EXPLORATION DU RÔLE PHYSIOLOGIQUE DU … · 3.8 E et du choc oxydatif sur l’expression de yadB . . . . . . . . . . . . . 61. x Liste des abr eviations aa Acide amin e aa-AMP Aminoacyl-ad

OLIVIER FISETTE

EXPLORATION DU ROLE PHYSIOLOGIQUE

DU GENE yadB CHEZ Escherichia coli

Memoire presentea la Faculte des etudes superieures de l’Universite Lavaldans le cadre du programme de maıtrise en Biochimie

pour l’obtention du grade de Maıtre es sciences (M. Sc.)

FACULTE DES SCIENCES ET DE GENIEUNIVERSITE LAVAL

QUEBEC

AVRIL 2005

c© Olivier Fisette, 2005

ii

Resume

L’enzyme glutamyl-queuosine-ARNt synthetase, presente chez plusieurs bacteries

et codee par le gene yadB chez Escherichia coli, catalyse la formation de glutamyl-

queuosine-ARNtAsp. Le role de cet aminoacyl-ARNt est inconnu, mais la cotranscription

de yadB et de dksA suggere une implication dans la reponse generale au stress.

yadB a ete remplace dans une souche de Escherichia coli ∆lac par lacZ, sans mo-

dification des eventuels elements transcriptionnels de yadB. L’activite β-galactosidase

a ete utilisee comme rapporteur pour determiner le niveau d’expression de yadB dans

diverses conditions de croissance et de stress. Les differences phenotypiques entre les

souches sauvage et ∆yadB ont ete investiguees.

Nous avons decouvert que yadB est un gene non-essentiel chez Escherichia coli.

Sa faible expression suggere un role dans le metabolisme basal de la cellule. Cette

expression est sensiblement plus elevee pendant la phase stationnaire de croissance.

Aucune difference phenotypique n’a ete decouverte entre les souches sauvage et ∆yadB.

iii

Avant-propos

Beaucoup de gens m’ont aide pendant les deux annees qu’ont dure mes etudes

de Maıtrise en biochimie. J’aimerais utiliser ces quelques lignes pour leur offrir mes

remerciements.

Je suis avant tout grandement reconnaissant a mes parents pour leur support

indefectible tout au long de mes etudes, pour leur interet et leurs encouragements.

Je souhaite remercier mon directeur de recherche, le Professeur Jacques Lapointe,

de m’avoir accueilli dans son laboratoire, de m’avoir soutenu et encourage tout au

long de mes travaux et d’avoir su constamment stimuler mon interet (et celui des

autres etudiantes et etudiants du laboratoire) pour le domaine passionnant qu’est la

biosynthese des proteines.

Les membres de mon comite aviseur, les Professeurs Barbara Papadopoulou et

Stephane Gagne, meritent aussi mes remerciements pour leurs conseils et suggestions

qui ont contribue a definir les orientations de mon projet de recherche.

J’en profite egalement pour faire un clin d’œil aux etudiantes, etudiants et

professionnels avec qui j’ai eu la chance de travailler au Laboratoire de recherche sur la

biosynthese des proteines : Pierre-Marie Akochy, Pierre Barrau, Vanessa Baudin, David

Beaulieu, Andreane Daviau, Habib Derbali, Daniel Dubois, Louis-Patrick Gagnon,

Charlotte Habegger-Polomat et Philippe Levesque. Vos conseils et votre amitie m’ont

aide plus que je ne saurais le dire.

Enfin, je tiens a souligner le support financier qui m’a ete accorde par le Conseil

de recherche en sciences naturelles et en genie du Canada a travers l’octroi d’une bourse

d’etudes superieures.

iv

A mes parents

v

Table des matieres

Resume ii

Avant-propos iii

Table des matieres v

Liste des tableaux viii

Table des figures ix

Liste des abreviations x

1 Introduction 1

1.1 La traduction de l’information genetique . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Les aminoacyl-ARNt synthetases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2.1 Fonctions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2.2 Structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.2.3 Modularite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.2.4 Specificite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.3 Evolution des aminoacyl-ARNt synthetases de la famille GlxRS . . . . 10

1.4 La glutamyl-queuosine-ARNtAsp synthetase . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.4.1 Le gene yadB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.4.2 Activite de YadB in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.4.3 Similarites structurales entre la GluQRS et la GluRS . . . . . . 15

1.4.4 Relation avec le gene dksA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.4.5 Questions et objectifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2 Materiel et methodes 19

2.1 Tampons, solutions et produits chimiques . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.2 Culture cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.2.1 Milieux de culture et conditions de croissance . . . . . . . . . . 19

2.2.2 Agents selectifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.2.3 Souches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Table des matieres vi

2.3 Manipulations de l’ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.3.1 Plasmides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.3.2 Oligonucleotides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.3.3 Purification d’ADN par extraction et precipitation . . . . . . . . 26

2.3.4 Preparation d’ADN plasmidique . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2.3.5 Preparation d’ADN genomique . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.3.6 Reaction en chaıne par la polymerase . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.3.7 Digestion d’ADN par des endonucleases de restriction . . . . . . 31

2.3.8 Ligature de fragments d’ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.3.9 Dephosphorylation de fragments d’ADN . . . . . . . . . . . . . 33

2.3.10 Electrophorese sur gel d’agarose . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.3.11 Purification d’ADN a partir de gels d’agarose . . . . . . . . . . 34

2.3.12 Transformation de cellules par de l’ADN plasmidique . . . . . . 35

2.4 Construction du vecteur pTOF-YB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.4.1 Amplification des regions flanquant yadB . . . . . . . . . . . . . 38

2.4.2 Clonage des regions flanquantes dans pTOF24 . . . . . . . . . . 38

2.4.3 Insertion de la cassette FLK2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

2.5 Remplacement de yadB par la cassette FLK2 . . . . . . . . . . . . . . 41

2.5.1 Transformation de E. coli TP8503 . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.5.2 Integration du plasmide au chromosome . . . . . . . . . . . . . 43

2.5.3 Excision et perte du plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.5.4 Confirmation du remplacement par PCR . . . . . . . . . . . . . 43

2.6 Deletion du gene yadB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.6.1 Transformation de POK1 par pCP20 . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.6.2 Excision de la cassette FLK2 et perte de pCP20 . . . . . . . . . 46

2.6.3 Confirmation de la deletion par PCR . . . . . . . . . . . . . . . 46

2.7 Dosage enzymatique de l’activite β-galactosidase . . . . . . . . . . . . . 47

2.8 Conditions d’expression et effets de la deletion du gene yadB . . . . . . 48

2.8.1 Croissance en conditions optimales . . . . . . . . . . . . . . . . 49

2.8.2 Croissance en milieu minimal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

2.8.3 Croissance a des temperatures non optimales . . . . . . . . . . . 49

2.8.4 Choc thermique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

2.8.5 Choc osmotique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

2.8.6 Choc de pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

2.8.7 Choc oxydatif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3 Resultats 52

3.1 Construction de la souche POK1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.2 Construction de la souche POK2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.3 Thermosensibilite de la souche POK2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.4 Expression et effets de la deletion de yadB . . . . . . . . . . . . . . . . 54

Table des matieres vii

3.4.1 Croissance en conditions optimales . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.4.2 Croissance en milieu minimal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.4.3 Croissance a des temperatures non optimales . . . . . . . . . . . 55

3.4.4 Choc thermique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.4.5 Choc osmotique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.4.6 Choc de pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

3.4.7 Choc oxydatif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4 Discussion 62

4.1 Expression de yadB pendant le cycle cellulaire . . . . . . . . . . . . . . 62

4.2 Cotranscription de dksA et de yadB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4.3 Role du Glu-Q-ARNtAsp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

4.4 Lien entre les concentrations de glutamate et le role de la GluQRS . . . 65

4.5 Phenotypes des cellules ∆yadB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

4.6 Analyse de la technique de remplacement employee . . . . . . . . . . . 66

4.6.1 Avantages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

4.6.2 Inconvenients . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

4.6.3 Techniques alternatives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

5 Conclusion 69

5.1 Resume . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

5.2 Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

Bibliographie 71

viii

Liste des tableaux

1.1 Classification des aminoacyl-ARNt synthetases . . . . . . . . . . . . . . 5

2.1 Tampons et solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.2 Milieux de culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.3 Agents selectifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.4 Souches de E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.5 Plasmides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.6 Oligonucleotides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.7 Composition des melanges reactionnels pour PCR . . . . . . . . . . . . 30

2.8 Conditions pour les reactions PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.9 Composition des melanges reactionnels pour la restriction de l’ADN . . 31

2.10 Composition des melanges reactionnels pour la ligature de l’ADN . . . 32

2.11 Conditions pour les reactions de ligature de l’ADN . . . . . . . . . . . 32

2.12 Composition des melanges reactionnels pour la dephosphorylation de

l’ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

ix

Table des figures

1.1 Le « dogme » de la biologie moleculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Reaction d’aminoacylation des ARNt par les aaRS . . . . . . . . . . . . 3

1.3 Synthese indirecte de Gln-ARNtGln par une GluRS ND et l’AdT . . . . 4

1.4 Exemples des structures des aminoacyl-ARNt synthetases de classes I et II 7

1.5 Reactions de correction de mesacylations . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.6 Evolution des aaRS de la famille GlxRS . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.7 Le gene yadB de E. coli et la GluQRS ; comparaison avec la GluRS . . 13

1.8 Structure de la base hypermodifiee queuosine . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.1 Plasmides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.2 Construction du vecteur pTOF-YB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.3 Selection de pTOF-YB par cartographie de restriction . . . . . . . . . . 40

2.4 Remplacement de yadB par la cassette FLK2 . . . . . . . . . . . . . . 42

2.5 Confirmation du remplacement de yadB par PCR . . . . . . . . . . . . 44

2.6 Deletion de yadB par excision de la cassette FLK2 . . . . . . . . . . . 45

2.7 Confirmation de la deletion de yadB par PCR . . . . . . . . . . . . . . 46

3.1 Confirmation de la contruction des souches POK1 et POK2 par PCR . 53

3.2 Expression de yadB dans des conditions de croissance optimales . . . . 55

3.3 Expression de yadB en milieu minimal . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.4 Expression de yadB a des temperatures non optimales . . . . . . . . . . 57

3.5 Effet du choc thermique sur l’expression de yadB . . . . . . . . . . . . 58

3.6 Effet du choc osmotique sur l’expression de yadB . . . . . . . . . . . . 59

3.7 Effet du choc de pH sur l’expression de yadB . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.8 Effet du choc oxydatif sur l’expression de yadB . . . . . . . . . . . . . 61

x

Liste des abreviations

aa Acide amine

aa-AMP Aminoacyl-adenylate

aa-ARNt Aminoacyl-ARNt

aaRS Aminoacyl-ARNt synthetase

ADN Acide desoxyribonucleique

AdT Amido-transferase

ALA Acide 5-aminolevulinique

Amp Ampicilline

AMP Adenosine monophosphate

ATP Adenosine triphosphate

ARN Acide ribonucleique

ARNm Acide ribonucleique messager

ARNt Acide ribonucleique de transfert

ARNtAsn ARNt specifique a l’asparagine

ARNtAsp ARNt specifique a l’aspartate

ARNtGln ARNt specifique a la glutamine

ARNtGlu ARNt specifique au glutamate

ARNtIle ARNt specifique a l’isoleucine

ARNtThr ARNt specifique a la threonine

Asn-ARNtAsn Asparaginyl-ARNt asparagine

Asp-ARNtAsn Aspartyl-ARNt asparagine

Asp-ARNtAsp Aspartyl-ARNt aspartate

AspRS Aspartyl-ARNt synthetase

BSA Albumine de serum bovin

Chl Chloramphenicol

CIP Phosphatase alcaline de l’intestin de veau

CTAB Bromure d’hexadecyltrimethylammonium

D.O. Densite optique

DTT Dithiothreitol

dATP Desoxyadenosine triphosphate

dCTP Desoxycytosine triphosphate

dGTP Desoxyguanosine triphosphate

Liste des abreviations xi

DMSO Dimethylsulfoxide

dTTP Desoxythymidine triphosphate

E. coli Escherichia coli

E.C. Classification enzymatique

EDTA Acide ethylenediaminetetraacetique

FRT Cible de reconnaissance Flp

GDP Guanosine diphosphate

Gln-ARNtGln Glutaminyl-ARNt glutamine

GlnRS Glutaminyl-ARNt synthetase

Glu-ARNtGln Glutamyl-ARNt glutamine

Glu-ARNtGlu Glutamyl-ARNt glutamate

GluRS Glutamyl-ARNt synthetase

GluRS D Glutamyl-ARNt synthetase discriminatrice

GluRS ND Glutamyl-ARNt synthetase non discriminatrice

GTP Guanosine triphosphate

GluQ-ARNtAsp Glutamyl-queuosine-ARNtAsp

GluQRS Glutamyl-queuosine-ARNtAsp synthetase

GluRS Glutamyl-ARNt synthetase

GluTR Glutamyl-ARNt reductase

GSA Glutamate-1-semialdehyde

IleRS Isoleucyl-ARNt synthetase

Kan Kanamycine

LB Luria-Bertani

NEB New-England BioLabs

ONPG Ortho-nitro-phenyl-β-D-galactopyranoside

PEG Polyethylene glycol

PCR Reaction en chaıne par la polymerase

Pi Phosphate inorganique

Pipes Piperazine-N,N’-bis(acide 2-ethanesulfonique)

ppGpp Guanosine-3’5’-bis(diphosphate)

PPi Pyrophosphate inorganique

Q Queuosine

SDS Sulfate dodecylique de sodium

Suc Sucrose

TBE Tris borate EDTA

TE Tris EDTA

ThrRS Threonyl-ARNt synthetase

Tris 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol

U.V. Ultraviolet

Liste des abreviations xii

Val-AMP Valyl-adenylate

Val-ARNtIle Valyl-ARNt isoleucine

Chapitre 1

Introduction

1.1 La traduction de l’information genetique

En 1958, Francis Crick enonca le « dogme » central de la biologie moleculaire [1],

qui resume les relations, recemment decouvertes a l’epoque, entre les proteines et les

acides desoxyribonucleiques (ADN) et ribonucleiques (ARN) :

L’ADN dirige sa propre replication et sa transcription en ARN qui, a son tour,

dirige sa traduction en proteines.

Cette hypothese, illustree a la figure 1.1, decrit bien les rapports entre les

catalyseurs biologiques (proteines), les vecteurs de l’information genetique (ADN) et

les effecteurs de cette information (ARN). Toutefois, il n’existe pas de correspondance

Fig. 1.1 – Le « dogme » de la biologie moleculaire

Chapitre 1. Introduction 2

structurale simple entre les bases azotees des acides nucleiques et les acides amines

(aa) des polypeptides [2]. C’est pourquoi Francis Crick suggera l’existence de molecules

adaptatrices faites d’ARN, auxquelles seraient lies enzymatiquement les acides amines

avant leur assemblage par les ribosomes. La lecture de l’information contenue dans

les codons des ARN messagers (ARNm) pourrait alors se faire par appariement de

bases. Cette « hypothese de l’adaptateur » fut confirmee par la decouverte des ARN

de transfert (ARNt) et du role de ces derniers dans la biosynthese des proteines [3].

La presence de ces adaptateurs implique l’existence d’une autre classe d’enzymes

dont la vocation est de determiner la correspondance entre les anti-codons des ARNt et

les acides amines (definissant ainsi le code genetique) par la liaison chimique specifique

de chaque adaptateur d’ARN a son acide amine correspondant. Ce role echoit aux

aminoacyl-ARNt synthetases.

1.2 Les aminoacyl-ARNt synthetases

1.2.1 Fonctions

Les aminoacyl-ARNt synthetases (aaRS), une famille d’enzymes ubiquitaires

(E.C. 6.1.1), catalysent l’esterification des acides amines aux ARNt. Chaque synthetase

est specifique a un acide amine et aux ARNt isoaccepteurs qui lui correspondent

(a deux exceptions pres qui seront presentees plus loin). Les aminoacyl-ARNt (aa-

ARNt) formes par cette reaction enzymatique servent de substrats aux ribosomes pour

l’assemblage des chaınes polypeptidiques [4].

Tel qu’indique a la figure 1.2, la reaction d’aminoacylation se deroule en deux

etapes. L’acide amine est d’abord active (figure 1.2 a) par reaction avec l’ATP, produi-

sant un aminoacyl-adenylate auquel le lien chimique reactif de l’ATP a ete transfere. Cet

aminoacyl-adenylate reste complexe a la synthetase. Notons que certaines synthetases

utilisent leur ARNt specifique comme cofacteur lors de cette etape. Par exemple, la

liaison de l’ARNt specifique au glutamate (ARNtGlu) a la glutamyl-ARNt synthetase

(GluRS), pendant l’etape d’activation de l’acide amine, modifie la conformation du site

de liaison de l’ATP, permettant la liaison de ce substrat dans une position qui favorise

la reaction avec le glutamate [5].

Lors de la seconde etape (figure 1.2 b), le deuxieme substrat de la synthetase,

soit son ARNt specifique, est complexe a l’enzyme, puis l’acide amine est lie a une


Fig. 1.2 – Reaction d’aminoacylation des ARNt par les aaRS. a) Activation de l’acide

amine (formation d’un aminoacyl-adenylate) par reaction avec l’ATP. Chez certaines

synthetases, la presence de l’ARNt est necessaire pour completer cette etape de la

reaction. b) Liaison de l’acide amine a l’ARNt et production d’une molecule d’AMP.

Un ion magnesium est requis pour completer cette etape de la reaction. c) L’aminoacyl-

ARNt peut etre complexe au facteur d’initiation IF-2 ou au facteur d’elongation EF-Tu

pour servir de substrat au ribosome.

des fonctions hydroxyle de l’extremite 3’-terminale de cet ARNt. Cette seconde etape

requiert la presence d’un ion magnesium agissant comme cofacteur [6].

L’aminoacyl-ARNt ainsi forme peut alors etre complexe a un facteur d’initiation

(IF-2) ou d’elongation (EF-Tu) de la synthese proteique et, finalement, servir de substrat

au ribosome pour l’assemblage des polypeptides (figure 1.2 c) [7].

Si de nombreux organismes disposent d’une aminoacyl-ARNt synthetase pour

chacun des acides amines standards, ce n’est toutefois pas le cas de tous. Le genome de

la majorite des bacteries, par exemple, est depourvu de glutaminyl-ARNt synthetase

(GlnRS). Ces organismes possedent toutefois une GluRS dite non discriminatrice (ND)

(parce qu’elle peut charger le glutamate indifferemment sur un ARNtGlu ou un ARNtGln)

ainsi qu’une amidotransferase ARNt dependante (AdT). L’action combinee de ces deux

enzymes permet la synthese du glutaminyl-ARNtGln (Gln-ARNtGln) par une voie in-

directe, tel qu’illustre a la figure 1.3. La GluRS ND procede d’abord au chargement


Fig. 1.3 – Synthese indirecte de Gln-ARNtGln par la GluRS ND et l’AdT. a) La GluRS

mesacyle l’ARNtGln avec le glutamate. b) L’AdT convertit le glutamate en glutamine,

produisant le Gln-ARNtGln.

de l’acide amine glutamate sur l’ARNtGln pour former le Glu-ARNtGln (figure 1.3 a).

Cette mesacylation est ensuite « corrigee » par l’action de l’AdT, qui transfere un ion

ammonium au glutamate pour le convertir en glutamine (figure 1.3 b). Cette voie de

synthese alternative resulte en une depense energetique superieure a celle de la voie de

synthese classique, puisque deux molecules d’ATP sont necessaires a la synthese d’un

aa-ARNt [3].

Cette voie de synthese indirecte est egalement employee par certains organismes

pour la synthese de l’Asn-ARNtAsn ; une AspRS non discriminatrice mesacyle l’ARNtAsn

pour former l’Asp-ARNtAsn, qui est ensuite converti en Asn-ARNtAsn par l’AdT [8].

En plus de leur participation a la synthese des substrats du ribosome, les

aminoacyl-ARNt synthetases jouent une variete de roles dans la biosynthese des

proteines et dans d’autres voies metaboliques, grace a leur activite d’aminoacylation

et aussi par d’autres mecanismes. La biosynthese de la porphyrine est un exemple de

l’utilisation d’un aa-ARNt dans un processus cellulaire distinct de la synthese proteique :

le Glu-ARNtGlu produit par la GluRS est reduit en glutamate-1-semialdehyde (GSA)

par la glutamyl-ARNt reductase (GluTR). Ce produit est ensuite converti en acide

5-aminolevulinique (ALA), lequel sert de precurseur a la porphyrine, elle-meme utilisee

dans le metabolisme de la chlorophylle [9]. Chez les eucaryotes, les aaRS participent a

la verification de l’integrite des ARNt en les aminoacylant apres leur maturation dans le

noyau. Seuls les ARNt aminoacyles (et donc completement matures) sont translocalises

dans le cytosol ou a lieu la synthese proteique [10]. Certaines aaRS participent aussi a

la regulation de leurs propres genes [11] ; la threonyl-ARNt synthetase (ThrRS), par

exemple, lie l’extremite 5’-terminale de son ARNm, dont la structure imite celle de

l’ARNtThr [12]. D’autres synthetases, encore, participent au controle du metabolisme

des acides amines [4].


Tab. 1.1 – Classification des aminoacyl-ARNt synthetasesSous-classe : Ia Ib Ic IIa IIb IIc

ArgRSa GlnRSa TrpRS GlyRSc AsnRS AlaRS

CysRS GluRSa TyrRS HisRS AspRS GlyRSc

IleRS ProRS LysRS IIb PheRS

LeuRS ThrRS

MetRS SerRS

ValRS

LysRS Iab

a Requierent la presence de leur ARNt pour l’activation de leur acide amine.

b Il existe deux types de LysRS, une appartenant a la classe I, l’autre a la classe II.

c Il existe deux types de GlyRS non apparentes.

1.2.2 Structure

Il existe deux classes d’aminoacyl-ARNt synthetases (classes I et II). Il n’y a pas

d’homologie entre les aaRS appartenant a ces deux classes, qui auraient evolue a partir

de deux proteines ancestrales differentes. Cette observation surprenante suggere que

le mecanisme de traduction aurait peut-etre evolue par la fusion de deux processus

primitifs associes a des ensembles d’acides amines differents [13]. Notons par ailleurs

que plusieurs organismes (incluant la bacterie Escherichia coli) possedent deux genes

codant pour des lysyl-ARNt synthetases, l’une appartenant a la classe I, l’autre a la

classe II [14]. Il s’agit du seul exemple connu d’une synthetase qui soit representee dans

les deux classes. Le tableau 1.1 resume la repartition des synthetases en deux classes

et en six sous-classes [4].

Si toutes les synthetases catalysent de facon similaire la reaction d’aminoacylation

[6], les synthetases des deux classes varient toutefois enormement en ce qui concerne

leurs structures et leurs facons de lier les ARNt [15]. Les differences les plus evidentes

se situent au niveau du motif structural responsable de l’activite catalytique : alors

que ce motif est un pli de Rossman (un feuillet β parallele dont chaque cote fait

contact avec deux helices α) chez les synthetases de classe I, il s’agit plutot d’un

feuillet β antiparallele chez les synthetases de classe II. Chez les enzymes de classe

I, les interactions avec la tige acceptrice de l’ARNt se font par le sillon mineur, alors

que les enzymes de classe II approchent la tige acceptrice par le sillon majeur. Le site

d’aminoacylation de l’ARNt varie egalement selon le type d’enzyme : les synthetases

de classe I esterifient l’acide amine sur la fonction hydroxyle 2’ du ribose de l’extremite

3’-terminale de l’ARNt, alors que les synthetases de classes II lient l’acide amine a

l’hydroxyle 3’ de ce meme ribose.


La figure 1.4 illustre ces differences entre les deux classes d’aminoacyl-ARNt

synthetases. La GluRS (figure 1.4 a) est en conformation alongee lorsqu’elle lie son

ARNt, et etablit des contacts avec le sillon mineur de la tige acceptrice. Le domaine

N-terminal (domaine catalytique) presente le pli de Rossman caracteristique des syn-

thetases de classe I. A l’oppose, l’aspartyl-ARNt synthetase (AspRS) (figure 1.4 b)

adopte une conformation courbee dans le complexe synthetase ARNt, et approche cet

ARNt par l’autre cote, interagissant avec le sillon majeur de la tige acceptrice. Enfin,

on remarque que le domaine catalytique est forme d’un feuillet β.

1.2.3 Modularite

Une importante caracteristique structurale des aminoacyl-ARNt synthetases est

leur modularite. Les aaRS ancestrales n’etaient probablement constituees que d’un seul

domaine, soit le cœur catalytique responsable de l’esterification des acides amines aux

ARNt. Au cours de l’evolution, des domaines supplementaires se sont greffes a ce cœur,

augmentant l’efficacite de ces enzymes. Ces modules sont hautement independants, tel

que demontre par de nombreuses etudes structurales [19].

Ces domaines additionnels ont des fonctions variees. La plus evidente est l’etablis-

sement d’interactions avec les determinants et antideterminants des ARNt, ameliorant

la specificite de la reconnaissance de ces derniers par la synthetase [20]. Une autre

fonction repandue est l’hydrolyse de produits de mesacylation ; les aminoacyl-ARNt

synthetises par le cœur catalytique peuvent etre deplaces vers ce domaine avant de

quitter la synthetase, permettant ainsi de verifier leur nature et, si necessaire, de

les hydrolyser avant qu’ils ne puissent etre reconnus par les facteurs d’initiation et

d’elongation de la traduction [21]. Enfin, certains domaines supplementaires peuvent

transmettre un signal vers le domaine catalytique, permettant d’induire des change-

ments conformationnels dans le site actif en reponse a la liaison de l’ARNt [22].

L’existence d’enzymes de correction des mesacylations homologues aux domaines

d’edition des aaRS [21] et l’independance importante des domaines des aaRS montrent

que les synthetases modernes ont evolue de facon divergente par duplication et fusion de

genes. Ce sont ces evenements de duplication qui auraient permis l’incorporation au code

genetique de l’ensemble des acides amines standards et, particulierement, celle des acides

amines glutamine et asparagine, souvent consideres comme les derniers acides amines a

avoir ete acquis par les organismes. La pression selective resultant de la duplication

d’un gene d’aaRS aurait force la specialisation concomitante des deux paralogues,

ou la transformation rapide d’un des genes en un gene cryptique [23]. La presence

de nombreux paralogues des aaRS dans les genomes des organismes contemporains


(a) La glutamyl-ARNt synthetase (une aaRS de classe I) de Thermus

thermophilus (en vert) complexee a son ARNt (en mauve) [16]. Le

motif structural (en bleu) contenant le site catalytique est un pli de

Rossman. m : Cote du sillon mineur (situe derriere l’ARN par rapport

a l’observateur). L’helice d’ARN est depliee apres la liaison a l’enzyme.

(b) L’aspartyl-ARNt synthetase (une aaRS de classe II) de E. coli

(en vert) complexee a son ARNt (en mauve) [17]. Le motif structural

(en bleu) contenant le site catalytique est un feuillet β anti-parallele.

M : Cote du sillon majeur (situe devant l’ARN par rapport a

l’observateur).

Fig. 1.4 – Exemples des structures des aminoacyl-ARNt synthetases de classes I et II.

Images stereoscopiques realisees avec le logiciel Pymol [18].


atteste cette hypothese. Le gene yadB, presente plus loin (section 1.4.1), est un de ces

paralogues, et a d’abord ete considere comme un gene cryptique resultant de l’evolution

des aminoacyl-ARNt synthetases de la classe Ib (section 1.3).

1.2.4 Specificite

La fidelite de la biosynthese des proteines depend grandement de l’aminoacylation

correcte des ARNt. Un ARNt mesacyle peut etre utilise lors de la synthese de nouvelles

proteines par le ribosome, lequel ne discrimine pas les ARNt correctement et incor-

rectement charges [24]. La specificite des aminoacyl-ARNt synthetases est le facteur

determinant dans l’aminoacylation correcte des ARNt.

La reconnaissance specifique des ARNt par les aaRS se fait principalement par le

biais de contacts avec la tige acceptrice et la region de l’anticodon. Dans le premier cas,

le domaine implique est celui responsable de l’activite catalytique. Dans le second cas, il

s’agit plutot d’un des domaines supplementaires presentes plus tot (section 1.2.3). La

preponderance des contacts avec la tige acceptrice suggere que les ancetres des ARNt

modernes etaient probablement constitues d’une mini-helice, laquelle aurait evolue par

fusion avec d’autres ARN [25]. Des contacts entre les aaRS et d’autres regions des

ARNt, telles que la tige D, certaines paires de bases et certains nucleotides modifies ont

egalement ete observes.

La specificite de certaines synthetases est augmentee par un mecanisme d’ajuste-

ment induit impliquant l’ARNt. Dans le cas de la GluRS, la liaison de l’ARNt modifie

la conformation du site actif, ce qui favorise la liaison de l’ATP dans un site qui permet

la reaction d’activation du glutamate (section 1.2.1). A l’inverse, lorsque l’ARNt est

absent, l’ATP est lie dans un site ou la distance qui separe son phosphate α de la

fonction carboxyle α du glutamate est trop importante pour que la reaction puisse avoir

lieu. Ce mecanisme d’ajustement induit permet a la GluRS de reagir a la concentration

d’ARNtGlu libre dans la cellule et de limiter la mesacylation d’ARNt non specifiques [5].

Le nombre eleve de contacts specifiques pouvant etre etablis avec les ARNt facilite

leur reconnaissance. Dans le cas des acides amines, la reconnaissance est plus difficile :

s’il est facile de distinguer certaines chaınes laterales (par exemple la cysteine, dont la

structure est tres particuliere [26]), d’autres sont difficiles a discriminer puisque qu’elles

different tres peu entre elles ; par exemple, l’isoleucine ne differe de la valine que par la

presence d’un groupe methyle supplementaire. Afin d’assurer la fidelite de l’aminoacy-

lation, les aaRS ont developpe deux mecanismes de correction, illustres a la figure 1.5

[27]. Le premier de ces mecanismes (figure 1.5 c) est la correction avant transfert :


Fig. 1.5 – Reactions de correction de mesacylations. Exemple pour l’isoleucyl-ARNt

synthetase. a) Mesactivation de la valine par l’IleRS. b) Mesacylation de la valine sur

l’ARNt de l’isoleucine. c) Correction pre-transfert : l’aminoacyl-adenylate incorrect est

hydrolyse avant son esterification a l’ARNt. d) Correction post-transfert : l’aminoacyl-

ARNt incorrect est hydrolyse.

l’acide amine active sous forme d’un aminoacyl-adenylate complexe a la synthetase

est hydrolyse avant d’etre charge sur l’ARNt. L’isoleucyl-ARNt synthetase (IleRS), par

exemple, dispose de deux sites catalytiques distincts qui agissent successivement comme

des filtres moleculaires. Le premier site, responsable de l’activation de l’isoleucine, exclut

les acides amines plus volumineux que l’isoleucine (et ne peut donc exclure la valine),

alors que le second site, qui possede une activite hydrolytique, ne peut lier que les petits

acides amines (esterifies a l’ARNt) tels que la valine [28].

Le second mecanisme de correction (figure 1.5 d), la correction post-transfert,

consiste en l’hydrolyse des aminoacyl-ARNt indesirables. Tel que mentionne plus tot

(section 1.2.3), cette fonction est remplie par des domaines structuraux autres que

celui qui assure l’aminoacylation. Certaines synthetases utilisent les deux mecanismes de

correction. C’est le cas de l’IleRS qui, meme si elle active une valine pour 150 isoleucines

in vivo, parvient a corriger ses erreurs pour limiter le remplacement de l’isoleucine par

la valine dans les proteines a une frequence de moins de une erreur pour 3 000 [29].

Ces determinants et antideterminants pour la reconnaissance des ARNt et des

acides amines, combines aux mecanismes d’edition, procurent aux synthetases une

fiabilite elevee : leur taux d’erreur moyen est de une pour 10 000 [4].

Enfin, les concentrations relatives des acides amines, des ARNt et des aminoacyl-

ARNt synthetases in vivo contribuent egalement a la specificite des reactions d’ami-

noacylation grace a l’etablissement de mecanismes de competition. Ces competitions

s’etablissent entre differentes synthetases pour l’utilisation d’un ARNt dont les


elements d’identite sont ambigus, et entre differents ARNt pouvant servir de substrats

a une meme synthetase. Globalement, ces mecanismes de competition augmentent la

specificite de l’aminoacylation par rapport aux valeurs mesurees dans les experiences

in vitro ou seule la specificite des aaRS est prise en compte [30].

1.3 Evolution des aminoacyl-ARNt synthetases de

la famille GlxRS

Les aminoacyl-ARNt synthetases glutamyl-ARNt synthetase et glutaminyl-ARNt

synthetase (GlnRS) sont les aaRS les plus rapprochees d’un point de vue phylogenetique

et forment ensemble la famille GlxRS (sous-classe Ib), elle-meme divisee en deux sous-

familles de genes. Etonnamment, cette division en sous-familles ne separe pas les GluRS

des GlnRS, mais rassemble plutot d’un cote les GluRS bacteriennes et organellaires,

et de l’autre les GluRS archæbacteriennes et eucaryotes ainsi que les GlnRS. Ces

relations evolutives non-canoniques impliquent egalement un transfert lateral du gene

de la GlnRS a partir des eucaryotes vers quelques bacteries [23].

L’evolution de la famille des GlxRS, illustree a la figure figure 1.6, debuta

par la formation de deux lignees distinctes par evolution d’une GluRS ancestrale

(figure 1.6 a). Cette derniere etait formee d’un seul domaine structural servant a

l’aminoacylation des ARNt glutamate et glutamine. La voie indirecte de formation

du Gln-ARNtGln par transamidation existait donc avant l’apparition de la GlnRS.

Cette separation en deux lignees concorde avec l’evolution de l’arbre de la vie, soit la

formation d’une lignee menant a l’apparition des bacteries et d’une autre rassemblant

les ancetre des eucaryotes et des archæ.

Les deux groupes de GluRS ainsi formes acquirent par la suite un domaine supple-

mentaire permettant la reconnaissance de l’anticodon des ARNt. Dans le cas des GluRS

bacteriennes, ce domaine est forme d’une cage d’helices α (figure 1.6 b), alors que,

dans le cas des eucaryotes et des archæ, il est forme d’un barril β (figure 1.6 c).

La separation entre les archæ et les eucaryotes (figure 1.6 d) eut lieu avant l’ap-

parition de la GlnRS. L’emergence de la GlnRS se produisit sans doute immediatement

apres cette scission, puisque tous les eucaryotes disposent de l’enzyme GlnRS. Cette

apparition se fit par duplication du gene de la GluRS eucaryotique (figure 1.6 e) et

par specialisation concomitante des produits des deux genes : l’un d’eux a perdu la

capacite de reconnaıtre l’ARNtGln pour devenir une GluRS discriminatrice, alors que


Fig. 1.6 – Evolution des aaRS de la famille GlxRS. a) Scission entre les bacteries et les

eucaryotes et archæ. b) Acquisition d’un domaine α de reconnaissance de l’ARNt par

les GluRS bacteriennes. c) Acquisition d’un domaine β de reconnaissance de l’ARNt

par les GluRS eucaryotes et archæbacteriennes. d) Scission entre les eucaryotes et les

archæ. e) Duplication et evolution de la GluRS chez les eucaryotes pour donner la

GlnRS. f) Acquisition de la GlnRS par quelques bacteries par transfert horizontal. g)

Specialisation de la GluRS bacterienne qui devient discriminatrice chez les bacteries qui

ont acquis une GlnRS par transfert horizontal.


l’autre a change de specificite pour reconnaıtre la glutamine plutot que le glutamate,

tout en perdant la capacite d’aminoacyler l’ARNtGlu.

La presence d’une GlnRS dans un nombre restreint de bacteries (incluant E.

coli) s’explique par le transfert horizontal du gene de la GlnRS eucaryote vers ces

organismes (figure 1.6 f). La presence simultanee des mecanismes direct et indirect

d’aminoacylation de l’ARNtGln n’etait probablement pas viable pour des organismes

deja tres specialises ; c’est pourquoi le transfert a probablement ete accompagne de la

specialisation immediate de la GluRS, qui a perdu la capacite de reconnaıtre l’ARNtGln

(figure 1.6 g).

Enfin, notons que les plupart des cellules eucaryotes disposent egalement d’une

ou de plusieurs GluRS bacteriennes, ces dernieres se trouvant dans les organelles qui

ont ete acquises par endosymbiose d’organismes qui etaient les ancetres des bacteries

modernes.

1.4 La glutamyl-queuosine-ARNtAsp synthetase

1.4.1 Le gene yadB

L’evolution complexe de la famille GlxRS presentee ci-haut (section 1.3) im-

plique plusieurs phenomenes de duplication et de specialisation de genes. Il ne serait

donc pas surprenant de retrouver dans les genomes des organismes contemporains des

reliques de cette evolution sous la forme de genes cryptiques ou de pseudogenes. Chez

E. coli, le gene yadB, codant pour la glutamyl-queuosine-ARNtAsp synthetase (dont on

ne connaissait pas la fonction jusqu’a tout recemment), ressemble a un tel gene : il est

homologue au gene gltX codant pour la GluRS, mais sa sequence est plus courte et ne

correspond qu’aux domaines N-terminaux de la GluRS ; de surcroıt, yadB n’aminoacyle

pas l’ARNtGlu in vivo a un niveau substantiel puisque l’inactivation de la GluRS de E.

coli est letale. La figure 1.7 detaille la structure du gene yadB et compare son produit

d’expression a la GluRS.

Il a toutefois ete demontre que yadB est exprime chez E. coli. Il ne s’agit donc

pas d’un gene cryptique : l’ARN messager de yadB a pu etre amplifie a partir de

preparations d’ARN total de E. coli en phase exponentielle de croissance, et le produit

d’expression YadB a ete detecte par transfert Western. YadB pourrait donc avoir un

role metabolique, tout au moins chez E. coli.


Fig. 1.7 – Le gene yadB de E. coli et la GluQRS ; comparaison avec la GluRS. a)

Localisation de yadB sur le chromosome et cotranscription avec dksA. b) Domaines

structuraux de la GluRS. 1 : Domaine catalytique. 2 : Domaine de liaison a la tige

acceptrice. 3 : Domaine SC (« Stem-Contact Fold »). 4-5 : Domaines de liaison a

l’anticodon. c) Domaines structuraux de la GluQRS, homologues a ceux de la partie N-

terminale de la GluRS. Les domaines de liaison a l’anticodon sont absents. d) Structure

de la GluQRS de E. coli [31]. e) Structure de la GluRS de T. thermophilus [16]. La

portion grise represente les domaines de liaison a l’anticodon.


Cette idee est renforcee par des etudes phylogenetiques. Celles-ci montrent que

des homologues de yadB sont presents dans de nombreuses bacteries et que les mo-

tifs caracteristiques des synthetases de classe I y sont conserves. Notons par ailleurs

qu’aucun homologue de yadB n’a ete identifie chez les eucaryotes et les archæ.

YadB est manifestement plus proche evolutivement des GluRS bacteriennes et

organellaires (type α) que des GluRS eucaryotes et archæbacteriennes (type β). La

presence d’un homologue de yadB dans toutes les bacteries disposant d’une GlnRS

permet de croire que yadB aurait pu jouer un role lors du transfert horizontal de

cette enzyme vers ces bacteries, en fournissant une voie metabolique temporaire pour

l’incorporation du glutamate dans les proteines pendant la transition de la GluRS non

discriminatrice vers la GluRS discriminatrice. Voir [32] pour ce paragraphe et les trois

precedents.

1.4.2 Activite de YadB in vitro

La similarite elevee de YadB avec la GluRS (figure 1.7 b et c) suggerait que

cette enzyme encore non caracterisee aurait pu proceder au chargement du gluta-

mate sur l’ARNtGlu. Des mesures d’echange ATP-PPi montrent que, contrairement

a la GluRS, YadB n’a pas besoin de son ARNt pour l’activation du glutamate. Des

experiences d’aminoacylation realisees avec de l’ARNtGlu pur montrent par ailleurs que

YadB n’aminoacyle pas cet ARN [31].

Toutefois, d’autres experiences montrent que YadB catalyse une activite d’amino-

acylation lorsqu’il est en presence d’un extrait d’ARNt total de E. coli. Des experiences

d’aminoacylation realisees avec d’autres ARNt isoaccepteurs purifies ont finalement

demontre que le chargement du glutamate se fait sur l’ARNtAsp. De plus, il a ete claire-

ment demontre que les deux acides amines (glutamate et aspartate) peuvent etre charges

simultanement sur cet ARNt, ce qui suggere l’existence d’un site d’aminoacylation du

glutamate distinct de celui de l’aspartate.

La facilite avec laquelle le Glu-ARNtAsp peut etre hydrolyse indique que le site

de chargement du glutamate est sans doute similaire en termes de proprietes chimiques

a l’extremite 3’ de l’ARN (site du chargement de l’aspartate). L’incapacite de YadB

d’utiliser un transcrit de l’ARNtAsp produit in vitro (et donc depourvu de bases mo-

difiees) comme substrat etait un indice qu’une base modifiee pourrait servir de site de

chargement. Des experiences de spectroscopie de masse ont permis de decouvrir que la

base hypermodifiee queuosine, presente a la premiere position de l’anticodon, est le site

d’aminoacylation. La structure de cette base modifiee est presentee a la figure 1.8. La


N

HN

NARNt

H2N

O N

OHHO

H2CH

Fig. 1.8 – Structure de la base hypermodifiee queuosine

purification d’ARNtAsp a partir d’une souche incapable d’echanger la guanosine 34 de

l’ARNt par la queuosine confirme ces donnees, l’enzyme etant incapable de charger cet

ARNt. Voir [33] pour ce paragraphe et le precedent.

Ces proprietes etonnantes suggeraient de renommer YadB pour mieux refleter

sa fonction biochimique : on designe maintenant cette enzyme sous le nom glutamyl-

queuosine-ARNtAsp synthetase (GluQRS) [34].

1.4.3 Similarites structurales entre la GluQRS et la GluRS

Il existe des similarites marquees entre la tige acceptrice de l’ARNtGlu et la tige

de l’anticodon de l’ARNtAsp chez les organismes possedant une GluQRS [34]. Ces

ressemblances soulevent des questions sur l’evolution des ARNt et des synthetases, et

renforcent l’hypothese selon laquelle une paire d’aaRS ancestrales (une enzyme de classe

I et une autre de classe II) auraient lie un ARNt primitif ; dans un tel complexe ternaire,

chaque synthetase aurait etabli des interactions avec un cote different de l’ARN [35].

Dans le cas present, on peut supposer que la GluRS et l’AspRS (des aaRS de classe

I et II respectivement) auraient lie un meme ARNt, peut-etre un ancetre des ARNt

specifiques au glutamate et a l’aspartate.

Les ressemblances entre ARNtGlu et ARNtAsp ne suffisent toutefois pas a expliquer

comment la GluQRS peut lier un ARNt dans une position si differente de celle employee

par la GluRS, enzyme avec laquelle la GluQRS partage 34 % d’identite. Une partie de

l’explication reside sans doute dans l’absence, dans la GluQRS, de regions homologues

aux domaines C-terminaux de reconnaissance de l’anticodon que l’on observe dans

les GluRS (figure 1.7 d et e) : sans ces deux domaines, la seule portion de l’ARNt

avec laquelle l’enzyme peut etablir des contacts est la tige acceptrice. Or, un nombre

important de determinants et antideterminants de l’identitie des ARNt se retrouvent

dans la region de l’anticodon.


Notons egalement le remplacement, dans tous les genes homologues a yadB, d’une

threonine hautement conservee (potentiellement impliquee dans la selection de l’acide

amine par la GluRS et la GlnRS) par un residu hydrophobe, soit la valine, la leucine ou

l’isoleucine. La specificite de la GluQRS pour le L-glutamate est pourtant aussi elevee

que celle de la GluRS. Il s’agit d’un indice structural supplementaire suggerant que le

mode d’action de la GluQRS est significativement different de celui de la GluRS [32].

La structure de la GluQRS libre a ete determinee a une resolution de 1,5 A [31].

Elle ressemble fortement a celle des domaines N-terminaux de la GluRS. Bien qu’un

modele ait ete propose pour la liaison de l’ARNt a l’enzyme [34], ce modele repose

essentiellement sur des contraintes theoriques et intuitives et ne permet pas de formuler

d’hypothese solide decrivant l’orientation de l’ARNt lors de l’approche par la GluQRS.

1.4.4 Relation avec le gene dksA

L’amplification de l’ARNm de yadB a demontre que, chez E. coli, les genes dksA et

yadB sont coexprimes (figure 1.7 a). La presence d’un operon dksA yadB est egalement

suggeree par la sequence du chromosome, ou l’on trouve une sequence promotrice en

amont de dksA, mais aucune immediatement en amont de yadB ; aucune sequence

terminatrice ne semble separer les deux genes [32].

Bien que leur coexpression n’ait pas ete verifiee pour d’autres organismes que E.

coli, ces genes montrent une relation syntenique dans le genome de plusieurs bacteries,

par exemple Pseudomonas æruginosa. Cette relation suggere qu’ils pourraient etre

impliques dans la meme voie metabolique.

dksA a d’abord ete identifie en tant que suppresseur dosable d’une mutation

inactivant dnaK. La surexpression de dksA dans la souche E. coli ∆dnaK palie la

thermosensibilite causee par l’inactivation [36].

Chez P. æruginosa, dksA est un regulateur important de plusieurs facteurs ex-

tracellulaires de virulence. La synthese de rhamnolipides et l’expression de l’elastase

LasB (une protease impliquee dans l’infection de l’hote) sont pratiquement nulles dans

les cellules ou dksA a ete delete. Des experiences ayant demontre que les niveaux de

transcription des genes lasB et rhlAB (une enzyme impliquee dans la synthese des

rhamnolipides) ne varient pas entre la souche sauvage et la souche ∆dksA, il semble

que dksA soit un regulateur post-transcriptionnel [37].


Le gene dksA est aussi implique dans la reponse a des stress environnementaux

varies chez certains pathogenes. Des etudes realisees avec la bacterie Salmonella typhi-

murium associent dksA a la resistance de cette bacterie a de faibles pH et a sa survie

pendant la phase stationnaire. Le mecanisme d’action de dksA chez S. typhimurium

n’est pas connu, mais serait lie a l’accumulation du facteur sigma alternatif σS de

l’ARN polymerase. DksA serait requis pour la traduction du gene rpoS ; son inactivation

empeche la synthese du facteur σS, ce qui diminue la virulence de la bacterie chez la

souris [38].

Un mecanisme semblable de regulation du gene rpoS par dksA a ete observe

chez Shigella flexneri. Une sensibilite accrue au choc oxydatif et a un milieu acide a

ete observee chez un mutant dksA. Ces effets ne seraient toutefois que partiellement

attribuables a une production insuffisante de RpoS ; DksA agirait aussi par le biais

d’un mecanisme independant de RpoS. Globalement, l’inactivation de dksA conduit a

une pathogenicite reduite, les cellules mutantes etant incapables de se propager dans le

milieu intercellulaire dans des cultures tissulaires [39].

Des informations supplementaires sur le mecanisme de regulation de RpoS par

dksA ont ete obtenues par l’etude des stress nutritifs chez E. coli. On sait qu’un manque

de nutriments induit, chez les bacteries, la synthese de guanosine-3’5’-bis(diphosphate)

(ppGpp). Ce metabolite agit comme un signal de l’appauvrissement du milieu en acides

amines libres. Son absence empeche l’expression de RpoS, maintenant la cellule en phase

exponentielle de croissance. L’action regulatrice de dksA impliquerait la mediation du

signal ppGpp conduisant a l’induction de rpoS [40].

La determination de la structure de DksA [41], couplee a des etudes recentes sur

les interactions entre l’ARN polymerase et l’effecteur ppGpp, permet de comprendre

le role de DksA au niveau moleculaire. Le modele propose suggere que DksA forme

un complexe avec l’ARN polymerase et stabilise la liaison du ppGpp a ce complexe

enzymatique. Cette interaction serait necessaire a la fixation du nucleotide tri-phosphate

(NTP) initial permettant l’initiation de la transcription des genes des ARN ribosomiaux

(ARNr). Ce modele est confirme par l’invariabilite du taux de transcription des genes

des ARNr dans une souche de E. coli ∆dksA ; a l’inverse, dans la souche sauvage, le taux

de transcription des genes des ARNr est influence, entre autres, par la concentration

d’acides amines libres et par la phase de croissance cellulaire. La meme etude rapporte

que l’effet de dksA est maximal pendant la phase stationnaire de croissance [42].


1.4.5 Questions et objectifs

Le role du Glu-Q-ARNtAsp synthetise par la GluQRS est encore inconnu. Les

etudes realisees jusqu’a maintenant excluent toutefois la possiblite d’une utilisation

classique de cet aminoacyl-ARNt dans la synthese proteique ; le chargement du glu-

tamate sur l’ARNtAsp ressemble davantage a une modification de l’ARN qu’a une

aminoacylation conventionnelle.

L’eventuelle relation entre dksA et yadB est egalement inconnue, mais l’existence

d’un operon liant l’expression de ces deux genes laisse penser que yadB pourrait, lui

aussi, etre implique dans un mecanisme de reponse generale au stress et dans le passage

a la phase stationnaire de croissance.

La presente etude visait, dans un premier temps, a determiner si yadB est un gene

essentiel chez E. coli. Pour ce faire, une souche mutante a ete construite par deletion

du gene yadB. La viabilite des cellules a ete verifiee dans des conditions de culture

optimales et dans des conditions minimales. Les differences phenotypiques entre les

souches sauvage et mutante ont ete investiguees.

Dans un second temps, le gene yadB a ete remplace sur le chromosome de E. coli

par un gene rapporteur (lacZ ). Ce dernier a ete utilise pour determiner les conditions

d’expression de yadB par dosage enzymatique du nombre de copies du rapporteur

(la β-galactosidase) dans des cultures liquides. Il a ainsi ete possible de verifier que

l’expression de yadB est liee au passage a la phase stationnaire de croissance. Nous

avons aussi essaye d’induire l’expression du gene en reproduisant in vitro certains stress

cellulaires.

Chapitre 2

Materiel et methodes

2.1 Tampons, solutions et produits chimiques

La composition des tampons et autres solutions utilisees dans les experiences

decrites plus loin est donnee au tableau 2.1. Toutes les solutions ont ete preparees avec

de l’eau purifiee par un systeme NANOpure (qui combine les methodes d’ultra-filtration

et de photo-oxydation aux rayons U.V.) de la compagnie Barnstead. Les solutions ont

ete sterilisees par filtration, a l’aide de membranes de pores de 0,22 µm de diametre. Des

produits chimiques de grade extra-pur ont ete employes dans la confection de toutes

les solutions. Les fournisseurs de ces produits sont les compagnies LabMat, Anachemia,

Fischer Scientific et BDH.

2.2 Culture cellulaire

2.2.1 Milieux de culture et conditions de croissance

Quatre milieux de culture ont ete utilises : Luria-Bertani (LB), M9 enrichi, SOB et

SOC. La composition de ces milieux est donnee dans le tableau 2.2. Les milieux ont ete

prepares en dissolvant les composants (provenant des fournisseurs Difco, Fischer Scien-

tific et LabMat) dans de l’eau demineralisee (milieux LB, SOB et SOC) ou NANOpure

(milieu M9), avant d’autoclaver le milieu pendant 20 minutes a 121 ◦C a une pression de

15 psi. Pour les milieu M9, SOB et SOC, les supplements nutritifs (chlorure et sulfate

de magnesium, glucose, thiamine, leucine et proline) ont ete prepares independamment,

Chapitre 2. Materiel et methodes 20

Tab. 2.1 – Tampons et solutionsSolution Composition (a 1 X) Reference

Reactif ONPGaONPG 4,0 mg/ml

[43]Solution preparee dans le tampon Z

Tampon de charge

pour gels d’agarose

Ficoll 400 2,0 %

[44]

EDTA 10 mM

SDS 0,1 %

Bleu de bromophenol 0,25 %

pHb (ajuste avec NaOH) 8,0

Tampon TB

Pipes 10 mM

[45]

CaCl2 15 mM

KCl 250 mM

MnCl2c 55 mM

pHb (ajuste avec KOH) 6,7

Tampon TBE

Tris 90 mM

[44]Acide borique 90 mM

EDTA 3,2 mM

pHb (non ajuste) ∼ 8, 3

Tampon TE

Tris 10 mM

[46]EDTA 1 mM

pHb (ajuste avec HCl) 8,5

Tampon Z

NaH2PO4 60 mM

[43]

NaH2PO4 40 mM

KCl 10 mM

MgSO4 1 mM

2-mercaptoethanold 50 mM

pHb (ajuste avec HCl ou NaOH) 7,0a Prepare immediatement avant son utilisation.

b Mesure a 22 ◦C.

c Ajoute en dernier apres ajustement du pH.

d Ajoute immediatement avant usage.


filtres pour les steriliser, puis rajoutes au milieu une fois ce dernier autoclave et refroidi

a une temperature de moins de 50 ◦C. L’ajout des acides amines leucine et proline

est requis par l’auxotrophie des souches TP8503, POK1 et POK2. (Les genotypes et

phenotypes des souches utilisees sont presentes a la section 2.2.3.) Les antibiotiques

appropries (section 2.2.2) ont ete ajoutes sterilement aux milieux apres que ceux-ci

aient ete autoclaves et que leur temperature ait redescendu en dessous de 50 ◦C.

Les milieux SOB et SOC n’ont ete employes que pour la transformation de cellules

de E. coli par de l’ADN plasmidique (section 2.3.12). Le milieu minimal M9 a ete

employe pour l’etude des conditions d’expression et des effets de la deletion du gene

yadB (section 2.8.2). Le milieu LB a aussi ete utilise pour les etudes sur l’expression et

les effets de la deletion de yadB, ainsi que pour toutes les autres experiences de biologie

moleculaire (section 2.3).

A moins d’indication contraire, les cultures ont ete realisees a une temperature de

37 ◦C, dans des tubes de verre de 18 mm (cultures de 5,0 ml) ou dans des erlenmeyers

de 250 ml (cultures de 50 ml) soumis a une agitation lineaire de 250 rpm.

2.2.2 Agents selectifs

Lorsque necessaire, les antibiotiques ampicilline, chloramphenicol et kanamycine,

ainsi que le sucrose, ont ete utilises comme agents de selection, selon les concentrations

indiquees dans le tableau 2.3. Tous les antibiotiques ont ete fournis par la compagnie

Boehringer Mannheim.

2.2.3 Souches

Les souches de E. coli employees dans le cadre de cette etude sont repertoriees

dans le tableau 2.4. Toutes les souches ont ete conservees a -80 ◦C dans un congelateur

sans cycle de degivrage, apres ajout de 10 % de glycerol a une culture liquide fraıchement

saturee.

Les souches E. coli XL1-Blue et TOP10 ont ete utilisees pour tous les clonages qui

ont ete necessaires a la construction du vecteur permettant le remplacement du gene

yadB. Ces procedures sont decrites en details plus loin (section 2.4). Les souches

EDCM, la souche DH5α/pCP20 et la souche TP8503 ont ete obtenues aupres des

chercheurs ayant mis au point la methode de remplacement et de deletion utilisee [48].


Tab. 2.2 – Milieux de cultureMilieu Composant Concentration Reference

LB

Hydrolysat de caseine (tryptone) 10,0 g/l

[47]Extraits de levure 5,0 g/l

NaCl 2,5 g/l

Agara 15,0 g/l

M9

Na2HPO4 6,0 g/l

[47]

KH2PO4 3,0 g/l

NH4Cl 1,0 g/l

NaCl 0,5 g/l

CaCl2 3,0 mg/l

Agara 15,0 g/l

MgSO4 1,0 mM

Glucose 0,2 %

Thiamine 50 ppm

L-Leucine 0,25 g/l

L-Proline 0,25 g/l

SOB


[45]

Extraits de levure 5,0 g/l

NaCl 10 mM

KCl 2,5 mM

MgCl2 10 mM

MgSO4 10 mM

SOC


[45]

Extraits de levure 5,0 g/l

NaCl 10 mM

KCl 2,5 mM

MgCl2 10 mM

MgSO4 10 mM

Glucose 20 mMa Seulement pour les cultures en milieu solide.

Tab. 2.3 – Agents selectifs

Produit Abreviation ConcentrationGene de Gene de Phenotypes

resistance sensibilite Resistant Sensible

Ampicilline Amp 100 µg/ml bla ApR ApS

Chloramphenicol Chl 35 µg/ml cat CmR CmS

Kanamycine Kan 50 µg/ml aph KmR KmS

Sucrose Suc 10 % sacB SucR SucS


Les plasmides presents dans les souches EDCM et dans la souche DH5α/pCP20 sont

decrits plus loin (section 2.3.1). La souche TP8503 a ete utilisee dans la construction

de la souche POK1, ou le gene yadB est remplace (section 2.5) par la cassette FLK2

portant le gene rapporteur lacZ, et dans la construction de la souche POK1, ou ce gene

est delete (section 2.6). Les souches POK1 et POK2 ont ete utilisees pour determiner

les conditions d’expression et les effets de la deletion (section 2.8) du gene yadB.

Apres la reception des cellules EDCM, DH5α/pCP20 et TP8503 par courrier,

sous forme de cultures en gelose profonde, chaque souche a ete etalee sur les geloses

appropriees (LB-Chl-Kan pour EDCM70, LB-Amp-Kan pour EDCM81, LB-Amp-Chl

pour DH5α/pCP20 et LB pour TP8503). Apres incubation a 37 ◦C pour les souches

EDCM81 et TP8503, et a 30 ◦C pour les souches EDCM70 et DH5α/pCP20 (afin de

permettre la replication des plasmides dont l’origine de replication est thermosensible),

un clone de chaque souche a ete repique en milieu liquide. Apres 18 heures de crois-

sance, un echantillon de 1,0 ml de chaque souche a ete preleve et conserve a -80 ◦C

dans les conditions indiquees ci-dessus. La presence des plasmides d’interet dans les

cellules a ensuite ete verifiee par preparation de l’ADN plasmidique (section 2.3.4) et

electrophorese sur gel d’agarose (section 2.3.10).

2.3 Manipulations de l’ADN

2.3.1 Plasmides

Les plasmides employes dans le cadre de ce travail sont listes dans le tableau 2.5.

Les plasmides pTOF24, pTOF30 et pET-dksA-yadB ont ete utilises pour la construction

du vecteur pTOF-YB (section 2.4), ce dernier ayant servi au remplacement du gene

yadB par la cassette FLK2 porteuse du rapporteur lacZ, resultant en la creation de

la souche POK1 (section 2.5). Le plasmide pTOF-YA est un intermediaire dans la

construction de pTOF-YB ; il contient les regions flanquant le gene yadB, mais la cas-

sette FLK2 n’y a pas encore ete inseree. Le plasmide pCP20 exprime la flippase de levure

(recombinase Flp), qui a permis d’obtenir une souche ∆yadB (POK2) (section 2.6)

par excision de la cassette FLK2 presente dans le genome de la souche POK1. Le detail

des plasmides pTOF24, pTOF30, pTOF-YA et pTOF-YB est presente a la figure 2.1.


Tab. 2.4 – Souches de E. coli

Souchea PlasmideGenotypes et Elements conferes Source ou

phenotypes par un plasmide reference

TOP10

F− mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC )

Invitrogenφ80lacZ∆M15 ∆lacX74 deoR

recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697

galU galK rpsL endA1 nupG

XL1-Blue

recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17

StratagenesupE44 relA1 lac [F’ proAB

lac1 qZ∆M15 Tn10 ]

TP8503 ∆(lac-proB) leu thi-1 supE42 fhuA [48]

EDCM70

(DH5α)pTOF24

φ80lacZ∆M15 recA1 endA1 gyrA96aph cat

sacB repAts [48]thi-1 hsdR17 (r−κ

m+κ

) supE44

relA1 deoR ∆(lacZYA-argF)U169

EDCM81

(DH5α)pTOF30

φ80lacZ∆M15 recA1 endA1 gyrA96bla FRT-lacZ -

aph-FRT[48]thi-1 hsdR17 (r−κ m+

κ ) supE44


DH5α pCP20

φ80lacZ∆M15 recA1 endA1 gyrA96bla cat flp

repAts [48]thi-1 hsdR17 (r−κ

m+κ

) supE44


POK1 ∆(lac-proB) leu thi-1 supE42 fhuAsection 2.5

(TP8503) yadB〈〉(FRT-lacZ -aph-FRT)

POK2 ∆(lac-proB) leu thi-1 supE42 fhuAsection 2.6

(TP8503) ∆yadBa Lorsqu’une souche a ete construite a partir d’une autre souche, cette derniere est indiquee entre parentheses.

Tab. 2.5 – PlasmidesPlasmide Elements genetiques Description Reference

pTOF24 aph cat sacB repAts

Vecteur pour le clonage de yadB

[48]et pour l’insertion de la

cassette FLK2

pTOF30 bla FRT-lacZ-aph-FRT Source de la cassette FLK2 [48]

pCP20 bla cat flp repAts

Exprime la recombinase Flp

[48]permettant l’excision de la

cassette FLK2

pET-dksA-yadBdksA-yadB-pncB’ Source du gene yadB et de ses D. Dubois

lacI aph regions flanquantes (non publie)

pTOF-YAsacB repAts cat dksA’ - Intermediaire dans la construction

section 2.4yadB’ -’yadB-pncB’ du vecteur pTOF-YB

pTOF-YB

sacB repAts cat dksA’ - Vecteur pour le remplacement du

section 2.4yadB’ -FRT-lacZ -aph- gene yadB par la cassette

FRT-’yadB -pncB’ FLK2


(a) pTOF24 - Vecteur servant a la

construction de pTOF-YB

(b) pTOF30 - Source de la cassette

FLK2

(c) pTOF-YA - Intermediaire dans la

construction de pTOF-YB

(d) pTOF-YB - Vecteur pour le rem-

placement de yadB

Fig. 2.1 – Plasmides


Tab. 2.6 – OligonucleotidesNom Site de restriction Sequencea Tm

b

Ci NotI ccgttccaagcggccgcaagagcgAGCGTCGAGCAAATCCTTCAGTCA 64

Co SalI aaaaagtcgacGCTTCGTATCCCGCTTTATTGAGC 69

Ni NotI cgctcttgcggccgcttggaacggCAGAGAGCCAAAATGAAGCTCGCC 67

No PstI aaaaactgcagATCGCACCGTTACACATATGCAGG 69

Cext TCCGTGAAGTAGCGGGTAAT 60

Next CCGGGCGAAGAGTATATGAA 60

F1 GGCCTCTTCGCTATTACGC 60

F2 CTGCCTCGGTGAGTTTTCTC 60a Les bases complementaires a la sequence genomique sont en majuscules. Les sites de restriction sont soulignes.

b Temperature de fusion

2.3.2 Oligonucleotides

Les oligonucleotides employes dans les experiences decrites plus loin sont detailles

au tableau 2.6. Les oligonucleotides No et Ni ont ete utilises pour amplifier par PCR

la region 5’ du gene yadB et une partie du gene en amont (dksA). De maniere similaire,

les oligonucleotides Co et Ci ont ete utilises pour l’amplification de la portion 3’ de yadB

et d’une partie du gene en aval (pncB). La paire No et Co a servi a amplifier le fragment

resultant de la ligature des regions 5’ et 3’. Ce fragment a servi a la construction du

vecteur pTOF-YB presente plus tot (section 2.3.1).

Les oligonucleotides Next et Cext ont ete utilises, soit ensemble, soit en combi-

naison avec les oligonucleotides F1 et F2, afin de confirmer le remplacement de yadB

par la cassette FLK2 (section 2.5.4) dans la souche POK1, et la deletion de yadB

(section 2.6.3) dans la souche POK2. Tous les oligonucleotides ont ete synthetises

par la compagnie Invitrogen et purifies par desalage. Le programme eprimer3, qui

fait partie de la suite logicielle EMBOSS [49], a ete utilise pour faciliter l’ingenierie des

oligonucleotides. Le programme remap, du meme ensemble logiciel, a ete utilise pour

choisir des sites de restriction compatibles avec les sequences a cloner.

2.3.3 Purification d’ADN par extraction et precipitation

L’ADN obtenu par digestion (section 2.3.7), dephosphorylation (section 2.3.9)

et ligature (section 2.3.8) a ete purifie par extraction au phenol et au chloroforme et

par precipitation a l’acetate de sodium et a l’ethanol, selon un protocole etabli [50] :


1. Ajouter a l’ADN en solution dans un microtube 1,0 volume d’une solution de

phenol / chloroforme / alcool isoamylique (25 : 24 : 1).

2. Vortexer vigoureusement pendant 10 secondes, puis centrifuger 15 secondes a

10 000 × g dans une microcentrifugeuse. Les proteines denaturees par le phenol

se retrouvent dans la phase organique, alors que les acides nucleiques restent dans

la phase aqueuse.

3. Prelever la phase superieure (aqueuse) et la transferer dans un autre microtube.

4. Ajouter 1,0 volume de tampon TE 1 X a la phase organique.


10 000 × g dans une microcentrifugeuse.

6. Prelever la phase superieure (aqueuse) et l’ajouter a la premiere phase aqueuse

qui a ete prelevee. Cette deuxieme extraction permet d’augmenter le rendement

de la purification.

7. Ajouter a la phase aqueuse 1,0 volume d’une solution de phenol / chloroforme /

alcool isoamylique (25 : 24 : 1).


10 000 × g dans une microcentrifugeuse.

9. Prelever la phase superieure (aqueuse) et la transferer dans un autre microtube.

Cette extraction supplementaire reduit la possibilite de contamination par des

proteines.

10. Ajouter 0,1 volume d’acetate de sodium 3 M pH 5,2. Melanger.

11. Ajouter 2,0 volumes d’ethanol 100 % froid. Melanger en vortexant. L’ADN en

solution commence a precipiter.

12. Placer a -80 ◦C pendant 20 minutes afin de favoriser la precipitation complete de

l’ADN.

13. Centrifuger 10 minutes a 10 000 × g.

14. Enlever le surnageant.

15. Ajouter 500 µl d’ethanol 80%.

16. Centrifuger 5 minutes a 10 000 × g. Ce lavage permet d’eliminer les sels.

17. Enlever le surnageant. Secher sous vide.

18. Resuspendre l’ADN dans le tampon TE 1 X.

2.3.4 Preparation d’ADN plasmidique

L’extraction d’ADN plasmidique a partir de cellules de E. coli a ete faite avec

la trousse commerciale QIAprep Spin Miniprep Kit de la compagnie QIAGEN. Les


preparations ont ete realisees a partir de 5,0 ml de cultures bacteriennes inoculees

environ 18 heures plus tot. Les croissances ont ete realisees a 30 ◦C afin de permettre la

replication des plasmides contenant une origine de replication thermosensible (repAts).

Le protocole employe est celui recommande par QIAGEN [51]. Les cellules sont

d’abord culotees par centrifugation, puis resuspendues dans un faible volume de tampon

contenant de la RNAse, afin de degrader les ARN. Les cellules sont lysees a l’aide

d’une solution alcaline contenant du NaOH et du SDS. A l’interieur d’une etroite plage

de pH (12,0 a 12,5), l’ADN circulaire de faible poids moleculaire (ADN plasmidique)

n’est pas denature, alors que l’ADN de plus haut poids moleculaire (ADN genomique)

l’est [52]. Le lysat est neutralise a l’aide d’un tampon contenant de l’acide acetique

et du chlorure de guanidinium (agent denaturant). La renaturation rapide de l’ADN

genomique conduit a sa precipitation, alors que l’ADN plasmidique demeure solubilise

dans le surnageant. Les proteines et l’ADN genomique precipites et les debris cellulaires

sont enleves par centrifugation, et le surnageant contenant l’ADN plasmidique est

applique sur une colonne contenant une resine de silice sur laquelle l’ADN s’adsorbe a

bas pH et a concentration saline elevee. Apres le passage sur la colonne de tampons de

lavage, l’ADN plasmidique purifie est elue a l’aide d’un tampon de pH eleve (8,5) dont

la concentration en sels est faible.

Pour chaque preparation, un controle est realise avec une souche de E. coli qui ne

porte aucun plasmide. Les plasmides obtenus et le controle sont analyses par electro-

phorese sur gel d’agarose (section 2.3.10).

2.3.5 Preparation d’ADN genomique

L’ADN genomique de E. coli a ete prepare selon une methode publiee [53] :

1. Centrifuger pendant 2 minutes a 10 000 × g, 1,5 ml d’une culture saturee afin de

culoter les cellules.

2. Resuspendre les cellules dans 570 µl de tampon TE 1 X.

3. Ajouter 3 µl de proteinase K 20 mg/ml et 30 µl de SDS 10 %. Melanger et incuber

une heure a 37 ◦C. Cette etape vise a solubiliser les parois des cellules et a degrader

les proteines.

4. Ajouter 100 µl de NaCl 5,0 M et melanger. Cet ajout empeche que les acides

nucleiques ne precipitent lors de l’ajout de CTAB a l’etape suivante ; a faible

concentration en sels, il y aurait formation de complexes CTAB • acides

nucleiques.


5. Ajouter 80 µl d’une solution de CTAB 10 % / NaCl 0,7 M. Melanger et incuber

10 minutes a 65 ◦C. Le CTAB forme un precipite avec les debris cellulaires, les

proteines denaturees et les polysaccharides.

6. Ajouter 1,0 volume de chloroforme / alcool isoamylique (49 : 1). Extraire la phase

superieure (phase aqueuse) contenant l’ADN.

7. Ajouter 1,0 volume de phenol / chloroforme / alcool isoamylique (25 : 24 : 1).

Extraire la phase superieure (aqueuse) contenant l’ADN.

8. Precipiter l’ADN en rajoutant 0,6 volume d’isopropanol. Il n’est pas necessaire de

rajouter un sel d’acetate pour precipiter l’ADN puisque la concentration saline

est deja elevee.

9. Centrifuger 5 minutes a 10 000 × g, puis laver le culot avec de l’ethanol 70 %

pour enlever les sels.

10. Resuspendre dans 100 µl de tampon TE 1 X.

2.3.6 Reaction en chaıne par la polymerase

La technique de PCR a ete utilisee lors de la construction du vecteur pTOF-

YB pour amplifier les regions chromosomiques flanquant le gene yadB (section 2.4.1).

Cette technique a aussi ete employee afin de demontrer l’integration de la cassette FLK2

dans le chromosome (section 2.5.4) et la deletion du gene yadB (section 2.6.3).

Les melanges reactionnels ont ete assembles tel qu’indique au tableau 2.7. Les

concentrations en MgSO4 et en DMSO ainsi que la temperature d’hybridation et le

temps d’elongation optimums ont ete determines experimentalement pour chaque paire

d’amorces utilisee. Ces conditions sont indiquees au tableau 2.8. Le protocole suivant

a ete utilise pour toutes les experiences de PCR [54] :

1. Les melanges reactionnels sont assembles dans des microtubes de 0,7 ml a parois

fines. L’enzyme est ajoutee apres tous les autres composants. Le contenu des tubes

est rapidement melange.

2. Environ 25 µl d’huile minerale est deposee a la surface du melange. Les tubes sont

centrifuges quelques secondes.

3. Les melanges reactionnels sont introduits dans un thermocycleur.

4. L’ADN est denature a 95 ◦C pendant 1 minute.

5. Le cycle denaturation / hybridation / elongation suivant est repete 30 fois :

(a) Denaturation de l’ADN a 95 ◦C pendant 30 secondes.


Tab. 2.7 – Composition des melanges reactionnels pour PCRTampon Venta 1 X

MgSO4 2-8 mM

DMSO 0-2,5 %

dATP 50 µM

dCTP 50 µM

dGTP 50 µM

dTTP 50 µM

Oligonucleotide 1 500 nM

Oligonucleotide 2 500 nM

ADN gabarit 1 ng

Polymerase Venta 1 U

pH 8,8

Volumeb 100 µla Provenant de New England BioLabs.

b Ajuste avec de l’eau NANOpure sterile.

(b) Hybridation des oligonucleotides au gabarit d’ADN pendant 30 secondes. La

temperature d’hybridation varie selon la paire d’oligonucleotides utilisee.

(c) Elongation des oligonucleotides a 76 ◦C. Le temps d’elongation varie selon la

longueur du gabarit d’ADN utilise.

6. Une etape d’elongation supplementaire de 7 minutes a 76 ◦C est realisee afin

d’obtenir seulement des produits PCR pleine longueur.

7. Le melange reactionnel est refroidi a 4 ◦C.

Un thermocycleur DNA Thermal Cycler de la compagnie Perkin Elmer a ete

employe pour toutes les experiences de PCR.

Les produits PCR obtenus ont ete purifies grace a la trousse commerciale QIAquick

PCR Purification Kit de la compagnie QIAGEN. Le protocole employe est celui propose

par QIAGEN [46]. Le melange reactionnel PCR est dilue 6 X dans une solution aqueuse

de propanol et de chlorure de guanidinium. Ce melange est depose sur une colonne

contenant une resine de silice sur laquelle l’ADN s’adsorbe a bas pH et a concentration

saline elevee. Apres le passage sur la colonne d’un tampon de lavage, le produit PCR

purifie est elue a l’aide d’un tampon de pH eleve (8,5) dont la concentration en sels

est faible.

Pour chaque experience PCR, une reaction controle a ete realisee ou l’enzyme n’a

pas ete ajoutee. Les produits des reactions PCR, incluant le controle, sont analyses par



Tab. 2.8 – Conditions pour les reactions PCRAmorces [MgSO4] [DMSO] Th.

a tel.b

mM % ◦C min

Ci - Co 4 0 50 1

Ni - No 4 0 50 1

No - Co 2 2,5 45 2

Next - F1 2 0 55 2

Cext - F2 4 1,0 60 2

Next - Cext 6 0 55 3a Temperature d’hybridation

b Temps d’elongation

Tab. 2.9 – Composition des melanges reactionnels pour la restriction de l’ADNTampon de restrictiona 1 X

BSA 100 µg/ml

ADN ∼ 1 µg

Enzyme de restriction 1 U/µg ADN

pH 7,9

Volumeb 25 µla Fourni par NEB. Le tampon varie selon l’enzyme employee.

b Ajuste avec de l’eau NANOpure sterile.

2.3.7 Digestion d’ADN par des endonucleases de restriction

Toutes les enzymes de restriction utilisees dans le cadre de ce projet (PstI, SalI,

NotI) proviennent de la compagnie New-England BioLabs. La composition des melanges

reactionnels est donnee au tableau 2.9. Tous les melanges reactionnels ont ete incubes

une heure a 37 ◦C, tel que recommande par le fournisseur.

Apres la digestion, l’ADN est isole par extraction au phenol et au chloroforme,

precipite a l’acetate de sodium et a l’ethanol (section 2.3.3), et resuspendu dans 20 µl

de tampon TE 1 X. Pour chaque experience, un controle sans enzyme a ete realise.

Les produits des reactions de digestion et de la reaction controle sont analyses par


2.3.8 Ligature de fragments d’ADN

Les fragments d’ADN obtenus par restriction ont ete ligatures a l’aide de la

ligase du phage T4. L’enzyme a ete obtenue aupres de la compagnie Invitrogen. La

composition des melanges reactionnels est donnee au tableau 2.10. La proportion des


Tab. 2.10 – Composition des melanges reactionnels pour la ligature de l’ADNTris • Cl 50 mM

MgCl2 10 mM

ATP 1 mM

DTT 1 mM

PEG-8000 5 %

ADN total 1,0 µg

ADN Ligase T4 1 U

pH 7,5

Volumea 20 µla Ajuste avec de l’eau NANOpure sterile.

Tab. 2.11 – Conditions pour les reactions de ligature de l’ADNF1a F2 `F1

b `F2 Site(s) Ratio −PO3−4

c

pb pb F1 : F2

’yadB-pncB’ ’dksA-yadB’ 448 368 NotI 1 : 1 Non

pTOF24∆aph ’dksA-yadB’-’yadB-pncB’ 5619 800 PstI SalI 1 : 3 Non

pTOF-YA FRT-lacZ -aph-FRT 6413 4578 NotI 1 : 2 Ouia F1 : fragment 1 ; F2 : fragment 2

b` : longueur du fragment

c−PO3−

4: dephosphorylation du fragment 1

deux fragments d’ADN ajoutes au milieu est variable et depend de la taille de chacun

des fragments. Ces proportions sont indiquees au tableau 2.11. Ce tableau indique

egalement quels fragments ont ete prealablement dephosphoryles (section 2.3.9). Tous

les melanges reactionnels de ligature ont ete incubes une heure a 25 ◦C. Ces conditions

correspondent a celles suggerees dans la litterature [55].

L’ADN resultant de la ligature des regions flanquant le gene yadB (section 2.4.1)

a ete isole par extraction au phenol et au chloroforme, precipite a l’acetate de sodium

et a l’ethanol, et resuspendu dans 20 µl de tampon TE 1 X. L’ADN circulaire produit

par les autres reactions de ligature a ete utilise directement pour transformer E. coli

XL1-Blue ou TOP10 (section 2.3.12). Pour chaque reaction de ligature, une reaction

controle sans ligase T4 a ete realisee. Les produits de toutes les reactions, incluant

les controles, ont ete analyses par electrophorese sur gel d’agarose (section 2.3.10).

Lorsque l’ADN a ete utilise directement pour transformer E. coli (section 2.3.12), le

produit de la reaction controle a ete utilise comme controle negatif lors de la reaction

de transformation.


Tab. 2.12 – Composition des melanges reactionnels pour la dephosphorylation de l’ADNNaCl 100 mM

Tris • Cl 50 mM

MgCl2 10 mM

DTT 1 mM

ADN ∼ 1 µg

CIP 0,5 U/µg ADN

pH 7,9

Volumea 20 µla Ajuste avec de l’eau NANOpure sterile.

2.3.9 Dephosphorylation de fragments d’ADN

Le vecteur recombinant dans lequel la cassette FLK2 a ete inseree a ete

dephosphoryle avant la ligature a l’aide de phosphatase alcaline de l’intestin de

veau (CIP) selon une procedure publiee [56]. L’enzyme provient de la compagnie

New-England BioLabs. La composition du melange reactionnel est indiquee au

tableau 2.12. Le melange reactionnel a ete incube une heure a 37 ◦C. L’ADN

dephosphoryle a ete isole par extraction au phenol et au chloroforme, precipite a

l’acetate de sodium et a l’ethanol (section 2.3.3), et resuspendu dans 20 µl de tampon

TE 1 X.

Un controle negatif sans CIP a ete realise. Les produits de la reaction et de

son controle ont tous les deux ete utilises dans une reaction de ligature de l’ADN

(section 2.3.8). Les deux melanges de ligature ont ensuite ete utilises pour transformer

E. coli (section 2.3.12).

La dephosphorylation n’a pas ete utilisee pour les deux autres reactions de ligature.

Dans le cas de la fusion des regions flanquant yadB, ce n’etait pas necessaire car l’ADN

lineaire obtenu a ensuite ete amplifie par PCR ; une tres faible quantite d’ADN ligature

etait donc suffisante, et le fragment d’interet amplifie a ete purifie sur gel d’agarose. Dans

le cas de l’insertion des regions flanquant yadB dans le vecteur pTOF24, la technique

du clonage positionnel a ete employee ; le vecteur ne pouvait donc pas se refermer sur

lui-meme.

2.3.10 Electrophorese sur gel d’agarose

La technique d’electrophorese sur gel d’agarose [44] a ete utilisee pour verifier

la presence de plasmides dans des souches de E. coli (section 2.3.4), pour analyser


les resultats des amplifications par PCR (section 2.3.6), pour confirmer la nature de

fragments de restriction (section 2.3.7) et pour purifier ces fragments, ainsi que pour

verifier le succes des reactions de ligature (section 2.3.8) et de dephosphorylation

(section 2.3.9).

Toutes les electrophoreses ont ete realisees avec des gels d’agarose 1,0 % prepares

dans le tampon TBE 1 X. Les echantillons (∼100 ng d’ADN) sont prepares dans un

volume total de 15 µl dans le tampon de charge pour gel d’agarose 1 X (section 2.1).

La migration se fait a 7 V/cm dans le tampon TBE 1 X, jusqu’a ce que le bleu de

bromophenol present dans le tampon de charge ait parcouru les deux tiers du gel de

8,5 cm (environ 30 minutes). Le gel est ensuite trempe dans une solution de bromure

d’ethidium 2,0 µg/ml et agite faiblement (50 rpm) pendant 10 minutes, puis rince a

l’eau froide pour eliminer l’exces de bromure d’ethidium.

L’ADN est ensuite visualise par exposition au rayonnement U.V. d’un transillu-

minateur, et le gel est photographie. Ces etapes ont ete realisees avec un appareil de

photodocumentation Chemi Genius2 Bio Imaging System, de la compagnie Syngene.

2.3.11 Purification d’ADN a partir de gels d’agarose

Certains fragment d’ADN resultant de reactions de digestion (section 2.3.7)

ou d’amplification PCR (section 2.3.6) ont ete purifies sur gel d’agarose apres leur

resolution par electrophorese et leur visualisation au bromure d’ethidium tel que decrit

ci-haut (section 2.3.10). Les bandes d’interet ont ete excisees a l’aide d’un scalpel,

puis la trousse commerciale QIAquick Gel Extraction Kit de QIAGEN a ete utilisee

pour recuperer l’ADN.

Le protocole suggere par QIAGEN a ete utilise [46]. On ajoute au morceau

d’agarose excise du gel un tampon contenant du thiocyanate de guanidinium (agent

denaturant). La solution contenant l’agarose est chauffee a 50 ◦C pour dissoudre l’aga-

rose et ainsi liberer l’ADN. L’ADN en solution est depose sur une colonne contenant

une resine de silice sur laquelle l’ADN s’adsorbe a bas pH et a concentration saline

elevee. Apres le passage sur la colonne d’un tampon de lavage, l’ADN purifie est elue a

l’aide d’un tampon de pH eleve (8,5) dont la concentration en sels est faible.


2.3.12 Transformation de cellules par de l’ADN plasmidique

Afin de pouvoir conserver et produire les plasmides recombinants pTOF-YA et

pTOF-YB crees dans le cadre de cette recherche (section 2.4), des cellules competentes

de E. coli (XL1-Blue ou TOP10) ont ete transformees avec ces plasmides (obtenus par

ligature de fragments d’ADN). pTOF-YB a par la suite ete utilise pour transformer

des cellules competentes de la souche TP8503, afin de remplacer, sur le chromosome

bacterien, le gene yadB par la cassette FLK2 (section 2.5). Des cellules competentes

de la souche POK1 ont ete transformees par pCP/20 afin d’obtenir une souche ∆yadB

(section 2.6).

Les cellules de E. coli XL1-Blue, TP8503 et POK1 ont ete traitees au DMSO pour

les rendre competentes, d’apres le protocole suivant [45] :

1. Ensemencer 50 ml de milieu SOB avec un inoculum provenant d’une culture

saturee (au moins 18 heures de croissance).

2. Incuber a 18 ◦C jusqu’a ce que la densite optique atteigne 0,6 (a une longueur

d’onde de 600 nm). Placer dans la glace pendant 10 minutes.

3. Prelever 20 ml de culture et centrifuger a 2 500 × g a 4 ◦C pendant 5 minutes.

4. Resuspendre dans 6,4 ml de tampon TB froid.

5. Placer dans la glace pendant 10 minutes.

6. Centrifuger a 2 500 × g a 4 ◦C pendant 5 minutes.

7. Resuspendre dans 1,6 ml de tampon TB froid contenant 7 % de DMSO.

8. Placer dans la glace pendant 10 minutes.

9. Aliquoter des portions de 100 µl dans des microtubes froids, et congeler aussitot

dans l’azote liquide.

10. Conserver a -80 ◦C. Utiliser a l’interieur d’un delais de 60 jours.

A cause du faible rendement de la reaction de ligature produisant pTOF-YB, il

n’a pas ete possible de transformer des cellules XL1-Blue traitees au DMSO par ce

plasmide. En lieu et place, des cellules hypercompetentes (1 • 109 cfu/µg ADN) E. coli

TOP10 fournies par Invitrogen ont ete utilisees. Toutes les transformations (XL1-Blue

par pTOF-YA, TOP10 par pTOF-YB, TP8503 par pTOF-YB, POK1 par pCP20) ont

ete realisees selon un protocole publie [45] modifie :

1. Degeler un microtube de cellules competentes a la temperature de la piece.


2. Ajouter au moins 1,0 ng d’ADN plasmidique dans un volume d’au moins 20 µl. S’il

s’agit du produit d’une reaction de ligature, diluer le melange reactionnel 5 X avec

de l’eau NANOpure sterile avant de l’ajouter aux cellules. Melanger delicatement

le tube.

3. Conserver sur la glace pendant 30 minutes.

4. Plonger dans un bain a 42 ◦C pendant 30 secondes. Ne pas agiter.

5. Plonger dans la glace pendant 5 minutes. Ne pas agiter.

6. Ajouter 0,8 ml de milieu SOC prechauffe a 30 ◦C (et non pas a 37 ◦C, afin de

permettre la replication des plasmides portant une origine de replication thermo-

sensible).

7. Incuber a 30 ◦C pendant une heure avec une agitation de 250 rpm.

8. Etaler des volumes de 10 µl et 100 µl sur les geloses selectives appropriees.

Au moins trois clones sont repiques en milieu liquide pour chaque transformation.

La presence du plasmide d’interet dans ces transformants est verifiee par preparation

de l’ADN plasmidique. Apres cette verification, des echantillons des transformants

selectionnes sont prepares et conserves a -80 ◦C tel que decrit precedemment

(section 2.2.3). Pour chaque experience de transformation, deux controles sont

realises : un controle negatif, auquel aucun ADN plasmidique n’est ajoute, et un

controle positif, realise en ajoutant aux cellules competentes 1,0 ng du plasmide

controle pUC19 (procure chez Invitrogen). 50 µl du controle negatif est etale sur une

gelose selective identique a celle utilisee pour la reaction de transformation. 50 µl du

controle positif est etale sur une gelose LB-Amp.

2.4 Construction du vecteur pTOF-YB

Cette section explique en details la construction du vecteur pTOF-YB ayant

servi au remplacement du gene yadB par la cassette FLK2 sur le chromosome de

E. coli TP8503. Cette construction a ete faite selon une methode publiee [48] se

deroulant en trois etapes illustrees a la figure 2.2 et detaillees dans les sous-sections

suivantes. Les regions flanquant le gene yadB sont d’abord amplifiees par PCR et

ligaturees (section 2.4.1). Ces regions sont ensuite inserees dans le vecteur pTOF24

(section 2.4.2). Enfin, la cassette FLK2 est excisee du vecteur pTOF30 et inseree

entre les portions aval et amont des regions flanquantes (section 2.4.3). Les plasmides,

amorces PCR et techniques utilises pour realiser cette construction ont ete decrits plus

tot (section 2.3).


Fig. 2.2 – Construction du vecteur pTOF-YB


2.4.1 Amplification des regions flanquant yadB

Le plasmide pET-dksA-yadB contient une courte region du chromosome de E.

coli K12, incluant les genes dksA (situe en amont de yadB) et yadB. Cette region

chromosomique comprend egalement la portion 5’ du gene pncB (situe en aval de

yadB). Dans la premiere etape de la construction de pTOF-YB (figure 2.2 a1), deux

sequences d’environ 400 paires de bases contenues dans cette region ont ete amplifees

independamment a partir de pET-dksA-yadB. La premiere de ces sequences (designee

N puisqu’elle contient la portion du gene yadB codant pour la partie N-terminale de

la GluQRS) comprend environ 300 paires de bases de l’extremite 3’ de dksA, la region

intergenique dksA-yadB et environ 100 paires de bases de l’extremite 5’ de yadB. Elle a

ete amplifiee a l’aide des amorces Ni et No. La deuxieme sequence (designee C ) contient

environ 180 paires de bases de l’extremite 3’ de yadB, la region intergenique yadB -pncB

et environ 160 paires de bases de l’extremite 5’ de pncB. Elle a ete amplifiee grace aux

amorces Ci et Co. Les extremites du gene yadB ont ete conservees afin de ne pas modifier

les eventuels signaux transcriptionnels qui peuvent etre presents dans ces regions.

Les amorces utilisees pour l’amplification de ces deux regions ont ete concues

pour inserer le site de restriction PstI a l’extremite 5’ de la sequence N (portion 5’ et

region en amont de yadB) et le site SalI a l’extremite 3’ de la sequence C (portion

3’ et region en aval de yadB). Les amorces ont egalement ete concues pour inserer des

sites de restriction NotI a l’extremite 3’-terminale de la sequence N et a l’extremite

5’-terminale de la sequence C.

Les sequences N et C ont ensuite ete digerees avec l’endonuclease de restriction

NotI puis ligaturees (figure 2.2 a2). Trois produits de ligature sont possibles : N-C,

N-N et C-C. Le melange de ces trois sequences a ete utilise comme gabarit dans une

seconde reaction PCR (figure 2.2 a3), ou les amorces No et Co ont ete utilisees. Les

trois fragments du melange ont ete amplifies, puis N-C a ete purifie par electrophorese

sur gel d’agarose.

2.4.2 Clonage des regions flanquantes dans pTOF24

Le vecteur pTOF24 (figure 2.1 a) a ete digere avec PstI et SalI pour en retirer

le fragment aph. pTOF24∆aph a ete purifie sur gel d’agarose, puis ligature avec les

regions flanquantes N-C (aussi digerees avec PstI et SalI) pour construire pTOF-YA

(figure 2.2 b).


pTOF-YA a ete utilise pour transformer E. coli XL1-Blue. Les transformants ont

ete selectionnes sur gelose LB-Chl. Le remplacement du fragment aph par le locus delete

et les regions flanquantes de yadB a ete confirme par la sensibilite des transformants a

la kanamycine.

2.4.3 Insertion de la cassette FLK2

La cassette FLK2 a ete excisee de pTOF30 (figure 2.1 b) par digestion avec

l’endonuclease NotI, puis purifiee sur gel d’agarose. pTOF-YA a aussi ete digere par

NotI, et dephosphoryle. La cassette et le vecteur ont ensuite ete ligatures (figure 2.2 c).

La cassette peut s’inserer soit dans la meme direction que yadB, soit dans la direction

opposee. L’objectif de la construction etant d’obtenir une region homologue au chro-

mosome ou le rapporteur lacZ est sous le controle des elements transcriptionnels de

yadB, il est necessaire que la cassette FLK2 soit inseree de telle facon que ses elements

genetiques soient dans le meme sens que ceux des regions flanquantes du gene yadB. La

construction ou la cassette est inseree dans le sens voulu est designee pTOF-YB.

La reaction de ligature contenant pTOF-YB et l’autre construction (ou la cassette

FLK2 est dans le sens non approprie) a ete utilisee pour transformer des cellules de E.

coli TOP10 hypercompetentes (le faible rendement de la reaction de ligature n’ayant

pas permis de transformer avec succes des cellules de E. coli XL1-Blue traitees au

DMSO pour les rendre competentes). Les transformants ont ete selectionnes sur gelose

LB-Chl-Kan. La resistance des transformants a la kanamycine confirme la presence de

la cassette FLK2 dans le vecteur.

Afin de selectionner un transformant ou la cassette FLK2 a ete inseree dans le

vecteur dans le sens desire, l’ADN plasmidique extrait de plusieurs transformants a

ete analyse par cartographie de restriction avec l’enzyme PstI : l’ADN plasmidique

est digere et les fragments resultant sont resolus par electrophorese sur gel d’agarose.

Tel qu’indique a la figure 2.3, la position des sites de restriction PstI sur le vecteur

pTOF-YB est telle que 3 fragments de 1235, 3717 et 6070 paires de bases resulteront

de la digestion. Par ailleurs, le patron de digestion du plasmide ou la cassette FLK2

est integree dans le sens non desire contiendra 3 bandes de 500, 1235 et 9287 paires de

bases.


(a) Cassette FLK2 inseree dans le sens oppose

aux regions flanquant yadB.

(b) Cassette FLK2 inseree dans le meme sens

que les regions flanquant yadB pour donner

pTOF-YB.

Fig. 2.3 – Selection de pTOF-YB par cartographie de restriction


2.5 Remplacement de yadB par la cassette FLK2

Le vecteur pTOF-YB, dont la construction a ete detaillee a la section precedente,

a ete utilise pour remplacer le gene yadB par la cassette FLK2 sur le chromosome de

E. coli. Ce remplacement a ete fait dans la souche TP8503, ou l’operon lac est delete.

L’absence de lacZ dans cette souche permet d’utiliser la copie de ce gene presente sur

la cassette FLK2 comme un indicateur de l’expression du gene remplace par la cassette,

en l’occurrence yadB. La souche resultante est designee POK1.

Le remplacement est fait de maniere a laisser les deux extremites du gene yadB

intactes (c’est pourquoi ces extremites ont ete amplifiees lors de la creaction de pTOF-

YB (section 2.4.1)). Ainsi, les eventuels elements transcriptionnels de yadB ne sont pas

modifies, et lacZ est sous le controle de ces elements. Le gene lacZ de la cassette FLK2

possede son propre site de liaison au ribosome, et n’est pas suivi d’un terminateur, ce qui

minimise l’influence de la cassette FLK2 sur la transcription des elements genetiques

en aval. La fin du gene yadB etant encore presente sur le chromosome, un eventuel

terminateur n’est pas delete lors de l’insertion de la cassette.

Le remplacement a ete fait en exploitant le phenomene de recombinaison homo-

logue medie par la recombinase RecA. La presence de regions homologues au chromo-

some sur le vecteur pTOF-YB a permis d’utiliser RecA pour integrer la casette FLK2

au chromosome par recombinaison.

Les trois etapes necessaires au remplacement sont detaillees dans les sous-sections

suivantes et illustrees a la figure figure 2.4. Le plasmide pTOF-YB est d’abord uti-

lise pour transformer E. coli TP8503 (section 2.5.1). Un premier phenomene de

recombinaison homologue conduit a l’integration du plasmide dans le chromosome

(section 2.5.2). Une seconde recombinaison excise le plasmide et le gene yadB, ne

laissant que la cassette FLK2 dans le chromosome ; le plasmide est immediatement

perdu (section 2.5.3). A chacune de ces etapes, les elements genetiques provenant de

pTOF-YB permettent la selection des cellules. L’integration de la cassette est finalement

confirmee par PCR (section 2.5.4).

2.5.1 Transformation de E. coli TP8503

Le vecteur pTOF-YB a ete utilise pour transformer la souche E. coli TP8503

(figure 2.4 a). Les transformants ont ete selectionnes sur gelose LB-Chl-Kan a 30 ◦C


Fig. 2.4 – Remplacement de yadB par la cassette FLK2


(afin de permettre la replication du plasmide, qui ne peut se faire a 37 ◦C a cause de

l’origine de replication thermosensible repAts).

2.5.2 Integration du plasmide au chromosome

Une culture de TP8503/pTOF-YB (incubee a 30 ◦C) a ete utilisee pour strier des

geloses LB-Chl-Kan. Ces dernieres ont ete incubees a 42 ◦C. La replication de pTOF-

YB etant impossible a 42 ◦C, les seules cellules a conserver les phenotypes CmR et KmR

sont celles ou le plasmide s’est integre au chromosome par recombinaison homologue

(figure 2.4 b). Les integrants produisent des colonies de taille normale, alors que

les autres cellules ne produisent que des micro-colonies. Un integrant a ete repique

en milieu liquide, puis strie a nouveau sur gelose, toujours en maintenant la pression

selective (temperature de 42 ◦C, antibiotiques chloramphenicol et kanamycine).

2.5.3 Excision et perte du plasmide

Un integrant a ete repique en milieu liquide LB et incube a 30 ◦C jusqu’a satu-

ration, ce qui retire toute pression selective et permet a un deuxieme phenomene de

recombinaison homologue d’avoir lieu (figure 2.4 c).

Des dilutions sequentielles de la culture ont ete etalees sur geloses LB-Suc-Kan,

lesquelles ont ete incubees a 42 ◦C. Le sucrose est toxique pour les cellules ou le plasmide

est encore integre au chromosome, a cause de la presence du gene de sensibilite sacB.

Seules les cellules ayant excise le plasmide de leur chromosome par recombinaison

peuvent survivre. La temperature elevee ne permet pas la replication de la forme excisee

du plasmide, et puisque sacB est present dans ce plasmide, celui-ci est toxique pour

les cellules. Par consequent, les seules colonies observables sont celles ou le plasmide a

ete excise du chromosome puis elimine de la cellule. L’antibiotique kanamycine assure

la selection de cellules ou la cassette FLK2 est encore presente. La sensibilite au

chloramphenicol a ete utilisee pour confirmer l’absence du plasmide.

2.5.4 Confirmation du remplacement par PCR

Un clone KmR CmS a ete selectionne. Afin de demontrer le remplacement du locus

yadB par la cassette FLK2, l’ADN genomique du clone a ete utilise comme gabarit dans


Fig. 2.5 – Confirmation du remplacement de yadB par PCR

deux reactions d’amplification par PCR tel qu’indique a la figure 2.5. La premiere

reaction utilise les amorces Next et F1. Next s’hybride a l’interieur du gene dksA, alors

que F1 s’hybride dans le gene lacZ present sur la cassette FLK2 ; la region amplifiee

comprend une partie du gene dksA et la portion N-terminale de la cassette FLK2. La

region ou s’hybride Next est situee en amont de la region ou s’hybride l’amorce No (qui

a ete utilisee pour amplifier la region en amont de yadB lors de la construction de

pTOF-YB). Next a ete concue ainsi pour qu’elle ne puisse pas s’hybrider a pTOF-YB

et l’amplifier. Ainsi, l’amplification par PCR ne peut avoir lieu que si la cassette est

presente dans le chromosome. La deuxieme reaction utilise les amorces Cext et F2, qui

s’hybrident respectivement a l’interieur de pncB (sur le chromosome) et de aph (sur

la cassette) pour amplifier la jonction C-terminale entre la cassette et le chromosome.

L’amorce Cext a ete concue pour s’hybrider en aval de la region ou s’hybride Co afin

qu’elle ne puisse pas amplifier l’ADN de pTOF-YB. Les fragments anticipes ont des

longueurs de 748 (portion N-terminale de FLK2) et de 1546 (portion C-terminale)

paires de bases. Des controles negatifs ont ete realises avec les meme amorces et l’ADN

genomique de TP8503. La souche obtenue par remplacement de yadB par la cassette

FLK2 dans TP8503 est designee E. coli POK1.

2.6 Deletion du gene yadB

La cassette FLK2 integree au chromosome dans la souche POK1 a ete excisee par

recombinaison homologue specifique pour ne laisser qu’une courte sequence de 93 paires

de bases qui ne change pas le cadre de lecture dans le chromosome. La souche ∆yadB

ainsi obtenue est nommee POK2.


Fig. 2.6 – Deletion de yadB par excision de la cassette FLK2

L’excision de la cassette est rendue possible grace a la presence de regions FRT aux

deux extremites de la cassette FLK2. Ces regions contiennent une sequence reconnue

specifiquement par la recombinase Flp de la levure. Cette enzyme catalyse la recom-

binaison homologue des regions FRT, ce qui conduit a l’excision de la cassette sous

forme d’ADN circulaire incapable de replication, tel que detaille dans les sous-sections

suivantes. La figure 2.6 illustre le processus.

2.6.1 Transformation de POK1 par pCP20

Le vecteur pCP20, qui exprime constitutivement la recombinase Flp de la levure

(gene flp), a ete utilise pour transformer E. coli POK1 (figure 2.6 a). Les transfor-


(a) Amplification du locus yadB dans E.

coli TP8503.

(b) Amplification de la region du locus

yadB delete dans E. coli POK2.

Fig. 2.7 – Confirmation de la deletion de yadB par PCR

mants ont ete selectionnes sur geloses LB-Amp-Chl-Kan a 30 ◦C (pCP20 contient les

genes bla et cat de resistance a l’ampicilline et au chloramphenicol, ainsi qu’une origine

de replication thermosensible).

2.6.2 Excision de la cassette FLK2 et perte de pCP20

Un transformant a ete strie sur une gelose LB incubee a 42 ◦C, ce qui assure la perte

du plasmide. Une dizaine de colonies ont ete repiquees sur des geloses LB, LB-Amp,

LB-Chl et LB-Kan incubees a 30 ◦C. Les clones provenant d’une cellule ou la cassette

FLK2 a ete excisee et ou pCP20 a ete perdu sont sensibles aux trois antibiotiques

(figure 2.6 b).

2.6.3 Confirmation de la deletion par PCR

La deletion du locus yadB dans la souche POK2 a ete confirmee par PCR. De

l’ADN genomique provenant de TP8503 et de POK2 a ete employe comme gabarit

dans deux reactions d’amplification utilisant les amorces No et Co. Tel qu’illustre a la

figure 2.7, le fragment PCR obtenu avec l’ADN de POK2 sera plus court (1012 paires

de bases) que celui obtenu avec l’ADN de TP8503 (1547 paires de bases), ce qui est du

a la deletion de yadB, dont il ne reste que les extremites. (Le fragment amplifie chez

POK2 contient aussi la courte cicatrice de 93 paires de bases laissee par la recombinaison

catalysee par la recombinase Flp).


2.7 Dosage enzymatique de l’activite β-galactosidase

La souche E. coli POK1, dont la construction a ete detaillee a la section 2.5, a

servi a l’etude de l’expression du gene yadB dans differentes conditions de croissance

et de stress. Ces conditions seront presentees en detail a la section 2.8. Les mesures

de l’expression ont ete rendues possibles grace au gene rapporteur lacZ.

L’expression de lacZ et, donc, de yadB, a ete determinee par dosage de l’activite

β-galactosidase en culture liquide, tel que decrit dans la litterature [43]. Des echantillons

de cultures ont ete preleves a des intervalles determines tel que decrit a la section 2.8.

Le protocole suivant a ete utilise pour determiner l’activite β-galactosidase des cultures

au moment de l’echantillonnage :

1. Prelever un echantillon de 1,6 ml de culture et le placer sur la glace afin de stopper

la croissance cellulaire.

2. Prelever 1,0 ml d’echantillon pour en determiner la densite cellulaire (densite

optique a 600 nm).

3. Prelever 0,5 ml d’echantillon, et ajouter a 0,5 ml de tampon Z 2 X (section 2.1)

froid dans un microtube de 1,5 ml. Le tampon Z ajuste le pH a 7,0 (l’activite

β-galactosidase etant mesuree a ce pH) et limite l’oxydation de l’enzyme grace au

2-mercaptoethanol.

4. Ajouter 2 gouttes de chloroforme et 1 goutte de SDS 0,1 % et vortexer vigoureu-

sement pendant 10 secondes. Le SDS et le chloroforme dissolvent partiellement les

membranes cellulaires, ce qui libere les enzymes des cellules. Les faibles concen-

trations de chloroforme et de SDS utilisees ne sont pas suffisantes pour denaturer

la β-galactosidase.

5. Centrifuger pendant 2 minutes a 10 000 × g. Les debris cellulaires et l’ADN sont

culotes, laissant les enzymes en solution.

6. Transferer 800 µl de la phase superieure (aqueuse) dans une eprouvette de verre

sterile.

7. Incuber 5 minutes a 28 ◦C.

8. Ajouter 200 µl de reactif ONPG (section 2.1). Agiter. Noter le moment de

l’ajout. L’ONPG est un analogue chromogenique du substrat naturel de la β-

galactosidase, le lactose. L’hydrolyse de l’ONGP libere une molecule d’o-nitro-

phenol, qui absorbe la lumiere de facon importante a 420 nm.

9. Lorsqu’une coloration jaune s’est developpee, mesurer l’absorbance a 420 nm et

noter le moment de cette mesure.


Le niveau d’activite β-galactosidase est calcule d’apres la formule suivante :

1000 × D.O.λ=420

t × v × D.O.λ=600

= Activite β-galactosidase

Ou t est le temps en minutes et v le volume de culture utilise pour le dosage. L’activite

ainsi calculee est exprimee en unites Miller.

Ce niveau d’expression est directement comparable a celui d’un autre echantillon

et d’une autre culture, puisqu’il est exprime independamment du temps de reaction

et de la densite cellulaire de la culture. Une activite d’environ 1 Miller correspond a

l’expression constitutive de lacZ dans l’operon lac dans une culture non induite. Une

activite d’environ 1 000 Miller correspond a l’expression de lacZ dans une culture ou

l’operon lac est induit au maximum.

Les mesures de densites cellulaires ont ete realisees avec un spectrophotometre

GeneQuant Pro (Biochrom). Les mesures d’absorbance de l’o-nitrophenol ont ete

realisees avec un spectrophotometre Ultrospec III (Pharmacia). Dans les deux cas, des

cuvettes de plastique jetables BioRad ont ete utilisees.

2.8 Conditions d’expression et effets de la deletion

du gene yadB

La souche POK1, construite par remplacement de yadB par la cassette FLK2

(section 2.5), a ete utilisee pour etudier l’expression du gene yadB dans diverses

conditions de croissance et de stress. Des differences phenotypiques dues a la deletion

de yadB ont egalement ete recherchees, par comparaison des cellules POK1 et TP8503.

Si des variations de phenotypes avaient ete observees, la souche POK2, ou yadB a

ete delete (section 2.6), aurait servi a confirmer ces differences. (L’absence de cas-

sette FLK2 dans POK2 permet d’exclure la possibilite qu’une difference phenotypique

observee entre POK1 et TP8503 soit due a la presence de la cassette.)

La technique utilisee pour la mesure du niveau d’expression de yadB a deja ete

decrite (section 2.7). Les conditions etudiees sont les suivantes : croissance en condi-

tions optimales (milieu riche, 37 ◦C) ou en milieu minimal (a 37 ◦C), croissance a des

temperatures non optimales (32 ◦C et 42 ◦C, en milieu riche) et croissance interrompue

par un choc thermique, un choc osmotique, un choc de pH ou un choc oxydatif. Les

procedures detaillees pour chacune de ces etudes sont presentees dans les sous-sections

suivantes.


Dans tous les cas, 50 ml de milieu a ete inocule avec 10 µl d’une preculture

saturee realisee dans des conditions identiques a celles qui seront employees pour la

culture. Les experiences sont toujours realisees avec les souches POK1 et TP8503 (cette

derniere servant de controle negatif pour le dosage de lacZ et de repere pour detecter

les variations de phenotypes dues a la deletion de yadB). Toutes les experiences ont

ete realisees en triplicata, a l’exception de celles impliquant le choc de pH et le choc

oxydatif, qui n’ont ete realisees qu’une seule fois.

En plus de ces experiences, la thermosensibilite de la souche TP8503 et celle de

la souche POK2 ont ete comparees en incubant des geloses LB striees par ces souches

a des temperatures de 4 ◦C, 22 ◦C, 30 ◦C, 37 ◦C, 42 ◦C, 48 ◦C et 56 ◦C.

2.8.1 Croissance en conditions optimales

Les cultures sont realisees en milieu LB, soumises a une agitation de 250 rpm et

incubees a 37 ◦C tel que detaille precedemment (section 2.2.1). A chaque heure, la

densite optique des cultures est mesuree, et l’activite β-galactosidase est dosee pour

determiner le niveau d’expression de yadB. Les mesures sont interrompues lorsque les

cultures atteignent la saturation. Une mesure supplementaire est realisee apres 24 heures

de croissance.

2.8.2 Croissance en milieu minimal

Les cultures sont realisees en milieu M9 et incubees a 37 ◦C. A chaque heure, la


determiner le niveau d’expression de yadB. Les mesures sont interrompues lorsque les

cultures atteignent la saturation. Une mesure supplementaire est realisee apres 24 heures

de croissance.

2.8.3 Croissance a des temperatures non optimales

Les cultures sont realisees en milieu LB et incubees a 42 ◦C ou a 32 ◦C. A chaque

heure, la densite optique des cultures est mesuree, et l’activite β-galactosidase est

dosee pour determiner le niveau d’expression de yadB. Les mesures sont interrompues


lorsque les cultures atteignent la saturation. Une mesure supplementaire est realisee

apres 24 heures de croissance.

2.8.4 Choc thermique

Les cultures sont realisees en milieu LB et incubees a 37 ◦C. A chaque heure, la


determiner le niveau d’expression de yadB. Lorsque la densite optique atteint 1,0, la

culture est refroidie dans un bain d’eau glacee pendant une heure, puis sa temperature

est amenee a 42 ◦C par immersion dans un bain d’eau (a 42 ◦C) pendant deux minutes.

La culture est ensuite a nouveau incubee a 37 ◦C. La densite optique et l’activite β-

galactosidase sont mesurees immediatement apres le choc thermique, puis a intervalles

de 15 minutes pendant une heure. Par la suite, la densite cellulaire et l’activite β-

galactosidase sont mesurees a toutes les heures. Les mesures sont interrompues lorsque

les cultures atteignent la saturation. Une mesure supplementaire est realisee apres

24 heures de croissance.

2.8.5 Choc osmotique

Les cultures sont realisees en milieu LB et incubees a 37 ◦C. Lorsque la densite

optique atteint 1,0, les cellules sont culotees par centrifugation a 2 500 × g pendant 15

minutes, puis resuspendues dans 50 ml de sucrose 20 %. Apres 10 minutes d’incubation,

les cellules sont a nouveau culotees, puis resuspendues dans 50 ml d’eau distillee. Apres

10 minutes d’incubation, les cellules sont finalement culotees et resuspendues dans

50 ml de milieu LB. La densite optique et l’activite β-galactosidase sont mesurees

immediatement apres le choc osmotique, puis a intervalles de 15 minutes pendant une

heure. L’experience est alors terminee.

2.8.6 Choc de pH

Contrairement aux autres experiences ou deux cultures sont realisees (une pour

la souche POK1, une autre pour TP8503), l’etude de l’effet du choc de pH requiert 5

paires de cultures de E. coli POK1 et TP8503. (Une de ces paires sert de controles.)

Les cultures sont realisees en milieu LB et incubees a 37 ◦C. Lorsque la densite optique

atteint 1,0, le pH des cultures est ajuste a 5, 6, 8 ou 9. Une culture de POK1 et une autre


de TP8503 sont ajustees a chacune de ces valeurs de pH. (Le pH des cultures controles

est d’environ 7 et n’est pas ajuste.) La densite optique et l’activite β-galactosidase sont

mesurees immediatement apres le choc de pH, puis a intervalles de 15 minutes pendant

une heure. L’experience est alors terminee. Pour toutes les valeurs de pH utilisees, le pH

du milieu reactionnel (tampon Z) utilise pour mesurer l’expression de yadB a ete verifie

pour s’assurer qu’il n’ait pas ete modifie substantiellement par le pH de la culture.

2.8.7 Choc oxydatif

Contrairement aux autres experiences ou deux cultures sont realisees (une pour

la souche POK1, une autre pour TP8503), l’etude de l’effet du choc oxydatif requiert

6 paires de cultures de E. coli POK1 et TP8503. (Une de ces paires sert de controles.)

Les cultures sont realisees en milieu LB et incubees a 37 ◦C. Lorsque la densite optique

atteint 1,0, la concentration en H2O2 est ajustee a 2,5 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, ou

40 mM. Une culture de POK1 et une autre de TP8503 sont ajustees a chacune de ces

concentrations. (Les cultures controles ne contiennent pas de H2O2.) La densite optique

et l’activite β-galactosidase sont mesurees immediatement apres le choc oxydatif, puis

a intervalles de 15 minutes pendant une heure. L’experience est alors terminee.

Chapitre 3

Resultats

3.1 Construction de la souche POK1

La construction de la souche POK1 a ete confirmee par PCR tel que decrit plus

tot (section 2.5.4). La figure 3.1 a illustre cette confirmation ; les puits 2 et 3

montrent l’amplification des jonctions 5’ et 3’ (respectivement) de la cassette FLK2

et du chromosome, alors que les puits 4 et 5 montrent une absence d’amplification dans

la souche TP8503. Les tailles attendues (respectivement 748 et 1546 paires de bases)

correspondent a ce qui est observe.

L’obtention d’une souche POK1 viable aussi bien en milieu riche qu’en milieu

minimal demontre que yadB est un gene non-essentiel chez E. coli.

3.2 Construction de la souche POK2

La souche POK2 a ete construite, et la deletion du gene yadB dans cette souche

a ete confirmee tel que decrit precedemment (section 2.6.3). Comme l’illustre la

figure 3.1 b, la region amplifiee sur le chromosome de POK2 (puit 2) est sensiblement

plus courte que la region correspondante dans la souche TP8503 (puit 3), indiquant

la deletion du locus d’interet. Les tailles observees correspondent a celles prevues, soit

1012 et 1547 paires de bases pour POK2 et TP8503 respectivement.

Chapitre 3. Resultats 53

(a) POK1 : Amplification des

jonctions 5’ et 3’ entre la cassette

FLK2 et le chromosome. Puit 1 :

Echelle moleculaire d’ADN 1 Kb.

Puit 2 : Jonction 5’ amplifiee

chez POK1. Puit 3 : Jonction

3’ amplifiee chez POK1. Puit

4 : Absence d’amplification pour

la jonction 5’ dans la souche

controle TP8503. Puit 5 : Absence

d’amplification pour la jonction 3’

dans la souche TP8503.

(b) POK2 : Amplification du

locus du gene yadB et de ses

regions flanquantes. Puit 1 :

Echelle moleculaire d’ADN 1 Kb.

Puit 2 : Amplification dans la

souche TP8503, ou le gene yadB

est intact. Puit 3 : Amplification

dans POK2 ; le fragment obtenu

est sensiblement plus court, indi-

quant la deletion du gene.

Fig. 3.1 – Confirmation de la contruction des souches POK1 et POK2 par PCR


Le fait que la souche POK2 soit viable, aussi bien en milieu riche qu’en milieu

minimal, confirme que yadB n’est pas un gene essentiel a la croissance de E. coli.

3.3 Thermosensibilite de la souche POK2

La thermosensibilite de la souche ∆yadB POK2 a ete comparee a celle de la souche

TP8503 selon le protocole decrit precedemment (section 2.8). Aucune difference n’a

pu etre reperee entre les deux souches. La croissance est observee a 4 ◦C, 22 ◦C, 30 ◦C,

37 ◦C, 42 ◦C et 48 ◦C pour les deux souches, autant en milieu LB qu’en milieu minimal.

L’absence de yadB n’a donc pas d’effet sur la croissance de E. coli a des temperatures

non permissives.

3.4 Expression et effets de la deletion de yadB

L’expression de yadB et la vitesse de la croissance des cellules ou yadB a ete

inactive par remplacement ont ete etudiees tel que decrit au chapitre precedent

(section 2.8).

3.4.1 Croissance en conditions optimales

Comme l’indique la figure 3.2, aucune difference phenotypique n’est apparente

au niveau de la croissance entre les souches TP8503 et POK1.

On remarque egalement que l’expression de yadB augmente significativement

lorsque la progression de la densite cellulaire cesse d’etre exponentielle (ce qui cor-

respond a la fin de la linearite de la courbe sur la figure, l’echelle etant logarithmique).

Cette augmentation a lieu lors de la transition de la phase exponentielle a la phase

stationnaire, et est maximale environ 4 heures apres le debut de la phase stationnaire.

Des experiences de PCR [32] ont demontre que l’ARNm de yadB est present dans la

cellule au debut de la phase exponentielle de croissance ; les resultats de la presente

experience indiquent toutefois que cette transcription du gene en ARN ne se fait qu’a

un niveau tres faible (indetectable avec la methode utilisee ici). L’expression observee

pendant la phase stationnaire, bien que plus importante, est tout de meme relativement


Fig. 3.2 – Expression de yadB dans des conditions de croissance optimales. Les souches

POK1, contenant le rapporteur lacZ, et TP8503, la souche sauvage controle, ont ete

cultivees pendant 24 heures. La densite optique a 600 nm et le niveau d’expression de

lacZ ont ete mesures tel que decrit precedemment (section 2.7). Les conditions de

croissance sont detaillees a la section 2.8.1.

faible (de l’ordre du Miller, ce qui correspond a l’expression constitutive de lacZ dans

l’operon lac dans une culture non induite).

3.4.2 Croissance en milieu minimal

Le patron d’expression de yadB est le meme en milieu minimal que lors de la

croissance en milieu riche. Ces resultats sont presentes a la figure 3.3 ; on remarque

que l’expression de yadB n’est mesurable qu’a partir de la periode de transition entre

la phase exponentielle de croissance et la phase stationnaire. Cette expression est moins

elevee que celle observee en conditions optimales. Il n’y a pas de difference appreciable

entre les vitesses de croissance des souches POK1 et TP8503.

3.4.3 Croissance a des temperatures non optimales

La figure 3.4 montre que le patron d’expression du gene yadB a des temperatures

de 32 ◦C ou 42 ◦C est identique a ce qui a ete observe dans les autres conditions :


Fig. 3.3 – Expression de yadB en milieu minimal. Les souches POK1, contenant le

rapporteur lacZ, et TP8503, la souche sauvage controle, ont ete cultivees pendant 24

heures. La densite optique a 600 nm et le niveau d’expression de lacZ ont ete mesures

tel que decrit precedemment (section 2.7). Les conditions de croissance sont detaillees

a la section 2.8.2.

l’expression est indetectable pendant les phases latente et exponentielle de croissance,

mais augmente lors de l’entree dans la phase stationnaire. Il ne semble pas non plus

y avoir de difference entre les capacites des souches POK1 et TP8503 de croıtre a ces

temperatures.

3.4.4 Choc thermique

La figure figure 3.5 montre que le choc thermique n’induit pas l’expression de

yadB. Aucune expression n’est detectee dans l’heure suivant ce choc. L’expression n’est

observable que pendant la phase stationnaire de croissance. On ne remarque pas non

plus de difference entre la croissance de TP8503 et celle de POK1 apres le choc. Dans

les deux cas, le rythme de croissance est ralenti de facon similaire.


(a) Croissance a 42 ◦C

(b) Croissance a 32 ◦C

Fig. 3.4 – Expression de yadB a des temperatures non optimales. Les souches POK1,

contenant le rapporteur lacZ, et TP8503, la souche sauvage controle, ont ete cultivees

pendant 24 heures. La densite optique a 600 nm et le niveau d’expression de lacZ ont

ete mesures tel que decrit precedemment (section 2.7). Les conditions de croissance

sont detaillees a la section 2.8.3.


Fig. 3.5 – Effet du choc thermique sur l’expression de yadB. La fleche indique la duree

du choc thermique. Les souches POK1, contenant le rapporteur lacZ, et TP8503, la

souche sauvage controle, ont ete cultivees pendant 24 heures. La densite optique a

600 nm et le niveau d’expression de lacZ ont ete mesures tel que decrit precedemment

(section 2.7). Les conditions de croissance sont detaillees a la section 2.8.4.

3.4.5 Choc osmotique

Comme indique a la figure 3.6, le choc osmotique n’induit pas non plus l’expres-

sion de yadB, qui reste indetectable une heure apres le choc osmotique. (Le temps zero

correspond a la fin de l’application du choc osmotique.) Apres que le choc osmotique ait

ete applique, la croissance ralentit considerablement, mais de facon similaire pour les

deux souches. Tel que decrit precedemment (section 2.8.5), des cultures dont la densite

optique est de 1,0 sont utilisees pour appliquer le choc osmotique. Or, la densite optique

immediatement apres le choc osmotique est d’environ 0,45 (pour les deux souches)

meme si le volume des culture reste inchange. Cette diminution considerable de la

densite optique est essentiellement due aux changements morphologiques causes par le

choc osmotique : perte des proteines du periplasme et augmentation de la viscosite des

cellules (ce qui empeche de les culoter efficacement).


Fig. 3.6 – Effet du choc osmotique sur l’expression de yadB. Les souches POK1,

contenant le rapporteur lacZ, et TP8503, la souche sauvage controle, ont ete cultivees

pendant une heure apres le choc osmotique. La densite optique a 600 nm et le niveau

d’expression de lacZ ont ete mesures tel que decrit precedemment (section 2.7). Les

conditions de croissance sont detaillees a la section 2.8.5.

3.4.6 Choc de pH

La figure 3.7 montre que des chocs de pH n’ont aucun effet mesurable sur

l’expression de yadB. Aucune difference notable n’est observee entre la croissance de la

souche POK1 et celle de la souche controle TP8503, et ce a tous les pH investigues.

Le pH du milieu de culture (LB) est d’environ 7,0 lorsque la densite optique atteint

1,0. Aucun ajustement de pH n’est necessaire pour les cultures incubees a pH 7,0. Le

pH d’une culture saturee est d’environ 8,8.

3.4.7 Choc oxydatif

Comme l’indique la figure 3.8, l’application d’un choc oxydatif a des cellules de

E. coli n’induit pas l’expression du gene yadB. L’absence du gene dans la souche POK1

ne semble pas non plus augmenter la sensibilite des cellules ; la croissance est inhibee a

des niveaux similaires pour les deux souches a chacune des concentrations testees.


(a) Souche POK1

(b) Controle - Souche TP8503

Fig. 3.7 – Effet du choc de pH sur l’expression de yadB. Les souches POK1, contenant

le rapporteur lacZ, et TP8503, la souche sauvage controle, ont ete cultivees pendant

une heure apres le choc de pH. La densite optique a 600 nm et le niveau d’expression

de lacZ ont ete mesures tel que decrit precedemment (section 2.7). Les conditions de



(a) Souche POK1

(b) Controle - Souche TP8503

Fig. 3.8 – Effet du choc oxydatif sur l’expression de yadB. Les souches POK1, contenant

le rapporteur lacZ, et TP8503, la souche sauvage controle, ont ete cultivees pendant

une heure apres le choc oxydatif. La densite optique a 600 nm et le niveau d’expression

de lacZ ont ete mesures tel que decrit precedemment (section 2.7). Les conditions de


Chapitre 4

Discussion

4.1 Expression de yadB pendant le cycle cellulaire

La presente etude demontre que yadB est exprime au moins pendant la phase

stationnaire de croissance. Des experiences de PCR [32] ont permis d’amplifier l’ARNm

de yadB a partir de cellules recoltees en phase exponentielle, ce qui indique que yadB

est egalement faiblement exprime pendant cette phase de croissance. Toutefois, les

valeurs mesurees dans les presentes experiences pendant la phase exponentielle sont

indistinguables du bruit de fond observe avec la souche controle ∆lac TP8503. L’ex-

pression detectee par PCR pourrait donc correspondre a l’expression basale du gene

yadB reprime.

L’expression plus elevee de yadB pendant la phase stationnaire de croissance

procure un indice sur le role physiologique de la GluQRS. De nombreux changements

environnementaux sont associes a cette phase de croissance, par exemple : depletion des

nutriments du milieu, changements de pH, choc oxydatif. Le phenomene de passage a

l’etat stationnaire est complexe, et yadB pourrait etre impliquee soit dans la reponse a

un stress environnemental particulier, soit dans le mecanisme global de regulation des

genes pendant la phase stationnaire. Notre incapacite a induire l’expression de yadB

en soumettant les cellules a des stress similaires a ceux qui accompagnent la phase

stationnaire suggere un role global. Notons par ailleurs que nos resultats montrent

que yadB n’est pas implique dans la reponse au choc thermique ou dans la vitesse de

croissance des cellules a des temperatures non optimales.

L’expression de yadB demeure faible, meme dans les conditions ou le gene est

exprime le plus fortement. Ce niveau d’expression (entre 500 et 1000 mMiller lorsque

Chapitre 4. Discussion 63

mesure avec le rapporteur β-galactosidase) est environ 500 fois plus faible que ce qui

a ete mesure (par la meme technique) pour le gene yacK (aussi designe cueO) dont

le produit d’expression est implique dans le metabolisme du cuivre [48]. L’expression

du gene yacK est induite par l’accumulation de cuivre dans le milieu. Son niveau

d’expression faible suggere que yadB pourrait etre implique dans le metabolisme basal

de la cellule plutot que dans la reponse a un stress particulier.

Les changements morphologiques (par exemple la diminution de la taille des

cellules) qui ont lieu lors de l’entree dans la phase stationnaire peuvent influencer le

rapport entre le nombre de copies du rapporteur et la densite cellulaire mesures, ce qui

limite la fiabilite de la technique employee ici. Toutefois, le rapport entre les valeurs

mesurees en phase stationnaire et le bruit de fond permet d’affirmer qu’il existe une

augmentation d’un facteur d’au moins 10 lors de l’entree dans la phase stationnaire, ce

qui ne peut etre entierement explique par des changements morphologiques.

L’expression sensiblement plus faible de yadB en milieu minimal (environ

300 mMiller) qu’en milieu riche (environ 500 mMiller) souligne le caractere non

essentiel du gene pour E. coli. Un grand nombre de genes qui ne sont pas necessaires au

metabolisme de base de la cellule sont sensiblement moins exprimes dans des conditions

ou la disponibilite des nutriments est moindre.

4.2 Cotranscription de dksA et de yadB

Bien que l’objectif de cette etude ait ete de doser le niveau d’expression du gene

yadB, l’absence de promoteur canonique immediatement en amont de ce gene suggere

que c’est plutot l’expression de l’operon dksA-yadB qui a ete mesuree. Toutefois, les

resultats obtenus different de ceux d’une autre equipe qui a determine le nombre de

copies de DksA pendant l’ensemble du cycle cellulaire et qui rapporte que ce niveau est

stable [41]. Nos resultats montrent que l’expression de yadB n’est pas constante, mais

augmente significativement pendant la phase stationnaire de croissance.

Cette disparite entre les resultats pourrait etre expliquee par la presence d’un

element de regulation situe entre les genes dksA et yadB. La transcription de dksA

pourrait alors se faire a un niveau constant, mais la propagation de l’onde transcrip-

tionnelle dans le gene yadB pourrait etre regulee en fonction de la phase de croissance.

Des experiences supplementaires seront necessaires pour verifier cette hypothese.


4.3 Role du Glu-Q-ARNtAsp

Bien que le role de l’aminoacyl-ARNt synthetise par la GluQRS soit encore in-

connu, la position de la base hypermodifiee queuosine chargee par la GluQRS sur

l’ARNtAsp laisse croire que cette modification de l’ARN pourrait avoir une influence sur

la traduction de l’information genetique. La queuosine etant situee a la premiere position

de l’anticodon, une modification de sa structure est susceptible d’affecter l’appariement

entre codon et anticodon sur le ribosome. L’importance des bases hypermodifiees a la

premiere position de l’anticodon pour l’appariement codon / anticodon sur le ribosome

a deja ete demontree pour d’autres ARNt [57].

Il n’existe qu’un seul type de gene d’ARNtAsp chez la plupart des bacteries (bien

que plusieurs copies de ce gene soient frequemment presentes dans les genomes). Le

decodage des deux codons aspartate (GAU et GAC) se fait donc par correspondance

avec un seul ARNt, ce qui implique un flottement (« wobble ») au niveau du troisieme

nucleotide des codons aspartate lors de l’appariement a l’ARNt sur le ribosome. La

presence de la queuosine a cette position rend ce flottement possible.

On sait que la queuosine est glutamylee in vivo dans l’ARNtAsp [33] et, donc,

que cette glutamylation n’empeche pas le decodage des codons aspartate. L’obtention

d’une souche ∆yadB viable demontre par ailleurs que la glutamylation n’est pas requise

pour la lecture des codons aspartate. Toutefois, il n’est pas exclu que la lecture d’un

ou des deux codons puisse etre influencee par la glutamylation de la queuosine, par

stabilisation ou destabilisation des interactions codon / anti-codon. Un tel phenomene

aurait un impact certain sur la traduction de l’ARNm par le ribosome. Considerant la

courte demi-vie du Glu-Q-ARNtAsp, la glutamylation de la queuosine pourrait participer

a la regulation post-transcriptionnelle de l’expression des genes.

Il a deja ete demontre que l’occurrence des codons correspondant a des ARNt

isoaccepteurs dont les concentrations physiologiques sont faibles est inferieure a la

moyenne dans les genes fortement exprimes [58]. Un mecanisme similaire pourrait

exister ou une categorie de genes presenterait une densite elevee en un certain codon

aspartate dont la lecture serait soit facilitee, soit rendue plus difficile par la gluta-

mylation de la queuosine de l’ARNtAsp. Des observations preliminaires indiquent a

ce sujet que plusieurs genes bacteriens dont l’expression est liee a la virulence et au

phenomene d’infection contiennent un nombre eleve de codons GAU ainsi qu’un ratio

eleve de codons GAU par rapport aux codons GAC. Ces genes incluent rns, qui, chez

E. coli, regule la production de CS1 et CS2 (respectivement une toxine et une structure


favorisant l’adherence aux cellules hotes) [59] et virF qui, chez S. flexneri, joue un role

central dans la regulation de l’expression des genes de virulence lors de l’infection [60].

L’implication de yadB dans la regulation post-transcriptionnelle pourrait ega-

lement expliquer certaines observations qui suggeraient que dksA jouait un role de

regulateur post-transcriptionnel, alors que l’elucidation de sa structure et de son role

physiologique rendent cette hypothese peu plausible [41]. Les informations suggerant

un role de regulateur post-transcriptionnel pour dksA ont ete obtenues a l’aide d’une

souche bacterienne ou dksA a ete delete [37]. Or, il est possible que cette deletion ait

egalement affecte yadB, situe immediatement en aval et faisant partie du meme operon.

4.4 Lien entre les concentrations de glutamate et le

role de la GluQRS

Tel que mentionne plus tot (section 1.4.4), le ppGpp est utilise par les bacteries

comme un senseur indirect du manque de nutriments (la synthese du ppGpp etant

induite par de faibles niveaux d’aminoacylation de l’ARNt). DksA reagit a l’accumula-

tion de ce metabolite en regulant la transcription des genes des ARN stables (ARNt et

ARNr).

De facon analogue, la GluQRS pourrait hypothetiquement etre influencee par

le niveau de glutamate libre. Des concentrations extracellulaires de glutamate elevees

favorisent la reponse au choc osmotique et aux bas pH chez E. coli et d’autres bacteries

enteriques, ces phenomenes etant directement relies aux conditions environnementales

auxquelles sont confrontees ces bacteries lors de l’infection de l’intestin [61]. La

GluQRS pourrait servir d’effecteur des fluctuations de la concentration de glutamate

en reagissant aux concentrations elevees par la glutamylation d’une plus grande

proportion d’ARNtAsp.

4.5 Phenotypes des cellules ∆yadB

L’hypothese presentee ci-haut (sections 4.3 et 4.4) concorde avec nos resultats

selon lesquels l’expression de yadB augmente lors du passage a la phase stationnaire

de croissance. En effet, le glutamate est une composante essentielle des mecanismes de

resistance aux conditions acides, et ces mecanismes sont particulierement actifs pen-


dant la phase stationnaire [61]. Toutefois, notre incapacite a identifier un ou plusieurs

phenotypes associes a la deletion de yadB limite la confiance que l’on peut accorder a

cette hypothese. Si yadB procede bien a la regulation post-transcriptionnelle de genes

associes a la reponse a certaines conditions environnementales associees au stress ou a

l’infection d’un hote, il devrait etre possible de mesurer une decroissance de la viabilite

des cellules mutees dans ces conditions.

Cette absence de resultats s’explique peut-etre par la methodologie employee pour

mesurer les differences phenotypiques. Des cultures ont ete realisees sur une echelle d’une

journee ; les cellules restent donc en phase stationnaire pendant moins de 24 heures. De

plus, seule la vitesse de croissance des cellules a ete mesuree, puisque l’objectif vise etait

la caracterisation du patron d’expression du gene yadB.

Afin de determiner les effets physiologiques de l’absence de yadB, des experiences

supplementaires seront necessaires. Celles-ci devront mesurer la viabilite des cellules

en phase stationnaire dans des conditions variees. Ces mesures devraient se faire sur

une periode de plusieurs jours, et etre realisees par comptage des cellules viables par

dilutions sequentielles et etalement sur geloses. Aussi, des observations microscopiques

devraient etre effectuees sur des cellules mutantes a divers stades du cycle cellulaire.

4.6 Analyse de la technique de remplacement

employee

4.6.1 Avantages

La methode de remplacement utilisee dans cette etude presente de nombreux

avantages par rapport aux autres techniques qui auraient pu etre employees pour obtenir

des informations similaires. D’abord, sa simplicite permet de la mettre en œuvre sans

avoir recours a des equipements sophistiques ou couteux. Elle est aussi tres fiable,

puisque son deroulement peut etre suivi a chaque etape grace a des phenotypes varies

(resistance a differents antibiotiques ou au sucrose, thermosensibilite). De plus, le test

enzymatique permettant de doser l’expression genique est facilement echelonnable : il

peut aisement etre automatise, et une variete d’analogues du lactose sont disponibles,

incluant des composes dont les produits d’hydrolyse sont fluorescents, ce qui permet la

mise au point de tests extremement sensibles.


Ces caracteristiques font de cette methode un outil interessant pour des etudes a

grande echelle de genes dont la fonction est inconnue. Une banque de mutants de E. coli

construits par le remplacement systematique des genes dont la fonction est inconnue

est d’ailleurs deja en cours [M. Masters, communication personnelle].

4.6.2 Inconvenients

La presente etude souligne une des faiblesses de la methode de remplacement uti-

lisee. La faible expression de yadB, couplee a l’utilisation de l’analogue chromogenique

peu sensible ONPG, n’a permis d’obtenir qu’une difference d’un facteur 10 entre le

bruit de fond et les valeurs d’expression les plus elevees. L’utilite de la methode est

donc discutable pour la caracterisation du patron d’expression de genes faiblement

exprimes, a moins d’avoir recours a des analogues plus sensibles.

Soulignons egalement que le dosage enzymatique de l’activite β-galactosidase

ne fournit aucune information sur le nombre de copies du produit du gene remplace

dans la cellule a un moment donne ; seul le niveau d’expression est mesure, ce qui ne

permet pas de juger de la demi-vie de la proteine. De plus, les valeurs d’expression

mesurees peuvent etre faussees par les changements metaboliques causes par le rem-

placement. Par exemple, tout phenomene d’auto-regulation sera rendu impossible par

l’absence de la proteine originale. L’expression mesuree dans un tel cas serait differente

de celle qui aurait lieu dans la cellule sauvage. Enfin, les phenomenes de regulation

post-transcriptionnelle ne peuvent etre mesures par cette technique. Meme si, chez les

bacteries, ce type de regulation est beaucoup moins frequent que la regulation de la

transcription, il est tout de meme important ; des techniques complementaires, dont

certaines sont mentionnees ci-dessous (section 4.6.3), devraient donc etre utilisees

afin d’identifier les mecanismes controlant le niveau intracellulaire de GluQRS.

4.6.3 Techniques alternatives

Le transfert Northern est une autre technique qui peut etre utilisee pour detecter

et quantifier l’expression d’un gene. L’avantage principal de la technique utilisee ici par

rapport au transfert Northern est la possibilite de tester un nombre eleve de conditions

et de faire des echantillonnages a des temps rapproches. Avec la technique du transfert

Northern, realiser un nombre aussi grand de mesures aurait ete malaise. Toutefois,

le transfert Northern a l’avantage de ne pas modifier le metabolisme de la cellule,

contrairement au remplacement de gene.


L’immunobuvardage (ou transfert Western) permet d’obtenir des informations sur

le nombre de copies du produit d’expression d’un gene dans les cellules. Il permet donc

d’integrer des informations sur la demi-vie des proteines. Toutefois, cette technique,

tout comme le transfert Northern, n’est pas utilisable avec un nombre de mesures aussi

eleve que ce qui a ete realise dans la presente etude.

Enfin, la technique de PCR en temps reel permet de mesurer de facon quantitative

et tres precise les niveaux d’ARNm d’un certain gene. La technique peut etre utilisee a

grande echelle avec un nombre eleve d’echantillons. Toutefois, l’instrumentation associee

a cette technique est complexe, onereuse et necessite une expertise considerable.

Chapitre 5

Conclusion

5.1 Resume

Le gene yadB code pour l’enzyme glutamyl-queuosine-ARNtAsp synthetase

(GluQRS), dont la fonction est la glutamylation de l’ARNtAsp. Le role physiologique

de l’aminoacyl-ARNt ainsi forme est inconnu. La GluQRS agit comme une enzyme de

modification de l’ARNt plutot que comme une aminoacyl-ARNt synthetase classique,

puisqu’elle lie le glutamate a la base hypermodifiee queuosine de l’anticodon de son

ARNt correspondant plutot que sur une fonction hydroxyle de l’extremite 3’-terminale.

Chez E. coli et, probablement, d’autres bacteries, yadB forme un operon avec le

gene dksA, qui est implique dans la regulation de la transcription des ARNr et dont

le produit d’expression a une activite maximale pendant la phase stationnaire de

croissance.

Nous avons demontre par deletion de gene que yadB est non-essentiel chez E.

coli, aussi bien en milieu riche qu’en milieu minimal. Une souche ou le gene yadB a ete

remplace par le gene rapporteur lacZ a egalement ete construite. Ce remplacement a

ete realise de facon a conserver les elements transcriptionnels de yadB. Le dosage de

l’activite β-galactosidase a permis de determiner le patron d’expression de yadB dans

des conditions de croissance variees. Nous avons decouvert que l’expression de yadB

est tres faible pendant la phase exponentielle, mais augmente significativement lors du

passage a la phase stationnaire. Nous avons tente d’induire l’expression de yadB en

reproduisant des stress associes a la phase stationnaire, mais sans succes. Il semble que

l’expression de yadB soit reliee au phenomene global de passage a l’etat stationnaire de

croissance.

Chapitre 5. Conclusion 70

La GluQRS pourrait agir comme regulateur post-transcriptionnel pour un en-

semble de genes impliques dans la phase stationnaire ou dans certains phenomenes

de virulence. Cette regulation pourrait se faire par le biais du decodage preferentiel

d’un codon aspartate par le ribosome. Ce decodage preferentiel serait lui-meme du a

la glutamylation de la queuosine de l’ARNtAsp, qui pourrait influencer le phenomene

de flottement qui a lieu a la troisieme position du codon dans l’appariement codon /

anticodon. Cette hypothese repose sur l’occurrence anormalement elevee (par rapport

aux valeurs moyennes pour le genome) dans de nombreux genes associes a la virulence

du codon GAU, alors que le codon GAC est y considerablement sous-utilise.

5.2 Perspectives

Afin de reperer les eventuels phenotypes dus a la deletion de yadB, des etudes de

viabilite en phase stationnaire seront realisees, ainsi que des examens microscopiques

des cellules, qui considereront l’ensemble du cycle cellulaire. Le rapport entre les ARNm

des genes yadB et dksA pendant les phases exponentielle et stationnaire de croissance

sera determine par transfert Northern. Ces observations permettront de verifier s’il

existe un element de regulation de l’expression de yadB immediatement en amont de ce

gene. Des anticorps ciblant DksA et la GluQRS etant disponibles, le nombre de copies

de ces deux proteines sera mesure pendant les phases exponentielle et stationnaire.

A long terme, il serait interessant de realiser des etudes proteomiques portant

sur les effets de la deletion de yadB sur l’expression des autres genes de E. coli. Par

comparaison de gels d’electrophorese en deux dimensions realises a partir des proteines

des cellules ∆yadB et des cellules sauvages, il pourrait etre possible d’identifier des

genes dont le patron d’expression est modifie en l’absence de yadB.

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Documents

EXPLORATION DU RÔLE PHYSIOLOGIQUE DU … · 3.8 E et du choc oxydatif sur l’expression de yadB . . . . . . . . . . . . . 61. x Liste des abr eviations aa Acide amin e aa-AMP Aminoacyl-ad