IMMUNOTHERAPIE ET THERAPIE CELLULAIRE

IMMUNOTHERAPIE ET THERAPIE CELLULAIRE

Pr J-Olivier Bay, Service d’hématologie, CHU Clermont-FerrandDépartement d’oncologie médicale, Centre Jean Perrin

STRATEGIES THERAPEUTIQUES DES CANCERS

Chirurgie

Chimiothérapie

Radiothérapie

Hormonothérapie

Immunothérapie - Thérapie cellulaire

Thérapie génique

EVOLUTION RECENTE (1)CONNAISSANCE DES MECANISMES IMMUNOLOGIQUES

Mise en évidence des mécanismes de reconnaissance par le système majeur d’histo-compatibilité (MHC) (Zinkernagel 1979)

Mise en évidence des structures moléculaires MHC type 1 et 2 (Bjorknan 1987; Brown 1993)

Mise en évidence des mécanismes de présentation antigénique (Townsend 1986; Lechler 1996)

Identification des récepteurs spécifiques d’antigène sur les lymphocytes T

Identification des mécanismes de reconnaissance et d’activation des lymphocytes T

Découverte des cytokines et des facteurs de croissance et détermination de leurs rôles respectifs

Développement des anticorps monoclonaux

EVOLUTION RECENTE (2)AMELIORATION DES TECHNIQUES

Progrès majeur dans les techniques de laboratoire- reconnaissance des cellules (anticorps monoclonaux)- technique de cytaphérèse- technique de congélation- culture ex-vivo des cellules- manipulation des greffons- expansion ex-vivo

Progrès à mettre en parallèle avec l’amélioration des techniques de biologie moléculaire et les connaissances sur la carcinogenèse

Interconnexion entre la biologie moléculaire et la thérapie cellulaire

CLASSIFICATION DES METHODES D’IMMUNOTHERAPIE (1)

Stimulation antigénique

Activation des lymphocytes T auxiliaires

Production de cytokines

Effecteurs cytotoxiques non spécifiques

• Natural Killers (NK)• Lymphocytes tueurs activés •par les cytokines (LAK)• Macrophages activés

Lymphocytes B

• Production d’anticorps spécifiques

Lymphocytes T cytotoxiques

Cellules dendritiques

• Structure de reconnaissance = récepteur spécifique d’antigène• Reconnaissance sur les cellules cibles de peptides associés au SMHC

I

VIII

VII

IV

V

III

CLASSIFICATION DES METHODES D’IMMUNOTHERAPIE (2)

Immuno-adjuvants (immuno-stimulants) Immunothérapie active non spécifique ou spécifique Anticorps monoclonaux Immunothérapie par les lymphocytes T cytotoxiques Immunothérapie adoptive (thérapie cellulaire non

spécifique ou spécifique) Immunothérapie utilisant des techniques de

thérapie génique

I

IV

VIIVI

IIIII

VIII

V






Lymphocytes B





I

IMMUNO-ADJUVANTS I

IMMUNOADJUVANTS

Il s’agit d’agents bactériens ou synthétiques qui facilitent la réponse immunitaire de l’hôte vis-à-vis d’antigènes tumoraux spécifiques ou qui augmentent l’immunité non spécifique.

premiers essais : toxines de streptococcus pyogènes ou de serratia marcescens (toxine de Coley)

actuellement : bacille de Calmette et Guerin (B.C.G. thérapie) et corynebacterium parvum (C. parvum)

I

MECANISME D’ACTION ANTITUMORALE

fixation du B.C.G. sur les cellules tumorales et les cellules épithéliales (récepteur à la fibronectine), mobilisation des cellules CD4+ de phénotype T avec une activité cytotoxique spécifique, des cellules CD8+, activation des cytokines INF-, IL-10, IL-12, TNF grâce lymphocytes T helper. La mémoire cellulaire des CD4 explique la durée de la réponse.

Les suspensions de C. parvum tuées augmentent la cytotoxicité des macrophages, induisent l’activité NK et stimulent l’activité anti-tumorale spécifique.

Levamisole : dérivé synthétique sulfuré possédant une activité anti-helminthe

L’OK-432 (picibanil) est une préparation obtenue à partir de toxines de streptococcus pyogène. Il induit une activation macrophagique et une sécrétion de TNF.

APPLICATIONS CLINIQUES

Cancers de l’ovaire Cancers de la vessie






Lymphocytes B





II

IMMUNOTHERAPIE ACTIVE NON SPECIFIQUE II

IMMUNOTHERAPIE ACTIVE NON SPECIFIQUE

Majoritairement représentée par l’utilisation clinique des cytokines

Cytokines (cyto : cellule ; kine : facteur) : médiateurs physiologiques des communications intercellulaires, utilisables en culture ex vivo

Actions autocrine, paracrine ou/et endocrine Utilisation clinique : IL-2, INFs, facteurs de

croissance, TNF

II

INTERLEUKINE-2

Identifiée en 1976 produite par les lymphocytes T auxiliaires actif sur les lymphocytes T et B si reconnaissance

d’un antigène spécifique (acquisition du récepteur à l’IL-2)

relative spécificité de la réponse immunitaire activation immédiate des cellules NK : LAK

UTILISATION ACTUELLE ET FUTURE DE L’INTERLEUKINE 2

Cancer du rein Mélanomes malins (Kirkwood J. Clin. Oncol. 2000; 18 : 2444-

58)

Cancer de l’ovaire Post réinjection de lymphocytes T

allogéniques Voie IV ou SC

INTERFERONS

Facteurs de résistance aux virus IFN de type 1

produit par les cellules hématopoïétiques produit par les fibroblastes• activité biologique identique (même récepteurs)• augmente l’expression MHC type I• stimule les cellules NK (LAK)

IFN de type 2 (INF)• produit par les lymphocytes T auxiliaire, cytotoxique et cellules NK• activateur puissant des macrophages et des cellules NK• stimule la production d’immunoglobulines• inhibe la production d’IL4

UTILISATION ACTUELLE ET FUTURE DES INTERFERONS

leucémie à tricholeucocytes leucémie myéloïde chronique myélome multiple lymphome non Hodgkinien de bas grade cancer du rein mélanome malin Cancer superficiel de la vessie (Belldegrun J. Urol.1998; 159 : 1793-

1801) Tumeurs gliales malignes ? (Borden Cancer Biology 2000; 10 : 125-

144) Cancer ovarien ? (Windbichler Br. J. Cancer 2000; 82 : 1138-44)

TNF - INTERLEUKINE 1

IL1 et TNF et TNF : précurseur membranaire : activité pro-

inflammatoire puissante TNF soluble : puissant activateur des cellules NK application en clinique : perfusion isolé de membre,

traitement intra-péritonéal application biologique : culture ex vivo

LES FACTEURS DE CROISSANCE

Cytaphérèses Cultures ex vivo Réduction des toxicités médullaires post

chimiothérapie Dysmyélopoïèse Effet anti-tumoral du GM-CSF (Spitler J. Clin. Oncol. 2000;

18 : 1614-21)






Lymphocytes B





III

IMMUNOTHERAPIE ACTIVE SPECIFIQUE III

Utilisation de peptides antigéniques tumoraux Vaccination autologue ou allogénique Peptides synthétisés à partir des épitopes reconnus par les

lymphocytes T cytotoxiques Reconnaissance restreinte par MHC type I ou II MAGE3 / HLA-A1 dans les mélanomes Analogue du peptide gp100 / HLA-A2 dans les mélanomes Gangliosides (GM2) (Levingston Semin. Oncol. 1998; 25 : 636-45)

IMMUNOTHERAPIE ACTIVE SPECIFIQUE III






Lymphocytes B





IV

ANTICORPS MONOCLONAUX IV

ANTICORPS MONOCLONAUX

activité anti-tumorale possible si un anticorps couplé à un agent-tueur (élément radio-actif, toxine ou drogue cytotoxique) est dirigé spécifiquement contre un antigène tumoral particulier

problème de l’utilisation d’anticorps monclonaux d’origine murin

Les techniques de biologie moléculaire permettent la constitution d’anticorps monoclonaux murins suffisamment humanisés (région constante humaine et région variable murine spécifique de l’antigène). Les risques d’immunisation sont ainsi beaucoup plus faibles.

IV

ANTICORPS MONOCLONAUX ACTUELS

Cibles : plutôt des onco-protéines fœtales ou des antigènes spécifiques de tumeurs

anticorps monoclonal anti-EGF = C225 edrecolomab = anticorps monoclonal anti 17-1A

(molécule d’adhésion) Herceptine

• induction de l’apoptose• réduit la prolifération cellulaire• effet synergique avec certaine drogues de chimiothérapie

Rituximab : anti-CD20• induction de l’apoptose• réduit la prolifération cellulaire

ANTICORPS BI-SPECIFIQUES

Il s’agit d’utiliser des anticorps bi-spécifiques liant les cellules tumorales et les cellules effectrices.

Cancer de la prostate : anti-CD64 couplé à anti-HER-2 (James 1999 Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1197)

Cancer du sein : anti-Fc couplé à l ’anti-HER-2/neu (Ojik Cancer Immunol. Immunother. 1997; 45 : 207-9)

Cancer de l’ovaire : anticorps OC-TR qui fixe le récepteur CD3 du lymphocyte T et de l’autre côté, fixe les récepteurs aux folates des cellules de carcinome ovarien. (Canevari J. Natl. Cancer Instit. 1993; 87 : 1463-1469)

LYMPHOCYTES T CYTOTOXIQUES






Lymphocytes B





V

V

Lymphocytes T infiltrants les tumeurs (TIL) Réaction du greffon contre la tumeur

• dans les tumeurs solides• évolution dans les hémopathies malignes

Réinjection de lymphocytes T allogéniques

LYMPHOCYTES T CYTOTOXIQUES V

TIL

Autrefois développés à la suite des essais cliniques sur les LAK

Résultats cliniques décevants Préparation des cellules difficile et complexe

REACTION DU GREFFON CONTRE LA TUMEUR

APPLICATION DANS LES TUMEURS SOLIDES

I

PRINCIPE DE L’ALLOGREFFE

effet cytotoxique majeur par un conditionnement myélo-ablatif (chimiothérapie seule ou association radio/chimiothérapie)

effet antitumoral immunologique par les lymphocytes T allogéniques (GVL ou GVT)

PRINCIPE DU CONDITIONNMENT NON-MYELOABLATIF (1)

effet immunosuppresseur majeur avec myélotoxicité réduite

absence de toxicité majeure à la chimiothérapie permet la réalisation de ce traitement chez des

sujets plus âgés car:• immunosuppression limitant les risques de

GVH aiguë chez les sujets plus âgés• toxicité réduite

PRINCIPE DU CONDITIONNEMENT NON-MYELOABLATIF (2)

myélo-ablatif • endoxan : 50 mg/m2 par jour pendant 4 jours

consécutifs• busulfan : 4 mg/kg par jour pendant 4 jours consécutifs

immunosuppresseur• fludarabine : 30 mg/m2 par jour pendant 5 à 6 jours

consécutifs• sérum anti-lymphocytaire : 2,5 mg/kg par jour pendant

1 à 4 jours consécutifs• busulfan : 4 mg/kg par jour pendant 2 jours consécutifs

RATIONEL DES ALLOGREFFES DANS LES TUMEURS SOLIDES

Théoriquement, l'effet GvL devrait être le même qu'un hypothétique effet GvT

Certitude d’utiliser un greffon indemne de cellules tumorales

Développement de conditionnements immunosuppresseurs

Observations de GvH autologues Sensibilité de certains cancers à l’immunomodulation

ALLOGREFFE ET TUMEURS SOLIDESRESULTATS DE LA LITTERATURE

Ben Yosef et al. Eild et al. Ueno et al. Bay et al. Childs et al.Nombre de patients 1 1 10 1 19Age (moyenne) 36 32 29-55 (42) 33 37-65 (48)Sexe F F F F 15 H / 4 FDiagnostic Leucémie aiguë et

cancer du seinCancer du sein Cancers du sein Cancer de l’ovaire Cancers du rein

Statut de la maladie RC de la leucémieRécidive locale

du cancer du sein

MétastatiqueMaladie réfractaire

MétastatiquesMaladies réfractaires

Evolution loco-régionale

Maladie réfractaire

MétastatiquesMaladies réfractaires

Donneur Frère Sœur 7 frères / 3 soeurs Frère 10 frères / 9 soeursConditionnement Myélo-ablalif Myélo-ablatif Myélo-ablatif Myélo-ablatif Non myélo-ablatifGreffon CSP Moelle CSP Moelle CSPRécupérationhématologique

Non précisée GB>1.000 à J+13 GB>1.000 6 à 16 J (11)P>20.000 8 à 24 J (15)

GB>500 7 à 13 J (10,5)P>50.000 0 à 10 (8)

Chimérisme Non précisé Complet à J+27 Complet pour 8 patientsévaluables

Complet à J+30 16 complets / 3 partiels àJ+30

GvH aiguë Incertaine Cutanée grade +++à J+27

4 GvH grade I à III Cutanée etdigestive grade III

à J+28

10 GvH grade II à IV (7/II ;1/III ; 2/IV) de J+21 à J+113

(55)GvH chronique Non Non précisée 4 GvH (4 cutanées – 1

hépatique)Hépatique à J+180 Non précisées

Réponsethérapeutique

RC cutanée RC M (hépatiques) 1 RC – 4 RP RC clinique etbiologique

3 RC – 7 RP

Toxicité létale liée àla greffe

- - 2 décès (complicationsinfectieuses)

- 2 décès (1 = GvH aiguë, 1 =complications infectieuses)

OBSERVATIONS

Faisabilité démontrée Bonne prise des greffons Taux de GvH observé conforme au taux de GvH

attendu Taux de réponse thérapeutique intéressant, surtout

dans les cancers du rein Absence de données sur le suivi à long terme

REACTION DU GREFFON CONTRE LA TUMEUR (2)

DEVELOPPEMENT DANS LES HEMOPATHIES MALIGNES

II

INTERET DES CONDITIONNEMENTS NON-MYELOABLATIFS DANS LES HEMOPATHIES

Réduction de la toxicité Application dans des hémopathies où la

toxicité de la procédure rendait la greffe inutile (myélome multiple)

Recul de l’âge limite Traitement possible même si le Karnovsky est

inférieur à 80 % Application à d’autres maladies ?

LYMPHOCYTES T ALLOGENIQUES

• Risque de rechute leucémique corrélé au degré de réactivité immunologique représenté par l'intensité de la GvH aiguë (Blaise 1995)

• Risque de rechute plus faible en cas de GvH chronique (Weiden 1981, Sullivan 1989)

• Risque de rechute augmenté si greffon déplété en cellules T (Maraninchi 1987, Goldman 1988)

• Risque de rechute augmenté en cas de greffes syngéniques (Gale 1994)• Risque de rechute plus important après autogreffe (Vey 1994)• Quelques publications rapportent que cette relation n'est pas toujours aussi

claire (Kolb 1995, Champlin 1995).

GvH et GvT sont-elles liées ?

ROLE DES LYMPHOCYTES T ALLOGENIQUES

la déplétion en cellules T (CD4 ou CD8) du donneur réduit ou évite la GvH

présence de lymphocytes T allogéniques activés au niveau des lésions de la GvH

activation de lymphocytes T cytotoxiques avec destruction des cellules du receveur et production de cytokines (IFN, IL2 etc...)

outre la production des cytokines, l'effet GvL serait lié à la réactivité des lymphocytes T allogéniques contre des antigènes mineurs du MHC sur les cellules tumorales

MODALITES THERAPEUTIQUES

Indications• Myélome multiple (Lokhorst J. Clin. Oncol. 2000; 18 : 3031-

37)

• Leucémie myéloïde chronique (Collins J Clin Oncol 1997 ; 15 : 433-44)

Nombre de cellules à réinjecter Nombre total de réinjection Rythme des réinjections Manipulation ex vivo des lymphocytes T ?






Lymphocytes B





VI

THERAPIE CELLULAIRE NON SPECIFIQUE VI

THERAPIE CELLULAIRE NON SPECIFIQUE

LAK Macrophages activés

VI

UTILISATION DE MACROPHAGES ACTIVES

INTERET

Interféron

Activation ex vivo de macrophages

Inhibition de l’activité tumoricide des macrophages par des facteurs extrinsèques (IL-10)

Activation des macrophages : acquisition d’un pouvoir tumoricide ( TNF, radicaux libres)

MODE DE PRODUCTION DES MACROPHAGES ACTIVES (1)

Obtention de cellules mononucléées par cytaphérèse

Culture des cellules mononucléées

Activation des macrophages

Recueil des macrophages

Administration des macrophages

MODE DE PRODUCTION DES MACROPHAGES ACTIVES (2)

Cytaphérèse(3-6 109 cellules)

Culture de 6 jours (37°c, GM-CSF 250 UI/ml)

Interféron (250 UI/ml)

Elutriation

18 hMacrophages

Injection(1-2 109 cellules)

APPLICATION CLINIQUE

Cancer de l’ovaire (traitement en intra-péritonéal)

Cancer du rein (Lesimple J. Immunol. 2001)

Mélanome malin






Lymphocytes B





VII

THERAPIE CELLULAIRE SPECIFIQUE VII

UTILISATION DE CELLULES DENDRITIQUES « PULSEES »

RATIONEL (1)

“antigènes tumoraux”

Cellules NKLAKTIL

MAK CTL

Cellules dendritiques (CD)

Cellules effectrices

Non restreint par le CMH Restreint par le CMH avec CDpour présentation des antigènes

tumoraux

RATIONEL (2)

Le développement d’une réponse immunitaire antitumorale efficace nécessite :

• l’expression d’antigènes spécifiques par les cellules tumorales (TAA),

• la présentation de ces antigènes par des cellules spécialisées (cellules dendritiques) aux lymphocytes T qui sont les effecteurs de la réponse immunitaire,

• la stimulation efficace de ces lymphocytes T et

• l’afflux des cellules effectrices sur le site tumoral.

INFLUENCE DE LA TUMEUR

Déficit dans la présentation des antigènes tumoraux

Activation altérée des lymphocytes T

Réponse antitumorale faible

Facteurs immunosuppresseurs produits par la tumeur, IL6, IL10

MATURATION DES CELLULES DENDRITIQUES

TNF, IL1, LPS

5 - 20 h 24 - 48 h Maturation

CD immature• activité endocytique forte• synthèse de CMH I/II faible• CMH I/II cytoplasmiques• demi-vie des CMH II <10h• co-stimulation T faible

Etat de maturation intermédiaire• activité endocytique forte• synthèse de CMH I/II forte• CMH I/II cytoplasmiques et membranaires

CD mature• activité endocytique faible• synthèse de CMH I/II faible• CMH I/II exclusivement à la surface cellulaire• demi-vie des CMH II >50h• co-stimulation T forte

Ingestion et apprêtement des antigènesStimulation des lymphocytes T

INTERET

Activation ex vivo Présentation ex vivo aux cellules dendritiques

des antigènes tumoraux spécifiques

MODE DE PRODUCTION DES CELLULES DENDRITIQUES

CD14+

LC

GM-CSF+IL4TGF

macrophagesM-CSF

GM-CSF+IL4

DC immatureCD1a+CD14-

LPS CD40L

TNFDC mature

CD83+CD86+

PROTOCOLE

Prélèvement et congélation des

cellules tumorales

J-7Prélèvement des cellules

mononuclééesIsolement des monocytes

J+1congélation des

cellules dendritiques

Consentement éclairé

J-11 à J-8administration de

G-CSF

J-7 à J+1culture ex vivo des

monocytes

J+1, J+8, J+15, J+22, J+52, J+82, J+112

Administration des cellules dendritiques

J-7 à J0 : Culture des monocytes (GM-CSF+IL4)J0 : Contact avec les lysats tumoraux autologues + TNFJ+1 : 1ere administration de cellules dendritiques

congélation des cellules dendritiques

APPLICATIONS CLINIQUES

Utilisation de lysats tumoraux autologues Utilisations d’antigènes spécifiques, de

peptides, de corps apoptotiques, d’exosomes Mélanomes malins (Panelli J. Immunol. 1999; 23 : 487-98)

Cancer de la prostate (Small J. Clin. Oncol. 2000; 23 : 3894-903)

IMMUNOTHERAPIE UTILISANT DES TECHNIQUES DE THERAPIE GENIQUE

Modèle des gènes suicides• Codent pour des enzymes pouvant convertir la forme inactive

d’une drogue en un produit toxique inhibant la synthèse des acides nucléiques

• Le produit du gène HSV-Tk convertit le gancyclovir en une forme phosphorylée toxique.

• Introduction ex vivo dans les lymphocytes T allogéniques d’adénovirus porteur du gène HSV-Tk pour traiter les GvH

• où transduction d ’adénovirus recombinant dans des lignées tumorales spécifiques (essai en court par Freeman et coll. dans les cancers de l’ovaire)

VIII

IMMUNOTHERAPIE UTILISANT DES TECHNIQUES DE THERAPIE GENIQUE

Virus recombinants permettant l’expression de cytokines (INF, IL-2...)

Virus recombinants permettant l’expression d’anticorps monoclonaux spécifiques

Virus recombinant permettant l’expression de peptides

MANIPULATION DES GREFFONS

Sélections cellulaires (CD34, déplétion T, sous population T effectrices, cellules mésothéliales…)

Expansion ex vivo Purge médullaire (anticorps monoclonaux,

drogues…)

PERSPECTIVES

Etroite collaboration entre le laboratoire de thérapie cellulaire et l’unité clinique

Association de plusieurs modalités d’immunothérapie

Association de plusieurs stratégies thérapeutiques

Essais multicentriques

MODELE DES ALLOGREFFES DE CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES

Indications et stades évolutifs Choix du conditionnement Choix du greffon Manipulation du greffon Immunosuppression à adopter Réinjection de cellules allogéniques

INDICATIONS

Tumeurs ayant fait la preuve de leur sensibilité à des traitements immunologiques (cancer du rein, mélanomes)

Tumeurs dont la localisation se situe au niveau des sites cliniques classiquement affectés par les GvH aiguës et/ou chroniques

Tumeurs relevant d’intensification thérapeutique mais dont les greffons autologues sont généralement contaminés

STADES EVOLUTIFS

Tumeurs peu évolutives Espérance de vie supérieure à 6 mois Absence de signes inflammatoires Cibles tumorales les plus minimes possibles Age limite ??

CHOIX DU CONDITIONNEMENT

Micro-allogreffe

Mini-allogreffe

Faiblemyélo-ablation

Myélo-ablationmodérée

Fortemyélo-ablation

TBI 2 Gy Bu8ATGFludara

Cy200 +ATGMel140BEAMICE

Cy120 +TBI 12 Gy

Cy 120 +TBI 12 Gy+ autre

- +Intensité du conditionnement

(Dansey Current Opi. Oncol. 2001; 13 : 27-32)

CHOIX ET MANIPULATION DU GREFFON

Cellules souches hématopoïétiques d’origine médullaire versus cellules souches hématopoïétiques d’origine périphérique (Bensinger N. Engl. J. Med. 2001; 344:175-81)

Déplétion T Sélection ex vivo de certaines cellules allogéniques

(cellules dendritiques, macrophages …)

IMMUNOSUPPRESSION

Rôle de la cyclosporine à déterminer Durée et dose de prescription Arrêt précoce ? Développement d’anticorps monoclonaux

(anti récepteur à l ’IL-2 par exemple) Intérêt du méthotréxate ? Utilisation de gènes suicides ?

REINJECTION DE CELLULES T ALLOGENIQUES

Type de cellules à réinjecter (lymphocytes T, macrophages, cellules dendritiques plus ou moins activés ex vivo …)

Dose ? Rythme ? Moment ?

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IMMUNOTHERAPIE ET THERAPIE CELLULAIRE