Extraction et prétraitement de fibres naturelles de lin par une … · 2019-06-27 · Extraction et prétraitement de fibres naturelles de lin par une approche enzymatique combinée

© Hervé Mayamba Nlandu, 2019

Extraction et prétraitement de fibres naturelles de lin par une approche enzymatique combinée au CO2

supercritique

Thèse

Hervé Mayamba Nlandu

Doctorat en génie chimique

Philosophiæ doctor (Ph. D.)

Québec, Canada

Extraction et prétraitement de fibres naturelles de lin par une approche

enzymatique combinée au CO2 supercritique

Thèse

Hervé Nlandu

Sous la direction de :

Safia Hamoudi, en remplacement de Khaled Belkacemi, directrice de recherche

Saïd Elkoun, codirecteur de recherche

iii

Résumé

La présente étude a eu pour objectif principal de mettre en place un procédé de

prétraitement de la fibre naturelle de lin, de fabrication de nanofibres lignocellulosiques et

leur modification de surface subséquente, environnementalement irréprochable sur toute

la ligne. Afin de répondre à cet objectif principal, les nanofibres lignocellulosiques de lin

ont été préparées en utilisant un procédé respectueux de l'environnement, soit une

combinaison de prétraitement au dioxyde de carbone (CO2) dans les conditions

supercritiques et d'hydrolyse enzymatique. Le prétraitement au CO2 supercritique visait à

surmonter la récalcitrance de la biomasse lignocellulosique et à donner accès aux

enzymes hydrolytiques. Il a été démontré que le prétraitement au CO2 supercritique des

fibres de lin a aidé à déstructurer la biomasse tout en évitant son fractionnement et à

faciliter l’hydrolyse enzymatique subséquente du substrat. Un cocktail d’enzymes

hydrolytiques comprenant la cellulase, la xylanase, la pectinase et la viscozyme a été

utilisé et a permis d’extraire des fibres lignocellulosiques ayant des dimensions

nanométriques. Ces nanofibres lignocellulosiques extraites ainsi que les résidus solides

de l’hydrolyse sont de nature hydrophile en raison de l'attraction / interaction entre les

groupes hydroxyles des composants fibreux et des molécules d'eau. La nature hydrophile

de ces nanofibres lignocellulosiques aboutit souvent à une mauvaise compatibilité avec

des matrices polymères hydrophobes. Une modification de surface s’impose donc afin de

les rendre plus hydrophobes et donc compatibles avec les matrices hydrophobes. La

laccase, une enzyme spécifique a été utilisée pour catalyser le greffage de composés

phénoliques naturels, le gaïacol et le syringaldéhyde, rendant ainsi les nanofibres

lignocellulosiques et les résidus solides de l’hydrolyse plus hydrophobes et compatibles

avec les matrices hydrophobes. Aucun changement significatif dans la composition

chimique des fibres de lin n’a été observé après le prétraitement tel que suggéré par les

analyses par spectroscopie infrarouge. Ces dernières ont démontré par ailleurs le greffage

de surface induit par la laccase, du guaïacol et du syringaldéhyde sur les nanofibres

extraites et sur les résidus de l’hydrolyse. La technique de diffraction des rayons X a

révélé que la cristallinité augmentait suite au prétraitement de la fibre avec le CO2

supercritique ainsi que suite à l’extraction des nanofibres. La microscopie électronique à

balayage a révélé les dommages physiques causés à la surface des fibres suite au

prétraitement alors que la microscopie électronique à transmission démontrait que les

nanofibres lignocellulosiques extraites étaient en forme des filaments, avec un diamètre de

5 – 10 nm et plusieurs micromètres de longueur. Enfin les fibres fonctionnalisées ont

iv

montré une meilleure stabilité thermique et un caractère hydrophobe comparativement aux

fibres brutes non traitées.

v

Abstract

The main goal of this research was to set up an environmentally friendly process for the

pretreatment of natural flax fibres in view to produce lignocellulosic nanofibers and modify

their surface for their use as compatible fillers in polymer composites. To achieve this main

objective, lignocellulosic nanosized flax fibres were prepared using an environmentally

friendly process based on a combination of supercritical carbon dioxide pretreatment and

enzymatic hydrolysis conditions. Supercritical CO2 pretreatment aimed to overcome the

recalcitrance of lignocellulosic biomass and to provide access to hydrolytic enzymes. It

was shown that the supercritical CO2 pretreatment of raw flax fibers helped to deconstruct

biomass, avoiding its fractionation and increased access to hydrolytic enzymes such as

cellulase, xylanase, pectinase and viscozyme leading to extraction of lignocellulosic fibres

having nanometric dimensions. These extracted lignocellulosic nanofibres as well as the

solid residues of the hydrolysis are hydrophilic in nature because of the attraction /

interaction between the hydroxyl groups of the fibrous components and water molecules.

The hydrophilic nature of these lignocellulosic nanofibers often results in poor compatibility

with hydrophobic polymeric matrices. Surface modification is therefore necessary to make

them more hydrophobic and compatible with the hydrophobic matrices. Laccase mediated

grafting of natural phenolic compounds, i.e. guaiacol and syringaldehyde, onto

lignocellulosic fiber was achieved, thus making lignocellulosic nanofibers and hydrolysis

solids residues more hydrophobic and compatible with hydrophobic matrices. No

significant changes in the chemical composition of flax fibres were observed after

pretreatment. This was confirmed by FTIR analysis, which also demonstrated laccase-

induced grafting of guaiacol and syringaldehyde onto lignocellulosic nanofibers and solid

residues hydrolysis surfaces. Moreover, X-ray diffraction revealed that crystallinity

increased for supercritical CO2 pretreated fibres as well as enzymatically produced

lignocellulosic nanofibers. Scanning electron microscopy revealed the physical damages in

the form of holes, cracks and erosions onto the surface of supercritical CO2 pretreated flax

fibres, while transmission electron microscopy evidenced the production of filament-

shaped nanosized fibrils with a diameter of 5-10 nm and several micrometers length.

Finally, bio-grafted fibers showed better thermal stability and hydrophobicity if compared to

untreated raw analogues.

vi

Table des matières

Résumé............................................................................................................................ iii

Abstract ............................................................................................................................ v

Table des matières.......................................................................................................... vi

Liste des figures .............................................................................................................. x

Liste des tableaux .......................................................................................................... xii

Liste des abréviations .................................................................................................. xiii

Symboles ....................................................................................................................... xiv

Remerciements ............................................................................................................ xvii

Avant-propos ................................................................................................................ xix

Introduction générale ...................................................................................................... 1

Chapitre I .......................................................................................................................... 4

I. Revue générale de la littérature ................................................................................ 4

I.1. La biomasse lignocellulosique ......................................................................... 4

I.1.1. Définition ...................................................................................................... 4 I.1.2. Classification ................................................................................................ 4 I.1.3. Structure ....................................................................................................... 5 I.1.4. Morphologie .................................................................................................. 6 I.1.5. Composition chimique .................................................................................. 7 I.1.6. Parois des cellules végétales ...................................................................... 11

I.2. La fibre de lin ................................................................................................... 11

I.2.1. Description botanique ................................................................................. 11 I.2.2. Production .................................................................................................. 12 I.2.3. Le marché .................................................................................................. 14 I.2.4. Caractéristiques et propriétés ..................................................................... 16

I.3. Les méthodes de prétraitement ...................................................................... 20

I.3.1. Les prétraitements physiques ..................................................................... 21 I.3.2. Les prétraitements chimiques ..................................................................... 24 I.3.3. Les prétraitements physico-chimiques. ....................................................... 31 I.3.4. Les prétraitements biologiques ................................................................... 36 I.3.5. Les combinaisons de prétraitements .......................................................... 38

I.4. Extraction de la fibre lignocellulosique ......................................................... 40

I.4.1. Notions sur les nanoparticules de la fibre lignocellulosique ......................... 40 I.4.2. Les méthodes physiques d’extraction ......................................................... 43 I.4.3. La méthode chimique d’extraction .............................................................. 45 I.4.4. Les méthodes biologiques d’extraction ....................................................... 47

vii

I.5. Fonctionnalisation de la fibre lignocellulosique ........................................... 48

I.5.1. Les méthodes physiques de fonctionnalisation ........................................... 49 I.5.2. Les méthodes chimiques de fonctionnalisation ........................................... 50 I.5.3. Les méthodes biologiques de fonctionnalisation ......................................... 54

I.6. Les laccases .................................................................................................... 55

I.6.1. Définition .................................................................................................... 55 I.6.2. Source de laccases .................................................................................... 56 I.6.3. Structure ..................................................................................................... 57 I.6.4. Mécanisme réactionnel ............................................................................... 59 I.6.5. Propriétés physico chimiques ..................................................................... 60 I.6.6. Applications ................................................................................................ 63

Conclusion du chapitre et situation du sujet de recherche ........................................ 67

Chapitre II ....................................................................................................................... 70

II. Hypothèses et objectifs de la recherche ............................................................... 70

II.1.1. Hypothèses ................................................................................................ 70 II.1.2. Objectifs ..................................................................................................... 70

Chapitre III ...................................................................................................................... 72

III. Matériels et méthodes ............................................................................................. 72

III.1. Matériels ........................................................................................................... 72

III.1.1. La matière première lignocellulosique ......................................................... 72 III.1.2. Les enzymes .............................................................................................. 72 III.1.3. Les produits chimiques ............................................................................... 74

III.2. Méthodes .......................................................................................................... 75

III.2.1. Préparation et conditionnement de la fibre de lin ........................................ 75 III.2.2. Prétraitement au CO2 supercritique ............................................................ 75 III.2.3. Extraction de fibre lignocellulosiques .......................................................... 77 III.2.4. Fonctionnalisation de fibres lignocellulosiques ............................................ 80 III.2.5. Les méthodes analytiques .......................................................................... 81

Chapitre IV ...................................................................................................................... 88

IV. Flax nanofibrils production via supercritical carbon dioxide pretreatment and enzymatic hydrolysis ..................................................................................................... 88

IV.1. Resumé ............................................................................................................ 88

IV.2. Abstract ............................................................................................................ 89

IV.3. Introduction ...................................................................................................... 89

IV.4. Materials and methods .................................................................................... 93

IV.4.1. Materials ..................................................................................................... 93 IV.4.2. Supercritical CO2 pretreatment ................................................................... 94 IV.4.3. Lignocellulosic nanofibrils production .......................................................... 94

viii

IV.4.4. Fibres characterization ............................................................................... 96

IV.5. Results and discussion ................................................................................... 98

IV.5.1. Lignocellulosic nanofibrils production .......................................................... 98 IV.5.2. Characterization ....................................................................................... 100

IV.6. Conclusion ..................................................................................................... 105

Contribution de l’article ............................................................................................... 106

Chapitre V ..................................................................................................................... 107

V. Laccase-mediated grafting of phenolic compounds onto lignocellulosic flax nanofibres .................................................................................................................... 107

V.1. Resumé .......................................................................................................... 107

V.2. Abstract .......................................................................................................... 108

V.3. Introduction .................................................................................................... 108

V.4. Materials and methods .................................................................................. 111

V.4.1. Materials ................................................................................................... 111 V.4.2. Laccase-mediated grafting phenolic compounds onto lignocellulosic nanofibrils ................................................................................................................ 112 V.4.3. Monitoring of reaction kinetics .................................................................. 112 V.4.4. Characterization of the nanofibrils ............................................................. 112

V.5. Results and discussion ................................................................................. 113

V.5.1. Enzymatic reaction time profiles ............................................................... 113 V.5.2. Characterization of LCNF materials .......................................................... 114

V.6. Conclusion ..................................................................................................... 118


Chapitre VI .................................................................................................................... 120

VI. Laccase-mediated grafting of guaiacol and syringaldehyde onto flax fibers for hydrophobization treatment ........................................................................................ 120

VI.1. Resumé .......................................................................................................... 120

VI.2. Abstract .......................................................................................................... 120

VI.3. Introduction .................................................................................................... 121

VI.4. Materials and methods .................................................................................. 122

VI.4.1. Materials ................................................................................................... 122 VI.4.2. Laccase-mediated grafting guaiacol and syringaldehyde onto lignocellulosic flax fibres ................................................................................................................. 123 VI.4.3. Measurement and optimization of biografting ratio .................................... 123 VI.4.4. Characterization of the biografted fibers ................................................... 124

VI.5. Results and discussion ................................................................................. 125

VI.5.1. Optimization of biografting conditions ....................................................... 125

ix

VI.5.2. Characterization of grafted LCFF materials .............................................. 126

VI.6. Conclusion ..................................................................................................... 130


Conclusion générale et perspectives ......................................................................... 132

Bibliographie ................................................................................................................ 135

x

Liste des figures

Figure I.1. Structure de la fibre végétale [13] ..................................................................... 6

Figure I.2. Structure de la cellulose [20] ............................................................................. 8

Figure I.3. Structure d’hémicelluloses [25] ......................................................................... 9

Figure I.4. Représentation schématique d’une structure de lignine typique [26] ............... 10

Figure I.5. Structure de la paroi de cellules végétales macroscopiques [29] .................... 11

Figure I.6. Schéma des principales étapes d’une ligne de teillage [34] et des fractions végétales issues de la paille de lin avec leur rendement (source Ademe) ........................ 14

Figure I.7. Principaux pays producteurs de lin oléagineux en 2009 [37] ........................... 15

Figure I.8. Coupes transversales et représentations schématiques du lin à différentes échelles, de la tige aux fibrilles de cellulose [43] .............................................................. 17

Figure I.9. Effets du prétraitement sur la biomasse lignocellulosique [63] ........................ 21

Figure I.10. Principaux cations et anions dans les liquides ioniques [110] ........................ 30

Figure I.11 Procédés mécaniques pour la production des nanofibres de cellulose [165] .. 45

Figure I.12. Réactions conduisant à l’estérification des surfaces cellulosiques [190] ....... 51

Figure I.13. Hydrolyse de silane ....................................................................................... 51

Figure I.14. Autocondensation des silanols ...................................................................... 52

Figure I.15. Adsorption de silanols ................................................................................... 52

Figure I.16. Greffage de silanols ...................................................................................... 53

Figure I.17. Mécanisme de biogreffage du syringaldéhyde sur les fibres de coco catalysé par la laccase [8] .............................................................................................................. 55

Figure I.18. Les réactions catalysées par la laccase (EC1.10.3.2) [201] .......................... 56

Figure I.19. Structure tridimensionnelle de : (a) laccase de champignons de Rigidoporus lignosus [216] et (b) laccase bactérienne de Bacillus subtilis [222] ................................. 57

Figure I.20. Environnement des 4 atomes de cuivre du site actif de la laccase (CotA) de Bacillus subtilis [217]........................................................................................................ 59

Figure I.21. Cycle catalytique de la laccase [231] ............................................................ 60

Figure I.22. Représentation schématique de la catalyse par la laccase en présence d'un médiateur [243] ................................................................................................................ 62

Figure III.1. Broyage et tamisage de la fibre ..................................................................... 75

Figure III.2. Dispositif du prétraitement au CO2 supercritique ........................................... 76

Figure III.3. Protocole de l'hydrolyse enzymatique et étapes analytiques pour déterminer la conversion ....................................................................................................................... 78

Figure IV.1. Experimental protocol of enzymatic hydrolysis and analytical steps to result in the extraction of lignocellulosic nanofibrils ....................................................................... 95

Figure IV.2. HPLC chromatograms of the precipitated hydrolysates: (a) Raw flax fibres and (b), SC-CO2 PFF-A (c) SC-CO2-PFF-B and (d) SC-CO2-PFF-C: Peaks 1 = Glucose; 2 =

xi

Cellobiose (DP 2); 3 = Maltotriose (DP 3); 4 = Cellotetraose (DP 4) and 5 = Cellopentaose (DP 5). ............................................................................................................................. 99

Figure IV.3. TEM images of lignocellulosic fragment fibers: (a) aggregates from RFF; (b) microfibrils from SC-CO2-PFF-A and nanofibrils from (c) SC-CO2-PFF-B (c) and (d) SC-CO2-PFF-C. ................................................................................................................... 101

Figure IV.4. SEM pictures: (a) Raw flax fiber (RFF), (b) SC-CO2 PFF-A (c) SC-CO2 PFF-B, (d) SC-CO2 PFF-C and (e) LCNF. .................................................................................. 102

Figure IV.5. FTIR spectra of: (A): untreated or Raw flax fiber (RFF) and SC-CO2 pretreated flax fibers and (B): lignocellulosic fragment fibres extracted. .......................................... 104

Figure IV.6. XRD patterns of Raw flax fiber (RFF), SC-CO2-PFF and different lignocellulosic fragment fibers extracted......................................................................... 105

Figure V.1. Time profile consumption of guaiacol (G) and Syringaldehyde (S) in different media: G or S with laccase (●); G or S with laccase and LCNF (▲); G or S with LCNF (■) ...................................................................................................................................... 114

Figure V.2. FTIR spectra of raw and surface-modified LCNF materials .......................... 115

Figure V.3. UV-Visible spectra of raw and surface-modified LCNF materials ................. 116

Figure V.4. TG (a) and DTG (b) curves of raw and surface-modified LCNF materials .... 117

Figure V.5. Contact angles over time for the raw and surface-modified LCNF materials 118

Figure VI.1. Effect of laccase and phenolic concentrations and incubation time on the biografting ratio, Gp: (A) with Guaiacol and (B) with Syringaldehyde ............................. 126

Figure VI.2. FTIR spectra of raw and surface-modified LCFF materials ......................... 127

Figure VI.3. SEM images: (a) raw (LCFF), (b) guaiacol-grafted and (c) syringaldehyde-grafted lignocellulosic flax fibers .................................................................................... 128

Figure VI.4. XRD patterns of raw and surface-modified LCFF materials ........................ 129

Figure VI.5. TG and DTG of raw and surface-modified LCFF materials ......................... 129

Figure VI.6. Water contact angle of raw and surface-modified lignocellulosic flax fibres 130

xii

Liste des tableaux

Tableau I.1. Les principaux types de fibres végétales [12] ................................................. 5

Tableau I.2. Propriétés morphologiques de quelques fibres végétales ............................... 7

Tableau I.3. Composition chimique de quelques fibres végétales [17] ............................... 7

Tableau I.4. Calendrier de la culture de lin ....................................................................... 12

Tableau I.5. Composition chimique des fibres de lin rapportée par différents auteurs ...... 17

Tableau I.6. Consommation d’énergie pour la réduction de la taille par broyage mécanique de la biomasse lignocellulosique (quelques exemples) .................................................... 22

Tableau I.7. Exemples de procédés Organosolv .............................................................. 29

Tableau I.8. Effets de différents procédés de prétraitement sur les compositions et les structures des matériaux lignocellulosiques [78]. ............................................................. 39

Tableau III.1. Les solvants utilisés ................................................................................... 74

Tableau III.2. Les produits chimiques utilisés ................................................................... 74

Tableau III.3. Les substrats phénoliques utilisés .............................................................. 74

Tableau III.4. Les sucres monomères utilisés comme standards ..................................... 74

Tableau III.5. Les sucres oligomères utilisés comme standards ....................................... 75

Tableau III.6. Paramètres opératoires du déroulement d'un procédé de prétraitement au CO2 supercritique. ............................................................................................................ 77

Tableau III.7. Méthodes d’analyses histochimiques utilisées............................................ 82

Tableau III.8. Gradients d’élution pour les analyses HPLC d’oligomères.......................... 85

Tableau VI.1. Infrared main transitions for flax fibers bundles ........................................ 127

xiii

Liste des abréviations

TAPPI: Technical Association of the Pulp and Paper Industry;

FTIR : Fourier transform infrared spectroscopy/ Spectroscopie Infrarouge à transformée de

Fourier (IRTF) ;

UV : Ultraviolet;

HPLC : High performance liquid chromatography / Chromatographie liquide à haute

performance (CLHP) ;

SEM: Scanning electron microscopy / Microscopie électronique à balayage (MEB);

TEM : Transmission electron microscopy / microscopie électronique à transmission (MET);

TGA: Thermogravimetric analysis / Analyse thermogravimétrique (ATG);

DTG: Derivative Thermogravimetric analysis / Signal dérivé de l’analyse

thermogravimétrique;

XRD: X-ray diffraction / Diffraction aux rayons X (DRX);

WCA : Water contact angle / angle de contact à l’eau;

CO2 : Carbon dioxide / dioxyde de carbone;

SC-CO2 : Supercritical carbon dioxide / dioxyde de carbone supercritique;

RFF : Raw flax fibres / Fibre de lin brute;

SC-CO2-PFF : Supercritical carbon dioxide pretreated flax fibre / Fibre de lin pretraitée au

dioxyde de carbone supercritique;

G : Guaïacol;

S : Syringalgehyde;

LCA : Lignocellulosic aggregates / agrégats lignocellulosiques;

LCMF : Lignocellulosic microfibres / microfibres lignocellulosiques;

LCNF : Lignocellulosic nanofibres / nanofibres lignocellulosiques;

LCNFG : Guaiacol-grafted Lignocellulosic nanofibres / Nanofibres lignocellulosiques

greffées du gaïacol;

LCNFS : Syringaldehyde-grafted lignocellulosic nanofibres / Nanofibres lignocellulosiques

greffées du syringaldéhyde;

LCFF : Lignocellulosic flax fibres / fibres de lin lignocellulosique;

G-g-LCFF: Guaïacol-grafted lignocellulosic flax fibres / fibres de lin lignocellulosiques

greffées du guaïacol;

S-g-LCFF: Syringaldehyde-grafted Lignocellulosic flax fibres / fibres de lin

lignocellulosiques greffées du syringaldéhyde.

xiv

Symboles

Gp : Pourcentage du biogreffage (%)

τ: Indice de cristallinité (%)

Mc : Masse corrigée du filtrat due à l’incorporation d’enzymes (g)

Ms : Masse des résidus secs de l’hydrolyse (g)

P : Pression (MPa)

T : Température (°C)

xv

À ma famille, pour le soutien, l’affection et l’énergie reçus !! À Khaled Belkacemi

par qui l’opportunité de toute une vie m’a été accordée. À jamais dans nos cœurs.

Repose en paix!

xvi

Croire correctement c’est savoir constamment la présence de Dieu en nous et avec nous en toute situation.

Victor Paul Wierwelle

xvii

Remerciements

J’aimerais tout d’abord rendre hommage à mon directeur, le regretté professeur Khaled

Belkacemi, victime de l’ignorance humaine, par qui l’opportunité de réaliser un rêve de

toute une vie m’a été accordée. Pour avoir permis l’existence de ce projet de thèse, pour

m’avoir accueilli au sein de ton équipe de recherche au département de sol et génie

agroalimentaire de l’université Laval, pour ton soutien constant et la confiance que tu m’as

témoignés, pour le financement que tu m’as accordé, de l’au-delà où tu séjournes

désormais, certes tu ne pourras me lire ou m’entendre, mais à travers ta famille, tes

collègues, tes amis, tous ceux qui t’ont connu ou te connaitront à travers cette missive,

laisse-moi te dire : Merci, Merci pour tout, et à jamais dans mon cœur.

Je remercie profondément la professeure Safia Hamoudi, qui a bien voulu reprendre par la

suite la direction de ma thèse malgré son canevas déjà chargé. Oui, ça ne pouvait être

que toi pour parachever cette œuvre car c’est de toi et de tes enfants Amir et Megda que

j’ai tiré et je puise encore cette force pour aller jusqu’au bout de ce travail. Ta présence

effective à mes côtés et ta disponibilité m’ont donné des béquilles pour achever ce travail.

Je te remercie également pour le soutien financier que tu m’assuré tout au long de cette

période sous ta direction.

Je remercie vivement mon codirecteur de recherche, le professeur Saïd Elkoun de

l’université de Sherbrooke pour son soutien indéfectible à mon égard, ses orientations, ses

conseils et aussi son soutien financier. Me donner ton numéro de cellulaire personnel où

je pouvais t’appeler au moindre souci et à n’importe quel moment, démontrait cette ferme

volonté de pouvoir m’apporter tout ce dont j’avais besoin. Merci cher professeur car ce

soutien a été effectif.

Mes remerciements s’étendent au professeur Mathieu Robert de l’université de

Sherbrooke pour son appui et financement au tout début de mon doctorat et au docteur

Nasima Chorfa, professionnelle de recherche à la faculté des sciences de l'agriculture et

de l'alimentation de l’université Laval pour son assistance, ses orientations, ses conseils et

sa disponibilité en tout temps tout au long de mon doctorat.

Mes remerciements vont aussi à Diagne Gagnon, Pascal Lavoie et Jocelyne Giasson ainsi

qu’à tout le personnel administratif et technique du département de génie chimique et celui

de sols et génie agroalimentaire de l’université Laval. Sans leur expertise, leurs conseils,

orientations et aides, mes travaux ainsi que mon cheminement auraient été plus difficiles à

réaliser. Merci à ICNA Relief Canada pour la Bourse ICNA-Prix Khaled Belkacemi que j’ai

reçue à trois reprises en hommage au regretté Khaled Belkacemi.

xviii

Une dédicace spéciale à toutes les personnes qui sont passées dans le bureau 2308,

mais aussi à Valentin Leroy, Natàlia Ueda Yamaguchi, Carolina Sayury Miyashiro, Ines

Ayouba, Mabrouk Feriani, et tous ceux que j’ai rencontrés et avec qui nous avons

partagés les mêmes directeurs de recherche durant cette période si importante de ma vie.

J’aimerais aussi exprimer ma profonde gratitude à tous mes amies et amis : Sarah Yoga,

Mardochée Mokengoy, Eric Sita, Gedeon Khenda, Noella Kiayima, Jane Zakompani, Jean

blaise Kalala, Ken Kelu ainsi que la communauté des étudiants congolais inscrits à

l’université Laval. La générosité, la bonne humeur et l’attention qu’ils m’ont apportées ont

contribué à rendre cette étape de ma vie très plaisante.

Je tiens également à remercier ma famille, particulièrement mes parents et mes sœurs,

qui n’ont jamais ménagé d’efforts pour me soutenir et s’investir dans mes projets

personnels et académiques. À la maisonnée The Way International : Jacqueline Esso,

Carole, Gérard, Christiane, Nathan, Mathieu Odessi, Marline Brunache, Bourgeois

Boungous, Prisca Essoh, Varlet-de-Jancy, Forcel Luc Aurore, Georgia, Ruddy Mopenza,

Severin Baluaka et Arlette Katanga, merci d’avoir été pour moi cette famille dont j’ai eu

besoin au Québec pour relever ce défi durant toutes ces années.

Merci à toi Romaine Boukou, pour tes encouragements, ton soutien et ton écoute tout au

long de cette aventure. Enfin, ces remerciements ne seraient pas complets sans

mentionner mon fils, Nathan Nlandu Mayamba, ma fierté, la source de motivation qui me

comble de bonheur.

Merci à tous !

xix

Avant-propos

Ce travail a été réalisé dans le cadre du programme de doctorat en génie chimique

et les résultats obtenus sont présentés sous la forme d’une thèse avec insertion d’articles.

Trois articles font ainsi partie intégrante de cette thèse dont leurs titres sont les suivants:

− Chapitre IV: Flax nanofibrils production via supercritical carbon dioxide

pretreatment and enzymatic hydrolysis (article soumis le 24 janvier 2019 au

Canadian Journal of Chemical Engineering);

− Chapitre V: Laccase-mediated grafting of phenolic compounds onto

lignocellulosic flax nanofibres (article soumis le 13 février au journal Waste

and Biomass Valorization);

− Chapitre VI: Laccase-mediated grafting guaiacol and syringaldehyde onto

lignocellulosic flax fibers for hydrophobization treatment (article soumis le

01 mars 2019 au Journal of Natural Fibers).

Les résultats de cette étude ont également été présentés sous forme de

présentations lors des congrès et séminaires suivants:

67ème Conférence canadienne de génie chimique qui s’est tenu du 22 au 25

octobre 2017 à Edmonton;

Mini-symposium départemental qui s’est tenu le jeudi 7 décembre 2017 au

département de génie chimique de l’université Laval;

9ème conférence annuelle du Centre en Chimie Verte et Catalyse (CCVC) qui s’est

tenue vendredi, le 4 mai 2018 à l’Université Laval;

29ème Congrès interaméricain de génie chimique intégrant la 68ème Conférence

canadienne de génie chimique qui s’est tenue du 28 au 31 octobre 2018 à Toronto.

En tant que candidat au doctorat et premier auteur de ces articles, j’ai effectué la

planification du travail, la préparation des échantillons, les essais de laboratoire, l’analyse

des données ainsi que la rédaction des articles. Le premier directeur de ma thèse, le

regretté professeur Khaled Belkacemi, en tant que coauteur des articles, fut responsable

de m’encadrer et de me conseiller dans la planification de ce travail. Reprenant la suite de

xx

ce travail, la professeure Safia Hamoudi, en tant que directrice de ma thèse, a poursuivi

mon encadrement et a fait la révision et les corrections des articles. M. Saïd Elkoun,

professeur à l’Université de Sherbrooke, codirecteur de ma thèse, en tant que deuxième

coauteur des articles, a collaboré également à la révision des manuscrits. Nasima Chorfa,

professionnelle de recherche à la faculté des sciences de l'agriculture et de l'alimentation

de l’université Laval a participé activement et m’a apporté des orientations pour les essais

de laboratoire et analyses des données.

Ce projet de recherche a été financé par le Conseil de recherches en sciences

naturelles et en génie du Canada (CRSNG).

1

Introduction générale

Les polymères ou matières plastiques existent dès le 20è siècle en raison de leurs

propriétés remarquables et d’une demande croissante pour cette classe de matériaux.

Ces polymères sont pour la majorité issus de ressources fossiles, sont non renouvelables,

peu ou non biodégradables (cinétique de biodégradation extrêmement lente), et ont un

effet néfaste sur l’environnement.

Par ailleurs les pressions règlementaires nationales et internationales visant à

réduire l’impact environnemental néfaste de ces plastiques exigent des solutions de

substitution de ces polymères issus de la pétrochimie. En plus de la disparition ou la rareté

progressive, avec l’augmentation du prix du pétrole ces dernières années, le marché des

polymères issus des ressources naturelles, principalement issus des agroressources, a

connu un fort développement. La disponibilité, le coût de production, et le prix de ces

agroressources ont permis d’augmenter la compétitivité de ces biopolymères par rapport

aux polymères issus des ressources fossiles. Toutefois les performances de ces

biopolymères restent souvent inférieures à celles de petro-polymères.

Ces biopolymères renforcés via l’incorporation de fibres ou nano-renforts c’est-à-

dire la mise au point de matériaux composites à matrices biopolymères s’avère être la

solution d’avenir. L’utilisation de fibres naturelles (fibres de lin, chanvre, bambou etc.) et

surtout des nano-renforts biosourcés (issus de ces fibres naturelles) permettrait de

préserver le caractère biodégradable de la matrice, tout en renforçant cette dernière.

Cependant, à l’instar des composites conventionnels, une modification de surface

des fibres ou des nano-renforts reste primordiale et nécessaire afin d’obtenir une adhésion

interfaciale et donc un bio-composite aux propriétés optimales.

Dans cette étude nous nous sommes intéressés à une plante particulière dont la

culture est très répandue au Canada, le lin. En effet, le lin est cultivé au Canada

essentiellement pour l’utilisation de sa graine et ses cultivateurs se retrouvent avec

d’énormes quantités de déchets constitués des tiges, qui sont abandonnés ou carrément

incinérés occasionnant des problématiques d’ordre économique et écologique [1]. Ces

déchets non exploités peuvent donc être valorisés à travers les fibres contenues dans les

tiges qui les constituent.

2

Afin de valoriser ces déchets de biomasse de la culture du lin canadien, notre

étude sera fondamentalement portée sur l’extraction de fibres ayant les dimensions

nanométriques ou les nanofibres lignocellulosiques, qui peuvent être avantageusement

utilisées comme renforts dans diverses applications, ainsi que sur leur modification de

surface pour leur compatibilisation avec les biopolymères hydrophobes. Les applications

de ces nanofibres lignocellulosiques fonctionnalisées comme renforts biosourcés dans les

composites fibres lignocellulosiques/biopolymères hydrophobes seront effectives dans les

années à venir.

Ces dernières années, divers travaux ont été réalisés sur les prétraitements de la

biomasse lignocellulosique, les voies de fabrication ou d’extraction des fibres cellulosiques

ayant des dimensions nanométriques ou les nanocelluloses à partir de différentes

biomasses et sur la modification chimique de ces nanoparticules. Ces investigations ont

été portées sur diverses combinaisons de prétraitements, d'hydrolyses

acides/enzymatiques et de désintégrations mécaniques pour produire les nanoparticules

de fibres et leur fonctionnalisation par des voies chimiques [2-4]. Cependant, ces

approches sont loin d’être de la chimie verte. Elles posent des problèmes de récupération

chimique, engendrent des problèmes environnementaux et sont parfois énergivores.

Nous proposons donc une approche beaucoup plus verte dans cette étude. Une

extraction de nanofibres lignocellulosiques par des enzymatiques hydrolytiques après un

prétraitement de la biomasse au CO2 dans les conditions supercritiques, et une

modification de surface de ces nanofibres par greffage des composés phénoliques

naturels (guaïacol et syringaldéhyde) catalysé par une enzyme spécifique, la laccase.

L’originalité dans cette étude provient de deux approches:

− De l’utilisation des enzymes (Cellulase de Trichoderma Reesei, Endo-1-4-

β-xylanase de Trichoderma longibrachiatum, Pectinase d’Aspergillus niger

et Viscozyme) pour l’extraction des fibres : les travaux antérieurs ont utilisé

les enzymes dans la préparation de nanofibres ou leurs dérivés, toujours

en combinaison avec les méthodes classiques d’hydrolyse acide ou de

traitement mécanique [5-7]. Alors que dans cette étude aucune étape de

ces méthodes conventionnelles n’y prend part;

− De l’utilisation de la laccase (laccase de Trametes versicolor) pour

catalyser la modification de surface : Plusieurs travaux antérieurs ont utilisé

3

la laccase pour induire la modification de surface de divers matériaux

lignocellulosiques en greffant divers composés phénoliques mais aucun sur

le greffage du guaïacol ou du syringaldéhyde sur les nanomatériaux

(nanofibres) lignocellulosiques ou leurs dérivés [8-10].

Cette thèse sera divisée en 6 chapitres. Le premier chapitre est une revue

générale de la bibliographie utile pour le projet. Il explore le domaine de la fabrication des

nanoparticules de fibres et leurs dérivés en mettant l'accent sur la description et la

caractérisation des constituants de la matière première lignocellulosique, les procédés de

prétraitement, de modification de surface et les perspectives pour l’amélioration de leurs

propriétés. La description de la biomasse choisie comme matière première pour notre

étude ainsi qu’une attention particulière sur une enzyme spécifique, la laccase, utilisée

pour catalyser la modification de surface.

Fort d’une enrichissante revue générale de la littérature, le second chapitre expose

les hypothèses émises et fixe les objectifs de manière globale et spécifique alors que le

troisième chapitre sera consacré aux matériaux et méthodologies utilisées dans le cadre

de ce projet.

Enfin les 3 chapitres suivants sont consacrés aux différents résultats obtenus se

rapportant à l'extraction de fibres et à leur modification de surface, ainsi qu’à l'étude des

propriétés hydrophobes et thermiques des renforts fabriqués. Le quatrième chapitre

concerne donc l’extraction de nanofibres lignocellulosiques par voie enzymatique après

prétraitement au CO2 supercritique, alors que le cinquième chapitre concerne la

modification de surface de ces nanofibres extraites par greffage des composés

phénoliques, catalysé par la laccase. Cette modification de surface s’étend au sixième

chapitre, qui traite des résidus solides de l’hydrolyse ayant conduit à la fabrication de

nanofibres, lesquels résidus sont fonctionnalisés par greffage du guaïacol et

syringaldéhyde, catalysé par la laccase. Le but étant d’exploiter ces microfibres qui

constituent ces résidus, qui présenteront des propriétés différentes dans les composites

par rapport aux nanofibres, et surtout de valoriser la biomasse toute entière dans son

utilisation.

4

Chapitre I

I. Revue générale de la littérature

I.1. La biomasse lignocellulosique

I.1.1. Définition

La biomasse lignocellulosique représente essentiellement les co-produits agricoles

et forestiers, les déchets végétaux issus de la transformation agro-alimentaire et les

déchets de bois. Elle est constituée de structures biologiques fibrillaires composées

principalement de cellulose, hémicelluloses et lignine. On y trouve en proportion

relativement faible des extractibles non azotés, des matières protéiques brutes, des lipides

et des matières minérales. Les proportions de ces constituants dépendent notamment de

la variété végétale considérée, des conditions climatiques durant sa croissance et encore

de la qualité du sol où a été cultivée la plante [11].

I.1.2. Classification

La classification la plus courante pour les fibres naturelles est par type botanique

ou selon l’organe de la plante dont les fibres sont issues. En utilisant ce système, il existe

six types de base de fibres naturelles [12] : les fibres de tiges tels que le jute, le lin, le

chanvre, le ramie et le kénaf; les fibres de feuilles (banane, sisal, agave et ananas); les

fibres de graines (coco, coton et kapok); les fibres d’herbes (blé, mais, et riz); les fibres de

noyaux (kénaf, chanvre et jute) et autres types tels que les racines et le bois. Le tableau

I.1 donne la liste complète des types de fibres naturelles. Certaines plantes se retrouvent

dans plus d’une catégorie de fibres. Par exemple, le jute, le kénaf et le chanvre produisent

des fibres de tiges et de noyaux. L’agave, le coco, et le palmier à huile produisent à la fois

les fibres de fruits et celles de tiges. Les céréales produisent les fibres de tiges et de

coques.

5

Tableau I.1. Les principaux types de fibres végétales [12]

Tiges Feuilles Graines

Noyaux Herbes Autres Fibre Gousse Coque Fruit Paille

Chanvre Ananas

Coton

Kapok

Coco Palmier

Riz Kénaf Blé

Bois Ramie Sisal Avoine Lin Agave

Luffa Blé Jute Orge

Kénaf Banane Chanvre Riz Racines Jute Raphia

Asclépiade Avoine Flax Bambou

Bissap Abaca Bagasse

I.1.3. Structure

Les fibres végétales, quelle que soit leur origine ont toutes la même structure de

base (Fig.I.1.). Cette structure est multicouche et possède essentiellement:

− Une couche intercellulaire ou lamelle mitoyenne: d’épaisseur comprise

entre 0.5 – 2 µm et est composée de substances pectiques auxquelles de

la lignine peut être ajoutée, elle permet de lier les cellules les unes aux

autres;

− Une paroi primaire : très mince (0.03 – 0.1 µm), elle est souvent confondue

avec la couche intercellulaire. Elle contient une grande quantité de lignines.

Ses microfibrilles de celluloses enchevêtrées de lignines et hémicelluloses

forment un réseau poreux;

− Une paroi secondaire : composée de trois couches de microfibrilles (S1, S2,

S3). La couche S1 est constituée de microfibrilles croisées, avec un angle

compris entre 60° et 80° par rapport à l'axe de la cellule. La couche S2

constitue la partie la plus volumineuse de la paroi. Elle est composée de

microfibrilles en hélice formant un angle de 5° à 50° par rapport à l'axe de la

cellule. La couche S3 est constituée de microfibrilles dont l'orientation varie

entre 60 et 90° par rapport à l'axe de la cellule.

6

Figure I.1. Structure de la fibre végétale [13]

Chaque couche est donc essentiellement un matériau composite dans lequel les

microfibrilles de cellulose rigide sont noyées dans une douce matrice composée

principalement de la lignine et des hémicelluloses [14]. L’orientation des microfibrilles par

rapport à l’axe de la cellule joue un grand rôle dans les propriétés mécaniques des parois

des fibres. Plus l’angle des microfibrilles augmente, plus sa rigidité diminue, tandis que

l’extensibilité des parois augmente [15].

I.1.4. Morphologie

La morphologie des fibres végétales est fonction de plusieurs facteurs qui influent

sur ses dimensions. Elle dépend de l’origine de la biomasse, des conditions

environnementales de croissance de la plante, et aussi de l’état de maturité de cette

dernière. Le caractère variable du diamètre et de la longueur de la paroi des fibres

végétales constitue une donnée importante pour bien appréhender les transferts de

contraintes aux interfaces fibre-matrice [16]. Les propriétés morphologiques de quelques

fibres végétales sont répertoriées dans le tableau I .2.

7

Tableau I.2. Propriétés morphologiques de quelques fibres végétales

Fibres Longueur

(mm) Diamètre

(µm) Module de Young

(GPa)

Coton 25 12 – 25 6 – 10 Lin 4 – 8.5 12 – 30 50 – 70

Jute 2.5 5 – 25 20 – 55 Sisal 100 – 125 100 – 400 9 – 22

Chanvre 5 – 40 16 – 50 30 – 60 Kénaf 2.5 – 4.5 14 – 33 60

I.1.5. Composition chimique

Les fibres végétales sont fondamentalement constituées de la cellulose,

d’hémicelluloses, et de la lignine. On y trouve en faibles quantités les pectines, les

pigments et les extractibles (Tableau I.3).

Tableau I.3. Composition chimique de quelques fibres végétales [17]

Fibres Cellulose

(%) Hémicellulose

(%) Lignine

(%) Pectine

(%) Graisses

(%) Eau (%)

Chanvre 70 - 74 17.9 - 22.4 3.7 - 5.7 0.9 0.8 2 - 6.2 Lin 71 18.6 - 20.6 2.2 2.3 1.7 5 - 10

Jute 61 - 71.5 13.6 - 20.4 12 - 13 0.2 0.5 8 Coton 85 - 90 5.7 - 0 - 1 0.6 - Sisal 66 - 78 10 - 14 10 - 14 10 2 10 - 22

Ramie 68.6 - 76.2 13.1 - 16.7 0.6 - 0.7 1.9 7.5 - 17 7.5 Kénaf 45 - 57 21.5 8 - 13 3 - 5 - -

I.1.5.1. La cellulose

La cellulose est le polymère renouvelable le plus abondamment disponible sur

terre avec une production annuelle estimée de 1011 à 1012 tonnes, englobant environ 33%

de toutes les matières végétales [18]

Le terme cellulose, est le nom trivial de β-1,4-D-glucopyranan. C’est un

homopolysaccharide linéaire, avec un degré de polymérisation allant de plusieurs

centaines à plus de dix milles. La cellulose est composée d'unités de β-D-

anhydroglucopyranose, également appelées unités anhydroglucose et glucopyranose,

mais abrégé universellement AGU, liées par des liaisons éther β-1,4 appelées liaisons

glycosidiques. Le β-D-anhydroglucopyranose est un hétérocycle à six chaînons avec un

carbone anomère (marqué C1) et généralement présent dans la conformation chaise [19].

L'extrémité réductrice du polymère correspond à l'unité anhydroglucopyranose dont le

carbone anomérique n'est pas lié à une autre unité glucidique (Fig.I.2.). Il existe donc un

8

équilibre entre la forme hémiacétale et la forme aldéhyde réductrice minoritaire. L'unité

glucose située à l'autre bout de la chaîne cellulosique est appelée extrémité non-réductrice

car le carbone anomérique est engagé dans une liaison glycosidique β (1- 4).

Figure I.2. Structure de la cellulose [20]

Dans la nature, la cellulose ne se présente pas comme une molécule individuelle

isolée, mais se trouve sous forme d'assemblages de fibres individuelles formant des

chaînes de cellulose. D’une manière générale, environ 36 assemblages de chaînes de

glucanes sont réunis par des forces de van der Waals et des liaisons hydrogènes intra et

intermoléculaires en plus grandes unités appelées fibrilles élémentaires (protofibrilles), qui

se regroupent en plus grandes unités appelées microfibrilles, et celles-ci sont à leur tour

assemblées en fibres de cellulose familières [21].

La cellulose native a une structure cristalline de type I composée de deux

allomorphes, Iα et Iβ, dans des rapports différents, en fonction de la source de cellulose.

D'autres structures cristallines ont été identifiées comme la cellulose II, III1, III2, IV1, IV2 et

peuvent être obtenues par des traitements chimiques spécifiques [22]. La principale

différence entre les types de cellulose réside dans l'orientation moléculaire des fibres de

cellulose et de leur réseau de liaison hydrogène.

Parmi les nombreuses applications de la cellulose, nous pouvons rappeler que la

cellulose sert à la fabrication du papier et dans le domaine pharmaceutique à celle

d'additifs ou de liants utilisés lors de la préparation de comprimés, gélules ou granulés. Le

nitrate de cellulose, appelé "nitrocellulose" sert dans l'industrie des explosifs. D'autres

dérivés de la cellulose tels que la méthylcellulose, I'hydroxyméthylcellulose et la

carboxyméthylcellulose sont utilisés comme épaississants dans l'industrie des peintures.

9

I.1.5.2. Les hémicelluloses

Les hémicelluloses sont des hétéropolysaccharides qui diffèrent de la cellulose par

leur ramification et leur faible degré de polymérisation (50 à 300 unités). Elles peuvent être

linéaires ou branchées. En plus du glucose, les monomères de l'hémicellulose peuvent

être du xylose, du mannose, du fucose, du galactose, du rhamnose ou de l'arabinose et

des acides uroniques.

Leurs formules générales sont (C5H8O4)n ou (C6H10O5)n, appelées respectivement

pentosanes et hexosanes [23]. Les hémicelluloses les plus courantes, principalement

présentes dans les feuillus ou les plantes annuelles, sont constituées d'une chaîne

principale de 1,4-β-D-xylopyranosyle avec un nombre variable de chaînes latérales

basées sur des unités L-arabinofuranosyle, 4-O-méthyl-D-glucuronopyranosyle, L-

galactopyranosyle ou D-glucuronopyranosyle [24]. Les principales hémicelluloses

présentes dans le bois dur sont les (4-O-méthyl-D-glucuronopyranosyl) -D-xylanes

partiellement acétylés et souvent appelés simplement xylanes (Fig.I.3).

Figure I.3. Structure d’hémicelluloses [25]

Les hémicelluloses sont essentiellement utilisées pour la production de sucres. En

effet, en milieu acide, l'hydrolyse de la plupart des hémicelluloses conduit aux monomères

constitutifs tels que le xylose, le glucose et l'arabinose. La fermentation alcoolique ou

enzymatique des sucres ainsi formés, les transforme en alcools (éthanol, butanol) et en

acides organiques (butyrique, acétique, lactique).

10

I.1.5.3. La lignine

La lignine est un polymère amorphe tridimensionnel de nature phénolique. Elle

présente une grande variabilité structurale suivant l’origine botanique, c’est pourquoi on

parle plus généralement des lignines que de la lignine.

Après la cellulose, elles constituent le composé organique le plus abondant sur

terre. Les lignines sont issues de la polymérisation radicalaire de trois alcools

phénylpropanoïde ou plus communément appelé monolignols (p-coumarylique,

coniférylique et sinapylique). Ces trois unités diffèrent par le nombre de groupements

méthoxyle (OCH3) portés par le cycle aromatique: En raison de la variété de monolignols

et la nature aléatoire des liaisons entre ces monolignols, la structure réelle de la

macromolécule de lignine est assez complexe et non-connue. Cette structure complexe de

la lignine comprenant de nombreuses fonctions phénoliques, hydroxyles et éthers explique

sa grande réactivité. Cependant, leur accessibilité est limitée par la conformation

tridimensionnelle du réseau moléculaire mais aussi par la distribution de ce polymère

parmi les autres constituants de la paroi cellulaire de la matière végétale. Un exemple

typique de la structure de la lignine est représenté dans la figure I.4.

Figure I.4. Représentation schématique d’une structure de lignine typique [26]

Dans le passé, la lignine isolée à partir du prétraitement de la biomasse

lignocellulosique était généralement utilisée pour générer de la chaleur et de la vapeur

dans les procédés industriels. La lignine, un polymère de haut poids moléculaire composé

d'unités alkylphénol méthoxylées, a des applications industrielles potentielles puisqu'elle

11

est une source abondante de composés phénoliques [27]. Le composé phénolique le plus

précieux de la lignine étant la vanilline, qui a de bonnes chances dans l'industrie des

polymères de remplacer les matériaux à base de pétrole tels que le styrène et l'acide

téréphtalique [28].

I.1.6. Parois des cellules végétales

La cellulose (à la fois cristalline et amorphe), les hémicelluloses ramifiées et le

réseau de lignines interagissent étroitement les uns avec les autres pour construire les

parois des cellules végétales macroscopiques (Fig.I.5).

Lors de la formation de ces parois des cellules végétales, la lignocellulose n'est

pas simplement un mélange physique de cellulose, d'hémicelluloses et de lignine. Ces

composants sont fortement entre-liés par des liaisons non covalentes et des liaisons

covalentes.

Figure I.5. Structure de la paroi de cellules végétales macroscopiques [29]

I.2. La fibre de lin

I.2.1. Description botanique

Le lin est une plante de la famille des Linacées et du genre Linum, qui comporte

plus de deux cents espèces et cultivé pour ses graines et pour ses tiges. Cette plante est

constituée d’une tige dont l’extrémité est formée de plusieurs petites fleurs blanches,

bleues, roses ou violettes selon la variété. Au Québec, les liniculteurs traditionnels ont

12

surtout semé le lin à fleurs bleues. Des feuilles poussent tout le long de la tige qui se

ramifie au sommet. Après la floraison, les ramifications ou petites branches se terminent

chacune par une capsule, appelée "balle" ou "caboche", qui renferme une dizaine de

graines. Si les plantes sont suffisamment nourries et abreuvées, la floraison dure trois

semaines ou plus. [30].

I.2.2. Production

La culture du lin est relativement rapide et débute par la mise en terre de semis,

généralement en mars, et s’étale jusqu’à la rentrée des andains, en septembre. Le tableau

I.4 nous renseigne sur le calendrier approximatif de la culture de lin au cours d’une année

civile.

Tableau I.4. Calendrier de la culture de lin

Mars Avril Mai Juin Juillet Aout Septembre

Semis Levée Croissance Floraison Arrachage Rouissage Récolte

I.2.2.1. Croissance ou développement de la plante

Une centaine de jours est requise pour voir la tige de la plante croitre. Cette

croissance débute lentement mais, lorsque la tige mesure environ 25 cm, elle peut gagner

près de 2.5 cm par jour, déterminant essentiellement la longueur de la tige. Au moment de

la floraison en juin, se déroulant environ une semaine, l'élongation cesse. Les derniers

centimètres apicaux de la tige se sont formés, en même temps que la maturation des

graines. La tige a maintenant atteint une hauteur variante entre 30 et 120 cm, chez les lins

de haute qualité. La fleur de lin ne vit pas longtemps, quelques heures seulement. Elle

éclot le matin et se fane tôt l'après-midi. Par temps frais et couvert, les pétales durent

parfois une journée entière. C'est le début de la maturité. La plante commence à se

consolider et à former ses fibres. La partie centrale se lignifie et les filaments prennent de

la consistance [30].

I.2.2.2. Arrachage

Contrairement aux cultures céréalières, le lin ne se fauche pas mais il s'arrache à

la fin de juillet. Lorsque les plantes sont à maturité, elles sont arrachées du sol et étalées

en andain. L'arrachage traditionnel s'est toujours effectué à la main, sans instrument de

travail. L'invention récente des arracheuses mécaniques est survenue pour répondre aux

13

besoins de la production industrielle. Les fibres encore sous forme de faisceaux

contiennent des impuretés et ne sont pas facilement séparables du reste de la tige [31].

I.2.2.3. Rouissage

Le rouissage est l'opération qui a pour but de désagréger, d'isoler les unes des

autres les fibres textiles du lin, en les séparant de la partie ligneuse proprement dite.

Traditionnellement, il consistait à laisser tremper les tiges dans un cours d’eau ou une

pièce d’eau. Plus simplement aujourd’hui, on applique un trempage pendant trois jours

dans de l’eau à 32 °C. La méthode de rouissage la plus répandue est le rouissage sur le

champ ou à terre, où les tiges de lin fraichement arrachées sont étalées à même le sol,

préférablement humide afin que les microorganismes et bactéries dégradent les lamelles

mitoyennes ou ciment pectiques, qui lient les fibres entre elles et avec les autres tissus. Il

débute en août et/ou en septembre, lorsque les conditions d’humidité sont favorables, et

dure 5 à 8 semaines. Les pluies, les rosées, les vents et le soleil alternés sont des

facteurs qui favorisent la pullulation de bactéries et champignons sur les tiges [32]. Ces

tiges sont régulièrement retournées afin d’assurer un rouissage homogène. Une fois les

tiges rouies de façon homogène et suffisante, les andains sont enroulés et pressés en

grosses balles, stockées à l’abri de la pluie et isolées du sol [33].

I.2.2.4. Teillage

Le teillage, consiste à extraire de façon mécanique différents fragments végétales

contenus dans la plante. La Figure I.6 schématise une ligne de teillage propre au lin et

présente les proportions massiques des fractions végétales obtenues. L’opération se

déroule en plusieurs étapes [34]:

a. Ouverture de la balle et préparation de la nappe : les balles de pailles de lin

sont tout d’abord déroulées et les tiges alignées sont étirées avant d’être

décortiquées par des rouleaux broyeurs;

b. Broyage : le broyage brise la paille centrale sans endommager la fibre,

c’est-à-dire, fractionne les écorces et la partie ligneuse, les anas, qui sont

évacués par voie pneumatique (d);

c. Battage : les turbines munies de couteaux viennent alors frapper et frotter

les faisceaux de fibres afin de les affiner, et surtout séparer les anas de

fibres longues (la filasse). Les fibres courtes et les déchets de bois (qui

14

constituent les étoupes de teillage) sont alors éliminés pour ne récupérer

que les faisceaux fibreux.

Figure I.6. Schéma des principales étapes d’une ligne de teillage [34] et des fractions végétales issues de la paille de lin avec leur rendement (source Ademe)

I.2.2.5. Peignage

Le peignage est généralement effectué sur la filasse. Les faisceaux de fibres sont

parallélisés et divisés de plus en plus finement à l’aide de peignes garnis d’aiguilles. Il

permet de dénouer et d’aligner les faisceaux, de retirer les fibres courtes restantes afin

d’obtenir un ruban continu [35].

I.2.3. Le marché

Le marché économique du lin se divise en deux sous-catégories, soit le marché de

la filière oléagineux (graine de lin) et le marché de la filière textile (la fibre de lin).

Le Canada est le plus grand producteur et exportateur de lin au monde depuis

1994 (la filière oléagineuse). En 2005/06, le Canada a produit environ 1,035 million de

tonnes et expédie actuellement 60% de ses exportations de lin vers l'UE, 30% vers les

États-Unis et 4% vers le Japon [36]. Le lin canadien est recherché sur les marchés

mondiaux pour la grande qualité de ses semences. La production dans un pays nordique

comme le Canada augmente la teneur en acide gras alpha-linolénique et la valeur iodée

de la graine. L’acide gras alpha-linolénique (C18:3 appartenant à la famille des oméga 3),

est un acide gras essentiel pour la nutrition humaine. L'indice d'iode élevé est une mesure

15

importante de la capacité de séchage d’une huile qui est appréciée dans la fabrication du

linoléum (revêtement de sol), des encres d'imprimerie, des peintures et des teintures. En

parallèle les tourteaux, coproduits de l’huile lors de la trituration de la graine, ont connu un

vif succès en alimentation animale et notamment auprès des éleveurs de bovins,

probablement en raison de la teneur encore élevée en matières grasses résiduelles

(source d’énergie) et à la présence d’Omega 3 dont on ne connaissait pas explicitement

les bienfaits [37].

Figure I.7. Principaux pays producteurs de lin oléagineux en 2009 [37]

Pour ce qui est de la fibre, le marché de la filière textile, le portrait en est tout autre.

Les principaux producteurs de lin sont la France, la Belgique et les Pays-Bas, qui

concentrent ainsi 80% de la production mondiale de lin et cultivent près de 130 000

hectares par an. Les autres pays producteurs sont la Russie, la Biélorussie, l’Égypte et la

Chine. Ces derniers, même s’ils peuvent représenter des surfaces conséquentes,

produisent des lins dont les rendements en fibre sont 3 à 4 fois moindre qu’en Europe de

l’ouest et dont les qualités sont bien inférieures. De plus les productions russes et

biélorusses sont autoconsommées en quasi-totalité.

Aussi invraisemblable que cela puisse paraître, compte tenu de l'immensité du

volume de production de graines de lin au Canada, ce dernier ne figure pas dans la liste

de producteurs de la fibre de lin. Les facteurs climatiques et une échelle d'opération

déséquilibrée seraient en partie la cause la plus probable de cette situation [38]

16

I.2.4. Caractéristiques et propriétés

I.2.4.1. Structure et morphologie

Une tige de lin, qui à maturité mesure entre 80 et 120 cm, est composée de

plusieurs parties (Fig.I.8). Dans sa section, du centre vers la périphérie, on peut trouver :

la lacune, le xylème, le cambium, le phloème (qui est la partie qui nous va intéresser plus

parce qu’il contient les faisceaux fibreux), le cortex et l’épiderme [39].

Les faisceaux sont à l’intérieur du phloème et ils ont une longueur de plusieurs

dizaines de centimètres et regroupent jusqu’à une quarantaine de fibres collées entre elles

par une interphase à base de pectines qui sáppelle lamelle mitoyenne [40].

La fibre a une longueur de lórdre du centimètre (2-5 cm) et un diamètre de

quelques dizaines de microns (15-25 µm), ce qui fait un ratio d’un ordre de magnitude de

L/d ≈ 103. Sa section peut être polygonale, avec 5 à 7 cotés, ou elliptique, et est composée

de parois cylindriques concentriques [41]. En son centre elle possède une cavité appelée

lumen qui contribue à la circulation de l’eau et sa taille permet de déterminer la qualité et

le degré de maturité de la fibre. L’influence du lumen au centre de la fibre est importante

mais souvent négligée. Quand le diamètre du lumen est important par rapport à celui de la

fibre, la section réelle des parois de la fibre est plus faible, ce qui conduit à une diminution

de ses propriétés [42].

Autour de lumen se trouve la paroi secondaire avec une épaisseur de l’ordre de 10

μm, qui constitue la majorité du volume de la fibre et qui peut être divisée en 3 couches

différentes (S1, S2 et S3). La couche S2 est la plus épaisse et est constituée de lamelles

concentriques de cellulose parallèles entre elles dans une matrice de pectines.

L’interphase matrice-lamelles est composée d´hémicellulose. Dans ces lamelles il y a des

micro-fibrilles qui possèdent de bonnes propriétés mécaniques.

Finalement, la paroi la plus externe de la fibre est la paroi primaire d’épaisseur

dénviron 0,2 μm. Elle est très poreuse, élastique et continue. Ses constituants principaux

sont des pectines mais elle contient aussi quelques microfibrilles de cellulose orientées

aléatoirement.

17

Figure I.8. Coupes transversales et représentations schématiques du lin à différentes échelles, de la tige aux fibrilles de cellulose [43]

I.2.4.2. Composition chimique

La composition chimique des fibres de lin dépend notamment de la variété

considérée, des conditions climatiques durant sa croissance et ainsi que de la qualité du

sol où a été cultivée la plante. Les méthodes d’extraction ou de production de la fibre

unitaire à partir de la tige (arrachage, rouissage, teillage, peignage et traitements finaux)

en modifient également les caractéristiques.

La fibre de lin est principalement composée à l’instar de toutes les biomasses

lignocellulosiques, de la cellulose (64-74 %), d’hémicelluloses (10-20 %), de la lignine (2

%), des pectines (2 %) et d’eau (8-10 %) (Tableau I.5). Son fort taux massique de

cellulose et sa faible teneur en lignine, fait du lin un végétal à fort potentiel d’utilisation

comme un renfort pour les composites, puisque ses fibres sont particulièrement rigides.

Tableau I.5. Composition chimique des fibres de lin rapportée par différents auteurs

Cellulose (%)

Hémicellulose (%)

Lignines (%)

Pectines (%)

Cires (%)

Humidité (%)

Références

71.0 18.6 - 20.6 2.2 2.3 1.7 10.0 [44]

62–72.6 18.6 - 20 2–5 2.3 1.5 - 1.7 8 - 12 [45]

73.8 13.7 2.9 - - 7.9 [46]

65 2.5 - - - [47]

64 - 74 11 - 17 2 - 3 1.8 1.5 8 - 10 [48]

18

I.2.4.3. Propriétés physiques

a. La densité

La densité varie peu dúne espèce de fibre végétale à une autre et est liée à la

porosité de la fibre. Elle est de lórdre de 1,5 g/cm3, concrètement pour la fibre de lin, elle

vaut 1,54 g/cm3. Il a été estimé que la porosité de la fibre de lin était de lórdre de 10%,

par conséquent sa densité apparente valait 1,38 [40].

b. Les dimensions

Une fibre de lin a une longueur comprise entre 5 et 80 mm et sa moyenne est

située autour de 30mm. Son diamètre peut atteindre plusieurs dizaines de microns, avec

une moyenne de 20μm. Les fibres de lin, par comparaison avec dáutres fibres végétales,

sont parmi les plus fines et les plus longues. En fait leur rapport L/d = 1500 est élevé. Ce

rapport revêt d’une importance capitale lorsquíl ságit de fabriquer un composite

unidirectionnel, car le renfort doit être le plus continu possible et la surface de contact

entre la matrice et les fibres suffisante pour assurer le transfert de charge;

c. L’angle micro-fibrillaire

Il est un point de différentiation très déterminant parmi les propriétés physiques

dúne fibre. La fibre de lin possède des micro-fibrilles orientées majoritairement à 10º de

láxe de la fibre dans la couche S2 de la paroi secondaire, et cette désorientation est

minimale [49]. Les bonnes propriétés mécaniques de la fibre de lin peuvent séxpliquer en

partie sur la base de cette organisation micro-fibrillaire. A titre de comparaison, la fibre de

coton ná pas un angle micro-fibrillaire constante (1- 45º) mais présente une bonne teneur

en cellulose (83-90%) et une teneur en lignine négligeable.

d. Les défauts

Souvent appelés genoux, nœuds, bandes ou dislocations, présents à la surface et

dans le volume de la fibre, sont le principal point faible de la fibre de lin. Certains déntre

eux sont produits irréversiblement pendant la croissance de la plante, ce qui explique

qu’ils apparaissent souvent à la même hauteur sur différentes fibres d’un même faisceau

[50]. Le procédé de décortication peut engendrer également des défauts [51]. Pendant les

étapes d’extraction mécanique (teillage, peignage), les fibres sont soumises à de larges

19

efforts de compression et les genoux se forment [52] , et finalement il existe aussi des

défauts micro-structurels.

I.2.4.4. Propriétés mécaniques

Les propriétés mécaniques des fibres végétales dépendent de leur structure, de

leur composition, de leur forme mais aussi des conditions de tests. Mukherjee et

Satyanarayana [53] ont proposé une relation empirique structure-propriétés qui relie les

propriétés mécaniques de la fibre au taux de cellulose, à l’angle des microfibrilles et à la

taille des cellules.

La fibre de lin se situe parmi les fibres végétales le plus résistantes avec un

module d´élasticité dénviron 50 GPa et une contrainte à la rupture généralement

supérieure à 1000 MPa. En revanche, son allongement à la rupture compris entre 1 et 3%,

est particulièrement faible [54].

En traction, les essais mécaniques sont délicats à mettre en place. La plupart

provient déssais réalisés avec une cellule de faible charge et des mors adaptés. Les

données bibliographiques [47, 51, 55, 56] nous révèlent ces propriétés:

Contrainte à la rupture : σr (MPa) = 600 – 2000;

Déformation à la rupture : εr (%) = 1 – 4;

Module d´élasticité : E (GPa) = 12 – 85

En compression, les propriétés mécaniques peuvent être estimées grâce au test

de la boucle élastique, qui nous rapporte une valeur de contrainte de rupture en

compression de 1200 MPa ± 370 MPa, après une dizaine d’essais [57]. En effet, le test de

la boucle élastique, développé en 1950, consiste à faire une boucle avec une fibre de lin, à

tirer sur ses extrémités et à suivre l’évolution de la taille de la boucle ; dès que le rapport

hauteur/largeur de la boucle n’est plus constant (environ égal à 1,34), des

endommagements apparaissent en haut de la boucle (sur la zone externe en traction et

sur la zone interne en compression), conduisant à la rupture de la fibre [58].

20

I.3. Les méthodes de prétraitement

La biomasse lignocellulosique est une matière composite qui présente au moins

deux niveaux de complexité :

− Le premier niveau est chimique car en effet la biomasse lignocellulosique

est une matière hétérogène, composée de différentes macromolécules

telles que décrites ci-haut;

− Le deuxième niveau de complexité de la biomasse est structural, car les

différentes macromolécules décrites ci-dessus s’associent de façon intime

dans une maille tridimensionnelle qui constitue les parois des cellules

végétales.

La cristallinité de la cellulose, la perturbation ou l’interférence de l’hémicellulose, la

surface spécifique accessible (porosité), la protection de la lignine et l’association

cellulose- hémicellulose-lignine sont donc les principaux facteurs qui affectent le taux

d’accessibilité et de digestibilité de la biomasse lignocellulosique [59].

Ces deux niveaux de complexité réunis procurent aux matériaux lignocellulosiques

une forte récalcitrante à toute forme de fractionnement, c’est-à-dire séparer la biomasse

lignocellulosique en cellulose, hémicellulose et lignine, qui sont des molécules d’intérêts,

source de fabrication des produits chimiques à haute valeur ajoutée. La figure I.9 nous

renseigne l’effet qu’un prétraitement peut avoir sur les matériaux lignocellulosiques.

Le prétraitement a longtemps été considéré comme l'une des étapes de traitement

les plus chères dans la conversion de la biomasse en sucres fermentescibles [60]. Avec

l'avancement des technologies de prétraitement, ce dernier est aujourd’hui considéré

comme ayant un grand potentiel pour l'amélioration de l'efficacité et la réduction des coûts

[61].

Dans le but d’avoir les meilleurs rendements en produits techniquement et

économiquement acceptables, il est impératif de procéder au prétraitement de la

biomasse lignocellulosique dont la faisabilité est fortement limitée par des considérations

d’ordre énergétiques, de coûts et environnementales [62].

Un prétraitement, pour être efficace devrait répondre aux conditions suivantes :

21

− Équipements simples et robustes;

− Utilisation de produits chimiques moins chers;

− Solubilisation et fractionnement des entités chimiques de la biomasse d’une

façon sélective et contrôlée;

− Efficacité de prétraitement sur une grande variété de matériaux

lignocellulosiques.

Différents procédés de prétraitement ont été développés et peuvent être classés en

différentes catégories : physiques, chimiques, biologiques, physico-chimiques, et

également leurs combinaisons. Parmi toutes ces méthodes de prétraitement que nous

allons décrire, en particulier le prétraitement hydrothermique, celui qui fait intervenir les

solvants organiques (Organosolv) et l’explosion à la vapeur font aujourd’hui l’objet d’un

développement industriel.

Figure I.9. Effets du prétraitement sur la biomasse lignocellulosique [63]

I.3.1. Les prétraitements physiques

Les prétraitements physiques de la biomasse lignocellulosique ont pour but

d’augmenter la surface spécifique accessible des matériaux lignocellulosiques en

réduisant la taille des particules et perturber leur régularité structurelle; d’augmenter le

volume des pores, et aussi diminuer la cristallinité et le degré de polymérisation de la

cellulose [64].

22

Différents types de procédés physiques tels que le broyage mécanique

(Déchiquetage, broyage, ou le fraisage) et les radiations (rayons gamma, faisceau

d'électrons ou micro-ondes) ont été utilisés pour améliorer la digestibilité des matières

lignocellulosiques [65].

I.3.1.1. Le broyage mécanique

Ce procédé consiste à réduire la taille de la biomasse en petites particules allant

du mm jusqu’au µm. Il est habituellement réalisé avant les étapes ultérieures du procédé

dont dépend la taille souhaitée des particules. Diverses méthodes de broyage (Broyage à

billes, à deux cylindres de fraisage, marteau fraisage, fraisage colloïde, et vibro-broyage

d'énergie) peuvent être utilisé pour broyer la biomasse lignocellulosique.

Khullar et al. [66] ont utilisé un broyeur à marteaux équipé d’écrans pour étudier

l'effet de la taille des particules sur l'hydrolyse enzymatique de Miscanthus. La conversion

totale la plus élevée de la biomasse a été obtenue en utilisant la plus petite taille de

particule (0,08 mm), suivie par la taille des particules de 2 mm, et la conversion la plus

faible a été obtenue avec une taille de particules de 6 mm.

Cependant, la consommation d'énergie du broyage mécanique est étroitement liée

à la granulométrie finale des matières lignocellulosiques et la réduction de la taille des

particules est consommatrice de temps. Par conséquent, un apport d'énergie relativement

élevée est nécessaire pour obtenir un taux de broyage ou de fractionnement élevé

(Tableau I.6). Ce qui rend ce procédé économiquement non-réalisable.

Tableau I.6. Consommation d’énergie pour la réduction de la taille par broyage mécanique de la biomasse lignocellulosique (quelques exemples)

Biomasses Équipements Humidité

(%) Granulométrie

(mm) Énergie

(KW ht-1) Références

Paille de blé Marteau de

fraisage 12.1

7.7 à 3.2 7.7-1.6 7.7-0.8

24.7 43.6 51.6

[67] [68]

Paille de riz Broyage à

billes 4 - 6 ND à < 2

2500 (5 min) 15000 (30 min) 30000 (60 min)

[69]

Bagasse Broyage à

disque ND à < 2

2940 (37 min) 6970 (82 min)

13333 (143min) [70]

23

I.3.1.2. Les radiations

Les méthodes de traitement par radiation mettent en œuvre les rayons gamma, les

faisceaux électroniques, le champ électrique pulsé, les UV et les microondes. Le mode

d’action des radiations serait attribué à un ou plusieurs changements dans la structure de

la biomasse tels que l’augmentation de la surface spécifique, la diminution du degré de

polymérisation et de la cristallinité de la cellulose, l’hydrolyse des hémicelluloses et la

dépolymérisation partielle de la lignine et des hémicelluloses [71].

Les microondes sont des ondes radio avec des fréquences comprises entre 300

MHz et 300 GHz. Lorsque ces ondes interagissent avec la matière organique, elles sont

absorbées par l'eau, les graisses et les sucres, et leur énergie est transférée à des

molécules organiques générant une énorme quantité de chaleur [72]. De cette façon, les

microondes présentent un effet de chauffage et peuvent donc être utilisées dans le

traitement de la biomasse lignocellulosique et conduire à une perturbation de l'architecture

lignocellulosique.

Cependant, les méthodes de radiations sont habituellement lentes, énergivores et

coûteuses. Elles semblent être aussi spécifiques au substrat. Elles ne permettent pas de

réduire la taille de la biomasse, ni d’éliminer la lignine ou les hémicelluloses. Elles sont

souvent utilisées en combinaison avec d’autres procédés de prétraitement.

Duarte et al. [73] ont rapporté qu'après un prétraitement par faisceau d'électrons

(50 kGy), suivi d’un prétraitement acide hydrothermal ou acide dilué, la digestibilité de la

bagasse de canne à sucre a significativement été améliorée, ce qui a augmenté le

rendement d'hydrolyse enzymatique de la cellulose de 20% par rapport à un prétraitement

hydrothermique seul et de 30% par rapport à un prétraitement acide dilué seul.

Il a aussi été rapporté que les prétraitements chimiques assistés par micro-ondes

sont plus efficaces que les prétraitements chimiques au système de chauffage classique

[74].

Bien que les radiations aient montré un effet positif sur l'amélioration de la

digestibilité des matériaux lignocellulosiques, le coût d'installation est trop cher pour les

applications industrielles.

24

I.3.2. Les prétraitements chimiques

Les prétraitements chimiques ont pour principal objectif d'améliorer la

biodégradabilité de la cellulose en éliminant la lignine et / ou l'hémicellulose et, à un

moindre degré, de diminuer le degré de polymérisation et la cristallinité du composant

cellulosique.

Différents procédés chimiques ont été développés pour améliorer la digestibilité de

la biomasse et c’est la plus répandue ou la plus étudiée de toutes les catégories de

prétraitement.

I.3.2.1. Le prétraitement acide

Étant donné que les liaisons glycosidiques de l'hémicellulose et de la cellulose sont

sensibles à l'acide, le prétraitement à l'acide peut être appliqué pour solubiliser

partiellement les hémicelluloses et améliorer l'accessibilité à l’extraction des fibres

cellulosiques [75]. L'acide sulfurique est l'acide le plus appliqué, tandis que d'autres acides

tels que l’acide chlorhydrique et l'acide nitrique ont également été rapportés [76]. Il est

donc possible d’utiliser un acide concentré ou dilué pour prétraiter la biomasse

lignocellulosique.

Cependant, les prétraitements acides concentrés sont susceptibles de causer une

grave dégradation de la cellulose, de générer une forte concentration des inhibiteurs, et

des sérieux problèmes de corrosion de l’équipement. Les coûts d'exploitation et de

maintenance élevés réduisent l'intérêt d'appliquer le prétraitement à l'acide concentré à

l'échelle commerciale [77]. C’est ainsi que les acides concentrés sont moins intéressants.

Divers acides minéraux dilués, tels que H2SO4, HCl, H3PO4, et HNO3, peuvent être

appliqués pour prétraiter différents matériaux lignocellulosiques. Toutefois, le

prétraitement de l'acide minéral ne favorise pas l'élimination de la lignine. Après avoir

préalablement traité avec des acides minéraux, les résidus lignocellulosiques avec une

teneur élevée en lignine sont habituellement obtenus. Un procédé de délignification doit

suivre pour améliorer la digestibilité de résidus lignocellulosiques [78].

Saleh et al.[79] ont statiquement modélisé le prétraitement acide sulfurique (0.025

M) des coquilles de la graine d’olive en utilisant une méthodologie de surface de réponse,

25

avec comme facteurs la température de traitement (180 à 220°C) et le temps de traitement

(2 à 8 min), afin de déterminer les conditions optimales d'hydrolyse visant à atteindre

l'extraction maximale du D-xylose à partir des hémicelluloses. Le rendement le plus élevé

en D-xylose a été trouvé à une température de 195 °C pendant 5 min. Dans ces

conditions, 89,7% du d-xylose total ont été récupérés à partir de la matière première.

À l'exception des acides minéraux, des acides organiques, tels que l'acide

formique, acétique, fumarique, maléique, oxalique, peuvent également être appliqué pour

prétraiter la biomasse lignocellulosique. En raison de leur acidité relativement faible et une

forte solubilité pour la lignine, des concentrations relativement élevées d'acides

organiques sont habituellement utilisées [80].

Kootstra et al. [81] ont comparé l’efficacité de l'acide fumarique, de l'acide maléique

et de l'acide sulfurique dilué dans le prétraitement de la paille de blé. Pour mesurer

l'efficacité du prétraitement, la digestibilité enzymatique de la biomasse lignocellulosique a

été déterminée. Les concentrations des monomères de glucose et xylose ont été

mesurées après l’hydrolyse, de même que les taux de produits de dégradation du sucre

furfural et hydroxyméthylfurfural après prétraitement. L'influence de la température de

prétraitement et du chargement de la paille de blé a aussi été étudiée. L’étude a démontré

que, à 150 °C et entre 20 et 30% (p/p) de paille de blé sèche, le prétraitement avec de

l'acide fumarique ou maléique dilué peut constituer une alternative sérieuse au traitement

préalable à l'acide sulfurique.

I.3.2.2. Le prétraitement alcalin

Les liaisons ester dans les hémicelluloses et la lignine sont facilement

décomposées dans les conditions alcalines. Le clivage de ces liaisons favorise

significativement la solubilisation des hémicelluloses et la lignine, ce qui entraîne

l'exposition de la cellulose. Le mécanisme d'hydrolyse alcaline est donc basé sur la

saponification des liaisons esters intermoléculaires réticulant les hémicelluloses de xylane

et d'autres composants tels que la lignine et d'autres hémicelluloses [82]. Il a été rapporté

qu’en plus, les prétraitements alcalins éliminent l'acétyle et les diverses substitutions

d'acide uronique sur l'hémicellulose qui diminuent l'accessibilité de l'enzyme à

l'hémicellulose et à la surface de la cellulose [83].

26

Divers réactifs alcalins, tels que NaOH, Ca(OH)2, KOH, Na2CO3, Na2SO3, Na2S et

l'ammoniaque, peuvent être utilisés pour prétraiter de nombreux matériaux

lignocellulosiques.

Le prétraitement alcalin peut altérer la structure de la matrice lignocellulosique par

deux approches selon l’alcali utilisé :

− Le prétraitement à base de NaOH et de Ca(OH)2 sont les plus couramment

utilisés. Les conditions de réaction sont généralement douces, ce qui

empêche la condensation de la lignine, conduit à sa grande solubilité et à

une plus grande élimination. Dans ces conditions, la dégradation des

sucres est minime [84]. Ce prétraitement des matériaux lignocellulosiques

provoque un gonflement, entraînant une augmentation de la surface

interne, une diminution du degré de polymérisation, une diminution de la

cristallinité, une séparation des liaisons structurales entre la lignine et les

hydrates de carbone et une perturbation de la structure de la lignine [85];

− Le prétraitement avec l’ammoniaque : Le trempage dans l’ammoniaque

aqueux ou la percolation avec recyclage de l’ammoniaque (ARP) sont les

principales techniques de prétraitement les plus couramment utilisées [86,

87]. Le procédé implique un traitement à l'ammoniaque à des températures

élevées. Il réduit suffisamment la teneur en lignine et élimine

l'hémicellulose, tandis que la cellulose est décristallisée.

Zhao et al. [88] ont étudié le comportement de l’hydrolyse enzymatique de l’épicéa

prétraité au NaOH aqueux à basse température (-15 °C, 23 °C et 60 °C) en présence et en

absence d'urée. Le prétraitement avait considérablement amélioré le taux d’hydrolyse

enzymatique et l’efficacité. À basse température, l’alcali utilisé, que ce soit le NaOH seul

ou le mélange NaOH-urée, pouvait éliminer légèrement la lignine, les hémicelluloses et la

cellulose des matériaux lignocellulosiques, perturber les connexions entre hémicelluloses,

cellulose et lignine et modifier la structure de la biomasse traitée rendant la cellulose plus

accessible aux enzymes d'hydrolyse. Les résultats ont indiqué que le rendement en

glucose pouvait atteindre 70% à -15 °C, avec une solution à 7% de NaOH/ 12% d’urée,

mais seuls 20% et 24% de glucose étaient obtenus à des températures de 23 °C et 60 °C,

respectivement, lorsque les autres conditions sont restées les mêmes. Ceci suggère que

la forte capacité de gonflement de la cellulose dans une solution aqueuse de NaOH ou

27

une solution aqueuse de NaOH/urée à basse température est susceptible de conduire à

une grande accessibilité des matériaux lignocellulosiques aux enzymes.

Kim et al. [89] ont prétraité les tiges de maïs avec de l’ammoniaque dans un

réacteur à colonne à flux continu, par le procédé de percolation à l'ammoniaque recyclé

(ARP). Ceci a conduit à un retrait maximal de 70 à 85% de la lignine dont la plus grande

partie a été enlevée dans les vingt premières minutes, à la solubilisation de 40 à 60% de

l'hémicellulose, alors que la cellulose est restée intacte. Un rendement maximal de 99% a

été obtenu au bout de 90 minutes d’hydrolyse enzymatique.

I.3.2.3. La délignification oxydative

En général, les réactifs tels que : O3, O2, H2O2, ClO2, NaClO, et Cl2 peuvent être

utilisé comme réactifs d'oxydation. Ces réactifs d'oxydation libèrent une grande quantité

de radicaux libres résultant d’une remarquable fragmentation oxydative, et élimine de la

lignine. L’efficacité de la délignification peut être attribuée à la haute réactivité des agents

oxydants vis-à-vis du noyau aromatique présent sur les unités constitutives de la lignine

[90]. Ainsi la lignine sous sa forme polymère sera convertie en composés de plus bas

poids moléculaire tels que les acides carboxyliques. Ces acides formés peuvent agir

comme des inhibiteurs dans une étape de fermentation. Ils devront donc être neutralisés

ou enlevés.

Des études ont montré que la dissolution d'environ 50% de la lignine et de la plus

grande partie de l'hémicellulose a été réalisée dans une solution de 2% H2O2 à 30 °C. Ces

études ont montré que l'hydrolyse du peroxyde d'hydrogène a conduit à la formation de

radicaux hydroxyles, qui dégradent la lignine et produisent des produits de faible poids

moléculaire. L'élimination de la lignine de la lignocellulose entraîne l'exposition de la

cellulose et de l'hémicellulose menant à une hydrolyse enzymatique accrue. Le rendement

d'hydrolyse enzymatique qui a suivi pouvait atteindre 95% [91].

Garcia-Cubero et al. [92] ont préalablement traité la paille de blé et de seigle avec

l’ozone et ont observé une réduction significative de leur teneur en lignine, une faible

dégradation des hémicelluloses et une perte négligeable de cellulose. Des rendements

d'hydrolyse enzymatique allant jusqu'à 89% et 57% ont respectivement été obtenus pour

la paille de blé et de seigle prétraitée, comparativement à 29% et 16% pour la paille de blé

et de seigle sans prétraitement.

28

Cependant, étant donné que le coût de la délignification par oxydation est

beaucoup supérieur à celui des prétraitements traditionnels alcalins ou acides, cette

technique de prétraitement est généralement utilisée comme une aide pour d'autres

prétraitements, en particulier un prétraitement alcalin, pour éliminer la lignine résiduelle

dans la biomasse lignocellulosique [93].

I.3.2.4. Le prétraitement avec les solvants organiques (procédé Organosolv)

Les solvants organiques ou un mélange de solvants en combinaison avec de l'eau

sont principalement utilisés pour extraire majoritairement la lignine et dans une moindre

mesure les hémicelluloses, sans former de produits inhibiteurs. Ceci a comme résultat

d’augmenter la porosité et la surface spécifique accessible des matériaux

lignocellulosiques et réduire considérablement leur teneur en lignine.

De nombreux solvants organiques, tels que l'éthanol, le méthanol, l'acétone,

l’éthylène glycol et l’alcool tétrahydrofurfurylique peuvent être utilisés pour prétraiter divers

matériaux lignocellulosiques [94]. Le tableau I.7 nous renseigne quelques exemples des

solvants utilisés dans les procédés Organosolv.

Dans ce procédé, la biomasse lignocellulosique est mélangée avec un liquide

organique et de l'eau et chauffée pour dissoudre la lignine et une partie de l'hémicellulose,

laissant la cellulose réactive dans la phase solide. De plus, un catalyseur peut être ajouté

soit pour réduire la température de fonctionnement, soit pour améliorer le processus de

délignification [95].

Les principales réactions durant les procédés Organosolv sont l’hydrolyse des

liaisons éther dans la lignine et des liaisons hémicelluloses-lignine. Les liaisons α-aryl

éther hydrolysables sont plus facilement rompues, mais il est vraisemblable que les

liaisons β-aryl éther soient aussi scindées dans certaines conditions de procédés. La

plupart des procédés Organosolv emploient soit un solvant neutre, avec ou sans

catalyseur acide ajouté, soit un solvant acide [96].

Aujourd’hui ce procédé de prétraitement est l’un des procédés qui connait un

développement industriel. La société canadienne Lignol a développé une technologie de

bioraffinerie pour la production de produits chimiques et carburants bio-basés à partir du

bois, des résidus agricoles et autre biomasse lignocellulosique abondante à bas coût. La

29

base du procédé est un procédé Organosolv, qui utilise de l’éthanol dilué, un solvant

organique biodégradable, à hautes températures pour séparer et récupérer plusieurs

produits chimiques qui sont présents dans ou créés à partir de la biomasse. Lignol utilise

l’ancien procédé Alcell (eau + éthanol) modifié en Alcell Plus [97].

Huijgen et al. [98] ont étudié le procédé Organosolv de bois de saule et de paille de

blé dans l'éthanol en presence de H2SO4, HCl et MgCl2 utilisés comme catalyseurs. Il a été

rapporté que l'addition de ces catalyseurs améliorait le fractionnement du bois de saule et

de la paille de blé. Les acides peuvent favoriser de manière significative l'élimination des

hémicelluloses. La conversion enzymatique maximale de la cellulose était de 87% pour le

bois de saule et de 99% pour la paille de blé par rapport à 74% (bois de saule) et de 44%

(paille de blé) pour le procédé non catalytique.

Tableau I.7. Exemples de procédés Organosolv

Procédé Système du solvant Références

ASAM Sulfure alcalin+ anthraquinone+ méthanol [99] Organocell Eau + hydroxyde de sodium + méthanol [100]

Alcell Eau + éthanol [101] Milox Eau + acide formique + peroxyde d’hydrogène [102]

Acetosolv Eau + acide acétique + acide chlorhydrique [103] Acetocell Eau + acide acétique [104] Formacell Eau +acide acétique + acide formique [105]

Battelle-Geneva Eau + phénol + acide hydrochlorique [106] Acos Eau + acétone + acide minéral [107]

I.3.2.5. Le prétraitement avec les liquides ioniques

Les liquides ioniques sont des sels typiquement composés de cations organiques

et anions inorganiques. Leurs propriétés peuvent être modifiées en ajustant les

constituants des cations et d’anions. Il y a un nombre très élevé de combinaisons

possibles entre un cation organique et un anion organique/inorganique [108]. Ces

propriétés intéressantes comprennent la stabilité chimique et thermique, l'ininflammabilité,

de faibles pressions de vapeur et une tendance à rester liquide dans une large gamme de

températures [109].

Les principaux cations mentionnés dans la littérature incluent l’imidazolium, le

pyridinium, l’ammonium quaternaire, le phosphonium quaternairem pyrrolidinium,

cholinium et le pyrazolium. Les principaux anions incluent le chlorure, le bromure, l’iodure,

le nitrate et le phosphate (Fig.I.10).

30

Figure I.10. Principaux cations et anions dans les liquides ioniques [110]

Pour le moment, il n'y a pas d'application industrielle utilisant les liquides ioniques.

De plus, des informations très limitées existent dans la littérature pour décrire leur action

sur la biomasse lignocellulosique. D’une manière générale, durant le prétraitement de la

biomasse lignocellulosique par les liquides ioniques, la délignification et la destruction de

la structure cristalline de la cellulose sont simultanées et les deux sont également

importantes pour activer la biomasse [111].

Li at al. 2010 [112] ont étudié l'effet de divers prétraitements avec des liquides

ioniques sur l'hydrolyse enzymatique de l'épi de maïs et ont observé que les liquides

ioniques contenant des groupements phosphate ou chlorure augmentaient

significativement le rendement en sucres réducteurs. Théoriquement, la surface spécifique

accessible de la biomasse lignocellulosique est considérablement agrandie après la

dissolution dans ces liquides ioniques, ainsi les enzymes pouvaient entrer en contact et

hydrolyser facilement les polysaccharides.

Cependant, comme les enzymes (cellulases) survivent difficilement dans les

liquides ioniques, l'hydrolyse enzymatique de la cellulose n’y peut pas être réalisée

directement. Par conséquent, les solutions homogènes contenant de la lignocellulose

sont généralement régénérées dans les anti-solvants des liquides ioniques pour préparer

la biomasse lignocellulosique régénérée. Les matériaux lignocellulosiques régénérés à

partir des liquides ioniques montrent toujours une cristallinité beaucoup plus faible et une

31

plus grande accessibilité aux enzymes que les matériaux non traités [94]. La cellulose

dans la lignocellulose régénérée peut ainsi être efficacement hydrolysée en glucose par la

cellulase.

Finalement, il n’y a pas encore de procédé efficace et industriel capable de réaliser

la séparation/récupération des monomères glycosidiques finaux et de réaliser la

récupération efficace du solvant. Ceci est la clé du développement de la technologie des

liquides ioniques. De plus, un des verrous actuels reste le prix des liquides ioniques.

I.3.3. Les prétraitements physico-chimiques.

I.3.3.1. Le prétraitement hydrothermique

Ce prétraitement, aussi appelé fractionnement aqueux, solvolyse,

hydrothermolyse, ou aquasolv utilise l’eau à haute température et haute pression (pour

maintenir son état liquide), qui se dissocie en ions H3O+ et OH- qui peuvent agir comme

catalyseur acide ou basique.

Ce prétraitement consiste en une montée en température progressive dans un

milieu saturé et à une pression accrue. Deux importantes composantes de la biomasse

(l’hémicellulose et la lignine) sont ainsi transformées en monomères et plusieurs acides

organiques sont formés mais la cellulose reste intacte. Cependant, les sucres monomères

sont partiellement dégradés en aldéhydes en présence d’acide. Ces aldéhydes,

principalement le furfural en provenance des pentoses et le 5-hydroxyméthylfurfural en

provenance des hexoses, sont des inhibiteurs dans la fermentation microbienne [113].

En effet, les principaux composants de matériaux lignocellulosiques montrent

différentes stabilités thermiques. La décomposition des hémicelluloses est généralement

plus facile que celle de la cellulose et de la lignine. Étant donné que les hémicelluloses et

la lignine peuvent être partiellement éliminées avant la dégradation de la cellulose dans

les conditions hydrothermiques, ce prétraitement peut être appliqué sur la biomasse

lignocellulosique. Comme la dégradation sévère de la cellulose se produit à une

température supérieure à 240 ºC, les températures hydrothermales sont généralement

dans une large gamme de 160 - 240 ºC [114].

Xiao et al. [115] ont étudié les changements dans la composition chimique des

fibres de bambou à différentes conditions de prétraitement hydrothermique (140- 200 °C

32

pendant 10 à 120 minutes) et ont exploré leurs comportements face à l’hydrolyse

enzymatique. La plupart des hémicelluloses ont été progressivement enlevées du bambou

avec l'augmentation de la température de prétraitement et la prolongation du temps, alors

que seulement une petite quantité de cellulose et de lignine ont été dégradées. Après un

prétraitement à 200 °C pendant 120 minutes, ils ont obtenu une conversion de glucose

maximale de 75,7%, comparativement à 15,7% de l'échantillon non traité et ceci après

l’étape d’hydrolyse enzymatique.

L’exemple typique d’un développement industriel de ce procédé est la société

danoise Inbicon, filiale du groupe Dong Energy, qui détient le plus grand pilote de

démonstration d’éthanol cellulosique en Europe. Inbicon a développé un prétraitement

hydrothermique breveté qui est intégré dans un procédé comportant trois stades : le

conditionnement mécanique de la biomasse, le prétraitement hydrothermique et

l’hydrolyse enzymatique. La technologie centrale d’Inbicon solubilise la lignine et libère la

cellulose et les hémicelluloses qui sont convertis en sucres fermentés en éthanol.

I.3.3.2. L’explosion à la vapeur

L’explosion à la vapeur est le prétraitement physico-chimique de la biomasse le

plus communément utilisé. Ce procédé consiste à soumettre la biomasse lignocellulosique

à une forte pression de la vapeur saturée à haute température pendant quelques

secondes à quelques minutes, puis la pression est réduite instantanément à la pression

atmosphérique. La biomasse explose en fibres séparées avec la libération rapide de la

pression. Les hémicelluloses et la lignine sont partiellement décomposées et solubilisées

donc éliminés des matériaux lignocellulosiques à des degrés différents [116].

Les effets combinés incluent la modification des propriétés physiques du matériau

(surface spécifique, rétention d’eau, coloration, cristallinité de la cellulose, etc.), l’hydrolyse

des composants hémicellulosiques, et la modification de la structure chimique de la

lignine, permettant l’ouverture du matériau et facilitant leur extraction. L’application de

conditions plus drastiques permet la formation de monosaccharides tout en augmentant la

concentration en furfural et 5-hydroxyméthylfurfural, qui sont des inhibiteurs de

fermentation alcoolique [117, 118].

Horn et al. [119] ont prétraité la paille de blé à la vapeur d'eau à 170-220 °C pour

explorer leur comportement par rapport à l’hydrolyse enzymatique pour la production du

33

glucose. Les résultats ont montré que le rendement d'hydrolyse enzymatique maximum a

été obtenu après explosion à la vapeur à 210°C pendant 10 minutes. Bien qu'un

rendement de glucose similaire puisse également être atteint dans des conditions plus

sévères, des inhibiteurs de fermentation tels que des composés aromatiques et des sous-

produits de déshydratation se sont formés dans des conditions drastiques d'explosion à la

vapeur, ce qui a également affecté le processus de d’hydrolyse subséquent. Un lavage à

l’eau a été requis pour la désintoxication.

Comme un grand nombre d'inhibiteurs d'hydrolyse enzymatique et de fermentation

se forment dans des conditions sévères d'explosion à la vapeur, différents réactifs ont été

appliqués pour améliorer l'isolement des hémicelluloses ou de la lignine dans des

conditions d'explosion de vapeur relativement douces. Parmi ces réactifs, le SO2 et le

H2SO4 sont les plus largement étudiés pour augmenter la solubilité de l'hémicellulose [120,

121] et le NaOH pour augmenter l'élimination de la lignine pendant l'expérience [122].

L’explosion à la vapeur a aussi connu un développement industriel et est

principalement utilisé comme méthode de prétraitement pour le blanchiment de la

biomasse lignocellulosique dans l'industrie de la pâte à papier. Parmi les procédés à base

d'explosion à la vapeur connus, on peut citer les procédés Iotech et Siropulper [123, 124].

La société canadienne Iogen a développé une technologie d’hydrolyse enzymatique pour

la production d’éthanol cellulosique à partir du maïs ensilé, de la paille de blé, d’avoine ou

d’orge, de la canne à sucre, des copeaux de bois, mais aussi du panic érigé et du

miscanthus. La base du procédé étant un prétraitement d’explosion à la vapeur, en

condition acide dilué (une variante pour augmenter le rendement et diminuer la formation

d’inhibiteurs) pour séparer et récupérer les composés en C6 et C5.

I.3.3.3. L’explosion à l’ammoniac ou procédé AFEX

Le procédé AFEX est très similaire à l’explosion à la vapeur. Dans ce procédé, la

biomasse lignocellulosique est exposée à l'ammoniac liquide à une température autour de

60-150°C sous haute pression (250 - 300 psi) pour une période de temps, puis la pression

est soudainement libérée [125].

Dans ce procédé, le mécanisme de réaction produit une combinaison d'effets

chimiques et physiques qui induit le clivage du complexe lignine-carbohydrate, l'hydrolyse

de l'hémicellulose et la décristallisation de la cellulose, qui conduisent à une augmentation

34

de la surface spécifique [126]. Le procédé AFEX élimine peu de lignine mais ses

modifications permettent une conversion enzymatique presque complète de la cellulose et

de l'hémicellulose en sucres fermentescibles à faibles charges enzymatiques [64].

Teymouri et al. [127] ont évalué les conditions optimales du procédé telles que le

chargement en ammoniac (ratio NH3/biomasse), le contenu en humidité de la biomasse, la

température et le temps de résidence nécessaire pour une efficacité maximale du procédé

AFEX sur la paille de maïs. Les conditions de prétraitement optimales furent une

température de 90°C, une fraction massique ammoniac/tige de maïs de 1 :1, un contenu

en humidité de 60% en poids et un temps de résidence de 5 minutes. Environ 98% du

rendement théorique en glucose fut obtenu durant l’hydrolyse enzymatique de la paille de

maïs prétraitée dans des conditions optimales. Le rendement en éthanol de cet échantillon

fut augmenté jusqu’à 2.2 fois par rapport à l’échantillon non traité.

Belkacemi et al. [128] ont prétraité la fléole des prés, la luzerne, l’alpiste roseau et

les résidus agricoles tels que les tiges de maïs et la paille d'orge au moyen du procédé

AFEX. Ces matériaux prétraités ont été directement saccharifiés par des enzymes

cellulolytiques. Des rendements de l’ordre de 60 à 80% du rendement théorique en sucres

ont été obtenus à partir des biomasses prétraitées. La fermentation alcoolique

subséquente des hydrolysats par le pachysolen tannophilus ATCC 32691 a donné un

rendement en éthanol de 40 à 60% du rendement théorique après 24 h, sur la base des

sucres présents dans les hydrolysats. La conversion des sucres n'était pas complète, ce

qui indiquait un effet inhibiteur possible sur le P. tannophilus lors de la fermentation de ces

substrats.

L’explosion à l’ammoniac est un procédé de prétraitement prometteur avec

plusieurs avantages, tels que le respect de l’environnement (aussi longtemps que

l’utilisation l’ammoniac est bien contrôlée), une haute efficacité énergétique et l’absence

de formation d’inhibiteurs. Bien que la plupart de l'ammoniac puisse être récupéré et

recyclé dans un réacteur pour réduire le coût d’exploitation, l'ammoniac est très cher pour

une application industrielle en plus d’être toxique.

I.3.3.4. Le prétraitement au CO2 supercritique

Le CO2 est un important solvant d'extraction commerciale et industrielle, avec de

nombreux avantages, tels que le faible coût, la non-toxicité, l’ininflammabilité, la

35

récupération facile et le faible impact sur l'environnement [129]. Soumis à des conditions

supercritiques, le CO2 a la capacité de diffusion d’un gaz, et la viscosité, la miscibilité ou le

pouvoir de solvatation d’un liquide [130].

Le prétraitement au CO2 supercritique est donc un prétraitement physico-chimique

potentiel similaire au prétraitement par explosion à la vapeur et à l'ammoniac. Avec une

libération explosive de la pression, le CO2 supercritique augmente par conséquent le

volume de pores et la zone de surface accessible des matériaux lignocellulosiques.

Par ailleurs, le CO2 peut former de l'acide carbonique en présence d’humidité, ce

qui favorise l'hydrolyse des polymères. Cette acidification de la biomasse dissocie les

liaisons hydrogènes qui relient les microfibrilles de cellulose à des polysaccharides

d'hémicellulose, augmentant ainsi l'accessibilité de l'enzyme cellulase à son substrat

naturel, ce qui favorise l'hydrolyse de la cellulose [131].

Alinia et al. [132] ont prétraité la paille de blé sèche et humide avec le dioxyde de

carbone supercritique seul puis avec la combinaison de la vapeur d'eau / CO2

supercritique en variant la température (160 -200 °C) et le temps de prétraitement (10, 60

ou 70 min), pour la production d’éthanol. Le prétraitement de la paille de blé sec au CO2

supercritique seul a donné son meilleur rendement global pour le sucre de 149,1 g de

sucre par kg de paille de blé) à 190 °C pendant 30 min alors que le prétraitement au CO2

supercritique de la paille de blé imprégnée d'eau a donné le meilleur rendement global

pour le sucre (208,4 g kg-1) à 185 °C et 30 min. La paille de blé sèche prétraitée avec la

combinaison explosion de vapeur d'eau / CO2 supercritique, à la température de vapeur

de 200 °C et le temps de rétention de 15 min sous les conditions de CO2 supercritique de

12 MPa, 190 °C et 60 min ont donné le meilleur rendement global pour le sucre (234,6 g

kg-1).

Il apparait clairement que l'existence de molécules d'eau, à la fois sous forme

liquide et vapeur, a entraîné des changements importants dans les résultats et que cela

est certainement lié à la production d'acide carbonique et à la décristallisation de la

cellulose dans la méthode combinée utilisant la vapeur et le CO2 supercritique.

36

I.3.4. Les prétraitements biologiques

Les microorganismes comme les champignons et les bactéries, ou les enzymes

peuvent aussi être utilisés pour le prétraitement de la biomasse lignocellulosique. Il existe

trois groupes principaux de champignons : la pourriture blanche, la pourriture brune et les

champignons de la pourriture molle. Pour les bactéries, il existe quatre classes : les

actinomycètes, les α-protéobactéries, les β-protéobactéries et les γ-protéobactéries. Quant

aux enzymes on peut les classifier en cellulases, hémicellulases, pectinases, et ligninases.

I.3.4.1. Le prétraitement avec les champignons

Les champignons des pourritures blanche et brune, ainsi que les champignons de

la pourriture molle ont déjà été utilisés pour la dégradation sélective de la lignine et des

hémicelluloses [133].

Parmi ces micro-organismes, le meilleur pour dégrader efficacement la lignine est

le champignon de la pourriture blanche, car il présente des enzymes ligninolytiques

hautement oxydantes telles que les lignines peroxydes, les peroxydes de manganèse, les

peroxydes polyvalents et la laccase [134]. Les champignons de la pourriture brune

préfèrent enlever la partie hydrate de carbone et la lignine est partiellement éliminée en

raison de mécanismes différents alors que les champignons de la pourriture molle

éliminent uniquement les sucres solubles de la lignocellulose [135].

Le mécanisme de dégradation de la biomasse lignocellulosique par les

champignons est bien connu et peut être divisé en deux grandes catégories: oxydative et

hydrolytique. Dans le mécanisme oxydatif, les champignons dégradent la lignine par la

production d'espèces réactives de l'oxygène principalement des radicaux hydroxyles [91].

Dans le mécanisme hydrolytique, les champignons produisent des enzymes hydrolytiques

qui dégradent les liaisons glycosidiques dans la cellulose et l'hémicellulose libérant des

monomères de sucres [136].

Les champignons de la pourriture blanche tels que Phanerochaete chrysosporium,

Ceriporia lacerata, Cyathus stercoreus, Ceriporiopsis subvermispora, Trametes versicolor

et Pleurotus ostreatus sont les plus utilisés pour le prétraitement de la biomasse

lignocellulosique [137].

Saha et al. [138] ont évalué 26 souches de champignons à pourriture blanche en

37

culture à l'état solide à 74% d'humidité à 28 °C pendant 30 jours pour la production des

sucres fermentescibles à partir de la paille de maïs. Après hydrolyse enzymatique de

chaque foin de maïs prétraité en utilisant un cocktail de 3 systèmes enzymatiques

(cellulase, β-glucosidase, hémicellulase), le meilleur résultat a été obtenu avec Cyathus

stercoreus NRRL-6573 qui a donné un rendement en sucre de 394 ± 13 mg / g, suivi de

Pycnoporus sanguineus FP-10356-Sp (393 ± 17 mg / g) et Phlebia brevispora NRRL-

13108 (383 ± 13 mg / g).

I.3.4.2. Le prétraitement avec les bactéries

Les bactéries dégradant la lignine ont une voie complexe individuelle pour la

dégradation spécifique des composants de la lignine tels que l'éther β-arylique, le

biphényle, le diarylpropane, le phénylcoumarane et le pinorésinol [135].

La dégradation bactérienne de la lignine est divisée en deux étapes: la

dépolymérisation de la lignine extracellulaire et la dégradation des composés aromatiques

dérivés de la lignine intracellulaire [139]. Peu de rapports sont publiés sur le prétraitement

bactérien appliqué à la biomasse directement. Cependant, certaines peroxydases

extracellulaires bactériennes telles que les laccases [140] et MnP [141] capables d'une

activité significative de dégradation de la lignine ont été rapportées.

I.3.4.3. Le prétraitement avec les enzymes

Les enzymes prises individuellement, peuvent aussi être utilisées pour modifier et /

ou dégrader le contenu en lignine et en hémicelluloses tout en maintenant la portion de

cellulose. L'approche enzymatique dans le traitement des fibres naturelles repose sur

l'idée d'une hydrolyse sélective de certains composants ou d'une hydrolyse limitée de

plusieurs composants de la fibre [142].

Étant donné que la biomasse lignocellulosique constitue en elle-même un matériau

composite, une seule enzyme ne peut pas dégrader la fibre. Un ensemble d’enzymes

appropriées est requis pour prétraiter la biomasse lignocellulosique. Généralement, ce

cocktail enzymatique est constitué de cellulases (endoglucanases, cellobiohydrolases ou

exoglucanases et les glucosidases), pectinases, hémicellulases et des enzymes modifiant

la lignine comme la laccase ou les peroxydases de lignine [143, 144].

Hyeon et al. [145] ont prétraité la paille de l’orge avec un complexe enzymatique

38

composé de laccase d’Escherichia coli et cellulosomes (complexe enzymatique produit

par des bactéries anaérobies telles que Clostridium cellulovorans) a une concentration de

2% dans du tampon acétate de sodium (50 mM, pH 5,0) pendant 24 h à 60 °C en vue de

la production du bioéthanol par une souche de levure Saccharomyces cerevisiae

produisant une cellulase. La paille d'orge prétraitée par le complexe de laccase a été

efficacement convertie en bioéthanol. La levure cellulolytique à l'aide de complexes de

laccase a produit 2,34 g d'éthanol/L après 72 h, ce qui indique une augmentation d'environ

2,1 fois par rapport à la fermentation sans les complexes de laccase. Cela démontre la

possibilité de développer un complexe de laccase efficace basé sur les cellulosomes et

cette stratégie peut être utilisée pour dégrader les matériaux récalcitrants.

Bien que les prétraitements biologiques présentent de nombreux avantages, tels

que la consommation de moins d’énergie, aucune exigence de produits chimiques et des

conditions de prétraitement douces, un temps de prétraitement très long (pouvant

atteindre plusieurs semaines) est toujours nécessaire pour atteindre un niveau

relativement élevé du taux d’hydrolyse enzymatique, ce qui limite considérablement leur

application dans l’industrie.

I.3.5. Les combinaisons de prétraitements

La plupart des procédés de prétraitement ne peuvent qu'affaiblir partiellement les

facteurs qui limitent l'hydrolyse des matériaux lignocellulosiques. Ainsi les processus de

prétraitement combinés sont considérés comme un moyen de maximiser ou améliorer leur

digestibilité.

Au regard des prétraitements décrits ci haut, nous pouvons constater que chaque

prétraitement pris individuellement, a une action efficace particulière sur la biomasse

lignocellulosique comme l’élimination des hémicelluloses (prétraitement alcalin, acide,

explosion à la vapeur), l’élimination des lignines (délignification oxydative, prétraitements

biologiques) ou l’augmentation de la surface accessible ou du volume de pores

(prétraitement à la vapeur, à l’ammoniac ou au CO2 supercritique). Les principaux effets

de ces processus de prétraitement sur les compositions chimiques et les structures des

matériaux lignocellulosiques sont résumés et illustrés dans le tableau I.8.

39

Tableau I.8. Effets de différents procédés de prétraitement sur les compositions et les structures des matériaux lignocellulosiques [78].

Procédés Elimination de lignine

Elimination d’hémicelluloses

Augmentation de surface

d’accès

Décristallisation de la cellulose

Augmentation de volume de

pores

Génération d’inhibiteurs

Broyage - - H H - F Alcalin H H H - H F Acide M H H - M H

Oxydation H - - - H F Organosolv H F H - M F

Liquide ionique M F H H H F Expl. à la vapeur F H H F H H Hydrothermique M H M - M H

AFEX M F H H H F CO2 supercrit. F F H - H F

Biologique H M H - H F

H : haut effet ; M : effet moyen ; F : faible effet

Ces prétraitements peuvent donc d'être combinés pour améliorer la digestibilité des

matériaux lignocellulosiques et faciliter la récupération de la lignine et des hémicelluloses

afin de produire des produits à grande valeur ajoutée.

Jusqu'à présent, les prétraitements alcalins restent les méthodes les plus

attrayantes et les plus rentables pour éliminer la lignine des matériaux lignocellulosiques.

Sur la base de cette vue, les acides dilués, les prétraitements hydrothermiques et les

explosions de vapeur combinées à des prétraitements alcalins sont probablement les

combinaisons les plus prometteuses des matières lignocellulosiques.

Ouyang et al. [146] ont combiné l’explosion à la vapeur au prétraitement alcalin

pour développer un procédé économique et écologique de prétraitement alcalin de l’épi de

maïs. L'explosion à la vapeur a facilité la délignification alcaline et a diminué la quantité

d'alcali utilisée pendant le prétraitement. Différentes quantités de lignine et d'hémicellulose

ont été éliminées dans les 5 min en utilisant différentes concentrations d'hydroxyde de

sodium et différentes sévérités de l'explosion à la vapeur. Le principal composant de la

lignine recueilli par le procédé combiné était la lignine insoluble dans l'acide, atteignant

une pureté de 84%. L'analyse structurelle a montré que l'explosion à la vapeur et

l'hydroxyde de sodium avaient un effet synergique sur l'élimination de la lignine et de

l'hémicellulose de l'épi de maïs. L'effet du processus de prétraitement simultané de

délignification a transformé la cellulose I en cellulose II, améliorant la conversion

enzymatique de la cellulose en glucose de 22% à 96%. Le processus combiné d'explosion

à la vapeur et de dépolymérisation alcaline présente un potentiel d'application dans la

40

bioraffinerie de la biomasse lignocellulosique.

I.4. Extraction de la fibre lignocellulosique

I.4.1. Notions sur les nanoparticules de la fibre lignocellulosique

La biomasse lignocellulosique est constituée de blocs de construction à l'échelle

nanométrique qui lui confèrent des propriétés précieuses telles qu’une résistance élevée à

la traction, un module de Young élevé, un ratio surface / volume élevé et un faible

coefficient de dilatation thermique.

Les particules de la fibre lignocellulosique ayant au moins une dimension à

l'échelle nanométrique (1 à 100 nm) peuvent être appelées nanoparticules de la

composante extraite. En fonction de la composante extraite de la fibre lignocellulosique,

des conditions de production qui influencent les dimensions, et les propriétés, nous

pouvons trouver dans la littérature : les celluloses nanocristallines (CNC), les celluloses

nanofibrillées (NFC), la cellulose bactérienne (BC), les nanoparticules de lignine (LNP) et

les nanofibres lignocellulosiques (LCNF).

I.4.1.1. La cellulose nanocristalline

Les celluloses nanocristallines (whisker de cellulose ou nanocristaux de cellulose)

sont des particules rigides en forme de bâtonnets avec une structure aciculaire typique,

monocristalline, de 1 – 100 nm de diamètre et 100 à une centaine de nm en longueur. Les

particules sont 100% cellulosiques et hautement cristallines, avec un indice de cristallinité

variant entre 54% et 88%.

L'extraction de la CNC à partir de différentes biomasses lignocellulosiques se

déroule en deux étapes. La première est un prétraitement caractérisé par l'élimination

complète ou partielle des hémicelluloses, de la lignine et des cires, tandis que la seconde

est un traitement chimique capable d'extraire les nanostructures de cellulose à haute

cristallinité.

Les premières CNC ont été obtenues par une hydrolyse contrôlée à l'acide

sulfurique d’une une suspension colloïdale de cellulose [147].

41

I.4.1.2. La cellulose nanofibrillée

Les celluloses nanofibrillées (CNF) ou les nanofibres de cellulose sont composées

d'agrégats individuels ou de fibrilles de cellulose longues, flexibles et enchevêtrées,

contenant à la fois des domaines amorphes et cristallins avec des dimensions latérales

typiques de l'ordre de 3-100 nm (selon la source naturelle de cellulose, méthode de

prétraitement et de défibrillation) et une longueur de plusieurs micromètres [148].

Les CNF peuvent être extraites au moyen d’un procédé de désintégration

mécanique et un prétraitement est parfois nécessaire pour faciliter la désintégration.

Différents procédés tels que la microfluidisation, le broyage, l'ultrasonication intense ou

l'homogénéisation à haute pression ont été utilisés pour extraire les nanofibres de

cellulose. Dépendamment de la biomasse utilisée, les prétraitements consistent en une

coupe mécanique, un prétraitement enzymatique, une hydrolyse acide ou une oxydation

TEMPO (2,2,6,6-tétraméthylpipéridine-1-oxyle) [149].

I.4.1.3. La cellulose bactérienne

De nombreuses espèces de bactéries, telles que celles appartenant aux genres

Acetobacter, Achromobacter, Salmonella, Escherichia et Rhizobium, sont capables de

produire de la cellulose extracellulaire solide. La cellulose bactérienne (BC), également

appelée nanocellulose bactérienne (BNC), cellulose microbienne ou biocellulose, est

formée par des bactéries aérobies, telles que les bactéries acétiques du genre

Gluconacetobacter xylinum. Ces bactéries sont répandues dans la nature où la

fermentation des sucres et des hydrates de carbone des plantes a lieu. La nanocellulose

bactérienne est composé de fibrilles linéaires nanométriques de D-glucose. Les chaînes

de glucose sont produites à l'intérieur du corps bactérien, puis libérées par de minuscules

pores présents sur leur enveloppe cellulaire.

Les bactéries sont cultivées dans des milieux nutritifs aqueux communs, et la

cellulose bactérienne est excrétée sous forme d'exopolysaccharide à l'interface avec l'air.

La forme stable de la cellulose bactérienne résultante est composée d’un réseau de

nanofibres de 20 – 100 nm de diamètre et plusieurs micromètres de longueur [150] .

Contrairement aux nanocristaux de cellulose et nanofibres de cellulose extraite de

différentes sources naturelles de cellulose, la nanocellulose bactérienne est formée par

42

des procédés d'assemblage biotechnologique à partir de sources de carbone à faible

poids moléculaire.

I.4.1.4. Les nanoparticules de lignine

Après la cellulose, la lignine est le deuxième biopolymère le plus abondant dans la

nature et le premier biopolymère aromatique le plus abondant. Le procédé à l'échelle

industrielle le plus courant pour extraire la lignine est le procédé de fabrication de pâte

Kraft à partir duquel on récupère la lignine alcaline, contenant plusieurs groupes

fonctionnels hydrophiles alors que la lignine obtenue par le procédé Organosolv est

hautement hydrophobe.

Les nanoparticules de lignine peuvent être synthétisées par des méthodes de

précipitation initiées avec des acides [151], saturation en CO2 [152], échanges continus de

solvants [153], dialyse [154], ainsi que par sonication et d'autres méthodes basées sur la

microémulsion d'eau dans l'huile [155, 156].

Les propriétés physiques de ces particules, telles que l'hydrophobicité, la charge

de surface et la stabilité, dépendent du type de précurseur de lignine et de la technique de

synthèse des nanoparticules. Cette grande variation des propriétés de surface des

nanoparticules de lignine les rend aptes à une fonctionnalisation contrôlée pour des

applications respectueuses de l'environnement [157].

I.4.1.5. Les nanofibres lignocellulosiques

Les nanofibres lignocellulosiques sont des celluloses nanofibrillées contenant de la

lignine. Elles sont en forme des filaments ramifiés et aléatoires dont les diamètres peuvent

varier entre 5 et 50 nm et la longueur de plusieurs micromètres. Sa structure et ses

dimensions lui confèrent un allongement à la rupture élevé et une grande surface

spécifique. En plus de leur résistance élevée, les fibrilles de LCNF sont biocompatibles et

peuvent être fonctionnalisées. [158].

Semblables aux celluloses nanofibrillées, les nanofibres lignocellulosiques sont

généralement obtenu par déconstruction mécanique de fibres.

43

I.4.2. Les méthodes physiques d’extraction

Généralement les méthodes physiques d’extraction de la biomasse

lignocellulosique conduisent à la production de nanofibres lignocellulosiques et des

celluloses nanofibrillées.

I.4.2.1. Homogénéisation

L’homogénéisation à haute pression est utilisée pour désintégrer mécaniquement

la biomasse lignocellulosique en nanofibres ou la fibre cellulosique en cellulose

nanofibrillées.

La cellulose nanofibrillée comme nouveau matériau cellulosique a été introduit par

Turbak et al. [159] et Herrick et al. [160], qui produisent de la cellulose avec des

dimensions latérales dans la gamme des nanomètres en faisant passer une suspension

aqueuse de pâte de bois de résineux à plusieurs reprises à travers un homogénéisateur

haute pression. Au cours d'un tel traitement, des réseaux fortement enchevêtrés de

nanofibres, possédant à la fois des domaines cristallins et amorphes, sont produits en

raison de forces de cisaillement élevées.

Dans ce contexte, deux types d'équipements sont utilisés : les homogénéisateurs

et les microfluidiseurs (Fig.I.11). Ces dispositifs sont couramment utilisés dans des

industries dans le domaine de l’alimentation, la cosmétique, la pharmacie et la

biotechnologie.

a. Homogénéisation à haute pression

Le procédé dit homogénéisation à haute pression (HPH) utilise un

homogénéisateur comme appareillage. Ce procédé comprend, après un prétraitement de

la biomasse lignocellulosique, le passage de la bouillie de cellulose à haute pression dans

un récipient par une buse très petite. La vitesse et la pression élevées ainsi que les forces

d'impact et de cisaillement sur le fluide génèrent des forces de cisaillement dans le

courant et diminuent la taille des fibres à l'échelle nanométrique. Ainsi les celluloses

nanofibrillées ou les nanofibres lignocellulosiques sont obtenues [161].

Li et al. [162] ont isolé et caractérisé les nanofibres de cellulose par

homogénéisation à haute pression à partir de la bagasse de canne à sucre prétraitée avec

44

un liquide ionique, le 1-butyl-3-methylimidazolium chloride. Environ 1% en poids de la

suspension bagasse/ liquide ionique a été mélangée dans le four à micro-ondes à 130 °C

pendant 2 h sous agitation magnétique jusqu'à ce que la bagasse soit complètement

dissoute pour former une solution limpide et visqueuse. Ensuite, la solution a été

homogénéisée par un homogénéisateur haute pression à des niveaux de pression allant

de 40 à 140 MPa et jusqu'à 50 cycles. Des nanofibres ayant 10-20 nm de diamètre ont été

obtenues à 80 MPa après 30 cycles avec récupération de 90% dans les conditions

optimales.

b. Microfluidisation

Le microfluidiseur est un autre instrument similaire à un homogénéisateur qui peut

aussi être utilisé pour produire les celluloses nanofibrillées. Il comprend une pompe

intensificatrice pour augmenter la pression et une chambre d'interaction pour défibriller les

fibres en utilisant des forces de cisaillement et d'impact contre les courants de collision et

les parois de canal [163].

Zimmerman et al.[164] ont rapporté l'utilisation d'un microfluidiseur pour la

production de cellulose nanofibrillée. Les suspensions de pâte de sulfite ont d'abord été

traitées avec un homogénéiseur rotatif en raison de à 24 000 tr / min pendant 8 h et

ensuite passées à travers le processeur de microfluidisation M-100Y à une pression de

1000 bar pendant 60 min. En conséquence, des nanofibres de 20-100 nm de diamètre et

plusieurs dizaines de micromètres de longueur ont été obtenues.

I.4.2.2. Le broyage mécanique

Une autre voie pour obtenir les nanofibres de cellulose est le broyage ultra fin de

friction. Les broyeurs supermasscolloider sont couramment utilisés pour un tel traitement.

Au cours d'un tel procédé, la biomasse prétraitée passe entre des pierres de meulage

statiques et tournantes (ou disques). La distance entre ces disques peut être ajustée, ce

qui permet d'éviter le problème de colmatage. Grâce aux forces de cisaillement générées

entre les disques ou les meules, la paroi cellulaire est laminée et les nanofibrilles sont

individualisées [165].

Pour augmenter l'efficacité de la méthode, Wang et al. 2012 [166] ont proposé

l'utilisation de la réduction de l'écart entre les pierres de meulage à - 100 µm de la position

45

zéro du mouvement. La position de déplacement zéro est la position de contact entre deux

pierres avant la charge de la biomasse lignocellulosique et l'espace « négatif » est fixé

après le chargement de la biomasse.

Taniguchi and Okamura [167] décrivent la production de nanofibres de cellulose en

faisant passer de 5 à 10% en poids les suspensions de fibres naturelles de différentes

sources (fibres de pâte de bois, les fibres de coton, fibres de soie etc.) à travers un petit

broyeur commercial avec un disque spécialement conçu (super-broyage). Toutes les

matières ont été traitées sous la forme d'une suspension contenant 90 à 95% d'eau et ont

été passées à travers le disque 10 fois. Ils ont donc réussi à obtenir des microfibrilles de

diamètre d'environ 20 - 90 nm par cette simple méthode mécanique.

Figure I.11 Procédés mécaniques pour la production des nanofibres de cellulose [165]

I.4.3. La méthode chimique d’extraction

Généralement l’hydrolyse acide conduit à la production de nanocristaux de

cellulose ou de filaments fins (whisker) de cellulose.

L’extraction de la cellulose nanocristalline à partir des matières lignocellulosiques

se produit en deux étapes : après un procédé de prétraitement, s’en suit un traitement

chimique contrôlé; une hydrolyse acide pour éliminer les régions amorphes du polymère

de cellulose.

Ranby [168] est considéré comme le pionnier dans la production de suspensions

colloïdales de cristaux de cellulose par hydrolyse contrôlée des fibres de cellulose en

46

utilisant l’acide acide sulfurique. Aujourd’hui, la méthode de choix pour l'isolement de

nanoparticules de la cellulose est encore basée sur l'hydrolyse contrôlée avec l’acide

sulfurique en raison de la stabilité des suspensions résultantes.

D’autres acides tels que l’acide chlorhydrique, l'acide oxalique, l'acide

hydrobromique et l’acide nitrique peuvent aussi être utilisés. La fonction essentiellement

commune de ces acides réside dans leur capacité à libérer des protons H+ pour le clivage

hydrolytique des liaisons glycosidiques dans les chaînes moléculaires de cellulose au

niveau des régions amorphes.

La procédure typique pour la production de nanocristaux de cellulose comprend les

étapes suivantes après un prétraitement [169]:

− Hydrolyse avec un acide fort de la biomasse lignocellulosique prétraitée dans

des conditions strictement contrôlées de température, de temps, d'agitation

et avec le contrôle d'autres conditions telles que la nature et la concentration

de l'acide et le rapport acide/ biomasse ;

− Dilution avec de l'eau pour arrêter la réaction et lavages répétés avec

centrifugations successives;

− Dialyse complète contre l'eau distillée pour éliminer complètement les

molécules d'acide libre;

− Traitement mécanique, habituellement une sonication, pour disperser les

nanocristaux sous forme de suspension stable uniforme;

− Concentration éventuelle et séchage de la suspension pour donner des

nanocristaux sous forme de poudre.

Silverio et al. [170] ont extrait les nanocristaux de cellulose à partir de l’épi de maïs,

qui a préalablement subi un prétraitement alcalin (2% en poids NaOH/ biomasse) à 140 °C

pendant 4h. L'hydrolyse acide qui a suivi, a été effectuée à 45 °C pendant 30, 60 et 90

minutes, en utilisant 15 ml de H2SO4 (9,17 M). Les nanocristaux de cellulose obtenus

présentaient une forme aiguilleuse, une haute cristallinité (83,7%), une bonne stabilité

thermique (environ 185 °C), une longueur moyenne (L) de 210,8 ± 44,2 nm et un diamètre

(D) de 4,15 ± 1,08 nm, donnant ratio (L / D) d'environ 53,4 ± 15,8.

47

I.4.4. Les méthodes biologiques d’extraction

Les voies biologiques de fabrication des fibres lignocellulosiques ayant les

dimensions nanométriques (les nanofibres lignocellulosiques), les nanofibres de cellulose

ou cellulose nanofibrillée, et les nanocristaux de cellulose ou whisker de cellulose, n’ont

pas été clairement établies et font encore objet d’investigations.

La revue bibliographique ne nous renseigne que sur quelques investigations faites

sur la fabrication des nanocristaux de cellulose impliquant l’utilisation des enzymes, en

combinaison avec les méthodes classiques d’extraction connues notamment l’hydrolyse

acide ou la désintégration mécanique.

Siqueira et al. [3] ont fait des investigations sur diverses combinaisons de

prétraitement mécanique, d'hydrolyse enzymatique et acide pour produire des

nanocristaux de cellulose à partir de la paille de sisal. Ils ont extrait des microfibres de

celluloses en présence de traces des nanocristaux de cellulose en forme des bâtonnets et

ont donc conclu que c’était faisable d’extraire de nanocristaux de cellulose par voie

enzymatique.

Satyamurthy et al. [171] ont utilisé le champignon cellulolytique Trichoderma reesei

pour préparer des nanowhiskers de cellulose par hydrolyse contrôlée à partir de cellulose

microcristalline. Ces celluloses microcristallines (45–53 µm) ont été par contre préparées à

partir des fibres de coton par une hydrolyse conventionnelle d'acide chlorhydrique (HCl

4N). Après une incubation de 1, 3 et 5 jours, ces auteurs ont obtenu des nanowhiskers de

cellulose dont la distribution de taille de diamètre est comprise entre 150 - 200 nm, 100 -

130 nm et 30-40 nm, respectivement.

De même, Chen et al. [172] ont utilisé la cellulase de Trichoderma viride G pour

produire les nanocristaux de cellulose à partir des fibres de coton. La fibre de coton a été

au préalable prétraité au DMSO ou NaOH et la pulpe obtenue a été mécaniquement

désintégrée avec un broyeur de cellule à ultrasons pendant 200 secondes avec 5

intervalles, puis filtrée pour enfin subir l’hydrolyse enzymatique. Les nanocristaux de

cellulose obtenus étaient en forme des bâtonnets de 70 à 280 nm de longueur et 10 à 40

nm de diamètre pour la fibre de coton prétraitée au DMSO, et en forme de graine

sphérique de diamètre moyen compris entre 20 et 6 nm, pour la fibre de coton prétraitée

avec le NaOH.

48

Plus récemment, Hu et al. [7] ont isolé des nanofibrilles de cellulose à partir de

pâte kraft de bois dur prétraitée à l'acide sulfurique, par les actions synergiques d'une

endoglucanase, d’un polysaccharide monooxygénase lytique (LPMO) et d'une xylanase.

La pâte kraft blanchie ou délignifiée a été préalablement désintégrée mécaniquement par

un mélangeur de laboratoire pendant 20 minutes avant l'hydrolyse enzymatique.

I.5. Fonctionnalisation de la fibre lignocellulosique

La fibre lignocellulosique, sous toutes ses désignations, est largement connue

comme un matériau vert renouvelable, respectueux de l'environnement et doté de bonnes

propriétés physico-mécaniques. Elle a été utilisée comme renforcement pour une variété

de matériaux composites dans de nombreux domaines de l'industrie du bâtiment [173,

174]. Elle est de nature hydrophile en raison de l'attraction / interaction entre les groupes

hydroxyles des composants fibreux fortement polarisés. Cette nature hydrophile de la fibre

lignocellulosique la rend intrinsèquement incompatible avec des matrices polymères

hydrophobes dans les composites. Les limitations majeures de l'utilisation de ces fibres

comme renforts dans de telles matrices comprennent une faible adhérence interfaciale

entre la fibre hydrophile polaire et la matrice hydrophobe non polaire telle que les

polyoléfines. De plus, la difficulté à mélanger du fait d'un mauvais mouillage de la fibre

avec la matrice est un autre problème qui conduit à des composites à interface faible

[175].

La solution possible pour éviter ces inconvénients est de soumettre la fibre

lignocellulosique à des modifications de surface spécifiques afin de lui fournir une barrière

hydrophobe efficace, de minimiser leur énergie interfaciale avec la matrice non polaire et

ainsi générer une adhérence optimale. Il faudra donc exploiter les groupements

hydroxyles de la fibre lignocellulosique qui sont la source des réactions bien connues

utilisées pour en préparer une large gamme de dérivés. Ces modifications devront se

limiter aux groupes OH superficiels pour préserver l'intégrité des fibres et donc leur

résistance mécanique [176].

Dans cette revue bibliographique, nous nous limiterons à décrire les méthodes

menant à la génération de groupements hydrophobes à la surface de la fibre

lignocellulosique. La littérature nous renseigne donc sur divers procédés de modification

de surface de la fibre lignocellulosique générant des groupes hydrophobes à la surface.

49

Nous pouvons les classifier en diverses catégories notamment : les traitements physiques

tels que le traitement au plasma [177]; les traitements chimiques par les réactions

d’estérification, de silylation, et d’isocyanation et enfin les traitements biologiques avec

l’utilisation des enzymes, champignons ou bactéries.

I.5.1. Les méthodes physiques de fonctionnalisation

I.5.1.1. Le traitement plasma

Le plasma, essentiellement une décharge luminescente, est caractérisé par une

décharge électrique produisant un gaz partiellement ionisé sous vide à température

ambiante. Ce gaz contient en quantités égales des ions positifs et négatifs, des électrons,

des radicaux et des particules neutres excitées et non excitées, mais sans charge

électrique nette [178].

Le traitement de surface au plasma et la polymérisation au plasma, souvent

méconnus comme phénomène commun, sont deux processus distincts : le premier

provoquant seulement la modification de surface des substrats organiques en modifiant la

chimie de quelques couches moléculaires extérieures ; alors que le dernier est

responsable du dépôt réel d'un mince film polymère sur les surfaces organiques et

inorganiques résultant du processus de polymérisation [179].

La polymérisation plasmatique ou le greffage induit par plasma de polymères

hydrophobes sur la fibre lignocellulosique est utilisé pour améliorer l'hydrophobicité et les

propriétés barrières.

L'hexaméthyldisiloxane (HMDSO) est souvent utilisé sur une biomasse

lignocellulosique comme le bois pour produire du gaz plasmatique à des fins de

modification hydrophobe [180, 181]. Le traitement conduit au dépôt d'un film hydrophobe,

qui présente une structure macromoléculaire fortement réticulée à base de liaisons Si-C et

Si-O-Si.

Les traitements au plasma comprenant du fluor ou la fluoration de la cellulose ou

de la fibre lignocellulosique par le plasma généré par les fluorocarbones ont déjà fait

l’objet d’investigations pour améliorer l’hydrophobicité de la biomasse lignocellulosique

[182]. Un enrichissement en fluor très élevé obtenu à la surface des fibres par des

50

fractions CFx liées de manière covalente, peut donner lieu, dans certaines conditions

expérimentales, à des propriétés super-hydrophobes [183].

Navarro et al. [184] ont traité la pulpe chimio-thermomécanique de sisal par le

plasma au fluorotrimethylsilane. Les espèces implantées en surface étaient des

groupements fluor et des fractions -Si (CH3)x qui se sont chimiquement liés principalement

à la lignine sur la surface de la pulpe de sisal (bien que la réaction du plasma se produise

aussi avec la cellulose et les hémicelluloses), formant des liaisons covalentes C-O-Si-F, et

aussi un peu de C-Si-F, lesquelles liaisons confèrent à la biomasse un caractère

hydrophobe. L'adsorption d'eau pour la fibre de sisal traitée par plasma a été réduite de

plus de 300 à 17 g d'eau/m2 et l'angle de contact est passé de moins de 15 °C à plus de

120°C.

I.5.2. Les méthodes chimiques de fonctionnalisation

I.5.2.1. L’estérification

L'hydrophobisation de la surface de la fibre cellulosique a habituellement été

réalisée par le procédé d'estérification de la cellulose bien connu, qui utilise

essentiellement les acides carboxyliques, les anhydrides d'acides ou les halogénures

d’acyles en tant qu'agents réactifs (Fig.I.12). Cette réaction implique l’introduction ou la

formation de groupe esters par condensation de ces réactifs acides et les groupements

hydroxyles de la fibre, provoquant ainsi la plastification de fibres lignocellulosiques qui en

augmente l'hydrophobicité [185].

L’utilisation des acides carboxylique est l'approche la plus directe pour former des

liaisons esters à la surface de la fibre lignocellulosique. Les acides carboxyliques tels que

l’acide acétique ou butyrique sont souvent utilisés pour introduire les groupes acétyles à la

surface de la fibre cellulosique, en mélange parfois avec l’anhydride acétique, sous

catalyse acide sulfurique ou perchlorique [186-189]. Dans une approche de chimie verte,

les acides gras tels que l’acide stéarique, peuvent aussi être utilisés pour introduire des

longues chaines hydrophobes à la surface de la fibre lignocellulosique.

51

Figure I.12. Réactions conduisant à l’estérification des surfaces cellulosiques [190]

I.5.2.2. La silylation

La modification de surface à base de silane est un moyen très répandu pour

changer la surface de la fibre d’hydrophile à hydrophobe. En l'absence d'eau, même à une

température élevée, aucune réaction ne se produit entre les liaisons Si-OR et les groupes

OH de la cellulose, tandis que les liaisons Si-OR réagissent avec le groupement OH

phénolique de la lignine. En présence d'humidité, un groupe alkoxyle hydrolysable conduit

à la formation de silanols. Le silanol réagit ensuite avec le groupe hydroxyle de la

cellulose, en formant des liaisons covalentes stables avec la paroi cellulaire par

chimisorption sur la surface de la fibre (Fig.I.13-16) [191].

D’une manière générale, l'interaction d'agents de couplage de silane avec des

fibres naturelles se déroule principalement suivant les étapes suivantes [192] :

1. Les monomères de silane sont hydrolysés en présence d'eau et d'un

catalyseur (normalement acide ou de base) libérant de l'alcool et donnant

des groupes silanol réactifs;

Figure I.13. Hydrolyse de silane

52

2. Pendant le processus d'hydrolyse, la condensation concomitante de silanols

a également lieu. La condensation doit être minimisée à ce stade pour laisser

les silanols libres pour être adsorbé aux groupes hydroxyle dans les fibres

naturelles. La vitesse de condensation des silanols peut être réglée en

ajustant le pH du système d'hydrolyse. Un environnement de pH acide est

habituellement préférable pour accélérer la vitesse d'hydrolyse des silanes

mais ralentir le taux de condensation des silanols.

Figure I.14. Autocondensation des silanols

3. Les monomères ou oligomères de silanol réactifs sont adsorbés

physiquement sur des groupes hydroxyles de fibres naturelles par des

liaisons hydrogène sur les surfaces des fibres (revêtement de surface) et / ou

dans les parois cellulaires (encombrement des parois cellulaires) qui dépend

de la taille moléculaire des monomères / oligomères de silanol formé. Les

silanols libres sont également adsorbés et réagissent les uns avec les autres,

formant ainsi des structures rigides de polysiloxane liées à une liaison Si-O-

Si stable.

Figure I.15. Adsorption de silanols

4. À haute température, les liaisons hydrogène entre les silanols et les groupes

hydroxyles des fibres peuvent être converties en liaisons -Si-O-C- covalentes

avec la libération d’eau. Les groupes silanol résiduels dans les fibres vont

encore se condenser l'un avec l'autre. Les liaisons de -Si-O-C peuvent ne

pas être stables vis-à-vis de l’hydrolyse ; cependant, cette liaison est

53

réversible lorsque l'eau est enlevée à une température élevée.

Figure I.16. Greffage de silanols

Van de Weyenberg et al. [193] ont modifié la surface de la fibre de lin en utilisant le

3- aminopropyl triméthoxy silane comme agent de couplage dans une solution d'acétone

et d'eau. Un traitement thermique a été appliqué après avoir atteint l'adsorption à

l'équilibre des silanes préhydrolysés sur le substrat cellulosique. Les analyses

spectroscopiques infrarouge à réflexion diffuse ont montré que la présence de liaisons Si-

O-Cellulose et Si-O-Si sur la surface de la fibre a confirmé que l'agent de couplage silane

était efficacement maintenu sur la surface des fibres à la fois par condensation avec des

groupes hydroxyles de cellulose et par autocondensation entre les groupes silanols. La

mesure d’angles de contact a révélé que le caractère hydrophile des fibres peut être

fortement diminué après le traitement au silane.

I.5.2.3. L’uréthanisation

L'uréthanisation, également connue sous le nom de carbamylation, est la réaction

d'un isocyanate avec des groupes hydroxyles disponibles à la surface de la fibre

lignocellulosique pour créer une liaison uréthane covalente [194].

Les agents de couplage à base d’isocyanate, incluant le toluène diisocyanate, sont

souvent utilisés pour favoriser une bonne adhérence dans les composites de fibre

lignocellulosique-plastique [195].

Shang et al. [196] ont préparé les nanocristaux de cellulose hydrophobe en greffant

de l'huile de ricin à terminaison isocyanate sur leur surface. L'existence d'un composant

d'huile de ricin dans les nanocristaux de celluloses modifiés a été vérifiée par FTIR, RMN

13C à l'état solide et par spectroscopie de photoélectrons par rayons X. En même temps, la

diffraction des rayons X et la TEM ont prouvé que la structure cristalline était

essentiellement préservée après greffage chimique. De plus, la surface des nanocristaux

54

de cellulose modifiés semblait hydrophobe, comme l'indiquait la variation des mesures de

l'angle de contact après fonctionnalisation, soit de 46° à 97°.

I.5.3. Les méthodes biologiques de fonctionnalisation

L'utilisation des enzymes devient de plus en plus importante pour la modification de

surface des fibres végétales. La raison majeure de l'utilisation des enzymes est le fait que

leur application est respectueuse de l'environnement. De plus, les réactions catalysées

sont très spécifiques.

Les enzymes telles que les hydrolases et les oxydoréductases peuvent être

utilisées pour la modification de surface de la fibre lignocellulosique. Dans la classe des

hydrolases, les enzymes les plus fréquemment utilisées pour la modification des

polymères sont les glycosidases, les protéases et les lipases, alors que dans la classe des

oxydoréductases : la tyrosinase, la laccase et la peroxydase sont utilisées depuis

longtemps.

La laccase favorise l'oxydation des hydroxyles phénoliques en radicaux

phénoliques en présence d'oxygène [197]. Lorsqu'elle est utilisée avec des phénols

naturels tels que l'acétosyringore, l'acide P-coumarique et la syringaldehyde, elle offre des

propriétés antimicrobiennes sur les composites à base de fibres naturelles [198] .

Thakur et al. 2015 [8] ont utilisé la laccase de Trametes versicolor pour le bio-

greffage du syringaldéhyde à la surface des fibres de coco (Fig.I.17). Une amélioration

des propriétés des fibres de noix de coco a été observée après biomarquage de

syringaldéhyde. On a constaté que la capacité de rétention de l'humidité des fibres de

coco était diminuée par le biogreffage du phénol syringaldéhyde. Ces fibres de coco

modifiées ont été utilisées pour le renforcement de la matrice de poly (butylène succinate)

pour préparer des biocomposites. Une augmentation de la résistance mécanique des

biocomposites a été observée lorsqu'on les a renforcées avec des fibres biogreffées par

rapport aux fibres de coco non modifiées.

55

Figure I.17. Mécanisme de biogreffage du syringaldéhyde sur les fibres de coco catalysé par la laccase [8]

La laccase fera l’objet d’une attention particulière dans ce travail car elle a été

utilisée dans la modification de surface des fibres de lin.

I.6. Les laccases

I.6.1. Définition

Les laccases (p-diphénol: oxygène oxydoréductases, EC 1.10.3.2) appartiennent à

un groupe d’enzymes nommé « oxydases bleues » de type ligninase, capables de

dégrader la lignine [199]. Elles sont capables d’oxyder des o- ou p- diphénols en quinones

correspondantes et oxydent les monophénols en semiquinones, sans hydroxylation

préalable (Fig.I.18). De plus, elles sont capables d’oxyder les méthoxyphénols, les

monomères de lignine, ainsi que des diamines et des amines aromatiques, avec une

réduction concomitante de l'oxygène moléculaire en eau [200].

56

Figure I.18. Les réactions catalysées par la laccase (EC1.10.3.2) [201]

I.6.2. Source de laccases

Les laccases se trouvent généralement chez les plantes supérieures et les

champignons, mais récemment, elles ont été retrouvées chez certaines bactéries telles

que Streptomyces lavendulae [202], Streptomyces cyaneus [203] et Marinomonas

mediterranea [204].

Dans les champignons, les laccases sont largement distribuées chez les

ascomycètes dont les nombreuses espèces de Trichoderma telles que T. atroviride et T.

harzianum [205]; les deutéromycètes dont les différentes espèces d’ Aspergillus telles que

A. niger [206], A. Flavus [207], A. Oryzae [208], et les basidiomycètes, communément

appelés champignons à chapeau, tels que le Phanerochaete chrysosporium, Theiophora

terrestris et Lenzites, betulina [209] et les champignons de la pourriture blanche tels que

Phlebia radiate, Pleurotus ostreatus [210] et Trametes versicolor [211].

La présence de laccases dans les plantes supérieures apparaît moins importante

que chez les champignons. Elles jouent un rôle dans la polymérisation de la lignine par un

mécanisme de déshydrogénation, alors que chez les champignons, elles sont impliquées

57

dans la délignification, la sporulation, la production de pigments, la fructification et la

pathogenèse des plantes [212]. Toutes les laccases caractérisées jusqu’à présent sont

des glycoprotéines, notamment celle de Rhus vernicifera qui est la plus étudiée. Les

laccases ont été signalées dans diverses plantes, notamment la laque [213] et le pin [214].

I.6.3. Structure

Actuellement, les connaissances sur la structure et même les propriétés physico-

chimiques des laccases reposent sur l'étude de protéines purifiées. Jusqu'à présent, plus

de 100 laccases ont été purifiées à partir de champignons et ont été plus ou moins

caractérisées. La masse moléculaire du monomère est d'environ 50 à 100 kDa avec un

point isoélectrique acide autour de pH 4,0. Une caractéristique importante est le haut

niveau de glycosylation (avec des fractions glucidiques liées par covalence allant de 10 à

50% du poids total, selon l'espèce ou l'hôte hétérologue), ce qui peut contribuer à la

grande stabilité de l'enzyme [215].

Les structures des laccases de Rigidoporus lignosus [216] et de CoA issue de

l'endospore de Bacillus subtilis [217] (Fig.I.19), de Coprinus cinereus [218], Trametes

versicolor [219], Pycnoporus cinnabarinus [220], Melanocarpus albomyces [221], ont été

établies par différentes techniques telles que la cristallographie, les rayons X, la

spectroscopie UV/visible ou la RPE (résonance paramagnétique électronique).

Figure I.19. Structure tridimensionnelle de : (a) laccase de champignons de Rigidoporus lignosus [216] et (b) laccase bactérienne de Bacillus subtilis [222]

58

En général, les laccases sont des glycoprotéines dimériques ou tétramériques

contenant au niveau de leur site actif quatre atomes de cuivre qui sont différents par la

nature de leurs ligands (Fig.I.20). On distingue trois sites appelés T1, T2 et T3 d'après

leurs propriétés spectroscopiques [223] :

− Le site T1 contient un atome de cuivre qui absorbe à 610 nm (Cu+),

responsable de la couleur bleue de l’enzyme. Il présente une coordination

trigonale avec deux histidines, une cystéine et un ligand axial, la méthionine

dans la bactérie (CotA), la leucine ou la phénylalanine dans les laccases

fongiques [224];

− Le site T2 a un atome de cuivre (Cu2+) qui ne présente aucune absorption

dans le spectre visible. Il a deux histidines avec l’eau comme ligand et

révèle des propriétés paramagnétiques. Sa position stratégique est proche

du cuivre du site T3, centre binucléaire caractérisé par une absorption

électronique à 330 nm et par l’absence de signal de résonance

paramagnétique électronique résultant du couplage antiferromagnétique de

la paire de cuivre [225];

− Le site T3 a deux atomes de cuivre fortement associés, qui absorbent à 330

nm. Les 2 cuivres du site T3 se coordonnent avec trois histidines chacun et

un pont hydroxyle, qui maintient le fort couplage antiferromagnétique entre

les atomes de cuivre [219].

59

Figure I.20. Environnement des 4 atomes de cuivre du site actif de la laccase (CotA) de Bacillus subtilis [217]

I.6.4. Mécanisme réactionnel

Le mécanisme catalytique de la laccase est de type « donneur-accepteur ». Il met

en jeu la réduction d'une molécule d'oxygène en deux molécules d'eau et l'oxydation

concomitante de quatre molécules de substrats produisant quatre radicaux libres très

instables et très réactifs pouvant subir des réactions non enzymatiques [226]:

− La réticulation des monomères: L'oxydation enzymatique des composés

phénoliques et des anilines par les laccases génère des radicaux qui

réagissent entre eux pour former des dimères, des oligomères ou des

polymères couplés de manière covalente par des liaisons C – C, C – O et C

– N;

− La dégradation des polymères: Les laccases interviennent dans la

dégradation de polymères naturels complexes, tels que la lignine ou les

60

acides humiques. Les radicaux réactifs générés conduisent au clivage des

liaisons covalentes et à la libération des monomères

D’une manière générale, d’après Solomon et al.[227, 228], Xu et al. [229] et

Mikolasch et al. [230], il y a trois étapes majeures dans la catalyse par la laccase tel que le

montre la figure I.21.

1) Oxydation du substrat par la laccase : le substrat perd 4 électrons

(donneur), et la laccase gagne 4 électrons (accepteur) au niveau du site T1

contenant le cuivre de type 1 (Cu1). L’oxydation du substrat et la réduction

du cuivre (Cu1) du site T1 de Cu2+ en Cu+ ont lieu pendant cette étape;

2) Un transfert interne d'électron du cuivre T1 vers le cluster de cuivre

trinucléaire T2 / T3 : l’oxydation du (Cu+ en Cu2+) de T1 et la réduction du

(Cu2+ en Cu+) de T2-T3 se passent pendant cette étape;

3) Liaison de l’oxygène moléculaire aux centres de cuivre T2-T3, transfert

d'électrons des atomes de cuivre T2 -T3 sur l'oxygène et sa réduction en

eau.

Figure I.21. Cycle catalytique de la laccase [231]

I.6.5. Propriétés physico chimiques

I.6.5.1. Spécificité du substrat

Les laccases sont généralement présentes sous forme de plusieurs isoenzymes

ayant leur propre spécificité de substrat [232]. En plus des mono et polyphénols, les

61

laccases sont capables d’oxyder divers composés aromatiques, tels que les phénols

substitués, les diamines, les amines et les thiols, et même certains composés

inorganiques tels que l’iode, Mo(CN)84−, et Fe(CN)6

4−[212, 233, 234]

Les substrats organiques des laccases sont des composés phénoliques substitués

sur différentes positions (ortho, méta, para) par –OCH3, -CH3 ou –COOH, notamment des

monomères phénoliques impliqués dans le métabolisme de la lignine (acide férulique,

acide sinapylique, alcool coniférylique, acide benzoïque…etc.). Les composés ortho-

substitués sont les meilleurs substrats pour la plupart des laccases et la syringaldazine (4-

hydroxy-3,5-diméthoxybenzaldéhyde azine) est généralement appelée substrat spécifique

de la laccase [234, 235].

Pour les substrats non phénoliques ou les composés phénoliques qui possèdent

un potentiel redox élevé, l’ajout d’un médiateur dans le milieu réactionnel permet d’élargir

la spécificité de la laccase ou d’augmenter la vitesse d’oxydation [236, 237]. Ces

médiateurs sont utilisés lorsque le substrat d’intérêt (comme c’est le cas des lignines) ne

peut pas être oxydé directement par l’enzyme à cause de sa taille qui lui ne permet pas de

pénétrer à l’intérieur du site actif ou parce qu’il a un potentiel redox particulièrement élevé

[238]. Ils transportent les électrons entre le substrat et l’enzyme (Fig.I.22). Ainsi, la laccase

oxyde le médiateur en radical, qui à son tour, oxyde le substrat [239]. Ces médiateurs

peuvent être d’origine synthétique, tel que l’acide 2,2’-Azino-Bis (3-éthylbenz-Thiazoline-6-

Sulfonique) (ATBS) [240], les dérivés de la lignine (alcool p-hydroxybenzylique, acide p-

hydroxybenzoïque, vanilline, acétovanillone, syringaldéhyde, acétosyringone et les acide

syringique, p-coumarique, férulique et sinapique)[241],et aussi les composés N-hydroxy

dérivés de l’hydroxylamine (N-Hydroxyphthalimide, N-Hydroxybenzotriazole, N-

Hydroxysuccinimide) [242].

62

Figure I.22. Représentation schématique de la catalyse par la laccase en présence d'un médiateur [243]

I.6.5.2. Influence du pH

La spécificité du substrat et l'affinité de la laccase varient avec les changements de

pH. Pour les substrats dont l’oxydation n’implique pas d’échange de protons (comme le

ferrocyanure), l’activité de la laccase diminue souvent avec l’augmentation du pH, tandis

que pour les substrats dont l’oxydation implique l’échange de protons (comme le phénol),

le profil d’activité de la laccase peut présenter un pH optimal dont la valeur dépend de la

source de laccase plutôt que du substrat [244, 245]. Pour les phénols, la plage de pH

optimale se situe entre 3 et 7 pour les laccases fongiques ainsi que pour les laccases

bactériennes et peut atteindre 9 pour les laccases végétales [246]. Les pH optimaux pour

les laccases fongiques peuvent être dus à l’aptitude des champignons à bien se

développer en milieu acide, mais les laccases végétales ont présenté leur pH optimal plus

proche de la plage physiologique en raison de la nature intracellulaire. Cette différence

des pH optimaux serait liée à leurs fonctions physiologiques [199].

I.6.5.3. Influence de la température

La température est un paramètre essentiel pour les réactions enzymatiques. La

température optimale de l’activité laccasique varie considérablement d’une souche à

l’autre. Pour la plupart des laccases, elle est comprise entre 50 et 70°C [247]. La stabilité

thermique des laccases varie de manière significative avec la plage de température de

63

croissance de l'organisme source. Les laccases fongiques ont généralement une stabilité

thermique inférieure à celle des laccases bactériennes [234]. Cette stabilité serait liée à

l'interaction entre les ions cuivre des centres et ponts de cuivre ainsi que le réseau de

liaisons hydrogène dans les structures protéiques internes [248].

I.6.6. Applications

Un certain nombre d'applications industrielles des laccases telles que la

délignification et le blanchiment de la pâte à papier, la biorestauration de sites contaminés,

la prévention de la décoloration du vin, les applications médicales, l'oxydation de

colorants, la conversion enzymatique d'intermédiaires chimiques et la production de

produits chimiques à partir de lignine ont été rapportés [249]. Outre l'application de

laccases dans de nombreux domaines agricoles, industriels et médicaux, les études sur

les laccases sont actuellement axées sur la bio-oxydation, la biotransformation et la

technologie du biocapteur à base de laccase [250].

En raison de leur efficacité catalytique élevée et de leur grande spécificité de

substrat, les laccases deviennent plus avantageuses par rapport à d’autres catalyseurs

chimiques ou microbiens classiques. Cependant, le coût élevé de l'isolation et de la

purification, la non-réutilisation, l'instabilité de la structure peuvent constituer des

problèmes pratiques potentiels pour les applications de laccases, mais ils peuvent être

surmontés en immobilisant des enzymes sur ou dans des supports solides [251].

I.6.6.1. Industries alimentaires

Plusieurs composés phénoliques tels que les acides coumariques, les flavanes et

les anthocyanes sont généralement présents dans les boissons (vin, jus de fruits et bière)

et peuvent, au cours de leur durée de conservation, provoquer des modifications

indésirables et délétères telles que la décoloration, la formation de trouble, la brume et les

changements de saveur. Les effets encourageants de l'action de la laccase ont été

observés sur le vin ainsi que sur les jus de fruits [252]. Les laccases peuvent améliorer la

qualité gustative des huiles végétales et stabiliser certains des produits périssables

contenant des huiles végétales [253]. Pour améliorer la résistance des structures de

gluten dans la pâte et / ou les produits cuits au four, on peut utiliser des laccases [254].

64

I.6.6.2. Industries textiles et cosmétiques

Les colorants synthétiques sont largement utilisés dans les industries telles que

textile, cosmétiques et impression du papier [255].

Les industries textiles utilisent un grand volume d'eau et de produits chimiques

pour le traitement par voie humide. Ces produits chimiques vont des composés

inorganiques aux composés organiques. La structure chimique des colorants offre une

résistance à la décoloration lorsqu'elle est exposée à la lumière, à l'eau et à d'autres

produits chimiques. Les laccases sont apparues dans l’industrie textile comme des outils

intéressants pour enlever les teintures [256] ou blanchir du coton [257] en raison de leur

potentiel pour dégrader différents colorants. L'application des laccases présente des

avantages en termes d'économie d'énergie, de produits chimiques et d'eau.

Dans les industries cosmétiques, les teintures capillaires à base de laccase

pourraient être moins irritantes et plus faciles à manipuler que les teintures capillaires

habituelles à base de H2O2 en milieu alcalin [258]. Plusieurs brevets ont d’ailleurs été

déposé en ce sens et relatent l'utilisation des laccases dans le monde cosmétique, surtout

pour la synthèse de nouveaux pigments dits "naturels" pour colorer les cheveux [259]. Des

préparations cosmétiques et dermatologiques contenant des protéines de laccase pour le

blanchiment de la peau ont aussi été développées.

I.6.6.3. Industries pharmaceutiques

La laccase peut être utilisée dans la synthèse de composés médicinaux complexes

ainsi que de dimères hétéromoléculaires d'antibiotiques par oxydation phénolique [260],

par couplage oxydatif phénolique [261], et par oxydation couplée à une amination

nucléaire [262].

Les laccases ont été utilisés dans la synthèse des composés médicinaux tels que

les triazolo (benzo) cycloalkyl thiadiazines (un groupe d'agents anti-inflammatoires,

analgésiques, etc.) [263], la vinblastine (un agent cytostatique et antitumoral), le

mitomycine, les dimères de pénicilline X, les céphalosporines et la vindoline dimérisée

(pour traiter les maladies néoplasiques) [264, 265].

65

I.6.6.4. Bionanotechnologies

Les nanotechnologies sont l’ensemble des technologies se déroulant à l’échelle du

nanomètre. Elles consistent à mettre en œuvre des procédés miniaturisés permettant la

production ou l’analyse de divers produits.

Un biocapteur est une sonde biologique intégrée avec un transducteur

électronique, qui convertit un signal biochimique en une réponse électrique quantifiable qui

détecte, transmet et enregistre des informations concernant un changement physiologique

ou biochimique [266]. Un certain nombre de biocapteurs utilisant la laccase ont été

développés pour la détermination du glucose, des amines aromatiques et des composés

phénoliques [267, 268].

Plus récemment, la laccase a été utilisé dans la technologie de surveillance

biomédicale et thérapeutique moderne pour la détection à haute performance de la

bromocriptine, un dérivé de l’ergoline, notamment utilisés en pharmacie comme

vasoconstricteurs, dans le traitement des migraines ou pour lutter contre la maladie de

Parkinson [269].

Une autre des utilisations intéressantes des laccases en nanobiotechnologie est le

développement de cellules électrochimiques pour la production d’énergie [270].

I.6.6.5. Bioremédiation et traitement des déchets

Le terme bioremédiation peut être défini comme étant "un ensemble de procédés

en vue d'améliorer les caractéristiques de l'environnement altérées par des contaminants

[271]. Les composés tels que : les diphényles polychlorés, le benzène, le toluène,

l’éthylbenzène, le xylène, les hydrocarbures aromatiques polycycliques, le pentachloro

phénol, le 1,1,1-trichloro-2,2-bis (4-chlorophényl) éthane et le trinitrotoluène sont des

substances connues pour leurs effets cancérigènes, mutagènes et persistants dans

l'environnement. La laccase immobilisée s'est avérée utile pour dégrader ou éliminer les

polluants phénoliques et phénoliques chlorés en raison de la large gamme de substrats de

l'enzyme [272].

66

I.6.6.6. Industrie du papier et de la pâte à papier

Les oxydants chimiques à base de chlore et d’oxygène sont utilisés pour la

séparation et la dégradation de la lignine, nécessaire à la préparation du papier. Les

systèmes laccase/médiateur sont le plus utilisés pour dégrader la lignine lors de

l’extraction de la pulpe évitant l’utilisation de produits chimiques chlorés [273].

I.6.6.7. Autres applications

Les laccases ne sont pas seulement utilisées dans l’industrie alimentaire, l’industrie

du papier et de la pâte à papier, l’industrie textile et cosmétique, pharmaceutique etc.,

mais ont également d’autres applications.

Les laccases peuvent être utilisées pour doser d'autres enzymes, notamment

l'amylase, les aminopeptidases (spécifiques à l'alanine, la cystine ou la leucine), les

phosphatases alcalines, les enzymes de conversion de l'angiotensine I, la chymotrypsine,

la plasmine, la thrombine, etc. [274]

Les laccases sont également rapportées dans la biogreffage des composés

phénoliques ou de certains autres types de composés de faible poids moléculaire afin

d'adapter la surface des biomasses lignocellulosiques ou de la lignine isolée dans des

conditions douces et généralement sans solvant nocif [275]

67

Conclusion du chapitre et situation du sujet de recherche

Dans cette revue de la littérature, nous avons dans un premier plan décrit de

manière générale la biomasse lignocellulosique et son potentiel comme biopolymère et

présenté une biomasse particulière, la fibre de lin. Ensuite divers procédés de

prétraitement pour améliorer la digestibilité de la biomasse ont été décrits, et les voies et

moyens d’extraction ou de production des nanofibres lignocellulosiques, celluloses

nanofibrillées et nanocristaux de cellulose ont été explorées. Enfin les moyens de

fonctionnalisation de ces nanoparticules hydrophiles pour leur compatibilisation avec des

matrices hydrophobes ont été présentés, et une attention particulière a été portée sur la

laccase, une enzyme utilisée dans cette étude pour induire la fonctionnalisation de la fibre.

En effet, la biomasse lignocellulosique décrite dans la revue bibliographique, se

présente comme un matériau hétérogène et très variable, constitué de macromolécules

qui sont liées de façon intime dans une maille tridimensionnelle, lui conférant une

récalcitrance à toute forme d’extraction.

Dans le cadre de notre sujet de thèse, nous avons porté notre choix sur la fibre de

lin comme biomasse lignocellulosique. Cette fibre a la particularité d'être une fibre longue

(plusieurs dizaines de centimètres) et rigide par rapport aux fibres courtes (coton,

chanvre). Líntérêt porté aux fibres de lin comme biomasse lignocellulosique est motivé

par plusieurs raisons : la première raison est environnementale et géographique. Tout

dábord la fibre de lin est un matériau naturel dont la culture est relativement neutre vis-à-

vis de lénvironnement, donc il semble pouvoir répondre à la préservation de la nature tout

en fournissant des matériaux industrialisables compétitifs. De plus, en termes de

production, le lin est parmi les plantes les plus cultivées au monde et au Canada cést un

produit largement cultivé, surtout pour la filière oléagineuse (1er producteur mondial de la

graine de lin). Ce qui sous-entend des tonnes de déchets sous forme de fibres disponibles

à valoriser. Un autre avantage de la fibre de lin est sa densité, estimée à environ 1.5 qui

est significativement inférieure à celle des fibres de verre qui vaut 2.54. Ajoutée à de

bonnes propriétés mécaniques, cette différence conduit à des propriétés spécifiques

comparables en termes de contrainte à la rupture, voire même supérieures concernant le

module d’élasticité, ce qui pourrait se répercuter sur les propriétés mécaniques des

composites qui en découlent.

Divers procédés de prétraitement ont été décrits et explorés pour améliorer la

68

digestibilité et surmonter la récalcitrance de la biomasse lignocellulosique, principalement

en réduisant la teneur en lignine et/ou en hémicelluloses, en augmentant la surface

spécifique accessible, en réduisant la cristallinité de la cellulose, en augmentant la

porosité ou en altérant la structure de la lignine. Cependant, un procédé de prétraitement

économiquement et écologiquement viable n'a pas été établi jusqu’à maintenant. L’idéal

serait un prétraitement susceptible de combiner les avantages de tous ces prétraitements

tout en minimisant leurs inconvénients et de réduire leur coût.

Étant donné que l’un des objectifs spécifiques de ce travail est de mettre en œuvre

un procédé de déstructuration des fibres de lin tout en évitant son fractionnement afin

d’extraire des fibres lignocellulosiques ayant les dimensions nanométriques, notre choix

s’est porté sur un prétraitement au CO2 comme fluide supercritique. Ce choix est dû au fait

que, le lin étant un matériau contenant peu de lignine (2¨%), ce prétraitement n’affecte pas

qualitativement et quantitativement la composition chimique de la biomasse

lignocellulosique, notamment moins ou presque pas d’élimination de la lignine, laquelle

lignine nous servira de pont pour la fonctionnalisation future. Seuls les dommages

physiques sont observés sous certaines conditions avec la libération explosive de la

pression, avec comme conséquences l’augmentation du volume de pores et de surface

d’accès.

Quant à l’extraction proprement dite des nanoparticules de fibres, outre les

traitements mécaniques classiques, tels que l'homogénéisation ou le broyage, nous avons

abordé la voie chimique de fabrication de ces nanoparticules et rapporté les progrès

réalisés en ce qui concerne les investigations faites sur l’utilisation des enzymes ou les

voies biologiques d’extraction des nanoparticules de la lignocellulose. Les traitements

mécaniques classiques (l'homogénéisation ou le broyage) peuvent être considérés comme

une approche efficace en raison de leur haut rendement et leur simplicité. Ils ne requièrent

généralement pas de solvants organiques. Pendant une longue période, le principal

obstacle au succès commercial de ces procédés de traitements mécaniques classiques

était la forte consommation d'énergie, qui pourrait atteindre 70 MWh/t [276]. Un autre

inconvénient de l'homogénéisation (principalement avec la microfluidisation) est le

colmatage du système lors de l'utilisation de fibres longues [277]. Cette question reste le

principal défi de l'expansion d’une telle approche. La voie chimique de fabrication de

nanoparticules, notamment l’hydrolyse acide, demeure à nos jours la méthode de choix

pour l’isolation de nanoparticules de la fibre lignocellulosique en raison de son efficacité et

69

de son rendement. Toutefois, à l’instar de tous les procédés chimiques, elle pose de

sérieux problèmes de récupération chimique.

L’utilisation des enzymes ou les voies biologiques d’extraction des nanofibres

lignocellulosiques, nanocristaux de cellulose ou celluloses nanofibrillées constituent la voie

d’avenir et du progrès et fait encore l’objet d’investigations à ce jour. Dans le cadre de

notre travail, la voie de l’hydrolyse enzymatique pour l’extraction des nanofibres

lignocellulosiques que nous avons choisie, constitue pour nous un challenge, une

originalité, et un apport par rapport aux travaux antérieurs réalisés dans le domaine.

L’originalité de notre étude réside en ce qu’après un prétraitement de la fibre de lin, il

s’agira d’extraire des fibres lignocellulosiques ayant les dimensions nanométriques

(nanofibres lignocellulosiques) par un cocktail d’enzymes hydrolytiques sans faire

intervenir une étape des méthodes classiques établies (hydrolyse acide ou broyage

mécanique conventionnel), tel que réalisé par les travaux antérieurs.

Enfin sur la fonctionnalisation de ces nanofibres extraites, les voies chimiques de

modification de surface décrites dans cette revue montrent que ces techniques

aboutissent à une forte formation de liaisons covalentes et de ce fait à l’hydrophobisation

de la fibre lignocellulosique. Cependant ces méthodes chimiques utilisent beaucoup de

produits chimiques dangereux dans le processus de fonctionnalisation des fibres

végétales. De plus, la manipulation et l’élimination appropriées des déchets chimiques

ainsi engendrés peuvent également augmenter le coût de production des composites

polymères renforcés par ces fibres végétales.

Des méthodes alternatives devraient être adoptées pour la modification de la

surface des fibres végétales. Les méthodes vertes ou respectueuses de l’environnement

telles que le traitement aux enzymes peuvent entraîner des changements dans la

morphologie de surface, le comportement thermique, la cristallinité et les propriétés

mécaniques des fibres végétales sans utiliser de produits chimiques nocifs. Dans le cadre

de notre travail, nous avons opté pour la fonctionnalisation de nanofibres

lignocellulosiques en greffant des composés phénoliques naturels (guaïacol et

syringaldéhyde) sous la médiation d’une enzyme oxydoréductase, la laccase.

70

Chapitre II

II. Hypothèses et objectifs de la recherche

II.1.1. Hypothèses

Forts de cette revue de la littérature, nous pouvons émettre les hypothèses selon

lesquelles :

− Le prétraitement au CO2 supercritique déstructurerait la biomasse sans

pour autant qu’il y ait modification de la composition chimique de cette

dernière ;

− Le prétraitement au CO2 supercritique faciliterait l’accès aux enzymes et

améliorerait l’hydrolyse du substrat (biomasse prétraitée) ;

− La lignine résiduelle de la biomasse aiderait à fonctionnaliser les fibres pour

leur compatibilisation avec les polymères ;

− L’enzyme oxydoréductase, la laccase, peut catalyser la modification de

surface des fibres lignocellulosiques.

II.1.2. Objectifs

II.1.2.1. Objectif général

L’objectif global de la présente thèse est de mettre en place un procédé de

prétraitement de la biomasse lignocellulosique, de fabrication de nanofibres

lignocellulosiques et de modification de surface de ces nanoparticules de ces fibres,

environnementalement irréprochable (vert) sur toute la ligne.

II.1.2.2. Objectifs spécifiques

Les objectifs spécifiques de ce travail sont :

− Mettre en œuvre un procédé de déstructuration des fibres de lin en utilisant

le dioxyde de carbone (CO2) comme fluide supercritique et éviter son

fractionnement ;

− Extraire des fibres lignocellulosiques ayant les dimensions nanométriques

(nanofibres lignocellulosiques) par un cocktail d’enzymes hydrolytiques ;

71

− Utiliser la laccase comme enzyme pour le traitement de surface de ces

nanofibres lignocellulosiques et leur compatibilisation.

72

Chapitre III

III. Matériels et méthodes

III.1. Matériels

III.1.1. La matière première lignocellulosique

La matière première lignocellulosique utilisée pour l’extraction de nanofibres

lignocellulosiques est la tige de Linum usitatissimum (lin). Ces tiges de lin sont les

dérivées des déchets de lin agricoles fournies par Biolin Research Inc (Saskatoon,

Saskatchewan, Canada).

III.1.2. Les enzymes

III.1.2.1. Cellulase de Trichoderma Reesei (EC. 3.2.1.4)

La cellulase utilisée dans ce travail est une Celluclast, une marque déposée de

Novozymes Corp, commercialisée par la société Sigma-Aldrich sous le code ou numéro

C2730. L’enzyme se présentant sous forme d’une solution aqueuse de couleur brune,

avec une densité comprise entre 1.10 et 1.30 g/ml, est produite par fermentation

immergée d'une souche sélectionnée du champignon Trichoderma reesei et catalyse la

dégradation de la cellulose en glucose, cellobiose et polymères de glucose. Généralement

stable à une température de stockage de 0 à 25 °C, l’enzyme maintient son activité

déclarée pendant au moins 3 mois. À basse température (2 à 8 °C), température de

stockage recommandée, sa durée de vie est considérablement augmentée (~18 mois).

Son activité déclarée est de 700 EGU/g et les conditions optimales d'activité de cette

préparation enzymatique sont comprises entre pH 4,5 et 6,0 et entre 50 et 60 °C.

III.1.2.2. Endo-1-4-β-xylanase de Trichoderma longibrachiatum (EC. 3.2.1.8)

La xylanase du champignon Trichoderma longibrachiatum dont l’action principale

est une endo-1,4-β-D-xylanase neutre en acide, avec des actions supplémentaires

secondaires incluant la β-glucanase, la cellulase, la pectinase, la mannanase, la

xyloglucanase, la laminarase, la β-glucosidase, la β-xylosidase, la α-L-

arabinofuranosidase, l'amylase et la protéase, commercialisée par Sigma-Aldrich sous le

code X2629, se présente sous forme de poudre brun clair pratiquement soluble dans l’eau

et stable à la température ambiante de stockage. Elle est fournie avec une activité de 1

73

U/mg de solide (Une unité libère 1 µmole de sucre réducteur mesuré en équivalents

xylose du xylane par minute à pH 4,5 à 30 °C).

III.1.2.3. Pectinase d’Aspergillus niger (EC 3.2.1.15)

La Pectinase utilisée dans ce travail, est une préparation d’enzymes pectolytiques

produite à partir d’une souche sélectionnée d’Aspergillus niger. Elle est commercialisée

par Sigma-Aldrich sous le code P4716 et est fournie dans une solution aqueuse de

glycérol (40%), avec une activité de 5 U/mg de protéine (Une unité libère 1,0 µmole

d'acide galacturonique d'acide polygalacturonique par minute à pH 4,0 à 25 °C).

III.1.2.4. Viscozyme L

Le Viscozyme, une marque déposée de Novozymes Corp, commercialisée par la

société Sigma-Aldrich sous le code V2010, est un complexe multi-enzyme produit par une

souche sélectionnée du champignon Aspergillus aculeatus, de densité 1,2 g/ml, contenant

une large gamme de carbohydrases, notamment l'arabanase, la cellulase, la β-glucanase,

l'hémicellulase et la xylanase. La préparation enzymatique est fournie sous forme de

liquide brun et est stable à 25 °C. A cette température, l'enzyme maintiendra son activité

déclarée pendant au moins 3 mois, alors qu’à la température de stockage recommandée

(2-8°C) l'enzyme maintiendra son activité déclarée pendant au moins un an. Son activité

déclarée est de 100 FBG/g et les conditions optimales avec ses activités multiples et

complexes sont une plage de pH de 3,3–5,5 et une température de 25–55 °C.

III.1.2.5. Laccase de Trametes versicolor (E.C. 1.10.3.2)

La laccase du champignon Trametes versicolor est commercialisée par la société

Sigma-Aldrich sous le code ou numéro 38429. La laccase se présente sous la forme d’une

poudre brunâtre et d’après la fiche technique, l’enzyme, présentant une masse molaire de

85 kDa, est stable dans les conditions recommandées de stockage (2- 8 °C) pendant 36

mois et possède une activité optimale à pH 5 et à 25°C. Cette préparation enzymatique

est fournie avec une activité de 0.50 U/mg (une unité enzymatique étant définie comme la

quantité d'enzyme qui convertit 1 µmole de catéchol par minute à pH 5,0 et à 25 °C).

74

III.1.3. Les produits chimiques

Les différents produits chimiques utilisés sont répertoriés dans les tableaux

suivants :

Tableau III.1. Les solvants utilisés

Désignation Fournisseur Numéro de catalogue

Dioxyde de carbone Praxair 1013 Buffer solution pH 4.0 Fluka 33665

Ethanol - P016AAN Chloroforme BDH BDH1109

Eau déionisée - Hydroxyde de potassium Merck 100778

Hydroxyde de sodium Sigma -Aldrich 72064 Acétate de sodium Fischer S220

Acétonitrile BDH BDH83639 Acétone Fischer A18P- 4 Méthanol Fischer A412P- 4

Tableau III.2. Les produits chimiques utilisés


Chlorite de sodium Sigma-Aldrich 244155 Acide acétique Anachemia 00598-466

Acide sulfurique Anachemia 88366-463 Benzène Sigma-Aldrich 319953

Bromure de potassium Fischer P227-25 Acide chlorhydrique Fischer SA48-1

Tableau III.3. Les substrats phénoliques utilisés

Désignation Fournisseur Numéro de catalogue Structure

Guaïacol Sigma G5502

Syringaldéhyde Aldrich S7602

Tableau III.4. Les sucres monomères utilisés comme standards


Galactose Fluka PHR1206 Xylose Sigma 95729

Mannose Sigma M8574 Glucose Sigma G-7528

75

Tableau III.5. Les sucres oligomères utilisés comme standards


Cellobiose Sigma C-7252 Maltotriose Sigma M-8378

Cellotetraose Sigma C8286 Cellopentaose Sigma C8792 Maltohexaose Sigma M9153

III.2. Méthodes

III.2.1. Préparation et conditionnement de la fibre de lin

Les tiges de lin présentant une humidité relative de 7,8% ont été broyées à l’aide

d’un broyeur à billes et tamisées pour obtenir des tailles de particules comprises entre

0,250 et 0,5 mm (Fig.III.1). Les échantillons ont été stockés dans des sacs en plastique à

la température ambiante jusqu'aux prochaines utilisations.

Figure III.1. Broyage et tamisage de la fibre

III.2.2. Prétraitement au CO2 supercritique

Valoriser la biomasse lignocellulosique, c’est avant tout fractionner d’une manière

séquentielle, sélective et contrôlée les entités polymériques. Cela exige donc un

appareillage adéquat, et des conditions telles que la composition chimique de ces entités

polymériques ne soit pas altérée par rapport à la composition initiale de la biomasse. Il

faudra donc éviter la dégradation thermique et une forte substitution de groupements

fonctionnels des entités chimiques de la biomasse.

76

L’équipement ou le dispositif utilisé dans cette étude, est un réacteur en acier

inoxydable d’un volume de 1 L, monté sur une pompe de pression pouvant fonctionner

jusqu’à 41.36 MPa, raccordé à une bombonne de CO2, et relié à un bain thermostatique

afin de permettre d’atteindre et maintenir les conditions supercritiques du solvant

(Fig.III.2). Les conditions supercritiques du CO2 étant une pression supérieure à 7.4 MPa

et une température supérieure à 31ºC.

Figure III.2. Dispositif du prétraitement au CO2 supercritique

Protocole du prétraitement

30 grammes de la biomasse initiale ont été déposée dans le réacteur en acier

inoxydable et hermétiquement fermé. La température du bain chauffant est ajustée pour

chauffer la double paroi de l’extracteur à la température désirée. L’alimentation en gaz est

ouverte, et le compresseur de pression est démarré lorsque la pression du gaz dans le

système est stabilisée. Lorsque la pression d’opération est atteinte, la stabiliser à l’aide

des régulateurs de pression. La réaction débute donc lorsque la pression d’opération

désirée est atteinte dans le réacteur, à ce moment, on peut arrêter le compresseur et

laisser se dérouler la réaction au temps voulu.

Les paramètres opératoires pour notre étude sont présentés dans le tableau III.6.

Nous avons varié la température, la pression et garder constant le temps de la réaction.

77

Tableau III.6. Paramètres opératoires du déroulement d'un procédé de prétraitement au CO2 supercritique.

Échantillons Pression (MPa) Température (°C) Temps(h)

ECH.1 20 70

1 ECH.2 37.7 70

ECH.3 37.7 80

Les échantillons prétraités, dénommés ECH.1,2,3, ont été séchés à 40 ° C dans

une étuve pendant 24 h avant d'être utilisés et analysés.

III.2.3. Extraction de fibre lignocellulosiques

L’extraction de fibres lignocellulosiques ayant les dimensions nanométriques a été

réalisée sur la fibre de lin brute, et sur la fibre de lin prétraitée au CO2 supercritique. Cette

extraction s’effectue en deux étapes : une hydrolyse enzymatique, suivi d’une étape de

précipitation à l’éthanol à partir du filtrat de l’hydrolyse afin de récupérer ces fragments de

fibres ayant les dimensions nanométriques.

III.2.3.1. Hydrolyse enzymatique

Dans un erlenmeyer de 250 mL, 10 % de la biomasse (p/v), cellulase (80 U/g),

endo-1-4-β-xylanase (60 U/g), pectinase (34 U/g) et Viscozyme (30U/g), ont été ajouté

dans une solution tampon buffer pH 4.0. On procède alors à une hydrolyse enzymatique

en mettant l’erlenmeyer dans un incubateur rotatif (shaker SI-300R). Les conditions

d’hydrolyses sont : T= 40 °C, pH= 4 ; vitesse d’agitation = 150 rpm et temps d’incubation =

24 heures. Ensuite l’erlenmeyer est placé rapidement dans un bain marie à 90°C pendant

15 minutes pour dénaturer les enzymes et inactiver ainsi la réaction d’hydrolyse. On

procède alors à une centrifugation à 10 000 rpm, 5 °C pendant 15 minutes. Le surnageant

(le filtrat) est conservé dans un congélateur à – 4°C pour les analyses futures

(quantification des monomères et oligomères) et le résidu solide est lavé avec de l’eau au

Soxhlet, puis séché pour une utilisation future.

Le protocole expérimental de l’hydrolyse enzymatique et le résumé des étapes

analytiques pour aboutir à la « conversion » de la biomasse pour un échantillon donné est

représenté par la figure III.3.

78

Figure III.3. Protocole de l'hydrolyse enzymatique et étapes analytiques pour déterminer la conversion

Calcul de la conversion

Pour bien comprendre la procédure de calcul, procédons à la démonstration d’un

exemple typique. Prenons l’échantillon de la fibre de lin brute, non traitée qui a subi

l’hydrolyse enzymatique :

79

− 10% P/V biomasse/tampon, soit 8.07 g de biomasse dans 80 ml de la

solution tampon ;

− 3,44 g d’enzymes sont introduits dans le milieu;

− Après hydrolyse et lavage, le volume total du filtrat récolté VT = 140 ml ;

− Les résidus solides de l’hydrolyse récoltés, Ms= 7,2 g avec une humidité

H2= 8,83 % ;

− A partir du filtrat, on prélève 5 ml (Vc) qu’on lyophilise, et récupère sa masse

du filtrat sec mc= 0.1506 g ;

− Tenant compte de la quantité d’enzyme introduite, la masse corrigée du

filtrat séché (Mc) est calculée par :

La conversion sera donc calculée par l’équation 1 :

(1)

III.2.3.2. Extraction de nanofibres lignocellulosiques

L’extraction et isolation proprement dite de nanofibres lignocellulosiques s’est fait à

partir du filtrat de l’hydrolyse enzymatique. Les nanofibres lignocellulosiques ont été

récupérées à partir d'hydrolysats de la fibre de lin brute et de la fibre prétraitée au CO2

supercritique, par précipitation à l'éthanol dans un rapport de 1 : 4 pendant 24 heures à 4

°C, après élimination des enzymes présentes dans la solution avec du chloroforme dans

un rapport de 1 : 8. Ensuite, la solution a été centrifugée à 10 000 tr / min, 5 °C pendant 15

min pour séparer le précipité de la partie liquide. Les différents précipités obtenus ont

ensuite été dissous dans de l'eau déionisée et soumis à une sonication à une amplitude

de 22% pendant 5 min pour une meilleure dispersion des fibres dans la solution. La

solution a ensuite été lyophilisée et les nanofibres lignocellulosiques ont été récupérées

sous forme de poudre.

viscozyme de 2mlpectinase de ml 0.32 xylanasede mg 480cellulase de mg 640

g 0.7758 3.440.1506)x5

140(m)mx

V

V(M enzymesc

c

Tc =−−=

80

III.2.4. Fonctionnalisation de fibres lignocellulosiques

Les nanofibres lignocellulosiques et les résidus de l’hydrolyse ont été

fonctionnalisés par le greffage du gaïacol et du syringaldéhyde sous la médiation de la

laccase. Ces expériences ont été effectuées dans un bécher ouvert sans limitation

d’oxygène afin de faciliter l’oxydation de ces composés phénoliques par la laccase en des

produits intermédiaires (radicaux libres) électrophiles et très réactifs, capables de réagir de

façon non-enzymatique avec la fibre lignocellulosique. Étant donné que les nanofibres

lignocellulosiques sont solubles dans le milieu réactionnel et que les résidus de l’hydrolyse

ne le sont pas, deux approches différentes ont été développées pour la fonctionnalisation :

la méthode homogène pour la fonctionnalisation des nanofibres lignocellulosiques et la

méthode hétérogène pour la fonctionnalisation des résidus de l’hydrolyse.

III.2.4.1. Fonctionnalisation de nanofibres lignocellulosiques par la méthode homogène

La méthode homogène a été réalisée en préparant d'abord séparément dans le

tampon pH 4.0, les solutions de nanofibres lignocellulosiques (1 % p/v) ; de composés

phénoliques (10 mM, 4% p/p de nanofibres), et de laccase (40 U/ g de nanofibres). Dans

un bécher ouvert, sans limitation d’oxygène, la solution de nanofibres a été chauffée à 40

°C et la solution phénolique a été ajoutée sous agitation constante (150 rpm) dans un

shaker SI-300R. 30 minutes après une distribution homogène, la solution de laccase a été

ajoutée lentement tout en agitant et laissée réagir pendant 24 h. La réaction a été ensuite

stoppé en menant le milieu réactionnel en ébullition dans un bain marie pendant 10 min,

puis centrifugé à 5 000 rpm pendant 5 min afin de séparer les particules adsorbées ou

n’ayant pas été solidement greffées. La solution surnageante a ensuite été coulée sur des

boîtes de Pétri de 7 cm de diamètre et séchée toute la nuit à 40 °C. Les films secs

obtenus ont été pelés soigneusement afin de récupérer les nanofibres fonctionnalisées qui

seront conservées dans un dessiccateur jusqu’à l’utilisation.

En parallèle, deux réactions témoins ont été effectués : sans ajout de laccase pour

évaluer la réactivité des composés phénoliques sur les nanofibres lignocellulosique en

voie chimique et sans ajout de nanofibres lignocellulosiques pour comparer la cinétique

enzymatique de l’oxydation ou de la consommation du gaïacol et du syringaldéhyde en

présence et en absence de nanofibres par chromatographie en phase gazeuse.

81

III.2.4.2. Fonctionnalisation de résidus de l’hydrolyse par la méthode hétérogène

La méthode hétérogène de fonctionnalisation des résidus catalysée par la laccase

se déroule dans un erlenmeyer de 250 mL, toujours ouvert et sans limitation d’oxygène,

où 200 mg de fibres lignocellulosiques à 1% de consistance dans la solution tampon pH

4.0, 4 % de gaïacol ou syringaldéhyde (p/p) et 40 U de la laccase/ g de la fibre sont

simultanément incubés dans un incubateur rotatif SI-300R, à 40 °C, 150 rpm et pendant 7

heures. La réaction a été ensuite stoppé en menant le milieu réactionnel en ébullition dans

un bain marie pendant 10 min, puis filtrée sous vide pour récupérer les fibres modifiées.

Ces fibres modifiées ont été ensuite soigneusement lavées avec de l'eau distillée, du

méthanol, éthanol et acétone pour éliminer toute trace de composés phénoliques

adsorbés par des liaisons électrostatiques ou n’ayant pas réagi. Enfin, ces fibres

biogreffées sont séchées à la température ambiante et conservées dans le dessiccateur

jusqu'à leur utilisation. La réaction témoin a également réalisée dans les conditions

identiques en l'absence de laccase.

III.2.4.3. Optimisation du biogreffage des composés phénoliques sur les résidus de l’hydrolyse.

Trois différents paramètres de la réaction, notamment la concentration en

composés phénoliques (2%, 5% et 6 %), la concentration en laccase (20, 30 et 50 U/g) et

le temps d'incubation (12 h et 24 h), ont été varié afin d’optimiser la fonctionnalisation de

résidus de l’hydrolyse. La quantification de cette fonctionnalisation a été déterminée par la

méthode de pesée et le pourcentage du biogreffage (Gp) a été calculé selon l’équation 2 :

𝐺𝑝 (%) =(W2−W1)

W1∗ 100 (2)

W2 représente le poids des fibres biogreffées et W1 est le poids final de

l'échantillon de contrôle (témoin).

III.2.5. Les méthodes analytiques

III.2.5.1. Les méthodes d’analyses chimiques

Afin de quantifier les différentes entités chimiques et polymériques présentes dans

la biomasse, les analyses histochimiques utilisées dans cette étude ont été réalisées sur

la fibre de lin brute et prétraitée au CO2 supercritique conformément aux normes TAPPI

82

(Technical Association of Pulp and Paper Institute) connues, basées sur la biomasse

sèche. Ces méthodes d’analyses histochimiques sont résumées dans le tableau III.7.

Tableau III.7. Méthodes d’analyses histochimiques utilisées

Entités chimiques Méthodes d'analyses

Extraits à l'alcool- benzène Extraction au soxhlet

Cendres Calcination

Lignines Méthode humide ①

Holocelluloses Méthode humide ②

α-celluloses Méthode humide ③

Hémicelluloses Différence entre ② et ③

① Hydrolyse primaire (acide sulfurique 24.1N) suivi d’une hydrolyse secondaire (acide

sulfurique 0.62N) de la biomasse;

② Traitement au chlorite de sodium catalysée par l'acide acétique;

③ Traitement de l’holocellulose à l'hydroxyde de sodium à 8,3% et 17,5% à 20 °C.

III.2.5.2. La diffraction rayon X

La diffraction rayon X est une technique largement utilisée pour caractériser la

structure cristalline de la biomasse lignocellulosique. Il est reconnu que divers traitements

affectent le taux de cristallinité des fibres lignocellulosiques. Afin de déterminer l’effet du

prétraitement au CO2 supercritique, de l’extraction de nanofibres lignocellulosiques et celui

du greffage des composés phénoliques sur la cristallinité de la fibre lignocellulosique, nous

avons opté pour la détermination de l’indice de cristallinité, par la méthode empirique de la

hauteur du pic développée par Segal et al. [278] en examinant les changements dans les

spectres après divers traitements.

Mode opératoire

Les motifs de diffraction des rayons X sur la poudre des échantillons ont été

obtenus à l’aide du diffractomètre monochromatique D-max-Ultima III Rigaku utilisant une

source de radiation Cu Kα (λ=0,15406 nm) à 40 kV et 44 mA. Les différentes phases

cristallines ont été identifiées par mesures de diffraction de rayons X aux grands angles.

Les motifs ont été recueillis à partir de 5° à 55° à une vitesse de 2° min-1. L’indice de

cristallinité (τ) a été calculé à partir du rapport de la hauteur de la valeur maximale du pic

I200, représentant l’intensité maximale du pic comprise entre 22° et 24° (2θ) et la hauteur

de la valeur minimale du pic I002, représentant l’intensité du pic amorphe mesurée à entre

18° et 19° (2θ), selon l’équation 3:

83

𝝉 =(I200−I002)

I200∗ 100 (3)

III.2.5.3. Microscopie électronique à balayage

La fibre de lin brute et prétraitée au CO2 supercritique, les nanofibres

lignocellulosiques extraites et fonctionnalisées, ainsi que les résidus de l’hydrolyse et les

résidus fonctionnalisés, ont été étudiées par microscopie électronique à balayage. Ils ont

tout d’abord été soumis à une fracture cryogénique (azote liquide), et recouverts d’un

alliage or-palladium puis étudié à l’aide du microscope électronique à balayage JEOL

model JSM-840A afin de capturer des microphotographies à différents grossissements, à

un voltage de 15 kV.

III.2.5.4. Microscopie électronique à transmission

La microstructure, la dimension et l'aspect de nanofibres lignocellulosiques

extraites ont été étudiés au moyen de la microscopie électronique à transmission. Cette

méthode permet de visualiser la taille, la forme et l’agencement des nanoparticules de la

fibre. Dès lors ces nanoparticules sont caractérisées par leur longueur et leur diamètre.

Mode opératoire

Les échantillons ont été observés avec une microscopie électronique à

transmission JEOL JEM-1230 utilisant une tension d'accélération de 80 kV. Les nanofibres

lignocellulosiques ont été mises en suspension dans du méthanol et traitées aux ultrasons

pendant 5 min. Une goutte de cette suspension a été déposée sur une grille recouverte de

carbone et colorée avec une solution à 2% en poids d'acétate d'uranyle pour obtenir une

coloration négative des échantillons et séchée à 60 °C pendant 20 min. Environ 10 images

ont été obtenues pour chaque matériau et les plus représentatives ont été sélectionnées.

Les dimensions des nanoparticules ont été déterminées à l'aide du logiciel ImageJ.

Plusieurs mesures ont été effectuées pour caractériser la longueur et le diamètre de

nanofibres.

III.2.5.5. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier est une puissante technique

qui révèle les changements que subissent les groupements fonctionnels présents dans les

polymères sous l’influence de vibrations. Ces analyses IRTF ont été effectuées sur la fibre

de lin brute, les fibres de lin ayant subi différents prétraitements au CO2 supercritique, les

84

nanofibres lignocellulosiques extraites et fonctionnalisées, et aussi sur les résidus solides

des fibres lignocellulosiques brutes et fonctionnalisés.

Mode opératoire

Un échantillon de la biomasse est mélangé, finement broyé et homogénéisé

ensemble avec le bromure de potassium (KBr) dans un ratio de 1/100 afin de préparer les

pastilles. Les spectres sont obtenus en utilisant le spectromètre Varian 100 FTIR, Scimitar

Series, dans l’air, à la température ambiante, 32 scannes et enregistrés à une longueur

d’onde comprise entre 4000 cm-1 et 400 cm-1.

III.2.5.6. La spectroscopie UV-visible

Les analyses UV/visible ont été réalisées sur les nanofibres fibres

lignocellulosiques extraites et fonctionnalisées avec les composés phénoliques (guaïacol

et syringaldéhyde). Ces analyses ont été effectuées afin de mettre en évidence le greffage

de composés phénoliques sur les nanofibres lignocellulosiques et de fournir des données

factuelles à l'appui d'observations expérimentales (changement de couleur notamment).

Mode opératoire

0,4 g de nanofibres lignocellulosiques (témoin) ainsi que de nanofibres

fonctionnalisées colorées par les produits d’oxydation laccasique des composés

phénoliques (Guaïacol et Syringaldéhyde) sont dissous dans 100 mL d’une solution

aqueuse acidifiée par HCl (pH = 2-3). Ces solutions sont maintenues sous légère agitation

et à température ambiante pendant 24 heures pour assurer une dissolution maximale. La

solution obtenue pour chaque essai est ensuite filtrée sur un filtre Whatman de 0,2 µm à

membrane en nylon, afin de garantir l'absence de particules solides. Un balayage de

spectre d'absorbance entre 190 et 1100 nm est alors effectué en utilisant un

spectrophotomètre UV-visible de marque HP UV-8453.

III.2.5.7. La chromatographie liquide à haute performance

Les analyses chromatographiques liquides à haute performance ont été réalisé sur

le filtrat de l’hydrolyse enzymatique de la fibre de lin brute et sur les filtrats de la fibre de lin

ayant subi différents prétraitements. Ces analyses ont été réalisées sur un appareil Dionex

ICS-2500, équipé d'une pompe à gradient GP50 et d'un détecteur électrochimique ED50

avec une cellule ampérométrique de type couche mince équipée d'électrodes en or et une

85

électrode de référence Ag / AgCl, relié à un ordinateur avec logiciel d’acquisition et de

traitement des chromatogrammes Chromeleon de Dionex. Ces analyses

chromatographiques ont été donc effectuées afin d’identifier et quantifier les quelques

monomères présents dans le filtrat, et aussi identifier quelques oligomères présents dans

le filtrat. Ces oligomères constituent les nanofibres extraites.

Analyse des monomères

La colonne utilisée pour l’analyse de monomères est une colonne Dionex

CarboPac SA10 de dimensions 250 mm x 4 mm et de granulométrie 6 μm dont la phase

apolaire est constituée de éthylvinylbenzène-divinylbenzene et une colonne de garde

CarboPac SA 10 (50 mm x 4 mm). La phase mobile était une solution de KOH 1 mM

s'écoulant à un débit de 1,3 ml / min. Le galactose, xylose, glucose et mannose ont été

utilisés comme sucres standards.

Analyse des oligomères

La colonne utilisée pour l’analyse des oligomères est une colonne Dionex

Carbopac PA1 de dimensions 250 mm x 4 mm et de granulométrie 10 μm dont la phase

apolaire est constituée de polystyrène réticulé à 2% avec du divinylbenzène. La phase

mobile comporte 3 éluents : l’éluent A : 0.15 M d’hydroxyde de sodium ; l’éluent B : 0.5M

d’acétate de sodium et l’éluent C : l’eau milli Q. La méthode d’élution comporte un gradient

de A, B et C avec un débit de 1 ml / min; le volume d’injection est de 25 μL. Le cellobiose,

le maltotriose, le cellotetraose, le cellopentaose et le maltohexaose ont été utilisés comme

oligosaccharides standards. Les gradients d’élution sont précisés dans le Tableau III.8.

Tableau III.8. Gradients d’élution pour les analyses HPLC d’oligomères

Temps (min) Eluent A (%) Eluent B (%) Eluent C (%)

0.00 65 0 35 3.00 65 2 33 7.00 65 5 30

12.00 65 15 20 30.00 65 15 20

III.2.5.8. La chromatographie en phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse a été réalisée afin de suivre la cinétique de

réaction de la consommation des composés phénoliques (gaïacol et syringaldéhyde) lors

de fonctionnalisation des nanofibres lignocellulosiques extraites. Les analyses ont été

86

effectuées sur un appareil de marque HP 6890, équipé d’un FID et d’une colonne

capillaire HP-5 de dimension 30 m x 0,25 mm et de granulométrie 0,25 µm dont la phase

apolaire est constituée 5% de phénylméthyl siloxane, relié à un ordinateur avec logiciel

d’acquisition et de traitement des chromatogrammes Chromeleon de Dionex. Le gaz

vecteur était de l'hélium à un débit de 1 mL / min.

Mode opératoire

Chaque 20 minutes, des échantillons de 0,1 ml ont été prélevés dans le mélange

réactionnel et 1,5 mL d'acétonitrile ont été immédiatement ajoutés pour arrêter la réaction,

et les échantillons sont filtrés avec soin avant d’être analysés à l'aide de membranes

Ministar-CR (Cellulose régénérée) (Sartorius, 0,2μm de porosité). Le système d’injections

automatique de l’appareil prélevait 1 µl à une température d’injection de 200 °C. La

température du détecteur réglée à 250 °C et le programme de température utilisé était le

suivant: température initiale du four à 80 °C augmentant de 4 °C / min jusqu'à 140 °C,

stable à 140 °C pendant 2 min, puis à 4 °C / min jusqu'à 310 °C et maintenue constante

jusqu'à la fin du programme. Le temps total d'exécution était de 57 min.

III.2.5.9. Les analyses thermogravimétriques

Dans le but de déterminer les limites supérieures de température auxquelles les

matières premières peuvent être soumises sans préjudice majeur, des analyses

thermogravimétriques (ATG) ont été diligentées. La dégradation des entités présentes

dans les nanofibres lignocellulosiques extraites et fonctionnalisées, ainsi que des résidus

solides de l’hydrolyse et fonctionnalisés en fonction de la température a été étudiée par

TGA et DTG. L’appareil utilisé est un TGA/DTA 851e Metler Toledo.

Mode opératoire

Dans un creuset, 7 mg de produit ont été pesés le plus précisément possible. Le

diazote a été utilisé comme gaz inerte pour la chambre de la TGA avec un flux de 50 mL /

min et l’air a été utilisé comme gaz oxydant avec un flux de 50 mL / min. La température,

initiale de 25°C, a augmenté jusqu’à 700°C avec une vitesse de 10°C/min. Deux

répétitions ont été effectuées pour chaque échantillon. Par la suite, la courbe TGA

obtenue est traitée par dérivation pour obtenir la courbe DTG décrivant la vitesse de

décomposition des entités polymériques en fonction de la température.

87

III.2.5.10. Mesure de l’angle de contact

La mesure de l’angle de contact est une analyse qui nous a permis d’évaluer les

propriétés hydrophobiques conférées aux nanofibres lignocellulosiques et aux résidus

solides de l’hydrolyse à la suite de la fonctionnalisation de ces derniers par le greffage du

gaïacol et syringaldéhyde. L’équipement utilisé pour réaliser cette analyse est un

goniomètre FTA200 de First Ten Angstrom. Le système comprend une plate-forme de

mesure, une caméra haute résolution et une carte d’acquisition d’images intégrée dans un

ordinateur, une pompe à seringue et un système d’éclairage contrôlé par ordinateur. Des

logiciels optimisés permettent d’enregistrer des vidéos avec une capture allant de 60

images par seconde à plusieurs heures. C’est un système vidéo permettant de faire des

mesures d’angle de contact, de tension interfaciale et de surface, de mouillabilité et

d’absorption.

Mode opératoire

Les échantillons ont tout d’abord été préparés sous forme des pastilles et

conditionnés dans un dessiccateur afin de maintenir un taux d’humidité équilibré. A l’aide

de la pompe à seringue commandée par ordinateur, une goutte d’eau de 4 µL est déposée

à la surface de la pastille et instantanément la caméra enregistre les images en raison de

60 images par seconde. A chaque seconde le logiciel calcul l’angle de contact de la goutte

d’eau déposée à la surface de la pastille. Ainsi il est possible de suivre la mouillabilité de

l’échantillon jusqu’à l’absorption totale de la goutte d’eau.

88

Chapitre IV

IV. Flax nanofibrils production via supercritical carbon dioxide pretreatment and enzymatic hydrolysis

IV.1. Resumé

Les fibres de lin sont des déchets agro-industriels disponibles en grande quantité dans

plusieurs pays du monde. Cette ressource mérite donc d’être mieux et correctement

valorisée. Le but de ce travail était d’extraire les fibres lignocellulosiques de lin ayant les

dimensions nanométriques utilisant un procédé écologique basé sur une combinaison de

prétraitement au dioxyde de carbone supercritique et d'hydrolyse enzymatique. À cet

égard, les fibres de lin brutes ont été soumises à un traitement préalable au CO2

supercritique à diverses températures (70 et 80 °C) et pressions (20 et 37,7 MPa) pendant

60 min. L'hydrolyse enzymatique a été réalisée à 40 °C pendant 24 heures dans un

tampon pH 4.0. La cellulase, la xylanase, la pectinase et le viscozyme ont été utilisés

comme enzymes hydrolytiques. Les fibres de lin brutes telles que reçues, les fibres de lin

prétraitées au CO2 supercritiques et les fibres lignocellulosiques extraites ont été

caractérisées par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, diffraction des

rayons X, microscopie électronique à balayage (MEB) et microscopie électronique à

transmission (MET). Il a été démontré que l’effet du prétraitement des fibres de lin au CO2

supercritique était double. Il a permis de désorganiser la biomasse sans en modifier la

composition chimique et d'accroître l'accès aux enzymes pour extraire les fibres ayant les

dimensions nanométriques. Les analyses spectroscopiques infrarouge n'ont montré aucun

changement dans les groupes fonctionnels après différents prétraitements au CO2

supercritique. La caractérisation par diffraction aux rayons X a révélé que la cristallinité

augmentait avec le prétraitement au CO2 supercritique et l'extraction des fibres ayant les

dimensions nanométriques. Les images de la MEB montrent les dommages physiques

(trous, fissures et érosions) à la surface des fibres de lin prétraitées. La MET a mis en

évidence la production de nano/micro fibrilles et d’agrégats dépendamment des conditions

de prétraitement.

Mots clés : Nanofibres lignocellulosiques, fibre de lin, explosion au CO2 supercritique, hydrolyse enzymatique.

89

IV.2. Abstract

Flax fibres are an agro-industrial waste available in large quantities in several countries

around the world. This resource deserves to be better and properly used. The goal of this

work was to extract lignocellulosic nanosized flax fibres using an environmentally friendly

process based on a combination of supercritical carbon dioxide (SC-CO2) pretreatment

and enzymatic hydrolysis.

In this connection, raw flax fibres (RFF) were submitted to SC-CO2 pretreatment at various

temperatures (i.e. 70 and 80 °C) and pressures (i.e. 20 and 37.7 MPa) for 60 min. The

enzymatic hydrolysis was performed at 40 °C for 24 hours in pH 4.0 buffer. Cellulase,

xylanase, pectinase and viscozyme were used as hydrolytic enzymes. The as-received

raw flax fibres, SC-CO2 pretreated flax fibres and extracted lignocellulosic nanofibrils

(LCNF) were characterized by Fourier Transformed Infrared spectroscopy (FTIR), X-ray

diffraction (XRD), Scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron

microscopy (TEM). It was shown that the effect of SC-CO2 pretreatment of flax fibres was

twofold. It helped to disorganize biomass without changing its chemical composition and

increased access to enzymes to extract LCNF. FTIR analysis showed no changes in

functional groups after SC-CO2 pretreatment. XRD characterization revealed that the

crystallinity increased with SC-CO2 pretreatment and LCNF extraction. SEM images

showed holes, cracks and erosion on the surface of the SC-CO2 pretreated flax fibres (SC-

CO2-PFF). TEM evidenced the production of nano/micro-sized fibril and fibril aggregates.

Keywords: Lignocellulosic nanofibrils, Flax fibers, Supercritical CO2 explosion, Enzymatic hydrolysis

IV.3. Introduction

Due to environmental concerns, biopolymers derived from renewable resources are

regarded as potential replacements for non-biodegradable and non-renewable petroleum-

based polymers. Unfortunately, those biopolymers exhibit generally lower performances as

compared to synthetic polymers and, consequently, must be reinforced. Natural fibres (e.g.

flax, hemp, cotton, sisal etc.) and their derivatives (e.g. cellulose, lignin etc.) prove to be

effective for biopolymers reinforcement, while preserving their biodegradability.

Lignocellulosic waste materials obtained from agricultural activities, energy crops and

wood industries represent the most abundant global source of renewable biomass [279].

Depending on the extraction method and surface treatment, cellulose micro- and nano-

90

fibrils as well as cellulose nanocrystals with various properties, such as surface area,

strength, modulus or optical properties, can be derived from raw natural fibres and used as

reinforcing fibres or particles for biopolymers.

Canada is the world's largest producer of flax seeds but as far as fibre is

considered, the picture is quite different. Canada does not even appear on the list of

producers of flax fibres according to the Food and Agriculture Organization of the United

Nations [38]. This apparently incredible situation, given the huge volume of linseed

production in Canada, may be attributed to climatic factors. Therefore, these flax stems

constitute tremendous agriculture waste containing fibres that can be used for other

applications and particularly as reinforcement fibres for composite materials.

Flax fibres are mainly composed of cellulose, hemicelluloses, lignin, pectin and

waxes, as most lignocellulosic biomasses. However, the botanic origin and geographical

location for cultivation, as well as primary processing, may affect significantly the relative

amount of each constituent. Thus, α-cellulose varies from 64.1 to 76%, hemicellulose from

11–20.6%, lignin from 2–5%, pectin from 1.8–2.3%, and some fats and waxes [36]. Flax

fibre is therefore a heterogeneous and highly variable material, containing different

macromolecules intimately bonded in a three-dimensional mesh forming its

supramolecular structure. The different components of these lignocellulosic materials form

a strong structure refractory towards any extraction operation. A suitable pretreatment

method is required to overcome this recalcitrance. Therefore, an appropriate pretreatment

should not only improve greatly the digestibility of lignocellulosic materials but also

facilitate the recovery of lignin and hemicellulose.

For decades, various pretreatment processes have been developed to improve the

digestibility of lignocellulosic biomass. Each pretreatment process has a different

specificity on altering the physical and chemical structure of lignocellulosic materials.

These various pretreatment processes can be broadly categorized into:

− Physical, such as mechanical process and irradiations [73, 280], which aim

to increasing the accessible surface area of lignocellulosic materials by

reducing particle size or disrupting their structural regularity;

− Chemical, such as alkaline, dilute acid, oxidative delignification, organo-

solvent and ionic liquids pretreatments [92, 281-284] to partially solubilize

91

hemicelluloses or/and lignin and improve the accessibility to the extraction

of cellulosic fibres;

− Physico-chemical, such as steam explosion [285], hydrothermal

pretreatments [115], ammonia and supercritical CO2 explosion

pretreatments [127, 286]. During these pretreatment, hemicelluloses and

lignin are partially decomposed and solubilized and therefore removed from

lignocellulosic materials. Also, the explosive release of pressure occurring

in the steam, ammonia as well as supercritical CO2 explosion, results in an

increase in the pore volume and the accessible surface area of the

lignocellulosic materials;

− Biological processes using microorganisms or enzymes [287, 288] to

degrade lignin or glycosidic linkages in cellulose and hemicelluloses

resulting in a release of sugars monomer;

− Different combinations of processes mentioned above, such as

hydrothermal pretreatment combined with acid pretreatment [289] to

maximize or improve digestibility of lignocellulosic biomasses.

Nevertheless, scrutiny of the open literature leads to the conclusion that an

economically and environmentally sustainable pretreatment process has not yet been

established. The ideal would be a pretreatment capable of combining the advantages of all

these pre-treatments mentioned while minimizing their disadvantages and reducing their

cost.

Regarding extraction, different mechanical treatments such as homogenization and

grinding were developed to generate LCNF or microfibrillated cellulose (MFC) [164, 290,

291]. Moreover, chemical hydrolytic treatment using sulfuric or hydrochloric acid resulted

in nanoparticles called cellulose nanocrystals (CNC) or whiskers [292, 293].

Conventional mechanical treatments can be considered an effective approach

because of their high efficiency and simplicity. They do not generally require organic

solvents. For a long time, the main obstacle to the commercial success of these

conventional mechanical treatment processes is the high energy consumption, which

could reach 70 MWh /ton [276]. Another disadvantage of homogenization, mainly with

microfluidization, is the clogging of the system when using long fibres [277]. Sulfuric and

hydrochloric acid hydrolysis processes, since they were discovered by Ranby [168, 294],

92

remain the methods of choice to produce cellulose nanocrystals because of the stability of

resultant suspensions, their efficiency and yields. However, they necessitate chemicals

disposal and recovery operations similarly to the majority of chemical processes.

It is worth to mention that although the use of enzymes represents a judicious

strategy for lignocellulosic nanofibrils or nanocellulose extraction, only limited reports have

been published on this topic [3, 295]. Moreover, all the reported works focused mainly on

enzymatic hydrolysis combined with conventional mechanical pretreatment or acid

hydrolysis to produce cellulose nanocrystals, lignocellulose nanofibrils or microfibrillated

cellulose. For instance, Hassan et al. [6] isolated microfibrillated cellulose from alkali

pretreated date palm fruit stalks by xylanase enzymes hydrolysis combined with a

repeated high-shear ultrafine friction grinding. Similarly, Tibolla et al. [5] isolated cellulose

nanofibres from alkali pretreated banana peel using xylanase enzymes. The dried peels

were previously milled in a knife mill and sieved through a 200-mesh (74 µm) sieve, which

afforded microparticles. More recently, Hu at al.[7] isolated cellulose nanofibrils from

sulfuric acid pretreated hardwood Kraft pulp by the synergistic actions of an

endoglucanase, lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO) and xylanase. The

bleached or delignified kraft pulp was previously disintegrated by a lab blender for 20 min

before enzymatic hydrolysis.

Besides, carbon dioxide (CO2) is an important solvent for commercial and industrial

extraction, with many advantages, such as low cost, non-toxicity, easy recovery and low

environmental impact. Under supercritical conditions, CO2 has the diffusion capacity of a

gas and the viscosity of a liquid. With a sudden pressure release, CO2 increases the pore

volume and the accessible surface area of the lignocellulosic materials submitted to

supercritical CO2 conditions.

To the authors’ knowledge, no study has been performed on the use of hydrolytic

enzymes or enzymes cocktail to extract LCNF, MFC or CNC materials from any raw

natural fibres without involving a step of conventional mechanical treatment or acid

hydrolysis.

The present work is devoted to the production of lignocellulosic nanofibres (LCNF)

from Canadian agricultural flax stem fibres waste via supercritical CO2 pretreatment

93

followed by enzymatic hydrolysis using a hydrolytic enzymes cocktail. The effects the

pretreatment on the composition and enzymatic hydrolysis of flax fibres were investigated.

IV.4. Materials and methods

IV.4.1. Materials

The flax stem fibres derived from agricultural flax waste and provided by Biolin

Research Inc (Saskatoon, Saskatchewan, Canada), were used as a source of

lignocellulosic material. These flax stem fibres with a relative humidity of 7.8%, were

ground using a ball mill and sieved to achieve particle sizes ranging from 0.250 to 0.5 mm.

Samples denoted herein RFF were stored in plastic bags at room temperature until further

use. All the monosaccharides (galactose, xylose, glucose and mannose) and oligomer

saccharides (cellobiose, maltotriose, cellotetraose, cellopentaose and maltohexaose) used

as standards were of analytical reagent grade and purchased from Sigma-Aldrich. All the

aqueous solutions and HPLC eluents were prepared using milli-Q water.

Industrial grade gas cylinder of CO2 was purchased from Praxair Canada Inc

(Mississauga, Ontario, Canada).

All the enzymes used in this work were purchased from Sigma-Aldrich and used as

received, without any modification. These enzymes are described as follows:

− Cellulase enzyme (EC No. 232-734-4) from Trichoderma reesei catalyzes

the breakdown of cellulose into glucose, cellobiose, and higher glucose

polymers;

− Endo-1-4-β-xylanase enzyme (EC No. 232-800-2) from Trichoderma

longibrachiatum has an activity of 1 U/mg solid. One unit will liberate 1

μmole of reducing sugar measured as xylose equivalents from xylan (Cat.

No. X0627) per min at pH 4.5 at 30 °C;

− Pectinase enzyme (EC No. 232-885-6) from Aspergillus niger has an

activity of 5 U/mg protein. One unit will liberate 1.0 μmole of galacturonic

acid from polygalacturonic acid per min at pH 4.0 at 25 °C;

− Viscozyme® L, multi-enzyme complex containing a wide range of

carbohydrases, including arabanase, cellulase, β-glucanase, hemicellulase,

and xylanase, has an activity of 100 FBGU/G.

94

IV.4.2. Supercritical CO2 pretreatment

The supercritical CO2 pretreatment was conducted in a 1-liter stainless-steel high-

pressure autoclave mounted on a pressure pump capable of operating up to 41.36 MPa,

connected to a CO2 cylinder and a thermostated bath to achieve and maintain the CO2

supercritical conditions (P > 7.4 MPa and T >31ºC). In a typical run, 30 grams of biomass

(moisture content predetermined, 7.8%) were placed in the stainless-steel reactor,

hermetically sealed and fed with CO2. The temperature of the thermostated bath was

adjusted to heat up the reactor to the desired temperature via a heating jacket. Then, the

liquid CO2 was pressurized by a motorized pump until the desired pressure. The sample

was therefore exposed to supercritical CO2 for a preset time. At the end of each test, a

quick pressure release was performed by opening a valve attached to the reactor thus

bringing the pressure levels to atmospheric conditions.

In the present investigation, all the pretreatment tests lasted 1 hour and were

carried out at various temperatures (70 and 80 °C) and pressures (20 and 37.7 MPa),

according to previously reported investigations [296, 297].

The pretreated samples, denoted SC-CO2-PFF (A: 70 °C and 20 MPa; B: 70 °C

and 37.7 MPa; C: 80 °C and 37.7 MPa), were dried at 40 °C in an oven for 24 h before

their further use and analysis.

IV.4.3. Lignocellulosic nanofibrils production

IV.4.3.1. Enzymatic hydrolysis and extraction of lignocellulosic nanofibrils

Raw and SC-CO2-PFF samples were hydrolyzed using Cellulase (80 U/g of

biomass), Endo-1-4-β-xylanase (60 U/g biomass), Pectinase (34 U/g biomass), and

Viscozyme® L (30 U/g biomass). Hydrolysis tests were conducted in 250 mL Erlenmeyer

flasks using buffer solutions (10 % (W/V)) at pH 4. The tests were carried out in a

temperature controlled incubating shaker SI300R, at 40 °C and 150 rpm during 24 h. After

enzymatic hydrolysis, the hydrolysates were placed in a water bath at 90 °C for 15 min to

denature the enzymes and stop the reaction. The hydrolysates were then centrifuged at 5

°C, 10 000 rpm, for 15 min in an Eppendorf 5804R centrifuge and the supernatants were

frozen at -4 °C for further analysis (quantification of monomers and oligomers by HPLC).

95

Lignocellulosic nanofibrils were recovered from hydrolysates of RFF and SC-CO2-

PFF materials by ethanol precipitation in a ratio of 1:4, for 24 hours at 4 °C, after removal

of the enzymes present in the solution with chloroform with a ratio of 1:8. Then, the

solution was centrifuged at 10 000 rpm, 5 °C for 15 min to separate the precipitate. The

different obtained precipitates were then dissolved in deionized water and sonicated at

22% amplitude for 5 min for better dispersion of the fibres in the solution. The solution was

then freeze-dried and lignocellulosic nanofibres were recovered in powder form.

The experimental protocol of enzymatic hydrolysis and analytical steps to result in

the lignocellulosic nanofibrils for a given sample are shown in Figure IV.1.

Figure IV.1. Experimental protocol of enzymatic hydrolysis and analytical steps to result in the extraction of lignocellulosic nanofibrils

96

IV.4.3.2. HPLC analysis

For the analysis and quantification of sugar monomers and oligomers, an HPLC

system from Dionex (ICS-2500) equipped with a gradient pump GP50 and an

electrochemical detector ED50 with a thin-layer type amperometric cell outfitted with gold

electrodes and an Ag/AgCl reference electrode was used. The data processing was

carried out by Chromeleon software from Dionex. For the analysis and quantification of

monomers, a CarboPac SA 10 column (250 mm x 4 mm i.d.) and a CarboPac SA 10 guard

column (50 mm x 4 mm i.d.) were used. The mobile phase was a solution of KOH 1 mM

flowing at a rate of 1.3 ml/min. The detector was operated in the integrated amperometric

mode.

Oligomers analysis and quantification were carried out using a CarboPac PA 1

column (250 mm x 4 mm i.d) and CarboPac PA 1 (50 mm x 4 mm i.d.) guard column. The

separation of oligosaccharides required the use of an eluent based on sodium hydroxide

and sodium acetate diluted in milli-Q water flowing at a rate of 1 mL/min. A gradient

controller was used to adjust the required eluent gradient to quickly detect, clean, and

reactivate the electrode surface.

IV.4.4. Fibres characterization

IV.4.4.1. Chemical composition

The chemical composition of raw and SC-CO2 pretreated flax fibres was

determined according to the Technical Association of Pulp and Paper Institute’s (TAPPI)

standards, based on dry biomass. First, the ash content was determined by calculating the

weight difference between the initial dried and calcined stem fibres for 6h at 575 °C [298].

Then, the holocellulose (α-cellulose + hemicellulose) content was estimated by sodium

chlorite acid attack of lignin catalyzed by acetic acid to form soluble products.

Subsequently, the α-cellulose content was determined by treating the holocellulose with

sodium hydroxide solutions of 8.3% and 17.5% at 20 °C [299]. The hemicellulose content

was obtained by substracting weight content of the α-cellulose from the holocellulose

content. Acid insoluble lignin content was assessed gravimetrically as Klason lignin by

total hydrolysis of the biomass. This requires primary hydrolysis with a strong mineral acid

(24.1N sulfuric acid) which results in a mixture of oligosaccharides. Subsequently,

secondary hydrolysis in a dilute acidic solution (0.62N) was carried out to complete the

97

conversion to monosaccharides [300]. As for extractives determination, samples were

extracted with ethanol-benzene (1:2) in a Soxhlet extractor [301].

IV.4.4.2. Structural characterization

Each RFF, SC-CO2-PFF and extracted fibres samples was mixed and ground with

KBr in a weight ratio of 1/100 to prepare the pellets. The spectra were obtained using

Varian 100 FTIR spectrometer, Scimitar series, and recorded at wavelengths between

4000 cm-1 and 400 cm-1 and an accumulation of 32 scans in air at room temperature.

The surface morphology of RFF, SC-CO2-PFF and LCNF was analyzed by

Scanning Electron Microscopy (SEM) using a JEOL JSM-84OA electron microscope. The

samples were previously prepared by sputter coatings with platinum to obtain conductive

surface. SEM images were recorded at 15 kV and magnified 1000 times.

The microstructure and sizing of extracted fibres were investigated by

Transmission Electron Microscopy (TEM). The images were acquired on a JEOL JEM-

1230 electron microscope, at an accelerating voltage of 80 kV. Lignocellulosic fibres were

suspended in methanol and treated under ultrasound for 5 min. Then, a drop of the

suspension was placed uniformly on a carbon microgrid and dried at 60 °C for 20 min

before analysis.

X-ray diffraction data of RFF, SC-CO2-PFF and extracted fibres samples were

collected on a Rigaku D-Max-Ultima III diffractometer using nickel-filtered Cu-Kα radiation

of wavelength 1.5406 Å with a voltage of 40 kV and a current of 44 mA. Powder diffraction

patterns were obtained between 5 and 55º with a scan speed of 2 degree/min. The

crystallinity index was calculated based on the method proposed by Segal et al [278]

according to equation 2:

𝜏 =𝐼200 − 𝐼002

𝐼002∗ 100 (1)

Where τ represents the crystallinity index (%), I200 the maximum intensity of the peak

between 22° and 23° (2θ) and I002, the minimum intensity of the amorphous peak

measured between 18° and 19° (2θ).

98

IV.5. Results and discussion

IV.5.1. Lignocellulosic nanofibrils production

IV.5.1.1. Enzymatic hydrolysis

Enzymatic hydrolysis was performed on the raw and SC-CO2 pretreated flax fibres

to investigate the effect of the pretreatment on hydrolysis. The total dissolved solid

amounts released from the fibres to the aqueous phase upon enzymatic hydrolysis

measured on the basis of dry filtrate after freeze-drying were 5.5 ± 0.7 gL-1 for RFF, and

10.3 ± 0.6, 11.9 ± 0.9 and 14.4 ± 1.1 gL-1 for SC-CO2-PFF-A, -B and – C, respectively.

Accordingly, conversions based on the weight loss due to enzymatic hydrolysis, were

evaluated according to Belkacemi [302] and were found to be 10.6 % for RFF and, 23, 25

and 28% for SC-CO2-PFF-A, -B and –C, respectively. Clearly, the more severe are the

SC-CO2 pretreatment conditions, the higher are the obtained enzymatic hydrolysis

conversions.

Furthermore, the analysis of monomers allowed identifying and quantifying the

simple sugars content in the filtrate (i.e. galactose, glucose, xylose, and mannose). The

quantification of these monomers is summarized in Table IV.1. As seen, glucose was the

most abundant monosaccharide produced via enzymatic hydrolysis for RFF and SC-CO2

pretreated materials. The total sugar content in the filtered hydrolysates was 4.2 g / L for

untreated (RFF) and, 8.6, 6.8 and 6.5 g /L for SC-CO2-PFF-A, -B and –C, respectively.

Besides, the monomer sugar yields were 8.04 % for untreated (RFF), and 16.08, 14.29

and 13.65 % for SC-CO2-PFF -A, -B and –C, correspondingly. These findings are in

agreement with most of the previously reported investigations [132, 297]. For instance,

Kim and Hong [303] reported a significant increase in glucose yield as a result of SC-CO2

pretreatment of two varieties of pine wood. This behavior is attributed to the ability of

supercritical CO2 to soak and facilitate penetration of CO2 molecules into the inner

structures of the biomass, while its quick release facilitates the disruption of cellulose

structure. Therefore, more glucose is produced from the flax fibres after SC-CO2

pretreatment as compared to the fibres without pretreatment [304, 305]. Also, supercritical

CO2 contributed to extract various carbohydrates as well as lignin from the flax fibres

which elucidates the higher total dissolved solids concentration (10.3, 11.9 and 14.4 g / L)

obtained with the SC-CO2 pre-treated fibres in comparison to raw fibres (5.5 g / L).

99

Table IV.1. Quantification of sugar present in the filtrate

Monomers (g/L)

Samples

RFF SC-CO2-PFF

A B C

Galactose 0.36 0.50 0.38 0.39 Glucose 2.58 4.48 3.70 3.61 Xylose 0.52 2.29 1.77 1.47

Mannose 0.75 1.29 0.95 0.99

Total 4.21 8.56 6.81 6.47

IV.5.1.2. Extraction of lignocellulosic nanofibrils

After SC-CO2 pretreatment, flax fibres were enzymatically hydrolyzed, and the obtained

hydrolysates were precipitated with ethanol (1:4) to produce nanoscaled lignocellulosic

flaps fibres as reported in “enzymatic hydrolysis and extraction of lignocellulosic

nanofibrils” section (IV.1.3.1). These flaps consisted of oligomers with different degrees of

polymerization as confirmed by HPLC analysis (See Figure IV.2). Precipitated products

from RFF hydrolysate exhibited only a degree of polymerization (DP) of 2, while the

precipitated products from SC-CO2-PFF hydrolysate exhibited DP values ranging from 2 to

5 and small size oligomers with DP value higher than 5. Besides, the amounts of

lignocellulosic flaps fibres recovered by freeze drying corresponded to 0.94 g / L for RFF,

and 1.1 g / L, 2.82 and 3.02 g / L for SC-CO2-PFF -A, -B and – C, respectively.

Figure IV.2. HPLC chromatograms of the precipitated hydrolysates: (a) Raw flax fibres and (b), SC-CO2 PFF-A (c) SC-CO2-PFF-B and (d) SC-CO2-PFF-C: Peaks 1 = Glucose; 2 =

Cellobiose (DP 2); 3 = Maltotriose (DP 3); 4 = Cellotetraose (DP 4) and 5 = Cellopentaose (DP 5).

100

IV.5.2. Characterization

IV.5.2.1. Chemical composition of raw and SC-CO2 pretreated flax fibers

The chemical composition of RFF and SC-CO2-PFF materials is given in Table

IV.2. As expected, raw flax fibres are mainly composed of cellulose (~ 64%), hemicellulose

(~ 15%) and lignin (~ 2%) in agreement with the data reported by Deyholos [306] and

Mondragon et al [307]. As evidenced, the chemical composition of SC-CO2 pretreated flax

fibres did not differ much from that of the untreated analogues. This is attributed to the fact

that SC-CO2 pretreatment is of physico-chemical nature resulting solely in a physical effect

due to explosive release of CO2. These results showed that SC-CO2 pretreatment

approach deconstructs flax fibres without modifying quantitatively or qualitatively their

chemical composition. However, depending on moisture content, Serna et al. [308]

reported that SC-CO2 pretreatment can lead to delignification effect and thus can modify

the chemical composition of biomass attributed to the acid hydrolysis induced by the

dissolution of CO2 in the aqueous phase leading to the formation of carbonic acid.

Table IV.2. Chemical composition of raw and SC-CO2 pretreated flax fibers

Weight content (%)

RFF SC-CO2-PFF Deyholos

[306] Mondragon et al.

[307] A B C

Moisture 7.8 4.39 4.93 4.85 5.6 ± 0.1 Holocellulose 79.0 78.7 78.6 78.6 - 85.1 ± 0.8

Cellulose 63.7 63.3 64.0 64.0 64 66.3 ± 3.5 Hemicellulose 15.4 15.4 14.7 14.7 15 18.8 ± 2.7

Lignin 2.1 2.0 2.1 2.0 2 2.2 ± 0.1 Ashes 3.2 3.1 3.2 3.2 - 0.8 ± 0.1

Extractives 3.0 2.9 3.0 2.9 - 2.6 ± 0.2

IV.5.2.2. Morphological characterization

The TEM images of fibre fragments obtained from RFF and SC-CO2-PFF are

reported in Figure IV.3. These images clearly showed that, from untreated biomass (RFF),

we obtained lignocellulosic aggregates (LCA) and the fibril structures were difficult to

observe (Fig.IV.3a). Besides, lignocellulosic microfibrils (LCMF) were obtained from the

SC-CO2-PFF-A (Fig.IV.3b), whereas lignocellulosic filament-shaped nanofibrils (LCNF1

and LCNF2) with a length of several micrometers and a width of 5-10 nm were

successfully extracted from SC-CO2-PFF-B and SC-CO2-PFF-C (Figure IV.3c-d).

101

Therefore, the SC-CO2 pretreatment of lignocellulosic biomass is demonstrated to

have a significant effect in the process of preparation of lignocellulosic nanofibres and to

have a great influence on the size of the resultant lignocellulosic fibres.

Figure IV.3. TEM images of lignocellulosic fragment fibers: (a) aggregates from RFF; (b) microfibrils from SC-CO2-PFF-A and nanofibrils from (c) SC-CO2-PFF-B (c) and (d) SC-

CO2-PFF-C.

Scanning electron microscope (SEM) was used to compare morphological changes

in flax fibres after SC-CO2 pretreatment. Figure IV.4 shows SEM images of RFF (Figure

IV.4a) and SC-CO2-PFF-A, -B and -C (Figure IV.4b, c and d). Before SC-CO2

pretreatment, the raw flax fibres surface was smooth, tight and contiguous, whereas after

pretreatment it showed extensive induced porosity and lamellar structure. Also, fibres

became relatively fluffy. Indeed, the SC-CO2 pretreatment exposed some internal areas in

102

the biomass as compared with untreated sample. Similar observations were previously

reported by Narayanaswamy et al. [286]. Moreover, holes, cracks and erosions could be

observed on the surface of SC-CO2 pretreated flax fibres, attributed to the breakdown of

the flax fibre structure during the rapid explosive release of CO2. Thus, SC-CO2

pretreatment proved to be effective in causing physical damages on the surface of flax

fibres as reported earlier for different biomasses exposed to SC-CO2 pretreatment [296,

309]. Besides, aggregates of particles that were formed during the drying process of

lignocellulosic nanofibrils (LCNF), clustered into various micrometer-sized fragments can

be observed in Figure IV.4e. Their surface morphology was smooth, neat and glossy.

Figure IV.4. SEM pictures: (a) Raw flax fiber (RFF), (b) SC-CO2 PFF-A (c) SC-CO2 PFF-B, (d) SC-CO2 PFF-C and (e) LCNF.

103

IV.5.2.3. FTIR analysis

FTIR analysis allowed identification of the functional groups present in the samples

and revealed how the composition and structure of the flax fibres evolved along SC-CO2

pretreatments or fibres extraction. Figure IV.5 depicts the FTIR spectra of RFF and SC-

CO2-PFF (A) and different fragment of lignocellulosic fibres extracted (B). As seen, spectra

of raw and SC-CO2 pretreated flax samples showed similar peaks within the wavenumber

interval investigated. However, an increase in intensity of absorption peaks was observed.

The structure of lignocellulosic flax fibres did not exhibit a chemical change [310]. These

observations confirmed that SC-CO2 pretreatment approach deconstructed flax fibres

without modifying qualitatively their chemical composition.

Moreover, the occurrence of a broad band around 3400 cm−1 was related to the

hydroxyl groups present in cellulose, hemicellulose and lignin [311]. Also, C─H stretching

vibrations of alkyl groups was observed around 2900 cm-1. The peak at 1740 cm-1

corresponding to the C=O bond, was attributed to the elongation vibration of acetyl group

and uronic ester of pectin and hemicelluloses, or the ester linkage of the carboxylic group

of the ferulic acids as well as p-coumaric acid of lignin. In addition, the peaks at 1510 and

1455 cm-1 were assigned to the aromatic C=C stretch of the aromatic rings of lignin and

C─H2 binding in lignin [312]. These peaks were also observed for LCNF1,2, LCMF and

LCA, suggesting the presence of remaining lignin and/or hemicelluloses in these materials.

This fact was ascribed to the partial solubilization of lignin and hemicelluloses during

enzymatic hydrolysis [313]. The peak at 1260 cm-1 was attributed to the elongation

vibration C─O of the aryl group in the lignin [314]. The peak at around 1600–1640 cm-1

was associated with absorbed water in crystalline cellulose [315]. The C─O─C pyranose

ring skeletal vibration gave rise to a prominent band at 1055 cm−1. The intensification of

this band at 1055 cm−1 was related to the increase in the cellulose content [316]. The tiny

sharp band at 893 cm−1 was associated with the occurrence of glycosidic C1─H

deformation, with a ring vibration contribution and OH binding. Such features are

characteristic of β-glycosidic linkages between the anhydroglucose units in cellulose [317].

104

Figure IV.5. FTIR spectra of: (A): untreated or Raw flax fiber (RFF) and SC-CO2 pretreated flax fibers and (B): lignocellulosic fragment fibres extracted.

IV.5.2.4. Crystalline structure

The influence of SC-CO2 pretreatment on the crystalline nature of the resulting

fibres was investigated and the X-ray diffraction patterns of RFF, SC-CO2-PFF and

different fragment of lignocellulosics fibres extracted are shown in Figure IV.6. All SC-CO2-

PFF samples, LCMF, LCNF1 and LCNF2 exhibited diffractograms typical of cellulose I

(native cellulose), with a characteristic peak around 18° and a broad peak around 22.5°

[318]. The crystallinity index values were about 53% for RFF, around 64% for all SC-CO2-

PFF, 72% for LCMF and LCNF1, and 67% LCNF2. However, LCA did not exhibit

characteristic diffraction peak around 22.5° representing the crystalline part of the

materials. Therefore, it was not possible to estimate the crystallinity index of the materials.

This is due probably to raw flax fibers recalcitrance, which limited access to enzymes.

Narayanaswamy et al. [286] observed no change in crystallinity in SC-CO2

pretreated corn stover compared with untreated equivalent. On the contrary, Zheng et

al.[304] reported that the crystallinity of the Avicel was decreased by about 50% after SC-

CO2 explosion pretreatment. The reason could be that Avicel is pure cellulose and not

105

associated with other polymers, whereas in corn stover, cellulose is surrounded by

amorphous hemicellulose and lignin.

Moreover, in the present investigation, all SC-CO2-PFF samples, LCMF, LCNF1

and LCNF2 showed an increase in their crystallinity when compared with RFF and LCA

from RFF. The pretreatment conditions on flax fibres might be strong enough to

breakdown the outer covering of lignin and pectin around the cellulose fibres, but not harsh

enough to significantly destroy the crystallinity of exposed cellulose [319]. The large

increase of the crystallinity index of LCMF, LCNF1 and LCNF2 highlighted the preferential

attack of the amorphous parts of cellulose or the partial solubilization of hemicelluloses

and lignin during enzymatic hydrolysis.

Figure IV.6. XRD patterns of Raw flax fiber (RFF), SC-CO2-PFF and different lignocellulosic fragment fibers extracted.

IV.6. Conclusion

Flax fibres were successfully pretreated using supercritical carbon dioxide (SC-

CO2) before their subsequent enzymatic hydrolysis in view to extract nanofibrils that may

be used as potential fillers in biocomposite materials. The SC-CO2 pretreatment enhanced

significantly the enzymatic hydrolysis conversions with the best results being obtained

under the more severe pretreatment conditions (80 °C, 37.7 MPa). The SC-CO2

pretereated fibres as well as the extracted nanofibrils were characterized using various

techniques (TEM, SEM, FTIR and XRD). The SC-CO2 pretreatment allowed inducing

physical changes in the fibres structure without any change in their chemical composition.

The obtained flax nanofibrils were shown to have 5-10 nm of diameter and several

micrometers of length.

106

Contribution de l’article

Ce chapitre a présenté une approche enzymatique d’extraction de fibres ayant les

dimensions nanométriques (nanofibres lignocellulosiques) combinée à un prétraitement au

CO2 dans les conditions supercritiques pour vaincre la récalcitrance de la biomasse à

toute forme d’extraction.

Dépendamment des conditions de prétraitement, il a été démontré qu’un cocktail

d’enzymes hydrolytiques pouvait extraire les fibres ayant les dimensions nanométriques

sans avoir recours à l’implication d’une étape de traitement mécanique classique ni

d'hydrolyse acide conventionnelle. C’est cet aspect qui caractérise l’originalité de cette

étude.

En effet, de la fibre de lin prétraitée au CO2 supercritique à 20 MPa et 70 °C

pendant 1 heure, l’hydrolyse enzymatique qui a suivi a conduit par précipitation à l’éthanol,

à l’extraction de fibres ayant les dimensions micrométriques, alors que les fibres ayant les

dimensions nanométriques ont été obtenues à partir de la fibre de lin prétraitée au CO2

supercritique à 37.7 MPa et 70-80 °C pendant 1 heure. Quant à la fibre de lin brute ou non

traitée, l’hydrolyse enzymatique a conduit à des monomères et oligomères de degré de

polymérisation 2 formant des agrégats et sans aucune structure fibrillaire. Le prétraitement

au CO2 supercritique avait donc une influence capitale sur l’extraction de la fibre et sur la

taille des particules extraites.

Cependant, ces nanofibres lignocellulosiques extraites, en forme de filaments,

avec les dimensions de 5-10 nm de diamètre et plusieurs micromètres de longueur, sont

de nature hydrophile et de ce fait, incompatibles avec des matrices hydrophobes, pouvant

conduire à des composites hétérogènes.

Il sera donc question dans les deux prochains articles (chapitres) de modifier non

seulement la surface de ces nanofibres lignocellulosiques obtenues pour leur

compatibilisation, mais aussi exploiter et fonctionnaliser la surface de résidus solides de

l’hydrolyse enzymatique qui peuvent aussi servir à diverses applications dans le domaine

de matériaux composites.

107

Chapitre V

V. Laccase-mediated grafting of phenolic compounds onto lignocellulosic flax nanofibres

V.1. Resumé

Les nanofibres lignocellulosiques (LCNF) sont des additifs ayant les dimensions

nanométriques pouvant être utilisés comme renfort afin d’améliorer les propriétés

mécaniques, esthétiques, optiques et thermiques des polymères dans les matériaux

composites, les emballages ou les revêtements. Ces additifs nanométriques de nature

hydrophile devraient subir une modification de surface afin d’améliorer leurs propriétés et

leur applicabilité ou leur compatibilisation dans la matrice de polymères hydrophobes.

Dans ce travail, deux monomères phénoliques de faible poids moléculaire, le gaïacol et le

syringaldéhyde, ont été pour la première fois greffés efficacement sur la lignine résiduelle

exposée à la surface de nanofibres lignocellulosiques par une réaction induite par la

laccase de Trametes versicolor. Les nanofibrilles lignocellulosiques greffées au guaïacol

(LCNFG) et au syringaldéhyde (LCNFS) ont été caractérisées par les techniques de

spectroscopies infrarouge à transformée de Fourier (IRTF) et UV-visible. Les propriétés

thermiques et hydrophobes ont été analysées par les analyses thermogravimétriques

(ATG) et les mesures dynamiques de l'angle de contact à l'eau. Les analyses IRTF ont

confirmé le greffage de gaïacol et de syringaldéhyde induit par la laccase sur les

nanofibrilles lignocellulosiques. Les analyses UV-visibles ont mis en évidence le greffage

de ces entités phénoliques sur des nanofibrilles lignocellulosiques par des données

factuelles à l'appui des observations expérimentales conduisant à des nanofibrilles

lignocellulosiques greffées de couleur marron avec le guaïacol et orange avec le

syringaldéhyde. Les ATG ont montré que le greffage de composés phénoliques conférait

au LCNF une meilleure stabilité thermique. Les mesures de l'angle de contact et le suivi

de la mouillabilité ont montré que l'hydrophobicité de surface de LCNFG et LCNFS était

augmentée après la modification induite par la laccase. Au vu de ces résultats, cette

approche enzymatique apparaît comme un moyen prometteur de fournir de nouveaux

polymères à base de LCNF qui devraient présenter de nouvelles propriétés d’intérêt.

Mots clés : nanofibres lignocellulosiques, biogreffage, guaïacol, syringaldéhyde, hydrophobisation.

108

V.2. Abstract

Lignocellulosic nanofibrils (LCNF) are nanometer additives that can be used to improve

the mechanical, aesthetical, optical and thermal properties of polymers in composites,

packages, or coatings. Surface modification of these hydrophilic nanometer additives is

needed to improve their properties and applicability in hydrophobic polymers matrix.

In this work, two phenolic monomers, guaïacol and syringaldehyde were for the first time,

efficiently grafted onto the exposed residual lignin of lignocellulosic nanofibrils surface by a

laccase from Trametes versicolor mediated reaction. Guaiacol grafted (LCNFG) and

syringaldehyde grafted (LCNFS) lignocellulosic nanofibrils were characterized with Fourier

Transform Infra-Red (FTIR) and UV-visible techniques. Thermal and hydrophobic

properties were analyzed by thermogravimetric analysis (TGA) and Water contact angle

(WCA) measurements.

FTIR analyses confirmed the laccase mediated grafting of guaiacol and syringaldehyde

onto lignocellulosic nanofibrils; UV-visible gave evidence for the grafting of phenolic

entities onto lignocellulosic nanofibrils by factual data supporting experimental

observations, leading to brown and orange colored grafted lignocellulosic nanofibrils

(LCNFG and LCNFS, respectively). TGA has shown that grafting of phenolic compounds

endowed LCNF better thermal stability. WCA angle and wettability measurements showed

that the surface hydrophobicity of LCNFG and LCNFS was increased after the enzymatic

grafting modification. In view of these results, this enzymatic procedure appears as a

promising way to provide new LCNF-based polymers that are expected to present new

properties of interest

Keywords: lignocellulosic nanofibrils, biografting, laccase, guaïacol, syringaldehyde, hydrophobization.

V.3. Introduction

The rise in environmental concerns have led to the current interest in replacing

plastic materials from fossil resources with greener alternatives, such as the manufacture

of polymers from natural resources such as lipids, proteins and polysaccharides. The so-

called biopolymers have numerous advantages over synthetic polymers because of their

biodegradability, renewability, eco-friendly nature and sometimes low-cost [44].

Unfortunately, those biopolymers exhibit generally lower performances as compared to

synthetic polymers and, consequently, must be reinforced. Presently, there is a strong

109

interest for the use of diverse plant fibres such as wood, hemp, flax, sisal, and kenaf as

reinforcement of biopolymers resulting in biocomposite materials potentially usable in

numerous applications including automotive, construction and furniture [320].

In this connection, lignocellulosic nanofibrils (LCNF) are lignin-containing cellulose

nanofibrils that can be an alternative to more traditional cellulose nanofibrils and can

potentially offer new uses and applications. Lignin can act as a compatibilizer to

hydrophobic polymers or a point of attachment of hydrophobic molecules and potentially

improve their dispersion in a composite [321]. Their intrinsic properties such as

renewability, high surface area, high specific strength, and modulus, make them ideal for

reinforcing biopolymers to obtain high performance biocomposites.

Numerous investigations related to lignocellulosic nanofibrils (LCNF), including

cellulose micro / nanofibrils (MFC/ NFC) and cellulose nanocrystals (CNC), used as

biopolymers reinforcement, for the formulation of bionanocomposites, have been reported

in recent years. The incorporation of these nanometric additives, aims not only to improve

the mechanical properties by increasing rigidity and hardness of biopolymers, but also

improve their aesthetic (appearance), optical (transparency) and thermal (stability)

properties.

Therefore, LCNF, MFC/NFC and CNC materials which are naturally hydrophilic,

have been easily and perfectly incorporated into polar or hydrophilic polymers such as

polyether block amide [322], polyvinyl alcohol [323], polyethylene glycol [324] or

polyurethane [325]. In all these cases, the resulting nanocomposites were reported to

show improved mechanical and/or thermal properties. At the opposite, the incorporation of

these nanometric additives into non polar or hydrophobic polymers such as polylactic acid

(PLA) [326], polycaprolactone (PCL) [327] and polypropylene (PP) [328] represented a

challenge because of the complexity of the mechanisms occurring at the fiber-matrix

interface, such as poor adhesion and poor dispersion of fibres in the matrix leading to a

heterogeneous composite.

Hence, it is essential in this last case to perform a treatment either on the

reinforcement or on the matrix to enhance the compatibility between both phases.

Generally, it is more convenient and economic to perform such treatments on the fibres

rather than on the matrix. Various treatment processes have been developed to improve

110

adhesion and dispersion of LCNF, MFC/NFC and CNC materials into non-polar polymers.

Chemical grafting of coupling agents such as silanes [329, 330], isocyanates [331] and

anhydrides [332, 333] have been used to introduce surface hydrophobicity onto these

nanomaterials, and thus a better compatibility with the hydrophobic matrix. However, these

chemical methods use huge amounts of hazardous chemicals in the grafting process

leading to very costly handling and disposal of the resulting chemical wastes.

The use of enzymes in grafting processes represents a judicious alternative, thanks

to the selectivity of the catalyzed reactions and their environmental friendliness.

Oxidoreductase enzymes such as tyrosinase, laccase and peroxidase have previously

been used to mediate surface functionalization of lignocellulosic fibers to enhance

hydrophobicity [334-336]. Nevertheless, the use of such enzymes on lignocellulosic

nanomaterials has scarcely been reported in the open literature [337-339].

Laccases (EC 1.10.3.2, benzenediol: oxygen oxidoreductase) are the most

investigated enzymes in this field and have emerged as important biotechnological

catalysts for their eco-friendly nature and mild working conditions. They are multi-copper

enzymes able to catalyze the direct oxidation of a wide range of aromatic compounds such

as mono-, di- and polyphenols, phenolic acids, methoxyphenols, aromatic amines and

lignin monomers, to generate reactive radicals, by using molecular oxygen as the oxidant

[340]. Due to the high reactivity of these radicals, either with each other or with a

secondary substrate, further reactions such as polymerization, depolymerization, co-

polymerization and grafting, can occur [341, 342].

Lignin in lignocellulosic nanofibrils, mainly composed of guaiacyl, syringyl, and

hydroxyphenyl units, is a suitable substrate for laccase. Therefore, laccase may activate

lignocellulosic nanofibrils by means of oxidation of phenolic moieties in lignin [343].

In addition, laccase has been shown to have the potential to graft several low

molecular natural phenolic compounds onto lignocellulosic materials to enhance

hydrophobic properties and antimicrobial activities. Various low molecular natural phenolic

compounds such as gallic acid, caffeic acid and isoeugenol [344], ferulic acid,

acetosyringone, p-coumaricacid, coniferaldehyde, sinapaldehyde [198], have already been

used in laccase mediated grafting onto lignocellulosic substrates.

111

Guaiacol and syringaldehyde also are well known as natural phenolic agents of low

molecular weight were previously reported for their straightforward grafting to

lignocellulosic biomasses by laccase. For instance, Thakur et al. [8] reported surface

functionalization of coconut fibers by laccase mediated grafting of syringaldehyde for the

development of biocomposite materials. Also, Schroeder et al. [345] used guaiacol in

laccase-induced coating of flax fibres with polyphenols. To our knowledge, no study has

been performed on the use of laccase mediated coupling guaiacol or syringaldehyde onto

lignocellulosic nanomaterials.

The aim of the present work is the surface modification of lignocellulosic flax

nanofibrils in view to enhance their hydrophobicity. To this purpose, syringaldehyde and

guaiacol were grafted to the nanofibrils using laccase from Trametes versicolor as an

ecofriendly biocatalyst. Structural characterization as well as hydrophobicity and thermal

properties of the surface-modified nanofibrils were performed.

V.4. Materials and methods

V.4.1. Materials

Lignocellulosic nanofibrils (LCNF) extracted from flax fibers were used in this study.

The preparation procedure consisted in a pretreatment of flax fibres using supercritical

dioxide carbon (SC-CO2) followed by an enzymatic hydrolysis. A cocktail of hydrolytic

enzymes composed of cellulase, xylanase, pectinase and viscozyme was used in the

hydrolysis reaction. Lignocellulosic nanofibres were recovered by ethanol precipitation

from the hydrolysis filtrate. As reported in our previous chapter, the obtained lignocellulosic

nanofibrils exhibited filament-shape of several nanometers in length and a diameter of 5-

10 nm. Also, these nanofibrils were completely soluble in aqueous medium.

All chemicals were purchased from Sigma Aldrich. They were of analytical grade

and used without further purification. Syringaldehyde (3,5-dimethoxy-4-

hydroxybenzaldehyde; 4-hydroxy-3,5 dimethoxy benzaldehyde, Mw 182.17 g / mol),

guaiacol (2-methoxyphenol; catechol monomethyl ether; pyrocatechol monomethyl ether,

Mw 124.14 g / mol) and laccase from Trametes Versicolor were used in lignocellulosic

nanofibrils surface modification.

112

V.4.2. Laccase-mediated grafting phenolic compounds onto lignocellulosic nanofibrils

The lignocellulosic nanofibrils functionalization was performed via a homogeneous

method, i.e. using dissolved free enzyme and the soluble nanofibrils. To this purpose, a

buffer solution having a pH of 4.0 was used to prepare separate stock solutions of LCNF

(1 % w/v) and phenolic compound (either guaicol or syringaldehyde) with a concentration

of 10 mM. In a typical run, the nanofibrils solution was contacted with the phenolic

compound solution with a ratio of 4 % w/g nanofibrils. The mixture was kept at 40 °C

during 30 min under stirring at 150 rpm for the sake of homogenization. Subsequently, the

enzymatic reaction was started by adding the laccase enzyme with a ratio 40 U/g

nanofibrils. The reaction conducted at 40 °C was allowed to last 24 h under stirring at 150

rpm. Aliquots were withdrawn at preset intervals and analyzed using GC as explained in

the next section. After 24 h, total reaction time, the enzymatic reaction was stopped by

boiling the reaction medium for 10 min in water bath followed by centrifugation at 5000 rpm

for 5 min. The supernatant was then put uniformly onto petri dishes and oven-dried

overnight at 40 °C. The obtained dry films were peeled off and characterized. Reference

nanofibrils samples were obtained following the same procedure without adding laccase.

V.4.3. Monitoring of reaction kinetics

Phenolic compounds (guaiacol and syringaldehyde) consumption was monitored

by gas chromatography (GC). Samples (0.1 mL) were withdrawn from the reaction

medium at various time intervals and analyzed. Chromatographic analyses were carried

out using a HP 6890 series gas chromatograph equipped with a FID. A capillary column

HP-5 (5% phenyl methyl siloxane) 30m x 0.25 mm x 0.25 µm was used. The carrier gas

was helium at a flow rate of 1 mL/min. Injections (1 µl) were made in the splitless mode at

an injector temperature of 200 °C. The detector temperature was set at 250 °C. The

temperature program employed was: initial oven temperature at 80 °C increasing at 4

°C/min up to 140 °C, stable at 140 °C for 2min, then at 4 °C/min up to 310 °C and kept

constant until the end of program for a total run time of 57 min

V.4.4. Characterization of the nanofibrils

Different characterization techniques were used to assess the effect of surface

modification by phenolic compounds grafting on the nanofibrils properties.

113

Fourier Transform Infrared (FTIR) absorption spectra were collected in the interval

400–4000 cm-1 on a Varian 1000 (Scimitar series) spectrometer using KBr pellets at room

temperature.

UV-Visible spectra were recorded using a HP UV-8453 a UV-visible

spectrophotometer within 190 and 700 nm wavelength interval. To this purpose, surface

modified and blank nanofibrils samples were dissolved in acidic solution (HCl, pH~2-3)

with a concentration of 0.4 % (w/v). The solutions were maintained under gentle stirring at

room temperature for 24 hours to ensure a maximum dissolution, then filtered (Whatman,

0.2 µm nylon membrane filters) before analysis.

Thermal behavior of the different LCNF samples was characterized on a Mettler

Toledo 851 thermogravimetric instrument in an inert gas (nitrogen) from 25–700°C at a

heating rate of 10°C / min.

The hydrophobic properties of the blank and surface-modified LCNF samples were

assessed by measuring the contact angle using a dynamic contact angle analyzer, FTA

200 (First Ten Angstroms, Portsmouth, VA, USA). Samples were first prepared as pellets

and conditioned to equilibrium moisture content. A 4 µl droplet of water was deposited on

the surface of the nanofibrils pellets by means of a syringe, and the Sanyo 1-6010 camera

captures the images as soon as droplets fell on the surface of the pellet. Instantly, at each

second, the software calculates the contact angle of the drop of water deposited on the

surface of the pellet. Thus, it was possible to follow the wettability of the sample until the

total absorption of the water droplet.

V.5. Results and discussion

V.5.1. Enzymatic reaction time profiles

To assess the extent of the enzymatic mediated grafting of the guaiacol and

syringaldehyde on the surface of LCNF materials and the eventual oxidative effect of the

laccase enzyme, time profiles of both phenolic compounds are illustrated in Figure V.1. As

can be seen, neither guaiacol nor syringaldehyde were consumed in the absence of

laccase enzyme, thus indicating that these compounds did not undergo neither reaction,

nor grafting, nor even adsorption on the LCNF surface. Similar behavior was reported by

Karaki et al [346] in their investigation on functionalization of pectin using ferulic acid in the

114

presence of laccase. Furthermore, when laccase was contacted with both phenolic

compounds in the absence of LCNF materials, the recorded time profiles indicated that

complete disappearance of guaiacol and syringaldehyde was reached within 320 and 180

min of reaction, respectively. This is attributed to the oxidative reactions occurring on both

compounds catalyzed by the oxidase enzyme. Besides, in the case where laccase was

contacted with both phenolic compounds in the presence of LCNF material, the complete

consumption of guaiacol and syringaldehyde was achieved within 300 and 180 min,

respectively. At the macroscopic scale, the color of the reaction media containing laccase

and phenolic compounds gradually changed from red (due to the color of buffer tampon),

to orange with syringaldehyde and dark brown with guaiacol within 24 hours of incubation.

Such behavior is attributed to the complete oxidation of both of guaiacol and

syringaldehyde into oxidized compounds, thanks to the oxidative effect of the laccase

enzyme which belongs to the group of oxidases enzymes.

Figure V.1. Time profile consumption of guaiacol (G) and Syringaldehyde (S) in different media: G or S with laccase (●); G or S with laccase and LCNF (▲); G or S with LCNF (■)

V.5.2. Characterization of LCNF materials

V.5.2.1. FTIR spectroscopy

The spectra of lignocellulosic nanofibers (LCNF), guaiacol grafted (LCNFG) and

syringaldehyde grafted (LCNFS) lignocellulosic nanofibres are shown in Figure V.2.

Significant differences between LCNF and biografted lignocellulosic nanofibres (LCNFG

and LCNFS) were observed. New bands were identified around 1730 cm-1. This new band

115

due to the grafting of phenolic compounds is attributed to C═O aldehyde stretching [347].

The broad bands around 3400 cm-1, present in all spectra, correspond to the hydroxyl

group elongation vibrations O─H [348]. A large peak observed at 1600 cm-1 corresponds

to the elongation vibration of the C=C bond of aromatic cycle present in the residual lignin

of the LCNF materials. The peak at 1415 cm-1 is assigned to the CH3 (asymmetric) or C─H

(symmetric) group deformation vibration present in the lignin. As for the peak at 1245 cm-1,

it is attributed to the elongation vibration C─O of the aryl group in the lignin. The peak

1080 cm-1 is ascribed to the elongation vibration of the ether group C─O─C of the

pyranose cycle and the peak at 898 cm-1 corresponds to the C─H (symmetric) bond in the

polysaccharide occurring in the β-glycosidic bond between the glucose units in the

cellulose moieties. From these observations, it is suggested that guaiacol and

syringaldehyde have been effectively covalently grafted onto the surface of the LCNF by

laccase.

Figure V.2. FTIR spectra of raw and surface-modified LCNF materials

V.5.2.2. UV-Visible absorption

Whatever the type of lignocellulosic nanofibres investigated (LCNF, LCNFG,

LCNFS), a high absorbance around 200 nm and small one around 280 nm, were observed

(see Figure V.3). Although these spectral regions were unspecific, absorbance around 200

nm and 280 nm could be attributed to cellulose and lignin, respectively [349].

116

Significant changes in the UV-Vis spectra were observed after biografting. A large

increase of the absorbance band at 280 nm was observed and attributed to the possible

reaction between the products of laccase-catalyzed oxidation of the phenolic compounds

and the free radicals belonging to the lignin content of LCNF. The higher absorbance of

LCNFG and LCNFS compared to the LCNF provided an evidence of the grafting of

phenolic compounds onto the nanofibres. These findings are similar to those recently

reported by Zheng et al. [350], regarding laccase mediated grafting of gallic acid onto

chitosan.

Moreover, as shown in Figure V. 3, LCNFG largely absorbed in the visible region

(λ> 400 nm) and at low level LCNFS also absorbed in this region, whereas LCNF showed

almost no absorbance. This is also visually observed by the brown color of LCNFG and

the orange color of LCNFS compared to the colorless LCNF.

Figure V.3. UV-Visible spectra of raw and surface-modified LCNF materials

V.5.2.3. Thermogravimetric analysis

Thermogravimetric analysis was used to investigate the decomposition patterns

and thermal stability of lignocellulosic nanofibrils. Figure V.4 illustrates the

thermogravimetric (TG) and derivative of thermograms (DTG) of LCNF and surface-

modified nanofibres using guaiacol (LCNFG) and syringaldehyde (LCNFS). At first glance,

it is noticed that the thermal behavior of lignocellulosic nanofibrils has changed

dramatically due to the biografting of phenolic compounds. Several transition temperature

ranges of decomposition are observed.

117

Indeed, a first decomposition step of LCNF, LCNFG and LCNFS was observed up

to 110 °C. The corresponding weight loss of around 6% was attributed to the absorbed

moisture on the surfaces of lignocellulosic biomass. Both LCNFG and LCNFS materials

showed a much slower decrease of weight than raw LCNF at this step. Such behavior

indicates that less water was released in LCNFG and LCNFS, possibly due to the

hydrophobicity induced by the surface modification by grafting of guaiacol and

syringaldehyde.

The second step of decomposition (110–250 °C) represents the beginning of

degradation of lignin and probably breaking of covalent bonding between lignin and

phenolic compounds (guaiacol and syringaldehyde) for LCNFG and LCNFS [8]. An

additional step of decomposition appeared (250- 290 °C) for LCNFG and LCNFS. This

may be due to the degradation of the grafted phenolic compounds.

The last step of decomposition occurred at approximately 300-400 °C and was

attributed to cellulose degradation [351]. LCNF material attained the maximum weight loss

at 388°C (58% weight loss) with 20% residue left at 690°C while LCNFG and LCNFS

presented their maximum weight loss at 430 °C (56% and 55% weight loss, respectively)

with solid residue of ~30% at 690 °C. Therefore, the increase in the maximum

decomposition temperature demonstrated by the surface-modified nanofibers as well as

their increased final percentage of residue at 690°C confirm the higher stability of these

materials compared to the raw unmodified nanofibres.

Figure V.4. TG (a) and DTG (b) curves of raw and surface-modified LCNF materials

118

V.5.2.4. Hydrophobic performances of biografted lignocellulosic nanofibrils

The hydrophobic properties of grafted lignocellulosic nanofibrils (LCNFG and

LCNFS) were evaluated by means of water contact angle and wettability measurements in

60 seconds compared to raw lignocellulosic nanofibrils (LCNF). Figure V.5 depicts the

value of water contact angle and wettability behavior of raw and surface-modified

lignocellulosic nanofibrils. Clearly, the bare raw lignocellulosic nanofibrils exhibited a

hydrophilic behavior showing a contact angle value of 30° with great wettability resulting in

contact angle decreasing to 16.9° after 60 seconds. The highest water contact angle

measured was 46.5° for guaiacol grafted lignocellulosic nanofibrils (LCNFG) followed by

38.7° recorded for the LCNFS material. After 60 s, the contact angles decreased to 20.6

and 20.0°, for the LCNFG and LCNFS, respectively. Therefore, the higher initial contact

angles observed for the surface-modified nanofibres is attributed to the enhanced

hydrophobicity induced upon laccase mediated grafting of guaiacol and syringaldehyde.

Figure V.5. Contact angles over time for the raw and surface-modified LCNF materials

V.6. Conclusion

The laccase mediated grafting of guaiacol or syringaldehyde onto lignocellulosic

nanofibrils for their hydrophobization was investigated. The laccase mediated biografting

of guaiacol or syringaldehyde onto LCNF was confirmed by GC analyses as well as FTIR,

UV–Vis, TG and contact angle measurements. Complete conversion of guaiacol and

syringaldehyde was obtained after 5 and 3 hours of incubation, respectively. The surface

modification via grafting of phenolic compounds endowed enhanced hydrophobicity and

better thermal stability to the lignocellulosic nanofibres investigated.

119


Ce chapitre a présenté une méthode enzymatique de modification de surface de

nanofibres lignocellulosiques avec les produits d’oxydation des composés phenoliques,

catalysé par la laccase. Il a donc permis de démontrer la faisabilité du greffage du

guaïacol et du syringaldéhyde sur les nanomatériaux (nanofibres) lignocellulosiques en

présence de la laccase alors qu’à notre connaissance, à ce jour, cela n’a été réalisé que

sur les matériaux (fibre) lignocellulosiques.

Une variation de la coloration du milieu réactionnel a été observée à l’échelle

macroscopique et les nanofibres fonctionnalisées en forme de poudre brune et orange ont

été obtenues pour le guaïacol et le syringaldéhyde, respectivement.

La cinétique de réaction suivie par HPLC a montré que le guaïacol est totalement

converti après 5h20 de réaction alors que le syringaldéhyde est totalement converti après

3 heures. La présence des nanofibres lignocellulosiques dans le milieu réactionnel semble

accélérer la cinétique d’oxydation du guaïacol et du syringaldéhyde.

Les analyses structurales ont mis en évidence le greffage du guaïacol et

syringaldéhyde sur les nanofibres lignocellulosiques. Ces nanofibres fonctionnalisées ont

présenté une meilleure stabilité thermique et une hydrophobicité accrue comparativement

aux nanofibres brutes.

Le procédé proposé apparaît donc comme une voie efficace et respectueuse de

l'environnement pour l'obtention de nouvelles fonctionnalités de nanofibres

lignocellulosiques et aussi une voie prometteuse pour élargir ainsi son champ

d’application.

Cet exercice va s’étendre au chapitre suivant, où les fibres de lin que constituent

les résidus solides de l’hydrolyse enzymatique qui a conduit à l’obtention des nanofibres

lignocellulosiques, vont à leur tour connaitre une modification de surface par le greffage du

guaïacol et du syringaldéhyde catalysé par la laccase. Le but étant de valoriser la

biomasse dans toute son entièreté pour une application différente à celle des nanofibres

dans les matériaux composites.

120

Chapitre VI

VI. Laccase-mediated grafting of guaiacol and syringaldehyde onto flax fibers for hydrophobization treatment

VI.1. Resumé

Dans ce travail, la modification de surface de fibres de lin lignocellulosiques (LCFF) a été

obtenue par greffage de guaïacol ou de syringaldéhyde induite par la laccase à partir des

fragments de lignine contenus dans la fibre de lin. La concentration en laccase, et en

composés phénoliques, ainsi que le temps d'incubation ont été variés afin d'optimiser les

conditions de réaction pour une fonctionnalisation maximale. Les fibres de lin

lignocellulosiques biogreffées ont été caractérisées par spectroscopie infrarouge à

transformée de Fourier (IRTF), microscopie électronique à balayage (MEB) et les

techniques de diffraction des rayons X (DRX). Les propriétés thermiques et

hydrophobiques ont été analysées par les analyses thermogravimétriques (ATG) et les

mesures statiques de l'angle de contact à l'eau. Les conditions optimales de biogreffage

étaient: 1% (p /v) fibres de lin / solution tampon pH 4,0, à 40 °C pendant 24 heures, avec

40 U/g de laccase et 6% de composés phénoliques. Les résultats ont révélé un couplage

covalent des produits d'oxydation du guaïacol et du syringaldéhyde avec le LCFF (G-g-

LCFF et S-g-LCFF, respectivement), confirmé par les analyses IRTF, MEB et DRX. Les

mesures statiques d'angle de contact à l'eau ont montré que l’hydrophobicité à la surface

des fibres de lin lignocellulosiques était augmenté après le greffage des composés

phénoliques induite par la laccase, passant de 63,56 ° pour LCFF à 90 ° et 83 °, pour G-g-

LCFF et S-g-LCFF, respectivement.

Mots clés : fibres de lin lignocellulosiques, biogreffage, laccase, guaïacol, syringaldéhyde, hydrophobisation

VI.2. Abstract

In this work, surface modification of lignocellulosic flax fibers was successfully achieved by

grafting guaiacol or syringaldehyde on lignin moieties of flax fibers using laccase-mediated

grafting method. Laccase and phenolic compounds concentration and incubation time

were varied to optimize the reaction conditions and obtain maximum biografting. The effect

of the grafting method on the surface, morphology, crystallinity, thermal resistance and

121

hydrophobicity of biografted lignocellulosic flax fibers were, then, investigated by Fourier

Transform Infrared spectroscopy, Scanning Election Microscopy, X-ray Diffraction,

thermogravimetric analysis and water contact angle measurements. The optimum

conditions were found using a 1% (w/v) flax fibers/Buffer solution at pH 4.0, 40 °C and in

the presence of 40 U/g of laccase for 24 hours. The results revealed covalently coupling

guaiacol and syringaldehyde oxidation products respectively with flax fibers. Moreover,

static water contact angle measurements evidenced that the surface hydrophobicity of

lignocellulosic flax fibers was increased after the laccase-mediated graft modification, from

63.6° for unmodified flax fibers to 90° and 83°, for guaiacol and syringaldehyde grafted flax

fibers respectively.

Keywords: lignocellulosic flax fibers, biografting, laccase, guaiacol, syringaldehyde,

hydrophobization

VI.3. Introduction

With increasing awareness of ecological and environmental issues, the desire to

obtain products from renewable materials has triggered an increased interest in natural

plant fibers such as cotton, flax or hemp. All plant fibres are rich lignocellulosic materials

that contain cellulose in the form of fibers or nanofibers as their major structural

component. These fibers or nanofibers are abundant, exhibit good mechanical properties,

low density and are biodegradable. Consequently, they are widely used as reinforcing

materials in polymer-based composites or nanocomposites for a large range of

applications [352, 353]. However, natural fibers are hydrophilic materials that lead to

moisture absorption causing plasticization and swelling effects as well as poor

compatibility with hydrophobic polymer matrices resulting in weak interfaces and poor

mechanical properties of the composites [354]. Surface modification is therefore required

to improve the interfacial adhesion between natural fibers and polymer matrix, which can

be achieved by chemical or biological surface treatment methods. Chemical treatments

require proper handling and disposal of large quantities of hazardous chemicals used,

which can be a major problem and result in additional cost for the final product. By

contrast, surface modification by biological approaches involves the use of appropriate

enzymes as biotechnological catalysts and are environmentally friendly [355].

Laccases (EC 1. 10.3.2, benzenediol: oxygen oxidoreductase), a family of blue

multi-copper oxidases, have been reported as effective for the functionalization of

122

lignocellulosic materials via biochemical coupling with a wide variety of compounds,

including phenols, polyphenols, flavonoids and proteins [356, 357]. With the laccase

catalyzed oxidation of lignin moieties rich on the surface, the lignocellulosic materials could

be activated to create a radical-rich reactive surface to which oxidized (radical-containing)

phenolic molecules of interest can be grafted [358, 359]. Laccase-catalyzed biografting of

phenolic and other low molecular weight compounds was also carried out to develop

antibacterial and hydrophobic properties. For instance, an increase in the hydrophobicity of

the surface of jute fibers was reported using laccase in combination with dodecyl gallate

[360]. Remarkable hydrophobic properties of Pulp Fibers were achieved by grafting, using

a laccase-assisted approach, octyl gallate or lauryl gallate onto the fiber surface to

improve the interfacial adhesion with Poly (lactic acid) [10].

Guaiacol and syringaldehyde are well known natural phenolic derivatives agents

capable to act as laccase mediators [361, 362]. Therefore, they can also be used as

potential laccase redox mediators in the biografting of lignocellulosic biomasses to

introduce hydrophobicity because of their poor or no solubility in water.

To the best of author's knowledge, syringaldehyde has already been used to

develop antimicrobial properties and to bleach lignocellulosic materials [358, 363].

However, few or almost no works have been reported on the use of guaiacol or

syringaldehyde to introduce hydrophobicity in lignocellulosic materials.

In the present work, biografting of syringaldehyde and guaiacol on lignocellulosic

flax fibers using Trametes versicolor-derived laccase was performed. Subsequently,

morphology, hydrophobicity, and thermal properties of biografted lignocellulosic flax fibers

were characterized and compared with unmodified flax fibers.

VI.4. Materials and methods

VI.4.1. Materials

In this study, solid residues derived from the enzymatic hydrolysis of flax fibers to

extract lignocellulosic nanofibrils were used as raw materials. These residues, referred to

as Lignocellulosic flax fibers (LCFF), were carefully washed with water and acetone to

remove all the impurities, and dried overnight at room temperature.

123

Syringaldehyde (3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyde; 4-hydroxy-3,5 dimethoxy

benzaldehyde, Mw 182.17 gmol-1), guaiacol (2-methoxyphenol; catechol monomethyl

ether; pyrocatechol monomethyl ether, Mw 124.14 gmol-1) and laccase from trametes

versicolor were purchased from Sigma Aldrich and used without further purification.

VI.4.2. Laccase-mediated grafting guaiacol and syringaldehyde onto lignocellulosic flax fibres

Lignocellulosic flax fibers functionalization was performed by heterogeneous

method in an open Erlenmeyer flask with no oxygen limitation. To this purpose, 1% of

LCFF (w/v), 4 % (w/w) of phenolic compounds and 40U/g laccase were mixed in a shaker

(SI-300R) and continuously stirred at 150rpm. The pH and temperature of the mixture

were kept constant at 4.0 and 40 °C, respectively. After 7 h, total reaction time with LCFF,

laccase, and phenolic compounds (guaiacol or syringaldehyde), the reaction was stopped

by boiling the reaction medium in a water bath for 10 min and then vacuum filtered to

recover the modified fibers. Then, the biografted LCFF were washed with distilled water,

methanol, ethanol and acetone to remove any traces of phenolic compounds adsorbed by

electrostatic bonds. Finally, these biografted LCFFs were dried overnight at room

temperature and kept in the desiccator until use. A reference mixture made of 1% of LCFF

and 4 % of phenolic compounds but without laccase was also prepared for purpose of

comparison. For the sake of simplicity, guaiacol and syringaldehyde biografted LCFF were

referred to as G-g-LCFF and S-g-LCFF respectively.

VI.4.3. Measurement and optimization of biografting ratio

The biografting weight ratio, Gp , was determined according to equation 1:

𝐺𝑝 (%) =(𝑊2 − 𝑊1)

𝑊1∗ 100 (1)

Where, W1 and W2 are the weights of the reference mixture and the treated lignocellulosic

flax fibers with laccase and guaiacol or syringaldehyde respectively.

Phenolic compounds concentration, enzyme concentration and incubation time

were then varied, one at a time, to determine the optimal biografting conditions. A mixture

made of 1% (w/v) flax fibers in buffer solution at pH 4.0 (with fungicide, citric acid / sodium

hydroxide / sodium chloride), 4% (w/w) guaiacol or syringaldehyde concentration and

40U/g of laccase, stirred at 150rpm for 7h, was used as the standard mixture (i.e the

124

starting mixture). Thus, the incubation time, phenolic content and laccase concentration

were varied from 7 to 36 h, 2 to 6% and 20 to 50 U/g, respectively. Only the optimized

samples were then fully characterized.

VI.4.4. Characterization of the biografted fibers

Fourier Transform Infrared (FTIR), Scanning Electron Microscopy (SEM), X-ray

diffraction, Thermogravimetric Analysis (TGA) and contact angle measurements were

used to investigate the effect of the grafting method on the surface, morphology,

crystallinity, thermal resistance and hydrophobicity of biografted flax fibers.

Fourier Transform Infrared (FTIR) absorption spectra were collected in the interval

400–4000 cm-1 on a Varian 1000 (Scimitar series) spectrometer using KBr pellets at room

temperature.

The surface morphology of unmodified LCFF, G-g-LCFF and S-g-LCFF fibers was

investigated by Scanning Electron Microscopy (SEM) using a JEOL JSM-84OA electron

microscope. The samples were previously prepared by sputter coatings with platinum to

obtain conductive surface. SEM images were recorded at 15 kV and magnified 1000

times.

X-ray diffraction data of unmodified LCFF, G-g-LCFF and S-g-LCFF fibers were

collected on a Rigaku D-Max-Ultima III diffractometer using nickel-filtered Cu-Kα radiation

of wavelength 1.5406 Å with a voltage of 40 kV and a current of 44 mA. Powder diffraction

patterns were obtained between 5 and 55º with a scan speed of 2o/min. The crystallinity

index was calculated based on the method proposed by Segal et al. [278] according to

equation 2:

𝜏 =𝐼200 − 𝐼002

𝐼002∗ 100 (2)

Where τ represents the crystallinity index (%), I200 the maximum intensity of the

peak between 2θ =22 and 23° and I002, the minimum intensity of the amorphous peak

measured between 2θ =18° and 19°.

125

Thermal resistance of unmodified and grafted LCFF fibers was characterized on a

Mettler Toledo 851 thermogravimetric instrument in nitrogen gas from 25 to 700°C at a

heating rate of 10 °C/ min.

The hydrophobic properties of the unmodified and surface-modified LCFF fibers

were assessed by measuring the contact angle using a dynamic contact angle analyzer,

FTA 200 (First Ten Angstroms, Portsmouth, VA, USA). Samples were first prepared as

pellets and conditioned to equilibrium moisture content. A 4 µl droplet of water was

deposited on the surface of the nanofibrils pellets by means of a syringe, and the Sanyo 1-

6010 camera captures the images as soon as droplets fell on the surface of the pellet.

Instantly, the software calculates the contact angle of the drop of water deposited on the

surface of the pellet. The static water contact angle was determined 2s after water drop

deposition.

VI.5. Results and discussion

VI.5.1. Optimization of biografting conditions

To get the maximum of biografting, the effect of laccase concentration, guaiacol or

syringaldehyde concentration and incubation time was investigated. Figure VI.1 presents

the effect of these 3 parameters on the biografting ratio (Gp).

As can be seen, at 40U/g of laccase, Gp reaches a maximum value of about 14

and 9% with guaiacol and syringaldehyde, respectively (Fig. VI.1. A1 and B1). This result

can be explained by the increase of phenoxy radicals generated with the increase of

laccase concentration. By contrast, above 40U/g of laccase, the observed decrease of Gp

can be accounted by the presence of by-products in the reaction media as well as the

degradation of lignin at higher laccase concentration [364]. As for the effect of phenolic

compounds concentration, Gp increases steadily with guaiacol or syringaldehyde

concentration. Maximum values of 14 and 13% for laccase mediated grafting guaiacol and

syringaldehyde, respectively, were observed with 6% of phenolic compounds (Fig. VI.1. A2

and B2). This result can be accounted for by the increase of the laccase reactivity due to

the increase of phenoxy radicals, which, in turn, form covalent bonding with lignin radicals

to achieve stabilization [365]. When the process was incubated for different times (7 to

36h), a maximum value of about 12% of the biografting ratio was reached after 24h of

incubation time for both laccase-mediated grafting of guaiacol and syringaldehyde

126

(Fig.VI.1. A3 and B3). At extended incubation time (i.e.36h), a reduction of the biografting

ratio is observed. This may be due to laccase reactivity that reduces at longer reaction

time. Overall, our observations are consistent with reported work in literature [345, 358,

366].

To sum up, it was found out that the use of 40 U/g of laccase, 6% of phenolic

compound and an incubation time of 24 h lead, within the selected experimental

conditions, to the highest biografting ratio, Gp, of 15,0 and 13.5 % for guaiacol and

syringaldehyde grafted flax fibres, respectively.

Figure VI.1. Effect of laccase and phenolic concentrations and incubation time on the biografting ratio, Gp: (A) with Guaiacol and (B) with Syringaldehyde

VI.5.2. Characterization of grafted LCFF materials

VI.5.2.1. Surface characterization and morphology

FTIR analysis was carried out on the samples obtained under optimal conditions as

previously described to confirm the surface modification of LCFF and the biografing of

guaiacol and syringaldehyde chains. Fig. VI.2 shows the FTIR spectra of raw or

unmodified-LCFF, guaiacol-grafted (G-g-LCCF) and syringaldehyde-grafted (S-g-LCFF)

127

lignocellulosic flax fibers. In contrast to the LCFF, the C═O stretching vibration around

1735 cm−1 of G-g-LCCF and S-g-LCFF split into 2 peaks due to C═O aldehyde stretching

of syringaldehyde and the laccase oxidation of guaiacol to corresponding quinone [367].

Accordingly, this result confirms the efficiency of the grafting method. Table VI.1

summarizes FTIR absorption bands of interest and their assignments [8, 368].

Tableau VI.1. Infrared main transitions for flax fibers bundles

Wave number

(cm-1) Vibration Source

3400 O─H linked shearing Cellulose

2935 C─H stretching Cellulose

1735 C═O stretching Pectin, Hemicellulose, and Lignin

1736 C═O stretching Grafting of phenolic compounds

1510 C═C aromatic stretching Lignin

1460, 1330 -OCH3 ether stretch Lignin

1260 C─O aryl group Lignin

1055 C─O─C ether group of pyranoses Cellulose, Hemicellulose

900 C─H glycosidic bonds Polysaccharides

Figure VI.2. FTIR spectra of raw and surface-modified LCFF materials

Figure VI.3 depicts SEM surface morphologies of unmodified-LCFF and biografted

lignocellulosic flax fibers (i.e. G-g-LCFF and S-g-LCFF). The LCFF surface morphology

was feathery with some natural residual compounds as flakes such as lignin and pectin

(Fig.VI.3a). After the laccase mediated grafting of guaiacol or syringaldehyde, G-g-LCFF

and S-g-LCFF present smoother and neat surfaces due to presence of phenolic units

128

covalently bonded to the surface of LCFF during the biografting process. The formation of

free phenolic radicals and the subsequent polymerization of lignin by laccase catalysis

redistributed the lignin on the lignocellulosic flax fibers surface and yield to glossy surfaces

[366].

Figure VI.3. SEM images: (a) raw (LCFF), (b) guaiacol-grafted and (c) syringaldehyde-grafted lignocellulosic flax fibers

VI.5.2.2. Crystallinity

The crystallinity of unmodified-LCFF and modified-LCFF (i.e. G-g-LCFF and S-g-

LCFF) was analyzed by X-ray diffractometry (figure VI.4). It is worth mentioning that the

surface of the fiber is covered with the grafted phenolic compounds which limits access to

the cellulosic or crystalline regions. As can be seen in figure VI. 4, G-g-LCFF and S-g-

LCFF exhibit lower crystallinity (i.e. 66 and 63%) as compared to raw lignocellulosic flax

fibers (LCFF: 76 %). The little decreasing in crystallinity is due to the grafting of guaiacol or

syringaldehyde [369].

129

Figure VI.4. XRD patterns of raw and surface-modified LCFF materials

VI.5.2.3. Thermals resistance

Thermal properties were derived from the TG and DTG curves. Fig. VI.5 depicts

the TG and DTG curves of unmodified-LCFF, G-g-LCFF and S-g-LCFF. As can be seen,

the first weight loss at about 100°C is due to the loss of water content in flax fibers. The

second one at about 260°C is generally ascribed to the degradation of hemicellulose,

lignin as well as phenolic compounds. Eventually, the last weight loss at around 380°C is

due the mainly to the degradation of cellulosic fibers. It is interesting to note that at this

high temperature the weight loss for the unmodified LCFF is about 70% while it is about

64% for G-g-LCFF and S-g-LCFF. The 6% difference corresponds approximately to the

percentage of bio-grafted phenolic compounds on the surface of LCFF.

Figure VI.5. TG and DTG of raw and surface-modified LCFF materials

130

VI.5.2.4. Hydrophobicity of unmodified and surface-modified LCFF.

The hydrophobicity of unmodified and grafted lignocellulosic flax fibres G-g-LCFF

and S-g-LCFF was derived from static water contact angle measurements (WCA). As

shown in Figure VI.6, the WCAs of G-g-LCFF, S-g-LCFF and unmodified LCFF were about

90.3° ± 0.2, 83.2° ± 0.3 and 63.6° ± 0.1 respectively. The increase of the WCA of modified

LCFF clearly confirm the grafting of guaiacol and syringaldehyde on the surface of the flax

fibres and the hydrophobicity increasing was possibly owing to the polymerization of lignin

on the LCFF surface caused by the coupling of enzymatic generated phenoxyl radicals.

These results are in agreement with those obtained by Dong et al. [360] when they

investigated the feasibility of laccase-mediated grafting dodecyl gallate onto the jute fibre

to enhance hydrophobicity.

Figure VI.6. Water contact angle of raw and surface-modified lignocellulosic flax fibres

VI.6. Conclusion

The present work demonstrated that covalent attachment of phenolic compounds

such as guaiacol and syringaldehyde onto lignocellulosic flax fibers surface was performed

by means of laccase-mediated approach. The biografting was confirmed by FTIR and

SEM characterization. In addition, it was shown that the laccase mediated process of the

flax fibers reached a maximum grafting ratio of 15,0 and 13.5 % with 6% of guaiacol or

syringaldehyde, when the grafting reaction was conducted at 40 °C for 24 hours in 1%

(w/v) flax fibers/Buffer solution pH 4.0 medium, with 40 U/g laccase. Eventually, the

contact angle measurement indicated that the surface hydrophobicity of the lignocellulosic

flax fiber was successfully increased by the biografting of phenolic compounds.

0

20

40

60

80

100

LCFF G-g-LCFF S-g-LCFF

Co

nta

ct

an

gle

(d

eg

)

131


Ce chapitre était une extension du précédent et a mis en évidence le greffage du

guaïacol et du syringaldéhyde sur les résidus solides de l’hydrolyse enzymatique ayant

conduit à la production des nanofibres, catalysé par la laccase.

Une optimisation des conditions de réaction a été réalisée afin de maximiser le

greffage du guaïacol et syringaldéhyde en variant la concentration en laccase, et en

composés phénoliques, ainsi que le temps d'incubation. Le greffage maximal du guaïacol

et du syringaldéhyde, soit 15.02 et 13.50 %, respectivement, a été atteint lorsque la

réaction de greffage a été réalisée à 40 °C pendant 24 heures, 1 % (p / v) fibres / solution

tampon pH 4.0, 6% (p/p) en composés phénoliques, et 40 U/g de laccase.

Les analyses structurales ont mis en évidence le greffage du guaïacol et

syringaldéhyde sur les fibres lignocellulosiques. Ces fibres fonctionnalisées ont présenté

une meilleure stabilité thermique et une hydrophobicité accrue comparativement aux fibres

brutes.

Ainsi ces fibres fonctionnalisées offrent des nouvelles fonctionnalités et propriétés

contraires aux nanofibres pouvant être exploitées dans les matériaux composites.

132

Conclusion générale et perspectives

Ces dernières décennies ont été marquées, dans le domaine des matériaux, par

l'évolution remarquable des composites à base de fibres naturelles qui sont de plus en

plus utilisés dans des applications extérieures et structurelles, notamment dans le

domaine de la construction, revêtement et emballage. Ce projet de doctorat s’inscrit dans

une thématique large visant à développer des biocomposites renforcés par des fibres ou

des nanoparticules lignocellulosiques produites au Canada et en particulier, les résidus de

la biomasse agricole Canadienne présents en quantités importantes. L’extraction de ces

fibres ou biorenforts ayant les dimensions nanométriques ainsi que leur modification de

surface restent indispensables. Ainsi, l'un des défis prioritaires à relever actuellement est

de trouver des voies et des moyens environnementalement irréprochables à ces fins tout

en contrôlant le coût de production.

Le but principal de cette thèse était de mettre en place un procédé de prétraitement

de la biomasse lignocellulosique, de fabrication de nanofibres lignocellulosiques et de

modification de surface de ces nanoparticules de fibres, environnementalement

irréprochable (vert) sur toute la ligne. Plus spécifiquement, il a été question de : i)

déstructurer la fibre de lin en utilisant le dioxyde de carbone (CO2) comme fluide

supercritique tout en évitant son fractionnement ; ii) extraire des fibres lignocellulosiques

ayant les dimensions nanométriques (nanofibres lignocellulosiques) par un cocktail

d’enzymes hydrolytiques et iii) utiliser la laccase comme enzyme pour induire le greffage

des composés phénoliques (guaïacol et syringaldéhyde) à la surface de ces nanofibres

lignocellulosiques pour leur compatibilisation.

Le travail a ainsi été divisé en trois volets principaux. Le premier volet a étudié les

effets du prétraitement de la fibre de lin au CO2 dans les conditions supercritiques. La fibre

de lin a été donc exposée à différentes conditions de prétraitement, et étant donné que le

prétraitement au CO2 supercritique est un procédé physico-chimique, les effets physiques

et chimiques sur la biomasse ont été évalués. Les résultats obtenus ont démontré que

physiquement, à la suite de la libération explosive de la pression, quelle qu’en soit la

condition, les analyses MEB ont révélé des fissures, trous ou érosions à la surface de la

fibre après le prétraitement, exposant ainsi les structures internes de la biomasse. Comme

conséquence, une augmentation de la cristallinité et un accès plus large aux enzymes

hydrolytiques ont été observés. Chimiquement, les résultats obtenus ont montré que la

133

composition chimique de la fibre de lin n’avait quantitativement pas subi une quelconque

modification après différents prétraitements au CO2 supercritique. Ces résultats similaires

à ceux reportés dans la littérature ont été mis en évidence et présentaient environ 64 % de

cellulose, 15 % d’hémicellulose et 2% de lignine. Les analyses IRFT ont qualitativement

bonifié ces résultats. Aucun changement significatif n’a été observé dans les groupements

fonctionnels identifiés dans la fibre après prétraitement. Ce premier volet a donc confirmé

l’hypothèse émise selon laquelle, le prétraitement au CO2 supercritique déstructurerait la

biomasse sans modifier sa composition chimique ou éviter son fractionnement et a permis

d’atteindre notre premier objectif spécifique.

Le deuxième volet visait l’extraction de la fibre de lin ayant les dimensions

nanométriques tout en se rapportant bien entendu aux conditions de prétraitement. Cette

extraction a été réalisée par hydrolyse enzymatique suivie d’une précipitation à l’éthanol

des oligomères. Ces oligomères constituaient ces fragments de fibres extraites. Dans les

conditions de prétraitement telles que présentées dans ce travail, il sied de prime à bord

de souligner que l’hydrolyse des biomasses prétraitées a conduit à une conversion de la

biomasse plus élevée comparativement à la biomasse brute. Après précipitation à

l’éthanol, la fibre de lin brute a conduit à des oligomères de degré de polymérisation (DP)

2, alors que la fibre de lin prétraitée à différentes conditions a conduit à des oligomères de

degré de polymérisation allant jusqu’à 5. Les résultats ont montré que la fibre prétraitée à

20 MPa et 70 °C, a conduit à l’obtention des microfibrilles de 1 à 10 µm de diamètre et

plusieurs micromètres de longueur, alors que les fibres ayant les dimensions

nanométriques ou nanofibres lignocellulosiques ont été obtenues à partir de la fibre de lin

prétraitée à 37.7 MPa et 70 ou 80 °C. Ces nanofibres lignocellulosiques en formes de

filaments présentaient un diamètre de 5 – 10 nm et plusieurs micromètres de longueur. Ce

deuxième volet a donc confirmé l’affirmation selon laquelle on pouvait extraire les

nanofibres par un cocktail d’enzymes hydrolytiques et a permis d’atteindre le second

objectif spécifique de ce travail.

Enfin, le troisième volet concernait la modification de surface de nanofibres

lignocellulosiques extraites par le greffage des composés phénoliques catalysé par la

laccase pour leur compatibilisation. Ce volet s’étend aussi aux résidus solides de

l’hydrolyse enzymatique ayant conduit à l’extraction des nanofibres. Le guaïacol et le

syringaldéhyde ont été greffés avec succès sur les matériaux lignocellulosiques à l'aide de

laccase, comme l'ont démontré des études IRTF, UV-visible et GC, soutenu par une

134

application positive pour augmenter l'hydrophobicité et doter une meilleure stabilité

thermique. Ce troisième volet a donc confirmé l’hypothèse selon laquelle la laccase, une

enzyme oxydoréductase pouvait induire la modification de surface des fibres

lignocellulosiques. Aucune réaction n'a eu lieu en l'absence de l’enzyme tel que l’a indiqué

la cinétique de réaction par les analyses GC. Ainsi le troisième objectif spécifique de ce

travail a été atteint.

Les résultats de cette étude semblent très encourageants mais soulèvent encore

beaucoup de questions pouvant faire l’objet de travaux futurs.

Nous suggérons donc de prime à bord, que ces nanofibres lignocellulosiques

extraites et fonctionnalisées puissent être évaluées dans un composite à matrice

hydrophobe pour les travaux futurs, ce qui serait une suite logique, puis étudier leurs

propriétés fonctionnelles telles que les propriétés mécaniques, antioxydantes et

antibactériennes ainsi que leur application en emballage dans le domaine alimentaire par

exemple.

Par ailleurs, ce travail peut être bonifié par une étude plus approfondie permettant

d’optimiser l’efficacité de la procédure d’extraction des fibres ayant les dimensions

nanométriques, surtout en termes de rendement, toujours en privilégiant des approches

écoresponsables.

Il faudra aussi améliorer la dispersion de ces nanofibres lignocellulosique dans la

solution enzymatique afin d’avoir des fragments de fibres individualisés. Une étape de

sonication plus longue et intense pourrait être la solution.

Enfin, il serait aussi intéressant de déterminer la quantité des composés

phénoliques (guaïacol et syringaldéhyde) greffé sur les nanofibres lignocellulosiques

fonctionnalisées et aussi de déterminer la structure des entités phénoliques qui s’y fixent

pour comprendre le mécanisme réactionnel mis en jeu. Des analyses structurales plus

poussées pour essayer d'identifier les types de liaisons établies entre la fibre et les

produits d'oxydation du guaïacol et du syringaldéhyde seraient souhaitables.

135

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