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Salima HADJEBA BTS 1 ère année Lycée Déodat de Séverac

Etude d'une méthode conduisant à l'extraction la séparation et l'identification de la chlorophylle

dans un végétal

Stage à l'ENFA du 11 mai au 04 juillet 2015 Tutrice : Christine DUCAMP

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SOMMAIRE Présentation du sujet I. Les méthodes d'extractions et de séparations 1.Chromatographie sur couche mince 2.Chromatographie sur colonne 3.Spectre d'absorption II. La solution d'épinards E III. Reproductibilité des manipulations : 1.Chromatographie sur couche mince 2.Chromatographie sur colonne V. Essais

I. Modification des éluants 1.Diminuer la quantité d'éthanol 2.Ajout d'un autre solvant 3.Changements des pourcentages de solvants 4.Remplacement du cyclohexane par de l'eau II. Modification de la silice 1.Grosseur de la silice 2.Modification de la quantité de silice Conclusion Annexes 1.Manipulation et mode opératoire 2.Tableau fiche toxicologique

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Présentation du sujet Tout au long de ce stage, j'ai continué à la mise au point d'une méthode pour extraire et séparer les constituants de la solution de chlorophylle des épinards. Les étudiants précédents avaient déjà commencé la partie extraction de la chlorophylle et la partie Chromatographie sur Couches Minces (CCM). Le but de ce sujet est de trouver la faisabilité d’une extraction, la CCM, la séparation par chromatographie sur colonne et l'identification par spectrométrie pour une séance de travaux pratiques (TP) d'une heure trente dans le contexte d'un TP de classe de Lycée. Dans ce rapport je vais vous présenter les expériences réalisées, les analyses effectuées pour arriver à mettre au point cette séance.

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I. Les méthodes d'extractions et de séparations

1. Chromatographie sur couche mince (CCM) Il y'a plusieurs utilisations d'une analyse CCM. Dans ce cas l'analyse CCM sert à voir comment se séparent les constituants pour ensuite les séparer et récupérer avec une chromatographie sur colonne. La chromatographie sur couche mince sert à tester la séparation avec différents solvant plus ou moins polaires en fonction des composés à séparer. La phase stationnaire est constituée d'une couche solide et le gel de silice déposé par dessus sert de support. Nous avons utilisé des plaques ALLUGRAM SIL G/UV REF 81813. La phase mobile constituée de l'éluant est entrainée par capillarité en haut de la plaque. Pour réaliser une CCM il faut tout d'abord choisir un ou plusieurs solvants qui permettront la séparation des différents constituants de la chlorophylle. Le choix de l'éluant dépend de la polarité des solvants choisi.

Schéma chromatographie sur couche mince

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2. Chromatographie sur colonne La chromatographie sur colonne est une méthode permettant de séparer les constituants d'une solution. C'est une séparation liquide-liquide. Dans la chromatographie sur colonne il y a toujours une phase mobile et une phase stationnaire. La phase stationnaire : Cette phase est composée le plus souvent de silice ou de gel de silice qui est fixé dans la colonne (on peut aussi utiliser le sucre glace par exemple). Elle va permettre de retenir plus ou moins l'éluant sur la phase mobile. La phase mobile : La phase mobile est constituée de l'éluant qui va servir à entraîner la solution en bas de la burette au contact de la phase stationnaire. C'est la polarité ou non de l'éluant suivant la phase stationnaire qui va déterminer le temps de la colonne. J'ai utilisé une burette à la place d'une pipette.

Schéma chromatographie sur colonne

J'utilise quatre éluants avec les mêmes solvants mais avec des proportions différentes. Il faut quatre éluants pour que les quatre constituants de la chlorophylle ne descendent pas à la même vitesse. Il faut choisir les différentes proportions des éluants en fonction de la polarité des quatre constituants. Les quatre constituants ont des polarités différentes Les carotènes sont des composés apolaires, ne comportant pas d’atome d’oxygène et ne sont donc pas retenus par le support solide. C'est donc les carotènes qui descendront le plus rapidement. Les chlorophylles sont des composés peu polaires. La chlorophylle b se différencie de la chlorophylle a par la présence d'un groupement aldéhyde (-CHO) au lieu d’un méthyle (CH3). La chlorophylle b est donc plus polaire et plus retenue par le support solide que la chlorophylle a. Les Xanthophylles sont polaires car ils ont de nombreux atomes d'oxygènes qui vont s'accrocher au support solide.

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3. Spectre d'absorption La spectrométrie d'absorption est une analyse est une méthode physique d'analyse chimique. Elle se fait principalement sur des liquides. L'absorbance mesure la capacité d'un milieu à absorber la lumière. Pour réaliser le spectre d'absorbances, on relève l'absorbance en fonction de la longueur d'onde. Les 4 composants de la chlorophylle ont des pics d'absorptions différents. Cela permet de les différencier et de faire un point sur la qualité de la séparation. Pics d'absorbance théorique : Ces valeurs serviront de comparatifs pour les spectres d'absorbances que je réaliserais. Carotène : pic 450 nm Chlorophylle A : pic 430 nm et 660 nm Chlorophylle B : pic 440 nm et 650 Xanthophylle : pic 470 nm et 580 nm Spectre d'absorbance théorique :

Spectre d'absorption expérimental : E1 : Carotènes E2 : Chlorophylle A E3 : Chlorophylle B E4 : Xanthophylles En comparant les deux spectres j'en conclu que le spectre expérimental est similaire au théorique. Je me servirais donc de ce spectre comme comparatif pour les prochaines manipulations.

0 200 400 600 800 10000

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Longueur d'ondes

Abso

rban

ces

E1

E2

E3

E4

Spectre d'absorption expérimental (ENFA,2015)

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II. La solution d'épinards notée E La solution extraite à partir d'épinard (appelé solution E) contient quatre constituants principaux que l'on peut facilement identifier au spectrophotomètre après séparation sur chromatographie sur colonne. La chlorophylle est un pigment présent dans toutes les plantes de la planète Terre. Le spectre d'absorption de la chlorophylle est responsable de la couleur verte des plantes. Dans la chlorophylle il y a plusieurs composés. Les Caroténoïdes sont des pigments de couleurs orange et jaune présents dans de nombreux organismes vivants. C'est une catégorie qui regroupe :

• Les carotènes : pigment de couleur jaune très important pour la photosynthèse. Les carotènes sont tous les carotènoïdes qui ne sont pas oxygénés. Elles se trouvent dans certains fruits et végétaux.

• Les xantophylles : Molécules dérivées des carotènes. La chlorophylle A : C'est le pigment photosynthétique le plus commun. Il est présent dans tous les végétaux. La chlorophylle B : C'est un pigment presque identique à celui de la chlorophylle a. Il y a qu'un seul groupement qui les différencie.

Carotène

Xanthophylle

Chlorophylle A Chlorophylle B

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III. Reproductibilité des manipulations

Les mises aux points des manipulations des étudiants précédents me serviront de base. Je les ai donc reproduites. Voir les expériences réalisées en annexe 1. Voici un comparatif des résultats que j'ai obtenus et leurs résultats sur les mêmes manipulations.

1. Chromatographie sur couche mince (CCM) Les CCM sont réalisées avec des épinards frais congelés

Eluant Interprétation Calculs des RF

CCM étudiants

Ether de pétrole Ether diéthylique

Acétone

60%

20%

20%

Tâches plus proches et plus concentrées

RF1:0,43 RF2:0,55 RF3:0,65

RF4:1

70%

15%

15%

Tâches plus espacées, moins concentrées

RF1 :0,34 RF2:0,44 RF3:0,53

Rf4:1

Ma CCM

Ether de pétrole Ether diéthylique

Acétone

60%

20%

20%

Constituants bien séparés

Tâches moins concentrées

RF1 :0,66 RF2 :0,83 RF3:0,93

RF4:1

70%

15%

15% Tâches bien séparées,

moins concentrées RF1:0,30 RF2 :0,55 RF3:0,67

RF4:1 Conclusion : Les résultats obtenus sont très proches des résultats précédents réalisés par d’autres étudiants. Les Rf sont différents ou légèrement différents : cela peut être dû au changement de manipulateur ainsi que la différence de température (expériences précédentes effectuées en février).

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2. Chromatographie sur colonne

Eluant Préparation de la colonne

Temps Interprétation

Colonne étudiant

Cyclohexane Ethanol 6g de silice 0,063-0,2 mm.

12,5 mL d'éluant. 0,5 cm de sable

Fontainebleau en haut et en bas.

Coton en bas de la burette

30 min

Séparation entre

chlorophylle A et B insuffisante

Bonne séparation de la xanthophylle

98% 2%

95% 5%

85% 15%

70% 30%

1

Cyclohexane Ethanol 6g de silice 0,063-0,2 mm.

12,5 mL d'éluant. 0,5 cm de sable

Fontainebleau en haut et en bas.

Coton en bas de la burette

1h15

Carotène bien séparé de la

chlorophylle A Chlorophylle A et

B pas assez séparés Xanthophylle bien

séparé de la chlorophylle B

98% 2% 95% 5%

85% 15%

70% 30%

Conclusion : La séparation des constituants se fait de la même manière dans les deux colonnes. Il y a néanmoins une grande différence de temps entre les deux manipulations. Ce qui pourrait expliquer cette si grande différence de temps entre les deux chromatographies sur colonne faites dans les mêmes conditions est que les épinards frais congelés utilisés sont les mêmes et que les colonnes ont était faite à un an d'intervalle. Les épinards ont pu se dégrader même conserver au congélateur et ainsi la chlorophylle n'est pas de même qualité.

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IV. ESSAIS La mise au point de la chromatographie sur couche mince a été réalisé par les étudiants antérieur. Je ne reviendrais pas sur cette manipulation. Il faut donc mettre au point la chromatographie sur colonne pour séparer la solution E en moins de temps possible pour pouvoir faire le TP en 1h30. C'est le but de mon stage. Dans ce paragraphe, je vais développer le cheminement de mes manipulations. Pour trouver la bonne méthode je peux modifier certains paramètres. Il faut par contre changer qu'un seul paramètre à la fois pour pouvoir comparer avec les manipulations précédentes. Les paramètres que je peux changer pour diminuer le temps de la chromatographie sur colonne et la séparation des différents constituants de la solution E sont :

• Les éluants :les solvants et la proportion des solvants. • La silice : sa grosseur et sa quantité

I. Modifications des éluants

1. Diminuer la quantité d'éthanol

La diminution de la quantité d'éthanol diminuera peut-être le temps de la chromatographie sur colonne car l'éthanol est un solvant polaire donc plus le solvant est polaire et a d'atomes d'oxygène plus l'éluant restera accroché à la phase stationnaire.

Eluant Préparation de la colonne

Temps Interprétation

4

Cyclohexane Ethanol 6g de silice 0,063-0,2 mm

12,5 ml d'éluant 0,5 cm de sable Fontainebleau bout de coton

1h30

Les chlorophylle A et B ne sont pas séparées

99% 1% 97% 3% 90% 10% 85% 15%

5

Cyclohexane Ethanol 6g de silice 0,063-0,2 mm

12,5 ml d'éluant 0,5 cm de sable Fontainebleau bout de coton

1h15

Les constituants sont bien séparés

99,5% 0,5% 99% 1% 95% 5% 90% 10%

Conclusion : Après avoir diminué au maximum la quantité d'éthanol je constate que cela améliore la séparation des constituants de la solution E et diminue aussi un peu le temps de la séparation de ses constituants. Il n’y a pas de changements significatifs. Je garderais donc la manipulation n°1 comme manipulation de base

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2. Ajout d'un autre solvant : Le méthanol

La chromatographie précédente a bien fonctionné mais le temps de la colonne est encore trop long. La viscosité de l'éluant a un rôle à jouer dans la vitesse de l'élution de l'éluant. Plus l'éluant est visqueux plus l'élution sera lente. Je choisi donc un troisième éluant moins visqueux pour diminuer le temps de la séparation. Le méthanol est moins visqueux que l'éthanol est a les mêmes caractéristiques. Il pourra donc séparer les constituants de la solution E de la même manière. Formule developper Polarité/Proticité Viscosités Ethanol CH3-CH2-OH Polaire/Protique 1,20 mPa·s à 20°C Méthanol CH2-OH Polaire/Protique 0,59 mPa·s à 25°C Voici un tableau récapitulatif de la chromatographie sur colonne faite avec le méthanol

Eluant Extractions Préparation de la colonne Intérprétation 6

Cyclohexane Méthanol

Épinard Congelés

6g de silice 0,063-0,2 mm

12,5 mL d'éluant 98% cyclohexane et 2% éthanol

0,5 cm de sable Bout de coton

Le dépôt de la solution E n'est pas descendu.

Aucune séparation n'est

visible.

98% 2% 95% 5% 85% 15% 70% 30%

Conclusion : La chromatographie sur colonne avec le méthanol qui remplace l'éthanol ne fonctionne pas. J'ai donc essayé de changer les proportions du cyclohexane et du méthanol.

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3. Changement des pourcentages des solvants

Eluant Extractions Préparation de la colonne Interprétation des résulats

7

Cyclohexane Méthanol

Épinards Congelés

6g de silice 0,063 à 0,2

mm 12,5 mL d'éluant 95% Cyclohexane et 5% de

méthanol. 0,5 cm de sable bout de coton

Le dépôt de la solution E n'est pas descendu

95% 5%

90% 10%

85% 15%

80% 20%

8

Cyclo-hexane

Éthanol Méthanol

Épinards Congelés

6g de silice 0,063 à 0,2

mm 12,5 mL d'éluant 95% cyclohexane et 5% de

méthanol. 0,5 cm de sable bout de coton

Les composants ne sont pas bien

séparés Il manque un

composé. Durée de la

colonne: 40mn

95% 2,5% 2,5% 90% 5% 5% 85% 7,5% 7,5% 80% 10% 10%

Conclusion : La chromatographie sur colonne avec le cyclohexane et le méthanol ne fonctionne pas. Celle avec le cyclohexane, l'éthanol et le méthanol ne séparent pas correctement les constituants de la solution E. De plus, le cyclohexane n'est pas complètement soluble avec le méthanol. Le dernier échantillon prélevé a deux phases et ne peut donc pas passer au spectrophotométre. Le changement des pourcentages des solvants ne donne aucune amélioration.

4. Remplacement du cyclohexane et de l'éthanol par de l'eau J'utilise l'eau comme éluant pour ces chromatographies sur colonne parce que l'eau n'est pas toxique , peu coûteuse et qu'elle est polaire et protique. Cela signifie qu'elle peut remplacer l'éthanol qui est aussi polaire et protique. Je réalise deux colonnes avec deux extractions différentes (épinard frais et congelés) pour comparer les résultats des deux séparations et voir si j'obtiens les mêmes résultats.

Eluant Extraction Préparation de la colonne Interprétation 9

Eau

Epinard frais congelés

Extraction à partir d'épinards congelés

6g de silice 0,2-0,5 mm 12,5 mL d'eau distillée

0,5 cm de sable de Fontainebleau Bout de coton

Aucune séparation visible

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Eau

Epinard congelés

Extraction à partir d'épinards frais 6g de silice 0,2-0,5 mm 12,5 mL d'eau distillée

0,5 cm de sable de Fontainebleau Bout de coton

Aucune séparation

visible

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Conclusion : Les chromatographies sur colonne avec de l'eau ne fonctionnent pas quel que soit les épinards utilisés. L'eau n'est donc pas un solvant approprié pour cette séparation. Après avoir essayé plusieurs chromatographies en ne changeant que les éluants et leurs proportions, j'en conclus que je garderais l'éluant éthanol/cyclohexane en modifiant d'autres paramètres dans l'optique d'améliorer la séparation et la durée de la chromatographie sur colonne. J'ai réalisé plusieurs essais :

• Changement des solvants : essais avec le méthanol et l'eau n'ont pas fonctionné • Changement des pourcentages des solvants : Diminution de la quantité d'éthanol ne donne pas

de changement significatif Je garde alors la manipulation n°1 comme manipulation de référence.

Eluant Extractions Préparation de la colonne 1

Cyclohexane Ethanol

Epinard Frais Congelès

6g de silice 0,063-0,2 mm

12,5 mL d'éluant 98% cyclohexane et 2% éthanol

0,5 cm de sable Bout de coton

98% 2% 95% 5% 85% 15% 70% 30%

II. Modification de la silice.

1. Grosseur de la silice La silice est fondamentale pour la séparation avec une chromatographie sur colonne. Je change donc la silice de 0,063-0,2 mm par une silice plus épaisse : 0,2-0,5 mm.

Colonne à partir d'épinard congelés

Colonne à partir d'épinard frais

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Voici un tableau récapitulatif :

Eluant Extraction Préparation de la colonne

Temps Interprétation des résultat

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Cyclohexane Éthanol

Épinards congelés

6g de silice 0,2-0,5

mm 12,5 mL d'éluant

0,5 cm de sable de Fontainebleau en haut de la burette.

Bout de coton en bas de la burette.

Aucune séparation visible

98% 2%

95% 5%

85% 15%

70% 30%

12

Cyclohexane Éthanol

Épinards frais

congelés

6g de silice 0,2-0,5 mm

12,5 mL d'éluant 0,5 cm de sable de Fontainebleau en haut de la burette.

Bout de coton en bas de la burette.

1h25

La silice a formé une crevasse. Le

dernier constituant y est

resté coincé.

99% 1% 95% 5% 90% 10%

85% 15%

13

Cyclohexane Éthanol

Épinards frais

congelés

6g de silice 0,2-0,5

mm 12,5 mL d'éluant

0,5 cm de sable de Fontainebleau en haut de la burette.

Bout de coton en bas de la burette.

40 min

Les couleurs sont bien visibles.

Les constituants sont bien séparés.

Le temps de la colonne a beaucoup

diminué mais est encore un peu

trop long.

99% 1%

95% 5%

90% 10%

85% 15% Conclusion : La silice 0,2-0,5 mm améliore nettement le temps de la colonne. Les constituants sont bien séparés. Je garderais donc cette silice pour les prochaines chromatographies en changeant d’autres paramètres.

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Cette chromatographie n°13 sur colonne sera ma manipulation de référence car c'est celle qui a donné de meilleur résultat.

Eluant Préparation de la colonne Temps Interprétation des résultats

Ref

Cyclohexane Éthanol 6g de silice 0,2-0,5 mm 12,5 mL d'éluant

0,5 cm de sable de Fontainebleau en haut de

la burette. Bout de coton en bas de la

burette.

40 min

Les couleurs sont bien visibles.

Les constituants sont bien séparés. Le temps de la

colonne a beaucoup diminué mais est encore un peu trop

long.

99% 1% 95% 5% 90% 10% 85% 15%

2. Modification de la quantité de la silice. Le fait de modifier la quantité de la silice modifie sa hauteur dans la colonne. Diminuer cette quantité peut donc diminuer la durée de la séparation mais aussi sa qualité. C'est pour cela que je vais diminuer la quantité de silice.

Eluants Préparation de la colonne Temps Interprétation

14

Cyclohexane Ethanol 6g de silice 0,2-0,5 mm. 12,5 mL d'éluant 99% cyclohexane

1% éthanol. Coton et 0,5 cm de sable.

40 min

Les constituants sont bien séparé

99% 1% 95% 5% 90% 10% 85% 15%

15

Cyclohexane Ethanol 4g de silice 0,2-0,5 mm. 12,5 mL d'éluant 99% cyclohexane

1% éthanol. Coton et 0,5 cm de sable.

25 min

Les constituants sont bien séparés

99% 1% 95% 5% 90% 10%

85% 15% Conclusion : Diminuer la quantité de silice diminue la durée de la séparation des différents constituants de la solution E. La chromatographie sur colonne n°16 est celle qui a le mieux fonctionné et celle qui a pris le moins de temps. L'objectif de mettre au point une méthode de séparation des constituants de la solution E qui dure le moins de temps possible dans l'optique de reproduire cette méthode dans le cadre d'un TP d'1h30 est atteint.

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E1 : Carotène E2 : Chlorophylle A E3 : Chlorophylle B E4 : Xanthophylle Conclusion : les conditions maximales que nous avons trouvé sont les suivantes : Eluant Extraction Préparation de la

colonne Temps Interprétation

Cyclohexane Ethanol Épinard Frais

4g de silice 0,2-0,5 mm. 12,5 mL d'éluant

99% cyclohexane 1% éthanol.

Coton et 0,5 cm de sable.

25 min

Les

constituants sont bien séparés

99% 1% 95% 5% 90% 10% 85% 15%

0 200 400 600 800 10000

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Longueur d'ondes

Abso

rban

ce E1

E4

E5

E7

Spectre d'absorption expérimental (ENFA,2015)

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CONCLUSION J'ai effectué mon stage au sein de l'École National de Formation Agronomique. Lors de ce stage de 8 semaines, j'ai pu mettre en pratique mes connaissances acquises durant ma 1 ère année de BTS Chimie. De plus j'ai pu découvrir le monde du travail et le fonctionnement d'un laboratoire dans une école agronomique. Après ma rapide intégration dans l'équipe avec laquelle j'ai travaillé, j'ai eu l'occasion de réaliser plusieurs tâches qui ont constitué ma mission de stage. Ce stage m'a aussi permis d'apprendre de nouvelles techniques et d'apprendre la chimie verte. C'est une très bonne expérience professionnelle qui m'a permis d'approfondir mes connaissances dans le cadre de ma formation. Enfin je pense que cette expérience m'a offert une bonne préparation à mon insertion professionnelle car elle fut pour moi très enrichissante.

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Annexe 1 : Manipulation et mode opératoire (déjà mise au point par des précédents stagaires)

I. Extraction de la chlorophylle à partir d'épinard frais.

Pour extraire la chlorophylle , il faut d'abord peser 10g d'épinard frais et les découper pour qu'il ne reste plus que les feuilles. Il faut ensuite ajouter 10 ml d'éthanol Une fois l'éthanol ajouté il faut broyer les épinards jusqu'à que le solvant ai une couleur verte bien marqué comme la photo ci dessous. Cette manipulation doit se faire sous hotte car l'éthanol et le dichlorométhane sont des produits plus ou moins toxique.

II. Chromatographie sur Couche Mince Mode opératoire : Mettre la plaque de silice dans l'étuve à 110°C pendant 10 mn pour la régénérer. Pendant ce temps préparer 10 mL d'éluant : 60% d'éther de pétrole , 20% d'acétone et 20% d'éther diéthylique dans une cuve ou un bécher haut. Déposer quelques gouttes de la solution E précédemment extraite a l'aide d'un tube capillaire. Poser la plaque dans la cuve verticalement. Attendre que l'éluant arrive au ¾ de la plaque ( front d'élution ). Interprétation des résultats

Xanthophylle

Chlorophylle A Chlorophylle B

Carotène

Schéma chromatographie sur couche mince

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III Chromatographie sur colonne

1) Choix des éluants et des proportions

Pour choisir les éluants il faut prendre en compte la surface mobile et la solution que l'on veut séparer. Pour cette chromatographie sur colonne j'utilise de l'éthanol et du cyclohexane. L'éthanol est polaire. Il faut mettre une faible quantité d'éthanol car plus la molécule est polaire et à d'atomes d'oxygène plus l'éluant restera accroché à la phase stationnaire. Le cyclohexane est apolaire donc il ne s'accrochera pas avec la phase stationnaire, il est soluble dans l'éthanol. 1 er éluant : 98% de cyclohexane et 2% éthanol. 2 ème éluant : 95% de cyclohexane et 5% d'éthanol. 3 ème éluant : 85% cyclohexane et 15% éthanol 4 ème éluant : 70% cyclohexane et 30% éthanol

2) Préparation de la colonne Préparer 50 mL d'éluant 98% de cyclohexane et 2% d'éthanol Placer un bout de coton en bas de la burette. Mettre quelques gouttes d'éluant pour que ce soit bien imbibé. Ajouter 0,5 cm de sable de Fontainebleau Peser 6g de silice 0,063-0,2 mm et ajouter 12,5 mL de l'éluant précédemment préparé. Mélanger jusqu'à que ça forme un gel de silice. Verser le gel de silice dans la burette en évitant la formation de bulle. Nettoyer le gel de silice qui est resté accroché à la paroi de la colonne avec un peu d'éluant. Remarque : Il faut toujours que le gel de silice soit recouvert d'éluant pour ne pas qu'il sèche. La colonne

20

est prête à être utilisée.

3) Préparation de la solution de chlorophylle Une fois la solution E extrait des épinards, placer la solution E dans un erlenmeyer et la chauffer au bain marie à 95°C jusqu'à qu'elle soit totalement desséchée. Resolubiliser ensuite la solution E avec quelques gouttes de l'éluant précédemment utiliser pour le gel de silice. Verser ensuite la solution E resolubiliser dans la colonne et commencer la séparation. Ajouter le 1 er éluant jusqu'à que la couleur jaune arrive en bas de la burette. Changer de flacon pour la récupérer. Ajouter ensuite le 2 ème éluant pour faire descendre la couleur vert-bleu. Une fois la couleur vert bleu en bas de la burette, changer de flacon pour la récupérer. Ajouter ensuite le 3 ème éluant pour que la couleur vert jaune descende en bas de la burette. Changer de flacon une fois que la couleur en bas de la burette. Ajouter le 4 ème éluant pour faire descendre la couleur jaune.

4. Interprétation des résultats Pour vérifier si les échantillons récoltés sont bien les produits attendus, je réalise une analyse spectrophotométrique qui permet de relever l'absorbance de la solution à analyser. Le spectrophotomètre fait passer une lumière blanche à travers une longueur l de solution et compare son intensité avec celle d’un faisceau de lumière blanche qui n’aurait pas traversé la solution. Le rapport sans unité donne l'absorbance de l’espèce colorée pour chaque radiation composant la longueur d’onde: on obtient alors un spectre.

Chromatographie sur colonne

22

Annexe 2: Tableau fiche toxicologique

Extraction et chromatographie sur colonne

Numéro C.A.S

Solubilité Polarité/ Proticité

Toxicité / Pictogramme de danger

Éthanol

64-17-5

Miscible dans l'eau, Complète dans les solvants polaires et

apolaires (acétone,éther diéthylique)

Polaire / Protique

Inflammable

Dichlorométhane

75-09-2

dans l'eau à 20°C :13g/L 100g/l dans l'acétone,

l'éthanol, l'éther diéthylique

Polaire / Aprotique

Nocif pour la santé

Méthanol

67-56-1

miscible dans l'eau et dans l'acétone en

toute proportion

Polaire / Protique

Inflammable

Nocif pour la santé

Danger

Cyclohexane

110-82-7

dans l'eau :nulle soluble dans l'alcool,

l'éther et dans l'acétone.

100 mL de méthanol dissout

57g à 20°C

Apolaire / Aprotique

Inflammable Nocif pour la

santé

Dangereux

pour

l'environnement

23

Chromatographie sur couche mince

Numéro C.A.S Solubilité Polarité / Proticité

Toxicité/ Pictogramme de danger

Ether diéthylique

60-29-7

Miscible avec l'éther de pétrole soluble l'acétone très soluble dans

l'éthanol Faiblement soluble

dans l'eau

Peu polaire

Danger

Inflammable

Ether de pétrole

64742-49-0

Soluble dans l'éther diéthylique et dans l'acétone

Apolaire / Aprotique

Inflammable Nocif pour la

santé

Dangereux pour

l'environnement

Acétone

67-64-1

miscible avec

l’eau, l’éthanol, l’oxyde de

diéthyle, les esters

Polaire /

Aprotique

Inflammable

Danger