John Ryan, Ph.D.Corning IncorporatedLife SciencesLowell, MA 01851, USA

Sommaire

Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Avantages de la congélation de cultures cellulaires . 2

Principes de la congélation de cellules . . . . . . . . . . 2

Aspects pratiques de la congélation de cellules . . . . 3

Références . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

IntroductionMaintenir en bonne santé des cultures de cellules encroissance est une tache exigeante rendue encoreplus difficile par le risque omniprésent de leur pertepar accident ou contamination. De plus, les culturesde cellules en croissance active ne sont pas statiquesmais, comme toutes les populations de microorgan-ismes, soumises à des modifications liées à l'âge ouinduites par l'environnement qui peuvent conduire àleur évolution et à leur perte potentielle.

La conservation cryogénique permet de minimiserces problèmes en stoppant l'horloge biologique descultures cellulaires, les plongeant efficacement dansune activité réellement suspendue. Ce concept,longtemps un des stratagèmes favoris des écrivains etproducteurs de cinéma de science-fiction, est devenuréalité depuis l'importante découverte de Polge,Smith et Parkes (11) en 1949 selon laquelle le gly-cérol protège les cellules des lésions causées par lacongélation. De nombreux protocoles dignes derecettes de cuisine sont maintenant disponibles pourcongeler des cellules, et ces procédures fonctionnentgénéralement bien (3, 6, 13-16). Il est essentiel,cependant, lorsque des problèmes surgissent ou queles protocoles nécessitent une adaptation et desaméliorations, de bien comprendre les concepts sous-jacents sur lesquels ils sont basés. Ce guide examineles concepts théoriques de base et les aspects pra-tiques nécessaires pour réussir la congélation de cel-lules animales et pour gérer une banque de cellules.

Guide général de cryoconservation decultures de cellules animalesBulletin technique

Life Sciences

Avantages de la congélation decultures cellulairesLa maintenance des cultures de cellulesnécessite peu de temps et d'effort lorsqu'ellessont correctement congelées et conservées.Le seul réel coût sont les dépenses de main-tenance d'un congélateur mécanique ultra-froid (-130°C ou moins) ou d'une alimenta-tion en azote liquide. Ces dépenses limitéesvalent très largement le temps, l'effort et lecoût substantiel des milieux et fournituresnécessaires au maintien en activité de cul-tures en croissance active, ou le coût d'unenouvelle culture obtenue à partir d'unebanque. Les cultures congelées sont unesource importante de réserve de secours pourremplacer les pertes occasionnelles dues auxcontaminations ou aux accidents, et assurentune alimentation homogène de cultures. Deschangements ou altérations cellulaires survi-ennent dans toutes les populations en crois-sance active. Ces changements entraînentsouvent la perte de caractéristiques impor-tantes pendant l'évolution des cultures,introduisant ainsi des variables indésirablesdans les expériences de longue durée. Lescultures conservées par cryogénisation nesubissent apparemment aucune modificationdécelable une fois conservées en dessous de–130°C (1, 8). Par conséquent, les effetsbiologiques du vieillissement et de l'évolu-tion cellulaires in vitro peuvent être min-imisés en revenant fréquemment aux culturesstock congelées, permettant ainsi de termineravec succès les expériences de culture delongue durée en cours sans subir de variablesindésirables. Les cultures congelées assurentégalement une ligne de base précieuse pourmesurer ou comparer les modificationsfutures induites par l'expérience.

Principes de la congélation decellulesPour comprendre pourquoi les protocolesde congélation fonctionnent, il est néces-saire d'examiner les évènements intracellu-laires et extracellulaires qui surviennentdans les cultures de cellules animales pen-dant le processus de congélation (2, 4, 8).La réfrigération initiale de la températureambiante à 0°C ralentit le métabolisme cel-lulaire, interrompant rapidement le trans-port actif et la pompe ionique. Cette inter-ruption n'endommage généralement pas lacellule si le milieu de culture est osmotique-ment équilibré. Lorsque le refroidissementse poursuit (0° à –20°C), des cristaux deglace commencent à se former dans l'envi-

ronnement extracellulaire, ce qui augmentela concentration en solutés du milieu deculture. De ce fait, l'eau commence à sortirdes cellules pour aller dans le milieu extra-cellulaire partiellement congelé, ce qui ini-tialise le processus de déshydratation et derétrécissement cellulaires.

Lorsque le processus de refroidissement estrapide, des cristaux de glace intracellulairesse forment avant la fin du processus dedéshydratation cellulaire. Ces cristaux deglace déchirent les membranes et lesorganelles cellulaires et entraînent la mortde la cellule pendant le processus de décon-gélation (Figure 2).

Lorsque le processus de réfrigération estlent, l'eau libre intracellulaire est expulséede la cellule par la force osmotique, entraî-nant une déshydratation et un rétrécisse-ment complets de la cellule. Ceci peutégalement entraîner une mort cellulairemais il n'existe pas de consensus sur lesmécanismes impliqués. Les contraintesphysiques du rétrécissement cellulaire peu-vent provoquer quelques dégâts, entraînantune perte de membrane irréparable et uneperturbation du cytosquelette et desorganelles. Les concentrations élevées ensolutés dans le milieu extracellulaire noncongelé (essentiellement de l'eau salée) peu-vent également provoquer des dégâts. Cessolutés attaquent les cellules par l'intérieuret l'extérieur, endommageant la membraneet provoquant un déplacement du pH etune dénaturation générale des protéines.

Cependant, lorsque la vitesse de refroidisse-ment est suffisamment lente pour empêcherla formation de glace intracellulaire, maissuffisamment rapide pour éviter les effets dedéshydratation graves, les cellules peuventsurvivre aux processus de congélation et dedécongélation. La zone ou fenêtre de survieest facilement observable chez de nom-breuses bactéries ou autres procaryotes,mais pour la plupart des cellules eucaryotes,elle est inexistante ou très difficile à trouversans utiliser d'agents cryoprotecteurs. Cesagents ont peu d'effet sur les dommagescausés par une congélation rapide (forma-tion de cristaux de glace intracellulaires),mais préviennent ou diminuent générale-ment les dommages dus à la congélationlente (déshydratation et rétrécissement) (8).

La température finale de conservation estégalement critique pour réussir une cry-oconservation. Pour stopper entièrementl'horloge biologique, les températures deconservation doivent être maintenues en

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Avantages de lacongélation decultures cellulaires◗ Moins de travail-économise

du temps et de l'argent.

◗ Sert de réserve de secoursen cas d'urgence

◗ Fournit une population plushomogène en min-imisant le vieillissement etl'évolution de la culture.

dessous de –130°C, point de transition vit-reuse en dessous duquel l'eau liquide n'ex-iste pas et la diffusion est insignifiante. Bienque de nombreuses cultures cellulairessoient conservées avec succès entre -70°C etl'horloge biologique n'est pas stoppée, maisuniquement ralentie, et des altérations oumodifications cellulaires vont s'accumuler.

La conservation dans l'azote liquide à–196°C prévient efficacement toutes lesréactions chimiques thermodépendantes.Seuls les effets physico-chimiques causéspar le rayonnement ionisant de fond esttoujours actif à cette température. Onestime qu'il faudrait des milliers d'annéesavant que ces rayonnements de fond ne pro-duisent d'effets notables sur les cellules cry-oconservées (2, 8). –90°C pendant des moisou même des années.

Aspects pratiques de lacongélation de cellulesMêmes dans les meilleures circonstances, leprocessus de congélation reste stressantpour toutes les cultures cellulaires. Il estimportant de faire tout ce qui est possiblepour minimiser ce stress sur les cultures afinde maximiser leur récupération et survieultérieures. Les suggestions et recomman-dations suivantes sont conçues pour com-pléter les protocoles cités précédemment.

I. Sélection des cellulesS'assurer d'abord que les cellules sont dansle meilleur état possible. Sélectionner lescultures proches de la fin de la phase decroissance logarithmique (à environ 90% deconfluence) et changer leur milieu 24heures avant de les récolter. Recherchersoigneusement toute trace de contaminationmicrobienne dans la culture. Cette procé-

dure est facilitée par la culture des cellulesdans un milieu sans antibiotique pendantplusieurs passages avant de les tester. Cecilaisse du temps à toute contamination résis-tante ou cachée (présente en très petit nom-bre) d'atteindre un niveau plus élevé et doncplus facilement détectable. Examinerensuite des échantillons de ces cultures aumicroscope et les tester par culture directepour rechercher la présence de bactéries,levures, champignons et mycoplasmes.

Les mycoplasmes représentent un problèmeparticulier, car ils peuvent être trouvés à desconcentrations très élevées (jusqu'à 108

organismes par millilitre de milieu) dans lescultures sans effets ni turbidité visibles.Ainsi, jusqu'à 20% de toutes les cultures decellules animales sont contaminées par cesorganismes ubiquitaires mais invisibles.Malgré les efforts particuliers nécessairespour détecter les mycoplasmes, les con-séquences sérieuses de leur présence ren-dent absolument essentiel le test de tous lesstocks de cultures congelées (9, 12).

Vérifier l'identité des cultures et la présencede toutes les caractéristiques particulièresattendues. Contrôler l'identité des cellulespar leur caryotype et leur analyse isoenzy-matique pour s'assurer qu'elles sont aumoins de la bonne espèce (10).

II. Récolte des cellulesDémarrer par la procédure de récolte stan-dard généralement conseillée pour la cul-ture en étant aussi délicat que possible.Retirer tous les agents de dissociation enlavant ou en les inactivant (particulièrementimportant en cas d'utilisation de milieu sanssérum). La centrifugation, lorsqu'elle estabsolument nécessaire, doit être juste suff-isamment forte pour obtenir un culot sou-

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Refroidissementlent

Refroidissementrapide

Mort cellulaire pardommages dus aux

cristaux de glaceinternes

Mort cellulaire pareffet de

déshydratation

Mort cellulaire pardommages dus aux

cristaux de glaceinternes

Les cellules seDéshydratent mais

survivent

Sans Cryoprotection Avec Cryoprotection

Refroidissementlent

Refroidissementrapide

Figure 1. Effets des vitesses de congélation sur les cellules.

Sans cryoprotection Avec cryoprotection

ple : 100 x g pendant 5 à 6 minutes sontgénéralement suffisants. Pour assurer l'uni-formité du stock final congelé, rassemblerles contenus de tous les récipients de cul-ture récoltés. Ceci facilite également l'exé-cution des tests de contrôle qualité essen-tiels pour la recherche des contaminationsmicrobienne et l'identification de la culture.

Compter puis diluer ou concentrer la sus-pension de cellules récoltées pour obtenirdeux fois la concentration finale désirée, quiest habituellement de 4 à 10 millions de cel-lules viables par millilitre. Un volume égalde milieu contenant l'agent cryoprotecteurà deux fois sa concentration finale seraajouté plus tard pour obtenir l'inoculumdésiré. Conserver les cellules au frais pourralentir leur métabolisme et les empêcherde s'agréger. Éviter toute dérive alcaline dupH en aérant avec du CO2 si nécessaire

III. CryoprotectionComme mentionné précédemment, lesagents de cryoprotection sont nécessairespour minimiser ou empêcher les détériora-tions associées à la congélation lente. Lesmécanismes permettant cette protection,bien qu'incomplètement compris, semblentfonctionner essentiellement en modifiant l'é-tat physique de la glace et des solutionsentourant immédiatement (extérieures aux)les cellules. La perméation des cellules pardes agents cryoprotecteurs n'apparaît pasnécessaire pour leur action correcte (4).Rappelons que ces agents ne protègent pascontre les dégâts dus à une congélation rapi-de (formation de glace interne), mais protè-gent plutôt par un contrôle attentif de lavitesse de congélation. Une grande variétéde produits chimiques assure une cryopro-tection adéquate, y compris l'acétamide deméthyle, le méthanol, l'éthylène glycol et lapolyvinylpyrrolidone (7). Cependant, lediméthylsulfoxyde (DMSO) et le glycérolsont les plus pratiques et les plus largementutilisés. Plusieurs de ces agents, bien qu'as-surant une excellente cryoprotection, ont deseffets secondaires toxiques sur les cultures,rendant leur utilisation difficile.

Le DMSO est le plus souvent utilisé à uneconcentration finale de 5 à 15% (v/v).Toujours utiliser une qualité réactif ou uneautre pureté suffisamment élevée dont lacompatibilité a été testée. Stériliser par filtra-tion à travers une membrane de Nylon de0,2 microns dans un logement en polypropy-lène ou en acier inoxydable et conserver enpetites quantités (5 mL). ATTENTION :

faire particulièrement attention à éviter toutcontact avec une solution contenant duDMSO. C'est un solvant polaire très puis-sant capable de pénétrer rapidement dans lapeau intacte en emportant avec lui des con-taminants dangereux tels que des car-cinogènes ou des toxines. Certaines lignéescellulaires sont affectées par un contact pro-longé avec le DMSO. Cet effet peut êtreréduit ou éliminé en ajoutant le DMSO à lasuspension cellulaire à 4°C et en le retirantimmédiatement lors de la décongélation. Sicela n'aide en rien, abaisser la concentrationou essayer du glycérol ou un autre cryopro-tecteur.

Le glycérol est généralement utilisé à uneconcentration finale de 5 et 20% (v/v).Stériliser par autoclavage pendant 15 min-utes dans de petits volumes (5 mL) etréfrigérer à l'obscurité. Bien qu'étant moinstoxique pour les cellules que le DMSO, leglycérol cause fréquemment des problèmesosmotiques, surtout après décongélation.Toujours l'ajouter à température ambiante ousupérieure et le retirer lentement par dilu-tion.

Les concentrations élevées en sérum peuventégalement aider les cellules à survivre à lacongélation. Le remplacement des mélangesmilieu-cryoprotecteur standards par 95% desérum et 5% de DMSO peut être meilleurpour certaines lignées cellulaires trop sensi-bles, surtout les hybridomes.

Ajouter les agents cryoprotecteurs au milieude culture (sans cellules) immédiatementavant de l'utiliser pour obtenir deux fois laconcentration finale désirée (2X). Mélangercette solution 2X avec un volume égal desuspension cellulaire récoltée (également 2X)pour obtenir l'inoculum à congeler. Cetteméthode est moins agressive pour les cel-lules, surtout en cas d'utilisation de DMSOcomme cryoprotecteur.

IV. Récipients de conservationAprès avoir mélangé la solution cryoprotec-trice avec la suspension cellulaire, l'inocu-lum résultant est ajouté par petits aliquote(généralement 1 à 2 millilitres) à chaquerécipient de stockage. Du fait des tempéra-tures extrêmement basses rencontrées encryoconservation, toutes les matières ouconceptions de récipients ne sont pasappropriées ni sures. De nombreux matéri-aux deviennent cassants à ces températures ;les récipients qui en sont composés peuventse briser ou se craqueler pendant le stock-age ou la décongélation. Vérifier soigneuse-ment les recommandations du fabricant durécipient avant de le choisir et de l'utiliser.

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Prévention des altéra-tions par congélation◗ Exécuter une congélation

lente pour extraire toutel'eau intracellulaire.

◗ Utiliser des agents cry-oprotecteurs pour min-imiser les effets de ladéshydratation.

◗ Conserver en dessous de-130°C pour arrêtercomplètement l'horlogebiologique.

Il est également important de choisir le sys-tème de scellage ou le type de bouchon util-isé pour maintenir l'intégrité du récipient,surtout pour le stockage dans l'azote liq-uide. Si ces récipients fuient pendant lestockage (comme beaucoup le font), ils serempliront lentement d'azote liquide.Lorsqu'ils reviennent finalement à la tem-pérature ambiante, l'azote liquide se vapor-ise rapidement en entraînant une accumula-tion rapide de pression. Les récipients peu-vent alors expulser violemment leur bou-chon ou exploser pour relâcher la pressionet libèrent alors leur contenu dans l'atmo-sphère. Ceci crée une situation très dan-gereuse, surtout si les récipients contien-nent des organismes pathogènes ou des sub-stances potentiellement toxiques ou dan-gereuses. Une conservation au-dessus del'azote liquide est vivement conseillée pourdiminuer les risques potentiels dans ces sit-uations.

Deux types de récipients sont courammentutilisés en cryoconservation : les ampoulesde verre thermoscellables et les tubes enplastique (généralement du polypropylène)à bouchon vissant. Les deux sontdisponibles dans différentes tailles (capacitéde 1 à 5 mL), bien que les tailles les plusfaibles soient préférées pour la cryoconser-vation (voir Figure 2).

À cause des problèmes d'étanchéité et d'éti-quetage, les ampoules de verre ne sont plusaussi largement utilisées dans les labora-toires de culture cellulaire. Des "trousd'épingle" invisibles peuvent se former dansles tubes pendant le processus de scellage ;s'ils sont ensuite stockés immergés dans l'a-zote liquide, ils peuvent exploser lorsqu'onles retire pour les décongeler. Les trousd'épingle peuvent généralement être détec-tés avant congélation en immergeant les

ampoules scellées pendant 30 minutes dansune solution réfrigérée d'éthanol à 70%contenant 1% de bleu de méthylène. Cettesolution pénètre rapidement et colore touteampoule présentant une fuite ; après rinçageà l'eau, les ampoules défectueuses sont alorsfacilement détectées et écartées.

Du fait de leur meilleure sécurité et de leurcôté pratique, les tubes en plastique ontlargement remplacé les ampoules de verreen cryoconservation. La grande variété deformes et de caractéristiques particulièrescomme les surfaces de marquage impriméeset les bouchons colorés facilitant l'identifi-cation a également contribué à leur popu-larité.

Différents types de capuchons sontdisponibles, certains à bouchons entrants etd'autres à bouchons coiffants qui aident àminimiser la contamination (voir Figure 3).

V. Étiquetage et archivageAssurer une localisation et une identifica-tion de longue durée des cultures cellulairesest le domaine le plus fréquemment négligéde la cryoconservation. Une banque de cel-lules cryogénique est sensée survivre auxtravailleurs du laboratoire ayant contribué àson établissement, mais des archivages d'in-ventaires mal entretenus ou inexistants, etdes tubes et ampoules mal étiquetés ou defaçon illisible peut empêcher cela, surtoutaprès le départ des responsables.

Les étiquettes doivent contenir suffisam-ment d'informations pour localiser lesarchives appropriées ; généralement, l'iden-tité de la culture, la date de congélation, etles initiales de la personne responsable sontsuffisants. La plupart des tubes en plastiquepossèdent des points ou zones de marquagefacilitant leur étiquetage. Sur les tubes etampoules sans point de marquage, utiliser

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Figure 2. Tubes cryogènes Corning à bouchon coiffant (gauche) et à bouchon entrant (droite)

des étiquettes en toile avec des adhésifs spé-ciaux composés spécialement pour les con-ditions cryogéniques.

Des encres spéciales à base de céramiquesont disponibles pour étiqueter lesampoules de verre. Appliquer ces encresavant le remplissage puis les cuire sur leverre, généralement pendant la stérilisationà chaleur d'archivage informatisé ; toujoursconserver une copie de sauvegarde actual-isée en plus des informations conservéesdans l'ordinateur.

VI. Vitesse de réfrigérationLa vitesse de refroidissement utilisée pourcongeler les cultures doit être juste assezlente pour permettre aux cellules de sedéshydrater, mais suffisamment rapidepour empêcher des altérations dues à unedéshydratation excessive. Une vitesse derefroidissement de –1°C à –3°C parminute convient à la plupart des culturesde cellules animales. Les cellules plusgrandes, ou les cellules possédant desmembranes moins perméables, peuventnécessiter une vitesse de congélation pluslente car leur déshydratation prendra plusde temps. Des points de marquage per-manents peuvent être appliqués sur lesampoules de verre avec du vernis à ongleblanc. Lorsqu'il a séché, utiliser un stylode marquage de laboratoire pour écriresur le point.

Quelle que soit la méthode de marquagechoisie, faire très attention à bien vérifiersa permanence en conditions cryo-géniques. Certaines zones de marquage,encres et étiquettes peuvent s'effriter ou

s'effacer pendant les stockages de longuedurée ; nous conseillons de faire un essaid'au moins plusieurs semaines.

Consigner avec précision dans un registreles conditions de stockage des cultures,comprenant toutes les informations suiv-antes : identité de la culture, nombre depassages, date de congélation, milieu etméthode de congélation utilisés, nombrede cellules par tube, nombre total detubes initialement congelés, le nombrerestant, leurs emplacements, leur viabilitéattendue et les résultats de tous les testsde contrôle qualité effectués (stérilité,mycoplasmes, espèce, caryotype, etc.).Des informations complémentaires sur lescultures, surtout leur origine, historique,paramètres de croissance, caractéristiquesspéciales et applications sont égalementutiles et doivent être ajoutées chaque foisque possible.

Faire des efforts particuliers pour gardertoutes les archives à jour et pour s'assurerque tout le monde dans les locaux lesutilise correctement. Utiliser des formu-laires pré-imprimés pour faciliter laprocédure d'archivage des informations etfavoriser son exécution. Conserver descopies actualisées de toutes les archivescruciales dans un endroit sûr à l'écart dulaboratoire pour les protéger contre touteperte ou destruction accidentelle. Ceci estparticulièrement important pour un sys-tème

La meilleure façon de contrôler lesvitesses de réfrigération est l'utilisationd'appareils de congélation électroniquesprogrammables. Bien qu'ils soient chers,ils permettent un contrôle précis duprocessus de congélation, donnent desrésultats uniformes et reproductibles, etpeuvent congeler un grand nombre detubes ou d'ampoules. La plupart desappareils sont disponibles avec un enreg-istreur pour un rapport permanent duprocessus de réfrigération.

Il existe de nombreux appareils de con-gélation mécaniques différents, relative-ment peu chers permettant de contrôlercorrectement la vitesse de réfrigération.Certains appareils utilisent des portoirsconçus pour accueillir des tubes à desprofondeurs prédéterminées dans le cold'un cryoconservateur à azote liquide. La

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Figure 3. Formes de bouchons de tubes cryogènes Corning

Tube cryogèneà bouchon coiffant

Tube cryogèneà bouchon entrant

Tube cryogèneà bouchon coiffant

vitesse de congélation dépend du nombretotal de tubes et de la profondeur à laquellele portoir est placé. Une autre techniqueutilise un "canister" en métal ou plastiquerempli d'alcool contenant un portoir d'unecapacité de 24 tubes maximum. La boîteremplie est placée dans un congélateurmécanique ultra-froid où l'alcool agitcomme un bain pour obtenir un transfertthermique et une réfrigération plus uni-formes. Après une congélation de 4 à 5heures, les tubes sont retirés de la boîte ettransférés dans leur emplacement de stock-age final.

Les boîtes en carton ou en mousse de poly-styrène isolées sont couramment utiliséescomme chambre de congélation dans lescongélateur ultra-froids. Ces systèmesmaisons marchent bien avec de nombreuseslignées cellulaires mais ne donnent pas tou-jours une réfrigération contrôlée, repro-ductible ou uniforme. Ainsi, il peut existerdes différences importantes de viabilitéentre les tubes lors de la décongélation.Cette approche maison n'est pas conseilléepour les cultures précieuses ou irrem-plaçables.

Quelle que soit la méthode de réfrigérationutilisée, le transfert de la chambre ou del'appareil de réfrigération vers l'emplace-ment de stockage final doit se faire rapide-ment pour éviter le réchauffement destubes. Utiliser un récipient de transfert isolérempli de carboglace ou d'azote liquidepour s'assurer que les cellules demeurent endessous de –70°C.

VII. Conservation cryogéniqueSeuls les congélateurs capables de mainteniren continu une température inférieure à–130°C doivent être considérés comme descryoconservateurs de longue durée. Bienque la plupart des congélateurs refroidis àl'azote liquide et certains congélateursmécaniques spécialement conçus répondentà ces exigences, la plupart des laboratoiresde culture cellulaire préfèrent les cryocon-servateurs à azote liquide (Voir Figure 4).Le choix final est souvent basé sur ladisponibilité d'une alimentation fiable enazote liquide, la capacité de stockage néces-saire, et l'importance du budget. Les cry-oconservateurs à azote liquide permettentun stockage soit dans les vapeurs d'azote au-dessus du liquide entre –140°C et –180°C,soit en immersion dans le liquide à unetempérature inférieure à –196°C. La con-servation dans la phase gazeuse diminueconsidérablement le risque d'explosion detubes ou d'ampoules présentant une fuite aumoment de leur retrait. Cependant, commela quantité d'azote liquide dans le cryocon-servateur est réduite pour faire de la placepour une conservation dans la phase vapeur,l'autonomie du cryoconservateur (durée demaintien de sa température de stockage sansajouter d'azote liquide supplémentaire) estégalement réduite. Ceci abaisse la marge desécurité du cryoconservateur et nécessiteune surveillance et un contrôle plusfréquents. Prêter une attention toute partic-ulière à ces problèmes de sécurité lors duchoix de la méthode de stockage.

Vérifier régulièrement les niveaux d'azotedans les cryoconservateurs ; établir un cal-endrier et s'y conformer strictement.L'évaporation de l'azote dépend du degréd'utilisation et de l'autonomie statique ducryoconservateur. Des augmentationssoudaines et inexpliquées de la vitesse d'éva-poration peuvent signaler une détériorationde l'isolation ou l'apparition d'autres prob-lèmes avec le cryoconservateur qui doiventêtre activement recherchés. Éviter la forma-tion de givre ou de glace autour des ouver-tures du cryoconservateur ; ceci augmentela vitesse d'évaporation de l'azote et peutentraîner des augmentations de températuredans la partie supérieure des cryoconserva-teurs à phase vapeur. Des systèmes d'alarmesonore pour détecter des niveaux faiblesd'azote liquide procurent une sécurité sup-plémentaire ; cependant, ils donnent unfaux sentiment de sécurité s'ils ne sont passurveillés 24 heures sur 24.

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Figure 4. Cryoconservateurs classiques

VIII. DécongélationATTENTION : toujours utiliser unéquipement de sécurité approprié pour retir-er des tubes ou ampoules de cryoconserva-teurs à azote liquide ou en phase vapeur. Leport d'un écran facial complet, de cryogantsépais et d'un tablier de laboratoire est vive-ment conseillé pour se protéger des explo-sions de tubes et ampoules.

Retirer le tube ou l'ampoule de sonemplacement de stockage et vérifiersoigneusement l'étiquette et le registre destockage pour s'assurer que c'est la bonneculture. Placer le récipient dans l'eau tiède,en l'agitant doucement jusqu'à décongéla-tion complète. Une décongélation rapide(60 à 90 secondes à 37°C) permet d'obtenirune meilleure récupération pour la plupartdes cultures cellulaires ; elle réduit ouempêche la formation de cristaux de glacepouvant endommager la cellule pendant laréhydratation.

IX. RétablissementCertains agents cryoprotecteurs peuvantendommager les cellules après une exposi-tion prolongée, il faut retirer ces agentsaussi rapidement et délicatement que possi-ble. Plusieurs approches sont utilisées suiv-ant l'agent cryoprotecteur et les caractéris-tiques des cellules.

La plupart des cellules récupèrent normale-ment si l'agent de cryoprotection est retirépar changement de milieu dans les 6 à 8heures après décongélation. Transférer lecontenu de l'ampoule ou du tube dans unflacon T-75 ou un autre récipient appropriécontenant 15 à 20 millilitres de milieu deculture et incuber normalement. Dèsqu'une majorité des cellules a adhéré, retir-er le milieu contenant l'agent cryopro-tecteur maintenant dilué et le remplacer pardu milieu frais.

Pour les cellules sensibles aux agents cry-oprotecteurs, il est possible de retirer facile-ment l'ancien milieu par une centrifugationdouce. Transférer le contenu du tube ou del'ampoule dans un tube à centrifuger de 15mL contenant 10 mL de milieu frais et cen-trifuger pendant 5 minutes à 100 x g. Jeterle surnageant contenant l'agent cryopro-tecteur et resuspendre le culot cellulairedans du milieu frais. Transférer ensuite lasuspension cellulaire dans un récipient deculture approprié et incuber normalement.

En cas d'utilisation de glycérol comme cry-oprotecteur, l'addition brusque d'un grandvolume de milieu frais à la suspension cellu-

laire décongelée peut provoquer un chocosmotique, endommageant ou détruisant lescellules. Utiliser plusieurs dilutions en sérieavec un volume égal de milieu tiède toutesles 10 minutes avant tout traitement supplé-mentaire pour donner du temps aux cellulespour réajuster leur équilibre osmotique.

X. Suggestions de résolution de problèmesLes problèmes de viabilité associés à la cry-oconservation sont généralement rencontréstout de suite après la décongélation etl'ensemencement des cellules. Les prob-lèmes surviennent dans quatre secteursprincipaux:

1. Pendant la récolte et le traitement descellules. Les problèmes peuvent être dusà une exposition excessive des cellules auxagents de dissociation, à l'utilisation d'unagent cryoprotecteur toxique ou à dessuspensions cellulaires à forte densitélaissées trop longtemps à températureambiante ou à un pH trop alcalin.

2. Pendant le processus de réfrigération(congélation). Des cellules excessivementendommagées et une viabilité des cul-tures réduite résultent souvent de l'appli-cation d'une vitesse de réfrigération troprapide ou trop lente, ou d'une interrup-tion temporaire du processus deréfrigération. Le fait de ne pas utiliser l'a-gent cryoprotecteur approprié à la bonneconcentration entraîne également desproblèmes de viabilité.

3. Pendant la cryoconservation. La viabil-ité des culture est souvent réduitelorsqu'on laisse les tubes se réchaufferpendant le transfert vers le congélateur,ou si la température de la banque n'estpas maintenue constante à des tempéra-tures cryogéniques appropriées.

4. Pendant la décongélation et la récupéra-tion. Les problèmes surviennent souventlorsque le processus de décongélation esttrop lent ou que les cryoprotecteurs nesont pas correctement retirés (voir ci-dessus).

Ces problèmes de viabilité peuvent souventêtre corrigés en utilisant les techniques suiv-antes pour identifier l'étape du processus decongélation qui est à l'origine du problème.

Récolter suffisamment de cellules pour pré-parer au moins quatre tubes. Prélever unéchantillon de suspension cellulaire, équiva-lent au nombre de cellules qui sera placédans les tubes, et le déposer immédiatement

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dans un récipient de culture avec la quantitéadéquate de milieu et incuber. Cette culturesera utilisée comme contrôle pour la com-parer avec les cultures traitées dans les étapesrestantes.

Ajouter ensuite l'agent cryoprotecteur auxcellules restantes et diviser en trois tubes.Placer un tube à 4°C pendant une heure.Retirer ensuite les cellules du tube, procédercomme si elles venaient juste d'être décon-gelées du cryoconservateur, et ensemencerdans un milieu comme ci-dessus. Cette cul-ture sera comparée à la culture contrôle pourvoir s'il y a des problèmes associés à l'agentde cryoprotection.

Pendant ce temps, traiter les tubes restantsen leur appliquant la procédure habituelle deréfrigération lente. Un tube est alors immé-diatement décongelé et traité commeprécédemment. Cette culture sera comparéeà la culture contrôle pour déterminer s'il y ades problèmes liés à la procédure deréfrigération lente.

Transférer le tube restant dans le cryoconser-vateur et le conserver pendant la nuit avantde le décongeler et de le traiter comme ci-dessus. Cette culture sera comparée à la cul-ture contrôle pour déterminer s'il y a desproblèmes liés aux conditions de cryoconser-vation. Si des tubes sont encore disponibles,utiliser différentes techniques de récupéra-tion pour déterminer si cette technique est lasource du problème.

En comparant toutes les cultures à la cultured'origine, il doit être possible de déterminer

à quelle étape du processus de congélationsurvient le problème. Une fois cela identifié,les informations présentées dans ce guide etces références devraient être suffisantes pourrésoudre le problème.

XI. Gestion d'une banque de cellulesLes efforts et les dépenses investis dans lagestion d'une banque doivent être mis enrelation avec la valeur des cultures qui y sontstockées. Cette valeur est déterminée enrépondant à deux questions : combien detemps, d'argent et d'effort ont-ils déjà étéinvestis dans ces cultures cellulaires stockées ?Et, quelles seraient les conséquences de leurperte ? Les cultures facilement remplaçablesauprès d'autres laboratoires ou de sourcescommerciales ne nécessitent pas d'effortsparticuliers, mais les cultures uniques, tellesque des hybridomes et autres cellulesgénétiquement modifiées, sont irrempla-çables et exigent des efforts spéciaux à mettreen ?uvre pour assurer leur sécurité. Lesréponses à ces questions vous aideront àdéterminer jusqu'où doivent porter vosefforts.

Identifier ensuite les domaines pouvant poserdes problèmes conduisant à la perte de cescultures. Certains de ces domaines, comme lechoix du récipient, l'archivage, l'étiquetage, lasurveillance du cryoconservateur, les con-ditions de stockage et les problèmes dequalité (contamination et identité desespèces), ont déjà été abordés dans ce guide.Décider quels étapes sont nécessaires pouréliminer ou minimiser ces problèmes.Répartir les cultures irremplaçables ou trèsprécieuses dans plusieurs cryoconservateurs,avec au moins un cryoconservateur dans unautre endroit pour se protéger contre lesincendies ou autres catastrophes naturelles.Les collègues des autres laboratoires ouautres bâtiments devraient pouvoir vousassurer une réserve de secours, surtout en casd'arrangement réciproque.

Une étape finale demeure ; planifier àl'avance les urgences ! Une des urgences lesplus sérieuses et inattendues est la panne decryoconservateur. Une surveillance attentivedu niveau d'azote liquide ou un diagrammede température peut donner une alerteprécoce d'une défaillance en cours, mais unepanne au milieu de la nuit peut également seproduire. Préparer des plans à l'avance pourgérer une panne de cryoconservateur ou lesautres problèmes. Si ces plans impliquentl'équipement d'un collègue, obtenir sapermission et faire tous les arrangements

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Liste de contrôle de congélation◗ Récolter délicatement les cellules.◗ Vérifier l'absence de contamination dans les

cultures, surtout par les mycoplasmes.◗ Vérifier l'identité de la culture par caryotype ou

analyse aux isoenzymes.◗ Utiliser des agents cryoprotecteurs testés.◗ Utiliser uniquement des tubes testés pour les

conditions cryogéniques.◗ S'assurer que l'étiquette est permanente et

complète.◗ Contrôler la vitesse de réfrigération.◗ Conserver les cultures en dessous de –130°C.◗ Surveiller fréquemment les niveaux d'azote liq-

uide.◗ Archiver correctement.

nécessaires à l'avance – les coups detéléphone tard dans la nuit sontgénéralement peu appréciés.

Ces informations ont été réunies pourrédiger ce guide permettant de mieuxcomprendre le processus decryoconservation. Pour obtenir uneassistance dans ce domaine, merci decontacter le Service Technique de CorningLife Sciences au 800.492.1110,1.978.635.2200 ou écrire à l'adresseclstechserv@corning.com.cctech@corning.com

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