Human papillomavirus infection vaccine · 16S rRNA gensekvensering En metode som er vidt udbredt til at undersøge fylogeni og taksonomi af prøver taget fra miljøer med komplekse

Kristine Wichmann Madsen Allerød Gymnasium 2016

Human papillomavirus infection vaccine

Undersøgelse af mikrobiomet hos patienter, der har udviklet myalgisk encephalomyelitis som mulig bivirkning af HPV-vaccine

Kristine Wichmann Madsen

Allerød Gymnasium

Forskerspirer 2016

SUND


Indholdsfortegnelse

Indledning ..................................................................................................................................................... 3

Problemformulering ................................................................................................................................. 3

Afgrænsning af forskningsprojekt ........................................................................................................ 3

Statistiske overvejelser ............................................................................................................................ 4

Metode ............................................................................................................................................................ 5

Afføringsprøver ....................................................................................................................................... 5

16S rRNA gensekvensering ................................................................................................................. 5

PCR opformering ..................................................................................................................................... 6

Forsøgsdesign .............................................................................................................................................. 6

Forsøgspersoner ..................................................................................................................................... 6

Udførelse af forsøg ................................................................................................................................. 6

Tidsramme ................................................................................................................................................ 7

Budget ......................................................................................................................................................... 8

Konklusion .................................................................................................................................................... 9

Tak ................................................................................................................................................................... 9

Litteraturliste ............................................................................................................................................ 10

Referencer .............................................................................................................................................. 10

Bilag 2 .................................................................................................................................................. 10

Bilag 3 .................................................................................................................................................. 10

Forsidebillede .................................................................................................................................... 11

Øvrig ......................................................................................................................................................... 11

Bilag .............................................................................................................................................................. 12

Bilag 1: ..................................................................................................................................................... 12

Bilag 2: ..................................................................................................................................................... 13

Bilag 3: ..................................................................................................................................................... 14

Bilag 4: ..................................................................................................................................................... 15


Indledning

I Danmark får alle piger mellem 12 og 18 år tilbud om at få HPV-vaccinen, da den kan forebygge mange tilfælde af livmoderhalskræft. På trods af at WHO Global Advisory Committee on Vaccine Safety har udtalt, at der ikke er en sammenhæng mellem HPV-vaccinen og autoimmune sygdomme, har landets fem HPV-skadecentre fået over 2000 henvisninger af kvinder i alderen 12-35 år, som har mistænkt bivirkninger ved HPV-vaccinen. Mange af patienterne rapporterer bivirkninger, der påvirker dem i sådan en grad, at det afholder dem fra arbejde og skole. Deres symptomer er forholdsvis ensartede, og blandt de mest fremtrædende symptomer er hovedpine, mavesmerter, svimmelhed, tab af muskelkraft og udtalt træthed.

I forskning foretaget ved synkopecentret på Frederiksberg Hospital, blev 90 % af de undersøgte patienter diagnosticeret med sygdommen myalgisk encephalomyelitis/kronisk trætheds syndrom (ME/CFS)[1]. ME/CFS er en sygdom, der rammer nervesystemet, immunsystemet og hormonsystemet, og desuden har den forbindelse til hjernen, mave-tarmflora og mitokondrierne i muskelcellerne.[2] Da ME/CFS patienter eksisterede før vaccinen blev indført, og sygdommen ofte opstår uafhængigt af vaccination i mange tilfælde, er det uklart hvorvidt der er tale om en kausalitet mellem vaccine og symptomer. På trods af dette er det relevant, at undersøge de piger der rapporterer disse alvorlige symptomer med udgangspunkt i kendskab til ME/CFS.

Der er relevant at kigge til den forskning, der er fortaget inden for ME/CFS. Forskning indenfor ME/CFS tyder på en mulig sammenhæng mellem tarmens mikrobiota og sygdommen [1]. Kunne der derfor findes nogle fællestræk, som f.eks. sammenfald i tarmflorasammensætningen blandt de piger med alvorlige bivirkninger af HPV-vaccinen?

Jeg finder det interessant at undersøge, hvorfor individer reagerer så forskelligt selvom de udsættes for det samme. At nogle unge piger måske kan blive invalideret af en vaccine som HPV er selvfølgelig utrolig alvorligt men også svært at undersøge, da man ikke ved nok om den sygdom, de lider af. Ved at sammenligne tarmfloraen hos patienterne, kan man få en bedre forståelse for om der kunne være fællestræk ifht. sygdommen og de piger, der lider af den.

Problemformulering

Forskning inden for myalgisk encephalomyelitis peget på at ME/CFS-patienter har en mindre i diversitet af tarmbakterier. Min hypotese er, at man vil se, at tarmbakteriesammensætningen hos HPV-vaccinerede piger med bivirkninger adskiller sig fra den hos raske, når man undersøger for en række bakterier ved brug af 16S rRNA sekvensering. Jeg analyserer for Bacteroidaceae, Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Prevotellaceae og Lachnospiraceae, som er udvalgt på baggrund af tidligere forskning i mikrobiota hos ME/CFS-patienter[3](se bilag 1).

Afgrænsning af forskningsprojekt


Det er vigtigt ikke at skabe mistillid til vaccinen. Med mit forskningsprojekt ønsker jeg at

bidrage til at genoprette tilliden til HPV-vaccinen ved at tage patienterne seriøst og undersøge

den sygdom, de lider af. Forskning indenfor dette felt er endnu minimal, og jeg kan ikke med

mit forskningsprojekt vise om der er en kausal sammenhæng mellem vaccinen og

symptomerne. Ved at undersøger hvorvidt patienternes mikrobiom adskiller sig fra en rask

kontrolgruppe, kan jeg skabe en bedre forståelse for patofysiologien. Således kan jeg bidrage

til udviklingen af bedre behandling af patienterne og til en forebyggelse af bivirkningerne. Jeg kunne også have undersøgt kausaliteten mellem vaccine og symptomer mere direkte ved at undersøge epidemiologisk, hvorvidt pigerne der er blevet syge efter HPV vaccination er blevet udsat for omstændigheder som spæd, som kan have indflydelse på tarmbakteriesammensætningen. Rent praktisk ville en sådan undersøgelse dog være vanskelig.

Jeg har valgt ikke at gå denne vej, da der i forvejen er så lidt forskning indenfor feltet, at man risikere at generalisere og skabe større mistillid til vaccinen. I stedet vil jeg undersøge meget specifikt for at finde ud af om bestemte tarmbakterier er fremherskende hos HPV-vaccinerede der har ME/CFS lignende bivirkninger.

Statistiske overvejelser

Der er mange overvejelser der går forud for bestemmelse af sample size. Det afhænger af hvilken form for statistik, man har med at gøre. I dette tilfælde ønsker jeg at sammenligne gennemsnit for to grupper, da jeg ønsker at sammenligne en gennemsnitlig forekomst for hver af de fem bakterier.

Ved beregning af sample size for to kontinuerlige variable, skal man kende standard afvigelsen (s) hos populationen. Standardafvigelsen er et mål for spredningen og beskriver, variationen i tarmbakteriesammensætning hos raske individer. Desuden skal man beslutte hvor stor en forskel man forventer at se (d), baseret på tidligere forskning. Derudover indgår konstanten C som afhænger af variablene α og β. Fejlmarginen er α og beskriver hvor stor en usikkerhed, man vil acceptere ved sin konklusion. I dette forskningsprojekt vil der arbejdes med en tosidig fejlmargin på 0,05, og jeg accepterer således en usikkerhed på 5%. Risikoen for at man ikke ser forskellen, hvis den er der kaldes for β og bestemmes til 0,20. Dette beskrives ved følgende formel:

𝑛 = 1 + 2𝐶 (𝑠

𝑑)2

Når α=0,05 og 1-β=0,8 gælder det, at C=7,85. [4]

For at beregne min sample size, benyttes resultater fra tidligere forskning indenfor mikrobiomet hos ME/CFS-patienter. I dette forsøg undersøges der for fem forskellige bakterier, men sample size er den samme i alle tilfælde. Til at bestemme sample size vælger jeg at benytte standardafvigelse og forventet forskel hos populationen bakterien Bacteroidaceae (bilag 1). Den forventede forskel er på 0,08 og spredningen er 0,213 og på baggrund af disse værdier beregnes sample size:


𝑛 = 1 + 2 ∗ 7,85 ∗ (0,213

0,08)2

= 112,39

Altså er det optimale antal patientforsøg 112, hvilket betyder at forskningsprojektet i alt vil omfatte 224 forsøgspersoner.

Metode

Min empiri i dette forskningsprojekt, er de data, der skal indsamles i løbet af forsøget. Til

dette formål vil jeg indsamle afføringsprøver og analysere dem ved hjælp af 16S rRNA

sekvensering. Jeg vil på baggrund af dette være i stand til at drage nogle konklusioner ift.

hvilke tarmbakterier der karakteriserer de patienter, der mistænker bivirkninger af HPV-

vaccinen.

Afføringsprøver Vores afføring indeholder genetisk materiale fra de mange forskellige bakterier der lever i

vores tarm. Man kan dermed ved hjælp af gensekvensering identificere de forskellige

tarmbakterier og få indblik i tarmens mikrobiom.

I dette forsøg indsamles afføringsprøver af forsøgspersoner i hjemmet. Der udtages 15 ml afføring til hver af prøverne, som opbevares ved -80°C indtil analysetidspunkt. Afføringsprøverne destrueres ved forskningsprojektets ophør.

16S rRNA gensekvensering En metode som er vidt udbredt til at undersøge fylogeni og taksonomi af prøver taget fra

miljøer med komplekse bakteriesammensætninger, er at ekstrahere og sammenligne

bestemte former for RNA ved brug at molekylære redskaber. Ved denne metode benyttes 16S

ribosomal RNA (16S rRNA) til identificering og sammenligning af bakterier fundet i en given

prøve.

Ribosomer er de organeller der oversætter generne i cellerne ved at omdanne mRNA-strengens nukleotidsekvenser til aminosyresekvenser. Generne for ribosomalt RNA har ændret sig meget lidt over de millioner af år, organismer har udviklet sig. De små forskelle der er i rRNA’et viser os, hvor tæt relaterede forskellige organismer er.

Da 16S rRNA genet kun består af 1542 nukleotider er det enkelt at kopiere og sekvensere.

Efter cellemembranen er blevet brudt, kan man begynde at identificere de bakterier, som man

ønsker at undersøge i prøven. I 16S rRNA gener er det de nukleotider der findes i henholdsvis

starten og slutningen af gensekvensen, som er unikke for en specifik organisme. For at kunne

identificere denne organisme i en prøve benytter man sig af primere, der er komplementære

til specifikke nukleotidsekvenser og dermed binder sig til dem. Således isoleres 16S rRNA i

prøven, og disse nukleotidsekvenser opformeres herefter ved brug af PCR. Man er således i

stand til at sammenligne 16S rRNA-sekvenserne fra prøven med den af andre kendte


bakterier og således bestemme hvilke bakterier, der er tilstede og i hvilken relativ mængde

[5].

PCR opformering Polymerase Chain Reaction (PCR) er en metode til opformering af DNA, som foregår ved at

bryde hydrogenbindingerne mellem baseparrene ved høj varme og dernæst sænke

temperaturen hurtigt. Herefter tilsættes primere og binder sig til hver af de enkelte DNA-

strenge, der er splittet af varmen. Primerne har en OH-ende som DNA-polymerasen kan binde

sig til, og når temperaturen hæves binder polymerasen sig til OH-gruppen og replicerer DNA-

stykket i tilstedeværelsen af nukleotider. Ved hvert varmeskift sker der en ny cyklus og

mængden af DNA fordobles.

Forsøgsdesign

Forsøgspersoner I mit forskningsprojekt ønsker jeg, at involvere 112 patienter som har oplevet alvorlige

mulige bivirkninger ved HPV-vaccinen og en kontrolgruppe som skal bestå af 112 raske

forsøgspersoner. Kontrolgruppen skal, ligesom patientgruppen, være kvinder i alderen 12-35

år, og skal være vaccineret med HPV-vaccinen og uden nogen form for bivirkninger.

Patientgruppen rekrutteres ved hjælp af patientregister på Synkopecenteret på Frederiksberg

Hospital. Patientgruppen kontaktes på mail og informeres om forsøget og dets formål, som er

at undersøge patologien bag de symptomer patienterne rammes af og således nærme sig et

behandlingstilbud.

For at få fat i en matchende kontrolgruppe, rekrutteres der gennem opslag på sundhed.dk.

Alle der responderer på opslaget, vil blive screenet ved en telefonsamtale med en

sygeplejerske, for at sikre, at de har forstået forsøgets omfang, opfylder kriterierne og at de

ikke lider af nogle kroniske lidelser.

Når forsøgspersonerne er godkendt, tilsendes de et brev om fremmødetid samt et brev om

deres rettigheder som forsøgspersoner (se bilag 2).

Udførelse af forsøg Fase I: I denne fase fokuseres på udvælgelse af velegnede forsøgspersoner. Individer

der responderer på opslag på sundhed.dk og på HPV-centrene ved Frederiksberg

Hospital og Sjællands Universitetshospital i Roskilde, som ønsker at melde sig som

forsøgspersoner screenes ved en telefonsamtale. Alle raske forsøgspersoner skal have

modtaget HPV-vaccinen uden bivirkninger, og må ikke lide af andre former for

kroniske lidelser. Dette sikres ved telefonsamtalen.

Fase II: Forsøgspersonerne møder op til undersøgelse på hospitalet. Her skal

forsøgspersonerne afgive informeret samtykke. Den forsøgsansvarlige sygeplejerske

giver mundtlig information om projektet og forsøgspersonerne får herefter lidt

betænkningstid inden de skal afgive deres samtykke (bilag 2).


Derudover udspørges de om tilstedeværelse af symptomer, vaccinationsstatus, højde,

vægt, alder og hvorvidt de har fået antibiotika1 i måneden op til prøven. Dernæst får

forsøgspersonerne udleveret et opsamlingssæt og en grundig vejledning i, hvordan det

gøres (se bilag 3). Der sættes 10 minutter af til hver forsøgsperson.

Fase III: Når afføringsprøverne er blevet indsamlet og indsendt til laboratoriet skal

bakterierne identificeres. De trin der er involveret i processen ses af nedenstående

tabel [4]:

Trin Procedure 1. DNA ekstraheres fra en 100 mg afføringsprøve ved brug af

ekstraktionskittet PowerSoil-htp DNA isolation kit ifølge producentens instruktioner.

2. 16S rRNA-gener opformeres ved brug af primerne 515F og 806R, der genkender den hypervariable region V4 på 16S rRNA-genet.

3. PCR opformering forgår ved brug af 2.5X HotMasterMix, 10-100 ng DNA-skabelon og 0,05 µM af hver primer. PCR opformering:

1. Start med denaturation ved 94°C (3 min) 2. 25 cyklusser af:

45 sek denaturation: 94°C 60 sek annealing: 50°C 90 sek extention: 72°C

4. Afsluttende extention ved 72°C (10 min)

4. Sekvensering af arvematerialet udføres i samarbejde med DTU på maskinen Illumina MiSeq 2x250 bp.

Fase IV: Statistisk behandling af data. Her skal resultaterne af prøverne sammenlignes.

For hver forsøgsperson laves et diagram over fordelingen af de forskellige bakterier i

procent (bilag 1). Frekvensen af de forskellige bakterier bliver opgjort, og tilsammen

udgør de 100%. Gennemsnittet for andelen af hver bakterie findes for henholdsvis

kontrolgruppen og patientgruppen og det undersøges, hvorvidt der er en statistisk

signifikant forskel på de to grupper.

Tidsramme Forløb Varighed

Inklusionsfase En måned Informationssamtaler samt indlevering af afføringsprøver

Tre uger

1Hvis forsøgspersonerne har fået antibiotika kort forinden prøvetagningen, skal de ekskluderes fra forsøget, da brugen af antibiotika har stor indvirkning på voksne menneskers mikrobiota.


Databehandling og sammenskrivning af resultater

Seks måneder efter igangsættelse af forskningsprojekt

Budget Nedenstående budgetskabelon tager udgangspunkt i mine beregninger af sample size.

Udgiftspost Noter Beløb Løn til sygeplejerske 10 minutter sættes af til hver

af de 224 forsøgspersoner. Sygeplejerskens timeløn: 250 kr/timen.

(37 timer)*(250 kr/timen) = 9.250 kr

Løn til laborant Der samarbejdes med en laborant ved DTU, som forventes at kunne udføre analyse af prøverne på 10 arbejdstimer. Laborantens timeløn: 250 kr/timen.

(10 timer)*(250 kr/timen)= 2.500 kr

Løn til statistiker Statistisk behandling af data forventes at tage 3 timer. Statistikerens timeløn: 400 kr/timen.


Sekvensering Sekvensering af 16S rRNA på maskinen Illumina MiSeq 2x250 bp. Sekventeringen koster 180 kr/prøve.

(180 kr/prøve)*(224 prøver)= 40.320 kr

I alt 53.270 kr

Som det fremkommer af ovenstående budget, skal jeg bruge 53.270 kr. for at kunne

gennemføre mit forskningsprojekt optimalt. I denne konkurrence bliver jeg dog kun bevilliget

20.000 kr. til udførelsen af mit projekt. Med 20.000 kr. til rådighed er det kun muligt at udføre

forsøget på ca. 80 forsøgspersoner (se bilag 4). Altså en patientgruppe på 40 personer og en

kontrolgruppe på 40 personer.

For at kunne udføre mit projekt, vil jeg forsøge at søge 33.270 kr. gennem fonde til udførelsen

af mit projekt. Disse penge vil Louise Brinth, forsker ved Synkopecenteret på Frederiksberg

Hospital hjælpe mig med at søge. Hun vil formidle kontakt til patientforeningen ME-

foreningen, som har erfaring med at søge fondsmidler til forskning i ME/CFS. Et tænkeligt

sted at søge midler er hos lægemiddelstyrelsen, da folketinget har afsat 7 mio. kr. til udførelse

af forskningsprojekter indenfor bivirkninger ved HPV-vaccinen i årene 2016-2018.[6]

Hvis ikke det lykkes mig at få bevilliget pengene til mit forskningsprojekt, vil jeg udføre mit

projekt med 80 forsøgspersoner. Det vil selvfølgelig have konsekvenser for sandsynligheden

for at få klare resultater. Jeg vælger dog at udføre projektet, selv hvis jeg kun har 20.000 kr.

tilgængelig, da jeg mener at min forskning alligevel kan være relevant og fungere som

pilotforsøg for fremtidig forskning.


Konklusion

Med dette forskningsprojekt kan jeg være med til at kaste lys over et ellers forholdsvis

uberørt forskningsområde. Hvis man på baggrund af denne undersøgelse kan se, at patienter

der har rapporteret bivirkninger ved HPV-vaccinen mikrobielt adskiller sig fra den raske

kontrolgruppe, kan det give håb for behandlingsmuligheder for de kvinder der er ramt af

symptomerne.

Hvis denne patientgruppe har en anderledes og evt. mindre divers

tarmbakteriesammensætning, kan man begynde at udvikle behandling, som kan forøge

livskvaliteten hos patienterne og i sidste ende kurere sygdommen. Man har tidligere haft held

med at behandle folk med forskellige lidelser med fæcestransplantationer. I en

fæcestransplantation overføres afføring fra et raskt individ, som ændrer

bakteriesammensætningen.

Desuden kan positive forskningsresultaterne fra dette forsøg give basis for en mere målrettet

undersøgelse af en kausal sammenhæng mellem vaccinen og symptomerne. Man kan f.eks. gå

epidemiologisk til værks og begynde et større forskningsprojekt, hvor man belyser hvorvidt

disse forskelle i mikrobiota er årsag til udviklingen af symptomerne eller blot er en del af de

symptomer, som patienterne har til fælles.

Det er kun en lille del af ME/CFS-tilfælde der er forbundet med HPV-vaccinen. Langt den

største del af tilfældene synes at udløses af virusinfektioner som Epstein-Barr, Enterovirus og

Borrelia.[7][8] Det kan således tænkes, at symptomerne ikke er en direkte virkning af

vaccinen, men at patienterne i forvejen har været disponeret for sygdommen, og at vaccinen

bliver en udløsende faktor.[9] Hvis man er i stand til at identificere de personer, der er i risiko

for at udvikle ME/CFS, kan man undtage dem fra vaccinen og dermed genoprette tilliden til

HPV- vaccinen og gøre brugen af den mere sikker.

Tak

Først og fremmest tak til forsker Louise Schouborg Brinth og overlæge Jesper Mehlsen, ved

Synkopecenteret på Frederiksberg Hospital for deres hjælp og vilje til at dele ud af deres

erfaring. Derudover skylder jeg Tine Rask Licht, leder af afdeling for fødevaremikrobiologi hos

DTU, en stor tak. Hun var til stor hjælp i forhold til at indskærpe mit fokus og løbende hjælpe

mig med problemer der opstod undervejs.

Derudover ønsker jeg at takke mine forældre for deres støtte - især min mor for at give mig

indblik i en hverdag som ME/CFS-patient og bruge sin sparsomme energi på at hjælpe mig. Jeg

skylder desuden en tak til Louise Lundbæk og Line Bach fra Allerød Gymnasium for vejledning

og råd.


Litteraturliste

Referencer [1] L. Brinth, K. Pors, A.G. Hoppe, I. Badreldin, J. Mehlsen

Is Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis a Relevant Diagnosis in

Patients with Suspected Side Effects to Human Papilloma Virus Vaccine?

International Journal of Vaccines and Vaccination, (4) (2015)

[2] http://me-foreningen.dk/om-me/

Om ME

Ukendt, me-foreningen.dk, besøgt 17/8/2016 [3] L. Giloteaux, J.K. Goodrich, W.A. Walters, S.M. Levine, R.E. Ley, M.R. Hanson

Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals

with myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome

Microbiome, 4 (1) (2016), p. 1

[4] P. Kadam, S. Bahlerao

Sample size calculation

International Journal of Ayurveda Research, 1 (1) (2010), p. 55-57

[5] http://www.microbeworld.org/careers/tools-of-the-trade/genetic-tools-and-

techniques/16s-rrna

16S rRNA

Ukendt, microbeworld.org, besøgt 1/10/2016

[6] https://laegemiddelstyrelsen.dk/da/bivirkninger/bivirkninger-ved-medicin/hpv-

vaccination/pulje-til-forskning

Forskning i mulige bivirkninger ved HPV-vaccination

H. Harder, laegemiddelstyrelsen.dk, besøgt 28/10/2016

[7] J. Treib, M.T. Grauer, A. Haass, J. Langenbach, G. Holzer, R. Woessner

Chronic fatigue syndrome in patients with Lyme borreliosis

European Neurology, 43 (2) (2000), p. 107-109

[8] J.K.S. Chia

The role of enterovirus in chronic fatigue syndrome

Journal of clinical pathology, 58 (11) (2005), p. 1126–1132

[9] http://patient.info/health/chronic-fatigue-syndromemyalgic-encephalomyelitis-me

Chronic fatigue syndrome/Myalgic Encephalomyelitis (ME)

T. Kenny, patient.info, besøgt 15/9/2016

Bilag 2 De videnskabsetiske komiteer for region hovedstaden

Forsøgspersonersrettigheder i et sundhedsvidenskabligt forskningsprojekt

2014

Bilag 3 Region Syddanmark Medicinsk Center

http://me-foreningen.dk/om-me/

http://www.microbeworld.org/careers/tools-of-the-trade/genetic-tools-and-techniques/16s-rrna

http://www.microbeworld.org/careers/tools-of-the-trade/genetic-tools-and-techniques/16s-rrna

https://laegemiddelstyrelsen.dk/da/bivirkninger/bivirkninger-ved-medicin/hpv-vaccination/pulje-til-forskning

https://laegemiddelstyrelsen.dk/da/bivirkninger/bivirkninger-ved-medicin/hpv-vaccination/pulje-til-forskning

http://patient.info/health/chronic-fatigue-syndromemyalgic-encephalomyelitis-me


Patientvejledning Afføringsprøve

Sygehus Sønderjylland, udarbejdet i 1997, revideret i 2016

Forsidebillede

https://commonfund.nih.gov/sites/default/files/HMP%20IBD%20Image.jpg

A Novel Approach to Gene Sequencing Reveals Hidden Depths in Microbial Diversity

commonfund.nih.gov, besøgt: 25/10/2016

Øvrig

M. Frémont, D. Coomans, S. Massart, K.D. Mielier

High-throughput 16S rRNA gene sequencing reveals alterations of intestinal microbiota

in myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome patients

Anaerobe, 22 (8) (2013), p. 50-56

S.E. Lakhan, A. Kirchgessner

Gut inflammation in chronic fatigue syndrome

Nutrition and Metabolism, 7 (1) (2010), p. 79

K. Donegan, R. Beau-Lejdstrom, B. King, S. Seabroke, A. Thomson, P. Bryan

Bivalent human papillomavirus vaccine and the risk of fatigue syndromes in girls in the

UK

Vaccine, 31 (43) (2013), p. 4961–4967

L. Tomljenovic, S. Colafrancesco, C. Perricone, Y. Shoenfeld

Postural Orthostatic Tachycardia With Chronic Fatigue After HPV Vaccination as Part of

the “Autoimmune/Auto-inflammatory Syndrome Induced by Adjuvants” -Case Report

and Literature Review

Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports, 2 (1) (2014), p. 1

L.J. Jara, E. Izquierdo, G. Medina

Is the immune neuroendocrine system the connection between epipharyngitis and

chronic fatigue syndrome induced by HPV vaccine?

Immunologic Research, () (2016), p. 1-3

C. Shepherd

Is CFS Linked to Vaccinations?

International Journal of Vaccines and Vaccination, ? (?) (2009)

J.M. Janda, S.L. Abbott

16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Identification in the Diagnostic Laboratory:

Pluses, Perils, and Pitfalls

Journal of Clinical Microbiology, 45 (9) (2007), p. 2761–2764

T.J. Borody, A. Nowak, S. Finlayson

The GI microbiome and its role in Chronic Fatigue Syndrome: A summary of

bacteriotherapy

Journal of the Australasian College of Nutritional and Environmental Medicine, 31 (3) (2012),

p. 3-8

https://commonfund.nih.gov/sites/default/files/HMP%20IBD%20Image.jpg


Bilag

Bilag 1: Udvælgelse af bakterier der undersøges for i dette projekt blev besluttet på baggrund af

forskning lavet ved Cornell University på 48 ME/CFS-patienter og 39 kontroller. Af

nedenstående graf kan gruppens resultater læses, og jeg har her fundet inspiration til min

undersøgelse.

Af illustrationen fremgår det, at det kan være interessant at kigge på bestemte

bakteriefamilier, da forekomsten af disse hos ME/CFS-patiener adskiller sig fra

kontrolgruppen. De bakteriefamilier hvor ME/CFS-patienterne adskiller sig mest fra den

raske kontrolgruppe er Bacteroidaceae, Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Prevotellaceae

og Lachnospiraceae.

I mit forskningsprojekt undersøger jeg derfor netop disse bakteriefamilier for at se, om den

samme forskel kan ses hos de HPV-vaccinebivirkningsramte i et forsøg med 224

forsøgspersoner.


Bilag 2:


Bilag 3:


Bilag 4: Udregning af budget ved 80 forsøgspersoner:

Udgiftspost Noter Beløb Løn til sygeplejerske 10 minutter sættes af til hver

af de 80 forsøgspersoner. Sygeplejersken får en timeløn på 250 kr/timen.

(13 timer)*(250 kr/timen) = 3.250 kr

Løn til laborant Der samarbejdes med en laborant ved DTU, som forventes at kunne udføre analyse af prøverne på 5 arbejdstimer. Laboranten har primere, PCR-mix og PowerSoil-htp DNA isolation kit til rådighed. Laboranten får en timeløn på 250 kr/timen.


Løn til statistiker Statistisk behandling af data forventes at tage 2 timer. Statistikeren får en timeløn på 400 kr/timen.

(1,5 timer)*(400 kr/timen)= 800 kr

Sekvensering Sekvensering af 16S rRNA på maskinen Illumina MiSeq 2x250 bp. Sekvenseringen koster 180 kr/prøve.

(180 kr/prøve)*(80 prøver)= 14.400 kr

I alt 19.500 kr

Documents

Human papillomavirus infection vaccine · 16S rRNA gensekvensering En metode som er vidt udbredt til at undersøge fylogeni og taksonomi af prøver taget fra miljøer med komplekse