Journal of Plankton Research Volume 4 Number 4 1982

Influence du debit d'eau de mer dans un dispositif de culture afibres creuses dialysantes sur la croissance phytoplanctonique et1'extraction des nitrates du milieu

Pierre Marsot, Claude Blais et Real Fournier

INRS-Ocianologie, 310, Ave. des Ursulines, Rimouski, Quebec, G5L 3A1,Canada

(Received February 1982; accepted May 1982)

Abstract. It is demonstrated that the productive capacity of mass dialysis culture of phytoplanktonis intimately related to the rate of flow of nutrient medium along the membrane. Comparison ofcultures of Phaeodactylum tricornutum, subject to different medium flow rates (92 versus 250ml.min"1) during a 17-day growth period, reveals increased productivity (in terms of cell numbers,chlorophyll o, dry weight, cell nitrogen, cell carbon, ATP) at the higher flow rate. Differences aremost pronounced in the latter stages of growth (i.e., linear and stationary) attaining ratios between 2and 3 for cell nitrogen, cell carbon and ATP. Lower C/N ratios for the greater yielding culturetranslates as enhanced osmotic diffusion as well as cellular assimilation of nitrates. The positive ef-fects of increasing medium flow rate on phytoplankton growth result from improved dialyzer perfor-mance with respect to low molecular weight solutes. This is evidenced in the proportionately greatervalues obtained for mass transfer of nitrate-nitrogen. Accordingly, measures of nitrate clearance in-dicate a progression from 29 to 85 ml.min"1 in response to augmenting sea water flow from 32 to 292ml.min " ' . The culture apparatus recently developed consists of a separate dialysis unit (a hollow-fibercartridge used in hemodialysis) coupled to a temperature-controlled growth chamber. Cultures receivea continuous flow of natural sea water and are grown in the batch dialysis mode. The main advantagesof this method relate to its potential for large-scale, axenic algal culture based on the abundant sourceof cheap nutrients that constitutes natural sea water.

Introduction

Le procede de culture a dialyse du phytoplancton marin a ete employe prin-cipalement a des etudes ecophysiologiques visant a determiner la valeur nutrition-nelle de l'eau de mer ou la tolerance des algues a divers degres de pollution(Maestrini et Kossut, 1981; Yoder, 1979; Sakshaug et Jensen, 1978; Kossut etMaestrini, 1977; Berland et al., 1976; Jensen et ah, 1974, 1976; Power et al.,1976; Jensen et Rystad, 1973). La methode s'est averee satisfaisante parfoismeme en milieu oligotrophe en raison des reponses metaboliques amplifiees del'algue (croissance elevee, accumulation importante des substances polluantes)decoulant d'une utilisation efficace des solutes concernes (sels nutritifs oumolecules toxiques). Effectivement, en cours d'evolution, la culture a dialyserecoit grace au jeu de l'osmose, un apport toujours croissant des solutes du milieuambiant, jusqu'a la limite de diffusion determinee par la capacite du materieldialysant. Ce phenomene d'accumulation des solutes (nutrilites) dans le temps aete mis en evidence par Schultz et Gerhardt (1969), pour les cultures de bacteries.Ils demontrerent que la densite cellulaire d'une culture a dialyse operant en milieunourricier limite (batch reservoir), est non seulement fonction de la concentrationdes nutrilites du milieu, comme c'est le cas pour les systemes de cultures

©IRL Press Ltd., Oxford, England. 0142-7873/82/0404-0951S2.00/0 951

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P.Marsol, C.Blais and R.Foumier

non-dialysants, mais egalement du volume du reservoir nourrice, c'est-a-dire dela quantite totale des nutrUites disponibles.

Dans la nouvelle perspective d'une production massive d'algues par la dialyse(Marsot, 1980; Marsot et Fournier, 1981; Marsot et al., 1981a, 1981b) celasignifie qu'un tel dispositif s'alimentant d'un milieu de volume infini (continuousreservoir), relativement riche, (estuaires, mangroves) pourrait produire unebiomasse interessante pour peu que le substrat nourricier atteignant les surfacesd'echanges soit renouvele de facon reguliere et le plus rapidement possible. Enfait, il s'agit de creer, par un artifice quelconque, une situation propice a la diffu-sion des nutrilites, a savoir le maintien d'un gradient de concentration des selsnutritifs (ACM) le plus eleve possible, de part et d'autre de la barriere dialysanteet d'abaisser autant qu'il est possible les resistances physiques s'opposant a cesechanges. Le present travail vise a preciser 1'influence du debit de l'eau de mer surla diffusion des nutrilites d'une culture dialysante de phytoplancton et l'impor-tance de ce facteur physique sur la croissance et l'etat physiologique de Palgue enculture massive.

Materiel et Methodes

Nous avons utilise pour ces experiences la diatomee Phaeodactylum tricor-nutum. La souche fut maintenue sur un milieu F/2 de Guillard et Ryther (1962)jusqu'en phase lineaire oii des aliquotes de 50 ml ont servi a ensemencer les en-ceintes de culture a dialyse.

Systimes de culture

Deux cultures a dialyse ont ete menees aseptiquement au Laboratoire dePointe-au-Pere sur une periode de 17 jours a l'aide d'appareils deja decrits (Mar-sot et al., 1981a). La chambre de croissance de 5 1 communique avec une seuleunite de dialyse (cartouche de fibres creuses de 1.1 m2 d'aire de dialyse: HospalMed. Corp. Littleton, USA). Les cultures ont ete conduites simultanement etsubissaient les memes conditions de croissance: temperature de la chambre, 14°C± 0 . 1 ; illumination naturelle variant entre 3000 et 50 000 lux; eau de mer non-enrichie en circulation continue dont la teneur en nutrilites s'etablissait enmoyennea9/t at-g.l -1 pour les nitrates et 0.5/iat-g.l"1 pour les phosphates. Lasalinite de l'eau oscillait entre 25 et 2 9 % o.

Durant toute l'experience les cultures a dialyse furent maintenues en croissancelimitee (batch dialysis culture) en exercant dans l'unite de dialyse une pressionintrafibrillaire egale a la pression extrafibrillaire (60 mm de Hg). Ceci a pour effetd'empecher toute dilution de la culture par ultrafiltration de l'eau de mer atravers les surfaces de dialyse (Marsot et al., 1981a). Le debit de Peau de mer dansles unites dialysantes etait ajuste a 92 ml.min~l pour une culture, et 250ml.min~l pour l'autre. La circulation des milieux de cultures dans le dialyseur estdemeuree constante a 166 ml.min"1.

Les parametres de croissance

La croissance des deux cultures a ete suivie regulierement en tenant compte desindices suivants: une numeration journaliere effectuee au microscope a contraste

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Influence du dibit d'eau de mer sur la croissance phytoplanctonique

de phase sur une lame a puits calibree; les valeurs en poids sec obtenues par unelyophylisation de 72 h des echantillons de culture recueillis sur un filtre prepese depolycarbonate; les concentrations en chlorophylle a et ATP determinees selon lesmethodes decrites par Strickland et Parsons (1972) et par Holm-Hansen et Booth(1966), respectivement; le carbone et l'azote cellulaire mesures sur l'analyseurCHN Perkin-Elmer (Elemental Analyzer 240) apres une lyophylisation de 72 hdes echantillons. Les volumes de culture variant entre 5 et 25 ml etaient recueillissur filtres en fibre de verre (Gelman A/E, 25 mm) prealablement exposes a unetemperature de 400°C pendant 48 h.

Mesures du transfert de masse de nitrates et de la 'clearance'

Le but de cette experience est de mesurer, a trois niveaux de debit d'eau de merdans le dialyseur, la quantite totale de nitrate traversant le fibres par diffusion(M). Pour ce faire, nous avons utilise un troisieme dispositif contenant uneculture de P. tricornutum parvenue a sa phase exponentielle (6 x 105

cellules.ml-1). Des echantillons d'eau de mer furent preleves simultanement al'entree et a la sortie du dialyseur, c'est-a-dire avant et apres que se produisent lesechanges osmotiques entre le substrat et la culture. Cette operation a ete effectueepour les trois debits suivants: 32, 120, 292 ml.min"1. Les echantillons ont eteanalyses pour leur concentration en NO3-N a l'aide d'un appareil TechniconAutoanalyzer II.

Resultats

Croissance phytoplanctonique

Dans l'ensemble des parametres de croissance etudies, il se degage une nettedifference d'activite entre les deux cultures (Figure 1). Les ecarts les plus marquesvont pour les valeurs de N, C et ATP alors que le dispositif alimente d'un fortdebit d'eau de mer fournit un rendement jusqu'a trois fois superieur a l'autreculture (voir les chiffres inscrits sur les courbes). II faut souligner la cinetique par-ticuliere des escarts de biomasse durant revolution des cultures; elle se traduit parune augmentation assez reguliere, pour atteindre les valeurs maximales a la phaseterminale de la croissance c'est-a-dire, aux plus fortes concentrations cellulaires.

Les densites cellulaires que nous avons obtenues (18 x 10 cellules.ml" •) se rap-prochent des r6sultats atteints pour la meme espece d'algue (24 x 106

cellules.ml"1) dans des petits sac a dialyse immerges dans une eau de richessesimilaire (Jensen et ah, 1972). Mentionnons que le present dispositif est munid'un seul dialyseur et presente done un rapport S/V (surface de dialyse survolume de culture) legerement inferieur (2.2) a celui du sac a dialyse (2.6; Jensenet Rystad, 1973).

Evolution des rapports C/N

Les rapports C/N des deux cultures montrent une evolution assez comparable.Cependant, les valeurs sont toujours plus basses pour le dispositif de culture rece-vant un fort debit d'eau de mer (Figure 2). Dans ce cas, elles se situent entre 5.4(phase exponentielle) et 10.0 (phase stationnaire) pour une moyenne de 8.9, tan-dis que l'autre culture donne aux memes stades des rapports variant entre 6.5 et

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Influence da debit d'eau de mer stir la croissance pbytoplanctonique

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ID-

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RapportCarbone /Azote

4Jours

8de

12 16Croissance

Fig. 2. Evolution des valeurs du rapport C/N (at/at) pour des cultures en dialyse de P. tricomutumeffectuees dans des conditions differentes de debit d'eau de mer. Pour la definition des courbes voir lalegende de la Figure 1.

12.4 avec une moyenne calculee de 10.0. Les valeurs C/N des deux systemes decultures se distinguent plus facilement au cours des derniers jours de croissance,plus precisement a partir du 4ieme jour. Ces resultats se rapprochent des valeursobtenues avec la meme espece d'algue cultivee par des methodes traditionnelles apartir d'un milieu enrichi. Elles fluctuent entre 5.7 et 7.9 (Berland et al., 1973) et7.0 en phase exponentielle (Parsons et al., 1961). Pour le cas d'un milieu limitatifen nutrilites on peut atteindre des valeurs de 5.7 a 20 (Moal et al., 1977). A notreconnaissance, les seules donnees s'appliquant a des cultures a dialyse de P. tricor-nutum, conduites dans un milieu non-enrichi, proviennent de tests realises in situdans des eaux oligotrophes; les valeurs de C/N s'etablissent a 11.3 et 13.3 (Kossutet Maestrini, 1977; Maestrini et Kossut, 1981).

Mesure du transfert de masse des nitrates

Un troisieme culture de P. tricornutum a ete amenee a sa phase exponentielleen employant un montage identique. Les concentrations en NO3-N du substratnutritif ont ete determinees avant et apres la dialyse (entree et sortie du dialyseur),pour trois debits croissants d'eau de mer. Le Tableau I nous montre desdifferences appreciates entre les deux echantillons preleves pour chaque debit,refletant l'utilisation efficace du nutrilite par une culture en pleine activite. Onpeut aussi remarquer une diminution dans l'extraction des nitrates a mesure quele debit s'eleve; a 32 ml.min"1 Pepuisement du substrat est realise a 92% alorsqu'il tombe a 29% pour un debit de 292 ml.min - 1 . Par contre, la quantite globalede solute traversant la membrane dialysante dans une meme unite de temps(transfert de masse des nitrates), s'accrott du triple avec Paugmentation de la cir-culation de Peau de mer dans le dialyseur. Le calcul du transfert du colute est

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Table I. Effet d'un debit croissant d'eau de mer dans un dialyseur a fibres creuses sur la diffusiondes nitrates et sur son transfert de masse (M). Ces essais ont ete realises sur une culture de P. tricor-nutum parvenue a sa phase exponentielle (6 x 10s cellules.ml"1).

Debits(ml.min"1)

QNe

32120292

Concentration

Entree dudialyseur

CNe

0.12040.11620.1246

de l'eau deGig.ml"1)

Sortie dudialyseur

CNs

0.00980.05320.0882

mer en NO3-N

CN~CNe+CNs

2

0.06510.08470.1064

Epuisement del'eau de mer

en NO3-N(%)

CNe - CNs x 100.1CNe

925429

Transfert desNOj-N

(/ig.min"1)

M = (Cnex QN)-(CNsxQN)

3.57.6

10.6

determine suivant la formule employee en hemodialyse:

M = (CNe x QNe) - (CNs x QNs),d'oii CNe et CNs sont les concentrations du substrat nourricier a l'arrivee et a lasortie du dialyseur et QNe et QNs les debits des liquides correspondants. Dansl'application de cette formule nous avons considere que les debits d'eau de mer,QNe et QNs etaient identiques. Le systeme operait en equilibre de pression trans-membranaire, done maintenait un niveau de culture stable sans excedent (Marsotet al., 1981a) de sorte que toute perte de debit occasionnee par diffusion hydrauli-que ou ultrafiltration etait eliminee.

La performance du dialyseur pour les nitrates dans les conditions actuelles decroissance a ete mesuree. Elle s'exprime par la 'clearance' (Wolf et al., 1951),e'est-a-dire, par le rapport entre le transfert de masse du solute considere et saconcentration dans l'eau de mer, avant la dialyse d'ou:

Cl = (CNe - CNs) QN

La Figure 3 indique trois mesures de clearance du NO3-N calculees en fonctiond'une variation de debit. Nous observons une nette influence du debit de l'eau demer sur le rendement de la dialyse. Celui-ci semble plafonner a 85 ml.min"1 audebit de 292 ml.min"1 ce qui equivaut environ a la moitie des performancesobtenues en hemodialyse pour les petites molecules comme l'uree et la creatinine(Hospal Dialysis Products, 1979).

Discussion

Les facteurs conditionnant les mecanismes osmotiques de 1'hemodialyse sontconnus (Wolf et al., 1951) et semblent parfaitement s'appliquer aux nutrilites duphytoplancton puisqu'il s'agit egalement de molecules solubles dont la massemolaire est comparable aux solutes concernes par ce type de dialyseur. Ils sontreunis dans l'equation determinant la diffusion passive des solutes au traversd'une membrane dialysante:

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Influence du debit d'eau de mer sur la croissance pbytoplanctonique

100-

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40-

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100 200 300

D6bit (ml/min)

Fig. 3. Influence de l'augmentation du debit d'eau de mer sur la 'clearance' des nitrates par undialyseur a fibres creuses (hemodialyseur, Hospal Corp.). Les mesures de 'clearance' sont determineesa partir des donnees presentees au Tableau I.

Nd = Ax ACrvTxKo,

d'ou A est l'aire efficace de dialyse, ACM le gradient moyen de concentration dusolut6 et Ko le coefficient global de permeabilite du dialyseur. Ce dernier sym-bolise l'inverse des resistances physiques s'opposant au passage du solute atravers la membrane (Ko = 1/RN + 1/RC + 1/RM). II s'agit essentiellement: a)de l'epaisseur des couches fluides limitrophes de la paroi dialysante, celle dumilieu nourricier (1/RN) et celle de la culture (1/RC); b) de la nature physique etchimique de la membrane (1/RM).

On connaft deja l'importance de la variable surface de dialyse (A) sur le rende-ment d'une culture a croissance limitee (Marsot et al., 1981a) ou en continu (Mar-sot et al., 1981b). Par exemple, dans ce dernier procede, le doublage des surfacesdialysantes permet d'accroTtre proportionnellement les productions journalieresde poids sec et de chlorophylle d'une culture de P. tricornutum. Par ailleurs,l'augmentation du ACM des sels nutritifs realisee soit par un epuisement pluspousse des nutrilites dans une culture populeuse (resultats non publies) ou, par unenrichissement du milieu nourricier (Marsot et al., 1981a) favorise de faconsignificative la croissance des algues.

La circulation des masses liquides de part et d'autre de la barriere dialysante(culture et eau de mer) peut affecter la dialyse des solutes de faible poidsmoleculaire en agissant sur l'ensemble des parametres (A, ACM, et Ko) con-sideres dans la diffusion des molecules. En hemodialyse cet effet est produit enaugmentant le debit sanguin a l'interieur des fibres et/ou celui du bain de dialysecirculant entre les fibres. Si on se rapporte a notre systeme de culture d'algues,une hausse du debit d'eau de mer dans le dialyseur se traduit par une amelioration

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des conditions de diffusion pour les nitrates qui se repercutent sur la croissancedu phytoplancton. L'influence du debit se fait d'abord sentir sur les valeurs de laconcentration moyenne (CN) du NO3 dans le dialyseur (Tableau I) et partant, surle ACM des nitrates entre la chambre de croissance et l'eau de mer. Cet effet pro-duit egalement une augmentation de l'aire efficace de dialyse (A) grace au main-tien d'un fort ACM sur un plus long parcours des fibres.

La circulation intrafibrillaire de l'eau de mer peut aussi modifier le coefficientde permeabilite de la membrane (Ko). En fait, elle reduit l'epaisseur du film li-quide (1/RN) recouvrant la surface interne des fibres (Jungers et al., 1978) etfavorise du meme coup la diffusion des molecules vers la chambre de croissance.De plus, l'acheminement a contre-courant des deux liquides - l'eau de mer versle bas et la culture vers le haut - permet d'attenuer ces resistances (Hampers etal., 1973). Pratt (1944) et Skoglund et Jensen (1976) ont observe un effet com-parable sur la croissance d'algues microscopiques en pratiquant une agitation dessacs a dialyse dans un bassin nourricier: cette operation devait, en quelque sorte,faciliter le 'balayage' des couches voisines de la membrane et diminuer laresistance a la diffusion des nutrilites.

En recherche clinique, les performances des dialyseurs et l'efficacite du pro-cessus de la dialyse, s'appliquant a l'extraction des solutes, sont exprimees enterme de 'clearance'. La 'clearance' represente done un taux volumetrique de dif-fusion d'un solute passant du liquide sanguin vers un milieu depourvu de cesolute, le bain de dialyse. En ce qui concerne la culture de P.' tricornutum lesvaleurs de 'clearance' des nitrates (Figure 3) se situent en deca des performancesde 1'hemodialyseur pour l'uree et la creatinine: elles s'etablissent a 170 et 140ml.min-1 pour un debit du dialysat de 500 ml.min-1 (Hospal Dialysis Products,1979). Dans notre cas, le debit du dialysat correspondant (la culture) est inferieursoit, 166 ml.min ~ *. Ce rendement inferieur est attribuable a la presence du solutedans notre bain de dialyse (chambre de croissance), traduisant un epuisement in-complet des nitrates par une culture de faible densite cellulaire (6 x 105

cellules.ml"1). Dans ce cas, nous avons estime cette concentration a 0.05/tg.ml"1; pour une population de 4 x 106 cellules de P. tricornutum cette concen-tration peut descendre a 0.01 /tg.ml""1 (Marsot et al., 1981a). Ainsi, une culturepeu dense entraine une diminution du ACMet il s'ensuit une baisse d'efficacite dela dialyse. Le choix d'une telle culture presentait toutefois l'avantage de faciliterles dosages du NO3-N, particulierement pour les echantillons d'eau de mersusceptibles de contenir d'infimes quantites d'ions, exemple le CNs (apresdialyse) au plus bas debit.

Par ailleurs, la performance du dialyseur envers les nitrates augmente tres net-tement avec le debit de l'eau de mer. Cette action est bien ressentie au niveau de laclearance du solute (Figure 3) et de son transfert total de masse (Tableau I), ce quireflete une fois de plus l'influence de la circulation du milieu nourricier sur1'ensemble des trois facteurs gouvernant le transfert par diffusion d'un solute.

Sur une plus longue periode, l'effet du debit se traduit manifestement par unecroissance et une condition physiologique superieures de l'algue (Figures 1 et 2).Ceci est vrai pour tous les parametres etudies, particulierement pour l'ATP, le Net le C; il semble done que 1'augmentation du debit d'eau de mer se fasse egale-

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ment sentir sur la diffusion des autres nutrilites de faible poids moleculaire(phosphates et ions carbonates). A l'approche de la phase stationnaire, les ecartsde biomasse entre les cultures sont nettement plus dinstincts (Figure 1). On peutattribuer ce resultat a Faction combinee des deux principaux facteurs favorisantl'elevation du ACM des nutrilites, soient: l'action continue d'un debit eleve; l'ac-tion croissante de la densite cellulaire conduisant a un appauvrissement desnutrilites de la culture et a la formation d'un meilleur ACM entre les deuxmilieux. C'est un fait que les cultures denses produisent un plus fort gradientmoyen de concentration de nutrilites (resultats personnels) et concourent de cettemaniere, a accrottre la diffusion des nutrilites et le rendement biologique dusysteme a dialyse (Marsot et al., 1981b).

Les valeurs du rapport C/N generalement plus basses dans la culture benefi-ciant d'une bonne circulation d'eau de mer, soulignent une fois de plus l'impor-tance du facteur debit sur la diffusion des nitrates et temoignent enfin d'unemeilleure utilisation du nutrilite par les cellules. Ce resultat est tout a fait com-patible avec les etudes faites par Maestrini et Kossut (1981) et Kossut et Maestrini(1977) sur des cultures a dialyse in situ, de P. tricornutum realisees dans des eauxpauvres en azote. Les valeurs de C/N etaient dans ce cas, toujours plus eleveesque ceux des inocula maintenus au laboratoire, en milieu enrichi.

La realisation de cultures massives d'algues par le procede de la dialyse peuts'averer une methode prometteuse dans certains secteurs de l'aquaculture mettanten valeur des plans d'eaux eutrophes (elevages des moules, crevettes, chainestrophiques artificielles). Dans ce contexte oii le volume du milieu n'est plus unfacteur limitant, on peut facilement accroitre les processus d'extraction et detransformation biologique des elements nutritifs grace a un plus grand apport dusubstrat nourricier dans le systeme a dialyse. Cette mesure permet d'ameliorer lesconditions osmotiques dans lesquelles se deroule la croissance de l'algue: 1)emploi d'une plus grande surface dialysante; 2) maintien d'un fort gradient deconcentration des nutrilites; 3) affaissement des resistances physiques s'opposanta la diffusion des molecules nutritives.

Remerciements

Nous tenons a remercier M.Marc Leclerc pour sa precieuse assistance technique.Cette recherche a ete financee par le gouvernement du Canada: Ministere des Ap-provisionnements et Services (contrat No 095 D-KF 401-8-1502) et Peches etOceans Canada, et par le Ministere de 1'Education du Gouvernement du Quebec(FCAC-DGES-EQ-841).

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