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LUIS FELIPE GUTIÉRREZ ALVAREZ
EXTRACTION ET CARACTÉRISTIQUES DES HUILES DE L’ARGOUSIER (Hippophaë rhamnoides L.) Une étude des effets de la méthode de déshydratation des fruits
sur le rendement d’extraction et la qualité des huiles
Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Génie Agroalimentaire pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)
DÉPARTEMENT DES SOLS ET DE GÉNIE AGROALIMENTAIRE FACULTÉ DES SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC
2007 © Luis Felipe Gutiérrez Alvarez, 2007
ii
Résumé Les huiles d’argousier (Hippophaë rhamnoides L.) ont été reconnues depuis longtemps
pour leurs propriétés nutraceutiques. Les effets du séchage à l’air et de la lyophilisation sur
les rendements d’extraction et la qualité des huiles de graines et de la pulpe d’argousier (cv.
Indian-Summer) ont été étudiés. Les extractions ont été effectuées en utilisant l’hexane. Les
graines séchées à l’air et celles lyophilisées ont donné des rendements d’extraction
semblables (∼12%p/p), tandis que des différences significatives ont été trouvées entre les
rendements d’extraction des pulpes séchées à l’air et lyophilisées (35.9±0.8 contre
17.1±0.6%p/p). Les acides α-linolénique (37.2-39.6%), linoléique (32.4-34.2%) et oléique
(13.1%) furent les principaux acides gras trouvés dans les extraits des graines, alors que les
extraits des pulpes furent riches en acides palmitoléique (39.9%), palmitique (35.4%) et
linoléique (10.6%). Le fractionnement des huiles brutes, fait par extraction en phase solide,
a donné principalement des lipides neutres (93.9-95.8%). Les indices de peroxyde des
huiles des graines et des pulpes furent d’environ 1.8 et entre 3.0 et 5.4 meq/kg,
respectivement. Les profiles de fusion des huiles ont été caractérisé par calorimétrie
différentielle à balayage.
iii
Abstract Sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) seeds and pulp oils have been recognized for
their nutraceutical properties. The effects of air-drying and freeze-drying on extraction
yields and quality of oils from sea buckthorn (cv. Indian-Summer) seeds and pulp were
studied. Oil extractions were carried out using hexane. Air-dried (ADS) and freeze-dried
(FDS) seeds, gave a similar extraction yields (∼12%w/w), whereas those of air-dried (ADP)
and freeze-dried (FDP) pulps were significantly different (35.9±0.8 vs. 17.1±0.6%w/w).
Fatty acid analysis revealed that α-linolenic (37.2-39.6%), linoleic (32.4-34.2%) and oleic
(13.1%) acids were the main fatty acids in seed oils, while pulp oils were rich in
palmitoleic (39.9%), palmitic (35.4%) and linoleic (10.6%) acids. Lipid fractionation of
crude oils, obtained by solid phase extraction, yielded mainly neutral lipids (93.9-95.8%).
The peroxide values of seed and pulp oils were circa 1.8 and between 3.0-5.4 meq/kg
respectively. The melting behavior of oils was characterized by differential scanning
calorimetry.
iv
Avant-propos De plus en plus la population s’intéresse à la consommation « d’aliments santé » et
d’aliments traditionnels enrichis en substances (vitamines, minéraux, acides gras essentiels,
etc.). Cet intérêt plutôt récent, et les fortes campagnes publicitaires axées sur les effets
bénéfiques de ces aliments sur la santé, constituent une des habitudes alimentaires du 21ème
siècle.
Face à ce changement dans les habitudes alimentaires, les entreprises agroalimentaires et
pharmaceutiques sont appelées à satisfaire cette demande. C’est ainsi qu’aujourd’hui, l’on
trouve dans le marché principalement trois gammes de produits ayant des effets bénéfiques
pour l’organisme : les produits censés contribuer au bon fonctionnement du système cardio-
vasculaire, les probiotiques et les produits allégés.
L’argousier (Hippophaë rhamnoides L.), une plante presque inconnue pour la population
québécoise et inexploitée commercialement au Québec, a été importé en 1938 de la Russie
vers le Canada. Sa production au pays, atteint déjà plus de 1.6 million de kilogrammes
(Agriculture and Agri-Food Canada, 2003). Il représente un candidat de choix pour le
marché des aliments fonctionnels et nutraceutiques, à cause de ses effets bénéfiques pour la
santé, prouvés scientifiquement depuis le 20ème siècle.
Dans le cadre d’un programme de mise en valeur de l’argousier au Québec, ce projet de
recherche, sous la direction de M. Khaled Belkacemi (Ph.D), professeur agrégé du
Département de sols et de génie agroalimentaire de l’Université Laval, et la codirection de
Mme. Cristina Ratti, (Ph.D), professeure titulaire du Département de sols et de génie
agroalimentaire de l’Université Laval, a visé un des composants les plus importants du fruit
d’argousier : ses huiles.
Le présent mémoire se compose de trois chapitres, dont le premier comporte une revue de
littérature sur la composition nutritionnelle des fruits de l’argousier, et les méthodes
utilisées pour extraire leurs huiles, et le deuxième présente les hypothèses et objectifs de
recherche. Le troisième chapitre, décrivant la méthodologie des travaux réalisés et les
v
résultats obtenus, a été rédigé en anglais sous forme d’article scientifique. Il sera soumis à
publication dans la revue « Food Chemistry », sous le titre « Effect of drying method on the
extraction yields and quality of oils from Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) seeds
and pulp ». M. Luis Felipe Gutiérrez est le premier auteur, et Mme. Cristina Ratti et M.
Khaled Belkacemi sont les coauteurs. Ils ont apporté leur soutien scientifique et leurs
conseils selon leurs expertises.
Une conclusion générale est présentée à la fin, donnant une vision globale de l’ensemble
des résultats obtenus, ainsi que les perspectives de recherche pour des travaux futurs.
vi
Remerciements J’aimerais exprimer mes plus sincères remerciements à mes directeurs de recherche, M.
Khaled Belkacemi et Mme. Cristina Ratti, pour la confiance qu’ils m’ont accordé dès
l’admission au programme, ainsi que pour le temps consacré et les conseils prodigués tout
au long de ce projet.
Je remercie très chaleureusement Mélanie Plourde et François-Olivier Marquis-Duval pour
leur aide technique dans les analyses GC. Également, à Gilles Ayotte pour sa collaboration
dans les analyses statistiques des données.
Je tiens à remercier aussi l’équipe du laboratoire pilote, Jocelyne Giasson, Mélanie
Martineau, Pascal Cliché et Gaétan Desnoyers. Merci également à ceux stagiaires d’été, qui
ont travaillé avec moi, Mélanie Peng et Mirabelle Prudencio.
Un remerciement spécial à mes collègues et amis, Mónica Araya, Mirela Vlad-Cristea,
Nassima Kemache, Huu Thuan Bui, Rabih Saad et Narindra Raharitsifa. Vos rires et
paroles de soutien tout au long de la réalisation de mes travaux, ont rendu cette expérience
plus agréable.
J’aimerais bien remercier mon épouse, Sandra Dalila. Sa compréhension, son appui
inconditionnel, ses sacrifices, et surtout son amour, ont joué un rôle incontestable, sans
lesquels la réalisation de ce rêve n’aurait pas été possible.
Je remercie infiniment mes parents, pour la vie, les principes et l’éducation qu’ils m’ont
procuré tout au long de ma vie. Maman, merci beaucoup pour ton immense amour et pour
m’encourager toujours.
Je voudrais finalement remercier avec gratitude le Conseil de recherches en sciences
naturelles et en génie du Canada (CRSNG), l’Association des Producteurs d’Argousier du
Québec (APAQ), et l’Institut des nutraceutiques et des aliments fonctionnels (INAF), qui
ont appuyé financièrement la réalisation de ce projet.
A mi esposa Sandra Dalila. Gracias a tu comprensión, tu
acompañamiento incondicional, tus esfuerzos y sacrificios, se ha hecho
posible la realización de otro de mis sueños.
Table des matières Résumé................................................................................................................................... ii Abstract................................................................................................................................. iii Avant-propos .........................................................................................................................iv Remerciements.......................................................................................................................vi Chapitre 1................................................................................................................................3 Revue de littérature.................................................................................................................3 1.1 L’argousier..................................................................................................................3
1.1.1. Brève description et distribution géographique ..............................................3 1.1.2. Composition nutritionnelle .............................................................................4
1.1.2.1. Vitamines ................................................................................................5 1.1.2.2. Sucres......................................................................................................6 1.1.2.3. Acides organiques...................................................................................6 1.1.2.4. Minéraux.................................................................................................6 1.1.2.5. Flavonoïdes.............................................................................................7 1.1.2.6. Lipides ....................................................................................................7 1.1.2.7. Acides gras..............................................................................................9 1.1.2.8. Caroténoïdes .........................................................................................14 1.1.2.9. Stérols ...................................................................................................15 1.1.2.10. D’autres composants des lipides...........................................................15
1.1.3. Effets physiologiques des huiles de l’argousier............................................20 1.1.4. Industrie et produits à base d’argousier ........................................................21
1.2 L’extraction d’huiles.................................................................................................22 1.2.1. Préparation des matières premières ..............................................................24
1.2.1.1. Le séchage....................................................................................................24 1.2.2. Influence de la méthode de déshydratation sur l’extraction d’huiles .................29
1.3 Extraction des huiles de l’argousier..........................................................................30 1.3.1. Extraction des huiles de l’argousier par pressage...............................................30 1.3.2. Extraction des huiles de l’argousier par solvants................................................31 1.3.3. Extraction des huiles de l’argousier avec des fluides supercritiques..................34 1.3.4. Extraction enzymatique des huiles de l’argousier ..............................................40 1.3.5. Extraction aqueuse des huiles de l’argousier ......................................................40
Chapitre 2..............................................................................................................................50 Hypothèses et objectifs de recherche....................................................................................50 2.1. Hypothèses.....................................................................................................................50 2.2. Objectif général..............................................................................................................50 2.3. Objectifs spécifiques......................................................................................................50 Chapitre 3..............................................................................................................................52 Effects of Drying Method on the Extraction Yields and Quality of Oils from Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) Seeds and Pulp ........................................................................52 3.1 Résumé............................................................................................................................52 3.2 Abstract...........................................................................................................................54 3.3 Introduction.....................................................................................................................54 3.4 Materials and methods ....................................................................................................56
3.4.1 Berries..................................................................................................................56
ix
3.4.2 Air-drying experiments........................................................................................56 3.4.3 Freeze-drying experiments ..................................................................................56 3.4.4 Total lipid content of starting materials...............................................................57 3.4.5 Oil extraction with solvent...................................................................................57 3.4.6 Analytical methods ..............................................................................................58
3.4.6.1 Melting profiles.............................................................................................58 3.4.6.2 Lipid fractionation ........................................................................................58 3.4.6.3 Fatty acid composition..................................................................................59 3.4.6.4 Triglyceride composition..............................................................................59 3.4.6.5 Peroxide value...............................................................................................60 3.4.6.6 Scanning electron micrographs.....................................................................60
3.4.7 Statistical analysis................................................................................................60 3.5 Results and discussion ....................................................................................................60
3.5.1 Moisture content of the sea buckthorn materials. ................................................60 3.5.2 Total lipid of the sea buckthorn materials ...........................................................60 3.5.3 Oil extraction using solvents................................................................................62 3.5.4 Fatty acid composition.........................................................................................66 3.5.5 Triglyceride composition.....................................................................................67 3.5.6 Lipid fractions extracted by SPE .........................................................................70 3.5.7 Peroxide values of the oils ...................................................................................73 3.5.8 Melting profiles....................................................................................................74
3.6 Conclusions.....................................................................................................................78 3.6 References.......................................................................................................................79 Conclusions générales...........................................................................................................81 Perspectives de recherche .....................................................................................................84 Annexe 1 ...............................................................................................................................85 Matériaux et produits expérimentaux ...................................................................................85 Annexe 2 ...............................................................................................................................86 Divers espèces et sous-espèces de l’Hippophaë ...................................................................86 Annexe 3 ...............................................................................................................................87 Enzymatic Oil Extraction of Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) Pulp: A Preliminary Study .................................................................................................................87 Résumé..................................................................................................................................87 Abstract.................................................................................................................................88 Introduction...........................................................................................................................88 Materials and methods ..........................................................................................................89
Fatty acid composition..................................................................................................90 Lipid fractionation ........................................................................................................90 Melting profiles.............................................................................................................91 Experimental design and statistical analysis.................................................................91
Results and discussion ..........................................................................................................91 Fatty acid composition..................................................................................................93 Lipid fractions...............................................................................................................94 Melting profiles.............................................................................................................97
References.............................................................................................................................99
Liste des tableaux Tableau 1.1.Teneur en acides organiques du jus du fruit de l’argousier cv. Indian-Summer (Adapté de Li & Beveridge, 2003 et Beveridge et al., 2002) .................................................6 Tableau 1.2. Teneur en lipides (%) des graines du fruit de l’argousier (H. rhamnoides) selon la sous-espèce et la méthode de détermination (Adapté de Beveridge et al., 1999; Yang & Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005) ..................................................................8 Tableau 1.3. Teneur en lipides (%) des parties molles (pulpe et peau) du fruit de l’argousier (H. rhamnoides) selon la sous-espèce et la méthode de détermination (Adapté de Yang & Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005) ................................................................................9 Tableau 1.4. Composition en acides gras de l’huile des graines du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Yang et Kallio, 2005; Rongsen, 2005; Cenkowski et al., 2006) ..............................................................................12 Tableau 1.5. Composition en acides gras de l’huile des parties molles du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Yang et Kallio, 2005; Rongsen, 2005; Cenkowski et al., 2006) ..............................................................................13 Tableau 1.6. Teneur en β-carotène des huiles de fruits de l’argousier de différentes espèces et sous-espèces d’Hippophaë L. (mg/100 g d’huile) (Tiré de Yang & Kallio, 2005) ..........14 Tableau 1.7. Composition en acides gras des TAGs de l’huile des graines du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001;Ozerinina et al., 1987; Zhmyrko et al. 1984) .........................18 Tableau 1.8. Composition en acides grasdes TAGs de l’huile des parties molles du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; Ul’chenko et al., 1995; Zhmyrko et al. 1984) .......................18 Tableau 1.9. Composition en acides gras des PL de l’huile des graines du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; ) .............................................................................................19 Tableau 1.10. Composition en acides gras des PL de l’huile des parties molles du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001) ...............................................................................................19 Tableau 1.11. Caractéristiques des extractions des fruits de l’argousier avec divers solvants...............................................................................................................................................35 Tableau 1.12. Caractéristiques des extractions des fruits de l’argousier avec chloroforme – méthanol................................................................................................................................36 Tableau 1.13. Caractéristiques des extractions des fruits de l’argousier avec le CO2 supercritique..........................................................................................................................37 Tableau 1.14. D’autres méthodes d’extraction des huiles du fruit de l’argousier (Adapté de Li & Beveridge, 2003) ..........................................................................................................41 Table 3.1. Lipid content in sea buckthorn dry pulp of different subspecies of Hippophaë rhamnoides............................................................................................................................61 Table 3.2. Oil recoveries from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulp using the Soxhlet extractor with hexane during 4 hours, over various solid to solvent ratios a...........64 Table 3.3. Effects of variation of temperature (T) and solid to solvent ratio (R), on the extraction efficiency of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulpsa. ....66 Table 3.4. Fatty acid composition (percent of total) of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps, extracted with hexane (30-68ºC). .............................................67
xi
Table 3.5. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, extracted with hexane using the Soxhlet extractor during 4 hours. ......................................................................................................................71 Table 3.6. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, extracted with hexane using the Soxhlet extractor during 4 hours. ......................................................................................................................72 Table 3.7. Thermal characteristics of sea buckthorn pulp oils .............................................75 Table A.3.1. Fatty acid composition (percent of total) of oils from sea buckthorn pulp, extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC ..........93 Table A.3.2. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from sea buckthorn pulp, extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC a..................................................................................................................96 Table A.3.3. Thermal characteristics of enzyme extracted sea buckthorn pulp oils a ..........97
Liste des figures Figure 1.1. Fruits de l’argousier (Photo : Luis Felipe Gutiérrez) ...........................................3 Figure 1.2. Schéma de l’opération d’extraction d’huiles par solvants. ................................23 Figure 1.3. Étapes du procédé de lyophilisation (Adapté de Barbosa-Cánovas & Vega-Mercado, 1996).....................................................................................................................27 Figure 3.1. Méthodologie suivie pour extraire et caractériser les huiles de l’argousier. ......53 Figure 3.2. Scanning electron micrographs of: (a) air-dried (ADP) and (b) freeze-dried (FDP) sea buckthorn pulps. ..................................................................................................62 Figure 3.3. Oil extraction kinetics from air-dried and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps using the Soxhlet extractor with hexane (R=0.25 g/mL). ...........................................63 Figure 3.4. Extraction efficiency of oils from freeze-dried pulp, over various ratios of solid to solvent (g/mL), using hexane for 24 hours at three different temperatures......................65 Figure 3.5. Triglyceride composition of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds......................................................69 Figure 3.6. DSC melting curves of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps. ...............................................................76 Figure 3.7. SFI of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps. .........................................................................................77 Figure A.3.1. Oil extraction yields obtained from sea buckthorn pulp using three commercial enzymes at different concentrations..................................................................92 Figure A.3.2. Melting profiles of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC (4ºC/min scan rate)..........................98 Figure A.3.3. Solid fat content of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC..........................................................98
Introduction L’argousier (Hippophaë rhamnoides L.) est un arbuste originaire d’Europe qui a été
importé en 1938 de la Russie vers le Canada, principalement comme plante ornementale.
Plus tard, cette plante est devenue une de celles qui convient le mieux à la conservation
environnementale (AAC, 2003). Ses fruits sont actuellement d’un grand intérêt grâce à
leurs propriétés nutraceutiques, déjà prouvées par les anciens médecins traditionnels de
l’Eurasie, et abondamment étudiées surtout au début du 21ème siècle (Zeb, 2004; Yang et
Kallio, 2002; Süleyman et al., 2001, Johansson et al., 2000; Yang et al., 2000).
Les fruits d’argousier, de part leur richesse vitaminique, ont un contenu appréciable en
huile contenant entre autres, deux acides gras essentiels, l’acide linolénique (ω-3) et l’acide
linoléique (ω-6) (Kallio et al., 2002, 2002a; Yang et Kallio, 2001; Beveridge et al., 1999).
La teneur élevée en tocophérols, en tocotriénols et en caroténoïdes de l’huile (Luhua et al.,
2004; Zadernowski et al., 2003), lui confèrent des propriétés antioxydantes, démontrées
dans de nombreuses études faites chez l’humain et in vitro (Gao et al., 2003; Eccleston et
al., 2002).
Ainsi, l’huile et autres produits dérivés de l’argousier entreraient dans la catégorie
d’aliments nutraceutiques et fonctionnels. Un aliment nutraceutique est un produit extrait
ou fabriqué à partir d’aliments, mais formulé sous forme de pilules ou de concentrés dont
les bienfaits physiologiques ou de protection contre les maladies chroniques ont été
démontrées.
Selon Agriculture et Agroalimentaire Canada (AAC), « l’argousier offre au Canada
d’intéressantes perspectives compte tenu de la présence d’un important approvisionnement
en eau de haute qualité pour la transformation, d’une expertise technique en extraction
d’huiles et d’un engagement de tous les paliers de gouvernement, envers la création de
produits à valeur ajoutée nouveaux et diversifiés ».
La région de Matane a été nommée région pilote pour la culture et la transformation de
l’argousier au Québec, où il existe environ 36 producteurs qui cultivent l’argousier pour
une production d’environ 78.000 plantes. Le cultivar Indian Summer est le plus utilisé par
2
les producteurs (96%) suivi de l’espèce Sinensis (MAPAQ, 2002). Cependant, les procédés
de transformation ne se sont pas encore développés, et des travaux de recherche sont
nécessaires pour trouver des conditions optimales d’opération et estimer les coûts de mise
en marché et production.
Parmi les produits à base d’argousier, ses huiles représentent une bonne alternative
commerciale avec une demande potentielle élevée. En fait, à partir de l’argousier, il est
possible d’obtenir trois types d’huile, selon qu’on la tire de la pulpe, de la graine ou de la
peau (Li & Beveridge, 2003). Cependant, vu la difficulté de séparer la peau de la pulpe,
normalement on ne fait pas de distinction entre ces deux huiles, et on les nomme
indistinctement huile de la pulpe ou huile des parties molles.
L’extraction des huiles de l’argousier a été réalisée depuis long temps. Plusieurs méthodes
d’extraction ont été appliquées, mais l’extraction par solvants, incluant le CO2
supercritique, prédomine. Comme pour la plupart de fruits, l’argousier requiert diverses
opérations préliminaires avant l’extraction de ses huiles. Ces opérations, normalement
comportent le nettoyage, le broyage et le séchage. L’information concernant les effets de
différents paramètres, tels que le type de solvant et la taille des particules, sur le rendement
d’extraction et la qualité des huiles, est relativement bien connue. Cependant, l’information
disponible concernant les effets de la méthode de déshydratation sur l’extraction des huiles,
n’est pas largement répandue. L’objectif global de ce travail est donc de comparer les effets
de la lyophilisation et du séchage à l’air, comme des opérations de déshydratation des fruits
d’argousier (cv. Indian summer), sur le rendement d’extraction et la qualité des huiles
obtenues, en utilisant l’hexane comme solvant.
Chapitre 1
Revue de littérature
1.1 L’argousier
1.1.1. Brève description et distribution géographique L’argousier (Hippophaë rhamnoides L.) est une plante qui se présente sous la forme d’un
arbuste ou d’un arbre, dont la taille rarement dépasse trois à quatre mètres de hauteur,
quoique certaines variétés puissent atteindre jusqu’à 20 mètres. Ses feuilles, étroites et
lancéolées, sont de couleur verte argentée à la face supérieure (Rousseau, 2002). Les fruits
se classifient comme non climatériques, et à l’état mûr peuvent être jaunes, oranges ou
rouges. Ils se présentent sous forme d’ovale légèrement arrondie, et sont réunis en grappes
denses sur les rameaux (Figure 1.1.). Leur poids varie normalement entre 4 et 60
grammes/100 fruits, pouvant dépasser 60 g chez certains cultivars russes. Le poids moyen
des fruits du cultivar canadien « Indian-Summer », oscille entre 20-40 g/100 fruits (Li &
Beveridge, 2003). Chaque fruit contient une graine brune, qui pèse environ 16 mg
(Harrison & Beveridge, 2002).
Figure 1.1. Fruits de l’argousier (Photo : Luis Felipe Gutiérrez)
4
Six espèces (H. rhamnoides, H. salicifolia, H. tibetana, H. neurocarpa, H. gyantsensis et H.
goniocarpa) et 12 sous-espèces de l’argousier ont été identifiés (Li & Beveridge, 2003),
dont deux (l’Hippophaë rhamnoides L. subsp. sinensis Rousi et l’Hippophaë rhamnoides
L. subsp. Rhamnoides) sont les plus utilisées pour des fins commerciales (Yang & Kallio,
2001).
L’argousier est naturellement distribué dans les régions froides de l’Asie et l’Europe. Les
principales populations naturelles d’argousier ont été trouvées en Chine, Russie et
l’Himalaya Indien (Singh, 2003). De nos jours, l’argousier pousse dans environ une
trentaine de pays (incluant l’Afghanistan, l’Allemagne, le Belarus, le Bhoutan, le
Danemark, la Finlande, la France, le Népal, la Norvège, le Pakistan, les Pays-Bas, la
Pologne, la République Tchèque, la Roumanie, le Royaume-Uni, la Suède et l’Ukraine), et
il a aussi été introduit en l’Amérique du Nord et du Sud, Canada et Bolivie, respectivement.
Au Canada, l’argousier est cultivé en Colombie-Britannique, Alberta, Saskatchewan,
Manitoba, Québec et Terre-Neuve (Harrison & Beveridge, 2002). Au Québec, la région de
Matane a été nommée région pilote pour la culture et la transformation de l’argousier. Dans
cette région, il existe environ 36 producteurs, possédant approximativement 78.000 plantes.
Le cultivar Indian Summer est le plus utilisé, suivi de la sous-espèce sinensis (MAPAQ,
2002).
Les plantes femelles commencent la production de fruits 4-6 ans après l’ensemencement
(Li & Beveridge, 2003), et en milieu naturel, elles peuvent donner un rendement fruitier de
0.75–1.5 t/ha (Lu, 1992). Schroeder & Yao (1995) ont rapporté une production de fruits de
4-5 t/ha en Saskatchewan, tandis qu’en Colombie-Britannique on a rapporté des
rendements entre 20-25 t/ha (Li & Beveridge, 2003).
1.1.2. Composition nutritionnelle L’argousier, appelé souvent «plante miracle», présente une composition chimique et
nutritionnelle unique, faisant d’elle une source de grand intérêt pour l’industrie des aliments
fonctionnels et produits nutraceutiques (Oomah & Mazza, 1999).
5
Les baies d’argousier sont parmi les fruits les plus nutritifs et les plus riches en vitamines.
Ils contiennent jusqu’à dix vitamines différentes, des acides gras essentiels, des sucres, des
oligo-éléments, des flavonoïdes, des pigments, ainsi que de l’huile (Yang & Kallio, 2002a).
Ils sont aussi riches en protéines et en éléments chimiques, y compris du fer, du calcium et
du manganèse (AAC, 2003).
1.1.2.1. Vitamines Les fruits d’argousier sont très riches en vitamines (C, E, A, B1, B2, F, K et P) (Lu, 1992).
Des études réalisées avec des fruits de la sous-espèce sinensis ont donné des concentrations
en vitamines A, B2 et C beaucoup plus élevées que celles contenues dans d’autres fruits et
légumes tels que la carotte, la tomate et l’orange (Zeb, 2004).
La teneur en vitamine C peut varier de 30.4 mg/100 g, chez les fruits de la sous-espèce
gyantsensis (Rongsen, 2005), à 2500 mg/100 mg chez les fruits de la sous-espèce chinoise
sinensis (Schroeder & Yao, 1995). Pour le cultivar Indian-Summer, Beveridge et al (2002;
1999) ont rapporté une teneur en vitamine C oscillant entre 137-193 mg/100 g. Comme le
contenu de vitamine C est influencé par plusieurs facteurs, tels que le degré de maturation,
l’origine et le temps de la cueillette, les conditions et le temps de stockage, ainsi que par
des facteurs génétiques et géographiques, il existe une grande variation de la teneur en
vitamine C entre les différentes sous-espèces et variétés.
Les tocophérols et tocotriénols (vitamine E) sont aussi trouvés dans des quantités
appréciables dans les fruits d’argousier. La teneur totale de ces composants varie de 100 à
300 mg/kg et de 10 à 150 mg/kg dans les graines et les baies fraîches, respectivement
(Yang & Kallio, 2002a). Récemment, Cenkowski et al. (2006) ont trouvé des
concentrations de tocophérols et tocotriénols variant entre 273.6 et 430.3 mg/100 g et entre
127.4 et 173 mg/100 g, pour les huiles des graines et la pulpe d’argousier respectivement,
chez le cultivar Indian-Summer.
6
1.1.2.2. Sucres La teneur en sucres des fruits d’argousier varie selon l’origine, la sous-espèce, le temps de
la récolte et leur état de maturité. Elle oscille entre 2.0 et 3.3%, quoique certains fruits
originaires de la Russie peuvent atteindre jusqu’à 7.0% (Singh, 2005). Le cultivar Indian-
Summer présente un contenu de sucres solubles qui varie entre 9.3 et 17.3 ºBrix (Li &
Beveridge, 2003). Or, les principaux constituants des sucres du fruit de l’argousier sont le
glucose et le fructose, avec des faibles quantités de xylose et d’alcools de sucre, tels que le
mannitol, sorbitol et xylitol (Li & Beveridge, 2003).
1.1.2.3.Acides organiques Les fruits de l’argousier ont une teneur élevée en acides organiques, parmi lesquels il est
possible de mentionner les acides malique, citrique, tartrique, succinique, quinique et
oxalique. D’après Rongsen (2005), la teneur en acides organiques des baies d’Hippophaë
varie entre 1.64-5.95%, étant beaucoup plus élevée que celle du fruit de citron. Le Tableau
1.1. présente la composition en acides organiques du fruit de l’argousier (cv. Indian
Summer). On y observe, l’importance de l’acide quinique, dont la concentration est environ
le double de la concentration en acide malique.
Tableau 1.1.Teneur en acides organiques du jus du fruit de l’argousier cv. Indian-Summer (Adapté de Li & Beveridge, 2003 et Beveridge et al., 2002)
Acide (mg/mL) Étendue Acide malique 11.4 – 15.5 Acide citrique 1.58 – 2.21 Acide tartrique 0.67 – 3.29 Acide quinique 19.6 – 26.5 Acide oxalique 0.13 – 0.50
1.1.2.4. Minéraux Les fruits de l’argousier contiennent des nombreux éléments minéraux et oligoéléments.
Selon Solonenko & Privalov (2005) la composition minérale du jus est élevée, et il contient
7
tous les micro et macroéléments essentiels. Le potassium, le calcium, le phosphore, le
magnésium, le sodium et le fer sont les éléments les plus représentatifs du fruit, bien que
d’autres éléments tels que le cuivre, le manganèse, le zinc, le nickel, le strontium, le
vanadium, le molybdène, le sélénium, le bore, le baryum, l’aluminium, le soufre, le chlore
et le plomb aient été aussi rapportés.
1.1.2.5. Flavonoïdes Plusieurs études ont démontré la présence de flavonoïdes dans les fruits et les feuilles de
l’argousier (Tolkachev & Sheichenko, 2005; Tsybikova et al., 2005; Guan et al., 2005;
Häkkinen et al., 1999; 1999a). Les principaux flavonoïdes identifiés sont la leucocyanidine,
la cathécine, les flavonols (isorhamnétine, quercétine, quassine et cameline) et des traces de
flavanone. Les flavonols peuvent représenter environ 87% de tous les composés
phénoliques, dont le principal est la quercétine (87.3%), suivie de faibles proportions des
acides ellagique (4.4%), férulique (3.1%), p-coumarique (2.8%) et p- hydroxybenzoïque
(2.8%) (Häkkinen et al., 1999a).
1.1.2.6. Lipides Une des caractéristiques principales des fruits de l’argousier est leur richesse en lipides.
Contrairement à d’autres fruits, l’argousier synthétise et accumule des lipides dans toutes
les parties du fruit, et par conséquent, il est possible d’obtenir trois types d’huile, selon
qu’on la tire de la pulpe, de la graine ou de la peau (Li & Beveridge, 2003). Cependant, vu
la difficulté de séparer la peau de la pulpe, normalement on ne distingue pas ces deux
huiles, et on les nomme indistinctement huile de la pulpe ou huile des parties molles.
Yang et Kallio (2002a; 2005; 2005a) ont réalisé une révision très complète de la teneur et
des effets physiologiques des lipides du fruit de l’argousier. D’après ces auteurs, le contenu
en huile des graines est généralement constant (environ 10%) et indépendant des
caractéristiques morphologiques et origines, bien que des valeurs plus élevées (jusqu’à 15-
16%) aient été rapportées pour quelques cultivars (Kallio et al. 1999; Kallio et al. 2002a;
8
Yang & Kallio, 2002). Par contre, la teneur en lipides des parties molles (pulpe et peau)
varie considérablement selon l’origine et d’autres facteurs tels que le temps de la cueillette,
l’application de fertilisants inorganiques, l’état de maturité des fruits et le climat. Des
valeurs variant entre 4% et 34% (en poids sec) ont été rapportées dans la littérature, dont les
plus élevées (30-34%) correspondent aux sous-espèces caucasica et turkestanika, et les
plus faibles (4-12%) à la sous-espèce sinensis (Yang et Kallio, 2005). Les travaux récents
de Yakimishen et al. (2005) indiquèrent que la teneur en huile du cultivar Indian-Summer
varie selon la méthode d’extraction, entre 10.3% et 19.7% et 3.4% à 11.7% pour les parties
molles et les graines respectivement.
Les Tableaux 1.2. et 1.3. montrent la teneur en lipides des graines et des parties molles du
fruit de l’argousier respectivement, selon la sous-espèce ou variété, et la méthode de
détermination.
Tableau 1.2. Teneur en lipides (%) des graines du fruit de l’argousier (H. rhamnoides) selon la sous-espèce et la méthode de détermination (Adapté de Beveridge et al., 1999;
Yang & Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005)
Sous-espèce ou variété Méthode de détermination Teneur en lipides (%)
Turkestanika Extraction Soxhlet avec éther diéthylique 5.3-15.7 Hexane 11.8 Extraction avec éther de pétrole 9.3-9.7 Extraction avec chloroforme 11.8-12.4 Mongolica Non définie 9.5-10.5 Chloroforme:Méthanol (2:1) 10.1-16.5 Sinensis Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 8.2-10.3 Extraction Soxhlet avec n-hexane 10.1-10.8 Extraction avec éther de pétrole 8.1-12.3 Non définie 6.9-11.4 Chloroforme:Méthanol (2:1) 4.2-10.7 Rhamnoides Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 8.2-10.4 Chloroforme:Méthanol (2:1) 7.0-14.2 Indian-Summer Chloroforme:Méthanol (1:1) 10.2-11.7 Extraction avec éther de pétrole 8.2 Extraction avec CO2 supercritique 5.3 Extraction par pression 3.4 Non définie 9.69-20.2
9
Tableau 1.3. Teneur en lipides (%) des parties molles (pulpe et peau) du fruit de l’argousier (H. rhamnoides) selon la sous-espèce et la méthode de détermination (Adapté de Yang &
Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005)
Sous-espèce ou variété Méthode de détermination Teneur en lipides (%)
Caucasica Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 30.1-33.2a Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 23.2-34.0b Turkestanika Extraction Soxhlet avec hexane 17.8-26.7b Chloroforme:Méthanol (1:2) 7.4c Extraction avec éther de pétrole 29.5d Extraction avec chloroforme 31.2d Extraction avec éther diéthylique 34.4d Non définie 21.2-29.1e Mongolica Non définie 16.0-28.0e Chloroforme:Méthanol (2:1) 5.4f Sinensis Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 5.6-9.2b Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 0.6-1.1c Extraction Soxhlet avec hexane 7.1-8.9b Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 20.0f Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 11.4-27.6d Extraction avec éther de pétrole 4.1-12.3d Non définie 4.1-8.9 Chloroforme:Méthanol (2:1) 2.8f Chloroforme:Méthanol (2:1) 0.8-2.6g Rhamnoides Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 4.8-5.4f Chloroforme:Méthanol (2:1) 3.2f Chloroforme:Méthanol (2:1) 1.7-4.1g Indian-Summer Extraction avec éther de pétrole 11.9b Chloroforme:Méthanol (1:1) 19.7b Chloroforme:Méthanol (1:1) 2.0c Extraction avec CO2 supercritique 10.3b Extraction aqueuse 0.7b
a Fruit sans pépins, b Parties molles sèches, c Jus frais, d Pulpe sèche, e Peau, f Parties molles fraîches, g Baies surgelées
1.1.2.7.Acides gras Les huiles issues des baies de l’argousier sont uniques parce que leur composition en acides
gras varie selon qu’on les tire de la graine ou des parties molles (pulpe et peau). Plusieurs
études sur la composition en acides gras des huiles du fruit de l’argousier de différentes
10
espèces, sous-espèces et origines ont été réalisées (Cenkowski et al., 2006; Ranjith et al.,
2006; Yin et al., 2005; Yakimishen, 2004; Cakir, 2004; Yang & Kallio 2005; 2002; 2002a;
2001; Kallio et al., 1999; 2002a; Beveridge et al., 1999).
L’huile des graines est caractérisée par sa teneur élevé en acides gras insaturés (85-90%),
parmi lesquels deux acides gras essentiels, l’acide linoléique ou oméga-6 (18:2n-6) et
l’acide α-linolénique ou oméga-3 (18:3n-3) peuvent représenter jusqu’à 70%. Les
proportions de ces deux acides gras sont généralement 30-40% et 20-35%, respectivement
(Yang & Kallio, 2002a). Cependant, des valeurs particulièrement faibles ont été rapportées
pour des baies sauvages chinoises de la sous-espèce neurocarpa (19% d’acide linoléique et
8% d’acide α-linolénique) (Yang & Kallio, 2005). D’autres acides gras normalement
trouvés dans les graines sont les acides oléique (18:1n-9, 13-30%), palmitique (16:0, 7-
20%), stéarique (18:0, 2-9%) et vaccénique (18:1n-7, 2-4%) (Yang & Kallio, 2002a; 2005)
(Tableau 1.4.).
L’huile des parties molles est caractérisée par sa forte teneur en acides gras saturés. Elle
comporte principalement les acides palmitoléique (16:1n-7, 16-54%), palmitique (16:0, 17-
47%), oléique (18:1n-9, 2-35%), et des faibles proportions en acides linoléique (18:2n-6, <
10%), α-linolénique (18:3n-3, < 3%) et stéarique (18:0, 0.2-3%) (Ranjith et al., 2006;
Cenkowski et al., 2006; Ul’chenko et al., 1995; Kallio et al., 1999; 2002a; Yang et Kallio,
2001;2002a, 2005) (Tableau 1.5.).
La teneur élevée en acide palmitoléique, un acide gras rare dans le royaume végétal,
caractérise donc l’huile des parties molles du fruit de l’argousier comme la source
principale d’acide palmitoléique, suivi de l’huile de noix de macadamia (Macadamia
integrifolia) qui en contient environ 20%. Tenant compte de l’intérêt accru que l’on attribue
au rôle physiologique des acides gras insaturés (Spitz et al., 1992; Katsouyanni et al.,
1991), l’huile de la pulpe d’argousier attire beaucoup l’attention. Les travaux de Yamori et
al. (1986) ont indiqué qu’un apport accru d’acide palmitoléique dans l’alimentation pourrait
améliorer le métabolisme des cellules musculaires lisses vasculaires. De plus, une
concentration élevée en acide palmitoléique, pourrait avoir des effets
11
hypocholestérolémiques et hypotriglycéridémiques, et réduire les risques d’accident
vasculaire cérébral (Yang et Kallio, 2002a).
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1.1.2.8. Caroténoïdes Des 600 caroténoïdes connus dans la nature, 39 ont été identifiés dans les fruits d’argousier
(Singh, 2005). La teneur en caroténoïdes peut varier grandement selon la source de l’huile
(50 et 2139 mg/100 g) (Beveridge et al., 1999). Les huiles de la pulpe sont plus riches en
caroténoïdes que les huiles des graines, lesquelles en contiennent habituellement des faibles
quantités (20 à 85 mg/100 g d’huile) (Li & Beveridge, 2003). Le β-carotène constitue
environ 15-55% des caroténoïdes totaux, variant ses teneurs typiques entre 100-500 et 20-
100 mg/100 g chez les huiles de la pulpe et des graines respectivement (Yang & Kallio,
2002a). La présence d’autres caroténoïdes dans les fruits d’argousier, tels que le α-
carotène, le γ-carotène, le δ-carotène, le licopène, le β-zéacarotène, la cryptoxanthine, la
sintexanthine, la lutéine et la zéaxanthine a été aussi rapportée (Li & Beveridge, 2003).
Le Tableau 1.6. présente les valeurs de la teneur en β-carotène des huiles issues de la pulpe
et des graines de fruits d’argousier de différentes espèces et sous-espèces rapportées
récemment par Yang & Kallio (2005). On remarque que les valeurs les plus élevées, dans
les huiles de graines et la pulpe, ont été trouvées chez l’espèce H. salicifolia (485.2 mg/100
g et 97.5 mg/100 g respectivement), tandis que les valeurs les plus faibles sont répertoriées
chez les espèces H. neurocarpa et H. rhamnoides sous-espèces mongolica et turkestanika
(13.0-18.4 mg/100 g et 122.7-169.2 mg/100 g respectivement).
Tableau 1.6. Teneur en β-carotène des huiles de fruits de l’argousier de différentes espèces et sous-espèces d’Hippophaë L. (mg/100 g d’huile) (Tiré de Yang & Kallio, 2005)
Espèce / Sous-espèce Huile de la pulpe Huile des graines H. salicifolia 485.2 97.5 H. gyantsensis 271.6 22.1 H. neurocarpa 148.6 13.0 H. tibetana 394.3 17.3 H. rhamnoides ssp. sinensis 363.9 33.6 H. rhamnoides ssp. yunannesis 364.8 21.2 H. rhamnoides ssp. turkestanika 169.2 18.4 H. rhamnoides ssp. mongolica 122.7 14.6
15
1.1.2.9. Stérols La teneur en stérols de l’huile du fruit de l’argousier oscille entre 2.2 et 8.8%, et varie selon
l’origine, la sous-espèce, la méthode d’extraction des huiles et l’époque de la cueillette des
fruits (Li & Beveridge, 2003; Yang et al., 2001). En termes de poids frais, elle oscille entre
0.1-0.2% chez les graines, et entre 0.02-0.04% dans les parties molles (Yang & Kallio,
2002a). D’après Mironov et al. (1989), environ 50% des stérols seraient contenus dans les
lipides de la peau du fruit, alors que les lipides de la pulpe et des graines en contiendraient
20% et 30%, respectivement. Yang et al. (2001) ont trouvé des contenus de stérols variant
entre 12 et 23 g/kg, 10 et 29 g/kg et 13 et 33 g/kg dans les huiles des graines, des parties
molles (pulpe et peau) et des fruits entiers respectivement, chez les sous-espèces sinensis et
rhamnoides. Le sitostérol a constitué entre 57 et 76% des stérols totaux des graines, et entre
61 et 83% des stérols totaux des parties molles. D’autres stérols trouvés dans cette étude
furent l’isofucostérol (13-21%), le stigmastanol (1-5%), le citrostadienol (2-5%) et le
campestérol (2-3%) dans les graines, tandis que l’isofucostérol, le stigmast-8-èn-3β-ol et
l’obtusifoliol ont constitué ensemble entre 3-9% des stérols totaux des parties molles.
Cenkowski et al. (2006) ont rapporté le β-sitostérol comme le principal stérol identifié dans
les huiles de graines (environ 97% des stérols totaux) et de la pulpe (96-98% des stérols
totaux), chez le cultivar Indian-Summer. D’autres stérols trouvés dans cette étude furent le
campestérol (17.2 à 22.5 mg/100 g d’huile de graines, et 6.6 à 12.4 mg/100 g d’huile de la
pulpe) et des faibles quantités de cholestérol et stigmastérol.
1.1.2.10. D’autres composants des lipides Outre les tocophérols, les tocotriénols, les caroténoïdes et les stérols, les triglycérides
(TAGs), les phospholipides (PL), les acides gras libres, et les mono et diglycérides sont les
principaux constituants des lipides du fruit de l’argousier. Leurs proportions et
compositions varient selon l’origine, la méthode d’extraction, la sous-espèce et le degré de
maturité des fruits, parmi d’autres facteurs (Yang & Kallio, 2005).
16
La teneur en TAGs totaux des fruits d’argousier oscille généralement entre 3 et 6%, malgré
qu’ils peuvent atteindre jusqu’à 14% dans certains cultivars russes (Li & Beveridge, 2003).
Chez les sous-espèces rhamnoides et sinensis, Yang et Kallio (2002) ont trouvé que la
teneur en TAGs des graines et des fruits entiers varia entre 5.7% et 13.0%, et entre 1.3% et
3.7% respectivement, tandis que chez la sous-espèce mongolica, Kallio et al. (2002a) ont
rapporté une teneur en TAGs d’environ 8.3% et 4.8% dans les graines et les fruits entiers
respectivement.
D’après Yang et Kallio (2001), les TAGs constituent 85 à 90% des huiles des graines et de
la pulpe du fruit de l’argousier. Manninen et al. (1995) ont rapporté que l’huile des graines
est constituée principalement de TAGs à indice d’acyle de 54 (environ 74% des TAGs
totaux), tandis que l’huile de la pulpe est constituée principalement de TAGs à indice
d’acyle de 48, 50 et 52 (environ 69% des TAGs totaux).
La teneur en phospholipides (PL) des graines et des fruits de l’argousier (sous-espèces
sinensis, rhamnoides et mongolica) oscille entre 0.4-1.0% et 0.1-0.4% respectivement
(Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; 2002). La phosphatidylcholine (PC), la
phosphatidyléthanolamine (PE), le phosphatidylinositol (PI), le phosphatidylglycérol (PG),
l’acide phosphatidique (PA), le lyso phosphatidylinositol (LPI) et la lyso
phosphatidylcholine (LPC) ont été identifiées dans les graines de l’argousier par
Isamukhamedov & Akramov (1982), qui ont en trouvé un contenu de phospholipides de
0.6%.
Le contenu de lipides polaires du fruit de l’argousier est de 8% dans les graines, 3.3% dans
la pulpe, et 8.9% dans la peau selon Li & Beveridge (2003). Les travaux récents de Pintea
et al. (2001), ont indiqué que les lipides polaires comprenaient des phospholipides (61%) et
des galactolipides (39%).
La composition en acides gras des classes des lipides des fruits d’argousier a été étudiée
depuis longtemps (Ul’chenko et al., 1995; Ozerinina et al., 1987; Zhmyrko et al. 1984;
Mamedov et al., 1981). Quelques données correspondant à la composition des TAGs et PL
17
des huiles des graines et de la pulpe d’argousier, sont présentées dans les Tableaux 1.7. à
1.10.
18
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1.1.3. Effets physiologiques des huiles de l’argousier L’argousier a été utilisé dans les médecines tibétaines et mongoles pendant plus de mille
ans pour le traitement de l’expectoration et de la toux, ainsi que pour améliorer la
circulation sanguine et le fonctionnement du système digestif (Yang & Kallio, 2002a). En
1977, le Département Chinois de Santé Publique a listé l’argousier dans le « Dictionnaire
des médecines chinoises » (Mingyu, 1994), et récemment le Ministère Chinois de la Santé a
classifié l’huile d’argousier dans la catégorie des aliments fonctionnels (Li & Beveridge,
2003).
Les effets physiologiques des huiles du fruit de l’argousier sont nombreux et la recherche
sur leurs utilisations médicinales est encore en développement. Yang & Kallio (2002a;
2005a), ayant fait une compilation exhaustive des effets physiologiques des lipides de
l’argousier, affirment que les effets antioxydants, les effets sur la peau et la muqueuse, les
effets sur des facteurs de risque des maladies cardiovasculaires, les effets sur les fonctions
immunes et les applications anticancéreuses, sont les principaux bienfaits des huiles du fruit
de l’argousier.
Les huiles des graines et de la pulpe d’argousier ont montré des effets positifs dans le
ralentissement du processus d’oxydation et dans la stabilisation de structures membranaires
(Rui & Gao, 1989; Gao, 2005), ainsi que des effets protecteurs contre les dommages de
tissu provoqués par intoxication chimique chez les modèles animaux (Wu & Meng, 2003).
Süleyman et al. (2002) ont montré qu’un extrait huileux du fruit d’argousier, mélangé avec
l’huile de maïs (1/1 v/v), pourrait être employé comme supplément diététique par les
personnes qui fument, afin d’empêcher le stress oxydatif causé par la nicotine.
Selon certaines études, l’huile et le jus d’argousier renferment des composés de nature
anticancéreuse (Xu et al. 2001). L’huile de graines a été employée comme traitement
auxiliaire à des patients avec différents cancers recevant la chimiothérapie (Li, 1993). Ce
traitement a fait augmenter le taux de transformation des lymphocytes et le taux de
21
formation de rosette E, et il a allégé les effets hémotoxiques et les perturbations gastro-
intestinales provoquées par la chimiothérapie (Li, 1993).
L’huile des graines d’argousier a aussi été utilisée avec succès comme traitement topique
pour les brûlures de la peau de premier et deuxième degré (Zhao, 1994). Le traitement avec
l’huile des baies d’argousier, extrait à l’hexane, a accéléré le processus curatif des blessures
de la peau des lapins, par rapport au traitement fait avec l’huile de tournesol (Mironov et
al., 1989). Chez les rats, l’huile des parties molles (pulpe et peau) d’argousier a montré des
meilleurs effets curatifs sur des blessures de la peau, que l’huile des graines (Mironov et al.,
1989).
D’autres études rapportent les effets des extraits des feuilles et du fuit de l’argousier sur la
guérison des blessures cutanées, ainsi que contre la toxicité à l’arsenic et contre les
dommages oxydants induits par la radiation, chez les rats (Gupta & Flora, 2006; Goel et al.,
2005; Gupta et al., 2005). Süleyman et al. (2001) ont rapporté les effets antiulcéreux d’un
extrait à l’hexane des fruits d’argousier chez le rat. Ils ont trouvé que ce type d’extrait
pourrait empêcher que des dommages gastriques se produisent.
Chez l’humain, les études de Yang et al. (1999; 2000), traitent des effets d’une
supplémentation diététique avec les huiles de la graine et de la pulpe de l’argousier sur la
dermite atopique. Ce traitement a donné des résultats encourageants. Johansson et al.
(2000) ont réalisé une étude afin d’évaluer les effets de l’huile de la pulpe de l’argousier sur
des facteurs de risque des maladies cardiovasculaires. Ils ont trouvé qu’une
supplémentation avec l’huile de la pulpe de l’argousier pourrait servir comme traitement à
des personnes qui présentent des tendances de coagulation sanguine, et qu’elle pourrait
aussi faire diminuer et empêcher l’agrégation plaquettaire, et par conséquent le risque de
maladies cardiovasculaires.
1.1.4. Industrie et produits à base d’argousier Malgré que l’utilisation de l’argousier en Europe et Asie soit connue depuis des siècles,
l’activité industrielle de l’argousier n’a débuté en Russie que depuis les années 40 (Li &
22
Beveridge, 2003). Les premiers produits ont fait partie de la diète des astronautes, qui ont
aussi utilisé des crèmes à base de l’argousier pour la protection de la radiation cosmique (Li
& Beveridge, 2003). C’est dans les années 80 que la Chine établit les premières plantations,
et à partir de 1982 près de 150 industries se sont établies, produisant environ 200 produits
(Li & Beveridge, 2003). Plus récemment, des industries se sont établies en Allemagne et
d’autres pays, incluant le Canada (Yakimishen, 2004).
Les produits faits à base de l’argousier occupent une place importante principalement dans
les industries pharmaceutique, cosmétique et alimentaire. En Chine et Russie, les fruits et
les huiles de l’argousier sont utilisées comme matières premières pour l’élaboration
d’aliments fonctionnels et d’ingrédients pour les médecines naturelles, ainsi que pour la
fabrication des produits cosmétiques (Yang & Kallio, 2005a).
Dans le cas des industries pharmaceutique et cosmétique, il est possible de trouver des
médicaments sous diverses formes (pilules, capsules, comprimés, poudres, aérosols,
liquides et liniments) lesquels peuvent servir au traitement de différentes maladies telles
que l’inflammation des muqueuses buccale, rectale et vaginale, l’érosion cervicale, les
lésions causées par les rayonnements, les brûlures, les ulcères duodénaux, gastriques et
cutanés (Li & Beveridge, 2003), ainsi qu’une grande variété de crèmes, pommades,
shampooings, savons, solutions topiques et protecteurs solaires.
L’industrie alimentaire comprend une large gamme de produits d’argousier, tels que les jus,
les liqueurs, la crème glacé, les bonbons, les confitures, les barres énergétiques, les vins et
les thés.
1.2 L’extraction d’huiles Les procédés d’extraction d’huiles varient largement selon la source d’où elles soient
issues. Dans le cas de graines et pulpes de fruits, cette opération se réalise principalement
par des méthodes mécaniques (extraction par pression), à l’aide de solvants (extraction par
solvants), ou par une combinaison des deux.
23
L’extraction par solvants est la méthode la plus largement répandue pour l’obtention
d’huiles issues de matériaux oléagineux. Il s’agit d’une opération de transfert de matière
impliquant le contact entre un solide qui contient le soluté, et un solvant qui le solubilise.
Elle comporte généralement une séquence de trois étapes: l’extraction de l’huile (faite par
des contacts successives entre le solvant et le solide), la désolvantation du solide (faite
généralement par chauffage à la vapeur), et finalement la récupération de l’huile de la
miscella (faite par évaporation et/ou distillation) (Figure 1.2.).
Matériau solide(Graines ou Baies)
Réduction du contenu eneau (Cuisson, Séchage)
Réduction de la taille(broyage, écrasement)
Solide lixivié Miscella(Solvant + Huile)
Distillation
Solvant Huile
Extraction par solvants
Nettoyage
Élimination des tracesdu solvant pour
utilisation postérieure
Figure 1.2. Schéma de l’opération d’extraction d’huiles par solvants.
Compte tenu du fait que l’extraction d’huiles est une opération très ancienne, elle a été
abondamment étudiée. Des nouvelles méthodes, telles que les extractions assistées par
micro-ondes ou par ultrason, l’extraction accélérée par solvants, l’extraction avec des
fluides supercritiques, et l’extraction assisté par des enzymes, ont été développées à petite
et grande échelle, afin de maximiser les rendements, de diminuer la consommation de
solvants, de réduire le temps d’extraction, de faire les opérations plus sélectives, et de
24
contribuer à la préservation de l’environnement. D’autre part, il est bien connu que les
rendements d’extraction et la qualité finale de l’huile sont affectés principalement par la
méthode d’extraction, le type et la quantité de solvant, la température, le temps d’opération,
la taille des particules et la teneur en eau du solide.
1.2.1. Préparation des matières premières Indépendamment de la méthode utilisée, l’extraction d’huiles comporte généralement
diverses opérations préliminaires, telles que le nettoyage, le décorticage, le broyage, la
floconnisation, la cuisson et/ou séchage, et dans certains cas la détoxication (Fils, 2000;
Williams, 1997). De ces opérations, le séchage revête une grande importance, vu qu’il
cause des changements physiques, chimiques et structuraux, qui affectent les propriétés de
transport et la qualité des produits (Okos et al., 1992).
1.2.1.1. Le séchage Le séchage est un procédé de conservation des aliments dont le but et d’éliminer la majorité
de l’eau qu’ils contiennent, afin que les microorganismes ne puissent plus se développer, et
pour ralentir la plupart des réactions de dégradation. Comme étape préliminaire à
l’extraction d’huiles, l’objectif du séchage est de réduire la teneur en eau jusqu’environ 2-
3%, pour favoriser les rendements d’extraction (Williams, 1997; Bernardini, 1983).
Le séchage est une opération complexe, dans laquelle les transferts de matière et chaleur se
produisent simultanément. Malgré qu’il puisse être réalisé par diverses méthodes, en
général tous les procédés de séchage peuvent être groupés dans trois catégories (Beaudry et
al., 2004): le séchage au soleil, le séchage sous conditions atmosphériques (y compris les
étuves, les tunnels de séchage, et les séchoirs à lit fluidifié, à micro-ondes, et par
atomisation), et le séchage sous conditions sub-atmosphériques (y compris le séchage sous
vide et la lyophilisation). D’après Flink & Knudsen (1987), le séchage à l’air et la
lyophilisation sont les méthodes les plus utilisées pour réduire la teneur en eau des produits
alimentaires solides.
25
1.2.1.1.1. Le séchage à l’air Dans une opération typique de séchage à l’air, le produit à déshydrater est placé dans un
environnement fermé, et mis en contact avec une courant d’air chaud. La chaleur, transmise
au produit principalement par convection, génère un gradient de température dans le solide,
causant l’évaporation de l’eau libre du produit, laquelle migre constamment vers la surface
(par diffusion et/ou écoulement capillaire, parmi d’autres mécanismes), pour être
postérieurement entraînée par l’air circulant (Menon & Mujumdar, 1987). Dans cette
première étape du processus, la vitesse de séchage, contrôlée principalement par les
propriétés physiques de l’air (la température, l’humidité et le débit), est généralement
constante (Chen & Johnson, 1969).
À la fin de la période de séchage à vitesse constante, l’eau libre n’arrive plus à la surface du
produit, et il commence une période à vitesse décroissante, toujours plus longue que celle à
vitesse constante. Dans cette deuxième période, la vitesse de séchage est gouvernée par les
propriétés physiques du solide, et les transferts de chaleur et de matière sont hautement
dépendants de la microstructure du produit (Aguilera & Stanley, 1999).
Le séchage à l’air est une méthode de déshydratation largement répandue à cause de sa
simplicité et des coûts de production relativement bas. Néanmoins, l’obtention de produits
secs non uniformes, les longues périodes de séchage, et les effets négatifs sur la qualité des
produits finaux sont ses principaux désavantages.
1.2.1.1.2. La lyophilisation La lyophilisation est une méthode de déshydratation qui consiste à éliminer par
sublimation, la majeure partie de l’eau contenue dans un produit. Cette opération se réalise
habituellement à des faibles conditions de pression et de température (au-dessous du point
tripe de l’eau), et comporte principalement deux étapes: la congélation et la déshydratation.
La congélation, normalement réalisée dans un appareil différente au lyophilisateur, joue un
rôle capital dans la lyophilisation, parce que la taille et distribution des cristaux de glace
formés, influencent le procédé de lyophilisation et la qualité du produit final. L’objectif de
26
cette première étape est de congeler l’eau libre du produit, laquelle constitue dans la plupart
des cas 70 à 90% de l’eau total. En général, une congélation rapide proportionne un produit
final de meilleure qualité, vu que l’on favorise la formation de petits cristaux de glace,
lesquels permettront de conserver mieux la structure du produit, prévenant son
effondrement pendant ou après la lyophilisation (Mellor, 1978).
L’étape de déshydratation recouvre deux principes physiques (Marin & René, 2000): la
sublimation des cristaux de glace formés durant la congélation (appelée déshydratation
primaire), et la désorption finale de l’eau non congelable (dénommée déshydratation
secondaire).
Le produit congelé est placé dans la chambre de séchage, d’où l’air est évacué
postérieurement à l’aide d’une pompe à vide. La sublimation se produit en fournissant de
l’énergie au produit congelé, et grâce à la différence de pression existant entre la pression
de vapeur d’eau du front de sublimation (interphase entre la couche sèche et la couche
congelée du produit) et la pression partielle de la vapeur d’eau dans la chambre de séchage.
L’énergie nécessaire pour atteindre la sublimation (chaleur latente de sublimation) est
fournie au produit congelé par conduction et/ou rayonnement, ou par l’irradiation des
molécules d’eau avec des micro-ondes (Barbosa-Cánovas & Vega-Mercado, 1996).
La désorption de l’eau contenue dans la surface interne du produit, commence quand il n’y
a plus de glace à sublimer, et la teneur en eau du produit correspond à l’eau partiellement
liée (entre 10 et 30%). Dans cette étape qui peut prendre plus d’un tiers de tout le cycle de
séchage, il est important de maintenir la température au-dessous de 30 à 50ºC, afin d’éviter
l’effondrement du produit (Barbosa-Cánovas & Vega-Mercado, 1996).
En bref, les étapes comportant le procédé de lyophilisation, peuvent se représenter tel
qu’illustré à la Figure 1.3.
Les produits lyophilisés sont très légers et poreux, et présentent une haute hygroscopicité et
une très faible teneur en eau. Ils peuvent être stockés presque indéfiniment à la température
ambiante, en évitant le contact avec l’oxygène, la lumière et la vapeur d’eau (Marin &
René, 2000; Mellor, 1978).
27
Figure 1.3. Étapes du procédé de lyophilisation (Adapté de Barbosa-Cánovas & Vega-
Mercado, 1996)
En raison de ses particularités, la lyophilisation occupe une place important parmi les
méthodes de séchage. Elle permet d’obtenir des produits finaux de haute qualité, lesquels
conservent leurs propriétés chimiques, physiques, biologiques et organoleptiques. La forme
et texture originales sont aussi conservées, vu que la transition de l’état congelé à l’état
déshydraté, en l’absence d’une forte proportion d’eau liquide, réduit les possibilités
d’altération (Marin & René, 2000). En plus, l’absence d’air et les faibles températures
d’opération, empêchent la croissance des micro-organismes et préviennent la dénaturation
des protéines, les modifications chimiques et le rancissement dû à l’oxydation (Mellor,
1978).
Or, les principaux désavantages de la lyophilisation sont reliés aux coûts énergétiques et au
temps de séchage (Liapis & Marchello, 1984). Le mode de fonctionnement sous vide, et les
faibles vitesses de déshydratation font de la lyophilisation une technique onéreuse, et en
conséquence elle ne s’applique que pour des produits ayant une grande valeur ajoutée.
1.2.1.1.3. Effets du séchage sur les propriétés des produits Outre la diminution de la teneur en eau, le séchage cause divers changements physiques,
chimiques et structuraux sur les produits. D’après King (1971) et Aguilera & Stanley
28
(1999), les principaux inconvénients qui peuvent altérer les produits au cours du séchage ou
durant leur stockage sont:
L’oxydation de lipides : La présence d’oxygène durant le séchage à l’air favorise
plus les réactions d’oxydation des lipides, par rapport à la lyophilisation.
Cependant, les produits lyophilisés possédant une grande surface spécifique et une
très faible teneur en eau, sont très susceptibles à ce type de détérioration. Le
stockage dans des emballages étanches à l’oxygène ou sous atmosphères contrôlées
(absence d’oxygène), permet de prévenir ce problème.
Le brunissement non enzymatique : Les réactions de brunissement non enzymatique,
communément appelées réaction de Maillard, désignent un ensemble complexe de
réactions impliquant des composés carbonylés ou des sucres réducteurs et des
composés aminés libres (protéines, acides aminés). Elles sont influencées par la
température, et entraînent généralement une modification de l’apparence, de la
flaveur et de la qualité nutritionnelle des aliments. Contraire au séchage à l’air, les
faibles températures d’opération et la transition relativement rapide d’un état
complètement hydraté à un état de faible teneur en eau, permettent de minimiser la
réaction de Maillard au cours de la lyophilisation.
Les réactions enzymatiques : Les réactions enzymatiques peuvent occasionner de
différentes manières la détérioration des produits alimentaires. Le brunissement
enzymatique, la scission des molécules d’amidon entraînant la production de sucres
simples, l’hydrolyse de pectines et de lipides sont quelques exemples. Ces réactions
sont favorisées par des teneurs en eau élevées, malgré qu’elles puissent se présenter
aussi à l’état congelé. Des traitements de blanchiment sont usuellement utilisés afin
de prévenir ce type de réactions.
Dénaturation de protéines : La dénaturation de protéines est un problème qui se
présente durant le séchage. Cet inconvénient, causé par les températures élevées (40
à 80ºC, dépendant de la protéine et du pH) et par des concentrations de sel élevées,
occasionne un faible taux de réhydratation, et des changements dans la texture du
29
produit. Par rapport à la lyophilisation, le séchage à l’air favorise plus la
dénaturation de protéines.
Changements microstructuraux : La perte de l’intégrité cellulaire et le
rétrécissement («shrinkage») sont des problèmes associées aux changements
microstructuraux des produits durant le séchage. Les effets du séchage sur la
microstructure des solides varient d’une méthode à l’autre. Par exemple, il est bien
connu que la qualité microstructurale des produits lyophilisés est nettement
supérieure à celle des produits déshydratés par d’autres méthodes, et que le
rétrécissement est habituellement beaucoup moins prononcé dans la lyophilisation
par rapport aux autres méthodes de séchage (Mellor, 1978).
1.2.2. Influence de la méthode de déshydratation sur l’extraction d’huiles Le séchage à l’air est la méthode de déshydratation la plus communément utilisé pour
ajuster la teneur en eau de graines et pulpes de fruits avant l’extraction de leurs huiles.
Malgré que d’autres méthodes de déshydratation ont été évaluées, l’information disponible
à ce sujet est vraiment limitée, et la plupart des études sont des applications aux huiles
essentielles.
Oomah et al. (1998) ont étudié les effets des séchages à l’air et par micro ondes sur le
rendement et la qualité de l’huile de pépins de raisins. Ils ont trouvé que le séchage par
micro ondes a fait augmenter significativement le rendement d’extraction, par rapport au
séchage à l’air (15.4% vs. 14.2%, p<0.05). L’indice de peroxyde et la viscosité des huiles
ont été plus élevés quand les pépins furent séchés par micro ondes. Or, pour ce qui
concerne les tocophérols et tocotriénols, les huiles dérivées des pépins séchés par micro
ondes ont présenté des contenus en α- et γ-tocophérol et en δ-tocotriénol plus élevés que
ceux trouvés dans les huiles issues des pépins séchés á l’air. Cependant, les contenus en β-
et δ-tocophérol, et en α- et γ-tocotriénol furent plus élevées chez les huiles issues des
pépins séchés à l’air. L’indice de saponification a été moins élevé chez les huiles dérivées
des pépins séchés par micro ondes (192.4 vs. 195.9).
30
Dans une étude récente, Díaz-Maroto et al. (2004) présentent les effets de trois méthodes de
séchage (séchage au four à 45ºC, séchage à l’air à la température de la pièce et
lyophilisation) sur les composants aromatiques et la structure des feuilles de basilic. Des
pertes de composants volatiles de 28.6%, 27.4% et 13.6% ont été trouvées après le séchage
au four, la lyophilisation et le séchage à l’air, respectivement. Le séchage a produit
d’importants changements structuraux aux feuilles de basilic. La structure des feuilles a
collapsée après les séchages au four et à l’air, tandis qu’après la lyophilisation ce
phénomène n’a pas été observé.
D’autres études ont aussi montré que la méthode de séchage exerce des effets significatifs
sur le rendement et la composition des huiles issues plantes aromatiques (Sefidkon et al.,
2006; Omidbaigi, et al., 2004; Raghavan et al., 1997; Deans & Svoboda, 1992).
1.3 Extraction des huiles de l’argousier Malgré le fait que l’extraction et l’utilisation des huiles de l’argousier soient des pratiques
très anciennes, l’information sur les méthodes d’extraction des huiles, et l’influence des
paramètres opérationnels n’est pas couramment disponible. Quelques brevets ont été cités
par Li & Beveridge (2003).
Les extractions avec des fins analytiques utilisent principalement des méthodes
traditionnelles. Quelques données rapportant des rendements typiques ont été présentées
précédemment (Tableaux 1.2. et 1.3.). Cependant, très peu des détails concernant les
conditions d’opération ont été rapportés, hormis quelques études récentes sur la
modélisation d’extractions avec le CO2 supercritique.
1.3.1. Extraction des huiles de l’argousier par pressage Très peu d’applications du pressage pour l’obtention des huiles de l’argousier sont
disponibles dans la littérature. L’extraction par pression, d’après Yang & Kallio (2002a),
n’est pas une méthode appropriée pour l’obtention de l’huile des graines, compte tenu de
son faible rendement par rapport aux coûts élevés des fruits. Cependant, la centrifugation et
31
décantation du jus obtenu après le pressage des fruits, constituent des méthodes efficaces
pour la séparation de l’huile de la pulpe.
Arumughan et al. (2005) ont rapporté des rendements élevés d’huile de pulpe (2.6-3.0% par
fruit frais), ainsi que du jus (75-80%), en utilisant le pressage suivi de centrifugation. En
utilisant une presse à vis, la majorité de la pulpe, et 80% du jus et de l’huile, ont été
récupérés dans la phase liquide. Le procédé ainsi développé pour ces auteurs, a permis la
séparation d’environ 70% de l’huile de pulpe, sans l’emploi des solvants organiques,
favorisant ainsi la conservation des molécules bioactives qu’y se trouvent.
L’huile des graines d’argousier cv. Indian-Summer a été obtenue par pressage avec des
rendements oscillant entre 3.3 et 3.8%w/w (Yakimishen, 2004). Des températures entre
63ºC et 70ºC, pour l’huile à la sortie de la presse, furent utilisées. Dans la même étude,
l’extraction par pressage de flocons de pulpe (teneur en eau entre 6.2-7.5%) n’a pas permis
la récupération d’huile.
Malgré l’indisponibilité d’information sur l’extraction des huiles de l’argousier par
pressage, quelques entreprises en Europe auraient produit des huiles issues de l’argousier
par cette méthode. Par exemple, Vlase et al. (2006) rapportent l’utilisation d’huile
d’argousier obtenue par pressage à froid, produit par la compagnie française Archimex.
D’autre part, diverses compagnies annoncent sur leurs sites Web, les huiles d’argousier
obtenues par pressage. C’est le cas par exemple de « Mountain Rose Herbs »
(http://www.mountainroseherbs.com/learn/oilprofile/sea_buckthorn.php) et « HR
Laboratories LLC » (http://www.hrlaboratories.com) dans les États-Unis, ainsi que
« Shokaty International Ltée » (www.shokaty.com) dans le Canada.
1.3.2. Extraction des huiles de l’argousier par solvants Les huiles des graines et de la pulpe de l’argousier ont été extraites il y a long temps, à
l’aide de différents solvants. Néanmoins, étant donné que les publications couramment
32
accessibles sont principalement reliées à des études de caractérisation des huiles ou de
différentes espèces et/ou cultivars, les effets des variables d’opération n’ont pas été étudiés.
Dans ce contexte, les solvants les plus utilisés sont ceux employés normalement dans les
méthodes standards, utilisant l’éther de pétrole, l’hexane et des mélanges de chloroforme et
méthanol comme solvants.
Mironov et al. (1980), ont réalisé des extractions selon la méthode de Soxhlet utilisant
l’hexane, l’éther de pétrole, et le chlorure de méthylène. Après 4–5 heures d’extraction ils
ont rapporté des rendements entre 22-23% et 32-34% en poids sec, pour les fruits et la
pulpe de l’argousier respectivement. Une étude de l’activité biologique de ces huiles, a
montré que celles-ci avaient une grande capacité pour la régénération intensive de lésions
de la peau chez les lapins et les rats.
L’éther de pétrole a été utilisé pour l’extraction des huiles des graines et de la pulpe de
fruits d’argousier de différentes espèces (Hippophaë rhamnoides ssp. sinensis, Hippophaë
goniocarpa, et Hippophaë neurocarpa) (Lu, 1999). La quantité d’huile obtenue oscillait
entre 9.77–14.15% et 29.04–32.10% pour les graines et la pulpe respectivement. L’espèce
neurocarpa est celle qui a présenté les valeurs les plus élevées en termes de rendement.
Yakimishen (2004) a réalisé l’extraction de l’huile des graines et de la pulpe d’argousier
(cultivar Indian-Summer), avec l’éther de pétrole, selon la méthode 02-01A de l’American
Association of Cereal Chemists. Les rendements des matériaux préalablement séchées à
l’air chaud (50ºC, 24 heures) furent de 8.2% et 11.9% (en poids frais) pour les huiles des
graines et de la pulpe respectivement.
L’éther diéthylique a été employé pour l’obtention de l’huile de fruits d’argousier séchés à
105ºC, durant 6–12 heures (Sabir et al., 2005). Dix grammes de fruits secs, furent soumis à
des extractions Soxhlet durant six heures, à des températures entre (30–40ºC). Les teneur
en huile, pour les graines et la pulpe, ont varié entre 7.7–13.7% et 17.8–29.1% (en poids
sec) respectivement.
33
Dans une étude concernant la production d’un ester concentré en acide palmitoléique, Klaas
& Meurer (2004) ont réalisé des extractions des fruits d’argousier du cultivar Leikora avec
le cyclohexane. Un rendement en huile de 20.2% par rapport à la peau du fruit fut
rapportée.
L’hexane a aussi été utilisé dans plusieurs études. Cakir (2004) a extrait avec l’hexane,
l’huile du mésocarpe et des graines de fruits d’argousier, par la méthode de Soxhlet durant
huit heures. Les extractions ont été protégées contre la lumière et le solvant fut évaporé à
pression et température réduites. Tsydendambaev & Vereshchagin (2003) ont utilisé
l’hexane pour l’extraction des huiles des graines de l’argousier, lors d’une étude de la
variation de la composition en triglycérides durant la maturation des fruits d’argousier (cv.
Dar Katuni).
Yin et al. (2005), ont rapporté une teneur en huile de 5.24% en poids sec, pour des graines
d’argousier extraites avec l’hexane à 343 K pendant 16 heures avec un ratio soluté:solvant
de 1:7 (m/v). Oomah et al. (2000) ont réalisé l’extraction de l’huile de la pulpe et des
graines de l’argousier de différents cultivars avec l’hexane. La pulpe, a été obtenue à partir
du jus par centrifugation à différentes vitesses (2500 et 12000 rpm) L’huile de la pulpe a
été récupérée par homogénéisation avec l’hexane (1:1 w/v). Les graines ont été soumises à
une extraction de trois heures (ratio 1:5 w/v). Ensuite, l’hexane a été évaporé et l’huile a été
mesurée par gravimétrie. Les résultats ont montré qu’à une vitesse de centrifugation élevée,
le rendement d’huile de la pulpe peut atteindre jusqu’à 49%, et que les caractéristiques et
composition des huiles varient selon le cultivar et la méthode d’obtention.
Un résumé des conditions et résultats d’opérations d’extraction des huiles de l’argousier
avec divers solvants, ainsi que leurs compositions en acides gras est présenté dans le
Tableau 1.11.
Les méthodes de Folch et al. (1957) et Christie (1982), lesquelles utilisent des mélanges de
chloroforme – méthanol comme solvant, ont été les plus utilisées dans les études portant sur
la caractérisation des huiles de fruits de l’argousier et leurs variations selon les différentes
espèces et origines (Ranjith et al., 2006; Tiitinen et al., 2005; Zadernowski et al., 2003;
34
Kallio et al., 2002; 2002a; Yang et Kallio, 2002; 2001; Pintea et al., 2005; 2001). Quelques
résultats obtenus par cette méthode, sont présentés dans le Tableau 1.12.
1.3.3. Extraction des huiles de l’argousier avec des fluides supercritiques L’extraction des huiles de l’argousier avec des fluides supercritiques (CO2), a déjà été
étudiée au niveau de laboratoire, et elle est aussi une technologie utilisée pour leur
production industrielle (Li & Beveridge, 2003) (Tableau 1.13.).
D’après Li & Beveridge (2003), le rapport de Stastova et al. (1996) constitue la seule
source de données des premières extractions des huiles de l’argousier avec le CO2
supercritique. Ces données indiquent que l’huile d’argousier a été extraite en Russie dès
1978 avec le CO2 en état liquide. L’extraction à contre courant à 20ºC et 5.7 MPa, durant 3-
3.5 heures, d’un mélange de flocons de pulpe et des grains séchés à l’air (45:55 en poids), a
eu un rendement variant entre 4–8% en poids. Les mêmes auteurs affirment, qu’en
Allemagne, la compagnie FLAVEX a extrait l’huile de fruits d’argousier d’origine
lituanien, à l’aide du CO2 à 40ºC et 35 MPa. Un rendement d’extraction de 16.5% en poids
a été rapporté.
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Stastova et al. (1996) ont étudié l’effet de différentes conditions d’opération sur le
rendement des extractions des huiles des graines et de la pulpe d’argousier, utilisant le CO2
supercritique. Dans cette étude, les graines, séparées mécaniquement du tourteau séché à
l’air, ont été moulues et extraites dans un appareil à extraction semi continu, en faisant
varier les pressions entre 9.6 et 27 MPa, et les températures entre 25 et 60ºC. Des
rendements d’extraction d’environ 50 g/kg et 85 g/kg ont été obtenus pour les graines et la
pulpe respectivement, à des conditions de 27 MPa et 40ºC, et avec un débit de CO2 de 1
L/min. L’huile de la pulpe a eu une solubilité dans le solvant plus élevée que l’huile de
graines, probablement dû à sa teneur en acides gras de chaînes plus courts. L’augmentation
de la température et de la pression a fait augmenter le taux d’extraction de l’huile.
Cependant, le paramètre qui a affecté le plus la quantité d’huile extraite, a été la taille des
particules. Les particules plus fines ont fourni les plus grands rendements. Les principaux
composants des huiles furent les triglycérides (76-92%), tandis que la teneur en acides gras
libres a oscillé entre 1-4%.
D’autres travaux d’extraction des huiles de l’argousier avec le CO2 supercritique, incluent
ceux de Derevich & Shindyapkin (2004), qui ont rapporté une efficacité d’extraction
d’environ 70% pour l’extraction des graines d’argousier à 35ºC et 48 MPa. Yin et al. (2005;
2003) utilisant des conditions optimales (pression d’opération entre 20 et 30 MPa,
température d’extraction entre 35-40ºC, débit de CO2 entre 0.15-0.3 m3/h, et temps
d’extraction entre 4-5 heures) rapportèrent un rendement d’extraction de l’huile de graines
d’environ 90%. Une composition élevée en acides linoléique (40.1%), linolénique (26.7%)
et oléique (21.8%), semblable à celle obtenue par Kallio et al. (2002; 2002a) et Yang et
Kallio (2002; 2001) en utilisant un mélange de chloroforme – méthanol comme solvant, a
été rapportée.
Yakimishen (2004) a réalisé l’extraction des huiles de l’argousier, cultivar Indian summer,
avec le CO2 supercritique à 45ºC et 35 MPa. Pour cette fin, les fruits ont été pressés, et le
tourteau placé en couches de 20 mm d’épaisseur a été séché á l’air durant 24 heures à 50ºC.
Après le séchage, les graines séparées de la pulpe à l’aide d’un vibrateur et nettoyées avec
de l’air comprimé, étaient moulues durant 10 et 30 secondes avant l’extraction. Après six
40
heures d’opération, cette approche a permis l’extraction du 37%, 65.1% et 86.3% des huiles
des graines moulues durant 10 et 30 secondes, et de la pulpe, respectivement. Pour des
temps d’extraction plus courts (3 heures), l’efficacité de l’opération représentait 90% par
rapport au rendement obtenu durant 6 heures. Cependant, une diminution de 50% du
volume de CO2 fut observée.
1.3.4. Extraction enzymatique des huiles de l’argousier Les travaux d’extractions enzymatiques des huiles de l’argousier sont quasiment
inexistants. Le seule étude, partiellement disponible, est celui de Nikolov & Heilscher
(2002). Dans ce travail, les fruits ont été soumis à des traitements de tamisage (0.6 mm) ou
ultrafiltration (membrane de polysulfone de 100 kDa) et traités avec deux préparations
enzymatiques (Novozyme AP ou Rohapect D5L) durant 24 h à 20 et 50°C. L’ultrafiltration
et le traitement enzymatique à 50ºC ont donné les meilleurs résultats, indépendamment du
type d'enzymes. Ainsi, ce procédé à permis récupérer 97-99% du jus et 1-3% d’huile.
1.3.5. Extraction aqueuse des huiles de l’argousier Les études des extractions aqueuses des huiles d’argousier ne sont pas très nombreuses. Les
travaux récents de Yakimishen (2004) constituent la seule référence disponible pour le
cultivar Indian-Summer. Les graines moulues furent soumises à l’extraction à 70ºC avec
l’éthanol au 40% (ratio 2.5:1 solvant/graines) durant deux heures. Cependant, après de
centrifuger et séparer la phase liquide, aucune huile n’a été récupérée. L’huile de la pulpe
fut récupérée après deux étapes. Dans la première, l’huile a été obtenue après la
centrifugation des fruits macérés et chauffés à 45ºC durant une heure. Dans la deuxième, le
jus obtenu après la centrifugation de la première étape, fut extrait avec l’éthanol (95-99%,
2/1 v/v) durant deux heures à 70-80ºC. Avec ce procédé, le rendement en huile de la pulpe
a été 0.13%w/w.
D’autres méthodes d’extraction des huiles du fruit de l’argousier utilisent le mélangeage et
chauffage (60ºC durant 48 heures) de la pulpe ou des fruits avec l’huile de tournesol, suivi
41
d’une séparation par pressage (Mironov, 1980). Le Tableau 1.14. résume quelques
méthodes d’extraction cités par Li & Beveridge (2003).
Tableau 1.14. D’autres méthodes d’extraction des huiles du fruit de l’argousier (Adapté de Li & Beveridge, 2003)
Méthode Caractéristiques Avantages - Désavantages Référence
Extraction par solvants avec Dichlore–difluor- méthane
Séchage des fruits jusqu’à une teneur en eau de 1.2 - 1.5%. Taille des particules : 500 µm Pression d’opération : 0.6 MPa Durée de l’extraction : 2-2.5 heures
Teneur en caroténoïdes de 500 mg %. Résidus de solvant inacceptables dans les aliments.
Arkhipova et al. (1995)
Extraction par composants floculants et solvants organiques
Ajouter des composants floculants à l’huile extraite de la pulpe, et enlever le précipité. Déshydratation de l’huile avec sulfate de sodium anhydre. Réextraction de l’huile à l’aide de benzène. Filtration.
Résidus de solvant inacceptables dans les aliments.
Horvarth et al. (1994)
Extraction méchanique
Congélation des fruits entre -22 et -27ºC durant 3-4 jours. Décongélation et fermentation prolongée durant 2-3 jours à 60-65ºC, suivi de la séparation du jus. Séchage de la pulpe avec agitation permanente. Séparation de l’huile de la masse sèche par centrifugation.
Coût élevé. Procédé très long. Rendement faible.
Nizhegorodtsev et Umanskii (1991)
Mélange avec huiles végétales
Mélange continu de la pulpe broyée avec des huiles végétales, et postérieure séparation de l’extrait huileuse.
Mélange d’huiles avec un contenu élevé en caroténoïdes.
Bekaso (1992), Gavrishin et al. (1990)
Mélange avec des huiles végétales et traitement ultrason
Mouture des fruits et séparation des graines intactes. Les fruits sont mélangés à l'huile végétale préchauffée à 50-60 ºC, et un traitement avec des ultrasons est appliqué, pour faciliter la séparation de l'huile dans les étapes postérieures.
Mélange d’huiles sans résidus chimiques.
Gorunzhina et al. (1990). Kesariiski et al. (1990)
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Chapitre 2
Hypothèses et objectifs de recherche
2.1. Hypothèses L’application de différentes méthodes de déshydratation, comme étape de prétraitement des
fruits d’argousier, aurait un effet sur le rendement de l’extraction de leurs huiles.
L’absence d’oxygène durant la lyophilisation serait un facteur qui contribuerait à améliorer
la qualité des extraits lipidiques des fruits d’argousier.
2.2. Objectif général Comparer les effets de la lyophilisation et du séchage à l’air, comme des opérations de
déshydratation des fruits d’argousier, sur le rendement d’extraction et la qualité de leurs
huiles, en utilisant l’hexane comme solvant.
2.3. Objectifs spécifiques
• Déterminer les rendements d’extraction des huiles des graines et de la pulpe de
l’argousier séchés à l’air chaud et lyophilisés, et analyser les différences causées par
ces deux méthodes de déshydratation.
• Étudier les effets de la température et du ratio soluté/solvant, sur les rendements des
extractions, utilisant l’hexane comme solvant. Analyser les données et déterminer
les conditions d’extraction optimales.
• Analyser par chromatographie gazeuse les huiles issues des graines et de la pulpe de
l’argousier séchés à l’air et lyophilisés, pour déterminer leur composition en acides
gras et leur contenu en triglycérides, et établir les différences par rapport à la
méthode de déshydratation.
51
• Fractionner les lipides à l’aide de l’extraction en phase solide, et déterminer la
composition en acides gras de chacune des fractions obtenues.
• Déterminer les profils de fusion des huiles et leurs teneurs en gras solide (SFC) en
fonction de la température, en utilisant la calorimétrie différentielle à balayage
(DSC).
• Estimer l’état d’oxydation des huiles, à l’aide de l’indice de peroxyde.
• Comparer les données obtenues avec ceux rapportées pour d’autres espèces et sous-
espèces.
Chapitre 3
Effects of Drying Method on the Extraction Yields and Quality of Oils from Sea Buckthorn (Hippophaë
rhamnoides L.) Seeds and Pulp
Luis-Felipe Gutiérrez, Cristina Ratti and Khaled Belkacemi*
Soils and Agri-Food Engineering Department, Nutraceuticals and Functional Foods Institute (INAF), Université Laval, Québec, G1K 7P4, Canada
*Corresponding author. Phone: 418-656-2131, ext. 6511. Fax: 418-656-3327. E-mail: [email protected]
Submitted to Food Chemistry
Ce chapitre, rédigé sous forme d’article décrit les travaux réalisés et les résultats obtenus,
concernant les effets de deux méthodes de séchage (lyophilisation et séchage à l’air chaud)
sur les rendements d’extraction et la qualité des huiles obtenues des fruits de l’argousier,
utilisant l’hexane comme solvant.
3.1 Résumé Les huiles d’argousier (Hippophaë rhamnoides L.) ont été reconnues pour leurs propriétés
nutraceutiques. Les effets du séchage à l’air et de la lyophilisation sur les rendements
d’extraction et la qualité des huiles des graines et de la pulpe d’argousier (cv. Indian-
Summer) ont été étudiés. Les extractions ont été effectuées en utilisant l’hexane. Les
graines séchées à l’air et celles lyophilisées ont donné des rendements d’extraction
semblables (∼12% p/p), tandis que des différences significatives ont été trouvées entre les
rendements d’extraction des pulpes séchées à l’air et lyophilisées (35.9±0.8 contre
17.1±0.6% p/p). L’analyse des acides gras a révélé que les acides α-linolénique (37.2-
39.6%), linoléique (32.4-34.2%) et oléique (13.1%) furent les principaux acides gras
trouvés dans les extraits des graines, alors que les extraits des pulpes furent riches
principalement en acides palmitoléique (39.9%), palmitique (35.4%) et linoléique (10.6%).
Le fractionnement des huiles brutes, fait par extraction en phase solide, a donné
53
principalement des lipides neutres (93.9-95.8%). Les indices de peroxyde des huiles des
graines et des pulpes furent d’environ 1.8 et entre 3.0 et 5.4 meq/kg, respectivement. Les
profiles de fusion des huiles ont été caractérisé par calorimétrie différentielle à balayage.
Le protocole expérimental de ce projet s’est divisé en trois étapes, comme le montre la
Figure 3.1.: Le prétraitement des fruits, l’extraction des huiles, et finalement, leur
caractérisation.
Fruits d'argousiercongelés
Broyage
Lyophilisation
Broyage
Séchage à l'air chaud
Tamisage
GrainesPulpe
Broyage
Broyage
Tamisage
GrainesPulpe
BroyageCon
ditio
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xtra
ctio
n de
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les
Car
acté
risa
tion
des h
uile
s
Pulpelyophilisée
lixiviée
Opération deséparation du solvant
SolvantHuile de la
pulpelyophilisée
Extraction avecl'hexane
Miscella dela pulpe
lyophilisée
Graineslyophilisées lixiviées
Miscellades graineslyophilisées
Pulpeséchée à
l'air lixiviée
Miscella de lapulpe séchée
à l'air
Grainesséchées à
l'air lixiviées
Miscella desgraines
séchées à l'air
SolvantHuile desgraines
lyophiliséesSolvant
Huile de lapulpe séchée
à l'airSolvant
Huile desgraines
séchées à l'air
Analyse des huiles
Compositionen acides gras
Compositionen
triglycérides
Propriétés defusion et SFC
Indice deperoxyde
Fractionnementdes lipides
Extraction avecl'hexane
Extraction avecl'hexane
Extraction avecnl'hexane
Opération deséparation du solvant
Opération deséparation du solvant
Opération deséparation du solvant
Broyage Broyage
Figure 3.1. Méthodologie suivie pour extraire et caractériser les huiles de l’argousier.
54
3.2 Abstract The effects of air-drying and freeze-drying on extraction yields and quality of oils from sea
buckthorn (cv. Indian-Summer) seeds and pulp were studied. Oil extractions were carried
out using hexane. Air-dried (ADS) and freeze-dried (FDS) seeds, gave a similar extraction
yields (∼12%w/w), whereas those of air-dried (ADP) and freeze-dried (FDP) pulps were
significantly different (35.9±0.8 vs. 17.1±0.6%w/w). Fatty acid analysis revealed that α-
linolenic (37.2-39.6%), linoleic (32.4-34.2%) and oleic (13.1%) acids were the main fatty
acids in seed oils, while pulp oils were rich in palmitoleic (39.9%), palmitic (35.4%) and
linoleic (10.6%) acids. Lipid fractionation of crude oils, obtained by solid phase extraction
(SPE), yielded mainly neutral lipids (93.9-95.8%). The peroxide values of seed and pulp
oils were circa 1.8 meq/kg and between 3.0-5.4 meq/kg respectively. The melting behavior
of oils was characterized by differential scanning calorimetry (DSC).
Keywords: Sea buckthorn, Hippophaë rhamnoides, oil extraction, freeze-drying, air-
drying, melting profiles, fatty acids, triglycerides, solid phase extraction.
3.3 Introduction Sea buckthorn berries are rich in vitamins, carotenoids, flavonoids, proteins, antioxidants,
amino acids, essential fatty acids, and phytosterols (Beveridge, Li, Oomah & Smith, 1999).
The most valuable components of the berries are their oils. Both seeds and berry pulp have
high total lipid content, including tocopherols, tocotrienols, carotenoids and two essential
fatty acids: ω-3 and omega-6 (Yang & Kallio, 2002). The composition of the sea buckthorn
seed and pulp oils vary according to the subspecies, origins, cultivation activities,
harvesting time of the berries, and the extraction method (Yang & Kallio, 2002a). The seed
oil is highly unsaturated, with proportions of linoleic (C18:2n-6) and α-linolenic (C18:3n-
3) acids between 30-40% and 20-35% respectively, whereas the pulp oil is more saturated
containing high amounts of palmitoleic (C16:1n-7, 16-54%) and palmitic acids (C16:0, 17-
47%) (Yang & Kallio, 2002).
55
Solvent extraction using hexane and supercritical CO2 extraction are among the main
methods used for sea buckthorn oil extraction, although aqueous extraction and pressing are
also used. Recently, Yakimishen, Cenkowski, & Muir (2005) reported for sea buckthorn
berries cv. Indian-summer, seed oil recoveries of 7.2% and 4.5% using supercritical CO2
extraction and screw pressing respectively, and a pulp-flake oil recovery of 17% for
supercritical CO2 extraction. Moreover, low recovery of pulp oil (1.2%) was obtained by
aqueous extraction.
Oil extraction involves various preliminary operations, such as cleaning, dehulling, drying
and grinding. However, the total amount of extracted oil depends mainly on the extraction
time and temperature, moisture content and particle size of the oil-bearing materials. The
greatest amount of oil is extracted during the first 20 minutes of extraction, and as moisture
content decreases, oil recovery increases (Bernardini, 1982).
Drying methods have different effects on microstructure and quality of dehydrated
products. Freeze-dried food materials remain a benchmark quality because of the structure
preservation during removing water (Aguilera, Chiralt & Fito, 2003), contrary to the
significant structural changes caused by air-drying. Oomah, Liang, Godfrey, & Mazza
(1998) studied the effects of microwave-drying and air-drying on the physical and chemical
properties of oil from grape seeds. They found that microwave drying increased oil yield,
viscosity, peroxide value and conjugated dienes, whereas p-anisidine and saponification
values were reduced. Other studies have showed that drying methods have significant
effects on oil extraction efficiency, physical properties and chemical compositions of
aromatic plants (Raghavan, Rao, Singh & Abraham, 1997; Omidbaigi, Sefidkon & Kazemi,
2004; Hsu, Chen, Weng, & Tseng, 2003).
The effects of dehydration method, as a pretreatment operation to oil extraction, on
extraction yields and quality from sea buckthorn berries have hardly been investigated.
Therefore, this research aimed to evaluate these effects for two drying methods: air-drying
and freeze-drying.
56
3.4 Materials and methods
3.4.1 Berries Sea buckthorn berries (Hippophaë rhamnoides L. cv. Indian-Summer) from Sainte-Anne-
de-Beaupré (Québec, Canada) were hand-cleaned and stored at -30ºC in sealed plastic bags
until the beginning of the experiments. Before drying, batches of 400 g of frozen berries
were ground only for 60 s to avoid possible seed damage, using a blender (model PR200B,
General Electric, USA).
3.4.2 Air-drying experiments Frozen ground berries were placed in a perforated drying tray. Starting with approximately
900 g berries, air-drying experiments were conducted at 50ºC and 1.0 m/s air velocity for
24 h, using a laboratory tray drier (Model UOP8-G, Armfield, Hampshire England). The
dried product was crushed in a mortar to facilitate the separation of seeds from the pulp.
Special caution was kept to avoid seeds damage. A 10 mesh (2 mm) sieve (Canadian
Standard Sieve Series, W.S. Tyler, St Catharines, ON, Canada) was used to separate most
seeds from dried pulp. Pulp residues adhered to seeds, were hand-separated and crushed in
a mortar. Air-dried seeds were cleaned and subsequently milled using a disc-grinder (Type
C/11/1, GlenMills Inc., Clifton, New Jersey, USA). Particle size distribution was measured
using a sieve shaker (model 41314, Retsch Inc., Newtown, PA, United States). Both air-
dried pulp (ADP) and seeds (ADS) were stored at -20ºC in plastic containers until oil
extraction.
3.4.3 Freeze-drying experiments Frozen ground berries were laid in layers of approximately 2-cm thickness in aluminum
trays covered with perforated aluminium paper. Freeze-drying experiments were carried out
in a freeze-drier (model Ultra 25 LE, Virtis, Gardiner, NY, USA) at constant temperature of
50ºC for 24 h, under vacuum pressure of 0.0145 kPa and a condenser temperature of -48ºC.
57
After freeze-drying, the samples were immediately stored under vacuum in plastic bags,
using a vacuum apparatus (Model 350, SIPROMAC Inc., St-Germain, QC, Canada), until
sieving under an anhydrous atmosphere in an Atmos-bag (model Z106089-1EA, Aldrich
Atmosbag, Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada). Freeze-dried samples were sieved using
a 10 mesh screen allowing the separation of seeds from the pulp and obtaining uniform size
pulp particles. Freeze-dried seeds were cleaned manually and subsequently milled, sieved
and stored as described above for air-dried seeds.
3.4.4 Total lipid content of starting materials Total lipids were extracted from ground materials using the chloroform-methanol
extraction procedure adapted from Christie (1982). Dried samples were homogenized for 5
min with chloroform/methanol (1:1 v/v) in proportion 1/10 m/v. The mixture was filtered,
and the obtained solid residue homogenized with chloroform in proportion 1/5 m/v for 5
min. The filtrate was transfered into a separatory funnel and the solid was extracted once
again under the same conditions and filtered. Distilled water was added to the combined
filtrates and the resulted mixture was thoroughly shaken and settled overnight. The lower
layer containing the lipids was removed from the funnel, and subsequently, the solvent was
evaporated on a rotary film evaporator (Büchi R-205, Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois
USA). The obtained crude lipid extracts were collected, evaporated under nitrogen,
weighed, and stored in sealed amber glass vials at -20ºC until lipid analysis.
3.4.5 Oil extraction with solvent Oil extraction was conducted at 30, 40, 50 and 68ºC using hexane as solvent and three solid
to solvent ratios (R): 1/4, 1/7 and 1/14 m/v. A Soxhlet extractor was used for the
extractions carried out at 68ºC, whereas extractions at 30, 40 and 50ºC were achieved in
sealed erlenmeyer flasks under continuous agitation (400 rpm) for 24 h, using a
thermoregulated bath. After the extraction process, the flask contents were filtered under
vacuum, and the liquid fraction containing lipid extract and solvent was poured into a 500-
mL flask of a rotary film evaporator to remove the solvent. The extracts were treated as
58
described above for total lipid content. For each dried product, the oil extraction yield
(%w/w) and the extraction efficiency were calculated using Eq. 1 and 2 respectively.
( ) ( )( ) 100
×−
=gmaterialbearingoilofMass
goilextractedofMass%yieldextractionOil (Eq. 1)
contentlipidTotalyieldextractionOilefficiencyExtraction
= (Eq. 2)
3.4.6 Analytical methods
3.4.6.1 Melting profiles Melting profiles of the seed and pulp oils were determined using a differential scanning
calorimeter (Pyris 1 DSC, Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) equipped with an intracooler
II (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA). The system was purged during analysis with
nitrogen at 30 mL/min. DSC melting curves were performed within the temperature ranges
of -60 to 30ºC and -50 to 50ºC for seed and pulp oils respectively. Samples (10-20 mg)
were cooled and held at the lowest temperatures for 5 min and then heated at 4ºC/min. An
empty pan was used as inert reference to balance the heat capacity of the sample pan.
Calibration of DSC was carried out using indium (mp=156.6ºC, ∆Hf =28.71 J/g). Data were
analyzed using thermal analysis software (Pyris 1 Version 3.5, Perkin Elmer). The solid fat
index (SFI) was determined from the DSC melting curves by sequential integration of peak
areas (Deroanne, 1977; Lambelet, 1983).
3.4.6.2 Lipid fractionation Separation of individual lipid fractions was achieved using solid-phase extraction (SPE)
cartridges (Bakerbond SPE amino [NH2] disposable extraction columns,J.T. Baker Inc.,
Phillipsburg, NJ, USA) as described by Oomah, Ladet, Godfrey, Liang, & Girard (2000).
The cartridges were preconditioned with 2-mL methanol, 2-mL chloroform, and 4-mL
hexane before use. Lipid fractions were recovered by sequential elution under vacuum with
59
4-mL each of chloroform/isopropanol (2/1, v/v), diethyl ether/acetic acid (95/5, v/v), and
methanol, to separate neutral lipids, free fatty acids and phospholipids, respectively. The
collected eluted fractions were evaporated under nitrogen, weighed, and stored at -20ºC for
subsequent fatty acid analysis.
3.4.6.3 Fatty acid composition The fatty acid composition of the oil extracts was determined by GC. Seed and pulp oils
were converted into their methyl esters (FAME) and analyzed on a 5890 series II gas
chromatograph (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). The oven temperature was programmed
as follows: from 60ºC (isothermal for 1 min) to 190ºC at 20ºC/min, and isothermal period
of 30 min at 190ºC. The injector and detector temperatures were set at 250°C. Hydrogen
was used as carrier gas. GC separation peaks was performed on a BPX-70 capillary column
(60 m×0.25 mm i.d.×0.25 µm film thickness; SGE, Melbourne, Australia). Fatty acids were
identified by comparing their retention times with those of the FAME standards purchased
from Nu Chek Prep (Elysian, MN, USA) under the same conditions. Peaks were integrated
using Hewlett-Packard ChemStation software.
3.4.6.4 Triglyceride composition A gas chromatography (GC) method was used for the determination of the triglyceride
composition (TAG) of the oil extracts. Seed and pulp oils were dissolved in octane and
analyzed on a 5890 gas chromatograph (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). The oven
temperature was programmed as follows: from 250ºC to 350ºC at 1.5ºC/min, from 350ºC to
360ºC at 0.5ºC/min, and isothermal period of 90 min at 360ºC. Injector and detector
temperatures were set at 400°C. Hydrogen was used as carrier gas. The GC separation
method was performed on a RTX-65TG capillary column (30 m×0.25 mm i.d.×0.1 µm film
thickness; Resteck, Bellefonte, PA, USA). The identification of the peaks was achieved by
comparing their retention times with those of the standards purchased from Nu Chek Prep
(Elysian, MN, USA) and Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, MO, USA) under the same
conditions. Peaks were integrated using Hewlett-Packard ChemStation software.
60
3.4.6.5 Peroxide value Peroxide values of the extracted oils were determined according to Official methods of the
AOCS (1993) (AOCS Recommended Practice Cd 8b-90).
3.4.6.6 Scanning electron micrographs Microstructure observations of ADP and FDP were carried out using scanning electron
microscopy (JEOL, Model JSM-6360LV, Tokyo, Japan) operated under vacuum at an
accelerating voltage of 30 kV.
3.4.7 Statistical analysis All assays were carried out at least in duplicate. Analysis of variance by the general linear
models (GLM) procedure and mean comparisons by the least significant difference (LSD)
test were performed using the Statistical Analysis System (SAS Institute, 2000).
3.5 Results and discussion
3.5.1 Moisture content of the sea buckthorn materials. Moisture content of fresh pulp and seeds were 87.6±0.0% and 5.5±0.2% respectively. After
drying operations the average values of moisture content were 2.6±0.2% and 1.5±0.3% for
ADP and FDP respectively, while no significant effects were found on the moisture content
of seeds, in comparison to their initial value.
3.5.2 Total lipid of the sea buckthorn materials Chloroform-methanol extraction was used to determine the total lipid content of the starting
materials. Significant differences were found between the total lipid content of ADP and
FDP (35.8±0.8 vs. 16.4±0.5%w/w, p<0.001), whereas no significant differences were
61
observed for ADS and FDS (11.1±0.0 vs. 13.1±0.8%w/w). Results of lipid content of seeds
are in agreement with those reported by Yakimishen (2004) for the cultivar Indian-summer,
and by Kallio, Yang, Peippo, Tahvonen, & Pan (2002) and Yang & Kallio (2001) for the
subspecies mongolica and rhamnoides. The lipid content of FDP was at the lower end of
the expected range reported previously by Yang & Kallio (2002) for different subspecies of
Hippophaë rhamnoides, whereas lipid yields from ADP were at the higher up of these
reported values (Table 3.1).
Table 3.1. Lipid content in sea buckthorn dry pulp of different subspecies of Hippophaë rhamnoides
Subspecies Lipid content (%) Ref.
16.4±0.5a, 35.8±0.8b This work Indian-summer
19.7±2.3 (Yakimishen, Cenkowski, & Muir, 2005)
Caucasica 23-34 (Yang & Kallio, 2002)
Turkestanica 18-34 (Yang & Kallio, 2002)
Mongolica 16-28 (Yang & Kallio, 2002)
Sinensis 4-20 (Yang & Kallio, 2002)
Rhamnoides 16.6-18.9 (Yang & Kallio, 2001) a FDP, b ADP.
Differences in the lipid content of sea buckthorn berries may be attributed to the different
subspecies, geographical and climate conditions, harvesting time of the berries, as well as
the extraction method (Yang & Kallio 2002a). Nevertheless, the marked difference between
oil recovery from ADP and FDP found in this work could be due to the drying effects on
pulp cellular microstructure. Figures 3.2a and 3.2b show the scanning electron micrographs
of air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, respectively. As evidenced, air-drying (Figure
3.2a) caused significant structural changes on pulp cells, contrary to freeze-drying (Figure
3.2b). It can be observed that the size and shape of air-dried pulp cells were irregular while
freeze-dried pulp cells exhibited a regular shape and size. Moreover, the diameter and
perimeter of ADP cells were larger than FDP cells. Air-drying caused breakage and
62
destruction of cell walls, and consequently large cavities and intercellular spaces were
formed. On the other hand, no broken cell walls were observed in freeze-dried pulp. Since
mass-transfer through the solid matrix is usually the rate-controlling step in food
extractions (Aguilera & Stanley, 1999), and because of the almost negligible cellular
damage of FDP, the resistance to oil diffusion is bigger than in ADP. This behavior could
explain the differences found in oil recoveries from ADP and FDP.
( a )( a ) ( a )( a )
( b )( b ) ( b )( b )
Figure 3.2. Scanning electron micrographs of: (a) air-dried
(ADP) and (b) freeze-dried (FDP) sea buckthorn pulps.
3.5.3 Oil extraction using solvents Sea buckthorn seed and pulp oils were bright yellow and dark red respectively. Both oils
were liquid at room temperature. The pulp oil was more viscous than seed oil. This could
be ascribed to its more saturated nature, as it will be shown later. Extraction yields of oils
63
from ground seeds and pulps were primarily monitored over time at 68ºC, using the Soxhlet
extractor with a solid to solvent ratio R of 1/4. The Figure 3.3 depicts the oil extraction
kinetics from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps. Once again, the oil
recovery from ADS and FDS was similar, whereas the oil extraction yield obtained from
air-dried pulp was more than two folds of that attained from freeze-dried pulp. The air-
drying process introduced some structural changes in the shape of cells, and even destroyed
them, allowing to the cellular substances, including lipids to be easily extracted. In contrast,
the regular structure of FDP cells exerted a transfer resistance to an adequate diffusion of
the solvent through the cell membrane.
Extraction time (min)
0 50 100 150 200 250
Extr
actio
n yi
eld
(% w
/w)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
FDP ADPADSFDS
Figure 3.3. Oil extraction kinetics from air-dried and freeze-dried sea buckthorn seeds and
pulps using the Soxhlet extractor with hexane (R=0.25 g/mL).
64
As depicted in Figure 3.3, extractions reached equilibrium at about 4 hours. This extraction
time was then chosen to evaluate the effect of solid to solvent ratio on oil extraction yields
from air- and freeze-dried materials using the Soxhlet extractor (Table 3.2). There was a
slight increase in the extraction yield from ADS as the R ratio decreased from 1/4 to 1/14
g/mL (11.2±0.1 vs. 12.4±0.1 %w/w, p<0.05), whereas this ratio did not show significant
differences on oil extraction yields from FDS, FDP and ADP, where their average values
were 13.1±0.9, 17.1±0.6 and 35.9±0.8 %w/w, respectively. These results did not differ
significantly from those obtained with chloroform-methanol, indicating a low content of
polar lipids, such as phospholipids, in the investigated sea buckthorn materials.
Table 3.2. Oil recoveries from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulp using the Soxhlet extractor with hexane during 4 hours, over various solid to solvent ratios a
Oil recovery (% w/w) R
(g/ml) FDS ADS FDP ADP
1/4 12.1±0.6a 11.2±0.1a 16.4±0.7a 35.9±3.9a
1/7 13.7±0.2a 11.9±0.3b 17.2±0.1a 35.2±1.7a
1/14 13.5±0.4a 12.4±0.1b 17.6±0.0a 36.7±2.9a a Means in a column followed by the same letter are not significantly different by LSD test at the 5% level.
To investigate the temperature effect on the extraction efficiency of oils, equilibrium data
were obtained at 30, 40 and 50ºC, after extraction times of c.a. 24 h. For each temperature,
the dried sea buckthorn materials were mixed continuously with hexane in sealed
erlenmeyer flasks, using 3 levels of R (1/4, 1/7 and 1/14 g/mL). The results indicated that
extraction efficiency of oils increased with the increase of temperature and with the
decrease of R, as illustrated in Figure 3.4 for FDP. However, the effect of R was more
marked than the effect of temperature. When R values decreased, the effect of temperature
became less important. Table 3.3 presents the effects of variation of temperature and solid-
to-solvent ratio on the extraction efficiency of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn
seeds and pulps. As seen in this Table, there was only an average 4%-increase in the oil
65
extraction efficiency from ADP when the temperature increased from 30 to 50ºC, while this
increase was about 15% (p<0.05) when R decreased from 1/4 to 1/14 g/mL. Thus, contrary
to Soxhlet extraction, where the oil recoveries were practically not affected by R ratio
because of the occurrence of better mass transfer features during the extraction process,
extractions carried out in erlenmeyer flasks were more dependent on R ratio than the
temperature. Thus, to obtain high yields (greater than 90% of extraction efficiency), and
prevent the negative effects of high temperatures on lipids and other valuable components,
oil extractions from sea buckthorn seeds and pulp could be carried out at low temperatures,
using low R ratios.
R (g/mL)
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25
Extr
actio
n ef
ficie
ncy
0,0
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
T = 30ºCT = 40ºCT = 50ºC
Figure 3.4. Extraction efficiency of oils from freeze-dried pulp, over various ratios of solid
to solvent (g/mL), using hexane for 24 hours at three different temperatures.
66
Table 3.3. Effects of variation of temperature (T) and solid to solvent ratio (R), on the extraction efficiency of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulpsa.
Extraction efficiency (%)b Extraction efficiency (%)c T
(ºC) FDS ADS FDP ADP
R
(g/mL) FDS ADS FDP ADP
30 74.7a 80.2a 71.4a 81.6a 1/4 73.1a 74.5a 65.2a 76.6a
40 87.9b 80.4a 76.3b 84.1a 1/7 84.0b 85.8b 76.1b 83.2b
50 87.8b 91.0b 82.1c 85.3a 1/14 93.4c 91.4c 88.5c 91.2c a Means in the same column followed by the same letter are not significantly different by LSD test at the 5% level. b Data represent the average of the extraction efficiency values obtained using the three solid to solvent ratios (R): 1/4, 1/7 and 1/14 g/mL. c Data represent the average of the extraction efficiency values obtained at T=30, 40 and 50ºC.
3.5.4 Fatty acid composition The fatty acid composition of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps
is summarized in Table 3.4. No significant differences were found in the fatty acid
composition of pulp oils when comparing the two drying methods, where their main
components are palmitoleic (Po), palmitic (P) and linoleic (L) acids (∼40%, ∼35% and
∼10%, respectively). Similar values were recently reported for sea buckthorn (cv. Indian-
summer) pulp oil (Cenkowski, Yakimishen, Przybylski & Muir, 2006), whereas Yang &
Kallio (2001) reported lower concentrations of palmitic (∼27%) and palmitoleic acids
(27.2-32.8%), and higher proportions of oleic acid (∼17%), in pulp oils from subspecies
sinensis and rhamnoides. Linolenic and α-linolenic acids were the major fatty acids in the
sea buckthorn seed oils. Except for stearic and oleic acids, oils from ADS and FDS
exhibited quasi-similar composition of fatty acid profiles (See Table 3.4). Oils from FDS
were richer in α-linolenic and linoleic acids (39.6% vs. 37.2%, p<0.05 and 34.2% vs.
32.4% p<0.05, respectively), and poorer in palmitic and palmitoleic acids (6.5% vs. 8.0%,
p<0.05 and 0.7% vs. 2.8%, p<0.05, respectively) than oils from ADS. Oleic and stearic
acids were 13% and 3%, respectively, in both oils from ADS and FDS. These values were
corresponds to those reported by Cenkowski, Yakimishen, Przybylski & Muir (2006) with
67
slightly lower linoleic acid content for similar cultivar. However, compared to those of seed
oils from subspecies sinensis and rhamnoides (Yang & Kallio, 2001), a lower content of
oleic (O) and linoleic (L) acids (13% vs. 18% and ∼33% vs. ∼39% respectively) and a
higher amount of α-linolenic (Ln) acid (∼38% vs. 29%) were obtained in our results.
Table 3.4. Fatty acid composition (percent of total) of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps, extracted with hexane (30-68ºC).
PULP SEEDS
Fatty acid ADP FDP ADS FDS
C16:0 (Palmitic) 35.3±1.6 35.5±0.5 8.0±0.5a 6.5±0.2
C16:1 (Palmitoleic) 40.1±1.2 39.7±1.2 2.8±0.5a 0.7±0.2
C17:0 (Margaric) 1.8±0.2 2.0±0.3 nd nd
C18:0 (Stearic) 0.8±0.04 0.9±0.1 3.1±0.5 2.9±0.03
C18:1n-9 (Oleic) 3.2±0.2 3.0±0.4 13.1±0.6 13.1±0.2
C18:1n-7 (Vaccenic) 6.5±0.5 6.3±0.1 2.2±0.1a 1.9±0.04
C18:2n-6 (linoleic) 10.6±0.6 10.6±0.7 32.4±1.0a 34.2±0.3
C:18:3n-3 (α-linolenic) 0.9±0.1 1.1±0.2 37.2±1.4a 39.6±0.4
nd: Not detected. a p<0.05 between the two drying methods.
Polyunsaturated fatty acids (PUFA) of the seed oils amounted between 70-75% of the total
fatty acids, while the monounsaturated (MUFA) and saturated (SFA) fatty acids were about
18% and 11% respectively. These oils, characterized by high ratios of PUFA/MUFA and
PUFA/SFA, are prone to the oxidation because of their high content in α-linolenic acid.
3.5.5 Triglyceride composition Figure 3.5a shows the triglyceride (TAG) composition of oils from ADP and FDP.
Significant differences were found in the TAG profiles of pulp oils when comparing the
two drying methods. These differences were probably due to the more severe conditions of
68
air-drying introducing some changes in the TAG molecules of ADP. However, pulp oils
contain mainly TAG with acyl carbon numbers of 48 and 50, with 1-3 double bonds
(C48:2, C48:1, C50:3, C50:2 and C48:3), representing approximately 85% of the total
TAGs. Taking into account the fatty acid composition of pulp oils (Table 3.4), C48
molecules (representing more than 50% of the total TAGs) should largely correspond to
TAG of three 16-carbon fatty acids. Most of these TAG molecules could mainly be PoPoP,
PPPo and PoPoPo. Similarly, C50 molecules (representing about 40% of the total TAGs)
would correspond to TAGs with two 16-carbon fatty acids and one 18-carbon fatty acid. In
view of these results, the majority of TAGs could correspond principally to PPoL and PPL.
The TAG distribution of oils from ADS and FDS is showed in Figure 3.5b. As can be seen
in this Figure, seed oils were mainly constituted by TAGs with acyl carbon numbers of 54
and 52, and minor amounts of C48 and C50 molecules, which comprise predominantly 18-
and 16-carbon fatty acids. As showed in Table 3.4, oils from ADS were richer in palmitic
and palmitoleic acids, and poorer in linoleic and α-linolenic acids than oils from FDS.
These differences made that the proportions of C54 and C52 TAGs were higher in oils from
FDS than in oils from ADS (66% vs. 56%, p<0.01 and 30% vs. 28%, p<0.01 respectively),
whereas concentrations of C48 and C50 molecules were higher in oils from ADS than in
oils from FDS (8% vs. 1%, p<0.01 and 7% vs. 2%, p<0.01 respectively). Regarding the
fatty acid composition of seed oils, C54 and C52 TAGs would be mainly, LLL, LnLnO,
OLLn, LLLn, LLO, LLP and PLLn. In general, the TAG compositions of seed and pulp
oils obtained in this work were in accordance with those reported by Yang & Kallio (2006)
for seeds and berries of sea buckthorn of different subspecies and origins.
69
(a)
C48:1C48:2
C48:3C50:1
C50:2C50:3
C50:4C52:2
C52:3C52:4
Con
tent
(%)
0
5
10
15
20
25
30
35
FDP ADP
(b)
C48:1C48:2
C48:3C50:1
C50:2C50:3
C52:2C52:3
C52:4C52:5
C52:6C54:3
C54:4C54:5
C54:6C54:7
C54:8
Con
tent
(%)
0
5
10
15
20
25FDS ADS
Figure 3.5. Triglyceride composition of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds.
70
3.5.6 Lipid fractions extracted by SPE Sea buckthorn seed and pulp oils consisted mainly of neutral lipids (NL) (∼95%), with
minor amounts of free fatty acids (FFA) (∼2-4%) and phospholipids (PL) (1-2%) (Tables
3.5 and 3.6). High levels of neutral lipids (92%) have been reported for sea buckthorn seed
oil by Zadernowski, NowakPolakowska, Lossow, & Nesterowicz (1997), while similar
values for FFA and PL fractions in oils from pumpkin seeds were recently reported
(Yoshida, Shougaki, Hirakawa, Tomiyama & Mizushina, 2004). The fatty acid profiles of
the NL fractions were very close to the corresponding crude seed and pulp oils, because of
the quantitative primacy of this fraction in the oils. However, when comparing the two
drying methods, slight differences were found between the fatty acid compositions of oils
from ADP and FDP. On the other hand, similar differences observed in the fatty acid
profiles of crude seed oils were found in the NL fractions of ADS and FDS.
The PL fractions of pulp oils were poorer in palmitic and palmitoleic acids (∼11% and
∼4%, respectively), but much richer in linoleic and α-linolenic acids (∼8% and ∼5%,
respectively) than in crude oils (Table 3.5). Significant differences, that could be attributed
to the alterations of the cell membrane during air drying, were found in the proportions of
linoleic (18.4% vs. 20.5%, p<0.05) and palmitic (25% vs. 22.7%, p<0.05) acids, when
comparing the PL fractions of oils from ADP and FDP, respectively. The PL fractions of
seed oils were in general richer in linoleic (∼13%), palmitic (∼4%) and stearic (∼3%) acids,
and poorer in α-linolenic acid (∼20%), than in crude oils (Table 3.6). Except for linoleic
acid, which amounted 45% of the total fatty acids in both oils from ADS and FDS,
significant differences in the proportions of the other fatty acids were found in PL fractions
when comparing air- and freeze drying methods.
71
Tabl
e 3.
5. F
atty
aci
d co
mpo
sitio
n (p
erce
nt o
f tot
al) i
n in
divi
dual
lipi
d fr
actio
ns o
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air-
and
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drie
d se
a bu
ckth
orn
pulp
s, ex
tract
ed w
ith h
exan
e us
ing
the
Soxh
let e
xtra
ctor
dur
ing
4 ho
urs.
Oil
from
AD
P O
il fr
om F
DP
N
L
FFA
PL
N
L
FFA
PL
Com
posi
tion
(mas
s%)
95.8
±1.3
1.
7±0.
8a 2.
2±0.
3 94
.3±0
.1
4.0±
0.5
1.5±
0.4
C16
:0 (P
alm
itic)
35
.8±0
.1a
28.7
±1.0
25
.0±1
.1a
35.2
±0.1
27
.6±2
.2
22.7
±0.4
C16
:1 (P
alm
itole
ic)
39.2
±0.1
a 38
.2±0
.5
34.8
±0.7
39
.9±0
.1
39.4
±0.8
35
.2±0
.7
C17
:0 (M
arga
ric)
2.0±
0.0a
2.9±
0.0
3.2±
0.3a
2.2±
0.0
3.1±
0.3
3.9±
0.1
C18
:0 (S
tear
ic)
0.9±
0.0
nd
1.6±
0.3
0.9±
0.0
nd
1.2±
0.0
C18
:1n-
9 (O
leic
) 3.
0±0.
0a 2.
4±0.
1 2.
4±0.
9 2.
7±0.
0 2.
1±0.
1 1.
4±0.
1
C18
:1n-
7 (V
acce
nic)
6.
4±0.
0 7.
6±0.
2 8.
9±0.
3 6.
3±0.
0 7.
3±0.
3 8.
9±0.
3
C18
:2n-
6 (li
nole
ic)
11.0
±0.0
a 13
.6±0
.3
18.4
±0.9
a 10
.8±0
.0
12.7
±0.5
20
.5±1
.0
C:1
8:3n
-3 (α
-lino
leni
c)
0.9±
0.0a
6.6±
1.0
5.8±
0.2
1.0±
0.0
6.9±
1.8
5.3±
0.2
nd: N
ot d
etec
ted.
a p<0
.05
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een
the
two
dryi
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ds.
72
Tabl
e 3.
6. F
atty
aci
d co
mpo
sitio
n (p
erce
nt o
f tot
al) i
n in
divi
dual
lipi
d fr
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ns o
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air-
and
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ckth
orn
seed
s, ex
tract
ed w
ith h
exan
e us
ing
the
Soxh
let e
xtra
ctor
dur
ing
4 ho
urs.
Oil
from
AD
S O
il fr
om F
DS
N
L
FFA
PL
N
L
FFA
PL
Com
posi
tion
(mas
s%)
94.3
±1.1
2.
9±0.
2 1.
2±0.
1 93
.9±0
.6
2.7±
1.9
0.8±
0.2
C16
:0 (P
alm
itic)
8.
2±0.
06a
9.1±
0.7b
12.2
±0.7
b 6.
9±0.
1 6.
8±0.
0 10
.0±0
.2
C16
:1 (P
alm
itole
ic)
2.9±
0.1a
3.1±
0.1c
1.9±
0.6a
1.4±
0.2
1.4±
0.0
0.6±
0.2
C18
:0 (S
tear
ic)
2.9±
0.0
3.2±
0.2a
6.5±
0.2a
3.0±
0.1
3.0±
0.0
5.9±
0.2
C18
:1n-
9 (O
leic
) 12
.7±0
.2
12.2
±0.4
b 12
.6±0
.2c
13.0
±0.2
13
.0±0
.1
14.2
±0.2
C18
:1n-
7 (V
acce
nic)
2.
2±0.
0a 2.
3±0.
1a 4.
9±0.
1a 2.
0±0.
0 2.
0±0.
0 4.
5±0.
1
C18
:2n-
3 (li
nole
ic)
31.9
±0.4
a 30
.9±0
.9a
44.4
±1.7
33
.1±0
.5
32.9
±0.3
45
.9±0
.9
C:1
8:3n
-3 (α
-lino
leni
c)
37.7
±0.4
35
.8±1
.5a
15.2
±0.1
a 38
.7±0
.7
38.5
±0.4
17
.4±1
.4
a p<0
.05,
b p<0
.01,
c p<0
.001
bet
wee
n th
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o dr
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met
hods
.
73
In general, for both seed and pulp oils, the fatty acid profiles of PL fractions obtained in
this work, are within the range reported for others subspecies of sea buckthorn (Kallio,
Yang, Peippo, Tahvonen & Pan 2002; Yang, & Kallio, 2001). Nevertheless, the sea
buckthorn (cv. Indian-summer) pulp oils would have a higher content in palmitoleic and
palmitic acids, but a lower content in linoleic and α-linolenic acids, compared with
subspecies mongolica, sinensis and rhamnoides. Genetic differences among subspecies, as
well as geographical conditions, cultivating activities and lipid extraction processes, could
explain these differences (Yang & Kallio 2002a).
The fatty acid profiles of the FFA fractions of seed and pulp oils were relatively similar to
those of crude oils (Tables 3.5 and 3.6). However, lower proportions of palmitic acid (∼7%)
and higher amounts of α-linolenic acid (∼6%), were observed in pulp oils. In the case of
seed oils, once again the same differences found in the fatty acid compositions of crude oils
were observed in the FFA fractions, when comparing the two investigated drying methods.
As observed in Tables 3.5 and 3.6, the different conditions of the drying methods used in
this work introduced some changes in the fatty acid profiles of individual lipid fractions of
the oils. Consequently, their TAG compositions were also affected, as showed in Figures
3.5a and 3.5b.
3.5.7 Peroxide values of the oils Fresh oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps had a peroxide value
(PV) of 1.8 and ∼4 meq/kg, respectively, which are lower than those generally found in
commercial vegetable oils (≤10 meq/kg). However, the PV of oils from ADP was higher
than those from FDP (5.4±0.3 vs. 3.0±1.9 meq/kg). The absence of oxygen during freeze-
drying of pulp and the effects of the more severe conditions of air-drying could explain
these results.
74
3.5.8 Melting profiles The melting curves of seed oils showed 4 overlapping peaks as depicted in Figure 3.6a.
This figure shows one minor low-temperature endothermic transition below -40ºC,
followed by one prominent endothermic transition, and two high-temperature endothermic
minor peaks at about -24ºC and -15ºC respectively. The main endothermic transition, most
likely corresponded to melting of the major TAG groups, C54 TAGs, such as LLL, LnLnO,
OLLn, LLLn and LLO. As can be seen in Figure 3.6a, oils from ADS did not show the two
higher-temperature peaks as exhibited by FDS oils. Only, a single peak at about -21ºC was
depicted. Moreover, the lower-temperature endotherm was broader for oils from ADS than
those from FDS. The slight differences between the melting curves could be attributed
mainly to the difference in the TAG composition of the oils obtained from air- and freeze-
dried seeds. The melting enthalpies found for oils from ADS and FDS (70.3±5.8 J/g and
64.7±4.7 J/g, respectively) are in agreement with those reported by Tan & Che Man (2002)
for various vegetable oils.
In Figure 3.6b, the DSC melting curves of oils from ADP and FDP indicate the presence of
three major groups of triglycerides melting independently between -30ºC and 20ºC. The
more saturated nature of sea buckthorn pulp oils is highlighted in these thermograms. The
first low-temperature endotherm (LTE), between -30ºC and -6ºC, could mainly correspond
to the melting of unsaturated TAGs such as PPoL, PPL and PoPoPo, whereas the other two
middle- and high-temperature endotherms (MTE and HTE), would represent the melting of
more saturated TAGs, such as PoPoP and PPPo, representing about 50% of the total TAG
in sea buckthorn pulp oils. As depicted in Figure 5b, the main peak of the middle-
temperature endotherm was followed by two minor transitions prior to the melting of the
third group of TAG. Nevertheless, the melting temperature selected for this endotherm
corresponded to the main peak. A similar criterion was used for the temperature attribution
for the first low-temperature endotherm. Therefore, the melting enthalpies and temperatures
of each endotherm are given in Table 3.7. When comparing the two drying methods, there
were no significant differences between the melting temperatures of endotherms, being
their average values -22.5ºC, -4ºC and 10ºC for the low-, middle- and high-temperature
75
endotherms respectively. The melting enthalpy of the low-temperature endotherm was
lower in oils from ADP than in those from FDP (19.4 J/g vs. 25.6 J/g, p<0.01), whereas
melting enthalpies for the middle- and high-temperature endotherms were about 10 J/g and
40 J/g. The different TAG profiles observed in oils from ADP and FDP could explain the
differences found between the melting enthalpies of the low-temperature endotherms. On
the other hand, according to Timms (1980), the large area of the highest melting peak
would partly due to the higher heat of melting of the TAG groups corresponding to this
endotherm. Another reason which could explain this situation is connected to the presence
of high melting triglycerides crystallizing together with lower melting triglycerides in a
quasi-stable mixture.
Table 3.7. Thermal characteristics of sea buckthorn pulp oils
ADP FDP
LTE MTE HTE LTE MTE HTE
Tm (ºC) -23.0±0.6 -4.4±0.9 9.9±1.5 -22.4±0.6 -3.4±0.4 10.9±0.4
∆Hm (J/g) 19.4±2.8a 9.5±2.9 40.4±8.9 25.6±2.4 10.2±1.7 40.6±1.9 a p<0.01 between the two drying methods. Tm: Melting temperature. ∆Hm : Melting enthalpie.
The solid fat indices (SFI) of the sea buckthorn seeds and pulp oils, calculated from their
corresponding thermograms by sequential peak integration areas, indicated that SFI
decreased as temperature increased (Figures 3.7a and 3.7b). Once again, it can be noticed in
these curves the differences found in the TAG profiles of both seed and pulp oils. Seed oils
melted completely at temperatures around 0ºC, because of their high unsaturated nature,
whereas complete melting of TAGs is achieved above 20ºC for pulp oils, confirming their
more saturated nature.
76
( a )
Temperature (°C)
-60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30
Htfl
dd
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
FDSADS
( b )
Temperature (°C)
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50
Htfl
dd
0
1
2
3
4
5
6
FDPADP
Figure 3.6. DSC melting curves of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps.
77
( a )
Temperature (ºC)
-60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30
SFI(%)
0
20
40
60
80
100SFI oils from FDS SFI oils from ADS
( b )
Temperature (ºC)
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50
SFI(%)
0
20
40
60
80
100SFI oils from FDPSFI oils from ADP
Figure 3.7. SFI of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps.
78
3.6 Conclusions Air-dried (ADS) and freeze-dried (FDS) sea buckthorn seeds, gave a similar extraction
yield around 12%w/w, whereas significant differences were found between extraction
yields of air-dried (ADP) and freeze-dried (FDP) sea buckthorn pulps (35.9±0.8 vs
17.1±0.6%w/w). Fatty acid analysis revealed that α-linolenic (37.2-39.6%), linoleic (32.4-
34.2%) and oleic (13.1%) acids were the main fatty acids in seed oil extracts, while pulp
extracts were rich in palmitoleic (39.9%), palmitic (35.4%) and linoleic (10.6%) acids.
Lipid fractionation of crude seed and pulp oils, obtained by SPE, yielded mainly neutral
lipids (93.9-95.8%). Sea buckthorn seed oils exhibited four thermal structural transitions
between -50ºC and 0ºC, whereas multiple transitions were observed in melting profiles of
pulp extracts. The seed oils were characterized with peroxide values of 1.8 meq/kg, while
those of pulp oils were between 3.0-5.4 meq/kg. Drying method did not have a marked
effect on oil quality. However, it is worth mention that oils from freeze-dried pulps had a
much lower peroxide value bearing out their enhanced quality.
3.6 References Aguilera, J.M., Chiralt, A., & Fito, P. (2003). Food dehydration and product structure.
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Conclusions générales Afin de vérifier les hypothèses de ce projet, une évaluation des effets de deux méthodes de
déshydratation (la lyophilisation et le séchage à l’air chaud) sur les rendements d’extraction
et la qualité des huiles des graines et de la pulpe du fruit d’argousier (cv. Indian-Summer) a
été réalisée. Les extractions ont été effectuées à différentes températures (30, 40, 50 et
68ºC) en utilisant l’hexane comme solvant. Trois ratios soluté - solvant (1/4, 1/7 et 1/14)
furent étudiés.
La quantité de lipides totaux des produits secs, déterminée en utilisant le chloroforme –
méthanol comme solvant, a été semblable pour les graines séchées à l’air chaud et
lyophilisées (∼12% w/w), contrairement à ce qui a été observé pour la pulpe (35.8% w/w
pour la pulpe séchée à l’air chaud vs. 16.4% w/w pour la pulpe lyophilisée). La différence
trouvée entre les quantités de lipides totaux issues des pulpes, a été attribuée principalement
aux effets du séchage sur leurs structures cellulaires. Des micrographies obtenues par
microscopie électronique à balayage ont montré que le séchage à l’air chaud a causé des
grands changements et dommages à la structure cellulaire de la pulpe, permettant aux
substances cellulaires, y compris les lipides, d’être facilement extraites. Par contre, la
structure régulière des cellules de la pulpe lyophilisée aurait exercé une résistance plus
élevée à la diffusion du solvant et des lipides, à travers de la membrane cellulaire.
Les rendements d’extraction des huiles obtenus à 68ºC en utilisant la méthode Soxhlet avec
l’hexane comme solvant, ont été similaires à ceux trouvés avec le chloroforme –méthanol,
et ce pour les trois ratios soluté – solvant étudiés. Les rendements d’extraction des graines
séchées à l’air chaud et lyophilisées furent semblables (∼12% w/w), tandis que la quantité
d’huile obtenue de la pulpe séchée à l’air chaud a été plus du double de celle extraite de la
pulpe lyophilisée (36%w/w vs. 17%w/w, respectivement). Après 4 heures, les extractions
effectuées par la méthode Soxhlet ont atteint l’équilibre. Contrairement à ce qui a été
observé pour les extractions réalisées dans des erlenmeyers à 30, 40 et 50ºC durant 24
heures, les rendements d’extraction n’ont pas été affectées par le ratio soluté – solvant en
raison d’un meilleur transfert de masse pendant le processus d’extraction. D’ailleurs, les
extractions effectuées dans des erlenmeyers furent plus dépendantes du ratio soluté –
82
solvant que de la température. Pour ces extractions, il a été trouvé une efficacité
d’extraction des huiles des graines et de la pulpe de l’argousier située entre 64-99% et 59-
91%, respectivement, lorsqu’on a fait varier le ratio soluté – solvant entre 1/4 et 1/14, et la
température entre 30 et 50ºC.
L’huile des graines est caractérisée par une faible proportion d’acides gras saturés, et par
une teneur élevée en acides gras insaturés. Les huiles issues des graines lyophilisées furent
plus riches en acides α-linolénique (39.6% vs. 37.2%) et linoléique (34.2% vs. 32.4%), et
moins riches dans les acides palmitoléique (0.7% vs. 2.8%) et palmitique (6.5% vs. 8.0%),
par rapport aux huiles extraites des graines séchées à l’air chaud. Par contre, la méthode de
déshydratation n’a pas causé des différences significatives dans la composition d’acides
gras des huiles de la pulpe, lesquelles ont été caractérisées pour un haut degré de saturation.
Elles contiennent environ 35% d’acide palmitique et une proportion d’acides gras insaturés
constituée surtout par les acides palmitoléique (∼40%) et linoléique (∼10%).
Des différences significatives ont été présentées dans les compositions des triglycérides des
huiles des graines et de la pulpe d’argousier, par rapport à la méthode de déshydratation.
Cependant, comme pour d’autres espèces et sous-espèces de l’argousier, les triglycérides
des huiles des graines furent constitués principalement par des molécules comportant 54 et
52 atomes de carbone, tandis que ceux des huiles de la pulpe ont été composés surtout par
des molécules comprenant 48 et 50 atomes de carbone. Or, les différences dans les
compositions des triglycérides des huiles des graines et de la pulpe par rapport à la méthode
de séchage, ont causé des légères dissimilitudes dans leurs profils de fusion et dans leurs
indices de gras solide, tel qu’illustré dans les Figures 3.6 et 3.7.
Le fractionnement des huiles brutes des graines et des pulpes, fait à l’aide de l’extraction en
phase solide, a donné principalement des lipides neutres (∼95%), et des faibles quantités
d’acides gras libres (2-4%) et de phospholipides (1-2%). La composition massique de ces
fractions n’a pas été amplement influencée par la méthode de séchage. Cependant, des
différences significatives dans leurs profils d’acides gras furent trouvées par rapport à la
méthode de déshydratation.
83
L’état d’oxydation des huiles des graines, évalué à l’aide de l’indice de peroxyde, n’a pas
été influencé par la méthode de déshydratation. Ceci pourrait être attribué au fait que les
graines sont enrobées pour la paroi membranaire de la graine, ce qui, dans les conditions
étudiées, empêcherait un peu l’oxydation des lipides durant la période de séchage. D’autre
part, les huiles de la pulpe lyophilisée ont présenté un indice de peroxyde moins élevé que
celui obtenu des huiles issues de la pulpe séchée à l’air chaud (3.0 vs 5.4 meq/kg), ce qui
pourrait être dû à l’absence d’oxygène durant la lyophilisation.
Ainsi, dans le contexte des paramètres étudiés dans ce projet, la lyophilisation ne serait pas
une méthode indiquée comme opération préliminaire à l’extraction des huiles de
l’argousier, compte tenu du rendement d’extraction plus faible qu’elle donne, et parce que
les différences trouvées dans les paramètres de qualité ne justifient pas ses coûts plus élevés
par rapport au séchage à l’air chaud. Cependant, vu l’énorme potentiel nutritionnel de
l’argousier, et les caractéristiques excellentes des produits lyophilisés, cette technique
pourrait être la méthode de choix pour la production d’une poudre d’argousier de haute
valeur ajoutée.
Perspectives de recherche Pour que la production et l’industrialisation de l’argousier au Québec soient rentables, il est
fondamental de réduire les coûts de récolte (estimés entre $8-10/kg). Pour cela, la recherche
concernant la cueillette mécanique des fruits devrait être faite.
Grâce aux propriétés physico chimiques des huiles d’argousier, ces fruits deviennent une
source importante de lipides pour l’industrie cosmétique et pharmaceutique. Néanmoins, il
est possible que des résidus d’hexane ne soient pas acceptés. Par conséquent, d’autres
solvants ou méthodes d’extraction devraient être étudiées. Commercialement, les huiles
d’argousier sont extraites à l’aide du CO2 supercritique. Cependant, les coûts élevés de
cette technologie sont un grand inconvénient, étant donné que les prix des huiles des
graines et de la pulpe ont été estimés à $300/kg et $160/kg, respectivement. Malgré que
l’utilisation d’enzymes a démontré une grande performance dans les procédés d’extraction
d’huiles, elle est pratiquement non étudiée dans le cas du fruit de l’argousier. Ceci nous a
amené à réaliser une étude préliminaire concernant l’extraction enzymatique de l’huile de la
pulpe d’argousier, en utilisant trois enzymes commerciales. Les résultats de cette étude sont
présentés dans l’Annexe 3.
D’autre part, les récents intérêts et applications des acides gras monoinsaturés donnent à
l’huile de la pulpe d’argousier une grande importance, compte tenu que ce fruit est la
source naturelle la plus riche en acide palmitoléique, suivi de la noix de macadamia.
L’application d’une technologie qui permette la production de fractions riches en acide
palmitoléique à partir de l’argousier valoriserait encore plus ce fruit, et lui donnerait
d’autres opportunités commerciales.
Annexe 1
Matériaux et produits expérimentaux
1. Fruits d’argousier entiers. 2. Graines entières de fruits d’argousier. 3. Graines moulues de fruits d’argousier. 4. Pulpe d’argousier séchée à l’air chaud. 5. Pulpe d’argousier lyophilisée. 6. Huiles de la pulpe (à gauche) et des graines (à droite).
2
3 4
5
1
6
Annexe 2
Divers espèces et sous-espèces de l’Hippophaë
subsp. turkestanica Rousi H.tibetana Schlechtend
H. salicifolia D. Don subsp. yannanensis Rousi
H. goniocarpa Lian,X.L.Chen et K.Sun H. gyantsensis (Rousi)Lian
subsp. goniocarpa H. rhamnoides cv. Indian-Summer
Annexe 3
Enzymatic Oil Extraction of Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) Pulp: A Preliminary Study
Luis-Felipe Gutiérrez, Cristina Ratti and Khaled Belkacemi*
Soils and Agri-Food Engineering Department, Nutraceuticals and Functional Foods
Institute (INAF), Université Laval, Québec, G1K 7P4, Canada *Corresponding author. Phone: 418-656-2131, ext. 6511. Fax: 418-656-3327.
E-mail: [email protected] Cet annexe, rédigé sous forme d’article, présente les résultats obtenus lors d’une étude
préliminaire de l’extraction enzymatique de la pulpe de l’argousier. Les effets de trois
enzymes commerciales, ainsi que de cinq concentrations enzyme/substrat, furent évalués.
Résumé Trois enzymes commerciales (Pectinex Ultra SP-L, Celluclast 1.5 L and Viscozyme L)
furent évaluées pour l’extraction d’huile de la pulpe d’argousier (Hippophaë rhamnoides
L.) obtenue après la séparation du jus. Les extractions furent réalisées durant 24 h à pH 5.0
et 50ºC, utilisant cinq concentrations enzymatiques différentes. Les huiles brutes obtenues
furent analysées dans leurs compositions d’acides gras, et fractionnées à l’aide de
l’extraction en phase solide. Les profils de fusion des différentes huiles ont été caractérisés
par calorimétrie différentielle à balayage. Les rendements d’extraction moyens obtenus
avec Viscozyme L (2.8%w/w) et Pectinex Ultra SP-L (2.6%w/w) furent significativement
plus élevés que ceux obtenus avec Celluclast 1.5L (2.1%w/w). Pour toutes les enzymes, les
profils en acides gras des huiles, furent caractérisés par des teneurs élevées en acides
palmitoléique (39.5%) et palmitique (36.1%), et de faibles quantités en acides linoléique
(10.8%) et vaccénique (6.2%). Le fractionnement des huiles brutes a donné environ 97% de
lipides neutres. Les courbes de fusion des huiles ont montré la présence de trois
endothermes fondant séparément entre -30ºC et 20ºC, pour lesquels les températures de
fusion furent -24ºC, -4ºC et 10ºC.
88
Abstract Three commercial enzymes (Pectinex Ultra SP-L, Celluclast 1.5 L and Viscozyme L) were
evaluated for oil extraction from the sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) pulp
obtained after juice separation. Extractions were carried out for 24 h at pH 5.0 and 50ºC,
using five different enzyme concentrations. The obtained crude oils were analyzed for their
fatty acid compositions, and fractionated using solid-phase extraction. The melting profiles
of different oil samples were characterized by differential scanning calorimetry. The
average oil yields obtained with Viscozyme L (2.8%w/w) and Pectinex Ultra SP-L
(2.6%w/w) were significantly higher than those obtained with Celluclast 1.5L (2.1%w/w).
For all enzymes, the fatty acid profiles of oils were characterized by high concentrations of
palmitoleic (39.5%) and palmitic (36.1%) acids, with minor proportions of linoleic (10.8%)
and vaccenic (6.2%) acids. Lipid fractionation of crude oils yielded about 97% of neutral
lipids. The melting curves of the oils showed the presence of three major endotherms
melting separately between -30ºC and 20ºC, for which the melting temperatures were -
24ºC, -4ºC and 10ºC.
Introduction Canadian production of sea buckthorn berries (Hippophaë rhamnoides L.) is estimated at
more than 1.6 × 103 t/year (1). These berries are of great interest because of their
nutraceutical properties, and since a few years, the sea buckthorn products are among the
most popular functional foods in various European countries and North America (2).
Consequently, the berries become a crop with economic potential for Canada (3).
Sea buckthorn berries have a high lipid content, including tocopherols, tocotrienols,
carotenoids and two essential fatty acids: omega-3 and omega-6 (4). The oil contents of
seeds and pulp range commonly between 10-15% and 30-35%, respectively (4-5). The pulp
oil contains high amounts of palmitoleic (C16:1n-7, 16-54%) and palmitic acids (C16:0,
17-47%), whereas the seed oil is highly unsaturated, containing mainly linoleic (C18:2n-6,
89
30-40%) and α-linolenic (C18:3n-3, 20-35%) acids (4). Both seed and pulp oils have
shown beneficial effects on human health (4, 6-12).
The most used techniques to obtain commercial seed and pulp sea buckthorn oils are
solvent extraction and supercritical fluid extraction (4). Aqueous extraction and pressing
have been also reported recently (13). Other methods comprise the use of additional
vegetable oils to extract oils from seeds and pulp, to obtain oils of mixed composition (14).
Enzymes have been used in oil extraction of various fruits and seeds, and the results in both
laboratory and industrial scale have been excellent (15). Enzymatic oil extraction of sea
buckthorn berries is a field practically not studied. Only one study (16) partially available
indicates the use of enzymes to obtain sea buckthorn oils and food-grade sea buckthorn
juice.
Given the increasing interest and applications of the sea buckthorn pulp oil, and with the
aim to avoid the use of toxic organic solvents, the objective of this work was to investigate
the extraction yields and composition of oils from sea buckthorn pulp, using three
commercial enzymes (Pectinex Ultra SP-L, Celluclast 1.5 L and Viscozyme L).
Materials and methods Sea buckthorn berries (Hippophaë rhamnoides L cv. Indian-Summer) from Sainte-Anne-
de-Beaupré (Québec, Canada) were washed with boiling water at short time periods, to
inactivate deteriorative enzymes, and then rinsed with cold water. The fresh extracted juice
was allowed to stand 48 h in the refrigerator at 4ºC. The upper pulp phase was treated
enzymatically for 24 h at 50ºC, after adjusting the pH to 5.0 with NaOH, with three
commercial enzyme preparations (Celluclast 1.5 L from Trichoderma reesei, Pectinex Ultra
SP-L from Aspergillus aculeatus and Viscozyme L from a group of Aspergillus) purchased
from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Five different concentrations enzyme/substrate (0.25,
0.5, 1.0, 2.0 and 4.0% v/v) were tested and compared with a control sample (without
enzymes). Extractions were carried out in Erlenmeyer flasks under permanent agitation
(400 rpm) using a thermoregulated bath. After centrifugation at 10000 rpm during 60 min
90
at 25ºC (Refrigerated Multipurpose Centrifuge 5804 R Eppendorf, Germany), the
supernatant oils were collected, weighted, and stored under nitrogen in sealed amber glass
vials at -20ºC until analysis. Oil extraction yields (%w/w) were calculated as the mass ratio
percentage of extracted oil (g) to pulp material (g).
Fatty acid composition The fatty acid composition of the oils was determined by GC. Oils were converted into
their methyl esters (FAME) and analyzed on a 5890 series II gas chromatograph (Hewlett-
Packard, Palo Alto, CA) equipped with a flame ionization detector and a split-splitless
capillary inlet. The oven temperature was programmed as follows: from 60ºC (isothermal
for 1 min) to 190ºC at 20ºC/min, and isothermal period of 30 min at 190ºC. The injector
and detector temperatures were set at 250°C. Hydrogen was used as carrier gas. Gas
chromatography separation was performed on a BPX-70 capillary column (60 m×0.25 mm
i.d.×0.25 µm film thickness; SGE, Melbourne, Australia). Fatty acids were identified by
comparing their retention times with those of the FAME standards purchased from Nu
Chek Prep (Elysian, MN, USA) under the same conditions. Peak areas were measured with
a Hewlett-Packard ChemStation software. Fatty acid composition was expressed as
percentage of the total amount of fatty acids.
Lipid fractionation Separation of individual lipid fractions was achieved using solid-phase extraction (SPE)
cartridges (Bakerbond SPE amino [NH2] disposable extraction columns, 1000 mg, J.T.
Baker Inc., Phillipsburg, NJ, USA), as described by Oomah et al. (17). The cartridges were
preconditioned with 2 mL methanol, 2 mL chloroform, and 4 mL hexane. A micropipet was
used to inject oil samples (∼100 mg) dissolved in chloroform. Lipid fractions were
recovered by sequential elution under vacuum with 4 mL each of chloroform/isopropanol
(2/1, v/v), diethyl ether/acetic acid (95/5, v/v), and methanol to separate neutral lipids, free
fatty acids and phospholipids, respectively. The collected eluted fractions, were evaporated
under nitrogen, weighed, and stored at -20ºC for subsequent fatty acid analysis.
91
Melting profiles Melting profiles of the oils were determined using a differential scanning calorimeter (Pyris
1 DSC, Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) equipped with an intracooler II (Perkin Elmer,
Norwalk, CT, USA). The system was purged during analysis with nitrogen at 30 mL/min.
Oil samples (10-20 mg) were poured into aluminium pans, weighted and then hermetically
sealed. DSC melting curves were performed within the temperature range of -50 to 50ºC.
Samples were cooled and held at the lowest temperature for 5 min and then heated at
4ºC/min. An empty pan was used as an inert reference to balance the heat capacity of the
sample pan. Calibration of DSC was carried out using indium (mp = 156.6ºC, ∆Hf = 28.71
J/g). Data were analyzed using a thermal analysis software (Pyris 1 Version 3.5, Perkin
Elmer). The solid fat index (SFI) was determined from the DSC melting curves by
sequential integration of peak areas (18).
Experimental design and statistical analysis The experimental units were grouped in three blocs, and the treatment structure adopted
was a 3×5 factorial design (three enzymes×five concentrations). Results were analyzed
using the analysis of variance by the general linear models (GLM) procedure. To analyze
the effects of the independent variables on the oil extraction yields, qualitative contrasts and
means comparisons by the least significant difference (LSD) test were performed according
to the Statistical Analysis System (19). Probability of p<0.05 was considered statistically
significant.
Results and discussion After settling, sea buckthorn juice separates into an emulsion pulp layer on the top, an
aqueous phase in the middle, and some solids on the bottom. Later than removing the solids
and the aqueous phase, the moisture content of the cream pulp layer was 84.4±0.1%. The
effects of the enzymatic treatments on oil extraction yields from this material are shown in
Figure A.3.1. When comparing with the control sample (oil yield 1.8±0.1%), it is clear that
92
enzyme concentrations greater or equal than 0.5% v/v improve the oil extraction yields of
the cream pulp phase. It was also observed that the higher oil yields were obtained with
Viscozyme L (a multienzyme complex containing a wide range of carbohydrases, including
arabanase, cellulose, β-glucanase, hemicellulase and xylanase) and Pectinex Ultra SP-L (an
enzyme preparation that contains pectolytic and a range of hemicellulolytic activities). In
contrast, Celluclast 1.5 L (a liquid cellulose preparation), produced the lowest oil yields,
reaching its maximum performance at a concentration of 1.0 % v/v.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
0,25 0,50 1,00 2,00 4,00
Enzyme concentration (%v/v)
Oil
yiel
d (%
w/w
)
Pectinex Ultra SP-LCelluclast 1,5 LViscozyme LControl
Figure A.3.1. Oil extraction yields obtained from sea buckthorn pulp using three
commercial enzymes at different concentrations.
No significant differences were found between the oil yields obtained with Viscozyme L
and Pectinex Ultra SP-L, and their average values (2.8% and 2.6% respectively) were
significantly higher (p<0.01) than those obtained with Celluclast 1.5L (2.1%). On the other
hand, as showed in Figure A.3.1, the oil yields increase as the enzyme concentration
increases. However, from concentrations higher than 1.0%v/v, the oil extraction yields
were not significantly different.
Our results are in according with those reported by Nokolov & Heilscher (16), who using
enzymes containing pectolytic and acid proteinase activity (Novozyme AP and Rohapect
D5L) for about 24 h at 20ºC and 50°C, obtained 1-3% of sea buckthorn oil. In addition, as
93
shown in other studies (20-21), the use of the multienzyme complex resulted more effective
than used enzymes individually.
Fatty acid composition The fatty acid composition of the obtained oils is summarized in Table A.3.1. As shown,
the fatty acids profiles of the oils were similar, and independent of the type of enzymes.
The major fatty acids were palmitoleic (39.5%), palmitic (36.1%) and linoleic (10.8%)
acids. Similar values were recently reported for sea buckthorn (cv. Indian-summer) pulp oil
from (22), while Yang & Kallio (15) reported lower concentrations of palmitic (26.7% and
27.8%) and palmitoleic (27.2% and 32.8%) acids, and higher proportions of oleic acid
(∼17%), in pulp oils from subspecies sinensis and rhamnoides respectively.
Table A.3.1. Fatty acid composition (percent of total) of oils from sea buckthorn pulp, extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC
Fatty acid Pectinex Ultra SP-L Celluclast 1.5 L Viscoayme L
C14:0 (Myristic) 0.4±0.0 0.4±0.0 0.4±0.0
C16:0 (Palmitic) 36.1±0.3 36.1±0.4 36.2±0.3
C16:1 (Palmitoleic) 39.4±0.3 39.5±0.3 39.5±0.3
C17:0 (Margaric) 2.1±0.1 2.1±0.1 2.1±0.1
C18:0 (Stearic) 0.8±0.0 0.8±0.0 0.8±0.0
C18:1n-9 (Oleic) 2.8±0.0 2.8±0.1 2.8±0.0
C18:1n-7 (Vaccenic) 6.2±0.2 6.2±0.2 6.2±0.2
C18:2n-6 (Linoleic) 10.8±0.3 10.8±0.3 10.8±0.3
C:18:3n-3 (α-linolenic) 0.9±0.0 0.8±0.0 0.9±0.1
Polyunsaturated fatty acids (PUFA) of the oils amounted between 12% of the total fatty
acids, while the monounsaturated (MUFA) and saturated (SFA) fatty acids were 48.5% and
37.3% respectively. The increasing interest and applications of the MUFA, give to the sea
94
buckthorn pulp oil an interesting economic potential, because of its high content in
palmitoleic acid. This fatty acid is present in the majority of fish oils (∼10% w/w), and is
found at low levels in plant and animal tissues (23). Other than sea buckthorn, the most
available source of palmitoleic acid is macadamia nut, which contains 17–34% (24-25).
Associations have been reported between high-monounsaturated fat diets and
cardiovascular diseases. Curb et al. (26) reported that a based diet high in monounsaturated
oils had potentially beneficial effects on cholesterol and LDL cholesterol levels. However,
studies carried out by Nestel et al. (27), showed that palmitoleic acid behaves like a
saturated and not a MUFA in its effect on LDL cholesterol. Others beneficial effects of
palmitoleic acid on cancer, hypertension, hyperlipemia and diabetes have been also
reported (23, 28-29).
Lipid fractions Enzyme extracted sea buckthorn pulp oils consisted mainly of neutral lipids (NL) (∼97%),
with minor amounts of free fatty acids (FFA) (∼2%) and phospholipids (PL) (1%) (Table
A.3.2).
The fatty acids profiles of the NL fractions were very close to the corresponding crude oils,
because of the quantitative dominance of this fraction in the oils. In FFA fractions,
palmitoleic acid was slightly lower than in crude oils, whereas the proportions of myristic,
palmitic, stearic and α-linolenic acids were higher than in crude oils. On the other hand,
significant differences were found in the contents of palmitic and vaccenic acids in PL
fractions, when comparing the type of enzymes. As showed in Table A.3.2., palmitic acid
was higher in oils extracted with Viscozyme and Celluclast than in oils extracted with
Pectinex, whereas vaccenic acid was slightly lower in oils treated with Viscozyme and
Celluclast than in oils treated with Pectinex. The PL fractions were poorer in palmitic and
palmitoleic acids, but richer in stearic, vaccenic, linoleic and α-linolenic acids, than in
crude oils. Linoleic and α-linolenic acids reached 12% and 8%, respectively, whereas
palmitoleic was about 33%. Kallio et al. (2) and Yang & Kallio (5) reported contents of
95
linoleic (32%, 22% and 24%), palmitoleic (22%, 15% and 19%), palmitic (21%, 16% and
17%) and α-linolenic (10%, 15% and 13%) acids in the PL fractions of the sea buckthorn
pulp oils from subspecies mongolica, sinensis and rhamnoides, respectively. Genetic
differences among subspecies, as well as climate, soil conditions, cultivating activities and
lipid extraction processes, could explain the differences (30).
96
Tabl
e A
.3.2
. Fat
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cid
com
posi
tion
(per
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L
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96.8
±1.6
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2±0.
6 0.
9±0.
2 97
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.3
1.5±
0.5
0.9±
0.1
97.9
±0.5
1.
5±0.
7 0.
9±0.
2
C14
:0 (M
yris
tic)
0.4±
0.0
2.2±
0.3
2.1±
0.3
0.4±
0.0
1.9±
1.0
2.1±
0.6
0.4±
0.0
2.6±
0.6
2.0±
0.9
C16
:0 (P
alm
itic)
36
.4±0
.1
38.3
±1.1
27
.5±0
.4a
36.5
±0.1
37
.9±1
.1
29.7
±0.8
b 36
.4±0
.0
38.6
±1.5
31
.9±1
.3b
C16
:1 (P
alm
itole
ic)
39.6
±0.2
36
.0±1
.7
32.6
±0.4
39
.6±0
.1
36.2
±2.8
34
.4±0
.6
39.8
±0.1
34
.9±0
.6
33.3
±2.3
C17
:0 (M
arga
ric)
2.1±
0.0
1.8±
0.2
2.1±
0.3
2.1±
0.0
2.0±
0.4
2.2±
0.3
2.1±
0.0
1.9±
0.2
2.3±
0.5
C18
:0 (S
tear
ic)
0.8±
0.0
1.7±
0.4
3.6±
0.5
0.8±
0.0
1.6±
0.7
2.6±
0.5
0.8±
0.0
1.8±
0.3
3.3±
0.6
C18
:1n-
9 (O
leic
) 2.
8±0.
1 3.
0±0.
3 2.
5±0.
5 2.
8±0.
0 2.
8±0.
1 2.
4±0.
1 2.
7±0.
0 2.
8±0.
1 2.
1±0.
4
C18
:1n-
7 (V
acce
nic)
6.
0±0.
0 5.
6±0.
2 9.
0±0.
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0±0.
0 5.
6±0.
3 7.
9±0.
3b 6.
0±0.
0 5.
5±0.
1 7.
5±0.
8b
C18
:2n-
6 (L
inol
eic)
10
.5±0
.1
9.9±
0.2
12.5
±0.6
10
.5±0
.0
10.3
±0.3
12
.3±0
.4
10.5
±0.1
9.
9±0.
0 11
.5±0
.5
C:1
8:3n
-3 (α
-lino
leni
c)
0.9±
0.0
1.6±
0.2
8.1±
0.1
0.9±
0.0
1.6±
0.4
6.3±
0.9
0.9±
0.0
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6.8±
2.0
a D
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ent l
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s, in
dica
te si
gnifi
cant
diff
eren
ces (
p<0.
05) b
etw
een
enzy
mes
.
97
Melting profiles The melting curves of the extracted oils are shown in Figure A.3.2. As it can be observed,
no significant differences were found between the melting profiles of the oils extracted with
different enzymes, indicating resemblances in their triglyceride compositions. These
melting curves indicate the presence of three major groups of triglycerides melting
separately between -30ºC and 20ºC. The melting profiles showed that there is one major
peak at 10ºC, and two minor peaks at -4ºC and -24ºC. The low melting endotherm (LME),
representing the melting transition of the more unstable crystals of the low melting
triglycerides, had a melting enthalpy of about 20 J/g. The melting enthalpies of both
medium (MME) and high melting endotherms (HME), corresponding to medium and high
melting triglycerides are given in Table A.3.3. There were no significant differences
between the melting temperatures and enthalpies of individual endotherms. According to
Timms (31), the large area of the highest melting peak would partly due to the higher heat
of melting of the triglyceride groups conforming this endotherm, and also because the high
melting triglycerides crystallizes together with lower melting triglycerides in a semi-stable
mixture.
Table A.3.3. Thermal characteristics of enzyme extracted sea buckthorn pulp oils a
LME MME HME
Enzyme ∆Hm (J/g) Tm (ºC) ∆Hm (J/g) Tm (ºC) ∆Hm (J/g) Tm (ºC)
Pectinex Ultra SP-L 20.6±0.4 -24.4±0.4 11.3±0.5 -4.6±0.6 43.6±0.4 10.4±0.3
Celluclast 1.5 L 20.5±3.2 -24.3±1.0 12.0±1.3 -3.9±0.9 40.6±4.0 10.7±0.5
Viscozyme L 21.6±1.5 -24.1±0.5 12.1±0.4 -4.1±0.3 43.3±1.2 10.7±0.3 a n=3. Tm: Melting temperature. ∆Hm : Melting enthalpie.
The solid fat indices (SFI) of the oils, calculated from their corresponding thermograms by
sequential peak areas integration, indicate that SFI decreases as temperature increases
(Figure A.3.3). As can be observed, complete melting of the oils is achieved above 20ºC.
98
Temperature (ºC)
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50
Hea
t flo
w e
ndo
dow
n (m
W)
0
1
2
3
4
5
6
Pectinex Ultra SP-LCelluclast 1.5LViscozyme L
Figure A.3.2. Melting profiles of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC (4ºC/min scan rate)
Temperature (ºC)-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50
Solid
Fat
Con
tent
(%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Pectinex Ultra SP-LCelluclast 1.5LViscozyme L
Figure A.3.3. Solid fat content of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC
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