Étude Qualitative et Quantitative des Inhibiteurs de Croissance Présents dans les Exsudats de Racines de Chénopode Blanc (Chenopodium album L.) au Début de sa Floraison en Culture

INRA, Laboratoires de Malherbologie (Dijon) et des Mediateurs Chimiques (St-Remy-Ies-Chevreuse), France

Etude Qualitative et Quantitative des Inhibiteurs de Croissance Presents dans les Exsudats de Racines de Chenopode Blanc (Chenopodium album L.) au Debut de sa Floraison en Culture Hydroponique et sous Conditions Controlees

Qualitative and Quantitative Study of Growth Inhibitors in Root Exudates of Common Lambsquarters (Chenopodium album L.) at the Beginning of its Flowering in Hydroponic Culture and under Controlled Conditions

JEAN-PIERRE CAUSSANEL et GERHARD KUNESCH

Avec 5 figures

Re~u Ie 21 novembre 1978 . Accepte Ie 10 janvier 1979

Summary

The exudation of Chenopodium album L. in distilled water was studied under the controlled conditions of a growth room. The exudates of plants beginning to flower show a growth inhibitory effect, measured by the elongation of the main root of maize developing seeds.

The inhibitory effect increases with the time of exudation (from 2 to 6 days) and with the exudate concentration of Chenopodium album L. (from 2,5 to 20 g fresh matter in 10 ml water extract).

Differences in the degree of inhibition are observed according to the methods used to obtain exudates: at the flowering stage, the exudates of common lambsquarters collected in fields or grown in POts are more inhibitory than those of common lambs quarters grown on hydroponic culture. These differences may be explained by the results obtained after the purification of exudates: Sephadex gel column chromatography enabled us to separate twO inhibitory fractions in the exudate of common lambsquarters grown on soil and only one in the exudate of common lambs quarters grown on nutrient solution. This last inhibitory fraction is common to both exudates, whatever the culture medium tested may be; it contains oxalic acid identified by lsC-NMR spectrometry. Oxalic acid is found in exudates of common lambsquarters at concentrations high enough (2,5 to 5 10-s Mil) to be responsible for the growth inhibitory effect observed.

Key words: Chenopodium album, exudates, Sephadex gel chromatography, oxalic acid.

Introduction

Le chenopode blanc (Chenopodium album L.) est une des especes les plus aptes a coloniser de nouvelles aires (LEROY HOLM et ai., 1977) et, dans certaines regions

z. P/lanzenphysiol. Bd. 93. S. 229-243. 1979.

230 JEAN-PIERRE CAUSSANEL et GERHARD KUNESCH

franpises, une adventice tres repandue des cultures de mats. Dans ces cultures, Ie fort pouvoir competitif du chenopode blanc est connu depuis longtemps (VENGRIS et al., 1955). Dans les conditions contr8lees d'une salle cIimatisee, nous avons mis en evidence un effet con curren tiel important de la part de cette adventice sur Ie mats, au moyen d'essais biologiques de courte duree: en culture sur sol comme en culture hydroponique, l'inhibition de 70 % de la croissance du mais est atteinte lorsque des chenopodes proches de la floraison sont laisses en concurrence pendant trois semaines avec des plantules de mais au stade 2 feuilles en debut d'experience (CAUSSANEL, 1978 a).

Le mais est egalement tres sensible aux effets alIelopathiques de mauvaises herbes comme Setaria faberii HERRM. (BELL et KOEPPE, 1972) ou Rumex crispus L. (EINHELLIG et RASMUSSEN, 1973). En France, il a ete cons tate qu'il suffisart de quelques pieds de chenopodes au metre carre pour provoquer une diminution appreciable a l'oeil de la taille du mais (LONGCHAMP, 1967). Dans les m~mes conditions contr8lees que precedemment, nous avons mis en evidence que des effets non competitifs se manifestent a partir du debut de la floraison du chenopode: une inhibition de 35 Ofo de la croissance du mais est atteinte lorsque ces mais se developpent pendant trois semaines sur des solutions nutritives utilisees prealablement pour la culture du chenopode jusqu'a la floraison et non limitantes en elements nutritifs (CAUSSANEL, 1978 b).

Ces resultats nous ont conduit a soups:onner l'existence d'effets alIelopathiques de la part du chenopode blanc sur Ie mais et a rechercher la presence de substances inhibitrices dans les milieux d'exsudation de chenopodes blancs arrives a floraison.

Les recherches dec rites ici ont pour objectif de verifier cette hypothese, en precisant l'effet inhibiteur sur la croissance du mais d'un milieu d'exsudation du chenopode blanc en fonction des facteurs contr8lant l'exsudation des racines, et de determiner les substances responsables de ces effets.

Materiel et Methodes

Culture du chenopode blanc

Dans les conditions controh!es d'une salle dimatisee, les chenopodes sont cultives a temperature constante de 20 DC, avec une humiditc relative de 70 % et sous un edairement de 10000 lux. Ces pI antes de jours courts preferantes sont placees en dysperiode pour que leur floraison soit retardee et leur developpement vegetatif accru: Ie regime photoperiodique dlOisi est de 16 heures de jour et de 8 heures de n ui t.

Les semences sont recoltees sur des individus d'une population provenant du Domaine d'Epoisses (INRA Dijon). Apres germination et levee en terrines, les plantules sont transplantees au stade 2 feuilles sur solution nutritive de HEWITT (HEWITT, 1952) convenant aussi bien a la culture du chenopode qu'a celle du maYs (CAUSSANEL et al., 1973). Les plantes se developpent jusqu'au stade d'experimentation choisi, sur recipients en polyethylene blanc contenant six litres de solution nutritive. Les recipients sont recouverts d'une plaque de lucoflex percee de huit orifices disposes en cerde ou prennent place huit entonnoirs pouvant supporter chacun une plantule. La solution est renouvelee chaque semaine et l'aeration du milieu est assuree au moyen d'un compresseur a air.

Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 93. S. 229-243. 1979.

Inhibiteurs de croissance dans les exsudats 231

Obtention des exsudats de racines du chenopode blanc

Chez les vegetaux la qualite et la quantite des exsudats varie avec plusieurs facteurs parmi lesquels les plus importants sont l'espece et l'age de la plante, la temperature, la lumiere, l'alimentation de la plante, l'humidite du sol, la presence de microorganismes, Ie milieu ou se developpent les racines ainsi que les lesions eventuelles du systeme racinaire (ROVIRA, 1971 ).

Dans les conditions contr&lees precedemment dHinies, Ie developpement du chenopode se deroule d'une fa~on reproductible d'une experience it l' autre: sur des plantes placees en culture hydroponique au stade 2 feuilles (stade 0), les premiers boutons floraux apparaissent apres six semaines (stade 6), Ie stade pre-floraison est atteint apres huit semaines de culture hydroponique (stade 8) et les chenopodes fleurissent de la neuvieme semaine (stade 9) it la douzieme semaine (stade 12).

L'exsudation est generalement plus importante dans l'eau distillt~e que dans une solution nutritive dont l'effet tampon limite la permeabilite cellulaire (MARTIN, 1957; McDoUGALL et al., 1965). Les exsudats de chenopode ont ete recueillis dans l'eau distillee sous aeration continue: cette methode a ete largement utilisee jusqu'ici dans la determination des composes exsudes par les racines (BORNER, 1960; DEHAY et CARE, 1957; EBERHARDT et MARTIN, 1957). Apres un lavage soigneux des racines de chenopode (en place sur leur plaque de lucoflex pour ne pas leser les racines) it l'eau puis it l'eau distillee, les chenopodes sont transplantes sur des recipients identiques aux precedents contenant six litres d'eau distillee. Apres Ie temps d'exsudation, determine par les experiences dec rites ulterieurement, les plantes sont retirees, leurs racines sOnt coupees, rapidement sechees entre des feuilles de papier Joseph et pesees. Puis les solutions d'exsudation sont recueillies et filtrees sur Mirac1oth. Les filtrats sont concentres sous vide au dixieme de leur volume initial it l'evaporateur rotatif it une temperature inferieure it 40°C. La solution obtenue est filtree sur filtre plisse Whatman 2V. Le filtrat est it nouveau concentre jusqu'it la concentration prevue pour l'essai biologique. L'extrait obtenu est centrifuge it 20000 g pendant 20 minutes et l'essai biologique est realise avec Ie surnageant.

Essais biologiques sur mats

L'effet inhibiteur des extraits aqueux precedents sur la croissance de la racine principale de semences germees de mais est etudie au moyen d'un essai biologique de cinq jours. Des semences de maYs (variete INRA 258) sont dCsinfectees exterieurement par traitement it I'hypochlorite de calcium. Elles sont ensuite mises it germer sur bacs de germination type Jacobsen, dans les conditions contr&lees de la salle climatisee. Apres 48 heures, les semences germees dont les radicules sont au meme stade morphologique (5 mm de longueur) sOnt selectionnees pour I'essai biologique realise en bohes de Petri (70 mm de diametre): dix semences germees sont placees sur papier it chromatographie Whatman, humidifie avec 10 ml d'extrait aqueux. Les temoins sont prepares de fa~on identique avec eau distillee. Chaque essai com porte quatre repetitions.

La longueur de chacune des dix racines de mais pour chaque bohe de Petri est mesuree au troisieme jour de l'essai biologique, soit cinq jours apres la mise en germination des semences. La precision de la mesure est de 10 % environ.

Les longueurs totales des racines sont comparees par une analyse de variance ou n'interviennent toujours que deux facteurs de variation: traitement et repetition. Les comparaisons entre moyennes sont faites d'apres la methode de TUKEY modifiee par SNEDECOR (SNEDECOR, 1956).

Les pourcentages d'inhibition qui figurent dans les tableaux SOnt obtenus en calculant l'expression (1- r) X 100, ou r represente Ie rapport entre la longueur moyenne de la racine de mais qui s'est developpee sur I'extrait aqueux experimente et la longueur moyenne de la racine de mais qui s'est developpee sur eau distillee.

z. PJlanzenphysiol. Bd. 93. S. 229-243. 1979.


Resultats

A. Phytotoxicite d'extraits obtenus par exsudation de racines

Influence de la duree d'exsudation

L'effet inhibiteur des extraits en fonction de la duree d'exsudation a ete compare pour trois lots de 15 chenopodes blancs d'origine differente: l'un a ete cultive dans les conditions contr8Iees definies precedemment jusqu'au stade 9; les deux aut res provenaient d'une parcelle de maYs non desherbee chimiquement: Ie premier a ete recolte au stade pre-floraison (stade 8), Ie second au stade debut floraison (stade 9).

Les durees d'exsudation experimentees etaient de 48 heures (tl), de 96 heures (t2) et de 144 heures (ts). Pour chaque duree d'exsudation, huit plantes ont ete utilisees. L 'essai biologique a ete realise a la concentration C 1/4 (2,5 g de matiere fra~che de racines pour 10 ml) pour les chcnopodes qui s'etaient developpes dans les conditions naturelles (Tableau 1 A) et aux concentrations C 1/4 et C 1/2 pour les chenopodes qui s'etaient developpes dans les conditions contr81ees (Tableau 1 B).

Tableau 1: Effets d'extraits aqueux obtenus a partir d'exsudats de racines de Chenopodium album L. sur la croissance de racines de mals en fonction du temps d'exsudation.

A. Developpement des plantes dans les conditions naturelles (Concentration C 1/4)

Poids moyen de matiere fratche de racines par plante (en g)

Longueur moyenne de la racine principale de mals (en mm) au 5eme jour

Pourcentage d'inhibition par rapport au temoin

1,7

20

Stade 8 t2

1,3

31

1,1 1,3

22 14

Stade 9 t2

1,1

19

B. Developpement des plantes sous conditions contr6Iees (Stade 9)

Concentration C 1/4 Concentration tl t2 ts tl t2

Poids moyen de matiere 5,14 5,34 5,78 5,14 5,34 fratche de racines par plante (en g)

Longueur moyenne de la 38,2 39,0 35,3"":') 38,8 36,2 racine principale de mals (en mm) au 5eme jour

Pourcentage d'inhibition 4 2 11 3 9 par rapport au temoin

1,3

32

C 112 ts

5,78

32,6':":)

18

Temoin

o

Temoin

0

39,8

",':") Difference significative par rapport a la croissance sur eau distillee a la probabilite 1 °10.

Z. Pflanzenphysiol. Bd. 93, S. 229-243. 1979.


L'effet inhihiteur des exsudats s'accroh avec Ie temps d'exsudation, quelle que soit la provenance des chenopodes. Le comportement des deux lots provenant de plein champ est tres comparahle: toutes les moyennes different significativement de celle du temoin. Six jours d'exsudation entra~nent des effets inhibiteurs plus accentues que demc ou quatre jours d'exsudation dans Ie cas des chenopodes preleves au debut de leur floraison.

II existe des differences notables de pourcentages d'inhibition entre les chenopodes preleves en plein champ et les chenopodes de culture hydroponique: pour ces derniers, seuls les extraits aqueux obtenus apres six jours d'exsudation reduisent significativement la croissance du mai's: de 11 % a la concentration C 1/4 et de 18 % a la concentration C 1/2.

Influence du mode d'exsudation

L'effet inhibiteur des extra its aqueux obtenus apres six jours d'exsudation des chenopodes a ete compare en fonction du mode de culture et de prelevement des plantes: sous conditions contr6lees, deux lots de 32 chenopodes ont ete cultives soit sur sol (en cultipots de 4 kg, a raison de 2 plantes par cultipot), soit sur solution nutritive, comme indique precedemment. Au debut de leur floraison, les pi antes ont ete transferees sur eau distillee, apres lavage soigneux de leurs racines:

les racines de 8 pi antes de chaque lot ont sejourne une demi-heure dans l'eau distillee, avec changement de l'eau distillee toutes les dix minutes. L'essai biologique sur ces solutions de «maceration» recueillies et traitees comme les solutions d'exsudation a ete realise a la concentration C 1 (Tableau 2 A);

- les racines des 24 pi antes restantes de chaque lot ont sejourne six jours dans l'eau distilIee et l'essai biologique sur ces solutions d'exsudation a egalement ete realise a la concentration C 1 (Tableau 2 B). Lorsque les racines des chenopodes sont transplantees directement de leur sol de

culture sur eau distilIee, un effet inhibiteur est constate dans les extraits 'obtenus par maceration et l'inhibition de croissance est accentuee (30 Ufo) apres six jours d'exsudation. En revanche, les extraits obtenus par maceration ne sont pas inhibiteurs dans Ie cas des chenopodes cultives en culture hydroponique et l'inhibition de croissance est moins accentuee (240/0) que precedemment dans les extraits obtenus par exsudation. Les conditions de culture hydroponique ont ete retenues dans les essais ulterieurs pour obtenir une bonne reproductibilite des resultats.

Influence du stade d'exsudation

L'effet inhibiteur des extraits de chenopode obtenus apres six jours d'exsudation a ete compare sous conditions contr6Iees et en culture hydroponique pour trois stades de developpement du chenopode blanc:

Stade 5: 12 a 16 feuilles, 10 a 15 cm de hauteur Stade 9: debut floraison, 40 a 50 cm de hauteur Stade 13: fin fIoraison, 70 a 80 cm de hauteur.

Z. P/lanzenphysiol. Bd. 93. S. 229-243. 1979.


Tableau 2: Effets d'extraits aqueux de racines de Chenopodium album L. sur la croissance de racines de mai's.

A. Obtenus par maceration (concentration C 1)

Longueur moyenne de la racine principale (en mm) au Seme jour


Culture sur sol

Chenopode Temoin

31,6"·"") 36,2

1.3

B. Obtenus par exsudation (concentration C 1)

Longueur moyenne de la racine principale (en mm) au Seme jour


Culture sur sol

Chenopode Temoin

34,7

30

Culture sur solution nutritive

Chenopode Temoin

39,1 39,8

2

Culture sur solution nutritive

Chenopode Temoin

39,8

24

'f':") Difference significative par rapport a la croissance sur eau distillee a la probabilite 1 Ofo.

Pour chaque stade de developpement, 24 pI antes ont ete utilisees et l'essai biologique a ete realise a la concentration C 1 (Tableau 3). Cet effet inhibiteur n'existe qu'au stade 9, c'est a dire au debut de la floraison des chenopodes.

Tableau 3: Effets d'extraits aqueux obtenus par ex sudation de racines de Chenopodium album L. sur la croissance de racines de mai's en fonction du stade de deveioppement du chenopode.

Stade S Stade 9 Stade 13

Cheno- Temoin Cheno- Temoin Cheno- Temoin pode pode pode

Longueur moyenne de la 44,9 47,3 36,8'f".) 47,3 43,2 47,3 racine principale de mai's (en mm) au Seme jour

Pourcentage d'inhibition S 22 9 par rapport au temoin

".".) Difference significative par rapport a la croissance sur eau distillee a la probabilite 1 Ofo.

Z. Pflanzenphysiol. Bd. 93. S. 229-243. 1979.


Influence de la concentration en racines

En fonction des resultats precedents, l'effet inhibiteur d'extraits de chenopodes cultives en culture hydroponique apres six jours d'exsudation sur eau distillee a ete compare sous conditions contr8lees au stade 9 de developpement du chenopode, aux concentrations suivantes, dans trois essais differents:

Essai nO 1: 2,5 get 5 g de matiere fraiche de racines pour 10 ml d'exsudat Essai nO 2: 6,25 get 12,5 g de matiere fraiche de racines pour 10 ml d'exsudat Essai nO 3: 10 g et 15 g de matiere fraiche de racines pour 10 ml d'exsudat.

Le pourcentage d'inhibition de croissance augmente avec la concentration de l'exsudat de racines de chenopode (Tableau 4).

Tableau 4; Effets d'extraits aqueux obtenus par ex sudation de racines de Chenopodium album L. sur la croissance de racines de mai"s en fonction de leur concentration en matiere fratme de racines.

Poids (en g) de matiere fraimc pour 10 ml d'extrait (en g)

Essai nO

2,5 5

Essai nO 2

o 6,25 12,5

Essai nO 3

o 10 15 o

Longueur moyenne de la 35,3"':-) 32,6':-':-) 39,8 38,3':-';-) 32,)'="':-) 45,2 30,2':-") 26,9·-':-) 39,6 racine principale de mai"s (en mm) au 5eme jour


11 18 15 29 24 32

,:-.-) Difference significative par rapport a la croissance sur eau distillee a la probabilite 1 Ufo.

La reproductibilite des resultats a ete etudiee dans les conditions definies aux concentrations C 1/4, C 1/2, C 1, C 3/2 et C 2 correspondant respectivement a 2,5, 5, 10, 15 et 20 g de matiere fraiche de racines pour 10 ml d'extrait. Les resultats sous forme graphique (Fig. 1) ont ete obtenus en repetant plusieurs fois dans Ie temps la culture hydroponique de chenopodes jusqu'au debut de leur floraison et en recueillant les exsudats apres six jours.

La pression osmotique des exsudats a ete mesuree avec un osmometre KNAUER:

aux concentrations C 1/4, C 1/2, C 1, C 3/2 et C 2, les pressions osmotiques des extra its sont respectivement de 4, 8, 17, 24 et 32 milliosmoles.

B. Determination des inhibiteurs de croissance

Les resultats precedents suggeraient l'apparition de substances inhibitrices de croissance dans les exsudats de racines du chenopode pendant une periode precise du developpement de la plante: a l'approche de la floraison et pendant la floraison. NollS



Pourcentage d'inhlbition de croissance

50

25

o 5 10 15 20 Concentration (en grammes de matiere fra7che de racines pour 10ml d'extraitJ

Fig. 1: Effet inhibiteur d'extraits aqueux obtenus a partir d'exsudats de racines de Chenopodium album L. en fonction de leur concentration en matiere fraiche de racines.

avions deja tente de purifier par diverses methodes chromatographiques les exsudats de racines de chenopode blanc, recueillis en culture hydroponique et sous conditions contr61ees: les essais de reproductibilite de nos resultats avaient abouti a mettre en evidence par chromatographie sur gel de Sephadex une fraction fortement inhibitrice sur la croissance de racines de maYs, qu'il s'agisse d'exsudats ou de broyats de racines de chenopode (CAUSSANEL et aI., 1973).

Purification

En raison des quantites d'exsudats necessaires pour identifier les substances responsables de l'inhibition observee, la purification quantitative des substances a ete poursui vie sur des exsudats de chenopodes recoltes en plein champ (lot A): ceux-ci furent recoltes au debut de leur floraison sur des parcelles de maYs non desherbees chimiquement et transplantes sur eau distillee en salle climatisee apres lavage de leurs racines.

La chromatographie sur colonne de 160 ml de gel de Sephadex G 25 «Fine» suivie d'un essai biologique sur les fractions obtenues aux concentrations C 1 et C 2 a revele l'existence de deux fractions inhibitrices 3 et 4 (Fig. 2 a). La localisation des fractions inhibitrices est a rapprocher des resultats obtenus lors du fractionnement d'exsudats de chenopodes cultives sous les conditions contr8Iees de la salle climatisee, en culture hydroponique (lot B): dans ce dernier cas, il existait une fraction inhihitrice suppJementaire, la fraction 5 (Fig. 2 b) (CAUSSANEL et aI., 1973).

La chroma tog rap hie de la fraction 4 sur colonne de 380 ml de Sephadex G 25 «Fine», suivie d'un essai biologique sur les fractions obtenues aux concentrations C 1 et C 2 a montre l'existence de plusieurs fractions inhibitrices: III et VI a la concentration C 1, III, V et VI a Ia concentration C 2 (Fig. 2 c).

Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 93. S. 229-243. 1979.

Inhibiteurs de croissance dans l.es exsudats 237

a) Lot A 5ephadex G 2S "Fine" (Volume de gel = 160ml)

100

~ 80

~ 60 c

~ ~o 8 20

o 100

let 2

• 1=== =

r-!.. t-

200 Volume d'elution (mil L S 6 Fract ion

cl Lot C Sephadex G 2S "Fine" (Volume de gel = 380 mil

i ~1...L-----1-....f-llitIillL...-L-L---J...· --'--200 ~OO Volume d'elullon (mil

II III IV V VI vn VIlI Fraction

b) Lot B Sephadex G 25 " Fine" (Volume de gel = 160 ml)

100

~ 80

~ 60 c

~ LO

8 20

o

= - .....!-~ -

r-;-

100 200 Volume d'elution Imll 2 3 L S 6 Fraction

o Concentration 1 C=:J Concentration 2

• Fraction inhibitrice

Fig. 2: Effet inhibiteur de fractions chrornatographiques obtenues a partir d'exsudats de racines de Chenopodium album L. sur la croissance de racines de maYs.

L'emploi d'une colonne de plus gros diametl"e de Sephadex G 25 «Fine» (volume du gel: 500 ml) a permis d'ameliorer Ie fractionnement des exsudats et de confirmer les n~sultats precedents sur:

chenopodes cultives sous les conditions controlees de la salle climatisee en vases de vegetation et transplantes sur eau permutee apres lavage de leurs racines (Lot C). chenopodes cultives dans les conditions non controIees d'une serre froide (mais la photoperiode est de 16 heures de jour et 8 heures de nuit), en culture hydroponique du stade 4 feuilles au stade debut floraison (Lot D).

Les chenopodes du lot C, directement transplantes des vases de vegetation sur eau permutee, ont presente deux fractions inhibitrices dans leurs exsudats: B et E. En revanche, les chenopodes du lot D, cultives en culture hydroponique, n'ont presente qu'une seule fraction inhibitrice: la fraction E (400 a 440 ml de volume d'elution) (Fig. 3). Par chromatographie sur colonne de Sephadex G 10, cette fraction E n'a redonne qu'une seule fraction inhibitrice: la fraction d (85 a 115 ml de volume d'eIution) (Fig. 4).

Z. P/lanzenphysiol. Bd. 93. S. 229-243. 1979.


a) Lot C

100 --i 80 ~ •

I-d> 60 u c

" 40 '" '" '9 20 u

a 200 400 Volume d'elution Imll

A B C o E F G Fraction

b) Lot 0 -100 -

i 80 • I-d> 60 u c

" 40 '" '" "§ 20 u

a 200 400 Volume d'l!lution Imll

A B C o E F G Fraction

Fig. 3: Effet inhibiteur de fractions dlromatographiques obtenues a partir d'exsudats de racines de Chenopodium album L. sur la croissance de racines de mais.

~ fi c:

" '" '" 0 U

~ .. u c:

" ~ "0 U

100

80

60

40

20

a 10 50

a

'jl I I

10 50 a

D Concentration I D Concentration 2

a) Lot C, fract ion E

F= r-- • F==

100 Volume d'l!lution I

b c d Fract ion

b) Lot D. fraction E

I I t1l I 100 Volume d'l!lution I

b d e Fraction

• Fraction inhibitrice

Fig. 4: Effet inhibiteur de fractions dlromatographiques obtenues a racines de Chenopodium album L. sur la croissance de racines de mais,

partir d'exsudats de

Le poids sec de chacune des fractions obtenues lors du fractionnement des exsudats des chenopodes du lot A et du lot D a ete determine a la suite de la chromatographie sur chaque type de colonne. Les mesures ont ete effectuees sur les fractions reunies

Z, Pjlanzenphysiol. Bd, 93. S, 229-243. 1979,

Lot A

Lot D


d'un volume d'exsudat ayant contenu 80 g de matiere fraiche de racines, avec trois repetitions. Les resultats montrent que 6,6 mg pour 10 ml d'extrait (lot A) et 6,2 mg pour 10 ml d'extrait (lot D) reduisent respectivement de 21 Ofo et de 29 Ofo la croissance des racines de mais dans I'essai biologique employe (Tableau 5).

Identification

L'identification a ete faite sur 37 mg du produit sec de la fraction VI (chenopodes du lot A). La spectrometrie dans I'ultraviolet et dans Ie visible n'a mis en evidence aucun pic d'absorption entre 200 et 700 nanometres. Par spectrometrie de RMN du C 13, un seul signal a ete observe entre 160,3 et 161,5 ppm: ce signal est identique a celui de I'acide oxalique a 1 ppm pres. Les spectres des oxalates d'ammonium, de sodium et de potassium ont egalement ete enregistres: les signaux obtenus sont differents de quelques ppm du signal observe.

Tableau 5: Poids sec des fractions chromatographiques (Sephadex G 25 et Sephadex G 10) obtenues a partir d'exsudats de racines de Chenopodium album L. (moyenne de 3 repetitions).

Sephadex G 25

Volume de gel = 160 ml

Sephadex G 25 Fraction 4


Fraction

Poids sec (en mg) pour 10 g de matiere fraiche de racines

Poids sec (en mg) pour 10 g

12

3,6

de matiere fraiche 2,7

Sephadex G 25


de racines

Fraction


Sephadex G 10 Fraction



A

0,3

a

o

3

10,9

II

1,1

B

1,8

b

0,3

6

20,6 2,0 o

lIP) IV V VF) VII VIII

1,1 1,8 4,2 6,6 2,9 1,0

c D E") F G

1,9 10,0 6,2 0,5 o

c e f

3,4 1,1 0,5 0,1

':0) Fraction inhibit rice



Un volume de solution a 10-1 Mil d'acide oxalique a ete chromatographie sur coIonne de Sephadex G 25 «Fine» (volume de gel = 500 ml) et sur colonne de Sephadex G 10 (volume de gel = 160 ml). La precipitation de l'acide oxalique sous forme d'oxalate de calcium par une solution de 0,01 N de chlorure de calcium a ete utili see pour determiner la presence de cet acide dans les diverses fractions chromatographiques: l'acide oxalique a ete identifie dans les fractions correspondant a un volume d'elution de 400 a 460 ml pour la chromatographie sur Sephadex G 25 et 100 a 125 ml pour la chromatographie sur Sephadex G 10. Ces fractions correspondent aux fractions inhibit rices recueillies par chromatographie des exsudats des chenopodes des lots C et D.

Enfin, l'effet inhibiteur de croissance de l'acide oxalique, celui de l'oxalate de potassium, celui de l'oxalate d'ammonium ont ete compares au moyen de l'essai biologique precedemment utilise: la gamme de concentrations employees (10-3 Mil a 10-2 Mil) comprenait les concentrations auxquelles se serait trouve cet acide dans les fractions 4/VI et E en admettant qu'elles aient ete suffisamment purifiees. L'inhibition observee dans ces fractions (21 et 29 0/0) correspond done a une concentration theorique en acide oxalique de 2,5 10-3 M determinee sur l'abaque de reference (Fig. 5).

Pourcentage d'inhibition de croissance

50

10

AClde oxalique

Oxalate de potassium

Oxalate d'ammonium

~-------,~~----.-~------,-~-----.~--2,5'10-3 5'10-3 7,5'10-3 10-2

Concentration (en moles par litre)

Fig. 5: Effets inhibiteurs de l'acide oxalique et des oxalates de potassium et d'ammonium sur la croissance de racines de mai's.

Discussion

L'exsudation de racines de chenopode blanc (Chenopodium album L.) dans l'eau distillee se traduit par l'apparition de substances inhibitrices dans Ie milieu de culture. Le debut de la floraison des plantes est l'epoque la plus favorable a l'expression de l'effet inhibiteur de ces substances dans Ie milieu sous les conditions contr81ees experimentees, mais des effets inhibiteurs peuvent exister a d'autres stades de developpement du chenopode, non retenus dans les essais presentes ici. L'effet inhibiteur est plus accentue apres six jours qu'apres deux jours d'exsudation. II augmente avec la


Inhibiteurs de croissance dans les exsudats ~41

concentration en racines de l'extrait aqueux obtenu par exsudation, mais cette augmentation n'est pas lineaire. Or, il est bien connu que des effets osmotiques participent aux effets inhibiteurs pour de fortes concentrations des extraits en materiel vegetal dans les essais biologiques de germination de semences ou de croissance de plantules (ANDERSON et LOUCKS, 1966). Des extra its aqueux obtenus a partir de feuiUes d'Adenostoma fasciculatum ou de Brassica nigra retardent la croissance radiculaire de semences germees de Bromus rigidus Roth, lorsque leur pression osmotique est superieure a 25 milliosmoles (BELL, 1974): Ie fort effet inhibiteur desexsudats a la concentration C 2 (20 g de matiere fra~che de racines pour 10 ml d'extrait) s'explique done aisement puisque la pression osmotique de l'extrait est de 32 milliosmoles.

Des variations dans Ie degre des effets inhibiteurs se manifestent selon les methodes d'exsudation employees: les exsudats de chenopodes preleves en plein champ ou en vases de vegetation sont plus inhibiteurs que ceux de chenopodes provenant de culture hydroponique. II est possible que ces differences soient dues a des lesions du systeme racinaire au cours de la transplantation des plantes: cette technique de prelevement favoriserait par la suite (et meme rapidement, puisque les eaux de maceration d'une demi-heure sont inhibitrices) la liberation des substances inhibitrices dans l'eau distillee. Cette hypothese a ete verifiee dans Ie cas des exsudats d' Albizzia 10-phanta (CLAYTON et LAMBERTON, 1964) ou de ble (AYERS et THORNTON, 1968). Dans Ie cas du chenopode blanc, la purification des exsudats sur Sephadex montre que ces differences sont d'ordre qualitatif: deux substances inhibitrices sont presentes dans les exsudats de chenopodes preIeves sur sol alors qU'une seule existe dans les exsudats de chenopodes provenant de culture hydroponique. Cette derniere substance, commune a tous les exsudats de chenopode blanc, queUe que soit leur provenance a ete identifiee a I'acide oxalique: present dans les exsudats a une concentration elevee (1 a 2,5 10-3 Mil), il se revele a ces concentrations inhibiteur de la croissance des racines de mais. Connu dans les exsudats du ble et de l'orge (ROVIRA, 1971; VANCURA, 1964), du lin, du haricot et de Rumex crispus (CEZARD, 1961), l'acide oxalique est abondant dans les tissus vegetaux du chenopode blanc et des Centrospermales en general (CARSTEN OLSEN, 1939; HEGNAUER, 1964). Present dans les sols en quantite importante (GRAUSTEIN et a!., 1977) et libere par de nombreuses especes de champignons du sol et de bacteries (GIBsON, 1953; MAXWELL et BATEMAN, 1968), son r&le dans l'environnement n'est pas negligeable (CROMACK Jr. et a!., 1978). C'est pourquoi, il serait interessant d'etudier l'emission de l'acide oxalique par Ie chenopode blanc en conditions steriles: la determination quantitative des exsudats de cette plante en conditions steriles permettrait de connaitre la quantite d'acide oxalique reellement emise par les racines, en l'absence de microorganismes de la rhizosphere et de la solution nutritive, eux-memes susceptibles de produire cet acide et d'interferer sur

I ••

cette emiSSIOn.

Nous remercions MM. G. BARRALIS, C. DESCOINS et C. MARTIN pour leurs CrItiques et suggestions ainsi que MM. P. GIRARD et M. SCHOUTITH pour leur collaboration technique.



Bibliographie

ANDERSON, R. C. and O. L. LOUCKS: Osmotic pressure influence in germination tests for antibiosis. Science 152, 771-773 (1966).

AYERS, W. A. and R. H. THORNTON: Exudation of aminoacids by intact and damaged roots of wheat and peas. Plant and Soil 28, 193-207 (1968).

BELL, D. T.: The influence of osmotic pressure in tests for allelopathy. Ill. State Acad. Sci. Trans. 67, 312-331 (1974).

BELL, D. T. and D. E. KOEPPE: Non competitive effects of giant foxtail on the growth of corn. - Agron. ]., 321-325 (1972).

BORNER, H.: Liberation of organic substances from higher plants and their role in the soil sickness problem. Bot. Rev. 26, 393-424 (1960).

CARSTEN, OLSEN: Absorption of calcium and formation of oxalic acid in higher green plants. C. R. Lab. Carlsberg, Ser. Chim. 23, 101-123 (1939).

CAUSSANEL, ]. P.: Etude sous conditions controlees de la concurrence entre Ie chenopode blanc (Chenopodium album L.) et la variete de maYs INRA 258, en fonction du stade de developpement du chenopode. Weed Research 18, 355-361 (1978). Effets non competitifs entre Ie chenopode blanc (Chenopodium album L.) et Ie maYs (INRA 258) (1979). (Accepte pour publication dans Weed Research.)

CAUSSANEL, ]. P. JOSETTE MARTIN, REGINE HANNEL, M. PAYNOT, ]. C. VALLEE et X. DE GOURNAY: Inhibition de la croissance de jeunes germinations de maYs par des solutions d'excnhats ou de broyats radiculaires de Chenopodium album L. IVeme Colloque International sur l'Ecologie et la Biologie des Mauvaises. Herbes, Marseille, p. 202-239 (1973).

CEZARD, R.: L'excretion radicellaire chez les vegetaux superieurs. Bull. Soc. Sci., Nancy 19, 234-248 (1961).

CLAYTON, M. F. and J. A. LAMBERTON: A study of root exudates by the fog-box technique. Austr. ]. BioI. Sci. 17, 855-866 (1964).

CROMACK, Jr. K., P. SOLLlNS, R. TODD, and R. FOGEL: The role of oxalic, malic, and other organic acids in the inorganic nutrition of fungi, roots and bacteria. Dans WICKLOW D. T. and G. c., CARROL (Ed.), The fungal community, its organization and role in the ecosystem, 33 pages. Marcel Dekker, New York, 1978.

DEHAY, C. et M. CARE: Etude de la composition de quelques excnhions radicellaires. C. R. Acad. Sci. 244, 230--233 (1957).

EBERHARDT, F. und P. MARTIN: Das Problem der Wurzelausscheidungen und seine Bedeutung fur die gegenseitige Beeinflussung hoherer Pflanzen. Zeitschr. Pflanzenkrankh. und pflanzenschutz 64, 193-205 (1957).

EINHELLlG, F. A. and J. A. RASMUSSEN: Allelopathic effects of Rumex crispus on Amaranthus retroflexus grain sorghum and field corn. American. MidI. Natur., 90, 79-86 (1973).

GIBSON, r. A. S.: Crown-rot a seedling disease of groundnuts caused by Aspergillus niger. Trans. Br. Mycol. Soc. 36, 198-209 (1953).

GRAUSTEIN, W. c., K. CROMACK, Jr., and P. SOLLlNS: Calcium oxalate: occurrence in soils and effects on nutrient and geochemical cycles. Science 198, 1252-1254 (1977).

HEGNAUER: Chemotaxonomie der Pflanzen. Birkhauserverlag, Basel & Stuttgart, 422-423, 1964.

HEWITT, E. ].: Sand and water culture methods used in the study of plant nutrition. Ed. Commonwealth Agricultural Bureaux, 550 p. (1952).

LEROY HOLM, G., D. L. PLUCKNETT, ]. V. PANCHO, and]. P. HERBERGER: The world worst weeds. Distribution and biology: 84-91. Ed. University Press of Hawaii, Honolulu, Hawaii, 1977.

LONGCHAMP, R.: Aspects de la competition entre les mauvaises herbes et les plantes cultivees. IVeme Conference du Columa, Versailles 3, 691-710 (1967).



McDOUGALL, M. BARBARA, and A. D. ROVIRA: Carbon 14 labeled photosynthate III wheat root exudates. - Nature 207, 1104-1105 (1965).

MARTIN, P.: Die Abgabe von organ is chen Verbindungen insbesondere von Scopoletin, aus den Keimwurzeln des Hafers. Z. Bot. 45, 475-506 (1957).

MAXWELL, D. P. and D. F. BATEMAN: Oxalic acid biosynthesis by Sclerotium rolfsii. Phytopathology 58, 1635-1642 (1968).

ROVIRA, A. D.: Plant root exudates. Biochemical interactions among plants. Environmental Physiology Subcommittee, USNC/IPB, 19-24 (1971).

SNEDECOR, G. W.: Statistical methods. Iowa State University Press, 535 p. (1971). VANCURA, V.: Root exudates of plants. I Analysis of root exudates of barley and wheat in

their initial phasis of growth. Plant and Soil 21, 231-248 (1964). VENGRIES, J., N. G. COLBY, and M. DRAKE: Plant nutrient competition between weeds and

corn. Agron. ]. 47, 213-215 (1955).

]. P. CAUSSANEL, Laboratoire de Malherbologie, INRA-Dijon, BV 1540, F-21034 Dijon Cedex, France.

G. KUNESCH, Laboratoire des Mediateurs Chimiques, Domaine de Brouessy, Magny les Hameaux, F-78470 Saint Remy les Chevreuse, France.

z. Pflanzenphysiol. Bd. 93. S. 229-243. 1979.

Documents

Étude Qualitative et Quantitative des Inhibiteurs de Croissance Présents dans les Exsudats de Racines de Chénopode Blanc (Chenopodium album L.) au Début de sa Floraison en Culture