Upload
cateline-voisin
View
111
Download
3
Embed Size (px)
Citation preview
Hypermutabilité et adaptation chez les souches de Staphylococcus aureus isolées de mucoviscidose : rôle des gènes mutS et mutL et impact sur la résistance aux macrolides
Anne-Laure PRUNIERDirecteur de thèse : Pr. R. Leclercq Laboratoire Relations hôte et microorganismes des épithéliums, EA 2128Faculté de médecine, Université de Caen Basse-Normandie
2
Hypermutabilité et adaptation bactériennes
3
Survie des bactéries dans l’environnement : Survie des bactéries dans l’environnement : transmission fidèle du matériel génétiquetransmission fidèle du matériel génétique
≠≠Adaptation des bactéries à un environnement Adaptation des bactéries à un environnement fluctuant : modification du matériel génétiquefluctuant : modification du matériel génétique
Existence d’une petite proportion de bactéries hypermutables au sein des
populations
4
Bactéries non mutatrices avec mutations favorables
Hypermutabilité et évolution
Bactéries non mutatrices avec mutations délétères
Bactéries mutatrices avec mutations délétères
Bactéries mutatrices avec mutations favorables
Chemin direct (lent)
Chemin indirect (rapide) :
Mutateur transitoire
Bactéries mutatrices Bactéries non mutatrices
Pression de sélectionPression de sélection
Taddei et al., Science, 1997
5
Deux mécanismes principaux de modification du matériel génétique :
Partiellement contrôlés par le système de réparation des mésappariements (SRM)
Acquisition de matériel génétique étranger (transfert horizontal puis recombinaison homéologue)
Acquisition de mutations et transmission à la descendance (transfert vertical)
6
Le SRM chez E. coli
Marti, T.M. et al., J. Cell. Physiol., 2002
7
Conservation de la protéine MutS
S.aureus 347 ISVKDGGLFKVGFNTQLDEYLEASKNGKTWLAELQAKERQRTGIKSLKISFNKVFGYFIEB.subtilis 350 LSVKEGNLIKDGYNQKLDEYRDASRNGKDWIARLEQQEREYTGIRSLKVGFNKVFGYYIEE.coli 357 VLVRDGGVIASGYNEELDEWRALADGATDYLERLEVRERERTGLDTLKVGFNAVHGYYIQP.aeruginosa 359 AVIRDGGVIKTGYDAELDELQALSENAGQFLMDLEAREKARTGLPNLKVGYNRIHGYFIE
S.aureus 407 ITRANLQNFEPSEFGYMRKQTLSNAERFITDELKEKEDIILGAEDKAIELEYQLFVQLREB.subtilis 410 VTKANLHLLE--EGRYERNETLTNAERYITPELKEKEALILEAENNICELEYELFTELREE.coli 417 ISRGQSHLAP---INYMRRQTLKNAERYIIPELKEYEDKVLTSKGKALALEKQLYEELFDP.aeruginosa 419 LPRVQAEQAP---ADYIRRQTLKGAERFITPELKAFEDKALSAQSRALAREKALYEELLE
S.aureus 467 EVKKYTERLQQQAKIISELDCLQSFAEIAQKYNYTRPSFSENKTLELVESRHPVVERVMDB.subtilis 468 KVKQYIPRLQQLAKQMSELDALQCFATISENRHYTKPEFSKD-EVEVIEGRHPVVEKVMDE.coli 474 LLLPHLEALQQSASALAELDVLVNLAERAYTLNYTCPTFIDKPGIRITEGRHPVVEQVLNP.aeruginosa 476 RLIGHLAPLQDSASALAELDVLANLAERALNLDLNRPRFVEHTCLHIEQGRHPVVEQVLE
S.aureus 527 YNDYVPNNCRLDNETFIYLITGPNMSGKSTYMRQVAIISIMAQMGAYVPCKEAVLPIFDQB.subtilis 527 SQEYVPNNCMMGDNRQMLLITGPNMSGKSTYMRQIALISIMAQIGCFVPAKKAVLPIFDQE.coli 534 EP-FIANPLNLSPQRRMLIITGPNMGGKSTYMRQTALIALMAYIGSYVPAQKVEIGPIDRP.aeruginosa 536 TP-FVANDLALDADTRMLVITGPNMGGKSTYMRQTALIVLLAHIGSFVPAARCELSLVDR
S.aureus 587 IFTRIGAADDLVSGKSTFMVEMLEAQKALTYATEDSLIIFDEIGRGTSTYDGLALAQAMIB.subtilis 587 IFTRIGAADDLISGQSTFMVEMLEAKNAIVNATKNSLILFDEIGRGTSTYDGMALAQAIIE.coli 593 IFTRVGAADDLASGRSTFMVEMTETANILHNATEYSLVLMDEIGRGTSTYDGLSLAWACAP.aeruginosa 595 IFTRIGSSDDLAGGRSTFMVEMSETANILHNATDKSLVLMDEVGRGTSTFDGLSLAWAAA
8
Conservation de la protéine MutL
S.aureus 58 VDNGSGIEAE DLGLVFHRHA TSKLDQDEDL FHIRTLGFRG EALASISSVA KVTLKTCTDN B.Subtilis 58 LDNGEGMENE DCKRAFRRHA TSKIKDENDL FRVRTLGFRG EALPSIASVS HLEITTSTGE E.coli 57 RDNGCGIKKD ELALALARHA TSKIASLDDL EAIISLGFRG EALASISSVS RLTLTSRTAE P.aerugin 61 RDDGRGIPAD DLPLALARHA TSKIRELEDL ERVMSLGFRG EALASISSVA RLTMTSRTAD
S.aureus 118 ANGNEIYVEN GEILNH--KP AKAKKGTDIL VESLFYNTPA RLKYIKSLYT ELGKITDIVN B.Subtilis 118 GAGTKLVLQG GNIISE--SR SSSRKGTEIV VSNLFFNTPA RLKYMKTVHT ELGNITDVVN E.coli 117 QQEAWQAYAE GRDMNVTVKP AAHPVGTTLE VLDLFYNTPA RRKFLRTEKT EFNHIDEIIR P.aerugin 121 AGEAWQVETE GRDMQPRVQP AAHPVGTSVE VRDLFFNTPA RRKFLRAEKT EFDHLQEVIK
S.aureus 176 RMAMSHPDIR IALISDGKTM LSTNG---SG RTNEVMAEIY GMKVARDLVH ISGDTSDYHI B.Subtilis 176 RIALAHPEVS IRLRHHGKNL LQTNG---NG DVRHVLAAIY GTAVAKKMLP LHVSSLDFEV E.coli 177 RIALARFDVT INLSHNGKIV RQYRAVPEGG QKERRLGAIC GTAFLEQALA IEWQHGDLTL P.aerugin 181 RLALARFDVA FHLRHNGKTI FALHEARDEL ARARRVGAVC GQAFLEQALP IEVERNGLHL
S.aureus 233 EGFVAKPEHS R-SNKHYISI FINGRYIKNF MLNKAILEGY HTLLTIGRFP ICYINIEMDP B.Subtilis 233 KGYIALPEIT R-ASRNYMSS VVNGRYIKNF PLVKAVHEGY HTLLPIGRHP ITFIEITMDP E.coli 237 RGWVADPNHT TPALAEIQYC YVNGRMMRDR LINHAIRQAC EDKLGADQQP AFVLYLEIDP P.aerugin 241 WGWVGLPTFS R-SQPDLQYF YVNGRMVRDK LVAHAVRQAY RDVLYNGRHP TFVLFFEVDP
S.aureus 292 ILVDVNVHPT KLEVRLSKEE QLYQLIVSKI QEAFKDRILI PKNNLDYVPK KNKVLYSFEQ B.Subtilis 292 ILVDVNVHPS KLEVRLSKET ELHDLIRDGI KDVFKQQQLI PSAQ---VPK KSAPAIKNEQ E.coli 297 HQVDVNVHPA KHEVRFHQSR LVHDFIYQGV LSVL-QQQLE TPLPLDDEPQ PAPRSIPENR P.aerugin 300 AVVDVNVHPT KHEVRFRDSR MVHDFLY--- -GTL-HRALG EVRPDDQLAP PGATSLTEPR
9
SRM et recombinaison
Inhibe la recombinaison entre fragments d’ADN homéologues : barrière à l’échange interspécifique (Matic et al., Trends Microbiol., 1996)
Important pour la notion de mutateur transitoire : réacquisition facilitée d’un SRM fonctionnel par recombinaison (de Visser, Microbiology, 2002)
Confirmé par la structure en mosaïque des gènes mutS et mutL (Denamur et al., Cell, 2000)
10
Hypermutabilité et pathogénicité
Données contradictoires sur cette relation
Avantage dans certaines pathologies, dans certaines conditions
Ex : forte pression antibiotique
environnement hostile et fluctuant
Altérations du SRM dans de nombreux cas
11
Hypermutabilité et résistance aux antibiotiques Mutateurs = facteurs de risque :
résistance par mutation mutations compensatoires du coût biologique de la résistance
Antibiotiques = sélecteurs de l’hypermutabilité (Blazquez, Clin. Infect. Dis, 2003)
Sélection de clones
résistants
Antibiotique A
Antibiotique B
Sélection de clones
résistants
12
Hypermutabilité et mucoviscidose
13
La mucoviscidose
Maladie génétique due à une mutation du gène cftr : atteintes pulmonaires et digestives (circulation difficile du chlore à travers la membrane cellulaire)
Atteinte pulmonaire : mucus épais contribuant à l’inflammation et à l’infection, principale cause de décès
14
Infections bactériennes chez les malades
Espèces bactériennes impliquées : H. influenzae (patients jeunes) S. aureus (patients jeunes) P. aeruginosa (patients plus âgés)
Adaptation pour combattre la réponse inflammatoire de l’hôte :
P. aeruginosa dits « mucoïdes » small colony variants de S. aureus
Administration prolongée de multiples antibiotiques
15
Hypermutabilité des souches isolées de mucoviscidose
P. aeruginosa : 19,5% de souches hypermutables, phénotype surtout dû à des altérations du SRM (Oliver et al., Science, 2000)
H. influenzae : 14,5% de souches hypermutables (Roman et al., J. Clin. Microbiol., 2004)
16
Les macrolides
17
Surtout actifs sur les bactéries à Gram positif
Inhibent la synthèse protéique : fixation à la sous unité 50S du ribosome (centre peptidyl transférase)
18
Résistance par mutation (1)
L4
L22
NISSEN et al., Science, 2000
19
Particulièrement aux positions A2058 et A2059
Mutations de l’ARNr 23S (gène rrl) : faible nombre de copies du gène
mycobactéries (1 copie) H. pylori (2 copies) S. pneumoniae (4 copies)
Jamais décrites chez S. aureus : 5/6 copies
Résistance par mutation (2)
20
S. aureus
Macrolide
RibosomeRibosome
Résistance aux macrolides chezS. aureus
Gènes de résistance acquis :
MéthylaseCH3
(1)erm
(2)
ABC transporteur
msr(A)
Modification enzymatique (3)
21
Résultats
22
Point de départ de l’étude
Observation au CHU de Caen : augmentation importante de la proportion de S. aureus résistants aux macrolides isolés de mucoviscidose (<30% en 1997, >50% en 1999)
Corrélation avec l’augmentation de l’utilisation de l’azithromycine pour son effet indirect putatif sur P. aeruginosa (anti-adhésion et réduisant l’inflammation) ?
23
Analyse des mécanismes de résistance aux macrolides chez les S. aureus isolés de mucoviscidose
24
Mutations de la cible des macrolidesPatient
(Souches)Gènes de résistance
ARNr 23S
L4 L22Domaine V Domaine II
1A
1B
1C, 1D
-
-
-
A2058T
A2059G
A2058G
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2B
2C
erm
-
-
A2058G
-
-
-
-
-
-
3A
3C
3D
erm
erm
erm
4
16
-
8
-
-
6
-
-
-
-
-
4A, 4B msr(A) T2089C, C2207T - - -
5B
5C, 5D, 5E
erm
-
C2163T
A2058G, C2207T
7
-
14
-
1
-
6B
6C
-
-
A2058G + 3
A2058G
-
-
-
-
-
1
7 - - - 2 -
8 - A2059G - - -
9 - A2058G - - -
(4/5)
(4/5)
(4/5)
(4/5)
(3/5)
(4/6)
25
Mutation du gène rrl Mutation successivement dans chaque copie
X
1
X
2
X
3
X
4
X
5
X
6
X
1 3 5
X X X X X
2 4 6
Mutation d’une copie puis transmission aux autres par conversion génique
26
Analyse du gène rrl quand 2 mutations adjacentes sont détectéesSouche
MutationsCopie A Copie B Copie C Copie D Copie E Copie F
4A2089C, 2207T
2089C, 2207T wt 2089C, 2207T wt 2089C, 2207T wt
5C2058G, 2207T
2058G, 2207T 2058G, 2207T 2058G, 2207T 2058G, 2207T 2058G, 2207T 2058G, 2207T
5D2058G, 2207T
2058G, 2207T wt 2058G, 2207T wt 2058G, 2207T 2058G, 2207T
5E2058G, 2207T
2058G, 2207T 2058G, 2207T 2058G, 2207T wt 2058G, 2207T 2058G, 2207T
Les mutations semblent s’être répandues par conversion génique entre les copies du gène rrl : recombinaison facilitée ?
27
Mutations des gènes domestiques
Détection d’altérations de gènes domestiques chez les souches accumulant de nombreuses mutations ribosomales :
sodA : résistance au stress oxydatif
spa : adhésion
28
Recherche de souches hypermutables parmi des isolats cliniques de S. aureus
29
Proportion de souches hypermutables chez les S. aureus isolés ou non de mucoviscidose
Test de Fisher (qualitatif): différence significative (p=0,0045)
Test de Mann-Whitney (quantitatif): différence significative (p=0,05)
Confirmé sur streptomycine
13 / 89: fréquence de mutation sur rifampicine >
10-7
1 / 74: fréquence de mutation sur rifampicine >
10-7Les souches résistantes aux macrolides isolées de
mucoviscidose accumulant de nombreuses mutations (ribosome + gènes domestiques) n’étaient pas
hypermutables
!
30
Analyse moléculaire de mutS et mutL chez les S. aureus cliniques
Gènes très conservés chez S. aureus
10 paires d’amorces définies
Séquençage intégral de la région mutSL chez les mutateurs et chez 4 souches contenant de nombreuses mutations ribosomales
31
Mutations de la cible des macrolidesPatient
(Souches)Gènes de résistance
ARNr 23S
L4 L22Domaine V Domaine II
1A
1B
1C, 1D
-
-
-
A2058T
A2059G
A2058G
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2B
2C
erm
-
-
A2058G
-
-
-
-
-
-
3A
3C
3D
erm
erm
erm
4
16
-
8
-
-
6
-
-
-
-
-
4A
4B
msr(A)
msr(A)
T2089C, C2207T
T2089C, C2207T
-
-
-
-
-
-
5B
5C, 5D, 5E
erm
-
C2163T
A2058G, C2207T
7
-
14
-
1
-
6B
6C
-
-
A2058G + 3
A2058G
-
-
-
-
-
1
7 - - - 2 -
8 - A2059G - - -
9 - A2058G - - -
32
Souches 3A et 5B Pas d’amplification avec les amorces mutSL Le gène mutS est indétectable en Southern blot :
A B C
S 3A 5B S 3A 5B S 3A 5B
S: souche de référence S. aureus RN4220
Électrophorèse sur gel d’agarose de l’ADN total restreint
Hybridation avec une sonde rrl (contrôle positif)
Hybridation avec une sonde mutS
Etape ultime de l’évolution des Etape ultime de l’évolution des S. aureusS. aureus isolés de mucoviscidose? isolés de mucoviscidose?
33
Altérations des protéines MutS et MutLSouche Hypermutabilité MutS MutL
1A + délétion F488 à R528, T192A aucune
UCN22 + délétion 5060 pb (1900 pb mutS et tout mutL)
UCN23 + aucune aucune
UCN24 + aucune aucune
UCN25 + aucune aucune
UCN26 + aucune aucune
UCN27 + aucune del L275 à R279
UCN28 + aucune Y314H
UCN29 +N181H, N373D, T415M, N588D, L811S,
S814CN364D, S377R, N418D
UCN30 + aucune aucune
UCN31 + aucune aucune
3A - délétion
3C -N181H, S201P, N373D, T415M, V773G,
G789D, L811SND
4A - aucune ND
5B - délétion
34
Analyse des gènes mutS et mutL chez S. aureus
35
Le SRM des bactéries à Gram positif
Surtout étudié chez B. subtilis, L. monocytogenes, S. pneumoniae
Corégulation des gènes mutS et mutL : opéron (B. subtilis, L. monocytogenes) séquences régulatrices similaires en amont (S. pneumoniae)
36
pBT1 (6.73kb)
Analyse in silico de la région mutSL chez S. aureus
U1S L4S
(1993 pb)
(8723 pb)
U5S L1L
(1211 pb)
U5L glpL
(717 pb)
U1L L4L
(1785 pb)
? ΔG=-17.3 kJ/mol ? ΔG=-22.4 kJ/mol
302 pb 12 pb 14 pb 36 pb 348 pb
glpFSA1136 mutS (2619 pb) mutL (2010 pb) glpP HP
37
Analyse par RT-PCR de la région mutSL
500 pb
1000 pb
1500 pb2000 pb
T 42 S 42 S 42 S 42 S
glpFSA1136 mutS (2619 pb) mutL (2010 pb) glpP HP
(1993 pb)
(+pBT1 = 8723 pb)
(1211 pb) (717 pb)
(1785 pb)
38
Rôle de MutS dans l’hypermutabilité chez S. aureus
pORI23
pORI23mutS
pORI23mutS1A
pORI23mutS29
RN4220 + pORI23mutS
mutS + pORI23mutS
RN4220 + pORI23mutS1A
mutS + pORI23mutS1A
mutS + pORI23mutS29
RN4220 + pORI23mutS29
mutS + pORI23
RN4220 + pORI23
39
Rôle de MutS dans l’hypermutabilité chez S. aureus
4
5
6
7
8
9Inv
erse
Lo
g o
f m
uta
tio
n f
req
uen
cie
s
4
4220 + pORI23422
0
4220 + pORI2
3 mutS2
9
mutS
mutS +
pORI23
mutS + pORI23 mutS
mutS + pORI23 mutS1
A
mutS + pORI23 mutS29
Log
in
vers
e d
es f
réq
uen
ces d
e
mu
tati
on
5
7
6
8
9
4220 + pORI23 mutS
4220 + pORI2
3 mutS1
A
40
3
4
5
6
7
8Inv
erse
Lo
g o
f m
uta
tio
n f
req
uen
cies
3
Log
in
vers
e d
es f
réq
uen
ces d
e
mu
tati
on
4
6
5
7
8
4220 + pAT mutL
4220 + pAT392
42204220 +
pAT mutL27
4220 + pAT
mutL29mutL
mutL + pAT392
mutL+ pAT mutL
mutL + pAT
mutL27
mutL + pAT
mutL29
Rôle de MutL dans l’hypermutabilité chez S. aureus
41
Rôle de MutS et MutL dans la prévention de la recombinaison homéologue chez S. aureus (1)
pBT1
(TS, CHLR)
pBT1sodA (100%)
pBT1sodA (97%)
pBT1sodA (94%)
pBT1sodA (87,5%)
pBT1sodA (74%)
pBT1sodA (82,3%)
RN4220
mutS
mutL
3 cultures successives à 42°C + CHL
42
S. aureus RN4220
707580859095100
DNA sequence identity
Su
rviv
al a
fter
3 s
ub
cult
ure
s at
42
°C (
rati
o o
f th
e in
itia
l in
ocu
lum
)1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
S. aureus RN4220
Pourcentage d’identité avec sodA
y=4.45x10-2X-3.3815
R²=0.9367
Su
rvie
ap
rès 3
cu
ltu
res
su
ccessiv
es à
42°C
(ra
tio d
e
l’in
ocu
lum
in
itia
l)
Rôle de mutS et mutL dans la prévention de la recombinaison homéologue chez S. aureus (2)
S. aureus mutL
707580859095100
DNA sequence identity
Su
rviv
al a
fter
3 s
ub
cult
ure
s at
42
°C (
rati
o o
f th
e in
itia
l in
culu
m)
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
S. aureus mutL
DNA sequence identity
y=4.72x10-2X-3.5188
R²=0.7393
Su
rvie
ap
rès 3
cu
ltu
res
su
ccessiv
es à
42°C
(r
ati
o d
e l’i
nocu
lum
in
itia
l)Pourcentage d’identité avec sodA
S. aureus mutS2
707580859095100
DNA sequence identity
Su
rviv
al a
fter
3 s
ub
cult
ure
s at
42
°C (
rati
o o
f th
e in
itia
l in
ocu
lum
)
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
DNA sequence identity
y=4.18x10-2X-3.0942R²=0.7726
S. aureus mutSS. aureus mutS
Su
rvie
ap
rès 3
cu
ltu
res
su
ccessiv
es à
42°C
(r
ati
o d
e l’i
nocu
lum
in
itia
l)
Pourcentage d’identité avec sodA
43
Relation entre hypermutabilité et résistance aux macrolides chez les S. aureus isolés de mucoviscidose
44
77 % chez les S. aureus hypermutables
50 % chez les S. aureus non hypermutables
Les souches hypermutables sont plus fréquemment résistantes (p<0,05 Test de Fisher)
Résistance à l’érythromycine
45
Sélection de clones résistants
Erythromycine Azithromycine Télithromycine
4
5
6
7
8
9
10
inve
rse
log
of
mu
tati
on
fre
qu
enci
es UCN23
UCN30
UCN22
GR87
RN4220
Souches
hypermutables
Souches témoins
Log
in
vers
e d
es f
réq
uen
ces d
e
mu
tati
on
4
5
6
7
8
9
10
46
Conclusions (1) Mucoviscidose : résistance aux macrolides des S. aureus
surtout due à des mutations de la cible ribosomale
Au moins trois copies du gène rrl étaient mutées chez chaque mutant de l’ARNr 23S étudié
La dissémination d’une mutation rrl entre les différentes copies du gène semble se faire par conversion génique
Relation avec l’administration prolongée d’azithromycine aux patients atteints de mucoviscidose (?)
47
Conclusions (2) Ces observations pourraient être liées à une forte
proportion de souches hypermutables chez les S. aureus dans la mucoviscidose:
Les souches hypermutables sont plus fréquemment résistantes à l’érythromycine
Les souches hypermutables sensibles aux macrolides acquièrent plus facilement une résistance par rapport aux souches sauvages
L’utilisation de combinaisons d’antibiotiques semble nécessaire pour éviter l’apparition de souches hypermutables
48
Conclusions (3) Spécificité de l’hypermutabilité des souches
isolées de mucoviscidose ?
Non : forte proportion de mutateurs dans d’autres pathologies
(ex: ITU – Denamur et al., J. Bacteriol., 2002)
Effets conjugués des pressions (antibiotiques + réponse immunitaire de l’hôte) : sélection de mutateurs
49
Conclusions (4)
Rôle de MutS et MutL chez S. aureus : Hypermutabilité : confirmé chez 4 souches cliniques Recombinaison : effet limité ?
Perspectives : Autres gènes mutateurs chez S. aureus ? Relation entre hypermutabilité et évolution du génome
de S. aureus ?
Hypermutabilité et adaptation chez les souches de Staphylococcus aureus isolées de mucoviscidose : rôle des gènes mutS et mutL et impact sur la résistance aux macrolides
Anne-Laure PRUNIERDirecteur de thèse : Pr. R. Leclercq Laboratoire Relations hôte et microorganismes des épithéliums, EA 2128Faculté de médecine, Université de Caen Basse-Normandie