160 B. MARIN ET J. VIEIRA DA SILVA Physio!. Plant. ,27: 150-155. 1972

Influence de la carence hydrique sur la repartitioncellulaire de I'aeide ribonucleique foliaire

chez le cotonnier

Par

BERNARD MARIN et JORGE VIEIRA DA SILVA

Orstom, Laboratoire de Physiologic Vegetale, Boite Postale 20, Abidjan, Cote-dTvoireet

Universite de Paris VII, UER de Biologie, 2 Place Jussieu, Paris 5«, France(Kegu le 27 Decembre, 1971)

AbstrsietWater stress, induced by addition of polyethyleneglycol 600

to the ntitrlent solution, reduces the ribonucleic acid contentof cotton leaves. The chioroplastic compartment, especiallyits ribosomal fraction, was most affected, even losing ribo-nucleic acid to the cytoplasmic compartment. Decrease ofribonucleic acid content on dehydration of leaf tissue is linkedwith an increase of ribonuclease.

IntroductionChez les especes de Gossypium sensibles a la seche-

resse, I'activite de certaines hydrolases comme la phos-phatase ou la ribonuclease augmente avec la secheresse(Vieira da Silva 1968 a,, b et c). Or, sous Teffe: d'unecarence hydrique moderee, chez de jeunes plants deTomate, la teneur en ARN diminue bien que sa syn-these mesuree par l'incorporation du '-P ne soit pasparticulierement modifiee (Gates et Bonner 1959). Lacarence hydrique induirait done une degradation accruede TARN cellulaire. Un phenomene semblable est ob-serve par Kessler (1961).

Nous nous proposons de preciser les effets de lacarence hydrique a la fois sur la teneur en ARN du tissufoliaire de Gossypium, sur la repartition de ces macro-molecules dans la cellule et sur leur evolution vis-a-visdes hydrolases.

Materiel et methodes

Materiel vegetal et techniques de culture

La variete HAR 444.2 de i'espece Gossypium hirsu-tum L. a ete cultivee en serre en milieu liquide seion les

methodes deja decrites {Vieira da Silva 1970). Des plantsages de 2 mois a 2 mois et demi ont ete utilises dans nosexperiences. La carence hydrique est provoquee parl'addition de polyethyleneglycoi (PEG) 600 a la solutionnutritive de fafon a obtenir un potentiel hydrique de— 20 joules par mole (soit — 11,1 bars). Le traitementdure habituellement 24 heures. Cependant, dans d'autresexperiences, I'effet du traitement a ete suivi pendantquatre jours. La perte d'eau est determinee par rapporta la surface foliaire et exprimee en pourcentage de l'eaudes tissus foliaires des temoins.

Preparation des echantillons

Seules sont recoltees les feuilles en position 2, 3 et 4sur l'axe principal a partir du sommet., Chaque feuilleprelevee est coupee selon sa nervure principale en deuxmoities equivalentes, l'une servant a doser I'activite ribo-nucleasique globale et I'autre a isoler les fractions cellu-laires.

Le fractionnement cellulaire est effectue selon Stutzet Noll (1967). Une fraction riche en chloropiastes: lafraction dite chioroplastique, et une fraction cytoplas-mique, debarassee des mitochondries, sont ainsi obtenues(Tableau 1). L'activite ribonucleasique est egalementdeterminee sur ces deux fractions.

Analyses faites

— Acide ribonucleique et proteines. L'acide ribo-nucleique (ARN) est extrait du matfriel vegetal par iamethode de Nieman et Poulsen (1963). Le materielvegetal est fixe dans l'alcool absolu, soit a -18°C pen-dant tOBte une nuit, soit botiillant pendant 2 minutes.

Physiol. Plant. 27. 1972 INFLUENCE DB LA CARENCE HYDRIQUE SUR L'ACIDE RIBONUCLEIQUE

Tableau 1. Preparation des fractions cellulaires a partir de materiel foliaire de Cossypium.

151

Tissu foliaire

Homogeneisation a 4°C dans du tampon de Stutz et Noll modifie,a raison de 5-10 mi par g de poids frais

filtration sur 4 couches de gazecentrifugation 600 g - 2 min - 4°C

Sicentrifugation 2 ,590 g - 12 min - 4°C

Clricbe en debris cellulaires et en noyaux

2fraction riche en cHoroplastes

= fraction chloropiastiquereprise dans du tampon sans saccharose

fraction contenant tous les autresorganites cellulaires,

centrifugation 25 000 g - 30 min - 4°C

addition de Triton X-100 (5 «/o final)agitation douce (au moins 2 min ^ 4^C)centrifugation 25 000 g - 30 min - 4°C culot riche

en mitochondriesfraction cytoplasmique

centrifugation160 000 g - 3 h - 4 ° C

Cs'

culot rihosomal

Ss'

addition de Triton X-100 (2 'in final)agitation douce (au moins 2 min a 4°C)centrifugation 25 000 K - 3D min - 4°C

centrifugation160 000 g - 3 h - 4

cuiot rihosomal

Le precipite obtenu est centrifuge et lave successivementa I'ethanol a 95 °C contenant du NaCl a 10 '»/o,, a l'etha-nol a 50 "/o acidifie a pH = 4,5, a l'acide perchlorique0,2 N a 4°C, au melange ethanol-ether (3 :1 v/v) bouil-lant, et finalement a l'ether. Puis il est seche.

La poudre obtenue est traitee par le NaOH 0,3 N3. 30°C pendant 18 heures. Le precipite est centrifuge,lave a NaOH 0,3 JV deux fois et une partie aliquote dessurnageants, rassembles et ajustes au volume exact leplus proche, est utilisee pour le dosage des proteines parla methode de Lowry et al. (1951). Le reste est acidifiea p H = l en ajoutant de l'acide perchlorique a 15 "/oa 4°C et laisse 40 minutes a 4°C avant d'etre centrifuge.Le surnageant est utilise pour le dosage de l'ARN parla methode a I'orcinol (Ashwell 1957). Sou vent, Ie culotest lave deux fois a l'acide perchlorique 0,5 N et le

liquide de lavage est ajoute au surnageant servant audosage de l'ARN.

Les valeurs obtenues sont exprimees soit par rapporta la surface foliaire determinee a partir d'un trace ducontour de la feuille soit par rapport aux proteinestotales. La representation par rapport a la surface foliairea ete retenue quand cela a ete possible. En effet, la sur-face de la feuille peut en premiere approximation etreconsideree constante au cours du traitement.

— Rihonuclease. Uoe partie aliquote de chacune desfractions recueillies est utilisee pour le dosage de I'ac-tivite ribonucleasique par la methode de Vieira da Silva(1970).

L'activite de Fenzyme est dosee spectrophotometrique-ment a 260 nm et exprimee directement en unites dedensite optique par mg de prot&nes et heure.

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Tableau 2. Influence de la carence hydrique sur le contenu en ARM et en proteines des feuiliesde Gossypium hirsutum. Les quantites d'ARN sont exprimees en [j.g de pentose par cm- de sur-face foliaire et ies proteines en mg par cm- de surface foliaire.

Parametre TotalFraction

chloroplastiqueCo

Fractioncytoplasmique

Ss

ARN

Proteines . .

traitement osmotique .tcmoinstraitement osmotique .temoins

17,5 ±2,2039,2 ±3,50

l,18±0,212,80 ±0,40

7,3 ±1,1026,1 ±4,200,7610,161,94 ±0,21

7,9 ±0,30.8,4 ±1,101,37 ±0,050,7110,21

Resultats

Influence de la carence hydrique sur I'ARNfoliaire total

Sous l'effet d'une carence hydrique accentuee, le po-tentiel de la solution nutritive etant de — 20 joules parmole, la teneur en ARN des feuilles de Cotonnier dimi-nue fortement. Cette diminution est de plus de 50 "Inpar rapport aux temoins au bout de 24 heures (Tableau 2)et ce processus se poursuit jusqu'a 96 heures, qui est ledernier stade que nous avons etudie (Figure 1). La dimi-nution de la quantite globale d'ARN foliaire est fonc-tion de la deshydration provoquee par !e traitementosmotique (Figure 2).

ParallMement a cette reduction de la quantite globaled'ARN dans la feuiile, l'activite totale de la ribonucleaseaugmente. Une liaison semble exister entre la teneur enARN et cette augmentation de Factivite ribonucleasique.Elie a ete observee dans toutes les experiences ou cetteactivite a ete dosee en meme temps que la quantite glo-bale d'ARN (Figure 3).

Influence de la carence hydrique sur la repartitioncellulaire de I'ARN foliaire

Apres un traitement osmotique de 24 heures, compareaux temoins, il ne reste plus que 28 '/o de l'ARN con-tenu dans la fraction chloroplastique. Le compartimentcytoplasmique ne semble pas etre touche: il en contientencore 94,1 %. C'est done le compartiment chloroplas-tique defini selon notre mode de fractionnement cellu-laire qui semble le plus affecte par la carence hydrique(Tableau 2).

Dans les plants temoins, la majorite de TARN et desproteines celiulaires se trouvent dans le compartimentchloroplastique dans une proportion sensiblement com-parable. Mais dans les plants traites l'accroissementreiatif dans le compartiment cytoplasmique est plus im-portant pour les proteines que pour l'ARN (Tableau 2).

La cinetique du processus confirme cette seosibiliteparticuliere du compartiment chioroplastique (Figure1 A) et souligne une legere augmentation de la teneur

en ARN du compartimeot cytoplasmique pendant les 24premieres heures seulement (Figure 1 B).

Dans les chloroplastes, la proportion d'ARN ribo-somal rapporte a l'ARN total contenu dans cette frac-tion passe de 71,3 "/» pour Ies plantes temoins a 46,4 "/opour les plantes traitees. Mais dans !e cytoplasme elle

JOURS

Fig. 1. Evolution de la teneur en ARN au niveau des com-partiments celiulaires chloroplastique (A) et cytoplasmique (B)au cours d'un cycle de secheresse de 4 jours. (O) temoin;(•) traitement osmotique.

Ptysiol. Plant. 27. 1972 INFLUENCE DE LA CARENCE HYDRIQUE SUR L'ACIDE RIBONUCLEIQUE 153

Tableau 3. Influence de la carence hydrique sur le pour-centage de I'ARN ribosomal par rapport a I'ARN total dansles fractions chioroplastique et cytoplasmique des feuilles deGossypium hirsutum.

10 20 30 40 50 60 70DE PERTE D'EAU

1,0 1,8 2,0 2,2 2,4AUGMENTATION DE LA RNASE

Fig. 2 (,en haut). Pourcentage d'ARN par rapport au temoinsuivant I'intensite des pertes d'eau foliaire.

Fig. 3 (en bas). Pourcentage d'ARN par rapport au temoinsuivant la valeur de I'augmentation de I'activite de larihonuciease.

n'est pas sensiblement modifiee (Tableau 3). Au coursd'une catence hydrique accentuee ce qui est le plus

Fraction

Chioroplastique (C2) . .Cytoplasmique (S3*) . . .

Pourcentage de

I Plantes; traitees

46,461,6

'ARN ribosomal

Plantestemoins

71,357,7

modifie du point de vue de I'ARN dans le compartimentchioroplastique c'est la teneur en ARN ribosomal.

La figure 4 rend compte du resuitat d'autres expe-riences ou la distribution de TARN dans la cellule estfonction de la perte d'eau des tissos foliaires. Compareeaux temoins, la teneur en ARN des deox compartimentschioroplastique et cytoplasmique,, diminue jusqu'a uneperte de 30 "/o d'eau par rapport aux temoins (Figure 4).Le compartiment cytoplasmique arrive meme a s'enrichiren ARN et plus particulierement eo ARN ribosomal.Uoe partie de I'ARN ribosomal chioroplastique sembleainsi se retrouver dans ce compartiment.

DiscussionLes tissus foliaires du Cotonnier reagissent de la meme

fafon que les feuilles de plantules de Tomate (Gates etBonner 1959) ou ies feuilles adultes de Betterave (Shahet Loomis 1965): un deficit hydrique accentue se traduitpar une diminution importante de la teneur en ARN.

Cette reduction du contenu global en ARN est associeea une augmentation des activites ribonucleasiques. Unetelle relation entre la teneur en ARN et l'activite ribo-nucleasique a ete esquissee pour les feuilles en developpe-ment (Kessler et Engelberg 1962) et les feuilles de plan-tules de Ble {Hadziyev, Mehta et Zalik 1969), et cettesituation est caracteristique des conditions d'agression(Bagi et Farkas 1967, Dove 1967, McHale et Dove 1968,Udvardy 1969). Pour le Cotonnier, une liaison entrel'augmentation de l'activite ribonucleasique et une dimi-nution de la quantite de matiere seche avait ete trouvee(Vieira da Silva 1968 a).

Si une augmentation de l'activite de la ribonucleaseest en rapport avec la diminution de la teneur en ARNde la feuille, elle affecte essentiellement le compartimentchioroplastique, ce qui modifie profondement la reparti-tion de l'ARN cellulaire, la ribonuclease degradant plusparticulierement I'ARN ribosomal chioroplastique. Unetelie alteration avait ete notee sur des plants de Betteravesoumis a la secheresse (Shah et Loomis 1965) mais c'estla fraction soluble cytoplasmique qui s'enrichit aux de-pens de I'ARN ribosomal cytopiasmique et de I'ARNcontenu dans la fraction insoluble constituee par lesnoyaux, les mitochondries et les chloroplastes. Pour une

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%

mz<

Oz<Io

140

120

100

80

60

20

o

•

CYTOPLASME

m

0

0

W\\\ \\ \\ \

CHLOROPLASTE

r I \

-'X>-

Vr

10 20 30 40% DE PERTE D'EAU

Fig. 4. Influence de la perte d'eau foliaire sur revolution dela teneur en ARN des compartiments chloroplastiqus et cyto-plasmique. ° ARN total; (•) ARN ribosomal.

carence hydrique prononcee, une telle situation est ren-contree aussl chez le Cotonnier. Ainsi, daos une premierephase, la ribonuclease augmente dans les chloroplastes,le contenu en ARN de cette fraction diminue et I'ARNribosomal plus: particulierement. Puis dans une secondephase, la ribonuclease se retrouvant aussi dans le cyto-plasme, ce compartiment se vide a son tour de son ARN.

L'enrichissement du cytoplasme en ARN peut etre leresultat d'une modification des structures cMoroplas-tiques qui seraient alors plus permeables a I'ARN et ala ribonuclease. En effet, les chloroplastes soumis a unehypertonicite perdent leurs ribosomes qui se retrouventdans le milieu exterieur (Filippovitch et al. 1967). Mais,,un tel phenomene peut correspondre aussi a une destruc-tion de ces chloroplastes bien que la chlorophylle ne seretrouve pas dans le compartiment cytoplasmique. II adeja ete observe que la deshydratation entraine unemodification de la structure des plastes des racines de

Mais (Nir et al. 1969),, ou les plastes se sont arrondis,et ont perdu leurs structures membranaires internes, etleur stroma est moins opaque aux electrons.

La sensibilite de TARN ribosomal aux ribonucleasesti'est pas specifique du materiel ici etudi^. Pour les feuil-les de plantules de Ble, une augmentation de I'activiteribonucleasique est aussi associee a une diminution de lateneur en ARN ribosomal (Hadziyev et al. 1969). Pourle Ma"is, I'ARN ribosomal est degrade pref^rentlellementdu fait meme de la localisation de la ribonuclease (Hsiao1968). Chez le Radis, I'ARN ribosomal chloroplastiqueest particulierement labile (Ingle 1968). Et cet enrichisse-ment observi du compartiment cytoplasmique en ARNrihosomal peut n'etre que la consequence d'une plusgrande resistance des ribosomes cytoplasmiques a la ribo-nuclease (Ingle et al. 1970, Vedel et D'Aoust 1970).

II existe une certaine analogie entre la carence hy-drique et la senescence foliaire, des resultats comparablesayant ete obtenus (Woolhouse 1967). Sissakyan et Odint-zova (1956) notent qu'au cours de la senescence leschloroplastes sont les premiers organites touches aussibien au niveau des proteines que des acides nucleiques.

La senescence a ete tres etudiee sur des feuilles excisees:au cours du vieillissement, tous les ARN ne sont pasaffectes de Ia meme fafon, la cessation de la synthese deI'ARN messager s'accompagne d'une degradation accruedes ribosomes (Parthier 1964, Wollghien et Parthier1964). Certains auteurs vont jusqu'a assimiler l'influencede la carence hydrique a une acceleration de la senescence(Shah et Loomis 1965, Ben-Zioni, Itai et "Vaadia 1967).Les resultats ici presentes pourraient confirmer cettehypothese.

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