Immunisation contre la tumeur ii virus SV,,; relation antigknique entre les cellules embryonnaires de hamster et les cellules transformkes par le SV,,'

GINETTE HOULE,' G . RICHER,' R. DUBREUIL ET A. G. BORDUAS Znstitut de Microbiologie et d1Hygi6ne de Montreal, 531, Boulevard des Prairies, Laual, Quebec

Approuve le 20 novembre 1973

HOULE, G., G . RICHER, R. DUBREUIL et A. G . BORDUAS. 1974. Immunisation contre la tumeur a virus SV4,; relation antigenique entre les cellules embryonnaires de hamster et les cellules transformees par le SV,,. Can. J. Microbiol. 20: 379-383.

Le degrt de protection confire par I'injection de differentes preparations cellulaires contre une greffe ulterieure de cellules tumorales a CtC CtudiC chez le hamster. Les cellules tumorales irradiies ont confer6 un haut degrt de protection, alors qu'une protection moindre a etC induite par des cellules tumorales antigtniquement modifiies ou par des cellules tumorales dCsintCgrCes par congelation-dCcongC1ation. Un phenomene de facilitation immunologique a etC observe lorsque I'immunisation a etC faite avec des cellules embryonnaires irradiees, ce qui tendrait a montrer qu'il existe une relation antigtnique entre les cellules d'embryon de hamster et les cellules de hamster adulte transformees par le SV,,.

HOULE, G., G. RICHER, R. DUBREUIL, and A. G. BORDUAS. 1974. Immunisation contre la tumeur a virus SV4,; relation antigtnique entre les cellules embryonnaires de hamster et les cellules transformees par le SV40. Can. J. Microbiol. 20: 379-383.

The degree of protection conferred by the injection of different cellular preparations against the subsequent challenge with cells transformed by SV,, was studied in the hamster. Irradiated tumor cells have afforded a high degree of protection, while a smaller degree of protection was induced by antigenically modified tumor cells or by tumor cells desintegrated by freezing and thawing. An enhancement phenomenon was observed when irradiated embryonic cells were used for immunization: that would indicate that an antigenic relationship exists between em- bryonic hamster cells and adult hamster cells transformed by SV,,.

Introduction

On a rapport6 que l'injection de cellules tumo- rales antigtniquement modifites pouvait induire la regression de tumeurs autologues chez la souris (7) et m&me chez l'homme (8). Si des cel- lules tumorales antigtniquement modifites sont capables d'induire une rtponse immunologique suffisamment forte pour entrainer la regression d'une tumeur, ces m&mes cellules devraient &tre capables d'induire une rtponse immunologique chez un animal normal et de le prottger contre une greffe ulttrieure de cellules tumorales.

Nous avons donc ttudit le pouvoir immunisant de cellules tumorales antigtniquement modifites comparativement au pouvoir immunisant de cellules tumorales irradites, de cellules tumorales dtsinttgrees, ou de cellules embryonnaires irradites.

La protection induite par des cellules tumorales antigtniquement modifites s'est avtrte beaucoup plus faible, dans nos conditions exptrimentales, que celle induite par des cellules tumorales

' R e ~ u le 28 mai 1973. ZAdresse actuelle: Service de Microbiologie, HBpital

Saint-Luc, MontrCal, Que.

irradites. Par ailleurs, un phtnomene de facilita- tion immunologique a t t t observe chez les ani- maux immunists avec des cellules embryonnaires irradites indiquant une relation antigtnique entre les cellules d'embryon de hamster et les cellules de hamster adulte transformtes par le Sv40'

Materiel et methodes ( I ) At~in~arrx

Les animaux utilises dans ce travail sont des hamsters mdles (Mesocricetrrs a~rratrrs), dges d'environ 2 mois, provenant d'un fournisseur local. 11s ont ete rtpartis a raison de quatre animaux par cage et ont reCu eau et nourriture ad libitum.

(2 ) Cultrrrrs cellulaires Deux ligntes de cellules tumorales ont Cte utilisees dans

ce travail: les cellules CH, provenant d'une tumeur induite in vivo chez le hamster par le virus SV40 et propagees par la suite en culture de tissu pendant 125 passages et les cellules RHa3-T provenant d'une culture de cellules renales de hamster transformees in vitro par le SV,, et ayant subi depuis 35 passages en culture. Ces deux ligntes cellulaires ont ete cultivees dans le milieu minimal de Eagle additionne de 10% de serum foetal bovin (9). Com- me nous n'avons pas travaille en systeme syngeneique, I'utilisation de deux IignCes cellulaires differentes pour I'immunisation et I'epreuve ainsi que l'utilisation d'un groupe temoin immunise avec du tissu normal (cellules

No de contribution IMHM 585.

380 CAN. 1. MICROBIOL. VOL. 20. 1974

embryonnaires irradiees) nous ont semblC necessaires afin d'eliminer la possibilitk que les effets de protection observCs soient dus des antigenes de transplantation plutdt qu ' i des antigenes tumoraux. Les cellules embryon- naires de hamster proviennent de cultures primaires d'embryons de 12 jours. Pour Ctablir ces cultures, le tronc des embryons a CtC dCcoupC en petits fragments; les cel- lules Ctaient ensuite dissociees par la trypsine, puis reprises dans le milieu minimal de Eagle enrichi de 10% de serum foetal bovin et ajustees a raison de 200 000 cellules par millilitre.

(3) Traitements des suspetlsiot~s ce1lrrlail.e~ Irradiatiotz Les cellules irradikes ont r e p une dose de 4000 R dans

un appareil a Cobalt 60, Gammacell 220 (Energie Ato- mique du Canada, Limitee).

Dt?sirltigratio~r Les cellules ont etC dCsintCgrCes par congelation-

dCcongClation, repCtCe quatre fois.

Modifcatiotr atrti.t?nique Les cellules CH, ont CtC modifiCes antiginiquernent

par couplage de la ferritine a la cellule par I'intermCdiaire de la benzidine bisdiazotke, selon la technique decrite par Czajkowski et al. (7).

(4 ) It,~t,~unisntiotz Les immunisations ont CtC faites par injection intra-

ptritontale d'une dose de loG cellules dans un volume de 0.5 ml, une fois par seniaine pendant 3 semaines. Huit groupes experiliientaux ont ete constituks, correspondant aux differents programmes d'immunisation.

Groupe I : Animaux temoins qui ne re~oivent aucun traitement avant l'epreuve.

Groupe 11: Aniniaux traites avec des cellules embryon- naires irradiees.

GroupeII I : Animaux traites avec des cellules CH, irradiCes.

Groupe IV: Animaux trait& avec des cellules CH4 desinttgrees.

Groupe V: Animaux traitis avec des cellules CH, antigtniquement modifiees.

Groupe VI: Animaux trait& avec des cellules CI-I, antigtniquement modifiees et irradites.

Groupe VII: Animaux trait& avec des cellules CH, antigkniquement modifites et irradiCes. D e plus, les animaux sont prC-immunists avec I'agent modifiant 3 semaines avant le debut de I'immunisation. La prBimmunisation consiste en I'injection de 0.5 nig de ferritine par animal, en tmulsion dans I'adjuvant complet de Freund, par voie intra-plantaire.

Groupe VIII: Animaux traitCs avec des cellules CH, antigeniquement niodifiCes. Ce groupe, qui n'a pas requ ~11tCrieurement de dose d'epreuve, a CtC ajoutC afin de contreler le pouvoir tumorigtne des cellules ainsi traitCes.

(5) Epreuve Trois semaines apris la fin de la pCriode d'immunisa-

tion, les animaux ont reGu une dose d'Cpreuve de lo5 ou de lo4 cellules tumorales RHa3-T. Les injections ont Cte

faites par voie sous-cutanCe dans la region dorsale et les animaux ont CtC examines a toutes les semaines pendant 25 semaines.

Rbultats

(a) Protection confkrke par dzflkrentes prkpara- tions vaccinales

Les figures 1 et 2 prCsentent en pourcentage la prise des tumeurs induites en fonction du temps chez des hamsters ayant subi diffkrents program- mes d'immunisation et CprouvCs au jour 0, soit avec 100 000 soit avec 10 000 cellules tumorales.

Chez les animaux CprouvCs avec 100 000 cellules tumorales (figure 1), deux groupes d'animaux se dCtachent assez nettement du groupe des animaux tCmoins non immunisis (groupe I) : ce sont les animaux du groupe I11 oil l'on observe un ~hCnomene de ~rotection et les animaux du groupe VII oil l'on observe, au contraire, un phenomene de facilitation immuno- logique. Chez les animaux du groupe I11 immu- nisCs avec des cellules tumorales irradiies, on observe une protection nette a partir de la 6ieme semaine jusqu'h la fin de l'expkrience ; en effet B la 6ieme semaine, seulement 3 des 15 animaux de ce groupe sont porteurs de tumeurs alors que 3 des 8 animaux du groupe tCmoin (groupe I) en sont porteurs; la fin de l'expkrience 7 des 15 animaux de ce groupe ont developpC une tumeur par rapport B 7 des 8 animaux du groupe tCmoin. Chez les animaux du groupe VII (immunisCs avec des cellules tumorales antiginiquernent modifiCes et irradiCes, et pre-immunisCs vis-a-vis l'agent modifiant), on observe un phCnom2ne de facilita- tion immunologique assez net entre la 4 i h e et la 7ieme semaine; ainsi, a 4 semaines, 5 des 11 ani- maux de ce groupe sont dCji porteurs de tumeurs alors qu'aucun des animaux tCmoins n'en aencore dCveloppC; a 5 et a 6 semaines, 9 des 11 animaux de ce groupe sont porteurs de tumeurs, compara- tivement a 3 des 8 animaux du groupe ttmoin. Dans les autres groupes immunisCs, les tumeurs se dCveloppent comme dans le groupe tCmoin.

Les rCsultats obtenus chez les animaux Cprou- vCs avec une dose de cellules tumorales 10 fois moindre sont prCsentCs a la figure 2. Le groupe des animaux immunisCs avec des cellules tumo- rales irradiCes (groupe 111) qui montrait dCjB une nette protection sur la figure 1, prCsente cette fois une protection complete contre la dose dYCpreuve utilisCe. De mSme chez les animaux du groupe VII immunisCs avec des cellules tumo- rales antiginiquement modifiies et irradiCes, et

HOULE ET AL.: LA TUMEUR A VIRUS S V 4 ~

SEMAINES APRES L'EPREUVE

FIG. 1. Prise des tumeurs ( z ) en fonction du temps chez les animaux CprouvCs avec lo5 cellules RHa3-T. Leschiffres romains identifient le groupe (cf. texte) et les chiffres arabes entre parentheses le nornbre d'animaux dans chaque groupe.

100 p ....................... A (10) I

90

80

70

# 60

0 YI (11)

f VI w p----------------a (1 1) 2 50 4 JlC (61

2 Z 4 0 a LY VI

30

20

10 /rn (10)

0 I m

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 75

SEMAINES APRES L'EPREUVE

FIG. 2. Prise des tumeurs ( z ) en fonction du temps chez les animaux BprouvCs avec lo4 cellules RHa3-T. Les chiffres rornains identifient le groupe (cf. texte) et les chiffres arabes entre parentheses le nombre d'animaux dans chaque groupe.

382 CAN. J. MICROB ,IOL. VOL. 20, 1971

pre-immunists vis-a-vis l'agent modifiant, on observe une facilitation immunologique de la turneur qui se manifeste particulikrement vers la 7ikrne et la 8ikrne sernaine. Un phtnomkne de facilitation irnrnunologique est tgalernent observt chez les animaux du groupe I1 irnmunists avec des cellules ernbryonnaires irradites oh I'on note entre la 8ikrne et la 12ikrne semaine un taux de turneurs beaucoup plus tlevt que chez les ani- rnaux ttmoins. L'irnrnunisation par des cellules turnorales antigtniquernent rnodifites et irradites ou non (groupes V et VI) a conftrt un certain degrt de protection, rnais qui est loin d'&tre comparable a la protection conferte par les cel- lules turnorales irradites seulernent (groupe 111). Enfin, les cellules dtsinttgrtes par congtlation- dtcongtlation (groupe IV) ont conftrt un degrt de protection interrntdiaire entre ces derniers groupes.

(b ) Prbence de cell~rles tumorig2nes duns les pre'parations vaccinales

Le groupe VIII, constitut d'anirnaux ayant requ par voie intra-ptritontale, trois doses irnrnuni- santes de lo6 cellules turnorales antigtniquernent rnodifites, avait t t t constitut pour savoir si la mo- dification antigtnique, telle que nous l'avons pra- tiqute d'aprks la description faite par Czajkow- ski et al. (7), enlevait aux cellules turnorales ainsi traittes leur pouvoir turnorigkne. Les anirnaux de ce groupe n'ont donc subi aucun traiternent ulttrieur et ont CtC gardts en observa- tion pour dtceler l'apparition tventuelle de turneurs. Deux des neuf anirnaux de ce groupe ont effectivernent prtsentt des turneurs ptrito- ntales palpables 7 et 9 semaines, respectivernent, aprks l'imrnunisation. De plus, un animal du groupe V, irnrnunist par voie intra-ptritontale avec la rn&rne prtparation vaccinale et Cprouvt ulttrieurernent par voie sous-cutante, a prtsentt concurrernrnent une turneur ptritontale et une turneur sous-cutanke. Aucun animal dans les autres groupes exptrirnentaux n'a prtsentt de tulneur ptritoneale.

Discussion

Plusieurs auteurs ont utilist des cellules turno- rales irradites pour "vacciner" avec succks des anirnaux contre une greffe ulttrieure de cellules turnorales (3, 5, 6, 14). Nos rtsultats confirrnent ces observations anttrieures. En effet, chez les

animaux ainsi traitts et tprouvts avec une dose de 10 000 cellules turnorales (groupe 111, figure 2), nous avons observe une protection cornplkte alors que 90% des anirnaux ternoins ont prtsentt des tumeurs. M&rne tprouvts avec une dose de 100 000 cellules turnorales (groupe 111, figure l), les animaux de ce groupe ont encore rnontrt une protection bien marqute.

Des auteurs ont rapport6 que la dtsinttgration physique des cellules tumorales leur faisait perdre leur pouvoir immunisant (5, 10, 12). Dans nos conditions expirimentales, la protection conftrte par les cellules turnorales (groupe IVY figure 2) sournisesa une congtlation-dtcongtlation rtpttte pourrait &tre imputable un petit nornbre de cellules turnorig&nes encore prtsentes dans l'ino- culum. Ceci a d'ailleurs t t t confirm6 dans un autre travail (rtsultats non publits) oh nous avons observe 2 l'autopsie des anirnaux injectts avec des cellules CH, "dtsintegrees" une invasion du ptritoine chez environ 10% des anirnaux.

Les cellules turnorales antigtniquement rno- difikes et irradites ou non (groupes V et VI, figure 2) ont conftrt une protection chez environ 50% des anirnaux irnrnunists; cette protection est loin d'&tre aussi bonne que celle induite par les cellules tumorales irradites. De plus, il est possible que la prtsence de cellules relativernent peu rnodifites dans les inocula ait pu contribuer la faible pro- tection observte chez les anirnaux du groupe VI. L'apparition de turneurs ptritontales chez deux des neuf anirnaux du groupe VIII tendrait a confirrner cette interprttation.

La prC-irnrnunisation des anirnaux vis-a-vis l'agent modifiant avait t t t faite dans l'espoir d'augmenter la rtsistance antiturnorale des anirnaux (2). Nous avons observt, au contraire, un phtnornkne de facilitation irnmunologique dans ce groupe (groupe VII, figures 1 et 2). L'expli- cation de cette observation inattendue ne nous apparait pas tvidente. Dans nos conditions expt- rimentales, nous avons possiblernent favorist le devtloppernent d'une i6rnunitt hurnorale plut6t que cellulaire.

Enfin, les rtsultats obtenus chez les anirnaux immunists avec des cellules ernbryonnaires irradites rntritent d'&tre soulignts. En effet, cette preparation cellulaire sernble avoir induit une facilitation en favorisant l'apparition prtcoce de la turneur, ce qui irnpliquerait une relation anti- gtnique entre les cellules d'embryon de hamster et les cellules de hamster adulte transformtes par

HOULE ET AL.: LA TUMEUR A VIRUS sv4,, 383

le SV,,. Une telle relation antigtnique a t t t dtcrite rtcemment par Coggin et al. (4) qui ont rtussi avec des cellules embryonnaires irradites B immuniser des hamsters adultes contre une transplantation ulttrieure de cellules transformtes par le SV,,. Le fait que nous ayons observt un phtnomkne de facilitation plut6t qu'une protection peut &tre dC1 B de multiples facteurs (dose immunisante, voie d'immunisation, intervalle entre l'immunisation et l'tpreuve, etc.). La prtsence d'antigknes em- bryonnaires sur la surface des cellules tumorales de hamster est B rapprocher des nombreux cas de reversion antigtnique dtjB connus (1, 11, 13).

Remerciements

Les auteurs remercient Mme Ginette Mercier de sa collaboration technique. Ce travail a ett subventionnt par 1'Institut National du Cancer du Canada.

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