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IntroductionIntroduction HistoriqueHistoriqueI. Caractères généraux de la FamilleII. ClassificationIII. Pathogénicité de quelques espèces IV. Méthodes d’analyses A- Analyses communes

B- Analyse des C.sulfitoréducteurs et des C. perfringens.

C- Analyse des C. botulinum

ConclusionConclusion

IntroductionIntroduction HistoriqueHistoriqueI. Caractères généraux de la FamilleII. ClassificationIII. Pathogénicité de quelques espèces IV. Méthodes d’analyses A- Analyses communes

B- Analyse des C.sulfitoréducteurs et des C. perfringens.

C- Analyse des C. botulinum

ConclusionConclusion

La famille des clostridium englobe un ensemble très complexe de bactéries ayant certaines caractéristiques écologiques, biochimiques et pathologiques.

- sont des germes commensaux très fréquents, en particulier au sein de diverses flores dont celle oropharyngée ou encore digestive.

IntroductionIntroduction

HistoriqueHistorique

premier genre isolé est Clostridium tetani par Kitasato.

Le genre Clostridium perfringens a été caractérisé chez un patient souffrant de rhumatisme. En France, Veillon et Zuber (1898) l’isolèrent d’appendicites aiguës.

1889

1891

Van Ermengen, mit en évidence la toxine dans un jambon Van Ermengen, mit en évidence la toxine dans un jambon et isola de celui-ci et de la rate d’un malade décédé un et isola de celui-ci et de la rate d’un malade décédé un bacille à Gram positif. Quelques années plus tard après bacille à Gram positif. Quelques années plus tard après consommation de conserve de légumes ; Landman en consommation de conserve de légumes ; Landman en isola en 1904 la bactérie responsable (isola en 1904 la bactérie responsable (Clostridium Clostridium botulinum)botulinum). Le type isolé par Landman fut désigné type A . Le type isolé par Landman fut désigné type A et celui par Van Ermengen type B. Par la suite dans et celui par Van Ermengen type B. Par la suite dans différentes épidémies, on isola plusieurs autres types de différentes épidémies, on isola plusieurs autres types de toxines (C, D, E, F, G).toxines (C, D, E, F, G).

1904

Hall et O'Toole ont isolés Clostridium difficile de 40 % de prélèvements de selles de nouveau-nés âgés de 1 à 10 jours.1935

PRINCIPALE CARACTÉRISTIQUE DE la PRINCIPALE CARACTÉRISTIQUE DE la famillefamille

• bacilles gram positif • anaérobies • anaérobies strict pour la plupart• souvent sporulés • mobile en général par l'intermédiaire de flagelles

péritriches.

• Bacilles Gram +

• Sporulé

•La Spore très résistante, non détruite à 100°C pendant 3 à 5 heures.

•mobiles le plus souvent par ciliature péritriche

Aspect microscopique

CLASSIFICATIONCLASSIFICATION

Phylum BXIII. Phylum BXIII. "Firmicutes""Firmicutes" Class I. "Clostridia"Class I. "Clostridia" Order I. Clostridiales Order I. Clostridiales Family I. Clostridiaceae Family I. Clostridiaceae Genus I. ClostridiumGenus I. Clostridium

D’ après bergey’s manual:D’ après bergey’s manual:

Les plus « célèbres » espèces sont :• C. tetani : agent du tétanos

• C. botulinum : agent du botulisme

• C. perfringens : retrouvé dans les plaies gangréneuses (gangrènes gazeuses) ou dans des intoxications alimentaires.

• C. difficile : peut être responsable de la colite pseudomembraneuse.

• C . acetobutylicum ou C. butyricum : ,sans danger pour l’homme, sont utilisées pour des fermentation dans l’industrie.

morphologie genre espèce habitat pouvoir pathogène

bacilles gram positif

  

Clostridium  

  tetani

perfringens

botulinum

 spores dans le sol

intestin et sol

terre et aliments

 tétanos

gangrènes gazeuses

botulisme

1- Clostridium

difficile une résistance aux ß-lactamines et aminoglycosides ------>

colite pseudomembraneuse atteinte du colon -------> production de toxines (entérotoxine et cytotoxine).

Le diagnostic bactériologique à partir de selles soit sur la recherche de la bactérie (milieu sélectif), soit sur la recherche d'un effet cytopathogène (toxines) en culture cellulaire.

Clostridium difficile sous microscope

PATHOGÈNÈCITÈ de quelques espècesPATHOGÈNÈCITÈ de quelques espèces

• (Le bacille de Nicolaer) commensal du tube digestif des animaux.

• Spores rencontrées dans le sol.

2- Clostridium tetani et tétanos

Habitat

Forme végétative :

• bacilles à bouts carrés en chaînettes plus ou moins longues Gram +

Forme de résistance : •spore dans un environnement favorable permet le développement d’un nouveau Clostridium tetani.Présent dans le sol et les poussières

•Spore terminale déformante

Pouvoir pathogène

Le tétanos est secondaire à l'introduction dans l'organisme de spores de Clostridium tetani consécutive à un traumatisme.

Si l'anaérobiose est suffisante (plaies profondes, multiplication de bactéries aérobies associées), les formes végétatives apparaissent par germination des spores.

Cependant, la multiplication bactérienne reste localisée à la porte d'entrée, la maladie est uniquement due à la toxine.

La toxine, libérée au cours de la multiplication entre par endocytose par les terminaisons nerveuses du site infecté.

Elle empêche la libération d'inhibiteurs du motoneurone (glycine, GABA) et provoque des spasmes musculaires (rire sardonique).

Rire sardonique

3 - Clostridium botulinum et le Botulisme

Habitat bactérie tellurique, les spores contaminent les légumes et les fruits, Mauvaise stérilisation de conserves familiales ou autres préparations: jambon, saucisson. Grande thermorésistance de la spore: 3-5 h à 100°C. Donc chauffer 10 min à 120°C.

Grand bacille (5 µm de long, 1 µm de large)

Gram +

Mobile a l’état végétatif

spore ovalaire terminale déformante.

Absence de capsule

catalase –

oxydase -

Pathogénie

La maladie n’est pas due à la bactérie mais à l’ingestion de sa toxine présent dans un aliment mal stérilisé.C’est une toxine thermolabile (sensible à la chaleur), il y a risque de contamination uniquement lors de l’ingestion d’aliments non chauffés.L'intoxication se traduira par une paralysie des muscles lisses essentiellement.

- trouble de l'accommodation et muscles intrinsèques de l'œil : mydriase.

•atteinte des muscles bucco-pharyngés (dysphagie) avec paralysie de la déglutition, difficultés d'élocution

essentiellement clinique avec un signe d'atteinte du SNC. Rechercher d'autres cas dans l'entourage immédiat ou non.

Diagnostic

Diagnostic biologique

il convient de rechercher la toxine dans le sang des malades, dans l'aliment incriminé, voire les selles; Toxines puissantes (1 mg contient 20.106 doses minimales mortelles) qui inhibent la synthèse d'acétylcholine au niveau des synapses ou des plaques neuro-musculaires. - De nature protéique (détruites par chauffage de 20 min à 100°C) - sont antigéniques, donc transformables en anatoxine et neutralisables par anti-toxines (anticorps) = sérum.

Traitement curatif

sérothérapie + anatoxine

Traitement préventif

mesures légales pour abattage des animaux, préparation des conserves industrielles. Règles de salaison et de conservation des aliments...

Grand bacille (5 µm de long, 1 µm de large),

Gram +,

Formant une spore ovalaire terminale déformante.

Présence d’une capsule

Catalase –

Oxydase –

4- Clostridium perfringens

exotoxine protéique (lécithinase) qui décompose la lécithine, constituant des membranes cellulaires.

Toxine

Ingestion d’aliment contaminé (106 – 108 cellules végétatives)

déclenchement de plusieurs mécanismes qui vont concourir à l’apparition de la toxi-infection.

Etat végétatif

Responsable de gangrènes gazeuses post-traumatiques, de toxi-infections alimentaires et d'entérites nécrosantes.

C'est aussi un commensal des flores de l'intestin, du vagin ou des voies aériennes supérieures de l'Homme et des animaux.Sa présence dans les eaux est un critère de contamination fécale.

Pathogénie

Etat sporulé

Ingestion d’aliment contenant des spores

sporulation rapide

séparation de la spore de son sporange

libération d’entérotoxine

déplacement des flux hydro minéraux de l’intestin

accumulation de l’eau dans le tube digestif

diarrhée bénigne

Clostridum perfringens sous microscope

Quelques exemples de gangrènes gazeuses

Méthodes d’analysesMéthodes d’analyses

Ι_ Analyses communes

1- Prélèvements – transport

hémoculture Lors d'hémoculture, un flacon avec et un sans oxygène sont systématiquement ensemencés.

Autres Certains prélèvements seront rapidement effectués sur un écouvillon avec ensuite ensemencement au sein d'un milieu gélosé permettant le transport rapide ou encore il convient d'éviter tout apport d'air dans la seringue. Puis leur acheminement sera le plus rapide possible au laboratoire.

2- Culture

• soit en travaillant en chambre spéciale (chambre de Freiter) avec mélange gazeux divers (C02, N2...)

Les contraintes déjà évoquées s'appliqueront encore en évitant le contact avec l'oxygène:

• soit plus habituellement en mini-chambre (jarre ou poche plastique) et utilisation d'un catalyseur chimique (sachet) en ensemençant des milieux solides tel gélose au sang frais.......

La recherche et le dénombrement des anaérobies sulfitoréducteurs sont réalisés dans deux buts différents :

• Clostridium perfringens de type A est recherché car parfois responsable d’intoxications alimentaires. 

• Les Clostridium sulfitoréducteurs (ou leurs spores), bactéries commensales de l’intestin ou saprophytes du sol, comme le test de contamination fécal, éventuellement ancienne vu la résistance des spores a l’extérieur.

D’autre part les Clostridium thermorésistants sont rechercher dans les conserves ou ils peuvent facilement proliférer puisque leurs spores sont les seules être vivants survivants après le chauffage qui assure, de plus, la fragilisation des enveloppes sporales nécessaire a la germination.

ΙΙ_ Analyses des Clostridium sulfitoréducteurs et Clostridium perfringens

1-But de leurs Recherches

6 H+ + 6 e- + SO3-2 S2- + 3H2O

2-PRINCIPE

Clostridium perfringens et les clostridium sulfitoréducteurs réduises les sulfites en sulfure :

Clostridium perfringens Clostridium sulfitoréducteurs

Caractères - anaérobie strict

- cultivant a 46°C

- réduise

- résistant a la cyclosérine

- anaérobie strict

- cultivant a 37°C

- réduise

- possédant des spores résistant au moins 10 min à 80°C

Milieu utilisé

Milieu solide anaérobie contenant des sulfites et un indicateur de sulfure

(Fer ΙΙ ou ΙΙΙ) et de la Cyclosérine.

Milieu solide anaérobie contenant

des sulfites et un indicateur de sulfure (Fer ΙΙ ou ΙΙΙ), avec traitement, pour le

dénombrement des seules spores, 10 min à 80°C.

T°d’incubation

46°C 37°C

Comparaison entre les deux catégories

Le dénombrement des clostridium perfringens n’étant pas spécifique doit être appelé dénombrement des (anaérobies sulfitoréducteurs à 46°C)

Apres l’incubation on comptera les colonies noires, chaque une étant issue d’une bactérie anaérobie étant à 46°C ou d’une spore de clostridium sulfitoréducteurs.

Remarque

3- TECHNIQUE 3.1- Dénombrement

Anaérobies sulfitoréducteurs 46°C

Spores de clostridium sulfitoréducteurs

Preparation des milieux

Milieu TSC (Tryptone-sulfite-Cyclosérine) régénéré Puis additionné de cyclosérine a la concentration finale de 400 mg.dm-3 ou milieu TSN.

Milieu TSC régénéré sans cyclosérine ou éventuellement milieu Wilson-Blair régénéré puis additionné de :-1.5 cm3 de sulfite de sodium 5 %.-0.5 cm3 d’alun de Fer ΙΙ ammoniacal à 5 %.

Préparation de l’inoculum

Placer le volume nécessaire de produit dans un tube stérile et le porter au bain d’eau à

80°C pendant 10 min (destruction des formes végétatives).

nsemencement

-en tube :mettre la prise d’essai dans le

milieu en surfusion ;mélanger sans faire de bulles et solidifier sous l’eau froide.

-En boite :Mettre l’inoculum dans la

boite et recouvrir de milieu ; puis couler une double

couche.Incubation anaérobie, durant

20 heurs maximum pour éviter un noircissement trop

important.

-en tube :verser le milieu dans le tube de produit traité mélanger sans faire de bulles et

solidifier sous l’eau froide.

Incubation 24 à 48 heurs à 46 °C 24 à 48 heurs à 37 °C

Les grosses colonies noires qui se sont développés en anaérobiose sont des colonies de bactéries produisant, à partir des sulfites, des sulfures qui ont précipités avec les ions du Fer. On considère qu’il s’agit de colonies de clostridium sulfitoréducteurs.

Les colonies grisent ou blanches sont en générales des colonies de bacillus.

Dans le cas des spores, chaque colonie noire est issue d’une spore, d’ou la détermination du nombre de spores dans le produit.

Dans le cas des formes cultivant à 46°C chaque colonie est issue d’une spore ou des formes végétatives d’où le nombre d’anaérobies catégories a 46°C (que l’on assimile à Clostridium perfringens de type A).

RESULTAT

Colonies de Clostridium sulfitoréducteurs sur Milieu TSC

L’identification des Clostridium perfringens peut être réalisé grâce à la démarche suivante.

Deux milieux sont ensemencés :• milieu nitrate mobilité, gélose molle aux nitrates, de lecture

classique.• Milieu lactose au rouge de phénol et a la gélatine, ou l’hydrolyse

de la gélatine sera mise en évidence par bactérie. Le refroidissement du milieu permettra de distinguer une liquéfaction à la chaleur d’une liquéfaction enzymatique.

Clostridium perfringens est considéré comme confirmé avec le caractère d’immobilité, de réduction des nitrates en nitrite, de fermentation du lactose et le possession d’une gélatinase(en 48h).

3.2- Identification

Ces tests sont généralement suffisants pour l’identification de clostridium perfringens ; un doute peut subsister avec certaines souches de clostridium absonum et sardiniensis, il peut alors s’avérer utile de réaliser quelques tests supplémentaires. Voir le tableau :

Tableau : identification biochimique des principaux Clostridium sulfitoréducteurs interférents sur les milieux sélectifs d’isolement

Espèces Mobilité Nitrate Gélatine lactose Raffinose lécithinase

C. absonum

C.bifermentans

C. celatum

C. baratii

C. perenne

C. perfringens

C. sardiniens

+ou faible

+

-

-

-

-

Faible

+

-

+

+

+

+

+ou faible

Lente

+

-

-

-

+

Lente

+

-

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

+

-

+

+

-

+

variable

+

+

Hormis les méthodes rapides basées sur l’identification enzymatique disponible dans le commerce, un certain nombre de méthodes rapide et peu coûteuse d’identifications peuvent être proposées:

• le milieu LS : peut être utiliser pour l’identification de clostridium perfringens caractériser par la production de sulfate ferreux et de gaz à 46°C de 8h à 24h ;

• le milieu de Brasier : exploite la possibilité de florescence à 365 nm des colonies de clostridium perfringens cultivées sur un milieu au sang contenant des substrats destinés à optimiser la production de protoporphyrine. En effet, clostridium perfringens est capable de produire des protoporphyrines fluorescentes par dé métallisation de l’hème.

Méthodes rapides

4- Produit et technique

4.1- Spores d’anaérobies sulfitoréducteurs

Produit Remarques

Eau Analyse effectuée sur 25ml de l’eau a analysé répartie en 5

tubes.

Produit Remarques

Viandes, surgelés Analyse effectuée sur 1cm3 de dilution 10-1 et quelquefois sur

1 cm3 de 10-2 et plus

Semi-conserves Analyse effectuée sur10 cm3 de dilution 10-1

4.2- Anaérobies sulfitoréducteurs a 46°C

5. Composition de milieuxMilieu

TSCMilieuTSN Milieu

WilsonBlair

Molécules organiquesAzotées

Semi-conservesExtrait de viandeExtrait de levure

20g 15g10g

5g1g2g

Glucides Glucose 20g

Autres molécules carbonées

Citrate de fer ΙΙΙammoniacal

1g 0,5g

Indicateur de sulfures Fer ΙΙΙ Présence Présence Présence

Inhibiteurs CyclosérineSulfate de néomycine

Sulfate de polymyxine

0,4g (1) 0,05g0,02g

Indicateur de pH pH final 7.2

Ions minéraux ajoutés NaClNa2SO3

Na2S2O3

Ammonium-FerΙΙΙ-sulfate(alun de fer)

1g 1g 5g4g (1)1g

Agar 5g 12g 12g

Eau 1dm3 1dm3 1dm3

(1)Ajouté au moment de l’emploi.

L'identification est le plus souvent biochimique

Exemple d'une galerie d'identification (Rapide ID 32A).

ΙΙΙ Analyse des Clostridium botulinum

2- Principe

En général, la recherche de Clostridium thermophiles nécessite plusieurs phases successives.

1- But de leurs Recherches

Analyses faites sur des conserves

- Souvent présentent dans les conserves dont la stérilisation est mauvaise..- Grande thermorésistante de leurs spores (3-5 h à 100°C)- En France, 567 cas entre 1971 et 1978.

3- Prélèvement

Du fait du nombre très faible de micro-organismes qui peuvent se présentés dans les conserves,il est essentiel de réaliser un prélèvement aseptique (auprès du bec bensen ou sous poste de sécurité microbiologique (PSM):- Nettoyage de l’emballage - Désinfection avec une solution hypochlorite de sodium puis avec l’éthanol a l’aide d’un coton hydrophile.- Ouverture de l’emballage:

Ouverture avec une cisaille courbe

Bouchon de coton cadré

poinçon

Entonnoir

Ouverture avec un poinçon

Zone stérile

4- Analyse et critères

schéma généralL’échantillonnage doit être réalisé dans un lot de produit fabriquer. Cinq boites sont prélevées: - 1 boite conservée a la température du laboratoire (25 °C environ).- 2 boites sont étuvées à 32 °C jusqu'à 21 jours avec examen quotidien (recherche de bombage ou de fuite).- 2 boites sont étuvées à 55 °C jusqu'à 7 jours avec examen quotidien (sauf pour conserves de pH > 4.5, a l’exclusion des tomates).

- aspect extérieur.- mesurage de la pression au manomètre.- examen du produit (odeur, couleur …) mais sans gouter. - mesurage du pH - examen bacterioscopique a partir d’une goute de produit liquide, ou en application direct d’un produit solide sur une lame.

Examens

après 24 h

25°C

32°C

55°C

32°C

55°C

Examen bacterioscopiqueMesure du pH et examen du contenu

-Ensemencer 3 bouillons de Rosenow cystéiné régénérés et paraffinés et 3 géloses sulfitées aux citrates de fer lll et régénérer.

- chauffer 10min a 100°C l’inoculum et ensemencer les memes bouillons

Schéma d’analyse dans les conserves

Milieu de Rosenow cystéine

Composition

Peptone trypsique 10 gExtrait de viande de bœuf 3 gChlorure de sodium 2g Chlorhydrate de Cystéine 0,3 gGlucose 2 gIndicateur d’Andrade 10 mL(fushine )

Source N et de C

Acide aminé, réducteurSource énergétique carbonée

pH = 7,2

Ensemencement

Sources minérales

Régénérer le milieu 20 min au BM à 100°C pour assurer l’anaérobie

La présence d’un réducteur renforce l’anaérobie Ensemencer en profondeur le tube en évitant les

bulles d’air Recouvrir de paraffine fondue Incuber 24 heures à 37°C.

Ajouter dans le tube:Un morceau de marbreUn morceau de cervelle de boeuf

Indicateur d’oxydo réduction

Pour les formes végétatives

ensemencement

Milieux Rosenow cystéinéBouillons glucosés ou géloses sulfitées aux citrates de

fer ΙΙΙ

inoculum

Pour les formes sporulées

inoculum

Traitement100°C/10min

Le reste de l’analyse est identique au test précédent

Coloration rose à rouge carmin au niveau de la cervelle : fermentation du glucose

Pas de coloration rose : glucose -

Milieu de Rosenow Cystéine

Décoloration du milieu voir virage au vert : les bactéries sont réductrices

Apparition de bulles, décollement de la paraffine production de gaz par les bactéries

Lecture

- Les milieux sont régénérés et vasolinés (pour les bouillons).- L’incubation est faite à 55 °C durant 8 jours.

Remarques

Résultat

Un trouble, un virage pour Rosenow, ou la présence de colonies noires (gélose sulfitée) signant la positivité en vérifiant ensuite : - l’aptitude a la sporulation en repiquant simplement un tube du même milieu.- Le caractère anaérobie par repiquage en bouillon puis sur gélose Columbia anaérobie et aérobie (incubation a 5°C).

- pHLa variation de pH due à l’étuvage ne doit pas être supérieure à 0.1 unité de pH.

- Aspect extérieurIl ne doit pas y’avoir de modification de l’aspect extérieur dues a l’étuvage.

- Examen bacterioscopiqueLe rapport du nombre de microorganisme dénombrés dans les boites étuvées et dans les boites non étuvées doit être inferieur à 100. La faible reproductibilité du test et le caractère généralement massif de la manipulation, quand elle a lieu, justifiant la valeur de 100 qui pourrait paraitre élevée.

- CultureIl semble que l’on puisse tolérer 1-2 microorganismes/g de conserve.Une telle valeur nécessite une technicité sans défaillance car la moindre contamination sera détectée, notamment celle liée au prélèvement.

Interprétations et critères

L'identification est le plus souvent biochimique

Exemple d'une galerie d'identification (Rapide ID 32A).

Toxinotypie

Expertise soit à partir de l'aliment, soit à partir d'un prélèvement du malade ou du cadavre.

5- Méthode de recherche de la toxine botulinique

La toxinotypie est l'identification d'une toxine par des techniques immunologiques.

La technique :

1°/ broyat du produit suspect et filtration2°/ répartition du filtrat et adjonction des sérums connus. On conserve deux témoins, l'un est laissé tel quel (positif), l'autre est chauffé (négatif)3°/ Injection d'un aliquote de chaque tube à un lot d'animaux (souris, cobaye)4°/ Bilan des survivants.

10g d’aliments suspects mis dans 30ml de diluant

Centrifugation 15min à 6000 tr/min

Culot: recherche de C. botulinumMise en culture sur milieux adéquats Surnageant: contient

éventuellement la toxine botulinique

Deux souris sont utilisées pour confirmer la présence de la toxine botulinique dans le sur nageant.

Injection de 1ml de surnageant a chaque souris

La souris meurt en 24h par arrêt respiratoire

Injection simultanée d’anticorps antitoxine botulinique

La souris survit

Identification d’une toxine botulinique dans un aliment (travaux de Mr Sebald )

La mort des souris peut-être due à: • toxine botulinique de type B• toxine ou toxique thermorésistant différente de la toxine botulinique• toxine trop concentrée (diluer le filtrat) • deux toxines botuliniques ensemble

Remarque

D’autres expériences supplémentaires peuvent être effectués en utilisant les anti toxines pour déterminer le type exact de la toxine à savoir les types (A, B, C, D, E, F, G)

Conclusion

Les risques dues au intoxications alimentaires peuvent être limités par quelques mesures préventives simples et issues du bon sens :- conserver les aliments dans un réfrigérateur;- se méfier des aliments suspects (même s'ils ne dégagent aucune odeur);- lire attentivement les étiquettes de délai de conservation (à l'achat et à la consommation).

Ces recommandations sont encore plus indiquées dans les pays du tiers-monde.

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