Immuno Analyse

7/22/2019 Immuno Analyse

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Ceci est la VERSION NUMERIQUE des CAHIERS BIOFORMA dj parus et

distribus l'ensemble des LABORATOIRES D'ANALYSES de BIOLOGIE

MEDICALE en FRANCE.

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de labm ) est permise.

BIOFORMA

230 bd raspail 75014 Paris


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Le prsent fascicule concerne la onzime opration de Contrle Nationale en immunoanalyse,

organise en juin 1994 sous lautorit de lAgence du Mdicament par convention avec Bioforma.

A lore dune priode au cours de laquelle des modifications dans lorganisation du Contrle

National vont intervenir, il nous a paru intressant, dans un premier chapitre, de faire le bilan et de

soumettre quelques rflexions sur plus dune dcennie de fonctionnement dans le domaine de

limmunoanalyse.

Lapparition dans les laboratoires de nouvelles techniques ncessite, de la part des biologistes, une

priode de familiarisation avec les difficults analytiques ou linterprtation. Cest pourquoi, ontrouvera ensuite un rappel sur les critres qui permettent dapprcier la qualit dun immunodosage et

une mise au point gnrale sur les piges et problmes rencontrs dans ce domaine de la biologie, de

ltape pranalytique au rendu du rsultat en passant par le marqueur et la mesure du signal en

immunoanalyse.

Le dernier chapitre comporte ltat de lart des pratiques biologiques en France et ltat des

connaissances sur certains analytes dont le dosage prsente des volutions techniques et/ou pose des

problmes de standardisation. Nous avons choisi dvoquer dans ce numro deux marqueurs tumoraux,

lantigne carbohydrate 19-9 (CA 19-9) et lantigne spcifique de la prostate (PSA), et deux hormones

glycoprotiques, lhormone chorionique gonadotrope (hCG) et lhormone thyrostimulante (TSH).


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2Cahier de Formation Hmatologie Immunologie 1995

L I S T E D E S A U T E U R S

!Professeur Ren BADORProfesseur des UniversitsLaboratoire de BiophysiqueFacult de Pharmacie Universit Claude Bernard Lyon I8, avenue Rockefeller 69373 LYON CEDEX 08

!Mademoiselle Andre BEAUDONNETPraticien HospitalierLaboratoire de BiologieHpital de lHtel Dieu Hpitaux de Lyon1, place de lHpital 69288 LYON CEDEX 02

!Madame Marie-Claude PATRICOTPraticien HospitalierLaboratoire dHormonologieCentre Hospitalier Lyon Sud Hpitaux de Lyon69310 PIERRE-BENITE

!Monsieur Richard COHENMatre de Confrence des Universits Praticien HospitalierLaboratoire de Biophysique Facult de Pharmacie

8, avenue Rockefeller 69373 LYON CEDEX 08Service de Radiopharmacie et Radioanalyse Hpital Neuro-Cardiologique59, boulevard Pinel 69394 LYON CEDEX 03

!Mademoiselle Anne-Claude RENARDPharmacienPROBIOQUAL281 C, cours Emile Zola BP 4016 69615 VILLEURBANNE CEDEX


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LE CONTRLE DE QUALITE NATIONALEN IMMUNOANALYSE

Rflexions aprs onze annes de fonctionnementR. COHEN, A. BEAUDONNET, A.C. RENARD

Lutilisation de limmunoanalyse en routine remonte au dbut des annes 1970. Il sagissait alors de dosagesutilisant des radioisotopes, pratiqus par un petit nombre de laboratoires spcialiss en raison de la lgislationfranaise relative la dtention et la manipulation des produits radioactifs. Actuellement les laboratoiresautoriss pratiquer ce type de dosages sont au nombre de cent vingt cent cinquante et se caractrisant encorepar des mthodes qui se prtent mal une automatisation complte. Trs rapidement, les biologistes concerns ontressenti le besoin dune valuation externe de la qualit. Cest pourquoi, ds 1977, un tel programme leur a tpropos dans le cadre dune association rgie par la loi de 1901 et gre par les biologistes bnvoles : le centrelyonnais dtudes pour la PROmotion de la BIOlogie et du contrle de QUALit (PROBIOQUAL). Une grandemajorit (80 90%) dentre eux y adhre de manire volontaire depuis cette poque.

Les techniques dimmunoanalyse avec marqueur non radioactif sont apparues au dbut des annes 1980 sousforme de trousses de ractifs prts lemploi, utilises dabord manuellement puis sur automates. La nomenclaturedes actes de biologie mdicale a fait lobjet des modifications ncessaires an avril 1985 et une large diffusion delimmunoanalyse tous les laboratoires publics ou privs franais en a rsult.

Le laboratoire National de la Sant, devenu depuis un service de lAgence du Mdicament, a alors dcid demettre en uvre, en "hormonologie" plasmatique , un contrle de qualit externe semblable celui quifonctionnait dj dans dautres secteurs de la biologie mdicale. Lexcution technique en a t confie, par arrtministriel du 1er fvrier 1983, renouvel le 23 novembre 1988, lassociation PROBIOQUAL en raison delexprience quelle avait acquise dans ce domaine depuis plusieurs annes. Les lignes qui suivent sont consacres

la description des caractristiques, aux problmes rencontrs et au bilan du contrle de qualit obligatoire en"hormonologie plasmatique", instaur en 1984.

!I. CARACTERISTIQUES DE LECHANTILLON STATISTIQUE DE PARTICIPANTS

Tout dabord, comme le montre le tableau I des Annales du Contrle National de Qualit, (n 2, Avril 1995),laugmentation du nombre de participants a t considrable pendant les onze annes de fonctionnement de cecontrle : on est pass dun peu moins de cinq cents laboratoires en 1984 prs de quatre mille laboratoires en1994, ce qui est voisin de la participation aux oprations de contrle national menes en biochimie, hmatologie,bactriologie-virologie ou parasitologie. La stabilisation note au cours des trois ou quatre dernires annes sembleindiquer que le maximum est atteint.

Si lon excepte les annes de mise en place, lassiduit des participants, traduite par le pourcentage de rponses,oscille entre 80% et 87%. La diminution observe en 1994, rsulte des laboratoires travaillant dans le cadre degroupements : selon nos indications, en effet, seuls les laboratoires ralisant effectivement les dosages devaientfaire parvenir les valeurs trouves. De plus, pour interprter les donnes concernant lassiduit des participants, ilest ncessaire davoir lesprit que les analyses effectues par chaque laboratoire et, par consquent, que laparticipation telle ou telle opration de contrle national sont dtermines partir dun questionnaire. Ce dernier,tabli et envoy par lAgence du Mdicament, est rempli priodiquement par les biologistes.

Les analyses soumises au contrle ont volu paralllement lapparition sur le march franais des troussescorrespondantes et leur introduction la nomenclature des actes de biologie mdicale. Actuellement,limmunoanalyse permet de raliser le dosage de vingt vingt-cinq analytes relevant non seulement de

lhormonologie plasmatique mais aussi de loncologie ou de lallergologie. Parmi les analytes les pluscouramment doss on peut citer : ACE, AFP et PSA pour les marqueurs tumoraux , hCG, FSH, LH, prolactine et


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TSH pour les hormones glycoprotiques, cortisol et estradiol pour les hormones strodiennes, T4 libre pour les

hormones thyrodiennes ainsi que ferritine et IgE totales. En raison du faible nombre de trousses disponibles

(tableau IIdes Annales du Contrle Nationale de Qualit, n 2, Avril 1995), les dosages de CA 15-3, CA19-9,

CA125, B2-microglobuline, progestrone et testostrone sont moins rpandus. Enfin dans lvaluation de la

fonction thyrodienne, la mesure de la forme libre, a en grande partie, remplac celle de lhormone totale pour T4.

Le dosage de T3 suit une tendance analogue avec un dcalage dans le temps.

!II.SCHEMA DORGANISATION

La non-linarit de la relation dtalonnage de la plupart des immunodosages, ainsi que la forme de lerreur

commise sur la mesure du signal en fonction de lintensit de celui-ci, rendent ncessaire un contrle plusieurs

niveaux de concentration. Cest pourquoi, au cours des trois premires enqutes interlaboratoires, trois spcimens

de contrle ont t distribus. Des raisons matrielles lies laugmentation importante du volume ncessaire nous

ont conduits proposer par la suite un seul spcimen par opration. En 1994, la collaboration avec Bioforma a

permis de proposer deux spcimens deux niveaux de concentration et de raliser pour la premire fois deux

oprations au cours de lanne, lune en juin et lautre en dcembre. Les prochaines oprations devraient se

drouler la mme frquence et selon un schma proche de celui adopt en 1994.

Depuis juin 1994, les participants assurent eux-mmes le codage de la technique et de lappareil grce ladisponibilit de tables de codage dveloppes par la SFBC dont la dernire version a t diffuse par Bioforma.

Auparavant, ces indications taient donnes en clair et le codage tait effectu par nos soins.

!III.PROBLEMES POSES PAR LES SPECIMENS DE CONTROLE

Ceux-ci doivent thoriquement tre reprsentatifs des situations physiopathologiques les plus frquentes. Or les

spcimens le plus souvent utiliss pour des raisons pratiques dorganisation, sont des srums du commerce

renfermant un grand nombre danalytes des concentrations variables. Au cours de leur prparation, le matriel de

dpart est surcharg ou au contraire " priv en certains analytes. Signalons, par exemple, que lobtention de

concentrations trs basses en TSH est un problme difficile, incompltement rsolu encore par les firmes

commerciales spcialises dans la fabrication de srums de contrle pour limmunoanalyse. De mme, lobtention

de concentrations basses en hormones thyrodiennes totales ou libres ncessite un traitement du matriel de dpartsusceptible dintroduire des artefacts. Ces conditions vont lencontre de lexigence prcdente et les rsultats

obtenus partir de tels spcimens risquent de conduire une interprtation errone car diffrente de celle

provenant de spcimens de patients.

Les qualits du spcimen de contrle idal pour limmunoanalyse pourraient tre rsumes de la manire suivante :

le matriel de dpart doit imprativement tre du srum humain,

en raison de la spcificit des techniques, certains analytes ne peuvent tre simultanment prsents dans

le mme spcimen des concentrations diffrentes des principales situations physiopathologiques

rencontres (estradiol avec estriol et estrone, digoxine avec digitoxine, hCG avec LH),

les concentrations des diffrents analytes doivent tre choisies de manire couvrir les zones critiques du

domaine de mesure,

lorigine des prparations danalytes purifis, surtout de nature glycoprotique, servant enrichir le

matriel de dpart joue un rle primordial. On peut citer, par exemple, la reconnaissance des degrs

divers par les couples danticorps prsents dans les trousses de prolactine recombinante, dinsuline

dorigine animale ou de marqueurs tumoraux obtenus par extraction.

Seule lexprience acquise dans lorganisation du contrle de qualit externe permet de reconnatre ces piges et

de soumettre au fabricant un cahier des charges qui permette den viter les principaux.


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!IV.EXPLOITATION DES RESULTATS

En immunoanalyse, il est particulirement difficile daccder la connaissance de la valeur vraie dun analyte dans

un spcimen biologique ce qui rend dlicate lapprciation de la justesse des techniques. Lapproche retenue en

France consiste utiliser la valeur de consensus cest--dire la valeur obtenue aprs un traitement statistique

correct des rsultats fournis par un grand nombre de laboratoires. Ce traitement consiste, dans le cas du contrle

national, en une double troncature, opration dont le but est dliminer les valeurs situes plus de deux cartstypes de part et dautre de la moyenne. La validit de la moyenne gnrale comme valeur de consensus est dautant

meilleure que les techniques adoptes sont nombreuses et varies. Les conclusions sur la justesse des techniques

doivent, par consquent, prendre en compte la plus ou moins grande contribution la moyenne gnrale des

valeurs fournies par les diffrentes trousses.

Une solution ce problme existe pour les petites molcules telles que les hormones strodiennes puisque la

chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse peut tre considre comme une mthode

de rfrence. Dans certains pays, tels que lAllemagne, la valeur fournie par cette mthode est choisie pour cible.

Sans aller jusque l, nous avons dcid, ds 1990, dappliquer cette mthode tous les spcimens de contrle

distribus en France pour cortisol, estradiol, progestrone et testostrone et dindiquer les valeurs obtenues aux

participants.

En ce qui concerne les molcules de masse molaire plus leve, telles que les hormones glycoprotiques ou les

marqueurs tumoraux, aucune mthode nest susceptible, lheure actuelle, de fournir une valeur vraie. Par ailleurs,

lhtrognit des formes circulantes de ces composs tant un phnomne de mieux en mieux tudi et connu

pour tre responsable de discordances importantes entre trousses, nous avons choisi de caractriser sur ce plan les

spcimens de contrle. Cest ainsi quune chromatographie dexclusion-diffusion effectue sur ces spcimens nous

permet de renseigner les participants, depuis 1990, sur le pourcentage de trois formes molculaires de prolactine

(monomre, "big prolactin" et "big-big prolactin") et depuis 1994, sur la proportion de formes libres et complexes

de PSA.

Le compte-rendu dune opration de contrle, calqu sur la biochimie, comporte un message individuel et une

prsentation de synthse (les Annales du Contrle National de Qualit) associe depuis la prsente opration un

cahier de formation.

!V. RENSEIGNEMENTS OBTENUS

Les objectifs du contrle de qualit externe sont doubles :

court terme, il consiste estimer les composants systmatique et alatoire de lerreur entre les

laboratoires et les mthodes et suivre leur volution au cours du temps,

plus long terme, il contribue lharmonisation des rsultats entre laboratoires par lamlioration des

mthodes cest--dire la standardisation des dosages. Il permet, alors, au biologiste de sassurer que les

rsultats quil rend sont conformes ceux des autres laboratoires utilisant ou non la mme mthode. En

outre, la consquence long terme du contrle est de faciliter linterprtation des rsultats par le

clinicien.

Les principaux enseignements tirs du contrle national en immunoanalyse remplissent les objectifs fixs plus

haut.

En premier lieu, lexploitation statistique toutes techniques confondues fournit une estimation de la variabilit

totale qui dpend du niveau de concentration. Celle-ci comporte deux composantes : lune, systmatique, qui

correspond aux carts entre les valeurs moyennes des diffrentes trousses et lautre, alatoire, qui dpend de la

dispersion des valeurs obtenues par les utilisateurs dune mme trousse. Lexploitation statistique par technique

permet de dterminer cette dernire. Le coefficient de variation (CV) obtenu est un indice de robustesse de la

trousse : un CV faible signifie que les valeurs obtenues restent trs proches malgr les diffrences dutilisation qui

existent dun laboratoire lautre. La srie des CV fournis par les principales trousses peut tre reprsente par la

valeur centrale ou CV mdian qui indique la reproductibilit atteinte par la moiti des trousses disponibles. Ainsi,en comparant la valeur du CV refltant la variabilit totale avec celle du CV mdian, on dispose dun moyen


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simple pour sparer la part de la dispersion globale des valeurs qui revient aux carts entre trousses de celle qui

doit tre attribue leur robustesse : une grande diffrence entre les deux CV signe la prsence de discordances

importantes entre trousses. Il existe une mthode statistique, lanalyse de variance avec dcomposition de la

variance totale, qui permet destimer rigoureusement les deux composantes prcdentes. Cependant, son

application ncessite des hypothses et un schma exprimental souvent peu compatibles avec lorganisation

pratique du contrle de qualit externe.

De cette manire, on apprcie ltat de lart des dosages et on met en vidence ceux dont la standardisation nest

pas satisfaisante comme cest le cas par exemple, actuellement, des dosages de TSH ou estradiol au niveau des

basses concentrations et des dosages de CA 19-9 OU PSA.

Lvolution, au cours du temps, de la qualit est galement intressante considrer. Une diminution notable de la

variabilit des immunodosages est intervenue au tout dbut des annes 1990. Celle-ci concide avec la

familiarisation des biologistes aux problmes poss par ce nouveau type de dosages (talonnage, piges

mthodologiques, interprtation).

Les autres informations utiles, tires des oprations de contrle national et difficiles obtenir par dautres moyens,

concernent la "popularit des trousses", cest--dire la connaissance des trousses effectivement utilises dans les

laboratoires des participants.

Pour terminer, insistons sur lun des points forts du contrle national franais qui est envi par les organisateurs du

contrle externe dautres pays : il sagit du nombre trs important de participants qui permet dobtenir de bonnes

estimations sur ltat de lart des immunodosages, sur la "popularit" et la qualit des trousses mme sil introduit

une lourdeur certaine au niveau de lorganisation.


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CRITERES DE QUALITEEN IMMUNOANALYSE

R. COHEN, A.C. RENARD

Les critres de qualit des immunodosages ne sont pas a priori trs diffrents de ceux utiliss dans les autres

domaines de la biologie clinique (voir cahier de formation de biochimie). Pourtant la matrise de la raction Ag-Ac

et de la mesure du signal pose des problmes nouveaux : en particulier, les courbes de calibrage (signal en fonction

de la concentration) sont loin dtre toujours linaires. Nous passerons en revue les critres de qualit classiques

(prcision, limite de dtection, justesse, spcificit) en insistant sur leurs particularits lorsquils sont appliqus

limmunoanalyse. Ce chapitre a pour but de donner les lments permettant le choix du meilleur ractif.

Concrtement lheure actuelle, ce choix est li le plus souvent celui de lautomate en raison du grand nombre

de "systmes ferms". Toutefois, lutilisation des ractifs dans les meilleures conditions passe par la

comprhension du mcanisme et la connaissance des points critiques dun immunodosage.

!I. ERREUR DE MESURE

Chaque rsultat de mesure est entach dune erreur qui sexprime par la diffrence entre la valeur trouve et la

valeur "vraie" que lon cherche estimer. Cette erreur dite totale peut tre dcompose en deux termes : lerreur

systmatique et lerreur alatoire (Figure 1).

Figure 1: Densit de probabilit P(x) des valeurs x de concentration obtenues au cours dun dosage.

Composantes systmatique et alatoire de lerreur totale.

xV : valeur "vraie" de concentration,

xj : valeur obtenue lors de la ime

mesure,

x : moyenne des valeurs exprimentales,ej : erreur totale commise dans la i

memesure,

e : partie non alatoire de lerreur totale ou erreur systmatique,

ej -e : erreur alatoire (fortuite, accidentelle).


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I.1. Erreur systmatique

Elle reprsente lcart toujours de mme signe entre un rsultat et la valeur "vraie" ou sa meilleure estimation.Suivant le cas, sa grandeur est proportionnelle la concentration ou, au contraire, indpendante de celle-ci.

On lapprcie en rptant un grand nombre de fois les mesures et en calculant lcart entre la moyenne de ladistribution des valeurs exprimentales et la valeur "vraie". La principale difficult pour valuer lerreursystmatique rside dans la ncessit de connatre la valeur "vraie" dun compos dans un chantillon biologiquedtermin. Or, la plupart du temps, pour les substances concernes par les immunodosages, la valeur "vraie" resteinconnue, except pour les petites molcules telles que les hormones strodiennes qui peuvent tre doses parchromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse. En rgle gnrale, lerreur gnrale,lerreur systmatique dont la cause est le plus souvent identifiable, provient du fait quil sagit de mthodesrelatives dans lesquelles le comportement des solutions de calibrage peut tre diffrent de celui des spcimens doser.

Parmi les paramtres susceptibles dentraner une erreur systmatique se trouvent principalement : ltalon qui esten cause la fois par sa nature, son titre et sa stabilit au cours de la conservation, les anticorps qui sontresponsables de la spcificit du systme de dosage et la mthode de calcul des rsultats. Il faut ajouter un certain

nombre de facteurs, qualifis de non spcifiques, tels que :

le pH ou la prsence de composs susceptibles de modifier la raction Ag-Ac (anticoagulants,hmoglobine, etc.),

la destruction de lanalyte au cours des tapes prcdant le dosage (prlvement, transport,centrifugation, dcantation, etc.),

la liaison de lantigne marqu aux parois des tubes, des protines de transport naturelles ou dventuels anticorps circulants conscutifs une auto-immunisation ou une thrapeutique comme, parexemple, chez les diabtiques traits linsuline.

I.2. Erreur alatoire

Elle reprsente lcart, de signe et de grandeur imprvisibles, entre un rsultat et la valeur "vraie" ou sa meilleureestimation.

Lerreur alatoire prsente plusieurs caractristiques. Elle suit gnralement une distribution normale de moyennenulle car les erreurs sont nombreuses et du mme ordre de grandeur. Elle est quantifie par lcart type de cettedistribution. Elle dpend troitement de la concentration : en effet, dans le cas des immunodosages lcart typeaugmente avec celle-ci.

Il existe, en immunoanalyse, de nombreux facteurs qui sont susceptibles dintroduire une erreur alatoire. Certainsont un effet prpondrant sur lerreur de mesure du signal : opration de distribution des volumes de spcimens doser ou de ractifs, mthode de sparation car la sparation des formes libre et lie peut tre plus ou moinscomplte dun tube lautre et erreurs de mesure du signal. On sait, pour un signal radioactif par exemple, que lephnomne de dsintgration nuclaire est lui-mme alatoire.

Dautres facteurs agissent principalement sur la pente de la courbe dtalonnage tels que, par exemple dans le casdes mthodes par dfaut danticorps, la dilution de lanticorps, la puret ou la masse de lantigne marqu et lesconditions dincubation.


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!II. NIVEAUX DERREUR DANS UN IMMUNODOSAGE

Figure 2: Niveaux derreur dans un immunodosage

La Figure 2reprsente les diffrents niveaux derreur et le domaine dapplication du contrle de qualit intra- ouinter-laboratoire. Les principales erreurs surviennent diffrents niveaux qui sont, par ordre croissantdimportance : la srie de dosages, le laboratoire effectuant plusieurs sries dans le temps, le groupe delaboratoires utilisant la mme technique et enfin le groupe de laboratoires utilisant des techniques diffrentes.

On comprend bien que les erreurs soient peu importantes au sein dune srie de dosages dans laquelle lesconditions sont strictement contrles (ractifs, oprateur, temps dincubation identiques). En revanche, au coursdu temps les ractifs voluent, le manipulateur peut changer ce qui augmente la dispersion des rsultats rendus parun laboratoire. Lorsque le patient se dplace et que le clinicien se trouve face des rsultats provenant delaboratoires diffrents mais utilisant la mme technique, ce sont alors lexprience et lquipement du laboratoirequi interviennent. Enfin, lorsque les rsultats sont obtenus par des laboratoires qui ont adopt des techniquesdiffrentes, la variabilit est, en grande partie, lie aux caractristiques des ractifs notamment de ltalon et desanticorps.

En rsum, il existe une hirarchie des erreurs. A chaque niveau, se retrouvent la fois erreurs alatoires etsystmatiques qui en se combinant concourent, toute deux, la variabilit cest--dire lerreur alatoire du niveau

suprieur.

!III. DEFINITION DES CRITERES DE QUALITE

III.1. Prcision

Elle est dfinie comme la qualit de laccord, dans une zone dfinie de concentration, entre des mesures rptes,effectues dans des conditions dtermines.

On lexprime habituellement par lcart type ou le coefficient de variation (cart type divis par la moyenne) de ladistribution des valeurs exprimentales de concentration obtenues lors de la rptition des mesures sur le mme

DANS UN LABORATOIRE

UTILISANT DESMETH. DIFFERENTES

UTILISANT LAMME METHODE

DANS UN GROUPEDE LABORATOIRES

D'UNE SERIEA LAUTRE

DANS UNE SERIE

CONTROLE DE QUALITEINTERLABORATOIRE

CONTROLE DE QUALITEINTRALABORATOIRE

ERREURSSYSTEMATIQUE ALEATOIRE


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spcimen. La prcision est dautant meilleure que lerreur alatoire est faible. Elle est fonction de deuxparamtres : lerreur (reprsente par lcart type) faite sur la mesure du signal et la pente de la courbe decalibrage. De plus, sa dfinition sous-entend quelle dpend de la concentration mesurer, phnomneparticulirement vrai dans le domaine des immunodosages, et des conditions de rptition des mesures. Cestpourquoi, on est amen affiner cette notion et proposer diffrentes expressions pour la prcision. On parle derptabilit, de reproductibilit intra- ou inter-laboratoire lorsque la rptition des mesures est effectuerespectivement dans la mme srie de dosage, dans le mme laboratoire ou entre laboratoires diffrents.

Pour apprcier la prcision, il suffit par consquent de rpter les mesures sur le mme spcimen et de calculerlcart type ou le coefficient de variation de la distribution des valeurs exprimentales. Il est, cependant, ncessairedeffectuer cette opration plusieurs niveaux de concentration. Un procd pour apprcier, trs commode etrpandu en immunoanalyse, consiste tablir le profil de prcision cest--dire la courbe reprsentative delvolution de lcart type ou du coefficient de variation en fonction de la concentration. Celui-ci peut reprsenternimporte lequel des niveaux de prcision dfinis prcdemment. Nous dcrirons les tapes conduisant sonobtention ainsi que ses applications en prenant comme exemple la courbe montrant la variation de la rptabilitselon le niveau de concentration. Pour lobtenir il faut passer par les tapes indiques sur la Figure 3 :

calcul par une simple rgression linaire, diffrents, niveaux de signal, de lcart type sR exprim en

valeur de signal,

calcul, diffrents niveaux de concentration, de lcart type exprim en concentration sc partir de sRetde la pente dy/dC de la courbe de calibrage :

trac de la courbe de variation de lcart type sc ou du coefficient de variation sc/C en fonction de laconcentration C.

Le profil de prcision rvle tout son intrt plusieurs niveaux. Dans le cadre du contrle de qualit, il permet devalider les rsultats dune srie de dosages. En ralit cela nest possible que lorsquon dispose dau moins deuxdterminations pour chaque spcimen ; or cette pratique tend disparatre avec le dveloppement delautomatisation. Grce aux profils de prcision intra- et inter-laboratoire, il est possible dapprcier ltat de lartde limmunodosage dun analyte. Au moment de la mise au point dun dosage, cette mthode statistique savreparticulirement utile en permettant dvaluer dun seul coup dil la prcision dans tout le domaine deconcentration. Ainsi le fabricant de la trousse dispose dun critre objectif pour choisir les conditionsexprimentales (concentrations des ractifs en prsence, modalits dincubation, nombre doprations de lavagelors de la sparation des formes libre et lie, etc.) optimales cest--dire celles qui conduisent la meilleureprcision aux niveaux de concentration qui reprsentent des seuils de dcision importants sur le plan clinique.Enfin signalons quon en dduit lcart type sCo,correspondant des valeurs de concentration faible voire nulle, partir duquel on estime la limite de dtection.


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Figure 3: Etapes conduisant la confection dun profil de prcision pour un immunodosage par dfaut (partie gauche) ou par

excs (partie droite) danticorps.

Les valeurs couramment obtenues pour les diffrentes formes de prcision lorsquon les exprime en coefficient devariation sont, dans le cas des immunodosages : infrieures 5% pour la rptabilit, comprises entre 5 et 10%pour la reproductibilit intralaboratoire et suprieures 10% pour la reproductibilit interlaboratoire. Les valeursles plus leves sont observes transitoirement lorsquapparaissent des techniques prsentant des caractristiquesnouvelles


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(meilleure spcificit par exemple des techniques immunomtriques par rapport aux techniques par comptition)

ou bien pour des dosages dont la standardisation est mauvaise comme cest le cas actuellement (1994) des dosages

destradiol, CA 19-9 et PSA. De plus, rappelons que les mthodes par excs danticorps fournissent le plus souvent

des coefficients de variation plus bas que les mthodes par dfaut danticorps.

III.2.Sensibilit, dtectabilit

Ces critres expriment, tous deux, laptitude dune mthode diffrencier les signaux fournis par deux spcimensde concentrations voisines.

Il ne faut cependant pas les confondre : la sensibilit sadresse toutes les concentrations diffrentes de zro alors

que la dtectabilit intresse le domaine des concentrations faibles ou nulles. Dans ce dernier cas, ont dfini la

limite de dtection analytique comme la plus petite concentration fournissant un signal significativement

diffrent de celui dun blanc (chantillon identique en tous points au spcimen doser mais de concentration

nulle). La comparaison doit se faire en termes statistiques par un test appropri.

Modalits pratiques du calcul de la limite de dtection analytique :

La relation donnant la limite de dtection L peut scrire :

0

. ./ O

bC

C

SL k k sdy dC

=

= =

( )1 1

, .b y

dans laquelle k t vn n

= +

avec t(, v) : variable de Student pour un risque donn (ou risque de conclure tort la prsence de la

substance dans le liquide biologique) et v degrs de libert (correspondant lestimation de sCo).

nb,ny: nombre de rptitions du blanc et des spcimens respectivement, dans les conditions habituelles

dutilisation de la mthode

sb: cart type des signaux fournis par le blanc

et sCo: cart type, exprim en concentration, pour des mesures de concentration nulle.

Pour calculer la limite de dtection analytique, il faut par consquence

a) dterminer sCo: pour cela, deux conditions doivent tre respectes :

effectuer les rptitions sur un chantillon dpourvu de la substance doser mais le plus proche possible

dans sa nature et sa composition du liquide biologique utilis,

travailler, dans un premier temps, sur les valeurs de signal pour obtenir lcart type sb, puis dterminer

sCoen divisant par la pente lorigine de la courbe dtalonnage.

Pour les laboratoires qui effectuent les dosages en double, la meilleure mthode consiste dduire du profit de

prcision la valeur de sCo. Cette dernire est la limite de la fonction sC=f (C) lorsque la concentration tend vers

zro.

b) multiplier sCopar k ; le choix de la valeur de k doit se faire en fonction du protocole de dosage adopt en

routine (nb,ny) comme la relation exprimant k le montre. La valeur habituellement utilise comme limite de

dtection est de 3,0 sCopour des dterminations en simple (nb=ny=1). Dans ce cas la variable de Student est gale

2,1 ce qui correspond un risque de conclure tort la prsence de la substance (risque ) de 1,7%. Pour une

valeur quivalente du risque , la limite de dtection est gale 2,1 sColorsque les dterminations sont effectues

en double (nb=ny=2).

Un autre moyen dvaluer la limite de dtection analytique, la mthode des dilutions limites , consiste diluer

progressivement un spcimen de faible concentration de manire dterminer partir de quel moment la rponse

devient incohrente. Lvaluation prcise est difficile et dpend, ici aussi, de la qualit du diluant.


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La dfinition prcdente plusieurs inconvnients :

elle nest valable que si un vritable spcimen zro est disponible ce qui est loin dtre toujours le cas,elle prend uniquement en compte la variabilit intrasrie ; cela implique que, pour tre reprsentative,

son estimation doit tre ralise partir de plusieurs sries de dosages,elle fournit la concentration significativement diffrente de zro mais nindique pas la prcision avec

laquelle celle-ci est mesure ; en calculant le coefficient de variation thorique correspondant unelimite de dtection analytique de 3 sCo, on obtient CV=sCo/3sCo=33 %. Cette valeur peut se rvlerinacceptable pour une dtermination quantitative dans certaines situations cliniques.

Pour remdier, au moins en partie, ces inconvnients on dfinit la limite de dtection fonctionnellecomme laplus petite concentration pour laquelle le coefficient de variation inter-sries est gal 20 %. Cest ainsi, parexemple, que lon qualifie de "troisime gnration" les dosages de TSH qui possdent une limite de dtectionanalytique infrieure 0,005 mUI/l et surtout une limite de dtection fonctionnelle comprise entre 0,01 et 0,02mUI/l.

III.3. Justesse

La justesse dune mthode reprsente la qualit de laccord entre la valeur mesure et la valeur "vraie" ou sameilleure estimation en dehors des erreurs alatoires. Ce critre se rapporte, par consquent, lerreursystmatique. Pour lapprcier, il est ncessaire de disposer de la valeur "vraie" ce qui est un problme non rsolu lheure actuelle (1994). En effet, il nexiste pas de mthode de rfrence permettant de doser les compossconcerns par les immunodosages. Tout au plus, assiste-t-on au dveloppement de mthodes utilisant lachromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse pour les petites molcules telles que leshormones strodiennes (cortisol, estradiol, progestrone, testostrone, etc.).

Dans ces conditions, les procds disponibles sont les suivants :

a) Comparaison des rsultats obtenus laide dune mthode consacre par une longue priode dutilisation :

pour cela, on fait appel aux mmes mthodes de rgression que dans les autres domaines de la biologie clinique.

Soulignons, en outre, que la comparaison doit porter sur des spcimens reprsentant le plus large ventailpossible de situations physiopathologiques.

b) Epreuve de dilution : celle-ci consiste, partir dun ou plusieurs spcimens de concentration leve en analyte,

raliser une srie de dilutions dans un milieu appropri. Lorsquil sagit dune trousse de ractifs du commerce,

le milieu utiliser imprativement est le "diluant" prconis par le fabricant pour le traitement des spcimens de

concentration leve.

Linterprtation des rsultats de cette preuve peut se faire en tablissant la relation entre la concentration

observe et la dilution. Celle-ci est, de manire idale, une droite passant par lorigine et de pente gale la

concentration du spcimen pur. En prsence dune erreur systmatique, on observe une ordonne lorigine non

nulle ou une relation non linaire. Enfin, cette preuve ne permet pas de mettre en vidence une erreur constante

en valeur relative.

c) Epreuve de surcharge : celle-ci consiste ajouter ; un ou plusieurs spcimens de faible concentration (Co) en

analyte, des quantits connues (Qi) dtalon.

La courbe reprsentative de la concentration observe (Ci) en fonction de Co+Qiest une droite, de pente gale

lunit, passant par lorigine en labsence derreur systmatique ou en prsence dune erreur constante en valeur

absolue.

d) Etude de spcimens dont la valeur de concentration est nulle : dans certaines circonstances (sujets

hypophysectomiss ou ayant subi une preuve de freinage par exemple), il est possible de disposer de liquides

biologiques dpourvus danalyte. Le signal fourni par ceux-ci dans le systme de dosage tudi peut se rvler

extrmement utile pour loptimisation de sa justesse.

III.4. Spcificit


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La spcificit dun dosage est son aptitude mesurer lanalyte dsir et seulement celui-ci, mme en prsence dequantits importantes de substances dont la structure est proche.

Il est vident que cette qualit du dosage est directement lie la nature de limmunsrum ou des anticorps utiliss.

Les tests de spcificit sont lourds mettre en uvre et, pour cette raison, sont gnralement pratiqus par le

fabricant lors de la mise au point de la trousse. Il existe deux faons dvaluer la spcificit :

a) Dtermination des pourcentages de raction croise : cette mthode ne sapplique quaux dosages par

comptition car elle repose sur lvaluation de la concentration dplaant 50 % du traceur, difficile dfinir dans

le cas des dosages par excs danticorps. Elle consiste raliser des courbes de calibrage avec tous les

composs qui sont susceptibles dinterfrer dans le dosage (Figure 4). Linterprtation du pourcentage de

raction croise obtenu doit se faire en tenant compte des concentrations relatives de lanalyte et de la substance

interfrante.

Figure 4:Dterminations des pourcentages de raction croise de la dsoxycorticostrone (DOC) et du cortisol dansun immunodosage de progestrone

DOC (4,4 / 70) 100 = 6,3 %

Cortisol (4,4 / 2.104) 100 = 0,022 %

b) Dtermination de la plus petite concentration de substance interfrante fournissant un signal non nul : cest la

seule valuation possible pour une mthode "sandwich".


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PIEGES ET PROBLEMESEN IMMUNOANALYSEA. BEAUDONNET-R. COHEN

ETAPE PRE-ANALYTIQUE CONSERVATION DES ECHANTILLONS

PROBLEMES LIES AUX REACTIFS ET AU PROTOCOLE EXPERIMENTAL

- Etalon- Anticorps- Effet crochet

- Composition du milieu ractionnel- Traitement des donnes

PROBLEMES LIES A LECHANTILLON

- Anticorps htrophiles- Auto-anticorps- Molcules anormales- Interfrences spcifiques par analogie de structure

MISE EN EVIDENCE DUNE INTERFERENCE

- Test de dilution- Test de surcharge- Tests particuliers


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PIEGES ET PROBLEMESEN IMMUNOANALYSEA. BEAUDONNET-R. COHEN

!ETAPE PRE-ANALYTIQUE CONSERVATION DES ECHANTILLONS

Les donnes indiques ci-dessous concernent plus particulirement les vingt-deux analytes proposs dans le cadredu contrle de qualit national en hormonologie plasmatique et marqueurs tumoraux.

En fonctions des systmes analytiques utiliss et des analytes doss, les conditions de prlvement peuvent trediffrentes et les interfrences cites ci-dessous plus ou moins importantes.

!I. ANTICOAGULANTSCertains anticoagulants peuvent tre dconseills par (suite dinterfrence avec lanalyte ou avec la mthodologieutilise) :

-hparinequi perturbe la raction antigne-anticorps- EDTA, fluorure de sodium et citrate lorsque la fluorescence en temps rsolu est utilise car ces

anticoagulants dissocient le chlate deuropium ; lEDTApeut aussi inhiber la raction enzymatique si le marqueurutilis est la phosphatase alcaline.

Dune faon gnrale, il est prfrable dutiliser des tubes sans anticoagulant.

!II. GEL SEPARATEURLutilisation de gels sparateurs est viter, en particulier lors du dosage dhormones libres.

!III. CONSERVATEURS

Lazidede sodiumest un inhibiteur de la peroxydase et son utilisation est donc dconseille avec les dconseilleavec les techniques utilisant cette enzyme.

!IV. CENTRIFUGATION

La centrifugation doit tre ralise le plus rapidement possible aprs le prlvement et doit tre suffisante pourliminer tous les globules rouges et toutes les particules en suspension dont la prsence peut perturber les

diffrentes ractions (I).

!V. ASPECT MACROSCOPIQUE DU SERUM

V.1. Srum hmolysLa prsence dhmoglobine peut perturber la raction antigne-anticorps et/ou altrer la qualit du signal mesur.Les fabricants indiquent en gnral partir de quelle concentration lhmoglobine devient gnante. Il fautnanmoins noter que dans le cas du dosage de laferritine, lhmolyse doit tre vite car linterfrence dpend dela concentration de ferritine intra-rythrocytaire qui est trs variable selon les pathologies.

V.2. Srum hyperlipidmique


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Lhyperlipidmie peut aussi tre nfaste en perturbant la raction antigne-anticorps et en modifiant les conditionsde pipetage par augmentation de la viscosit du milieu. Lhyperlipidmie modifie galement les coefficientsdextraction de certains strodes lorsquune extraction pralable est ncessaire. Les prlvements seront doncraliss de prfrence sur un sujet jeun depuis au moins 8 heures.

V.3. Srum ictrique

Les fabricants indiquent en gnral la concentration de bilirubine en dessous de laquelle, aucune interfrence nat note.

!VI. CAS PARTICULIERS DES DOSAGES HORMONAUX

Plusieurs facteurs influencent le rsultat dun dosage hormonal.

VI.1. Position du sujet

Un repos prolong est ncessaire avant de prlever certaines hormones : prolactine par exemple.

VI.2. Stress

Le stress augmente artificiellement la concentration de plusieurs hormones dont la prolactine et le cortisol.

VI.3. Rythme circadien

Linterprtation du rsultat dpendra du moment du prlvement pour les hormones dont la scrtion est soumise un rythme circadien. Dans le tableau ci-dessous sont rassembls quelques exemples dhormones dont lesamplitudes de variation sont importantes ou modres selon les heures de la journe (2).

HORMONE HEURESDACROPHASES

AMPLITUDE DE VARIATIONleve (>50%)

modres (10-50%)

Cortisol 8 14 h leveProlactine 22 8 h leve

Testostrone 6 7 h leve

Hormone thyrostimulante

(TSH)20 23 h leve

Hormone folliculostimulante

(FSH)

Hormone lutinisante (LH) variables modres

Estradiol 12 h modre

VI.4. Cycle menstruel

La connaissance de la date des dernires rgles est ncessaire pour linterprtation des rsultats des dosages deFSH, LH, prolactine, estradiol, progestrone, testostrone.VI.5. Caractre pulsatile de la scrtion des hormones gonadotropes

Le caractre trs pulsatile de la scrtion de LH peut ncessiter deffectuer le dosage sur un mlange de srums

(mlange volumes gaux de 3 srums prlevs 10 minutes dintervalle).


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VI.6. Etat physiologique (grossesse, mnopause)

Bien entendu, linterprtation dun dosage hormonal devra tenir compte de ces situations.

VI.7. Mdicaments

Il est conseill dans la mesure du possible de supprimer quelques jours avant le prlvement les mdicaments quiprsentent des analogies de structures avec la substance doser ; cest le cas en particulier des contraceptifs oraux

et des corticodes pour le dosagedes hormones strodiennes.Lors dun dosage de T4 libre, le dosage sera ralis avant la mise en place dune hparinothrapie. En effet,lhparine favorise la libration dacides gras libres non estrifis (AGLNE) partir des triglycrides (paractivation de la lipoprotine lipase), AGLNE qui dplacent la T4 de sa liaison avec ses protines vectrices etpeuvent interfrer surtout dans les techniques utilisant un analogue marqu de la T4.

Avec les techniques utilisant le systme streptavidine-biotine, chez les patients traits par de fortes doses debiotine, le prlvement devra tre effectu au moins six heures aprs la dernire administration.

!VII. AUTRES CAS PARTICULIERS

Le prlvement pour dosage de PSA doit tre fait avant toutes manipulations prostatiques (biopsie, massage,chographie transrectale, etc.) susceptibles daugmenter artificiellement et transitoirement la concentration de cemarqueur.

!VIII. CONSERVATION DES ECHANTILLONS

Ces conditions sont variables selon lanalyte, mais dune faon gnrale, les chantillons doivent tre centrifugsle plus rapidement possible et conservs congels sils ne sont pas analyss dans les 24 heures suivant leprlvement.

Il faut galement viter les conglations et dconglations successives.

Ltape de dconglation doit tre lente ; aprs dconglation le prlvement doit tre soigneusement homogniset subir une ventuelle centrifugation lorsque des particules en suspension sont prsentes.

Cas des prlvements expdier

Lorsque le prlvement peut tre effectu sur EDTA (ceci dpend de la mthodologie utilise et de lanalyte),laddition dagent anti-protolytique (aprotinine=Zymofrenou Iniprol) au plasma permet une conservation de48 heures temprature ambiante de la plupart des hormones protiques (3).Dans le cas contraire, il est important denvoyer les chantillons centrifugs congels et de maintenir laconglation pendant le transfert (caissons isothermes).

PROBLEMES LIES AUX REACTIFS ETAU PROTOCOLE EXPERIMENTAL

!I. ETALON

La validit dun immunodosage repose sur labsolue identit de structure entre la molcule talon et la molcule doser. Les problmes poss par la prparation des solutions talons sont diffrents selon la structure des analytes :analytes de faible masse molaire et de structure chimique bien dfinie et analytes de masse molaire leve et destructure complexe.

I.1. Analytes de faible masse molaire et de structure bien dfinie

Cest le cas des hormones strodiennes et thyrodiennes. Ces hormones existent sous forme purifie et lesprparations issues de diffrents lots seront identiques.


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La concentration sera exprime en mole ou sous-multiple par litre.

I.2. Analytes de masse molaire leve et de structure complexe

Dans le cas deshormones glycoprotiques et des marqueurs tumoraux, le problme est beaucoup plus complexe.Les talons sont obtenus par extraction de liquides biologiques, de tissus sains ou pathologiques. Mais les talonsne correspondent pas toujours lanalyte doser car il existe des variants gntiques et de nombreuses formesmolculaires dont les proportions varient selon les situations physiopathologiques (prolactine, LH, hCG, PSA par

exemple). Il nest donc pas possible dutiliser une substance talon reprsentative du mlange de ces diffrentesformes. En consquence, selon ltalon utilis (et la spcificit des anticorps), la rponse du systme conduira des rsultats diffrents.

La prparation de ces talons est confie des organismes spciaux tel que le National Institute for Biological

Standards and Controls ou NIBSC(Herfordshire, United Kingdom) la demande de lOrganisation Mondiale dela Sant (4).

- Prparations disponiblesPour les analytes proposs dans le cadre du contrle national de qualit, de telles prparations sont disponibles etdistribues pour hCG, hCG, FSH, LH, Prolactine, TSH, alpha-ftoprotine (AFP), ferritine et IgE totales.

La prparation de ces talons de rfrence ncessite une tude collaborative entre de nombreux laboratoires quidterminent quelle est la prparation la plus adapte, dfinissent les conditions de prparation et de conservation etattribuent une valeur de rfrence.

- Dfinitions

Deux types de prparations sont disponibles :

"International Standard" ou IS, prparation laquelle une unit internationale (UI) a t attribue lasuite de ltude collaborative de laboratoires utilisant lventail le plus large possible de mthodes dedosage. A lorigine, ces prparations destines aux dosages biologiques taient des prparations peupurifies. On peut citer lexemple du 2meIS 61/6 pour dosage de lhCG prpar partir dextrait durines

de femmes enceinte et contenant de lhCG dimre, des sous-units et libres et de la LH.

"International Reference Preparation" ou IRP, prparation purifie destine aux dosagesimmunologiques. Le 2me IS 61/6 pour dosage dhCG a t remplac par le 1er IRP 75/537 contenantessentiellement de lhCG dimre. Ces prparations (IRP) sont mises en service au terme dune tudecollaborative moins importante.

Lunit internationale (UI) et dfinie comme lactivit biologique contenue dans une masse dfinie dun IS oudune IRP.

-Remplacement de ces talons

Ces prparations doivent tre utilisables ou moins pendant 10 ans. Lorsquun talon doit tre remplac, la nouvelleprparation est compare lancienne afin de dterminer la quantit du nouvel talon contenant une unitinternationale, ce qui permet la constance dans le temps de lUI. La masse de prparation qui dfinit une UI peutdonc varier en fonction des talons successifs.

- Etalons secondaires

Le nombre dampoules dIS ou dIRP tant limit, les fabricants de trousses utilisent des talons secondaires dontlactivit immunologique est compare aux talons de rfrence. Cependant, les conditions dextraction et depurification ne sont pas toujours identiques, les activits par unit de masse sont diffrentes et les facteurs deconversion entre g/l et UI/l sont variables (prolactine AFP par exemple).

Lexpression des rsultats en UI/l est fortement recommande car elle permet une meilleure concordance entre

valeurs obtenues avec diffrentes trousses.


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Actuellement, pour un certain nombre danalytes, les fabricants calibrent leurs talons par rapport aux diffrents ISou IRP, par exemple :

- LH : 2meIS 80/552 ou 1erIRP 68/40- Prolactine : 1er IRP 75/504, 2meIS 83/562, 3meIRP 84/500

Dans le cas du dosage de lhCG la rfrence par rapport au 2meIS 61/6 est pratiquement abandonne.

En ce qui concerne la ferritine, la plupart des fabricants calibrent leurs trousses partir de ltalon 80/602 prpar partir de ferritine de foie humain. Dans le cas de lAFP, la majorit des trousses et calibre par rapport la 1re

IRP 72/225 prpare partir de "pool" de srums provenant de sang de cordon.

!II. ANTICORPS

Le dveloppement des anticorps monoclonaux issus des travaux de KOHLER et MILSTEIN (5) associ la miseen uvre de dosages de type immunomtrique a permis damliorer la spcificit, la prcision et la limite dedtection de nombreux dosages.

II.1. AvantagesLes anticorps monoclonaux permettent lobtention de ractifs homognes de lot lot.

Par ailleurs, lutilisation danticorps monoclonaux dans des systmes immunomtriques a permis notamment :

-La mise au point de dosages spcifiquesdhormones prsentant une grande similitude de structure : hCG-FSH-LH-TSH,

-Le dosage spcifique de lACEsans interfrence avec les autres glycoprotines de structure proche : NCA(non specific cross reacting antigen), BGP1 (biliary glycoprotein 1), NFA1 (normal ftal antigen 1),

- La mise au point de dosages prsentant une limite de dtection trs basse : TSH (permettant ladiscrimination entre sujets euthyrodiens et hyperthyrodiens),

- La dcouverte dantignes associs des tumeurs, dont le dosage est trs utile au suivi de certainestumeurs : antignes carbohydrates tels que CA 15-3 et cancer du sein, CA 125 et cancer de lovaire, CA 19-9 etcancers digestifs par exemple.

II.2. Inconvnients

Les anticorps monoclonaux prsentant nanmoins certains inconvnients lis leur manque daffinit et leur"surspcificit".

- Affinit

Laffinit dun anticorps monoclonal est en gnral infrieure celle dun anticorps polyclonal. Ce manquedaffinit ne pose pas de problme avec les systmes immunomtriques o lon est en excs danticorps. parcontre, dans le cas des dosages par comptition, cette baisse daffinit est un inconvnient et les anticorps

polyclonaux sont en gnral utiliss avec ce type de mthodologie.- " Surspcificit "

Un anticorps monoclonal est spcifique dun pitope et non de la molcule entire. Selon le cas, cette"surspcificit" se traduira par une sur-estimation ou une sous-estimation des rsultats.

Si lpitope reconnu est prsent sur une molcule diffrente, on pourra avoir des ractions croises importantes.Inversement, le dosage de molcules complexes et htrognes (hormones glycoprotiques, marqueurs tumoraux)pourra tre en dfaut si lpitope reconnu nest plus exprim ou si les pitopes prsents ne sont pas reconnus parles anticorps utiliss (formes molculaires variables).Plusieurs exemples peuvent tre cits :

hCG scrte sous forme de sous-units libres au cours de certaines tumeurs, formes non reconnues parles systmes immunologiques dosant spcifiquement lhCG dimre,


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ACE dont la structure antignique peut tre variable selon la tumeur lorigine de sa scrtion,

prolactine dont la forme molculaire principale est monomrique ("little prolactin"), mais qui circulegalement sous forme dimrique ("big prolactin") et polymrique ("big-big prolactin"), formes glycosylesou non dactivit biologique diffrente (6),

LH, hormone glycoprotique prsentant une microhtrognit lie aux chanes glycosyles et pourlaquelle une quinzaine disoformes a t dcrite (7). Certaines formes de LH scrtes chez des femmesendocrinologiquement normales ne sont pas dtectes par certains systmes immunologiques et on parle deLH "invisible" (8)

!III. EFFET CROCHET

III.1. Dfinition

Leffet crochet (effet dinversion haute dose dantigne ou "hook effect") se traduit par une chute paradoxale dusignal mesur en prsence dune forte concentration de lantigne doser et par lobtention dune courbe encloche. A une mme valeur du signal correspondront donc deux valeurs diffrentes de lanalyte, avec le risque derendre une valeur normale ou trs sous-estime (9).

III.2. Caractristiques

Cet effet crochet concerne les molcules possdant au moins deux sites antigniques diffrents et nest dcrit quepour les techniques immunomtriques.

Ce phnomne est observ pour les molcules prsentant de larges marges de variations physiopathologiques :hCG, prolactine, marqueurs tumoraux (ACE-AFP-antignes carbohydrates-PSA), ferritine par exemple.

III.3. Explications

Lexplication est diffrente pour les techniques en un temps et pour les techniques en deux temps.

Dans le cas des techniques en un temps, le phnomne est assimilable au phnomne de prozone observ avec les

techniques par hmagglutination (lexcs dantigne est tel que tous les sites anticorps sont saturs rendantimpossible la liaison anticorps de capture-antigne-anticorps marqu).Le phnomne disparat si on utilise une mthode en deux temps.

Dans le cas des techniques en deux temps, plusieurs explications ont t proposes :

- lavage incomplet aprs la premire incubation

- anticorps marqu en quantit insuffisante

- utilisation danticorps htrognes sur le support, cest--dire danticorps de forte et de faible affinit ;cependant, leffet crochet a t dcrit aussi avec les anticorps monoclonaux.

III.4. Mise en vidence et solutions

La dilution du srum permet la mise en vidence de ce phnomne. La poursuite des dilutions (dans le diluantfourni par le fabricant) est ncessaire jusqu lobtention de deux rsultats concordants.

En labsence dindication clinique, seule la dilution systmatique du srum permet de se mettre labri de leffetcrochet.

Nanmoins, les techniques en deux temps sont moins "sensibles" que celles en un temps et les concentrations partir desquelles on peut observer ce phnomne sont en gnral leves, mais doivent tre dtermines et connuespour chaque trousse de ractif.

Dans le cadre de la lgislation actuelle qui impose une double dtermination pour certains marqueurs tumoraux, la

possibilit de pratiquer cette double dtermination sur deux dilutions du mme srum permet la mise en videncedun ventuel effet crochet. Cette lgislation concerne le PSA, les antignes carbohydrates (CA 15-3, CA 19-9 etCA 125).


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!IV. COMPOSITION DU MILIEU REACTIONNEL EFFETS DE MATRICE

Le droulement de la raction antigne-anticorps est troitement li aux conditions de pH, force ionique,concentration en protines en gnral et concentration en protines de liaison de lanalyte en particulier, prsenceventuelle dagents tensioactifs. Le dosage de molcules de faible masse molaire (strodes) est particulirement

"sensible" aux effets de matrice. Par consquent, le milieu de dilution de la gamme talon et lchantillon doserdoivent avoir des compositions aussi proches que possible. Une trousse adapte au dosage dun chantillon sriquene sera pas obligatoirement adapte au dosage de ce mme chantillon dans un autre milieu biologique.

Par ailleurs, en cas de dilution de lchantillon, le choix du diluant doit tenir compte des conditions cites ci-dessus : pH, force ionique, etc. (10).

!V. TRAITEMENT DES DONNEES

En immunoanalyse, il ny a pas de relation linaire entre lintensit du signal et la concentration de lanalyte. Selonles diffrents modles mathmatiques utiliss pour ltablissement de la courbe de calibration, les rsultats

pourront tre diffrentes, expliquant une partie des carts intertechniques (11).

PROBLEMES LIES A LECHANTILLON

Lchantillon analyser peut contenir des molcules inhabituelles ou prsentes une concentration anormalementleve qui vont perturber le droulement des ractions immunologiques.

!I. ANTICORPS HETEROPHILES

I.1. Dfinition

Les anticorps htrophiles sont des anticorps prsents dans certains srums et qui sont dirigs contre lesimmunoglobulines animales du ractif. Ces anticorps pourront interfrer au cours des diffrentes tapesimmunologiques, en particulier dans les techniques immunomtriques lorsque les deux anticorps ractifs ont lamme origine animale. On peut noter galement une interfrence dans les techniques par comptition (12).

I.2. Origine

Lorigine de ces anticorps est multiple. Ils peuvent apparatre :

- aprs immunisation par vaccins prpars sur tissu animaux,

- par suite de contacts frquents avec les animaux,- au cours de maladies auto-immunes (facteurs rhumatodes des affections rhumatismales et du lupus

rythmateux),

- par suite dinjection danticorps monoclonaux de souris dans le cadre dimmunoscintigraphies etdimmunothrapies.

Enfin, dans un certain nombre de cas, on ne trouve pas dexplication leur prsence.

I.3. Caractristiques

Ces anticorps peuvent tre dirigs contre les diffrents motifs antigniques de limmunoglobuline : motifsisotypiques, allotypiques et idiotypiques. Actuellement, les anticorps htrophiles lorigine des interfrences les

plus souvent dcrites sont des anticorps anti-isotypes dirigs contre la partie constante des immunoglobulines


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(fragment Fc) et des anticorps anti-idiotypes dirigs contre la partie hypervariable de limmunoglobuline. Cesanticorps sont de classe IgG et/ou IgM.

I.4. Problmes poss par la prsence des anticorps htrophiles .

- Avec les techniques immunomtriques, ces anticorps vont tre le plus souvent lorigine dune sur-estimation des rsultats en se fixant dune part sur lanticorps de capture et dautre part sur lanticorps traceur,simulant ainsi la prsence de lantigne (13-14). Plus rarement, ces anticorps peuvent aussi tre lorigine dunesous-estimation des rsultats (cas dIgM anti-immunoglobulines animales qui, par suite dencombrement strique,empchent la fixation de lantigne sur lanticorps spcifique).

- Avec les techniques par comptition, bien que moins souvent signal, ce type dinterfrence peutnanmoins exister (cas dIgM anti-IgG animales qui par suite dencombrement strique empchent la fixation dutraceur sur lantisrum).

I.5. Solutions pour liminer ou minimiser ces interfrences

Plusieurs solutions sont possibles :

- laddition de srum animal provenant de la mme espce que celle ayant fournie les anticorps ractifspermet de neutraliser les anti-immunoglobulines (13-14) ; cependant, la concentration dimmunoglobulines

neutralisantes peut tre suffisante pour certains spcimens et insuffisante pour dautres ; par ailleurs, il et difficilede neutraliser compltement les anticorps de classe IgM,

- lutilisation de fragments F(ab) 2comme anticorps de capture ou traceur au lieu de lanticorps complet,ce qui vite la fixation des anticorps htrophiles dirigs contre le fragment Fc, mais nvite pas la fixation desanticorps anti-idiotypes (15),

- lutilisation de techniques en 2 temps; les anticorps htrophiles se fixent sur deux molcules danticorpsde capture et ne sont plus disponibles pour lier lanticorps traceur ajout au cours de la deuxime ractionimmunologique (15).

I.6. Cas particuliers des patients soumis une immunoscintigraphie ou une immunothrapie

Linjection danticorps monoclonaux de souris (ou de leur fragments) entrane lapparition danticorps anti-souris

(HAMA ou Human Anti-Mouse Antibodies) une concentration telle quils ne sont plus "neutralisantes" par lessolutions prcdentes (16).

Les techniques immunomtriques avec deux anticorps monoclonaux de souris sont particulirement "sensibles" la prsence danticorps anti-isotypes. Par consquent, tous les analytes doss ainsi sont concerns (ACE-AFP-PSA-ferritine-hCG-antignes carbohydrates-etc.).Llimination des "HAMA" ncessite un traitement pralable du srum avant immunodosage, traitement par lepolythylne glycol 130 g/l ou chauffage du srum 90C dans le cas de lACE (17).

La prsence danticorps anti-idiotypespertubant fortement le dosage du CA 125 a t dcrite chez des patientesayant subi plusieurs immunoscintigraphies (avec injection danticorps OC 125) pour surveillance post-opratoiredun cancer de lovaire. Dans ce cas, les anticorps anti-idiotypes se comportent comme le CA 125 en se fixant sur

les anticorps anti-OC 125 du ractif. Ces anticorps anti-idiotypes peuvent tre limins par chromatographiedaffinit pralable sur protine A (18).

!II. AUTO - ANTICORPS

II.1. Anti-T3, anti-T4

Les auto-anticorps (anti-analytes) rencontrs en pathologie thyrodienne vont galement perturber, plus ou moinsselon le type de mthodologie, les rsultats de dosage de T3 et T4 libres.

OrigineCes auto-anticorps peuvent tre prsents chez les malades atteints de maladies thyrodiennes (Basedow,

Hashimoto) ou non thyrodiennes et mme quelquefois chez des sujets sains (19-20).


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La frquence de ces auto-anticorps est denviron 1/1000 dans la population gnrale est plus importante dans lespathologies auto-immunes.

Mcanisme dactionLinterfrence observe (positive ou ngative) dpendra de la mthode de sparation des formes libres et lies.

- Avec les techniques de type ELISA en une seule tape, ces auto-anticorps en se fixant sur lhormonemarque diminuent la disponibilit du traceur pour lantisrum, entranant une augmentation artefactuelle deshormones libres.

- Avec certaines techniques radioimmunologiques, o le complexe analyte-immunoglobuline anti-analyte estretrouve avec la fraction lie, on observe une diminution des valeurs.

Les techniques en deux temps (immunoextraction de lhormone libre, suivie de lavages, puis de laddition dumarqueur), ou les techniques reposant sur le principe dune comptition vis--vis danticorps marqus sont moins"sensibles" la prsence de ces auto-anticorps (20-21-22).

Mise en videnceCes auto-anticorps sont mis en vidence par la mesure du pourcentage des hormones T3 ou T4 radioactivesprcipites par le polythylne glycol 20%.

II.2. Anti-TSH

Les anticorps anti-TSH (synthtiss la suite de lintroduction de TSH dans lorganisme dans un butthrapeutique) se fixent sur la TSH doser et inhibent la fixation de lanalyte sur les anticorps ractifs. On auraune sous-estimation des rsultats avec les techniques immunomtrique.

!III. MOLECULES ANORMALES

Dysalbumine et dosage de T4 libre

La prsence dune dysalbuminmie, anomalie de lalbumine se caractrisant par une affinit anormale de cette

protine pour la T4 marque peut entraner une augmentation artefactuelle de la T4 libre avec les techniques dedosage en un temps (20).

!IV. INTERFERENCES SPECIFIQUES PAR ANALOGIE DE STRUCTURE

Lorsque le srum contient des molcules proches structurellement de lanalyte doser, on pourra observer unesurestimation des rsultats par suite de ractions croises entre ces molcules et lantisrum : interfrences

mdicamenteuses et situations pathologiques particulires.

IV.1. Interfrences mdicamenteuses

Certaines de ces interfrences sont bien connues, parmi lesquelles :- Triac (acide triiodothyroactique) et dosage de T3 totale et libre,

- Prednisolone (et prednisone transforme en prdnisolone dans lorganisme) et dosage direct ducortisol,

- Progestrone orale et dosage direct de laprogestrone(lorsque lantisrum prsente des ractions croisesavec les mtabolites rduits de cette molcule),

- 17 estradiol micronis et dosage direct de lestradiol, par suite de ractions croises avec les mtabolites(23).

IV.2. Situations pathologiques particulires

Le choix dune technique de dosage des strodes sriques (dosage immunologique direct ou dosage aprsextraction et sparation chromatographique) devra tenir compte des situations physiopathologiques, du sexe et de

lge qui vont modifier les concentrations relatives du strode et de ses mtabolites (24).


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- CortisolLe dosage direct de la cortisolmie est surestim :

en cas de forte augmentation des prcurseurs (17 hydroxy-progestrone, 11 dsoxycortisol) quiprsentent des ractions croises avec les antisrums anti-cortisol ; ces situations se rencontrent lors dedficit enzymatique des surrnales, en particulier dficit en 21 hydroxylase et au cours du test lamtopirone en cas daccumulation des strodes conjugus et non conjugus, au cours de linsuffisance rnalechronique (25).

- Testostrone, le dosage direct sera surestim chez la femme en raison des ractions croises en gnralimportantes avec la dihydrotestostrone (qui reprsente environ 50% de la concentration en testostrone). Ledosage direct est galement surestim chez lhomme trait par la dihydrotestostrone.

MISE EN EVIDENCE DUNE INTERFERENCE

Lorsque le rsultat trouv ne correspond pas au rsultat attendu, des tests simples de dilution et de surchargepeuvent permettre de mettre en vidence des problmes dexactitude (26).

- Test de dilution

Un test de dilution non linaire permettra de mettre en vidence :un effet crochet une diffrence daffinit de lanticorps entre lantigne doser et lantigne de lchantillon (soit en

raison dune diffrence de structure, soit en raison de la prsence dune substance interfrente).

- Test de surcharge

Ce test est ralis en mlangeant le srum et ltalon le plus lev ; lobtention dune valeur plus faible que celleattendue doit faire suspecter galement la prsence dune substance interfrente.

Tests particuliers

Par ailleurs, la recherche des facteurs rhumatodes est possible (test de Waaler-Rose, test au latex) ainsi que celledes "HAMA" laide de trousses commerciales.


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Nuclaire VIIIe Colloque CORATA Montpellier, 16-19 octobre, p 55


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PROBLEMES LIES AU MARQUEUR ET A SON SIGNALEN IMMUNOANALYSE

R. BADOR

!!!!INTRODUCTION

Au cours des deux dernires dcennies on a assist un essor considrable de limmunoanalyse, avec unlargissement sans cesse croissant de son champ dapplication et une diffusion de plus en plus grande dans leslaboratoires danalyses. Cet essor a t favoris principalement par lapparition des anticorps monoclonaux et parlutilisation des marqueurs non radioactifs encore appels marqueurs froids.

Limmunoanalyse regroupe un ensemble de mthodes danalyse chimique dans lesquelles la spcificit dedtection dune espce molculaire est due sa liaison in vitro avec un ou plusieurs anticorps spcifiques. Afin dequantifier la formation du complexe antigne-anticorps, la plupart des techniques courantes emploient unmarqueur. Dune manire gnrale, ont peut dfinir un marqueur pour immunodosage comme tant une entit

(atome, molcule, ion, ) lie chimiquement un antigne ou un anticorps et dlivrant un signal, direct ouindirect, quantitativement mesurable.

Les techniques dimmunodosages, comme toute technique danalyse, peuvent tre values au moyen dun certainnombre de critres de qualit : prcision, exactitude, dtectabilit (ou limite de dtection). A ces critresstatistiques classiques bien dfinis, il faut ajouter dautres caractristiques importantes : tendue de la gamme deconcentration accessible (dynamique du dosage) et praticabilit (degr dautomatisation, temps danalyse,conservation des ractifs,).

Quelle est linfluence du marqueur et de son signal sur la qualit globale dun immunodosage ? Cest la question laquelle tente de rpondre les lignes qui suivent.

!LES MARQUEURS

Les principaux marqueurs utiliss en immunoanalyse courante sont :

- les radiolments dans les techniques RIA (radioimmunoassay) et IRMA (immunoradiometric assay),

- les enzymes dans les techniques EIA (enzymoimmunoassay) et IEMA (immunoenzymometric assay),

- les fluorophores dans les techniques FIA (fluoroimmunoassay) et IFMA (immunofluorometric assay),

- les molcules chimiluminescentes dans les techniques CLIA (chemiluminoimmunoassay) et ICMA(immunochemiluminometric assay).

Les fluorophores et les molcules chimiluminescentes sont souvent regroups sous la dnomination plus gnralede luminophores, cest--dire groupements chimiques susceptibles dmettre un signal luminescent sous leffetdune excitation approprie, lumineuse dans le premier cas, chimique dans le second cas.

Outre la distinction habituelle entre mthodes de comptition et mthodes immunomtriques deux anticorps, ilexiste un autre niveau de classification des immunodosages faisant intervenir la ncessit ou non dune sparationphysique des formes libre et lie avant la mesure du signal. Pour cette raison, on parle dimmunodosages en phasehtrogne et dimmunodosages en phase homogne, ces derniers ne pouvant tre mis en uvre que si le marqueurdlivre un signal modul par la formation du complexe antigne-anticoprs.


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Les marqueurs peuvent galement tre classs selon leur nature chimique. Il peut sagir datomes (125I, 3H), dions(Eu3+, 57Co3+), de molcules organiques de faible masse molaire (fluorescine, ester dacridinium, ) ou demolcules de masse molaire leve (enzymes).

Les diffrents marqueurs pour immunoanalyse doivent possder un certain nombre de qualits gnrales. Enpremier lieu, leur liaison chimique une molcule dantigne (traceur) ou danticorps (anticorps de rvlation)doit perturber le moins possible la formation du complexe antigne-anticorps. De plus, le signal physique mis doitavoir une intensit (par unit de concentration de marqueur) leve, proprit dont dpendent troitement laprcision des mesures et la limite de dtection du marqueur. Enfin, la spcificit du signal est une propritessentielle garantissant un faible bruit de fond des mesures, donc contribuant galement une bonne dtectabilit.Outre les trois qualits cites prcdemment, il est souhaitable quun marqueur soit dtectable quantitativement surune large gamme de concentration, cest--dire que son signal possde une grande dynamique ; cette proprit estlie la fois la nature du signal physique lui-mme et lappareil de mesure pouvant prsenter un niveau desaturation.

La figure 1 met en vidence les critres de qualit caractrisant la dtection intrinsque des marqueurs (ou desmolcules marques), sans prendre en compte les autres sources de variabilit des immunodosages. La sensibilitdS/dC est constante dans toute la zone de proportionnalit et diminue au voisinage de la zone de saturation.

Lerreur C sur la concentration dpend la fois de la variabilit du signal exprime ici par S et de la sensibilitdS/dC, puisque C = S.(dS/dC)-1. La limite de dtection LD, o concentration minimale dtectable, dpend lafois de lincertitude ks0sur le bruit de fond S0 et de la sensibilit lorigine (dS/dC)0: LD = ks0 (dS/dC)0

-1. Lesignal minimum net dtectable est estim en multipliant lcart type s0 sur le bruit de fond par le coefficient kncessaire pour considrer que la mesure effectue est significativement suprieure S0.

!LES DIFFERENTS SIGNAUX

Tout marqueur met un signal physique direct ou indirect, spontan ou provoqu, sensible ou non lenvironnement physico-chimique. Ce signal physique est mesur au moyen dun instrument qui le convertit en unsignal lectrique lui-mme transform ensuite en un signal numrique. Au cours de ces oprations de conversionapparaissent diffrents bruits qui sajoutent au signal net pour donner un signal numrique brut S (voir figure2). Selon la nature du marqueur et le principe de sa dtection les contributions relatives des diffrents bruits sont variables.


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Figure 1: Relation entre signal et concentration en molcules marques

Figure 2: Signal et bruits lors de la dtection dun marqueur

S = signalC = concentration en molcules marquesdS/dC = sensibilitLD = limite de dtection

Snet= signal numrique netS = signal numrique brutBint= bruit interneBext= bruit externe


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Le signal radioactif

En immunoanalyse, les deux principaux radiolments marqueurs tant liode 125 et le tritium, le signal consistedonc soit en une mission de photons X et , soit en une mission de particules : ces deux types dmission sontaisment dtectables au moyen de spectromtres appropris. On utilise parfois le Cobalt 57 metteur dans le casdes dosages simultans.

Le Signal physique lui-mme est un signal direct (directement mis par le marqueur), spontan (ne faisant pasintervenir une source dnergie externe) et trs spcifique (les rayonnements parasites ou les contaminations tantexceptionnels) ; son mission est indpendante du milieu, lactivit (amplitude du signal physique) tant seulementproportionnelle au nombre de molcules marques. Dautre part, la dtection de ce signal est une dtectionnumrique (comptage dimpulsions), donc facilement corrige du bruit de fond rsiduel.

Le tableau suivant indique les limites de dtection (LD) des espces marques avec de liode 125 et avec dutritium.

Par rapport aux autres marqueurs, en particulier les enzymes, le marqueur radioactif prsente aussi lavantage dunfaible encombrement strique.

Malgr ces proprits trs favorables, il existe certains inconvnients dans lutilisation des molculesradiomarques : dune part, le temps dacquisition du signal doit tre suffisamment long pour obtenir une prcisionet une limite de dtection satisfaisantes, dautre part le phnomne de dcroissance radioactive, et ventuellementla radiolyse, limitent la dure de conservation des molcules marques.

LD ABSOLUES DES ESPECES MARQUEES

2000 Ci / mmol125I BF = 35 cpm LD 10-18 mol

t min

3H 100 Ci / mmolBF = 25 cpm 10-16 mol < LD < 10-17molt min


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Le signal fluorescent direct

En immunoanalyse, le signal fluorescent peut tre produit soit directement par le marqueur lui-mme (fluorophoreli un antigne ou un anticorps), soit indirectement la suite de la transformation dun substrat fluorigne en unproduit fluorescent par une enzyme spcifique employe comme marqueur (figure 3).

Dans le cas du marquage fluorescent, le signal lumineux mis par le marqueur est un signal direct, provoqu parune excitation photonique. Lamplitude SFdu signal reu par le dtecteur peut sexprimer sous la forme :

SF=k.0..Q.N

o k est un facteur gomtrique, o le flux excitateur, labsorptivit molaire du fluorophore, Q le rendementquantique du fluorophore et N le nombre de molcules marques.

Par rapport au signal radioactif, on constate lexistence de deux causes de variabilit supplmentaires : o nestjamais parfaitement constant puisque toutes les sources lumineuses excitatrices sont susceptibles de fluctuation, Qdpend de la composition du milieu. En outre se pose le problme de la spcificit du signal et de la slectivit desa dtection en raison de linterfrence possible de fluorescences parasites et de rayonnements diffuss ; ceproblme ne peut tre rsolu dans le cas des fluorophores classiques comme la fluorescine et lamthylombellifrone. Seul lemploi des chlates deuropium a permis, grce la technique de fluorimtrie pulse,de saffranchir la fois des rayonnements parasites et du bruit interne du dtecteur, avec pour consquence unelimite de dtection trs favorable (environ 10-18mol). Les principaux avantages du marquage fluorescent sont : untemps dacquisition du signal trs bref et une dynamique de dtection pouvant atteindre cinq ordres de grandeur.

(a)

(b)

Figure 3 :

Emission du signal fluorescent.

(a) mission directe

(F* = fluorophore)

(b) mission indirecte

(E = enzyme)


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Le signal chimiluminescent direct

Comme dans le cas du signal fluorescent, lmission lumineuse peut provenir soit du marqueur (luminophore)ragissant directement avec un ractif en excs, soit dune espce molculaire transforme par une enzymespcifique utilise comme marqueur (figure 4).

Dans le premier cas on a affaire un signal direct, provoqu par une raction chimique. Lamplitude du signal SCLreupar le dtecteur un instant t aprs linjection du ractif peut sexprimer sous la forme :

k, Q et N ayant la mme signification que prcdemment, tant la vitesse de raction chimique.

Il existe diffrentes causes de variabilit de SCL: le rendement quantique et la vitesse de raction dpendent de la

composition du milieu ; le volume de ractif et linstant du dbut de la dtection ne peuvent tre parfaitementreproductibles. En revanche la spcificit de lmission, donc la slectivit de la dtection, est meilleure que celledu signal fluorescent puisquil ny a pas de source de lumire parasite. Il faut galement noter que le bruit internedu dtecteur peut tre en grande partie supprim lorsquon emploie la technique du comptage de photons grce laquelle la limite de dtection atteint dans certains cas 10-19mol.

Les avantages du marquage chimiluminescent sont les mmes que ceux du marquage fluorescent en ce quiconcerne le temps dacquisition du signal et la dynamique de dtection. Linconvnient majeur en est la fugacitde lmission qui a pour consquence limpossibilit de vrifier une mesure effectue sur un tube.

Le tableau suivant prsente les principaux marqueurs chimiluminescents (en marquage direct) ainsi que lesractions de chimiluminescence.

dNdt

SCL = k.Q. dN dt

Figure 4 :

Mode dmission du signal

chimiluminescent.

(a) mission directe par le

marqueur (L*)

(b) mission indirecte grce

un marqueur enzymatique (E)


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PRINCIPAUX MARQUEURS CHIMILUMINESCENTS

PHTALHYDRAZIDES : LUMINOL, ISOLUMINOL, DERIVES

peroxydase

Luminol + H2O2 Aminophtalate + hv OH

ESTERS DACRIDINIUM

Ester dacridinium + H2O2 N-Mthylacridone + hv OH

Le signal enzymatique

Les marqueurs enzymatiques nmettent pas un signal physique direct, ils sont dtects par lintermdiaire dunsubstrat spcifique en excs qui est transform en un produit mettant un signal physique dont lamplitude estproportionnelle la quantit du marqueur enzymatique et au temps dincubation. Le signal enzymatique est doncun signal indirect, soit dmission lorsque le produit form est fluorescent ou chimiluminescent, soit dabsorptionlorsque le produit form est dtect par une mesure dabsorbance une longueur donde caractristique (Figures 5et 6).

Figure 5: Principe dmission du signal enzymatique


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Figure 6: Diffrentes possibilits de mesure du signal enzymatique

Lorsquon procde des mesures fluorimtriques ou luminomtriques, on retrouve les causes de variabilit citesprcdemment auxquelles sajoute la variabilit de la raction enzymatique elle-mme. Quant aux mesuresphotomtriques dabsorption les plus frquemment employes, elles souffrent en plus dun certain manque despcificit (influence des bulles, imperfections des tubes de mesure, ) et dune dynamique rduite.

Cependant, malgr ces inconvnients, le marquage enzymatique est le seul offrir la possibilit damplification dusignal par simple augmentation du temps dincubation de ltage de rvlation.

Le tableau suivant prsente les principales enzymes utilises en immunoanalyse ainsi que les modes de dtectionpossibles (photomtrie dabsorption, fluorimtrie, luminomtrie).

Les deux enzymes les plus employes sont la peroxydase de raifort qui peut tre rvle par mesure photomtriquedabsorption et par chimiluminomtrie et la phosphatase alcaline qui offre les trois possibilits de dtection :absorption, fluorescence et chimiluminescence.

PRINCIPALES ENZYMES UTILISEES EN I.A.

Dtection

Absorption Fluo. C.L.

Peroxydase de raifort (HRP) + +

Phosphatase alcaline + + +

-D-Galactosidase (GAL) + + +

Glucose 6 Phosphate dshydrognase(G6PD)

+ +


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Signalons que la malate dshydrognase est utilise dans les mthodes de comptition en phase homogne.

Cette liste nest pas exhaustive, on peut citer galement le lysozyme, lactylcholine-estrase,

Trois exemples de rvlation du signal enzymatique sont prsents ci-aprs.

Premier exemple : rvlation photomtrique dabsorption de la PEROXYDASE au moyen dun ractif contenantde lo.phnylnediamine et H2O2

Le mesure dabsorbance est effectue 492 nm, aprs 30 minutes dincubation.

Ractif PEROXYDASE Produit

La dynamique de mesure est

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