Programme des travaux pratiques d’immunologie Médecine- Troisième année

2010-2011

1. Initiation au travail de laboratoireTests d’agglutination : Hémagglutination : Groupage sanguin Agglutination passive du latex 

2. Tests d’agglutination de bactéries : Test de Widal pour le diagnostic de la typhoïde

3. Test ELISA 

4. Travaux dirigés : Exercices

Instructions générales pourles travaux pratiques d’Immunologie Fondamentale

Matériel indispensable- Blouse de laboratoire en coton, manches longues, arrivant au genou- Gants de latex usage unique, non stériles (25 paires en moyenne)- Un rouleau de papier cuisine (un/binome)- Marqueurs permanents noirs, pour écriture sur verre, grosseur F - Matériel d’écriture (certaines séances nécessitent du papier millimétré)- Calculatrice

Mesures de sécurité:- Porter en permanence la blouse et les gants pendant toute la séance de travaux

pratiques- Considérer tout spécimen biologique comme potentiellement infectieux: éviter tout

contact avec la peau ou les muqueuses, jeter judicieusement (voir ci-dessous) et nettoyer tout épanchement accidentel

- Ne pas manger, boire ou mastiquer du chewing-gum au laboratoire- Eviter de toucher avec vos gants à tout objet en contact potentiel avec la bouche - Jeter chaque type de déchet de manière adéquate:

o Ejecter les cônes de pipette automatique directement dans le cristallisoir contenant de l’eau de Javel à 30% (l’eau de Javel est le meilleur désinfectant)

o Verser tous les liquides biologiques dans un cristallisoir contenant de l’eau de Javel à 30%

o Remplir ou rincer tout le matériel de laboratoire à usage unique ou multiple ayant contenu du matériel biologique avec de l’eau de Javel à 30% et incuber pour 1 minute au moins

o Jeter le matériel de laboratoire à usage unique (tubes et plaques en plastiques…), désinfecté à l’eau de Javel, dans les sacs poubelle

o Laver le matériel à usage multiple, désinfecté, très abondamment à l’eau de robinet. Savonner, rincer à l’eau de robinet puis à l’eau distillée, retourner pour sécher sur du papier cuisine propre

- Après avoir terminé, nettoyer la paillasse à l’eau et au savon, la rincer et la sécher. - Enlever les gants, les jeter dans les poubelles, et se laver toujours les mains pour 30

secondes au moins avant de quitter le laboratoire.

Rédaction d’un rapport scientifique

Un rapport scientifique est la conclusion logique et essentielle qui complète un travail scientifique. Ce dernier pourrait être une expérience réalisée en une séance de travaux pratiques, un mémoire de fin d’études ou même une thèse de doctorat étalée sur plusieurs années ! Dans tous les cas, l’organisation générale du rapport reste la même.

Le rapport est destiné à satisfaire deux objectifs :- Répondre à la problématique qui a nécessité le travail en exposant le travail effectué et

sa valeur- Permettre au lecteur de refaire ce travail, soit pour le vérifier, soit pour l’appliquer à

d’autres problématiques.

Le rapport doit donc être à la fois explicite, objectif, instructif, concis et précis. Afin d’assurer ces critères, tout rapport scientifique doit être impérativement organisé en cinq sections :

1. Introduction :- Problématique- Objectif du travail- Principe du travail

2. Matériel et Méthodologie3. Résultats4. Conclusion

Dans ce qui suit, nous exposons les directives générales concernant les différentes sections d’un rapport scientifique de Travaux Pratiques :

1. Introduction

1.1. Problématique Cette section place le travail dans son contexte : elle résume ce que l’on sait du sujet et relie les différents éléments de ce savoir entre eux.Prenons pour exemple le test de Wright pour le diagnostic de la brucellose. Dans la section «Problématique » on rappelle en quoi consiste la brucellose, ses signes cliniques, ses indicateurs biologiques et l’importance d’un diagnostic de laboratoire précoce et fiable pour la confirmation du diagnostic clinique et pour le traitement. Cette section est rédigée au temps présent et elle est appuyée par une bibliographie. 2.2. Objectif du travailCette section doit indiquer le but de l’expérience, c’est-à-dire pourquoi elle a été choisie et réalisée, ce que l’on cherche à savoir. Prenons toujours l’exemple du test de Wright. Dans la section « Objectif » on indique si le patient dont on teste le sérum présente les signes cliniques de l’infection (fièvre, fatigue…), le début d’apparition de ces signes, et les raisons pour lesquelles le médecin traitant suspecte une brucellose. Ensuite on se propose de rechercher, dans le sérum du patient, les anticorps spécifiques de la bactérie brucella qui confirmeraient le diagnostic d’une brucellose active.

Cette section doit être rédigée au temps présent.

2- Principe

Cette section indique comment ces anticorps sont recherchés selon la technique utilisée dans le test. Toujours dans le même exemple du diagnostic de la brucellose, le principe du test de Wright repose sur l’agglutination de bactéries du genre brucella, préalablement tuées, fixées et colorées, en présence d’anticorps spécifiques en quantité suffisante. Cette agglutination peut être visible à l’œil nu. La quantité d’anticorps étant cruciale au diagnostic, on indique que l’on recherche également le titre du sérum en testant différentes dilutions de ce dernier.

Cette section doit être également rédigée au temps présent.

3- Matériel et Méthodologie

3.1. Matériel Il comporte essentiellement les réactifs spécifiques à ce test :

- Le sérum test (on indique ici son numéro)- Les contrôles positif et négatif sélectionnés- Les bactéries : origine commerciale et numéro de référence si connus- Les tampons utilisés : nature, molarité et pH

Il ne faut pas mentionner dans le rapport les solutions d’usage usuel, récipients, équipement, etc…

3.2. Méthodes :Cette section est destinée à permettre au lecteur d’évaluer les conditions de l’expérience, et par conséquent de faire sa propre interprétation des résultats, ainsi que de répéter l’expérience dans les mêmes conditions si nécessaire. Elle indique donc les étapes de la procédure de manière quantitative et objective, en donnant les éléments suivants :

- Les dilutions de sérum testées et le nombre de points expérimentaux, le volume, le tampon et le récipient. Ex : 6 dilutions de sérum test de 1:2 en 1:2, allant de 1:20 à 1:640, dans 0,5 ml de PBS, dans un tube à hémolyse.

- Les contrôles- Le volume et la concentration des bactéries rajoutées- La durée et la température d’incubation- La durée et la vitesse de centrifugation- Le mode de lecture : agitation des tubes et observation à l’œil nu de l’état libre ou

agglutiné des bactéries. - La méthode d’estimation des résultats : (Ex : ++++ indique que 100% des bactéries

sont agglutinées, +/- indique que 25% des bactéries sont agglutinées).

Il ne faut pas dans cette section détailler la façon de faire les dilutions ou les « trucs » de manipulation, tels que pipetage, calcul des dilutions, homogénéisation, fermeture des tubes, etc…).

Cette section est rédigée au passé composé actif (Nous avons dilué le sérum ….) ou, encore mieux, passif (le sérum a été dilué…).

4- Résultats 

Cette section décrit ce qui a été observé à la fin de l’expérience. Elle doit en premier lieu démontrer la validité de l’expérience en donnant les résultats des contrôles positif et négatif et en indiquant si ces résultats sont conformes à ceux escomptés. Seulement alors on peut s’assurer que l’expérience s’est déroulée dans les bonnes conditions de qualité et que les résultats sont fiables.

Ensuite, on indique les résultats de l’ensemble du test. Ceci peut être fait de différentes manières, généralement à l’aide d’un texte rédigé, de tableaux, de graphes, de diagrammes, de photos, etc… Tous ces éléments graphiques doivent être impérativement numérotés, titrés et légendés.

Ex : Dans le test de la brucellose, on peut reporter les intensités d’agglutination sous forme de (+) ou (-) en fonction de la dilution de sérum dans un tableau, introduit par une phrase courte, titré et légendé.

Comme la section « Méthodologie », cette section est rédigée au passé composé actif (Nous avons dilué le sérum ….) ou, encore mieux, passif (le sérum a été dilué…).

5- Conclusion

Cette section doit indiquer la ou les interprétations possibles des résultats de l’expérience, les limites de cette interprétation, et éventuellement les recommandations pour affiner dans le futur la réponse à la problématique.

Ex : Un titre de sérum anti-brucella de 80 est équivoque : Il peut indiquer une brucellose au début ou à la fin. Il faut corréler les résultats de l’expérience avec l’évolution clinique du patient et répéter ce test dans une quinzaine de jours : un titre croissant indique un état évolutif de la maladie, alors qu’un titre décroissant indiquera un début de convalescence.

Cette section doit être rédigée au temps présent.

Test de groupage sanguin

But du test Déterminer le groupe sanguin pour les systèmes ABO et Rhésus par la recherche des agglutinogènes A, B et D à la surface des globules rouges.

Principe du testLes globules rouges portant un agglutinogène donné sont agglutinés lorsqu’ils sont mis en présence d’anticorps spécifiques de cet antigène. Les anticorps utilisés dans ce test sont monoclonaux, donc monospécifiques, assurant l’absence de réactivité croisée. L’agglutination peut être mise en évidence dans des tests qualitatifs, réalisés sur des plaques de verre ou d’opaline.

Protocole expérimental - Désinfecter le bout du majeur à l’aide d’un coton imbibé d’alcool à 70- Appuyer avec le pouce sur le bout du doigt pour retenir la circulation sanguine- Piquer le bout du majeur vivement avec la lancette stérile- Recueillir 5 gouttes de sang dans les 5 puits de la plaque de verre destinée au test en

touchant légèrement avec le doigt- Ajouter une goutte de réactif différent à proximité de chacune des gouttes de sang- A l’aide d’un cure-dent ou d’un agitateur à usage unique, mélanger les réactifs de

chaque puits en décrivant un cercle de 2-3 cm de diamètre - Imprimer à la plaque un mouvement rotatif pendant quelques minutes (jusqu’à 10

minutes) et noter les agglutinations.

Résultats et interprétation

Le groupe sanguin pour le système ABO peut être déterminé per référence au tableau suivant :

Agglutination avec anti-A

Agglutination avec anti-B

Agglutination avec (anti-A + anti-B)

Groupe O - - -Groupe A + - +Groupe B - + +Groupe AB + + +

Généralement, ces agglutinations sont rapides et nettes. Par contre, l’agglutination avec les anticorps anti-D est beaucoup plus difficile à mettre en évidence. Dans certains cas, elle est même inexistante. Un test de Coombs est alors nécessaire pour trancher le diagnostic.

Tit

re d

’Ac

Tests d’agglutination directe de bactéries

IntroductionQuand un individu subit une infection par des micro-organismes pathogènes, il développe une réponse immunitaire spécifique, cellulaire et humorale, afin de neutraliser l’intrus et de l’éliminer. L’un des mécanismes de cette réponse est la production d’anticorps spécifiques des antigènes du micro-organisme infectant. Le délai d’apparition de ces anticorps, leur titre et leur persistance dans le sérum de l’individu dépendent de plusieurs facteurs, tels que l’immunogénicité de l’organisme, sa voie d’entrée, l’amplitude de l’infection, ainsi que la susceptibilité génétique et l’état physiologique général de l’individu. Ils dépendent également de l’éventuelle exposition préalable au micro-organisme (infection antérieure ou vaccination).

Test de Widal et Félix pour le diagnostic de la fièvre typhoïde

Principe Les Salmonelles sont des bactéries Gram négatif de la famille des entérobactéries. Elles contiennent essentiellement les antigènes suivants:

- un antigène somatique O, de nature glucidique et correspondant à l’endotoxine. Cet antigène est stable à la chaleur (résiste à un réchauffement à 100 C pour 2.5 hrs) et résistant à l’alcool. Il n’est pas non plus détruit par le formaldéhyde, mais quand la bactérie est fixée par le formaldéhyde, les anticorps anti-O ne peuvent plus l’agglutiner.

- un antigène H, présent dans toutes les souches flagellées de Salmonelles, de nature protéique. L’antigène H est conservé lors d’un traitement par le formaldéhyde. Par contre, il est détruit par l’alcool à 96º. De plus, quand la bactérie est exposée à la chaleur, le flagelle se détache.

- un antigène d’enveloppe Vi, présent seulement chez certaines souches (bacille d’Eberth et paratyphi C), et de valeur diagnostique faible.

L’infection par des Salmonelles peut provoquer une fièvre typhoïde (infection par Salmonella typhi) ou paratyphoïde (infection par Salmonella paratyphi A, B ou C). Chez les sujets atteints de fièvre typhoïde ou paratyphoïde et chez les sujets vaccinés, ces antigènes entraînent la production d’anticorps spécifiques dont le taux sérique évolue en fonction du temps selon la courbe suivante:

N.B. Cette courbe est importante à connaître pour l’interprétation du séro-diagnostic.

Le séro-diagnostic de Widal et Félix se fait en mettant en présence, dans des conditions appropriées, le sérum à étudier, à différentes dilutions, avec des suspensions de Salmonelles :- suspensions alcoolisées, enrichies en antigène O, pour la recherche d’anticorps anti-O- suspensions formolées, enrichies en antigène H, pour la recherche d’anticorps anti-H.

Mode opératoire

Vous disposez des réactifs suivants :- 5 ml de suspension de Salmonella typhi alcoolisées, donc enrichies en antigène O

(TO)- 5 ml de suspension de Salmonella typhi formolisées, donc enrichies en antigène H

(TH)- NaCl 0.9%- 0.25 ml de sérum test (noter le numéro du sérum).

Détermination du titre su sérum

1- Préparer deux séries de 5 dilutions de sérum chacune, allant de 1/10 à 1/160, en procédant comme suit :- Préparer deux séries de tubes à essai, de 6 tubes chacune. Marquer l’une d’elles

O1 à O6 et l’autre H1 à H6. Pour chaque série :- Dans le 1er tube, introduire 0.9 ml de NaCl- Dans les autres tubes, introduire 0.5 ml de NaCl- Dans le 1er tube, introduire 0.1 ml de sérum, mélanger et transférer 0.5 ml dans le

2ème tube- Mélanger et répéter cette procédure jusqu’au 5ème tube ; mélanger et jeter 0.5 ml

de solution.N.B. Le dernier tube ne contient que du NaCl et sera le témoin d’absence d’agglutination spontanée des bactéries.

2- Introduire dans chaque tube de la 1ère série 0.5 ml de suspension de Salmonelles «TO»3- Introduire dans chaque tube de la 2ème série 0.5 ml de suspension de Salmonelles

«TH»4- Mélanger les réactifs dans chaque tube, puis incuber pour une heure au bain-marie à

45°C5- Centrifuger les tubes à 2000 tours/min pour 5 minutes 6- Remettre les culots en suspension en administrant un coup sec au fond de chaque tube

et noter immédiatement s’il y a ou non une agglutination en comparant l’aspect des bactéries resuspendues avec celui du tube no. 6. En déduire les titres d’Ac anti-O et anti-H.

N.B. Pour la détermination des titres, tenir compte des dilutions finales de sérum, qui vont de 1/20 à 1/320.

Résultats et interprétation

Un diagnostic précis de l’infection repose à la fois sur les données cliniques et sur les résultats des tests de laboratoire. Les agglutinines sont produites lentement au cours de la phase aiguë de l’infection et jusqu’à la convalescence. Leur titre augmente considérablement entre les deux phases.

- L’élévation du titre entre deux spécimens de sérum, testés à quelques jours d’intervalle, accompagnée des signes et symptômes typiques de la maladie chez le patient constituent ensemble la meilleure base pour un diagnostic positif.

- Si seuls des anticorps anti-H sont mis en évidence, le sujet a été probablement exposé à des salmonelles depuis un certain temps, soit naturellement, soit par vaccination. Il se peut également qu’il soit atteint de typhoïde, mais qu’il ait reçu un traitement à base de chloramphénicol qui empêche l’apparition d’anticorps anti-O.

Test ELISA pour la détection des anticorps anti-thyroglobuline

La thyroïdite de Hashimoto

La thyroïdite de Hashimoto est une maladie auto-immune atteignant généralement la femme d’âge mûr, due à la production d’auto-anticorps et/ou de cellules TDTH auto-réactives spécifiques d’antigènes thyroïdiens. La réponse DTH est caractérisée par une intense infiltration cellulaire de la glande thyroïde. La réaction inflammatoire qui s’ensuit entraîne un goitre, c’est-à-dire un élargissement visible de la glande thyroïde. Le sérum des malades atteints de thyroïdite de Hashimoto contient généralement des auto-anticorps spécifiques d’un nombre de protéines thyroïdiennes, dont la thyroglobuline, protéine cellulaire impliquée dans la fixation de l’iode. La liaison des anticorps à leur cible cellulaire inhibe la fixation de l’iode, conduisant à une production diminuée d’hormones thyroïdiennes (hypothyroïdie).

Recherche des anticorps anti-thyroglobuline par ELISA

1. Principe La technique d’ELISA est l’une des techniques les plus utilisées dans le dosage immunologique d’anticorps car un grand nombre de déterminations sensibles peuvent être effectuées dans un temps relativement court et de manière économe.

Dans le dosage des anticorps anti-thyroglobuline par ELISA, les puits de microtitration sont recouverts d’antigène purifié, la thyroglobuline, à concentration constante et optimale. Les sites réactifs résiduels du plastique sont bloqués par incubation avec du tampon PBS (phosphate buffered saline) contenant du lait écrémé. Le lait est utilisé comme source riche en protéines non spécifiques.

Après blocage, différents sérums humains à tester sont incubés purs en duplicata. Le contrôle positif consiste en une sérum standard dont la concentration en anticorps anti-thyroglobuline est exprimée en unités internationales par millilitres (UI/ml). Une courbe étalon est réalisée avec différentes dilutions de ce sérum standard. Le contrôle négatif consiste en un sérum dépourvu d’anticorps anti-thyroglobuline.

Après incubation des sérums humains et lavage, la liaison des anticorps est mise en évidence par l’addition d’anticorps de mouton anti-Ig humaines couplés à la péroxydase, suivie par celle d’un substrat chromogène de la péroxydase, le tétraméthylbenzidine (TMB). La transformation du substrat en un produit coloré, proportionnelle à la quantité d’enzyme dans le puits, et par conséquent à celle des anticorps anti-thyroglobuline, est déterminée par lecture de la densité optique à 450 nm, à l’aide d’un spectrophotomètre.

La concentration d’anticorps anti-thyroglobuline dans chaque sérum est déduite par extrapolation de la densité optique qui lui correspond sur la courbe étalon.

2. Matériel et méthodologie

Matériel- « Strips » d’une plaque de microtitration recouverts de thyroglobuline et bloqués avec du

PBS contenant 3% (m/v) de lait écrémé.

- Tampon de lavage : PBS contenant 0.05% de Tween 20 (PT). Le tween 20 est un détergeant qui sert à diminuer la liaison des protéines non spécifiques du sérum au plastique, par augmentation de la tension de surface. Le tampon PT est contenu dans une pissette et placé près de l’évier.

- Tampon de dilution et d’incubation : PBS contenant 0.05% de Tween 20 et 3% (m/v) de lait écrémé (PTL). Ce tampon se trouve dans un tube à hémolyse sur le portoir.

- Sérums (dans des tubes eppendorf, sur le portoir): Sérum test (noter son numéro) Sérum standard (contrôle positif) contenant 1000UI/ml d’anti-thyroglobuline Sérum de contrôle négatif.

- Anticorps de mouton anti-Ig humaines, couplés à la péroxydase (MAH-POX). Ces anticorps sont dilués dans du PTL et prêts à l’emploi. Ils se trouvent dans un tube à hémolyse sur le portoir.

- Substrat de la péroxydase, tétraméthylbenzidine (TMB). Ce substrat doit être préparé extemporanément.

- Solution stop: HCL 3N. L’addition de l’acide arrête la réaction enzymatique et transforme le produit bleu en un produit jaune dont la densité optique est lisible à 450 nm.

Méthodologie

1- Lavage des strips   : Vider la plaque au-dessus de l’évier en la retournant vivement. A l’aide de la pissette de PT (tampon de lavage), laver les puits en les remplissant à ras-bord et en les retournant vivement. Faire trois lavages. Tapoter énergiquement la plaque retournée contre un kleenex pour la vider totalement.

2- Incubation des sérums humains   :

Plan de la plaque :

Sérum étalon 1000 UI/ml A1 A2 Sérum test

Sérum étalon 500 UI/ml B1  B2 (duplicata)

Sérum étalon 250 UI/ml C1  C2 Sérum de contrôle négatif

Sérum étalon 125 UI/ml D1  D2 (duplicata)

Sérum étalon 62.5 UI/ml E1  E2 Anticorps secondaire seulement

Sérum étalon 31.25 UI/ml F1  F2 (duplicata)

Sérum étalon 15.6 UI/ml G1  G2 Blanc

Sérum étalon 7.8 UI/ml H1  H2 (duplicata)

Pour réaliser les différentes dilutions du sérum étalon :- Dans le puits A1, introduire 100 l de sérum étalon- Dans les puits B1 à H1 introduire 50l de PTL- Transférer 50 l de A1 en B1, mélanger- Répéter jusqu’en H1- Jeter les 50 l excédentaires de H1

Dans les autres puits :- A2 et B2 : introduire 50 l de sérum test- C2 et D2 : introduire 50 l de sérum de contrôle négatif- E2, F2, G2 et H2 : introduire 50 l de PTL

Incuber la plaque, recouverte de Kleenex, 30 minutes à température ambiante, sur la paillasse

3- Incubation des anticorps anti-Ig humaines

- Laver les strips trois fois comme précédemment.

- Distribuer 50 l de MAH-POX dans tous les puits sauf dans G2 et H2.

- Distribuer 50 l de tampon PTL dans les puits G2 et H2.

-Incuber la plaque, recouverte de Kleenex, 20 minutes à température ambiante, sur la paillasse.

4- Révélation de la réaction   :

- Laver les strips trois fois comme précédemment.

- Obtenir le substrat TMB.

- Distribuer 50 l de TMB dans tous les puits.

- Observer le développement de la couleur bleue pour 10 minutes.

- Arrêter la réaction en rajoutant 50 l de HCL 3N dans tous les puits. La couleur tourne au jaune.

- Lire la densité optique à 450 nm.

5- Vérification des contrôles   :

- Les puits A1 à H1 ont reçu différentes dilutions de ½ en ½ du sérum étalon. Leur densité optique devrait être décroissante.

- Les puits C2 et D2 ont reçu le contrôle négatif qui ne contient pas d’anticorps anti-thyroglobuline. Leur densité optique devrait être très faible.

- Les puits E2 et F2 ont reçu l’anticorps secondaire seul qui ne devrait pas se lier en l’absence d’anticorps humains. Ils correspondent au bruit de fond qui devrait être négligeable.

- Les puits G2 et H2 ont reçu seulement du substrat, jamais mis en contact avec l’enzyme  : ils correspondent au blanc

6. Calculs et Interprétation   :

- Calculer la moyenne de densité des puits A2 et B2 (sérum test) et de celle des puits C2 et D2 (contrôle négatif).

- Retrancher la densité moyenne du contrôle négatif de celle des puits A1 à H1 (contrôle positif) et de la densité moyenne du sérum test.

- Sur du papier millimétré, tracer la courbe étalon de D.O. en fonction des unités internationales du sérum de contrôle positif.

- En extrapolant la densité optique du sérum test sur la courbe étalon, déterminer la concentration de ce dernier en anticorps anti-thyroglobulines

N.B. La présence des anticorps anti-thyroglobuline est fortement suggestive d’un désordre auto-immun, presque toujours associé à une thyroïdite de Hashimoto. Par contre leur absence ne permet pas d’infirmer le diagnostic.

Préparation des cellules mononucléées du sang

Introduction

De nombreuses expériences réalisées par des immunologistes nécessitent l’obtention de leucocytes, principalement des lymphocytes, pour des études ultérieures in vitro ou in vivo. La source de lymphocytes humains la plus communément utilisée est le sang périphérique et l’une des méthodes les plus simples pour leur purification est l’utilisation d’un milieu de séparation appelé Ficoll Isopaque.

Principe de séparation des cellules mononucléées sur Ficoll Isopaque:

Le Ficoll Isopaque est un liquide de densité (d = 1,077) inférieure à celle des globules rouges et des neutrophiles mais supérieure à celle des cellules mononucléées (lymphocytes et monocytes). Lorsque du sang entier collecté sur anti-coagulant est déposé au-dessus d’une couche de Ficoll dans un tube et que l’ensemble est soumis à l’action de la gravité, les cellules sanguines se séparent: les globules rouges et les neutrophiles se déposent dans le fond du tube au-dessous du Ficoll, alors que les lymphocytes et les monocytes surnagent.

Mode opératoire Vous disposez des réactifs suivants:- 1,5 ml de sang humain frais collecté sur anti-coagulant (héparine)- 4 ml du Ficoll Isopaque- Tampon PBS

- Marquer votre nom sur le tube de Ficoll (près du bord supérieur)- Diluer le sang humain au tiers dans du tampon PBS- Maintenir le tube de Ficoll incliné à 45° et déposer doucement le sang dilué le long de la

paroi du tube afin de maintenir les deux phases séparées.- Redresser doucement le tube, le boucher à l’aide de parafilm et centrifuger 15 minutes à

1700 rpm- Retirer le tube avec précaution de la centrifugeuse. En le maintenant au niveau de vos

yeux, identifier les différentes phases et localiser la couche de cellules mononucléées à l’interphase

- Introduire la pipette Pasteur dans le tube jusqu’à l’interphase. En décrivant des mouvements de va et vient, retirer les cellules mononucléées et les déposer dans un autre tube

- Rajouter 6 ml de tampon PBS aux cellules mononucléées et centrifuger 7 minutes à 1200 rpm.

- Se débarasser du surnageant. Casser le culot cellulaire et laver les cellules encore une fois avec 6 ml de PBS.

- Reprendre le culot dans 0,5 ml de PBS et compter les cellules comme décrit ci-dessous.

Comptage des cellules à l’aide d’un hémocytomètre

Les cellules sont comptées à l’aide d’un hémocytomètre. Celui-ci est formé d’une lame épaisse de verre, munie d’un plateau central coupé en deux par un sillon transversal. Chaque demi-plateau central est quadrillé finement par gravage et constitue une chambre de comptage. La lame est recouverte d’une lamelle qui repose sur deux plateaux latéraux de la lame, surélevés de 0.1 mm par rapport au plateau central et qui délimite donc la hauteur de la chambre de comptage à 0.1 mm. Nous utilisons un hémocytomètre de type Naubaeur, quadrillé comme suit :

Le volume du centre de la croix de quadrillage = 1 x 1 x 0.1 = 0.1 mm3 = 10-4 ml

La viabilité cellulaire est déterminée par exclusion de colorant, en utilisant le bleu Trypan. Ce colorant est exclus par la membrane plasmique des cellules vivantes, dont le cytoplasme reste alors non coloré. Cependant, lorsque la cellule est morte, la membrane endommagée laisse passer le colorant librement vers l’intérieur et son cytoplame devient bleu.

Mode opératoire:

Vous disposez des réactifs et matériels suivants :- Suspension de cellules sanguines mononucléées lavées- 50 l de bleu trypan dans un tube eppendorf- hémocytomètre de type Naubaeur et lamelle de verre

Largeur de 5 carrés = 1 mm

Longueur de 5 carrés = 1 mm

- Préparer l’hémocytomètre: humecter votre doigt d’alcool et le passer sur les deux plateaux latéraux délimitant les chambres de comptage de l’hémocytomètre. Déposer la lamelle sur l’hémocytomètre et appuyer légèrement pour la coller.

- Prélever 50 l de cellules à compter à l’aide d’une pipette automatique et mélanger au bleu Trypan

- Prélever un échantillon du mélange et l’introduire lentement dans l’une des chambres de comptage de l’hémocytomètre jusqu’à la remplir, sans qu’elle ne déborde

- Attendre 10 secondes, positionner l’hémocytomètre sur le microscope optique, fermer le diaphragme du microscope et faire la mise au point

- Compter les cellules vivantes (claires) et les cellules mortes (bleues) dans les carrés des 4 coins et le carré central.

- Estimer la concentration de cellules vivantes et celle des cellules mortes par ml de sang, selon la formule suivante:

- Concentration /ml = nbr moyen de cellules/carré x 25 x 104 x 2

- Estimer la viabilité cellulaire: - Pourcentage de viabilité = (cellules vivantes/cellules totales) x 100