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Principaux outils en Biologie Moléculaire:

acides nucléiques, enzymes, notion d’hybridation.

Préparation et marquage des sondes

I. Préparation du matériel biologique

• Extraction et purification de l’ADN• Extraction et purification de l’ARN

– ARN totaux– ARN messagers

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A - Extraction de l’ADN

- Sang total- Culture cellulaire- Tissu sain / tumeur- Villosités choriales …

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CAS du SANG TOTAL : tube avec anti-coagulant ( EDTA +++)pas d’héparine !!!

plasmaGlobulesblancs

Globules rouges

Solution hypotonique

+ centrifugation 2

Culot de blancs

Centri 1

1. Élimination du plasma

2. Lyse des globules rouges

3. Culot de globules blancs

Purification de l’ADN au phénol chloroforme: Phénol → phase aqueuse : ADN

→ phase phénolique(éliminée): protéinesChloroforme → phase aqueuse : ADN

→ phase chloroformique (éliminée): traces de phénol résiduel

Ethanol /NaCl → ADN précipité (« méduse »)

Culot de blancs

SDS + protéinase KLyse des membranes et digestion des protéines associées à l’ADN

ADN libre en solution

Méthodes commerciales: pas de réactifs toxiques, solution d’ADN concentrée

Méduse

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Séchage de la méduseCulot sec repris dans un tampon

Evaluation de la concentration1 unité DO à 260nm = 50µg/ml

Mesure directe de la DO sur ADN dissout

B - EXTRACTION DE L’ARN

- ARN fragiles +++ → RNAses ubiquitaires- conditions stériles (RNAses bactériennes)- cellules ou tissus traités immédiatement

- détergent : SDS- agent dissociant : isothiocyanate de guanidine- solution tampon- agent réducteur : β mercapto-éthanol /DTT

→ inhibition des RNAses, dénaturation des protéines

- séparation ARN/ADN- par précipitation différentielle en fonction du pH- par respect des structures nucléaires (ARN libres ds le cytoplasme)

- purification par traitement à la DNase

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T T T

T

T

T TT

Oligo dTcellulose

ARN totaux = ARN ribosomaux + ARNm

A A A A ARNm

A A A A ARNm

C% salineimportante

C% salinefaible

Elution des ARNm

Elution des ARNr

T T T

T

T

T TT

Précipitation à l’alcool

Devenir des acides nucléiques extraits

• Exploitation directe avec ou sans amplification : Southern/Northern Blot, PCR, RT-PCR…

• Conservation : – En solution, à 4°C : qq années

– Sous forme précipitée à -20°: plus long terme

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II. LES OUTILS ENZYMATIQUES

A – Les enzymes de restriction

B – Visualisation des fragments de restriction

C – Utilisation des enzymes de restriction- carte de restriction- autres…

D – Les autres enzymes

A - ENZYMES DE RESTRICTION

NOMENCLATURENOMENCLATURE

Escherichia co li Ry13

Eco R I 1ière enzyme trouvée chez E coli

Eco R V 5ième enzyme trouvée chez E coli

Providencia StuartiPst I

Endonucléases d’origine bactérienne (défense contre les bactériophages)

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LES DIFFERENTS TYPES DLES DIFFERENTS TYPES D’’ENZYMES DE RESTRICTIONENZYMES DE RESTRICTION

Type I : coupure aléatoire 1000 à 1500 bases après le site reconnu et libération de qq dizaines de nucléotides

Type II : coupure au niveau de la séquence reconnue

Type III : coupure une vingtaine de paire de bases après la séquence reconnue

En pratique, enzymes de type II +++

Isoschizomères : enzymes ≠ reconnaissant le même site de coupure

LES SEQUENCES RECONNUES (Type II)LES SEQUENCES RECONNUES (Type II)→ courtes (4 - 6 pb +++), palindromiques

COUPURES A BOUTS COHESIFS Ex : EcoR I

5 ’……G A A T T C …….3 ’ 5 ’……. G AATTC……3 ’3 ’……C T T A A G…….5 ’ 3 ’…….. CTTAA G……5 ’

COUPURES A BOUTS FRANCS (BLUNT ENDS) ex : Sma I

5 ’ …….C C C G G G …….3 ’ 5 ’ …….C C C G G G …….3 ’3 ’ …….G G G C C C …….5 ’ 3 ’ …….G G G C C C ……..5 ’

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Enzyme Bactérie d’origine Séquence cible(coupure à l’*)5' -->3'

Ava I Anabaena variabilis C* C/T C G A/G G

Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C

Bgl II Bacillus globigii A* G A T C T

Eco RI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C

Eco RII Escherichia coli R245 * C C A/T G G

Hae III Haemophilus aegyptius G G * C C

Hha I Haemophilus haemolyticus G C G * C

Hind III Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T

Hpa I Haemophilus parainflenzae G T T * A A C

Kpn I Klebsiella pneumoniae G G T A C * C

Mbo I Moraxella bovis *G A T C

Pst I Providencia stuartii C T G C A * G

Sma I Serratia marcescens C C C * G G G

Sst I Streptomyces stanford G A G C T * C

Sal I Streptomyces albus G G * T C G A C

Taq I Thermophilus aquaticus T * C G A

Xma I Xanthamonas malvacearum C * C C G G G

Sites = 4 à 6 pbasesCoupure fréquente~ 3kb

Sites = 8 pbasesCoupure rare~ 100-200kb

Fréquence statistiquede la séquence cibleν = 1/4nb de bases

EXEMPLE : COUPURE PAR EcoRI

EcoRI EcoRI EcoRINNGAATTCNN NNGAATTCNN NNGAATTCNN

NNCTTAAGNN NNCTTAAGNN NNCTTAAGNN

NNGOH p AATTCNN NNGOH pAATTCNN NNGOH pAATTCNN

NNCTTAAp OH GNN NNCTTAAp OHGNN NNCTTAAp OHGNN

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SITES METHYLES

- Influence de la méthylation sur l’expression des gènes.- L’ADN des eucaryotes peut être méthylé au niveau des cytosines CpG. - Certaines enzymes ne reconnaissent pas l’ADN méthylé

→ enzymes sensibles à la méthylation

Ex: HpaII et MspI: isoschizomères (C/CGG) mais HpaIIsensible à la méthylation

→ identité de profil électrophorétique attendue sauf si méthylation fragments de taille différente

C CG GG GC C

HpaII ne coupe pas MspI coupe

C CG GG GC C

Sau 3A site contenu dans Bam HI : sites compatibles

…...G A T C……. …...G G A T C C……. …...C T A G……. ……C C T A G G…...

SITES INCLUS

Intérêt : • ADN1 coupé par Sau 3A, ADN2 coupé par Bam HI• réassociation possible de fragments de restriction ADN1/ADN2• recombinant non clivable par Bam HI sauf si N=G

NN

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II . LES OUTILS ENZYMATIQUES

A – Les enzymes de restriction

B – Visualisation des fragments de restriction

C – Utilisation des enzymes de restriction- carte de restriction - autres…

D – Les autres enzymes

Visualisationdes fragmentsde restriction(électrophorèse)

An Introduction to Genetic Analysis

Après colorationau BET

Sens de la migration

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ADN génomiquenon coupé

ADN génomique

coupé

ADN de phage (50kb)

coupé

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Nombre de kb(échelle Log)

Migration mm

II . LES OUTILS ENZYMATIQUES

A – Les enzymes de restriction

B – Visualisation des fragments de restriction

C – Utilisation des enzymes de restriction- carte de restriction - autres…

D – Les autres enzymes

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CARTE DE RESTRICTION

Coupure d’un ADN linéaire ou d’un plasmide par une enzyme de restriction

Séparation des fragments obtenus par électrophorèse

Evaluation du nombre et de la taille des fragments générés

→ L’usage de plusieurs enzymes seules ou combinées et l’étude des profils électrophorétiques obtenus permet de localiser les sitesde restriction et de définir une « carte de restriction »

Profils électrophorétiques obtenus après coupure et migration

Les fragments de 3, 7 et 10 kbobtenus en simple coupure ont également un site de coupure

pour l’autre enzyme3 kb = 2 kb+1 kb7 kb = 6 kb+1 kb10 kb = 8 kb+2 kb

17 kb

Exemple de carte de Exemple de carte de restrictionrestriction

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Autre application desenzymes de restriction

→ génération d’ADNrecombinant par ligationdes extrémités cohésives

ADN ADN plasmidiqueplasmidiqueGène à insérer

ligation

Coupure par EcoRI

ADN recombinant

Applications nombreuses des enzymes de restriction (diagnostic / recherche):

• identification de mutations créant ou supprimant un site de coupure (hémochromatose, mucoviscidose, drépanocytose)• étude des polymorphismes minisatellites (criminologie)• génération de plasmides recombinants• création de banques génomiques• …

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II . LES OUTILS ENZYMATIQUES

A – Les enzymes de restriction

B – Visualisation des fragments de restriction

C – Utilisation des enzymes de restriction- carte de restriction - autres…

D – Les autres enzymes

Les polymérases

- Origine bactérienne

- L’ADN polymérase I (E coli)- activité polymérasique 5’→3’: nécessité d’une amorce 3’OH- activité exonucléasique 5’→3’ et 3’→5’ (activitéproofreading)

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Les polymérases

• Le fragment de Klenow de la Polymérase I (E coli)– obtenu par protéolyse ménagée de la précédente– mêmes ptés sauf activité exonucléasique 5’→3’

• La Taq polymérase– Origine: Thermus aquaticus → thermostable– Mêmes ptés que le fragment de Klenow– En général, pas d’activité proofreading– +/- qualité hot start

Les polymérases

• Les ARN polymérases– Activité polymérasique 5’→3’– Amorce 3’OH non nécessaire mais présence du

promoteur correspondant indispensable– Pas d’activité proofreading

• La transcriptase inverse– Origine rétro-virale– Activité polymérasique 5’→3’: synthèse d’ADN à partir

d’une matrice ARN– Amorce 3’OH nécessaire– Activité RNase H (destruction de l’ARN des hybrides

ADN/ARN)

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Autres …

• Nucléases– DNase I:

• Endonucléase ADN db ou sb

• Trous = « nicks » au hasard

– nucléase S1• Endonucléase ADN sb uniquement

• RNases– RNase A : ubiquitaire, très active et résistante,

détruit les ARNsb

– RNase H : destruction des ARN ds les hybrides ADN / ARN

Autres….

• Ligases

– formation des liaisons phosphodiester entre des extrémités 3’OH et 5’phosphate libres

– Extrémités cohésives: ADN ligase d’E coli

– Extrémités cohésives ou franches: T4 DNA ligase

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Molecular Cell Biology

Autres …

• Kinases et phosphatases- traitement à la phosphatase alcaline

PALextrémité 5’phosphate 5’OH� plus de ligation possible

- T4 polynucléotide kinase : extrémité 5’OH 5’phosphate

� ligation à nouveau possible

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Enzymes, conclusion …

• Grand choix d’enzymes• Actions diverses

• Usage courant en génétique moléculaire

III . Hybridation molIII . Hybridation molééculaireculaire

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21

Notion de Tm (Melting Temperature)

- Tm = t°de fusion du DNA

- Température au-delà de laquelle l’ADN passe sous forme simple brin.

- Phénomène coopératif

- Modification de la DO à260 nm

Facteurs agissant sur la valeur du Tm

• Composition en basesTm = 69,3 + 0,41(%G+C)

• Longueur des fragmentsADN long ↔ Tm

• Stringence du milieu (= faible force ionique)milieu stringent ↔ Tm

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HYBRIDATION MOLECULAIRE

ADNdouble brin

ADNsimple brin

Simple brin

glace

refroidissement progressif

REAPPARIEMENT

HYBRIDATION

Dénaturation- chauffage > Tm- agent dénaturant

Conditions nécessaires àl’hybridation:

- Refroidissement lent

- Reconnaissance d’une séquence strictement complémentaire ↔ absolue spécificité

Rq : Hybrides ADN/ARNpossibles, + stables

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FACTEURS DE L’HYBRIDATION

- Température de fusion / composition en G + C

- Facteurs influençant l’hybridation

- la C% dC% d’’ADN et le tempsADN et le temps→ probabilité de rencontre

- la température VmaxVmax ↔↔ tt°°= 0,75Tm= 0,75Tm

- la complexitcomplexitéé des séquences

- la force ioniqueforce ioniqueélevée ↔ favorise l’hybridation

L’hybridation peut avoir lieu

1 - en solution (PCR+++)

2 - sur support solide : immobilisation sur membrane (nitrocellulose, nylon), sur verrecolonies bactérienneschromosomescoupe de tissus, cultures cellulaires...

Objectif : détecter la présence d'un acide nucléique d'une séquence donnée par l’utilisation d’un fragment d’ADN complémentaire = sonde

Les différents types d’hybridation

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SOUTHERN BLOTSOUTHERN BLOTHybridation sur support solide (nitrocellulose)

25

1 . Séparation des fragments de restriction

2. Transfert

3. Hybridation de la sonde

4. Révélation

EcoRI EcoRIFMR 1 exon 1

Sonde StB 12.3(CGG)6-45

EagI

5,2 kB

2,8 kB

ApplAppl°° : : SdSd X fragileX fragile

- Gène FMR1 - Région répétée : triplets CGG (n = 6 à 45)- n très ↑ chez les malades- Southern blot : chez les malades, le fragment révélé par la sonde est de taille augmentée

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5,2 kB

EcoRI EcoRIFMR 1 exon 1

Sonde StB 12.3(CGG)6-45

EagI

2,8 kB

NORTHERNNORTHERN BLOT BLOT -- distribution ddistribution d’’un ARN un ARN dsds les tissusles tissus-- éévaluation de son abondance relativevaluation de son abondance relative-- ddéétermination de sa taille, des termination de sa taille, des éépissagespissages possiblespossibles

Expression comparée de l’ARNm de PEDF chez le fœtus et l’adulte- Différences notables : cerveau, rein- Expression similaire : cœur, foie, poumon

ExempleExemple

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Hybridation Hybridation in situin situ sur culture cellulairesur culture cellulaire

�� DDéétection tection du virus d'du virus d' EpsteinEpstein --BarrBarr à l’aide d’une sonde reconnaissant l’ARN (= génome) viral

- coloration bleu foncée des noyaux infectés - contre coloration verte des autres noyaux

Indications : Syndromes lymphoprolifératifs et lymphomes

Hybridation Hybridation in situin situ sur coupe de tissusur coupe de tissu

�� Objectif :Objectif : déterminer quelle sous population cellulaire d’un tissu exprime un ARN donné

Coupe d'embryon de Drosophile qui a subi une Coupe d'embryon de Drosophile qui a subi une hybridation avec une sonde d'un ghybridation avec une sonde d'un gèène impliqune impliquéédans le ddans le dééveloppement embryonnaireveloppement embryonnaire

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Hybridation Hybridation in situ in situ sur chromosomesur chromosome

ObjectifObjectif : déterminer sur quel chromosome et dans quelle région se trouve le gène dont on possède la sonde.

En pratique :- préparation des chromosomes (métaphase)- hybridation directement sur les préparations fixées sur lame- sonde marquée au tritium (H3): rayonnement très court, donne donc une localisation fine de la zone émettant la radioactivité. - résultat lu sous microscope : les signaux positifs apparaissent sous forme de grains noirs disposés sur les chromosomes.

Localisation Localisation d'un gd'un g èène de ne de

DrosophileDrosophile

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Application diagnostique de la FISH: Sd de Williams (microdélétion Ch7)

Chromosome painting → sondes permettant le marquage d’unepaire de chromosomes

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Multi FISH :Caryotype 24 couleurs

Hybridation sur colonie de bactéries, sur plage de lyse

�� Objectif:Objectif: détecter parmi un grand nombre de bactéries ou de phages recombinants celle ou celui qui contient le fragment d'ADN recherché →→ criblage de banquecriblage de banque

Boîtes avec colonies

-bactéries ou phages-

(milliers àmillions)

Prise d'empreinte(nylon ou

nitrocellulose)

Coussin de NaOH(éclatement cellules +

dénaturation ADN)

Fixation(cuisson ou UV)

Addition de la sonde

HybridationAutoradiographieLocalisation des clones d'intérêt

Lavages

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Criblage dCriblage d ’’une une banque banque phagiquephagique

Identification du clone d’intérêt

Infection de bactéries pour production

massive du clone recombinant

Isolement du phage recombinant

sur la boite mère

Gène d’intérêt

IV . LES SONDESIV . LES SONDES

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IV . LES SONDES

A – Définition

B - Les différents types de sondes

C- Obtention des sondes

- clonage

- PCR

D – Marquage des sondes

A A –– DDééfinitionfinition

• Séquence d’acide nucléique simple brin , d’au – 15 nucléotides

• Homologue d’une séquence ARN ou ADN• Hybridation stable et spécifique par

réassociation entre bases complémentaires

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B B -- DiffDifféérents types de sondesrents types de sondes

• Sonde d’ADN génomique (sélectionnée àpartir d’une banque d’ADN génomique)

• Sonde d’ADNc (sélectionnée à partir d’une banque de cDNA)

• les oligosondes : 20-25 pb +++• les ribosondes :

CC-- ObtentionObtention

• Clonage : fragment d’intérêt inséré dans un vecteur

• PCR• Synthèse chimique

– Oligosonde +++

• Transcription in vitro– Ribosonde : à partir d’un fragment d’ADN

cloné ds un vecteur pourvu d’un promoteur spécifique d’une RNA polymérase

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D D –– Marquage des sondesMarquage des sondes

1 - l’agent de marquage :

- marquage radioactif

- marquage froid- direct – nucléotide modifié par un fluorophore- indirect – nucléotide marqué par un reporter qui

sera repéré par une molécule affine

2 - stratégies de marquage

- nick translation- multi-amorçage au hasard- marquage des oligonucléotides

Les sondes radioactivesLes sondes radioactives

32P, 35S, 3H

Révélation par autoradiographie

Attention : les sondes radioactives présentent de nombreux inconvénients :

1. nécessité de se protéger contre le rayonnement émis, maniement des sondes inconfortable, traitement des déchets

2. décroissance rapide du 32P, d'où besoin de marquer les sondes fréquemment (T1/2 = 15 jrs)

Avantage : grande sensibilité

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D – Marquage des sondes

1 - l’agent de marquage :

- marquage radioactif

- marquage froid- direct – nucléotide modifié par un fluorophore- indirect – nucléotide marqué par un reporter qui

sera repéré par une molécule affine

2 - stratégies de marquage

- nick translation- multi-amorçage au hasard- marquage des oligonucléotides

Les sondes froidesLes sondes froides

- Digoxigénine :révélation par un Ac anti-digoxigénine marqué par

- un fluorochrome- une enzyme : addition d’un substrat chromogène

- Système biotine-streptavidine :sonde biotinyléerévélation par l’avidine /streptavidine(affinité +++ pr la biotine) marquée par

- un fluorochrome- une enzyme

amplification par des systèmes sandwichs divers (Ac anti-avidineégalement marqués)

Marquage indirect

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Les sondes froides

Fluorophore

Nucléotide portant le marqueur est incorporé directement.

Groupe chimique qui fluoresce quand il est exposé à une longueur d’onde donnée : Fluorescéïne, Cy5, Cy3, Rhodamine, Texas Red

Marquage direct

D – Marquage des sondes

1 - l’agent de marquage :

- marquage radioactif

- marquage froid- direct – nucléotide modifié par un fluorophore- indirect – nucléotide marqué par un reporter qui

sera repéré par une molécule affine

2 - stratégies de marquage

- nick translation- multi-amorçage au hasard- marquage des oligonucléotides en 5’

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Marquage par Marquage par NickNick--TranslationTranslation

-Traitement de la sonde par la DNAse(conditions ménagées)

- Génération de qq coupures aléatoires(nicks = trous) sb

- Action de la DNApol I : - dégradation de l’ADN au niveau descoupures (activité exonucléase)- repolymérisation avec incorporationde nucléotides marqués (activitépolymérase)

Marquage par Marquage par randomrandom primingpriming

- Dénaturation de la sonde

- Addition d’un cocktail d’hexanucléotides synthétiques → hybridation au hasard

- Les nucléotides hybridés servent d’amorce au fragment de Klenow quireconstitue le brin complémentaireet incorpore des nucléotides marqués

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Marquage des Marquage des oligonucloligonuclééotidesotides en 5en 5’’