Inhibition de l'activité enzymatique En se liant à l ...esilrch1.esi.umontreal.ca/~syguschj/cours/BCM1502/Web-Notes/3b... · Nature des inhibiteurs :-Analogues de S (ou P) -Analogues

-Entité (I) l’activité enzymatique ( la vitesse d’une réaction enzymatique) :

-En se liant à l’enzyme, un inhibiteur peut :

• empêcher la fixation de S au site actif,

• provoquer une déformation du site actif (notamment à l’état de transition) et rendre

l’enzyme moins active (voire inactive) vs S.

-L’affinité de I pour E est traduite par la constante d’inhibition Ki :

• Ki = cte de dissociation de EI en E + I (unité : M),

• Ki = [I] pour laquelle la moitié des sites enzymatiques est occupée,

• + Ki est petit, + l’affinité de I pour E est grande,

• Inhibiteur « idéal » : forte affinité (Ki petit) pour E et forte sélectivité vs S (Km/Ki

grand).

[EI]

[E][I]

i

i-i

k

kKE + I EI

ki

k-i

Exemple :

phosphoglucose

isomérase (PGI)

µM 200F6P

m K

nM 2005PAH

i K1000im KK

Inhibition de l'activité enzymatique

; unités en Molaire

BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 1/29

Conception des inhibiteurs :

-Beaucoup d'inhibiteurs (médicaments) ont été trouvés par hasard !

-Ethnopharmacologie

-Criblage à haut débit (HTS ou High Throughput Screening) de produits naturels ou

synthétiques (chimiothèques…)

-Criblage virtuel (screening « in silico »)

-Conception d’un I vs E ciblée par docking

Nature des inhibiteurs :

-Analogues de S (ou P)

-Analogues de l’ET ou IHE

-Complexants de métaux (EDTA…)

-Structures diverses (généralement trouvés par hasard)

« Mimes » : qui ressemblent à… sans être eux-mêmes transformés

CK2

POMs

Inhibition non-compétitive (IC50 = 3 nM) d’une protéine kinase (CK2) par un composé de type polyoxométallate (POM).

Chem. Biol., 2008, 15, 683-692

© CEA


1.1. Différents types cinétiques d’inhibiteurs d'enzymes

Inhibiteurs réversibles :

-Liaison non-covalente (ou covalente) peu stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexes

EI, ESI).

-L'inhibition est réversible (peut être levée), i.e. l’enzyme n’est pas irréversiblement

inhibée :

• Inhibiteurs compétitifs

• Inhibiteurs incompétitifs (et inhibition par excès de substrat)

• Inhibiteurs non-compétitifs purs

• Inhibiteurs non-compétitifs mixtes

Inhibiteurs irréversibles :

-Liaison covalente (ou non-covalente) stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexe E-I)

-Inhibition ne peut pas être levée (inactivation l’enzyme est irréversiblement inhibée) :

• Marqueurs d'affinité

• Inhibiteurs suicides (ou mécanistiques)

• Cas particulier : inhibiteurs dits à interaction lente et/ou à forte affinité :

inhibition non-covalente mais quasi-irréversible (slow-binding, tight-binding

inhibitors)


1.2. Intérêts et usages des inhibiteurs d’enzymes

Recherche fondamental :

-Etudes cinétiques des mécanismes enzymatiques :

• Mode d'interaction d'un inhibiteur ?

• Stoechiométrie et mécanisme de l'inhibition ?

• Effet de l'inhibiteur sur les paramètres cinétiques Km et Vmax (Kmapp, Vmax

app)

• Efficacité d'un inhibiteur (Ki vs Km)

• Comparaison de l'efficacité de ≠ inhibiteurs sur une cible (comparaison des Ki )

• Comparaison de l'efficacité d’un inhibiteur sur ≠ cibles (comparaison des Ki )

4PEA 0.028 1.7

4PEH 0.029 0.057

Ki (mM) Ki (mM)

Inhibiteur SoRpiA MtRpiB

SoRpiA : Rpi d’épinard, type A MtRpiB : Rpi de Mycobacterium tuberculosis, type B

Exemple : Etudes d’inhibition de ribose-5-

phosphate isomérases (Rpi) de type A et B

R5P (Km) 7.5 2.5


-Etudes cristallographiques des enzymes (complexes EI cristallisés) :

• Nature et rôle des résidus du site actif

• Mode de fixation du substrat (→ I analogues de S/P)

• Mode de fixation des intermédiaires réactionnels (→ I analogues de IHE/ET)

• Fonctionnement de l’enzyme (mécanisme)

-Etudes de métabolismes (rôle d’une enzyme dans un processus métabolique)

-Génération d’abzymes (anticorps catalytiques) :

• Enzymes artificielles générées par un organisme en réaction à la présence

d’un antigène (inhibiteur analogue de l’ET appelé « haptène »)

PDB 1G98

Biochemistry 2001, 40, 1560-1566

Complexe EI RmPGI-5PAA

5PAA


Applications thérapeutiques :

-Enzymes : cibles de choix

-Utilisation biomédicale des inhibiteurs : bien avant de connaître les enzymes !

-Difficulté : spécificité de l’enzyme inhibée : souvent, les cellules « cibles » et « hôtes »

possèdent les "mêmes" enzymes (→ parasites, cellules cancéreuses…)

-Correction d’un métabolisme défectueux :

• Hypocholestérolémiant (vs excès de cholestérol)

• Antidiabétique (hypoglycémiants)

-Correction d’un "désordre physiologique" :

• Antidépresseurs

• Antiépileptiques

• Antihypertenseurs

• Antihistaminiques (vs effets de l’histamine produite lors de réactions allergiques)

• Antipyrétiques (vs fièvre)

• Analgésiques (vs douleur)

• Antiinflammatoires


Environnement :

-Lutte contre les plantes parasitaires, les insectes et les champignons (xylophages…)

• Herbicides

• Insecticides

• Fongicides

Armes chimiques (!) :

-Neurotoxiques (gaz Sarin, Tabun) : → I irrév. d’une enzyme du SNC

-Vésicants (gaz Moutarde/Hypérite) : → irritants (peau, yeux, muqueuses…)

-Destruction d’un organisme pathogène :

• Antiparasitaires (paludisme, trypanosomiases…)

• Antibactériens

• Antifongiques (vs champignons)

• Anticancéreux

• Antiviraux (antirétroviraux) (vs maturation des virus, interaction virus-cible…)

Pesticides (produits phytosanitaires)

O P

O

F

O P

O

N

Sarin Tabun


1.3. Exemples d’agents thérapeutiques inhibiteurs d’enzymes

http://www.wellesley.edu/Chemistry/Chem101/hiv/HIV-2.html

Infection par le VIH

AZT

ddC

Ritonavir

Trithérapie

-4 cibles dont 2 principales ; d’autres multi-thérapies existent

-résistances vs RT du VIH

(vs résistances)





Ritonavir® Ic Protéase (VIH)

Zidovudine® 3’-azido-2’, 3’-dideoxy-thymidine (AZT)

AZT-TP : Ic Transcriptase Inverse (VIH)

Aciclovir® Aciclovir-TP :

Ic ADN Polymérase (Herpes, VZV)

Antiviraux (antirétroviraux)

O

NH

RR'

S

P O P P

P O P P

AZT AZT

AZT-TP

kinases

X

2’, 3’-dideoxy-cytidine (ddC) ddC-TP :

Ic Transcriptase Inverse (VIH)

P O P P


Antibactériens

Triméthoprim® Ic Dihydrofolate Reductase

Pénicilline Iirr Transpeptidase (paroi cellulaire bactérienne)

Sulfaméthoxazole® Ic Dihydroptéroate Synthase

Autres activités

Kétoconazole® Antifongique Ic C14 a-Demethylase à CytP450 (biosynthèse de l’ergostérol de la paroi cellulaire des champignons)

Méthotrexate® Anticancéreux Ic Dihydrofolate Reductase

Bactrim®


Aspirine Analgégique, antipyrétique, antiinflammatoire Iirr Prostaglandine Synthase (Cyclooxygénase)

Isocarboxazide Antidépresseur Iirr (suicide) Monoamine Oxidase

Allopurinol vs goutte/calculs rénaux Ic Xanthine oxydase (biosynthèse acide urique)

Autres activités (suite)

Captopril Antihypertenseur Ic Enzyme de Conversion de l’Angiotensine (ACE)

Mévinoline Hypocholestérolémiant Ic Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase


2. Inhibition réversible : généralités et cinétique

2.1. Inhibition compétitive

Fixation réversible exclusive

Différents modèles de l’inhibition compétitive :

A. Modèle classique : S et I ont le même site de fixation

1.

S et I sont en compétition vs site actif

de part leur analogie de structure.

Site actif de la fructose-1,6-

phosphate aldolase d’H. pylori


FBP

Inh

J Biol Chem. 2011 286, 40219-31

B. Modèles alternatifs : les sites de fixation de S et I sont distincts

2.

L’encombrement stérique de I

empêche la fixation de S

3.

S et I ont un groupe en commun

qui se fixe sur un 3ème site

4.

Les sites de fixation de S et I

se recouvrent

5.

Régulation allostérique :

La fixation de I induit un

changement de conformation de

l’enzyme qui déforme ou

masque le site de fixation de S

(et inversement)

"Enzyme Kinetics " I. Segel (1975), Ed. J. Wiley & Sons, Inc.

Exemples :

-aspartate transcarbamylase

-glutamine synthétase


k1 S

EI

E +

I

k-1

kcat

Ki

E + P

+

ES

• S et I sont en compétition pour leur fixation sur E (inhibition exclusive)

• L’affinité apparente de E : Kmapp

• I peut être déplacé par un excès de S : Vmax n’est pas modifié

[ES]

[E][S]m K

[EI]

[E][I]i K v0 = kcat[ES] [E]T = [E] + [ES] + [EI]

Cinétique de l’inhibition compétitive (rappels) :


Vmax

Vmax/2

Km Kmapp

Vo

[S]

[I] > 0

[S][I]

1

[S]V

m

i

max0

KK

v

avec m

i

m

app [I]1 K

KK

Inhibition compétitive : v0 = f([S])

[S]

[S]V

appmax0

mKvsoit


-1/Km

Km/Vmax

1/[S]

1/Vmax +

+

+

+ +

1/Vo

-1/Km1app

sans inhib.

[I]1

[I]2

[I]3

Km1app/Vmax

Inhibition compétitive : 1/v0 = f(1/[S]) (Lineweaver-Burk)

[S]

1

V

[I]1

V

11

max

m

i

max0

KK

v

[I]3 > [I]2 > [I]1

pente = max

m

i V

[I]1

K

K

oao = 1/Vmax

pente et oao = cte lorsque [I]

oao = ordonnée à l'origine


Inhibition compétitive (Lineweaver-Burk)

représentation secondaire : pente = f([I])

-Ki [I]

•

•

•

•

pour pente = 0, [I] = -Ki pentei =

max

m

i

i

V

[I]1

K

K


50%

100%

v0I / v0

[I] IC50

Mesure du paramètre IC50

IC50 = [I] pour v0I = v0 /2

IC50 = conc. d’inhibiteur pour laquelle v0 mesurée (v0I) = 50% vo sans inhibiteur :

(mesure réalisée généralement à [S] = Km)

+

+

+

+

+ +

+

Inhibition compétitive : (IC50 = 2 Ki pour [S] = Km) i

m

i[S]IC50 K

K

K


2.2. Inhibition incompétitive

Un inhibiteur incompétitif (uncompétitif) ne se fixe que sur le complexe ES (le site de fixation de I est induit par celle de S) : L’affinité de E pour S (induit par la formation de ESI) : Kmapp E apparaît moins active (à cause de ESI, inactif) : Vmaxapp

kcat

x

E + P

S

E

ES

ESI

KS

Ki

I

I

S

S

[ES]

[E][S]m K

Si [S] >> Km :

[E]T = [ES] + [ESI]

Vmaxapp = kcat([E]T - [ESI])

(< Vmax)

[ESI]

[ES][I]i K v0 = kcat[ES]

[E]T = [E] + [ES] + [ESI]


[S][I]

1

[S]

[I]1

Vν

i

m

i

max0

K

K

K

i

max

maxapp

[I]1

VV

K

[S]K

[S]V

m

appmaxapp

0

v

Inhibition incompétitive : v0 = f([S])

avec et

i

mm

app

[I]1

K

KK

• Lineweaver-Burk nous donne :

[S]

1

VV

[I]1

1

max

m

max

i

0

KK

v

pente = cte et oao lorsque [I]

max

i

V

[I]1oao

K

-1/Km

Km/Vmax

1/[S]

1/Vmax

+

+

+

+ +

1/Vo

-1/Km1app

sans inhib. [I]1 [I]2 [I]3

1/Vmax1app

(IC50 = 2 Ki pour [S] = Km)

im i

[S]IC50 K

KK

Inhibition incompétitive : 1/Vo = f(1/[S])

soit

pente = Km/Vmax


2.3. Inhibition non-compétitive pure

• Un inhibiteur non-compétitif peut se fixer sur E et sur ES (mais n’est pas en compétition avec S pour sa fixation à l’enzyme). Il ne peut être déplacé par augmentation de [S]

• E apparaît moins active (à cause de ESI, inactif) : Vmaxapp

• L’affinité de E (et EI) pour S n’est pas modifiée : Km n’est pas modifié (I nc pure)

[ESI]

[EI][S]

[ES]

[E][S]m K

[ESI]

[ES][I]

[EI]

[E][I]i K

v0 = kcat[ES]

[E]T = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]

k1

k-1

kcat

Ki

E + P

Ki

k1

k-1

x BCM 1502 Cinétique d’inhibition enzymatique Page 21/29

Vmax

Vmax/2

Km

Vo

[S]

[I] > 0

[S]

[S]

[I]1

V

m

i

max0

K

K

avec

i

max

maxapp

[I]1

VV

K

[S]

[S]V

m

maxapp

0

Ksoit

Inhibition non-compétitive pure : v0 = f([S])

Vmaxapp

Vmaxapp/2

Si [S] >> Km :

[E]T = [ES] + [ESI]

Vmaxapp = kcat([E]T - [ESI]) (< Vmax)


-1/Km

Km/Vmax

1/[S]

1/Vmax

+

+

+

+ +

1/Vo

sans inhib.

[I]1

[I]2

[I]3

Km/Vmax1app

Inhibition non-compétitive pure : 1/v0 = f(1/[S]) (Lineweaver-Burk)

[S]

1

V

[I]1

V

[I]1

1

max

m

i

max

i

0

KKK

pente et oao lorsque [I]

1/Vmax1app

[I]3 > [I]2 > [I]1

pente = max

m

i V

[I]1

K

K

max

i

V

[I]1oao

K

IC50 = Ki


2.4. Inhibition non-compétitive mixte

• Par rapport au cas précédent, dans le cas d’un inhibiteur non-compétitif mixte, les affinités de E pour I (Ki) et de ES pour I (K’i) sont .

• Il en résulte que les affinités de E pour S (KS) et de EI pour S (K’S) sont également .

[ES]

[E][S]m K

[EI]

[E][I]i K

v0 = kcat[ES]

[E]T = [E] + [ES] + [EI] + [ESI] [ESI]

[ES][I]i K'

[ESI]

[EI][S]m K'

ES

ESI

+

+

k1

k-1

kcat

K’i

x

E + P

I

+

Ki

I

EI S

k’1

k’-1

+

E S


Deux cas peuvent être distingués :

• Ki > K’i : Kmapp

• Ki < K’i : Kmapp

Dans les deux cas :

• Vmaxapp (à cause de ESI)

[S]α'

α

[S]

α'

V

m

max0

K

avec

[S]

[S]V

m

appmaxapp

0

Kvsoit

α'

VV

max

maxapp et m

app

α'

αKKm

i

[I]1α

K

i

[I]1α'

K'

Inhibition non-compétitive mixte : Vo = f([S])

• Lineweaver-Burk nous donne :

[S]

1

V

α

V

α'1

max

m

max0

K

v

Inhibition non-compétitive mixte : 1/Vo = f(1/[S])

pente = max

m

i V

[I]1

K

K

pente et oao lorsque [I]

max

i

V

[I]1oao

K'


Inhibition non-compétitive mixte : 1/v0 = f(1/[S])

-1/Km

Km/Vmax

1/[S] 1/Vmax

+

+

+

+ +

1/Vo

sans inhib.

[I]1

[I]2

[I]3

a1Km/Vmax

[I]3 > [I]2 > [I]1

a’1/Vmax

m1

1

α'

αK

Ki < K’i


Inhibition non-compétitive mixte : 1/v0 = f(1/[S])

-1/Km

Km/Vmax

1/[S] 1/Vmax

+

+

+

+

+

1/Vo

sans inhib. [I]1

[I]2

[I]3

a1Km/Vmax

[I]3 > [I]2 > [I]1

a’1/Vmax

m1

1

α'

α

K

Ki > K’i


Deux modèles alternatifs d’inhibition non-compétitive (mixte)

kcat

E + P

Ki

KS

K’S

kcat

E + P

Ki K’i

KS

EI peut fixer S (pour donner ESI inactif),

mais ES ne peut pas fixer I

ES peut fixer I (pour donner ESI inactif),

mais EI ne peut pas fixer S


Tableau comparatif des inhibitions réversibles

Finalement, les inhibitions compétitive, incompétitive et non-compétitive pure sont des cas particuliers de l’inhibition non-compétitive mixte :

Inhibition Effet sur Vmax Vmaxapp Effet sur Km Km

app

K’i = compétitive - Vmax aKm

Ki = incompétitive Vmax /a’ Km/a’

Ki = K’i non-compétitive pure Vmax /a - Km

Ki > K’i non-compétitive mixte Vmax /a’ aKm/a’

Ki < K’i non-compétitive mixte Vmax /a’ aKm/a’

i

[I]1α

K

i

[I]1α'

K'

Remerciement à Dr. Laurent Salmon, Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d’Orsay (ICMMO), Université Paris-Sud 11, 91405 Orsay Cedex, France


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