This article was downloaded by: [Texas State University, San Marcos]On: 20 September 2013, At: 18:58Publisher: Taylor & FrancisInforma Ltd Registered in England and Wales Registered Number: 1072954Registered office: Mortimer House, 37-41 Mortimer Street, London W1T 3JH,UK

Analytical LettersPublication details, including instructions forauthors and subscription information:http://www.tandfonline.com/loi/lanl20

Extraction Rapide de la CafeineUrinaire Sur Cartouche C18 EtDosage Par ChromatographieGazeuseJ. M. Duthel a , C. Mignot a & J. J. Vallon aa Laboratoire de Biochimie, Toxicologie et Analysedes Traces (Professeur J.J. VALLON) Hôpital EdouardHerriot et Laboratoire de Chimie Analytique III,Faculte de Pharmacie, Lyon, FrancePublished online: 23 Oct 2006.

To cite this article: J. M. Duthel , C. Mignot & J. J. Vallon (1989) Extraction Rapidede la Cafeine Urinaire Sur Cartouche C18 Et Dosage Par Chromatographie Gazeuse,Analytical Letters, 22:11-12, 2627-2636, DOI: 10.1080/00032718908052380

To link to this article: http://dx.doi.org/10.1080/00032718908052380

PLEASE SCROLL DOWN FOR ARTICLE

Taylor & Francis makes every effort to ensure the accuracy of all theinformation (the “Content”) contained in the publications on our platform.However, Taylor & Francis, our agents, and our licensors make norepresentations or warranties whatsoever as to the accuracy, completeness,or suitability for any purpose of the Content. Any opinions and viewsexpressed in this publication are the opinions and views of the authors, andare not the views of or endorsed by Taylor & Francis. The accuracy of theContent should not be relied upon and should be independently verified withprimary sources of information. Taylor and Francis shall not be liable for anylosses, actions, claims, proceedings, demands, costs, expenses, damages,and other liabilities whatsoever or howsoever caused arising directly or

indirectly in connection with, in relation to or arising out of the use of theContent.

This article may be used for research, teaching, and private study purposes.Any substantial or systematic reproduction, redistribution, reselling, loan,sub-licensing, systematic supply, or distribution in any form to anyone isexpressly forbidden. Terms & Conditions of access and use can be found athttp://www.tandfonline.com/page/terms-and-conditions

Dow

nloa

ded

by [

Tex

as S

tate

Uni

vers

ity, S

an M

arco

s] a

t 18:

58 2

0 Se

ptem

ber

2013

ANALYTICAL LETTERS, 22(11&12), 2627-2636 (1989)

EXTRACTION W I D E DE LA CAFEINE URINAIRE

ET DOSAGE PAR CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE SUR CARTOUCHE C18

MOTS-CLES : cafhe, extraction, urine, chmatqgaphie gazeuse

J.M. Duthel, C. Mignot. J.J. Vallon*

*Labratoire de Biochimie, Toxicologie et Analyse des Traces (professeur J.J. VALLON) H6pital Edouard Herriot et Laboratorre ' dechimie Analytique III, Facultd de Pharmaue, Lyon, France.

RESUME Une methode &extraction rapide sur cartouche C18 de la & h e urinahe est

prop& envuedu dosage par chrmnatographieenphase gazeuse dansle cadre des

umtr6les antidopage chez les sportifs. Le choix de Petalon et des conditions o p b -

toires a etd guidd par la n M t d de disposer dime dthode rapide.

L'extraction de la caf&e en phase inverse C 1 8 est obtenue avec un rende-

ment de 98 % et un coefficient de variation de 3 Yo. Dans ces conditions, un & a h -

nage interne a l'extraction n'a pas etd jug6 nkssaire. L'etalon interne choisi pour la

chromatographie &azeuse est l'amobarbital en laisan de sea avantages : temps de n5-

tention, stabilitd thermique, i nMt en fragmentom&ie de masse.

2621

C o p y r b t 0 1989 by Marcel Dekker, Inc.

Dow

nloa

ded

by [

Tex

as S

tate

Uni

vers

ity, S

an M

arco

s] a

t 18:

58 2

0 Se

ptem

ber

2013

2628 DUTHEL, MIGNOT, AND VALLON

ABSTRACT

A mpid method for Urinary caffeine excractiOnon C18 carhidge before GC

determination is pmposed in view of doping mtr& in sport ?he choice of the

standard and of the analytical procedure has been directed by the necessity of rapid

determinati on.

Caffeine extraction on C18 reverse-phase is achieved with a good efficiency

(recovery : 98 %, CV = 3 Om), so that use of an intemal standard was not found ne-

cessary. A m O ~ l t a l was c h m as internal standard in Gc because of several ad-

vantages : retention time, thermal stability, interesting properties in mass fYagmen-

m e w .

INTRODUCTION

La &kine (1,3,7 - trirnethylxanthine) est d o t d q u e , diurktique et stimu-

lank du systkme nerveux central. Outre sa tnk large consommation mondiale sous

forme de boissons (cafk, thk, cola), elle est utilistk par les sportifs mmme substance

dopante car ene fadite l'ef€ort prolong6 et la performance tout en diminuant

l'impression subjective deffort 1.

Les contrijles antidopage ont un certain nombre d'exigenm parmi lequelles

la mpidi~ de +me et des seuils de ditection assez bas pour pennettre de dbler le

dopage m h e sur des ichantillons urmaires de faible volume ou pour des

concentrations faibles dans le milieu biologique. La m6thode que nous pmposons

nipond ces exigenm.

Les method- de dasage par CPG de la d&ne dans lis milieux biologiques

font appel, dam la plupart des as, A l'extraction liquide-liquide 2, . . . I 13.

L'extraction liquide-liquide cunventionnelle prbnte l'inumvMent d'&e amsom-

matrice dedvant et detempp : uneexixactimmubipleestsouvent n m A

Dow

nloa

ded

by [

Tex

as S

tate

Uni

vers

ity, S

an M

arco

s] a

t 18:

58 2

0 Se

ptem

ber

2013

EXTRACTION RAPIDE DE LA CAFEINE URINAIRE 2629

l'obtention de bons dements . Elle inWuit, en outre, un facteur de dilution @-

judiciable a la sensibilitk, a moins d'kvaporer le solvant. certains auteurs 141 15 ont

chemhe a diminuer la du& des manipulations par l'utilisation dune extraction

liquide-liquide ap&j immobilisation de la phase aqueuse sur support inerte pulveru-

lent [Extrelut W>I. ~a methode evite la formation &emulsions, diminue Ie temp

devaporation des solvants, et ses rendements dextraction Font elevb. Un de ses

inmnvhienrs est le volume important de solvant nkessaire a l'extraction (20 a

40 ml).

L'extraction en phase solide de la cafeine a partir des milieux biologiques a

e~ jusqu'a maintenant peu UW. ~ z e t o et mu. 16 ont employe Yextraction en

phase inverse C18 pour son isolement a partir de plasma de chien avant identiiica-

tion par chromatographie sur couche mince. De m h e , Hartwick et coll. 17 l'ont

appliqk au &rum avant dosage par CLHP. Les autres applications concernent des

extractions a partir &aliments 181 19 avant dosage par CLHP.

Les avantages de l'extraction solide-liquide sur phase C18 son1 nom-

breux 2 0 : outre la rapidig, en gh&d 12 fois plus grande qu'en extraction liquide-

liquide, et la silectivitk obtenues, on peut avoir un effet de concentration qui rrhlte

des petits volumes nkessaim aux &apes de lavage et &elution. Ces raisons ont

guide notre choix pour l'exrraction rapide et simple de la cafhe urinake avant

chmatoprhie gazeuse.

PARTI EEXF'ERIMENT ALE

A p p i I k W

- Chromatographe en phasc gazeuse Packard, modde 427, &pipe d'un in-

jecteur & Ross et d'un dttecteur a ionisation de flamme ~ l i i a un mt@akur

Hewlett-Packard, modde 3380 A.

Dow

nloa

ded

by [

Tex

as S

tate

Uni

vers

ity, S

an M

arco

s] a

t 18:

58 2

0 Se

ptem

ber

2013

2630 DUTHEL, MIGNOT, AND VALLON

Mawel et rt!acJ&

- Cartouche C18,3 lob d i f f h b ut ibb, SEP-PAKwDh Mil l ipcdND),

- pH m&e, PHN 75 [Tacussel],

- Colonne caplllaire en silice fondue B phase greffk, SPB- 1, 30 m

x 0,32 mm ID x 0,25 pm d'kpaisseur de film [SupelcoWD)1,

- Chlorofonne, mkthanol et &an01 A 95 %, Uvasolm), (Merck],

- Eau pour prkparations injectables,

- Cafdne d o n n e B la I X h e a o n de la Pharmaqke Franpk, Coo@-

ration Phanrlaceurique Ran@, Melun,

- Amc'm&(al [Laboratoire de l'I.S.H., 97 rue de Vaugiraxd, 75006 Paris].

tion par chng&gradue eaZeu se

C k i x de l ' a o n jntgme LA linkratme indique l'utilisation d'etalons internes les plus divers :

lchmine 2, vinbarbital3, 9, phthdtine 4, phtalate de dicydohexyl l , m6piva-

caine 8, hexcdmbital12.

Notre choix s'est porti sur un barbiturique, l'amobarbital. Ce com-

podde en effet des propri6th int15msantes : temps de &ention voisin de celui

de la &kine (voisins respectivement de 7 minutm et 9 minutes a 170" C) et diffkent

de ceux des m6tabiites de la cafkine, stabilitk thennique n'obligeant pas a d&iver le

produit (stable jusqu'a 270" C), h e solubilitk dans le chloroforme, bonne &k-

tion en spectrm&ie de mase en vue des 6tudes mhboliques (fragment principal

intense A d e : = 156).

M o d e w h t o h

La &paration h-hique est effectutk en isotherme a 170" C.

L'iijecteur de Robs est a 260" C. Le gaz vecteur est l'azote R sous un debit de

1,5 mlhnin. IR d&&w ionisation de hnme estP 260" C.

Dow

nloa

ded

by [

Tex

as S

tate

Uni

vers

ity, S

an M

arco

s] a

t 18:

58 2

0 Se

ptem

ber

2013

EXTRACTION RAPIDE DE LA CAFEINE URINAIRE 2631

- Etude du coeffient de rhome

Nous avons effectue trente injections SUCCeSSives de melanges

cafkine-amobabital (a 50 pg/ml dans l'&anol) cOrreSpOndant a une concentration

Urinaire de 5 c1B/ml. Les rhltals mdiquent un coefficient de dponse egd a 0,7 10 k

0,003 (CV = 0,4 %).

Nous a v m aussi ophe it des temptkatures de colonne s i t u h entre

170et 190" C : dans cetintervalle, le coefficientde n5pcmse resteconstant.

Etude de I'extractiOn solide-liquide sur phase C18

Nous avom utilist5 dea cartouches C18 amtenant 350 mg de phase greffk.

Un Cchantillon de 10 ml d'urinc a &d p a d lentement sur la cartouche. L'elution a

& faitt par 4 ml dc chlorofm. A@ evaporation du chlomforme sous courant

d'amtc, le d d u a6tkrcpris par400 pl d'etalon (amobarbital) a 125 clghnldans

l'&hmd. L'mjcdicm dc 1 pl dans k chromatographe a etd faite par injecteur de

Ross.

ence du DH de l'h

Avec le protcmle pkkdent, now a v m etudie l'influence du pH de

l'urine sur le rendement d'extrsction en chargeant des urines exemptes de bases

xanthiquesavecde lad t ihe bla concentration de 5 pg/ml. La figure n"1 montm que

le d e m e n t d'exhaction de la cafhe est maximum et constant en- pH 4 et 9. Il

diminue enmilieu plus acide.

Dans la suite de cette h d e , nous avons d&dd d'o- dkectement sur des

urines non tampom& mutes les lois que les echantillons pdsentalent un pH dans

la zone habituelle, entm 4 3 et 73.

Dow

nloa

ded

by [

Tex

as S

tate

Uni

vers

ity, S

an M

arco

s] a

t 18:

58 2

0 Se

ptem

ber

2013

2632 DUTHEL, MIGNOT, AND VALLON

1 2 3 4 5 6 7 0 9 10 PH

Figure 1 : Influence du pH sur l'emaction de la af&e

'extractl 'on avec et sans 6 ta- !&nm&um du a&&ient de wn,&m de 1 . .

1-e intanegg&wbarM

Tmte 6chantillom d'urmes d 6 p o m debases xanthiques ont 6td

a d d i b m h de 5 Mml de caf6ine et d'mobarbital (6- mteme). Les rhltats

obtenus (tableau 1) mmtrent que le taux m o p de cafhe m e s d est de 5,13 pg/m.l

f 0,47. Le coeffiaent de variation est de 9 %.

Tmte autrea khantillons d'uinea d6pourvus de bases xanthiques

ont ensuite 6td a d d i t i d de 5 pghl de cafhe et le &idu sec del'&uat chloro-

foxmique a 6t6 repria par 400 pl d'amobarbital A 125 pghl dans l'6thanol

(&alonnage extaae). Les taux de c a f b ont& caIcul4a Al'aide du coefEcient de

n5ponse parrappopt hl'amobarbbl. Le tauxmoyenurinafre (tableau 1) est 6galA

4,92 pgbl dzvine f 0,14 (CV - 3 %).

Cesessais montrent quela c a f k u r h h estexlraite en phase m-

verse WIT avtouche Ci II avec un mdement M e de 100 %. Avec l'&alonnage

Dow

nloa

ded

by [

Tex

as S

tate

Uni

vers

ity, S

an M

arco

s] a

t 18:

58 2

0 Se

ptem

ber

2013

EXTRACTION RAPIDE DE LA CAFEINE URINAIRE 2633

TABLEAU 1

Cafkine en &ml d'urine (thhxie : 5,O &ml) avec &ahnage interne (A) et exteme (B).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

5,66 5,OO 4,79 5,65 4,66 5,27 5,45 4,99 3,99 5,73 4,15 4,96 5,07 5,15 5,52

4,54 4,93 5,06 4,93 5,03 4,99 4,59 4,97 4,94 5,06 4.81 4,92 5,OO 4,89 4,90

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

5,12 4,52 4,99 459 5,5 1 5,09 5,30 5,37 540 S,56 4,79 5,39 5,47 4,69 6,03

4.87 4,94 494 5,08 4,94 5,Ol 5,13 4,85 5,Ol 4,64 5,04 4,86 4.85 5,OO 4,89

n = 30 A B

x 5,13 4,92 0 0,47 0,14

cv % 9 3

Dow

nloa

ded

by [

Tex

as S

tate

Uni

vers

ity, S

an M

arco

s] a

t 18:

58 2

0 Se

ptem

ber

2013

2634 DUTHEL, MIGNOT, AND VALLON

n

- 04143 + 0,9833~ r = 0,999 ( I )

0,0167 + 0,9667~ r = 0,999 (2 )

SANS ERTRACT ( 1 ) ( 2 )

figure 2 : Etude de la h&tk .

exteme, la reproductibW est bonne (CV = 3 %). Par amm, ene est mauvaise

(CV = 9 %) lorsque l'amobarbital sert d'ktalon interne de Pextraction. La raison est

la mauvaise ,reprodudibW de l'extraction du barbiturique.

Ces observations now conchisent B prkmiser l'emploi de

l'amobarbital en &alunnage exteme mqk-tenu des nombreux avantages obse1~6a

pour ce barbiturique et h o n k plus haut

- Ljndalig

Elle a & ttudi6-e de 0,3 B 10 clg/ml pour les solutions pures de ca-

f&e et pour les uxines chargh. La figure n"2 montre que, dans l a deux cas, la li-

ntkitk est excellente jusqu'h 10 pg/ml.

- &dement de l'exlraction

Le rendement de l'extraction sur cartouche est voisii de 100 %

(98 %).

Dow

nloa

ded

by [

Tex

as S

tate

Uni

vers

ity, S

an M

arco

s] a

t 18:

58 2

0 Se

ptem

ber

2013

EXTRACTION RAPIDE DE LA CAFEINE URINAIRE 2635

- RWbilid

Le tableau 1 a montri pr+demment que la r+$tabiliti sur 30 khan-

tillons d'urine chargb a 5 pglml est trb bonne (CV : 3 %).

- Limite de d W o n

Elle a & calculk en p a n t les valeurs du bruit de fond moyen

(exprimh en unit& de surface) de part et d'autre du pic de cafiine. Le doublement

de cette valeur moyenne fournit la limite de detection qui a etk ainsi mesunk a

0,25 pgfml d'urine.

DISCUSSION

La mkthode proposk. s'est av& ftable ei reproductible. ELle est adaptable a

des extractions en dries, automatis&. Elle a, en outre, l'avantage de la simplicid et

de la rapiditi : 10 a 15 minutes s u f f i i t a l'obtention d'un n%du sec disponible

pour la chromatographie. Nous a v m v*e qu'elle s'applique aussi a i'extraction

des principaux metabolites de la d & e (thi&mnine, paraxanthine et thhphyhe)

et a leur dosage par couplage GCMS. Cette utilkation pour des etudes metabohques

fera l'objet d'une prochaine publication. Le bon rendement de l'extraction et son

faible coefficient de variation justifient l'ateence d'etalonnage interne. L'amobarbital

a ed choisi comme etalon de l'ktape chmmatogmphique pour son temps de ktention

diffhent de ceux de la &kine et cie ses metabolites. En outre, ce barbitwique pd-

sente. en spectromebie de masse, union intense a d e - 156 parfaitement adaptk A la

fragmentomebie de masse et a m etudes m&boliques sur la &he .

BIBLIOGRAPHIE

I . F.T. Delbeke, M. Debackere, Int. J. Sports Med., 5, 179, (1984)

2. S. Stavchansky, A. Loper, J. Pharm. Sci., 21, 194, (1982)

Dow

nloa

ded

by [

Tex

as S

tate

Uni

vers

ity, S

an M

arco

s] a

t 18:

58 2

0 Se

ptem

ber

2013

2636 DUTHEL, MIGNOT, AND VALLON

3. J.L. Brazier, D. Delaye, M. Deaage, A. Bannier, J. Chromatogr., 224,439, (1981)

4. J.M. Seegers, M. O m , L.P. Jager, J. VanNoordwijk, J, Pharm. sci., B, 900, ( 1 9 W

5. S. Floberg, B. Ljndstrom, G. Lonnerholm, J. Chromatogr., 22L, 166, (1 980)

6. I.D. B&&k C.A. James, P.J. Morrison, H.J. Rogers, J. Chromatogr.,

7. H. Milon. J.A. Anumioli, J. Chromatogr., 162,223, (1979)

161, 118, (1979)

8. J.L. Cohen, Chi Cheng, J.P. Henry, Yuen Ling Chan, J. P h m . Sci., 42, 1093, (1978)

9. J.L. Brazier, H. Renaud, B. Ribon, G. Faucon, J. Sassard, Thtkapie, 23, 341,

10. R.L. Merriman, A. Swanson, M.W. Anders, N.E. Sladek, J. Chromatogr.,

11. M. Johnsgard, Y. Torud, K. Tmby, B. Salvesen, Medd. Norsk Farm.

(1978)

- 146, 85, (1978)

Selsk., 40, 33, (1978)

12. D. Lavene, M. Guerret, H. Humbert, J.L. Kiger, Ann. Phann. Fr., 3 2 , 5 0 5 , (1974)

1 3. T. Hirai. H. Kondo, Analytical Sciences, 4, (2). 19 1, (1 985)

14. F.T. Delbeke, M. Debackere, J.Chrornatogr.,325, 304, (1985)

15. F.T. Delbeke, M. Debackere, J. Chromatogr., 278, 418, (1983)

16. D.W. Szeto, F.L.S. Tse, J. High Res. chnnn. & m o m . Commun., 4, 305, (1981)

17. R.A. Hartwick. D. Van Haverbeke, M. McKeag, P.H. Brown, J.Liq. Chrom., 2,725, (1979)

18. H. Terada, Y. -be, J. Chrom.,291,453, (1984)

19. W.J. Hurst, R.A. Martin Jr., J. Uq. chnrm., I, 585, (1982)

20. B. T¶ppins, Int. Laboratory, iz, (3), 28, (1987)

21. F. De Fabrido. J. Phann. Sd, he, 854, (1980)

Received April 3 1989 Accepted August 18, 1989

Dow

nloa

ded

by [

Tex

as S

tate

Uni

vers

ity, S

an M

arco

s] a

t 18:

58 2

0 Se

ptem

ber

2013