

the partitioning of pyrene to dissolved organic carbon. Analytica Chimica Acta 338(1-2), 155.

Machatha, S.G. & Yalkowsky, S.H. (2004) Estimation of the ethanol/water solubility profile from the

octanol/water partition coefficient. International Journal of Pharmaceutics 286(1-2), 111-115.

Mader, B.T., Uwe-Goss, K. & Eisenreich, S.J. (1997) Sorption of Nonionic, Hydrophobic Organic

Chemicals to Mineral Surfaces. Environmental Science and Technology 31(4), 1079-1086.

Maskaoui, K., Hibberd, A. & Zhou, J.L. (2007) Assessment of the Interaction between Aquatic

Colloids and Pharmaceuticals Facilitated by Cross-Flow Ultrafiltration. Environmental Science

and Technology 41(23), 8038-8043.

McCarthy, J.F. & Jimenez, B.D. (1985) Interactions between polycyclic aromatic hydrocarbons and

dissolved humic material: binding and dissociation. Environmental Science and Technology

19(11), 1072-1076.

McCarthy, J.F., Roberson, L.E. & Burrus, L.W. (1989) Association of benzo(a)pyrene with dissolved

organic matter: prediction of Kdom from structural and chemical properties of the organic

matter. Chemosphere 19(12), 1911-1920.

Menzie, C.A., Potocki, B.B. & Santodonato, J. (1992) Exposure to carcinogenic PAHs in the

environment. Environmental Science and Technology 26(7), 1278-1284.


Characterisation of Surface Lakewater Samples: Implications for the Quantification of Nitrate

and the Properties of Dissolved Organic Matter. Annali di Chimica 97(10), 1107-1116.

Ministère de l’Écologie, de l’Énergie, du Développement durable et de la Mer, Réglementation

REACH [en ligne], dossier de presse, Juin 2008, <http://www.developpement-

durable.gouv.fr/IMG/pdf/DP_Reach_cle55acde.pdf> (consulté le 01.09.09)

Moeder, M., Schrader, S., Winkler, M. & Popp, P. (2000) Solid-phase microextraction-gas

chromatography-mass spectrometry of biologically active substances in water samples.

Journal of Chromatography A 873(1), 95-106.

Nghiem, L.D., Schafer, A.I. & Elimelech, M. (2006) Role of electrostatic interactions in the retention

of pharmaceutically active contaminants by a loose nanofiltration membrane. Journal of




Bibliographie

294

Nunes, B., Carvalho, F. & Guilhermino, L. (2005) Acute toxicity of widely used pharmaceuticals in

aquatic species: Gambusia holbrooki, Artemia parthenogenetica and Tetraselmis chuii.

Ecotoxicology and Environmental Safety 61, 413-419.

Oetken, M., Nentwig, G., Löffler, D., Ternes, T. & Oehlmann, J. (2005) Effects of Pharmaceuticals

on Aquatic Invertebrates. Part I. The Antiepileptic Drug Carbamazepine. Archives of


Pan, B., Ghosh, S. & Xing, B. (2007a) Nonideal Binding between Dissolved Humic Acids and


Pan, B., Xing, B., Liu, W., Xing, G. & Tao, S. (2007b) Investigating interactions of phenanthrene with

dissolved organic matter: Limitations of Stern-Volmer plot. Chemosphere 69(10), 1555-1562.

Pan, B., Ning, P. & Xing, B. (2008) Part IV—sorption of hydrophobic organic contaminants.


Pan, B., Ning, P. & Xing, B. (2009) Part V—sorption of pharmaceuticals and personal care products.


Parker, C.A. (1968) Photoluminescence of solutions. Amsterdam - London - New York: Elsevier

Publishing Company.




Pawliszyn, J. & Pedersen-Bjergaard, S. (2006) Analytical Microextraction: Current Status and

Future Trends. Journal of Chromatographic Science 44(6), 291-307.

Perdue, E.M. & Ritchie, J.D. (2003) Dissolved organic matter in freshwaters. In Surface and ground

water, weathering and soils, Vol. 5, pp. 273-318. Edited by J.I. Drever. Oxford: Elsevier-

Pergamon.






597-600.

Porschmann, J., Kopinke, F.D. & Pawliszyn, J. (1998) Solid-phase microextraction for determining

the binding state of organic pollutants in contaminated water rich in humic organic matter.

Journal of Chromatography A 816, 159-167.

Puchalski, M.M., Morra, M.J. & Von Wandruszka, R. (1992) Fluorescence quenching of synthetic

organic compounds by humic materials. Environmental Science and Technology 26(9), 1787-

1792.

Raber, B. & Kögel-Knabner, I. (1997) Influence of origin and properties of dissolved organic matter

on the partition of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). European Journal of Soil Science

48(3), 443-455.

Bibliographie

295

Rahman, F., Langford, K.H., Scrimshaw, M.D. & Lester, J.N. (2001) Polybrominated diphenyl ether

(PBDE) flame retardants. The Science of The Total Environment 275(1-3), 1-17.

Schäfer, A.I., Mastrup, M. & Jensen, R.L. (2002) Particle interactions and removal of trace

contaminants from water and wastewaters. Desalination 147(1-3), 243-250.



27(5), 961-969.

Schwaiger, J., Ferling, H., Mallow, U., Wintermayr, H. & Negele, R.D. (2004) Toxic effects of the

non-steroidal anti-inflammatory drug diclofenac: Part I: histopathological alterations and

bioaccumulation in rainbow trout. Aquatic Toxicology 68(2), 141-150.

Schwarzenbach, R.P., Gschwend, P.M. & Imboden, D.M. (1993) Environmental Organic Chemistry.

New York: J. Wiley & Sons.

Senesi, N. (1990) Molecular and quantitative aspects of the chemistry of fulvic acid and its

interactions with metal ions and organic chemicals. Part II. The fluorescence spectroscopy

approach. Analytica Chimica Acta 232, 77-106.

Shirey, R. (2007) Selecting the Appropriate SPME Fiber Coating – Effect of Analyte Molecular Weight

and Polarity. In The Reporter, Vol. 28, pp. 13-15.

Sierra, M.M.D., Giovanela, M., Parlanti, E. & Soriano-Sierra, E.J. (2005) Fluorescence fingerprint of

fulvic and humic acids from varied origins as viewed by single-scan and excitation/emission

matrix techniques. Chemosphere 58(6), 715-733.

Sila-On, W., Vardhanabhuti, N., Ongpipattanakul, B. & Kulvanich, P. (2008) Influence of

incorporation methods on partitioning behavior of lipophilic drugs into various phases of a

parenteral lipid emulsion. AAPS PharmSciTech. 9(2), 684-692.

Simpson, M.J., Simpson, A.J. & Hatcher, P.G. (2004) Noncovalent interactions between aromatic

compounds and dissolved humic acid examined by nuclear magnetic resonance

spectroscopy. Environmental Toxicology and Chemistry 23(2), 355-362.

Sinkkonen, S. & Paasivirta, J. (2000) Degradation half-life times of PCDDs, PCDFs and PCBs for

environmental fate modeling. Chemosphere 40, 943-949.

Soclo, H.H., Garrigues, P. & Ewald, M. (2000) Origin of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) in

Coastal Marine Sediments: Case Studies in Cotonou (Benin) and Aquitaine (France) Areas.

Marine Pollution Bulletin, 40(5), 387-396.

Spohn, U., Paul, W., Alan, T. & Colin, P. (2005) Membrane Techniques | Dialysis and Reverse

Osmosis. pp. 515-524. Oxford: Elsevier.

Srogi, K. (2007) Monitoring of environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons: a review.

Environmental Chemistry Letters 5(4), 169.

Stein, K., Ramil, M., Fink, G., Sander, M. & Ternes, T.A. (2008) Analysis and Sorption of

Psychoactive Drugs onto Sediment. Environmental Science and Technology 42(17), 6415-

6423.

Suffet, I.H., Jafvert, C.T., Kukkonen, J., Servos, M.R., Spacie, A., Williams, L.L. & Noblet, J.A.

(1994) Synopsis of Discussion Session: Influences of Particulate and Dissolved Material on

Bibliographie

296

the Bioavailability Of Organic Compounds. Chapitre 3 dans Bioavailability: Physical, Chemical,

and Biological Interactions. Ann Arbor, MI: Lewis Publishers.

Sun, W.L., Ni, J.R., Xu, N. & Sun, L.Y. (2007) Fluorescence of sediment humic substance and its

effect on the sorption of selected endocrine disruptors. Chemosphere 66, 700-707.

Supelco, Polyethylene Glycol (PEG) SPME Fibers, Product information T407068 [en ligne],

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Supelco/Product_Information_Sheet/t407068.

Par.0001.File.tmp/t407068.pdf (consulté le 01.09.09)

Ter Laak, T.L., Agbo, S.O., Barendregt, A. & Hermens, J.L.M. (2006a) Freely Dissolved

Concentrations of PAHs in Soil Pore Water: Measurements via Solid-Phase Extraction and

Consequences for Soil Tests. Environmental Science and Technology 40(4), 1307-1313.

Ter Laak, T.L., Barendregt, A. & Hermens, J.L.M. (2006b) Freely dissolved pore water

concentrations and sorption coefficients of PAHs in spiked, aged, and field-contaminated soils.


Thacker, S.A., Tipping, E., Baker, A. & Gondar, D. (2005) Development and application of functional

assays for freshwater dissolved organic matter. Water Research 39, 4559-4573.




Tolls, J. (2001) Sorption of Veterinary Pharmaceuticals in Soils: A Review. Environmental Science

and Technology 35(17), 3397-3406.

Tusseau-Vuillemin, M.-H., Gourlay, C., Lorgeoux, C., Mouchel, J.-M., Buzier, R., Gilbin, R.,

Seidel, J.-L. & Elbaz-Poulichet, F. (2007) Dissolved and bioavailable contaminants in the

Seine river basin. Science of The Total Environment 375(1-3), 244-256.

Valeur, B. (2004) Invitation à la fluorescence moléculaire. Bruxelles: De Boeck.

Voulvoulis, N. (2006) Antifouling Paint Booster Biocides: Occurrence and Partitioning in Water and

Sediments. In Antifouling Paint Biocides, pp. 155-170.



Watanabe, I. & Sakai, S.-i. (2003) Environmental release and behavior of brominated flame

retardants. Environment International 29(6), 665-682.

Wijnja, H., Pignatello, J.J. & Malekani, K. (2004) Formation of pi–pi Complexes between

Phenanthrene and Model pi-Acceptor Humic Subunits. Journal of Environmental Quality 33,

265-275.

Woolgar, P.J. & Jones, K.C. (1999) Studies on the Dissolution of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons

from Contaminated Materials Using a Novel Dialysis Tubing Experimental Method.


Yamamoto, H., Liljestrand, H.M., Shimizu, Y. & Morita, M. (2003) Effects of Physical-Chemical

Characteristics on the Sorption of Selected Endocrine Disruptors by Dissolved Organic Matter

Surrogates. Environmental Science and Technology 37(12), 2646-2657.

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Supelco/Product_Information_Sheet/t407068.pdf

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Supelco/Product_Information_Sheet/t407068.Par.0001.File.tmp/t407068.pdf

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Supelco/Product_Information_Sheet/t407068.Par.0001.File.tmp/t407068.pdf

Bibliographie

297



Ying, G.-G. (2006) Fate, behavior and effects of surfactants and their degradation products in the

environment. Environment International 32(3), 417-431.

Zhang, Y-Z, Tang, C-Y., Song, X-F. & Li, F-D. (2009) Behavior and fate of alkylphenols in surface

water of the Jialu River, Henan Province, China. Chemosphere 77, 559–565.

Zimmermann, U., Skrivanek, T. & Löhmannsröben, H.-G. (1999) Fluorescence quenching of

polycyclic aromatic compounds by humic substances. Part 1. Methodology for the

determination of sorption coefficients. Journal of Environmental Monitoring 1(6), 525-532.

299

Annexes techniques

301

ANNEXE 1

Conditions d’extraction LLE des HAP

3 5 mL CH2Cl2 + étalons internes HAP deutérés

solution aqueuse de HAP à quantifier

après agitation et décantation

CH2Cl2 + HAP + HAP deutérés + traces

d‘eau

élimination des traces d’eau

Na2SO4

évaporation sous flux d‘azote (pureté 4.5)

transfert dans flacon d‘injection (isooctane) et ajout d‘étalon seringue

analyse GC-MS

302

ANNEXE 2

Conditions d’extraction SPE des HAP

1) Lavage et

conditionnement

2 3 mL CH2Cl2

1 3 mL MeOH

1 3 mL H2O

Flacon poubelle

Phase C18

2) Passage de l’échantillon et

séchage sous vide

Passage de l‘échantillon

Piégeage des HAP par la phase

Cuve sous vide

3) Élution

3 3 mL CH2Cl2

HAP dans CH2Cl2

Impuretés dans cartouche

évaporation sous flux d‘azote (pureté 4.5)

transfert dans flacon d‘injection (isooctane) et ajout d‘étalon seringue

analyse GC-MS

303

ANNEXE 3

Conditions d’extraction SPE des médicaments

1) Lavage et

conditionnement

1 3 mL éthylacétate (EA)

1 3 mL H2O à pH 2

Flacon poubelle

Phase MCX

2) Passage de l’échantillon et

séchage sous vide

Passage de l‘échantillon

Piégeage des molécules par la phase

Cuve sous vide

3) Élution

1 3 mL EA

1 3 mL EA-acétone (50-50)

1 3 mL CH2Cl2-MeOH (50-50)-2% NH4OH

médicaments

Impuretés dans cartouche

évaporation à sec sous flux d‘azote (pureté 4.5)

transfert dans flacon d‘injection (méthanol) et ajout d‘étalon seringue

dilution des échantillons les plus concentrés dans le solvant puis dilution dans l‘eau (20µL échantillon – 180 µL eau ultrapure) juste avant l‘analyse

analyse LC-MS/MS

304

ANNEXE 4

Conditions d’extraction SPME

Appareil : CombiPal (CTC Analytics)

Tête injection GC-MS : septum ou Merlin Microseal (avec les fibres de gauge 23)

Volume des flacons : 10 mL

Blanc Echantillon

Temps de pré-incubation (s) 50 50 Température d‘incubation (°C) 40 40

Vitesse de préagitation (tours.min-1

) 250 250 Pénétration dans le flacon (mm) 22 22

Temps d‘extraction 10 s 30 min Pénétration dans l‘injecteur (mm) 50 50

Temps de désorption (min) 30 30

305

ANNEXE 5

Conditions d’analyses par GC-MS

Chromatographe en phase gazeuse : Agilent 6890 Series Spectromètre de masse : 5972 Colonne : HP-5MS (5 % phényl - méthylsiloxane) de 30 m de long, 0,25 mm de diamètre interne et de 0,25 µm d‘épaisseur de film. Gaz vecteur : hélium de pureté 5.6 Débit : 1,3 ml.min

-1 en mode débit constant.

Composés analysés HAP médicaments

Injecteur : - température 250 °C 250 °C

- mode injection splitless pulsé (30 psi - 1 min) splitless pulsé (30 psi - 1 min) - débit de purge 55 mL.min

-1 après 2 min 55 mL.min

-1 après 2 min

- économiseur de gaz 20 mL.min-1

après 15 min 20 mL.min-1

après 15 min

Programmation du four : - température initiale 60 °C pendant 2 min 60 °C pendant 2 min - rampe 1 20 °C.min

-1 jusqu‘à 150 °C 20 °C.min

-1 jusqu‘à 280 °C

- rampe 2 15 °C.min-1

jusqu‘à 250 °C - rampe 3 10 °C.min


- température finale 310 °C pendant 3 min 280 °C pendant 6 min - durée totale d‘analyse 22,17 min 19 min

Spectromètre de masse : - délai du solvant 4,5 min 4,5 min

- ionisation électronique électronique - énergie 70 eV 70 eV - mode SIM SIM

- voltage du multiplicateur d‘électrons 2000 V 2000 V - temps d'accumulation 80 ms 90 ms

- cycles/seconde 1,31 1,18

Ions m/z recherchés :

N 128 Carbamazépine, 165 N d8 136 193 Acy 152 236

Acy d8 160 Carbamazépine d10

203

Ace 154 246 Ace d10 164 Diazépam 256

Flu 166 Diazépam d5 261 Flu d10 176 Imipramine 234 Phe - An 178

Phe d10 - An d10 188 DBT 184

DBT d8 192 Fluo - Pyr 202

Fluo d10 – Pyr d10 212 BaA - Chrys 228

BaA d12 - Chrys d12 240 BbF + BkF - BeP - BaP - Per 252

BbF d12 + BkF d12 - BeP d12 - BaP d12 - Per d12

264

IP - BP 276 IP d12 - BP d12 288

DahA 278

DahA d14 292 Les ions m/z en italique sont des ions de confirmation (non utilisés pour la quantification).

306

ANNEXE 6

Conditions d’analyses par GC-MS/MS

Appareil : Quattro micro GC 6890N Micromass MS Technologies de Waters

Colonne : HP-5MS (5 % phénylméthylsiloxane) de 30 m de long, 0,25 mm de diamètre et de 0,25 µm

d‘épaisseur de film.

Gaz vecteur : hélium de pureté 6.0

Débit : 1,3 mL.min-1

en mode débit constant.

Composés analysés HAP Injecteur : - température 250 °C - mode injection splitless - débit de purge 60 mL.min

-1 après 1,5 min

- économiseur de gaz 20 mL.min-1

après 10 min Programmation du four : - température initiale 60 °C pendant 2 min - rampe 1 20 °C.min


- rampe 2 15 °C.min-1

jusqu‘à 250 °C - rampe 3 10 °C.min


- température finale 310 °C pendant 3 min - durée totale d‘analyse 22,17 min Spectromètre de masse : - délai du solvant 4,5 min - ionisation électronique - énergie 70 eV - mode SIM - voltage du photomultiplicateur 580 V - temps d'accumulation 80 ms - cycles/seconde 1,25

Ions m/z et transitions m/z-m/z (énergies de collision en eV) recherchés :

N 128 128-128 (15) 128-102 (15) N d8 136 136-136 (10) 136-108 (10) Acy 152 152-152 (20) 152-151 (21)

Acy d8 160 160-160 (20) 160-158 (15) Ace 154 154-153 (20) 154-152 (27)

Ace d10 164 164-162 (10) 164-160 (25) Flu 166 166-165 (20) 166-164 (35)

Flu d10 176 176-174 (15) 176-172 (25) Phe - An 178 178-178 (14) 178-152 (14)

Phe d10 - An d10 188 188-188 (18) 188-160 (18) DBT 184 184-184 (14) 184-152 (14)

DBT d8 192 192-192 (15) Fluo - Pyr 202 202-202 (20) 202-200 (20) Fluo d10 – Pyr d10 212 212-212 (20) 212-208 (20) BaA - Chrys 228 228-228 (20) 228-226 (23) BaA d12 - Chrys d12 240 240-240(18) 240-236(18) BbF + BkF - BeP - BaP - Per 252 252-252 (25) 252-250 (30) BbF d12 + BkF d12 - BeP d12 -

BaP d12 - Per d12 264 264-264 (25) 264-260 (25)

IP - BP 276 276-276 (25) 276-274 (45) IP d12 - BP d12 288 288-288 (25) 288-284 (30) DahA 278 278-278 (25) 278-276 (27) DahA d14 292 292-292 (25) 292-288 (30)

Les transitions en italique sont des transitions de confirmation (non utilisées pour la quantification).

307

ANNEXE 7

Conditions d’analyses par LC-MS/MS

Appareil : Agilent 1200 Series 6410 Triple Quad LC/MS

Colonne : Zorbax SB C18, 50 2,1 mm ; 1,8 µm

Générateur d’azote : Mistral (Schmidlin-DBS AG)

Composition de la phase mobile : - solvant voie A : eau ultrapure, 0,1 % acide formique

- solvant voie B : méthanol, 0,1 % acide formique

Débit de la phase mobile : 0,5 mL.min-1

Volume d’injection : 5 µL

Gradient d’élution : Voie B (%)

- 0-12 min 0

- 12-13 min 65

- 13-15 min 100

- 15-20 min 0

- durée totale d‘analyse 20 min

Spectromètre de masse :

- mode d‘ionisation électronébulisation

- polarité positive

- mode d‘acquisition MRM

- potentiel du capillaire 3000 V

- température du gaz 300 °C

- débit du gaz 11 mL.min-1

- pression nébulisateur 30 psi

- temps d'accumulation 10 ms

Transitions m/z-m/z (énergies du fragmenteur ;

énergies de collision, en eV) observées :

carbamazepine 237-194 (130 ; 20) 237-192 (120 ; 20)

diazépam 285-154 (120 ; 28) 285-256.7 (120 ; 22)

diazépam d5 290-154 (120 ; 30)

imipramine d4 285-85.7 (120 ; 22)

Les transitions en italique sont des transitions de confirmation (non utilisées pour la quantification).

308

ANNEXE 8

HAP natifs et deutérés utilisés

HAP Pureté

(%) Fournisseur m/z

Etalons internes

Pureté isotopique

(%) Fournisseur m/z

Naphtalène (N) 99+ Aldrich 128 N d8 98 EGA-

Chemie 136

Acénaphthylène (Acy) 99+ Aldrich 152 Acy d8 98 Promochem

(CIL) 160

Acénaphtène (Ace) 99 Aldrich 154 Ace d10 99 Promochem

(CIL) 164

Fluorène (Flu) 99+ Aldrich 166 Flu d10 98 Promochem

(CIL) 176

Dibenzothiophène (DBT)

99 Acros 184 DBT d8 99 MSD

Isotopes 192

Phénanthrène (Phe) 99 Aldrich 178 Phe d10 98 CIL 188

Anthracène (An) 98 Labosi 178 An d10 98 CIL 188

Fluoranthène (Fluo) 99 Aldrich 202 Fluo d10 99.2 MSD

Isotopes 212

Pyrène (Pyr) 99+ Fluka 202 Pyr d10 98 CIL 212

Benzo[a]anthracène (BaA)

99 Aldrich 228 BaA d12 98 Promochem

(CIL) 240

Chrysène (Chrys) 99+ Fluka 228 Chrys d12

98 MSD

Isotopes 240

Benzo[b]fluoranthène (BbF)

99 Aldrich 252 BbF d12 98 CIL 264

Benzo[k]fluoranthène (BkF)

98 Aldrich 252 BkF d12 98 Promochem

(CIL) 264

Benzo[e]pyrène (BeP) 99 Aldrich 252 BeP d12 98 CIL 264

Benzo[a]pyrène (BaP) 97 Aldrich 252 BaP d12 98 CIL 264

Pérylène (Per) 99+ Aldrich 252 Per d12 99.5 MSD

Isotopes 264

Indeno[1,2,3-cd]pyrène (IP)

99 Promochem 276 IP d12 98+ Promochem

(CIL) 288

Benzo[g,h,i]pérylène (BP)

99.7 Promochem 276 BP d12 98 CIL 288

Dibenz[a,h]anthracène (DahA)

97 Aldrich 278 DahA d14

98 Promochem

(CIL) 292

309

ANNEXE 9

Conditions expérimentales de la spectrofluorimétrie

Appareil : Fluorolog FL3-22 (Jobin-Yvon)

Temps d’intégration : 0,5 s

Incrément longueurs d’onde d’émission : 1 nm

Bandes passantes d’excitation et d’émission : 4 nm

Spectrofluorimétrie tridimensionnelle : accumulation de 17 spectres 2D :

- excitation de 250 à 410 nm, incrément de 10 nm

- émission de 260 à 700 nm

Documents

Etude des interactions matiere organique dissoute ...ori-oai.u-bordeaux1.fr/pdf/2009/DE_PERRE_CHLOE_2009.pdf · 4 dans les ports du Bassin. En parlant de promenade, je remercie aussi