Cours UE 7 n° 2

Professeur N. Charnaux

Ronéotypeurs :

- partie 1 : Chériaux Laura

- partie 2 : Lumbu Hermann

Fonctions des protéoglycanes à héparane sulfate

Quelques abréviations pour ce cours :

IC intracellulaire

EC extracellulaire

GAG glycosaminoglycane

PG protéoglycanes

Aa acide aminé

Structure et fonction PG et GAG

Quand on regarde une cellule on se rend

compte que beaucoup de composants du

milieu EC sont susceptibles d’avoir un effet

sur la cellule. Ces composants jouent un rôle

particulièrement important car ils induisent

des effets biologiques sur une cellule (ex :

prolifération, migration, communication

cellulaire). Les protéoglycanes à héparane

sulfate membranaires sont des molécules

susceptibles de lier de nombreux ligands entre

autre par des interactions avec des chaines

glycosaminoglycaniques.

Ils peuvent êtres des récepteurs de ligand EC

avec un effet biologique sous jacents.

Les PG sont constitués d’un corps protéique sur lequel sont Oliés par O glycosylation des chaines

glycosaminoglycaniques. On retrouve plusieurs types de PG dans la matrice EC mais nous ne parlerons ici

que des PG membranaires qui expriment des chaines héparane sulfate

Un GAG est une chaine polysaccharidique non ramifiée composée d’une répétition d’un disaccharide (n

répétitions). Le disaccharide est constitué de deux monosaccharides :

- un acide uronique : soit l’acide D glucuronique soit l’acide L iduronique

- ose simple aminé de type D acétylé : soit N acétyl glucosamine (obtenu par acétylation du glucose)

soit N acétyl galactosamine

Ose aminé : ose dans lequel on a remplacé un groupement hydroxyle par un groupement amine

Acétylation : par réaction avec une molécule d’acide acétique on a un groupement NH2 acétylé

Les glycosaminoglycannes ou GAG

RAPPEL

glucose

C

C

C

C

C

C

OHH

OHH

HO H

OHH

H O

OHH

H

ose

acidification

acide uronique

C

C

C

C

COOH

C

OHH

OHH

H OH

OHH

H O

acide glucuronique

O

OHNH2

CH2OH

HO

HO

glucosamine

O

OHNH

CH2OH

HO

HO

C O

CH3

N-acétyl-glucosamine

(GlcNAc)

Osamines : remplacement d’un grpt –OH par –NH2

Acétylation de l’osamine

On trouve différentes familles de GAG :

- acide hyaluronique

- chondroitine sulfate/dermatane sulfate (globalement la même famille)

- héparine/héparane sulfate

- kératane sulfate

Biosynthèse des héparanes sulfates

Les molécules d’héparane sulfate sont chargées négativement :

1) du fait de la présence de groupements carboxyliques COOH qui deviennent COO- en solution

2) car les chaines de type héparane sulfate sont fréquemment sulfatées

BIOSYNTHÈSE DES HÉPARANES SULFATE

1- attachement d’un tétrasaccharide de liaison (Ser, Thr)

2- polymérisation d’un dissacharide [glycosyltransférases]

20 à 80 disaccharides

3- modifications des disaccharides : épimérisation,

sulfatation

Motifs de liaison uniques

Reconnaissance spéficique de ligand

Quand on s’intéresse à la biosynthèse des PG en particulier à l’association de chaines de type héparane

sulfate sur un corps protéique on s’aperçoit qu’il y a différentes étapes :

1) Oglycosylation : liaison covalente d’un tétrasaccharide (xylose galactose acide glycuronique) sur une

serine thréonine dans le golgi

2) Polymérisation du disaccharide par une glycosyltransferase

Le nombre de disaccharides est très variable d’une chaine héparane sulfate à l’autre : entre 20 et 80

répétitions de disaccharides.

Il existe des modifications très importantes des disaccharides en termes :

- d’épimérisation (acide D glycuronique peut être épimérisé en acide L iduronique)

- de sulfatation (possibilité d’avoir des 2-O sulfatases, 6-Osulfatases qui vont sulfater les sucres et

donc donner globalement à ces GAG une charge négative)

Les GAG de type héparane sulfate sont composés à l’origine d’un même disaccharide mais sont modifiés par

épimérisation ou sulfatation. Ces modifications vont générer le long de la chaine des motifs de disaccharides

uniques. L’existence de ces motifs uniques rend les GAG susceptibles de lier des facteurs de croissances ou

chimiokine (la liaison semble être spécifique). On parle ainsi d’héparanome (sorte de code moléculaire). On

essaye de séquencer les motifs disaccharidiques qui vont spécifiquement lier tel ou tel facteur de croissance

ou chimiokines mais il se pose un problème méthodologique : séquencer des sucres est très difficile.

Diversité structurale des héparanes sulfates

Les chaines héparanes sulfate présentent

une diversité structurale très importante :

- elles portent une information

considérable

- une séquence est en théorie égale

à un site d’interaction

- cependant il se pose une

difficulté méthodologique =on

séquence très mal les sucres

contrairement aux protéines et à

l’ADN

Néanmoins on arrive globalement à appréhender qu’une 2-O sulfatation, une 6-Osulfatation est nécessaire à

la reconnaissance de ces chaines héparanes sulfate par un facteur de croissance de type FGF2.

De la même manière une 3-O sulfatation est nécessaire dans la reconnaissance d’une molécule de type

antithrombine. A l’inverse si on a un déficit enzymatique de type 2-O transférase on pourra avoir une

anomalie de la signalisation du FGF2.

HS

n = 20 to 100

O

DIVERSITÉ STRUCTURALE DES HÉPARANES SULFATE

N-Ac

OHOO O

OOH

HOOH

COO-

N-SO3-2-O-SO3

-

6-O-SO3-

3-O-SO3-

1) Une information considérable

2) Une séquence = Un site d’interaction

3) Une difficulté méthodologique

Exemples : - 2-O sulfatation et 6-O sulfatation reconnaissance FGF-2

- 3-O sulfatation reconnaissance anti-thrombine

- Déficit en 2-O sulfotransférase : anomalie de la signalisation du FGF-2

Syndécanes :

Les syndécanes sont des protéoglycanes à héparane

sulfate membranaires, présentant également des chaines

chondroitine sulfate. Il existe 4 familles de syndecanes

chez les vertébrés.

Structure :

- un domaine cytoplasmique

- un domaine transmembranaire

- un domaine extracellulaire

domaine cytoplasmique

Domaine court avec 2 régions conservées d’un membre à l’autre de la même

famille : C1 et C2 et une région variable V

Régions conservées :

- C1 : région adjacente à la membrane, impliquée dans la dimérisation

des syndécanes. C1 est capable d’interagir avec de nombreuses

molécules et notamment de se lier avec des protéines IC comme :

ezrine, tubuline ou Src kinase. C1 est identique dans les 4

syndécans

- C2 : présente des sites de liaison PDZ avec des protéines comme :

syntenine, synectine, synbindine, calcium/calmoduline-dépendant

serine proteine kinase SAR kinase

Région variable V : région moins conservée, hétérogène, mais intéressante car

présente un site de liaison PIP2. Cette liaison PIP2 va permettre l’interaction

avec des effecteurs moléculaires de type PKC → le site de liaison PIP2 joue un

rôle important dans la liaison et l’activation de la PKC. Les syndécanes sont

donc des molécules capables d’émettre une signalisation IC

domaine TM

Domaine hydrophobe très conservé. Ce domaine est impliqué dans le

dimérisation des syndécanes

domaine extracellulaire

Ce domaine porte majoritairement des chaines héparanes sulfate mais

également pour certains PG comme syndécane 1 porte des chaines de type

chondroitine sulfate avec une séquence consensus d’attachement de GAGs)

→ce domaine EC est le siège de modifications post-traductionnelles +++. Ce

domaine présente un degré de similitude dans les ectodomaines relativement

éloignés d’un syndécane à un autre.

Il existe aussi 2 autres grandes familles

de PG à héparane sulfate membranaires :

- glypicane (5 membres chez

l’homme → glypicane est une

protéine intrinsèque liée de façon

covalente au feuillet EC de la

membrane plasmique par ancre GPI

donc n’est pas une protéine

transmembranaire)

- βglycane

V : 1 site de liaison PIP2

Régulation de l’expression des syndecannes par les facteurs de croissance

Expression :

SD-1 : tissus épithéliaux et mésenchymateux

SD-2: cellules neuronales et épithéliales

SD-3 : tissu neuronal

SD-4 : ubiquitaire

Régulation de l’expression par des facteurs de croissance :

TNF-alpha SD-2 ↓ SD-1 dans les cellules épithéliales

TGF beta SD-4 ↓ SD-1 dans les cellules épithéliales

FGF2 SD-4 dans les cellules musculaires

SD-4 lors de processus de réparation cellulaire (IDM, affections artérielles)

SD-3 et développement

Pr appréhender la fonction d’une protéine on peut utiliser :

- un KO de gènes in vivo

- une technique in vitro appelée ARN interférence. Cela permet d’éteindre un gène ou d’en diminuer

l’expression : on intercale de petits ARN (de 19 nucléotides) qui vont se fixer sur un gène d’intérêt

→ conséquence : le gène d’intérêt qui aura fixé ces ARN interférents sera soit dégradé soit aura sa

traduction diminuée

Gene Mutant Species Developmental processes affected Signaling

Processes

affected

SD-1 KO Mouse Viable and fertile

slow re-epithalization during wound healing; leukocyte–

endothelial interactions

Wnt1

SD-2 Anti-SD2

oligonucléotidesZebra

-fish

Intersegmental vessel formation VEGF

SD-3 KO Mouse Viable and fertile; feeding behavior; hippocampus-

dependent memory function; muscular dystrophy

HGF, FGF2

SD-4 KO Mouse Viable and fertile; postnatal angiogenesis during wound

healing; focal adhesion formation; sensitivity to infection.

HGF, FGF2,

TNF beta

Syndecans functions in animal models

Expériences : on utilise soit un KO soit des oligonucléotides anti syndécane 2

Résultats : On s’est aperçu que globalement les souris étaient viables et que surtout un certain nombre de

processus de signalisation Wint, EGF, FGF2 étaient perturbés avec un phénotype particulier affecté

Ex : la souris KO syndécane 4 est viable mais présente des problèmes d’angiogénèse, des problèmes au cours

de la réparation tissulaire, des problèmes de formation de contact focaux et des sensibilités aux infections

→ Ce phénotype particulier est lié à un processus de signalisation du HGF, du FGF2 ou du TNFβ affecté

Ces molécules qui lient des ligands EC sont donc susceptibles de jouer un rôle dans la signalisation

cellulaire.

A quoi servent les PG à héparane sulfate ? (mécanismes d’action)

Ex du FGF2

La famille FGF est une famille de facteurs de croissance héparin-binding protéine (protéine monomérique

susceptibles de lier des chaines héparane sulfate). Ces facteurs de croissance interviennent largement dans

l’angiogénèse, dans la réparation tissulaire, dans le développement, dans l’athérosclérose… Classiquement

ce sont des molécules qui vont se lier à des récepteurs de type tyrosine kinase (récepteurs membranaire) mais

également à des chaines héparanes sulfate.

Quelques ligands des héparanes sulfate:

• Cytokines• Chimiokines

• Facteurs de croissance• Morphogènes• Récepteurs

• Molécules d’adhésion• Matrice extracellulaire

• Enzymes• Inhibiteurs• Lipoproteines

• Pathogènes

• Inflammation/Réponse immune

• Prolifération/Différentiation

• Adhésion cellulaire/migration

• Métabolisme/Homéostasie

• Adsorption/Entrée

DIVERSITÉ FONCTIONNELLE DES HÉPARANES SULFATE

> 300 Protéines La plupart des fonctions biologiques

?

Structure de FGF2 :

Dans FGF2 on trouve une région cœur

avec des acides aminés conservés et 12

feuillet béta → on regarde d’un peu plus

près (en rose au niveau du feuillet béta 1-2

et béta 10-11 on trouve des zones

d’interaction avec chaines héparanes

sulfate (liaison à l’héparine Kd = 10-9

M)

→ donc cela implique qu’il existe des

acides aminés impliqués dans la liaison

avec les chaines héparane sulfate. Cela

concerne les acides aminés positifs :

lysines, arginine, histidine (aa basiques)

On cherche la région protéique qui interagit spécifiquement avec les chaines GAG :

Pour identifier les aa qui interagissent avec les chaines GAG on fait de la mutagénèse dirigée, c'est-à-dire

qu’on transforme par ex une arginine en alanine dans la séquence (on change un aa basique par un aa plus

neutre ex alanine), puis on met en contact avec le GAG et si on n’a plus de liaison cela signifie que l’aa était

impliqué dans la liaison.

Technique d’interaction entre 2 protéines ou d’un sucre avec une protéine :

On utilise la résonance plasmonique de surface : on fixe sur une surface d’or une molécule d’intérêt et on

fait passer dans un système de fluide une deuxième molécule pour voir si elles interagissent. Lorsqu’on

bombarde notre puce d’or avec de l’infra rouge, on constate qu’il y a un angle de diffraction et que cet angle

peut varier en fonction de l’interaction ou non de la molécule → cela donne directement le Kd

Modulation de l’activité du FGF par les PG à héparane sulfate

Modulation of activity of fibroblast growth factor (FGF)

by heparan sulfate proteoglycans

(Pool de réserve de FGF-2)

(Complexe de haute

affinité)

(changement de

conformation)

Il existe 2 rôles majeurs de l’interaction FGF2 avec syndecane 4 :

1) présentation de FGF2 à son récepteur Tyrosine kinase : pour qu’il y ait transduction de signal et

présentation optimale du FGF2 à son récepteur membranaire il faut qu’il y ait en amont une liaison à

des chaines glycosaminoglycaniques portées par le syndécane 4 → cela forme un complexe de

haute affinité

Il existe aussi pour le FGF2 des interactions avec des PG de type matriciel qui vont constituer un

pool de réserve de FGF2 qui pourront être libérés à la demande

2) signalisation propre

Signalisation propre

Volk, R. et al. J. Biol. Chem. 1999;274:24417-24424

Syndecan-1, syndecan-4, glypican-1, and syndecan/glypican chimera constructs

SIGNALISATION

Construction de chimères :

On prend l’ADN complémentaire qui code un PG héparane sulfate qui est lié par une ancre GPI (ex

glypicane 1) et on prend l’ADN complémentaire qui code pour le syndécane 4.

On construit au labo 2 chimères c'est-à-dire qu’on obtient un ADN complémentaire qui va se transformer en

protéine qui contiendra soit :

- toute la partie EC du glypicane 1 (ectodomaine) et la partie IC du syndécane → protéine

membranaire

- le domaine EC de syndécane 4 (ectodomaine) et la partie Cterm de la protéine qui correspondra à

l’ancre GPI du glypicane

Une dois cette construction au labo réalisée, on transfecte puis on induit la croissance des cellules avec du

FGF2.

Observations : On remarque que seules les cellules qui ont été transfectées et qui surexpriment le

syndécane 4 ou la protéine chimérique de type glypicane 1 EC/syndécane 4 IC vont avoir une réponse

augmentée au FGF2 en terme de prolifération. Les cellules infectées avec un plasmide qui vont surexprimer

la protéine chimérique syndécane 4 EC et ancre GPI du glypicane 1 ne vont pas proliférer sous FGF2.

Déduction : la partie IC du syndécane 4 est importante dans la signalisation du FGF2

Effet de syndécane :

Volk, R. et al. J. Biol. Chem. 1999;274:24417-24424

Effect of syndecan-1, syndecan-4, glypican-1, and syndecan/glypican chimera construct expression on bFGF-induced growth in vitro

-Only cells expressing S4 and G1-S4 constructs

demonstrated an enhanced responsiveness to FGF2

-Removal of syndecan-4 HS chains also blocked

enhanced FGF2 responsiveness

Horowitz

On construit des mutants de l’ADNc

codant pour le syndécane 4. On délète la

région d’interaction avec les PIP2 dans la

portion variable de la partie ICyt. Cette

région PIP2 est nécessaire à l’interaction

avec PKC

On transfecte ces mutants dans des

cellules endothéliales et on introduit ces

cellules dans un matrigel (MEC

reconstituée)

Dans une MEC reconstituée les cellules

endothéliales vont reformer une structure

qui ressemble à des vaisseaux c'est-à-dire

qu’on aura formation de tube/structure

vasculaire.

Alors qu’avec l’ADN complémentaire codant pour un mutant PIP2- (haut droite) on a des cellules

endothéliales qui expriment une protéine mutée. On ne forme donc pas de tube vasculaire quand on met du

FGF2.

Il y a donc une implication majeure de la zone PIP2 et de l’interaction avec la PKC.

Horowitz et al, J Cell Biol 2002,157

Introduction of syndecan-4 constructs

with a mutated PDZ- or PIP-2binding regions

inhibited FGF-2 but not serum-induced endothelial

ability to form vascular structures on matrigel

1- FGF2 binding to its high affinity tyrosine kinase receptor induces the activation of a phosphatase (PP1/2A)

which is associated with the cytoplasmic tail of syndecan-4 through a PDZ adaptor protein

2- PP1/2A dephosphorylates Ser183 of the syndecan-4 cytoplasmic tail, which is normally maintained

at a high basal phosphorylation level.

3- Dephosphorylation fo syndecan-4 increases its affinity to PIP-2. In turn PIP-2 binding facilitates

the multimerization of syndecan-4. The complex PIP-2-syndecan-4 activates PKC alpha

Il existe une signalisation propre du syndécane 4 qui est un corécepteur du FGF2 même si le récepteur

classique est un récepteur de type tyrosine kinase

Les chimiokines

Nous allons voir le rôle des Protéoglycanes à Héparane Sulfate dans les

chimiokines.

Ce sont des cytokines chimioattractantes jouant un rôle notamment dans

l’inflammation.

- Ce sont des molécules qui vont établir des gradients à la surface d’un endothélium. Par des

mécanismes de type patteming, angiogénèse, diapédèse…, de faire passer des leucocytes à travers

l’endothélium.

- Les cytokines vont guider ces leucocytes à travers un gradient de chimiokines, établi grâce à

l’endothélium qui exprime des protéoglycanes (PG), ce qui permet des liaisons de type héparane

sulfate entre les protéoglycanes et les chimiokines.

- Elles expriment des récepteurs couplés aux protéines G (à 7 domaines transmembranaires). Plus

l’on s’éloigne de la liaison, plus l’action des cytokines est faible.

Endothélium PGP

P

Chimiokine

PGP

P Liaisons de type héparane

sulfate

Famille des CXC :

La principale protéine étant SDF-1α (CXCL12), dont le récepteur est CXCR4, corécepteur du VIH

Famille des CC :

Un représentant important : RANTES dont le récepteur classique est CCR5, autre corécepteur du

VIH

Remarques :

1) une chimiokine est une heparin biding protein

2) une chimiokine peut lier plusieurs récepteurs, et un récepteur peut fixer plusieurs chimiokines (il

s’agit de liaisons avec un système dégénéré)

Elles dépendent

d’un motif conservé

contenant des

cystéines dans la

région N-terminale

4 sous-groupes :

C, CC, CXC, CX3C

Voici les rôles de la liaison des chimiokines aux chaînes à héparane sulfate :

la dimérisation (indispensable pour la fixation de la chimiokine à son récepteur) : il existe une

liaison spécifique des chimiokine à une chaîne héparane sulfate.

GAG dependant binging of SDF1 to SD4

La liaison de SDF-1 aux molécules de syndecan-4 est fortement diminuée par un traitement des protéines

électrotransferées par des heparitinases I et III. Ces données expérimentales démontrent que SDF-1 se lie

directement au syndecan-4 et que cette liaison est, au moins partiellement GAG-dépendante.

Les données expérimentales obtenues

sur des cellules HeLa ont été

complétées par des données apportées

par des expériences de double

marquage en microscopie confocale

et en microscopie électronique.

L’analyse en microscopie confocale

met en évidence un haut niveau de

colocalisation de plus de 75% des

molécules de syndecan-4 et de SDF-1.

Ces données sont confirmées par

microscopie électronique où l’on

retrouve une colocalisation de

molécules de syndecan-4 (petite bille

d’or colloidal de 6 nm) et de SDF-1

(grosse bille d’or colloidal de 15 nm).

Pour rechercher si SDF-1 se lie directement au syndecan-4 sur des cellules HeLa, les

protéoglycannes, enrichis par chromatographie sur DEAE Sephacel sont électrotransférés.

Dans ces conditions, SDF-1 biotinylé se lie à du syndecan-4 qui migre en smear avec une

masse moléculaire apparente de 150-250 kDa alors qu’il ne se lie pas aux autres

protéoglycannes.

Approche en microscopie confocale :

Une expérience a été faite par immunofluorescence indirecte avec un anticorps anti SDC-4 (syndecan 4),chez

la souris, pour mettre en évidence la colocalisation des molécules de syndecan-4 (marquage rouge) et de

SDF1 (marquage vert). La colocalisation se voit par un marquage jaune.

Bien sûr, il faut faire un contrôle isotypique (utilisation de lames sériés : on y pose l’anticorps anti SDC4

(fait chez une souris) et juste à côté dans la manipulation, on y pose un anticorps de la même sous classe

(isotype), utilisé à la même concentration de la même espèce, mais la souris n’a pas été immunisée contre

des cellules humaines, donc elle n’est pas censée reconnaître un antigène humain).

Ainsi, si la manipulation ne montre pas de marquage membranaire, alors on peut confirmer que le

marquage avec un anticorps spécifique est spécifique.

Approche en microscopie

confocale :

La lame fait 100nm de

longueur. Si la colocalisation

est inférieure à 15nm, on

considère que les molécules

sont proches (et donc qu’elles

entrent en interaction l’une

avec l’autre)

Autre approche pour

démontrer cette interaction :

On prend des cellules que

l’on incube avec du SDF en

condition douce non

dénaturante, et on fait une co-

immunoprécipitation

Rappel :

Isoler une protéine d’intérêt à partir d’un lysat cellulaire

Utiliser un Ac spécifique de la protéine d’intérêt

Précipiter le complexe Protéine-Ac avec une forme insoluble de protéines se liant à des anticorps

(ex: Protein G)

Centrifuger la suspension: la protéine d’intérêt est séparée

Ensuite un Western Blot est fait pour révéler l’interaction entre SDF1 et SDC4

Souvent avec du sel on détache SDF1, on récupère le diluat, on le dépose sur un gel et on fait un Western-

Blot, et on a un signal qui correspond au poids moléculaire de CXCR4, car SDF1 se lie sur CXCR4. Avec un

ligand de type SDC4, on a également un signal.

La piste 7 (IgG2a), c’est le contrôle isotypique fait chez la souris, car SDF-1 est aussi un anticorps anti

IgG2a chez la souris. Mais pour la protéine IgG2a, on n’obtient aucun signal. Si ça avait été, le cas, on

n’aurait pas pu conclure sur l’interaction en SDF1 et SDC4.

Autre approche : rôle de SDC4 dans la signalisation de SDF1 (ARN interférent : SiRNA)

Conseil : voir le premier

cours du lundi 17/10

pour mieux comprendre.

On diminue l’expression de SDC4 et on va regarder la transduction du signal dans les cellules humaines

induites par SDF1 (dont une des voies classiques est la MAP kinase). Les cellules non traitées sont

transfectées avec un plasmide vide et on a une phosphorylation de base assez faible. Or les protéines

(p42/p44/MAPK) sont activées lorsqu’elles sont phosphorylées.

Lorsqu’on incube ces cellules transfectées avec un plasmide vide, on a une activation du signal : SDF1 induit

la transduction du signal (car 100% d’expression de SDC4).

Quand on éteint par RNAinterférence (SDC4 DS RNA) l’expression de SDC4 qui passe de 100% à 30%,

alors la cellule répond moins à la signalisation de SDF1

Donc SDC4 joue un rôle dans la signalisation induite par SDF1

Pour ce qui est du contrôle, 2 types :

Utilisation d’un anticorps qui va reconnaître des formes phosphorylées, mais ici on n’a pas le

droit de dire que SDF1 augmente la phosphorylation de p42/p44 par rapport à JNK/SAPK, car on est

en expérimental et on n’est pas sûr de la quantité de protéine qu’on a mis dans chaque « puits ». Pour

s’en assurer on utilise un anticorps dirigé contre les formes totales de p42/p44 puis on fait le

rapport forme phosphorylée/forme totale. Et on voit que l’expression de p42/p44 totales est plus

forte que dans l’expression de JNK/SAPK totales

Contrôle de l’ARN interférent. En amont, on a gardé dans les banques de données que les

oligonucléotides se fixent spécifiquement sur SDC4 et vont éteindre son expression. Néanmoins,

nous sommes en expérimental et les oligonucléotides peuvent se fixer sur d’autres ARNs de manière

non spécifiques. Donc un contrôle de l’ARN interférent est indispensable

Au final, on montre que le SDC4 est un corécepteur de la chimiokine SDF1, qui se lie à CXCR4

d’un côté, à SDC4 de l’autre. SDC4 joue un rôle dans la signalisation de SDF1.

La migration cellulaire

Le SDC4 peut-il jouer un rôle dans les effets biologiques induits par SDF1 ?

1ère

technique : la migration dite « en blessure »

On prend une boîte, dans laquelle on fait pousser nos cellules, et avec un cône de pipette, on enlève toute une

partie de nos cellules au milieu. On attend 24 ou 48 heures (en pratique, il faut éviter de se mettre dans le

temps de doublement des cellules, sinon, c’est la prolifération. Donc se mettre dans un temps pour lequel

elles ne proliféreront pas), et on regarde le fond de migration.

2ème

technique : la chambre de Boyden modifiée (fréquent)

On a une chambre supérieure, qui présente des pores dans lesquels on met des cellules, et en dessous on met

une cellule chimioattractante (SDF1). On attend un certain temps (si possible, inférieur au temps de

doublement des cellules), puis on va compter le nombre de cellules, au microscope, après coloration à

l’hématoxyline.

Remarque :

si on utilise la fibronectine, on dit qu’on est dans un cadre de migration cellulaire

si on utilise une matrice reconstituée (PG, fibronectine…), on parle d’invasion, c’est-à-dire que la

protéine doit a priori sécréter des métalloprotéases (MMP) matricielles.

Ex : on éteint par ARN

interférence l’expression

de SDC4, et on va

regarder la migration

induite par SDF1 en

chambre de Boyden.

Les cellules transfectées avec le plasmide vide ont 100% d’expression et une bonne migration.

Dans les cellules où l’expression de SDC4 est éteinte, la migration est bien réduite.

Donc SDC4 joue un rôle très important dans les effets biologiques induits par SDF1

Cette approche est utilisée dans le travail du développement de thérapies : pour inhiber l’action de SDF1, il

existe des antagonistes de SDF1, le plus connu étant la MD3100 (car SDF1 se fixe sur CXCR4, corécepteur

du VIH), le but étant d’intérioriser le récepteur CXCR4 et empêcher l’entrée de VIH.

Il y a toute un développement de recherches qui ciblent les liaisons de SDF1 avec les chaînes de type

héparane sulfate. Ex : l’utilisation des polymères de Dextran (+/- carboxyméthylées, +/- sulfatées),

mimétiques des glycosaminoglycanes, et capables d’inhiber fortement la migration induite par SDF1.

Il y a un problème, dû à une approche méthodologique difficile : c’est que ces molécules ne sont pas

entièrement spécifiques au jour d’aujourd’hui. Elles peuvent aussi inhiber d’autres interactions (par exemple,

de type FGF2).

Le but de la recherche ici, c’est séquencer spécifiquement les zones d’interaction avec SDF1, pour

développer les mimétiques des glycosaminoglycanes spécifiques (aujourd’hui, le plus spécifique est

l’héparine, avec l’antithrombine).