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Institut de Génétique et Microbiologie
LES CRISPRS, INSTRUMENTS D'ETUDE DE L'EVOLUTION INTER ET INTRA-SPÉCIFIQUE
CHEZ LES MICROORGANISMES
Soutenance de thèse, le 24 Juin 2008, IGM
Ibtissem GRISSA
Introduction Résultats Discussion Perspectives
2
PLAN
Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux But de la thèse
Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie
Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie
Perspectives Les metagenomes
Introduction : Les CRISPRs avant 2006Etat des lieuxBut de la thèse
RésultatsInvestigation des CRISPRsLe CRISPR pour la phylogénie
DiscussionInvestigations du CRISPRUtilisation du CRISPR pour la phylogénie
Perspectives Améliorer les outils Les métagénomes
Introduction Résultats Discussion Perspectives
Introduction Résultats Discussion Perspectives
3
DRLeader
spacers DR dégénéré
TTAGGGTTACGTCCCCCCCGATTCTTGTGACCCTCTTTTTATCACTATGACTAACGTATTGATTTTTATGCTACTCAGGTATTTCACTAAAAAAAGGGTTTTTACGCATTTTGCGCCATTGCTCATTGATAAACATCGGGTTATCCGTATTATCTTACGTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAAATGTTCGACGATTTATTTTATTTGTATTTCAGGTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAAATTTATTAAAGATGCTGACAAAAAGAACTTAAGTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAAGTCAACGCTTCACTCCCTGCGCGGGGTATAACGTTCACTGCCGCACAGGCAGCCCAATAA
Yersinia pestis CO92 (NC_003143_2 )
1ère observation : Escherichia coli (Ishino 1987) succession de séquences répétées de 29pb espacées de séquences
uniques de 32-33pb. 2 locus séparés de 24 kb (14 et 7 répétitions)
Introduction La découverte des CRISPRs (1)
Introduction Résultats Discussion Perspectives
4
1991 : découverte d’un CRISPR dans le complexe Mycobacterium tuberculosis
Introduction
Structure présente chez tous les membres du complexe M. tuberculosis
Marqueur génétique assez polymorphe pour différencier les souches
1996 : Le spoligotypage pour le typage épidémiologique de M. tuberculosis (Membrane d’oligonuclétides composée de 43 spacers)
La découverte des CRISPRs (2)
Obeservations chez les archées : 2 Haloferax volcanii et H. mediterranei (Mojica et col. 1993, 1995) Sulfolobus (She 1994)
Introduction Résultats Discussion Perspectives
5
L’acronyme CRISPR TREP Tandem Repeat SRSR Short Regularly Spaced Repeats DVR Direct Variable Repeat LCTR Long Cluster of Tandem Repeat SPIDR Spacers Interspaced Direct Repeats
E. coli DR : 29bp, spacer : 32-33pb CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTC
H. mediterranei et H. volcanii DR : 30bp, spacer : 33-39pb GTTACAGACGAACCCTAGTTGGGTTGAAGC
M. tuberculosis DR : 36pb spacer : 35-41pb GTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAAC
CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic RepeatJansen 2002
Introduction
Introduction Résultats Discussion Perspectives
6
Un groupe de gènes associés
DRLeader
spacers DR dégénérégènes cas
Le système CASS : CRISPR + cas
Jansen 2002cas1 : réparation de l’ADNcas2 : transposasecas3 : hélicasecas4 : recB exonuclease
Makarova 2002 20 gènes impliqués dans la réparation de l’ADN
Etude phylogénétique des gènes cas Présence du même DR chez des espèces éloignées
Transfert horizontal
Introduction
Introduction Résultats Discussion Perspectives
7
Tang et col. PNAS 2002 Identification of 86 candidates for small non-messenger RNAs from the archeon Archaeoglobus fulgidus.
Introduction
Transcription du locus CRISPR
Introduction Résultats Discussion Perspectives
8
Origine des spacers
Acquisition du spacer à partir d’éléments génétiques préexistants d’origine extrachromosomique (phages, plasmides) ou chromosomique
Génomes analysés
Spacers analysés
Spacers reconnus
phages plasmides chromosome
67 4500 88 (2%) 47 (54%) 10 (11%) 31 (35%)
(Mojica 2005)
2005 : origine des spacers et suggestions sur le rôle du CRISPR
Mojica 2005 Pourcel 2005 Bolotin 2005
67 procaryotes
Streptococcus thermophilusS. vestibularis
Yersinia pestisY. pseudotuberculosisStreptococcus pyogenes
Corrélation avec la résistance aux phages
Hypothèse : Le CRISPR est un système immunitaire chez les procaryotes utilisant l’interférence ARN
Introduction
Introduction Résultats Discussion Perspectives
9
Un système de résistance par interférence ARN
sp4Leader DR’DR sp2sp3 sp1
ADN invasif
Cas
Dégradation du phage
phage
Protéines CassRNA
sRNA
CasCas
ARNTranscription
Modèle d’action du CRISPR
Introduction
Introduction Résultats Discussion Perspectives
10
Evolution de la structure CRISPR
Acquisition polarisée adjacente à la séquence leader Perte interstitielle de spacers Les spacers communs renseignent sur un ancêtre commun
Le polymorphisme des spacers est un indicateur phylogénétique
DR’DR sp2sp3Leader sp1
sp4Leader
ADN invasif
DR’DR sp2sp3 sp1
++
=
CasCas
Introduction
Introduction Résultats Discussion Perspectives
11
Problématique
Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son
parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur
de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure
minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences
adjacentes sur le même génome
Introduction
Outils informatiques pour faciliter l’exploration, la compréhension et l’utilisation des CRISPRs
Introduction Résultats Discussion Perspectives
12
PLAN
Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse
Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie
Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie
Perspectives Les metagenomes
Introduction : Les CRISPRs avant 2006Etat des lieux But de la thèse
RésultatsInvestigation des CRISPRsLe CRISPR pour la phylogénie
DiscussionInvestigations du CRISPRUtilisation du CRISPR pour la phylogénie
Perspectives Les metagenomes
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
13
Outils informatiques créés
Analyse systématique de tous les CRISPRs
des génomes séquencés
Analyse systématique de tous les CRISPRs
des génomes séquencés
Utilisation du CRISPR pourla phylogénie intra-espèce
Utilisation du CRISPR pourla phylogénie intra-espèce
• Créer une base de donnéesAnalyser les séquences flanquantesStocker les DRStocker les spacers (tronçons de virus) Effectuer des BLAST
CRISPRdb
• Analyse de la microévolutionComparaison des CRISPRsIdentifier les spacersConstruire un catalogue par espèce
CRISPRcompar
Données Gold Oct. 2005315 génomes complets
804 procaryotes en cours
Introduction
Identifier les CRISPRs
Introduction Résultats Discussion Perspectives
14
Les programmes utilisés
Patscan
p1=24...47 15...70 p1
Consensus pattern (60 bp):GTGTTCCCCGCGCATCGCGGGGGTTGAAGGGTCAGGTCTGCATCAACGATCGCCCACTCC TRF
Repeat size
Start position
Programmes non spécifiques aux CRISPRs Besoin de traitement manuel supplémentaire
Besoin d’automatisation Définition des limites du DR
REPuter
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
15
Création de CRISPRFinder
CRISPRFinderA Aa cb d
Utilisation de Vmatch (Reputer)
-Liste des répétitions maximales ayant une taille bien définie, séparées par des séquences de taille prédéfinie
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
16
Les bornes du DR: DR consensus
GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA ATGTTCGACGATTTATTTTATTTGTATTTCAG
GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA ATTTATTAAAGATGCTGACAAAAAGAACTTAA
GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA GTCAACGCTTCACTCCCTGCGCGGGGTATAAC
GTTCACTGCCGCACAGGCAGCCCAATAA
CRISPRFinder : difficultés (1)
29 pb
Y. pestis C092 Positions : 1773655-1773862
!
La taille des spacers
Clostridium botulinum A3 Positions : 131045- 131754
30 pb Entre 21 et 37 pb
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
17
CRISPRFinder : difficultés (2)
1 AGGTTTTGCTGCCTTTTCGGCGGGTATC TCAAAGTCAACTTGTAAATGACGATTTTCACG 32
2 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC AGTTTGGGGCTGAGTTTGCCATTTTCCTAAAT 32 3 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC GATGAAGCAGACCACCTCGATTACCCCACGCT 32 4 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC ACTATTTATCAAGACCTTCTTTAAAATCAAAC 32 5 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC AGTTTGGGGCTGAGTTTGCCATTTTCCTAAAC 32 6 ATTTTCAGCTGCCTATTCGGCAGGTCAC
(4626121)
(4626448)
** ** * * **
Shewanella sp. ANA-3 (CRISPR_2)
Yersinia pestis KIM (CRISPR_4)
1 TTATTGGGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC GTTATACCCCGCGCAGGGAGTGAAGCGTTGAC 32
2 TTTCTAAGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC TTAAGTTCTTTTTGTCAGCATCTTTAATAAAT 32 3 TTTCTAAGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC CTGAAATACAAATAAAATAAATCGTCGAACAT 32 4 TTTCTAAGCTGCCTGTGCGGCAGTGAAC
(2875721)
(2875928)
** **
Sulfolobus tokodaii str. 7 (CRISPR_2)
7 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG TGATTGATCACAATGAGAAGACTGTAAAGCTGATAAAC 38 8 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG TGTTGAGGCATAAATTAATCTATCCTTAATGAAAAAT 37 9 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG TTCTTCCTCAGCCTCCATTTTGTTTATGATTTGTAGTGCC 40 10 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG TTCAATAATCTCTATCTTTCCAAAATCTGTAAATGAAGAC 40 109 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG AAAGCACAGTCAATAACGTTATCTGGTATCATATTATCAAA 41 110 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG CTTTCTCCTTCCCTCTGATCTCTCGCTGAATTGAAAAGA 39 111 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAAG GTAAGTATTGATGCTAACATTGACTTCGCTGTCCCAGGGGC 41 112 GATGAATCCCAAAAGGAATTGAAGG AAGTATAATAACGATAGTACTAAAATTAATTGATCC 36
113 GATGATTCTCAAAAGGAATTGATAA * * ***
(32702)
(39896)
Le DR dégénéré
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
18
CRISPRFinder : difficultés (3)
Aquifex aeolicus VF5 NC_000818_6, positions : 988518-988611
GTTCCTAATGTACCGTGTGGAGTTGAAAC TTTTCGTAAGCTCTTGAAGCGCTTGTTTAAGTTCCT GTTCCTAATGTACCGTGTGGAGTTGAAAC
Alignement des leader
Les petits CRISPRs
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
19
Les grandes étapes de CRISPRFinder
Sequence(s)
Localisations possibles
DR DR23bp - 55bp
25bp - 60bp
DR’ DR DR
23bp - 55bp
[0.6DR - 2.5DR]
2
3 DR DR[ , ]
Vérification de la structure
Elimination desRépétitions en
tandem
Identification des DR candidatsCRISPRsputatifs
CRISPRs confirmés
?
Vérification des DR aux extrémités
Répétition maximale
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
20
Création de la base CRISPRdb
Filtres ajoutés pour la base
Télécharger les génomes complets sur le site NCBI
ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria
Vérification manuelle
Appliquer CRISPRFinder
Blast des DR et vérification de la terminaison
Vérification de la taille des DR et spacers
Filtres sur les CRISPRs putatifs
Validation
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
21
Bilan CRISPRdb
Mise à jour du 05/06/2008
Des CRISPRs de un à presque 300 motifs de long (moyenne : 23) (22 pour les bactéries et 27 pour les archées)
Une espèce peut posséder jusqu’à 20 CRISPRs (Methanocaldococcus jannaschii)
2 ou plusieurs CRISPRs de DR identiques ou différents
Les CRISPRs constituent presque 1% du génome qui les portent (1,1% chez Sulfolobus tokodaii)
Les souches d’une même espèce ne partagent pas toujours les mêmes CRISPRs
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
22
PLAN
Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse
Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie
Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie
Perspectives Les metagenomes
Introduction : Les CRISPRs avant 2006Etat des lieux jusqu’à fin 2005But de la thèse
RésultatsInvestigation des CRISPRsLe CRISPR pour la phylogénie
DiscussionInvestigations du CRISPRUtilisation du CRISPR pour la phylogénie
Perspectives Améliorer les outils Les métagénomes
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
23
Le CRISPR pour la phylogénie intra-espèce
Mécanisme d’évolution par délétion ou par insertion polarisée
Analyse de multiples allèles de différentes souches pour un locus CRISPR donné
Lorsque l’espèce contient un ou plusieurs CRISPRs Lorsque le CRISPR présente un polymorphisme intra-
espèce important
Espèces jeunes (Y. pestis, M. tuberculosis) ou complexes clonaux (Pseudomonas aeruginosa) contrairement aux espèces plus anciennes (Y. pseudotuberculosis, M. canetti)
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
24
Investigations (1)
Identification d’un (plusieurs) CRISPRs Consultation de la base CRISPRdb Utilisation de CRISPRFinder
Quantifier le polymorphisme du CRISPR
Utilisation de CRISPRcomparison MyCRISPRdb
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
25
Investigations (3)
Choisir les amorces PCR : 20-30pb à 40 pb du CRISPR
Flankalign CRISPRcomparison
sp4Leader DR’DR sp2sp3 sp1
F1 R1 R2
Résultats
Manipulations techniques sur une collection représentative d’une espèce (amplification PCR et séquençage)
Introduction Résultats Discussion Perspectives
26
Analyse des données (1) Constituer un catalogue de spacers
http://crispr.u-psud.fr/crispr/Dict/Dict.php
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
27
Analyse des données (2)
TableCodedAlleles
Fichier binaire
Strain Ref-Seq Spacers1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Microtus NC_005810 1 1 1CO92 NC_003143 1 1 1 1 1 1 1 1KIM NC_004088 1 1 1Antiqua NC_008150 1 1 1 1 1 1Nepal516 NC_008149 1Pestoides-F NC_009381 1 1 1 1 1 1
Organisation des locus CRISPR dans six souches Y. pestis
Fichiers de sortie
Résultats
Introduction Résultats Discussion Perspectives
28
PLAN
Introduction : Les CRISPRs avant 2006 Etat des lieux jusqu’à fin 2005 But de la thèse
Résultats Investigation des CRISPRs Le CRISPR pour la phylogénie
Discussion Investigations du CRISPR Utilisation du CRISPR pour la phylogénie
Perspectives Les metagenomes
Introduction : Les CRISPRs avant 2006Etat des lieux jusqu’à fin 2005But de la thèse
RésultatsInvestigation des CRISPRsLe CRISPR pour la phylogénie
DiscussionInvestigations du CRISPRUtilisation du CRISPR pour la phylogénie
Perspectives Améliorations des outils Les métagénomes
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
29
Comparaison de PILER-CR, CRT et CRISPRFinder
PILER-CRRapiditéPeu de faux positifs
CRTRapiditéTrouver le DR dégénéréDéfinition du DR consensus
MaisDR dégénéréDR consensusPetits CRISPRs
Faux positifsChevauchement de CRISPRsPlusieurs propositionsPetits CRISPRs
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
30
Comparaison de PILER-CR, CRT et CRISPRFinder
Streptococcus sanguinis SK36,
TTTGCAGTCCCCTCTCGAGGTGACTGGGG TTTCTGACATAATCAGGATGGTGTTTATAGTTATGCAGAAAAAGG
GTTTCCGTCCCCTCTCGAGGTGATTGGGG GTTCTAAATGTTTTGAAGATGTTTCTATGAATCCATCTAGTAT
ATTTCTGTCCTCTTTAGAGGTGAATTGGG GTTGTTACAAACCTATTTACATATAAGTTTCTAGGTAGTAAGTA GTTTCCGTCCCCTTTCGAGGTAACTGGGG TGAATTACTGATTACATTGTATTTAAAAATCATTGGTCTAGCGGA GTTTCCGCCCCCTTTCGAGGTGACTGGGG GTTCTAACAGACTAGAGTATTACAGTTACCGAGAACAAACAGACAT
GTTTCCGCCCCCTCTCGAGGTGACTGGGG GGTCTTACCTATCTTGCTGCTGTTCTTATACACGCTAATGCCGTCTA GTTTCCGTTCCCTCTCGAGGTGAATGGGG GTTCTTACAAAATATACTACCGAAGTAAAAGTAGGTAACATTTCATA
GTTTCAGTACCCTCCCGAGGTCACTGGGG GTTCTTACTGAAGCGCTCACATCTAACTCCAAATTAAAGCAA GTTTCCGCCCCCTCTCGAGGTGAATGGGA GGTCTTACGAAAGCCAGGAAGACCTAAAGGAAGGACAAAATTTCC GTTTTCGTCCCCTCCCGAGGTGAATGGGG GGTCTTACATCGCTTGAAACTAAAAGATAGTTATTTTGGAGAAGAA
GTTTCCGTACCCTCTCGAAGTGAATGGGG ATTCTTACGCTAGAAAATTGAAACAACAACGTAAAACCTCC GTTTCCGTACCCTCGCGAGATGAATGGAG TTCTTACACAAAGACGAACACGGCGTATCTCAATTAGGACTTA
GTTCCCGTACCCTATCGAGCTGACTGGGG TTTCTTACAAAGACGTTGCTGTTCCTGTCCTTATTGGCGTTACTAG TTTTCCGTACCCTTCCGAGGTGAATGGGG GTTCTGACCGATTGAGAGTAAAGAGGGCGAAGAAAACTGCTAG GTTTCCGTCCCCTCTCGAGGTGTTTGAGG TTTCTTACTCAAACTGTACCTAACCTTTATACAGAAGAGAATAT
GTTTCCGTACCCTTGCGAGATAACCGAGA GCTCTCACATAAAGTAGAGATTGTCAAGACTTAAATGAGCAAG GTTTCCGCCCCCTCGCGAGGTGATTGGGG TGTCTTACATTCAGGCATTGGAATTTTAGAACTTGATGATTT
GTTCCCGTACCCTCCCGAGGAGACTGGGG GTTCTAACCTTTTGACAAAAAACTAGATACTGAATATCTGGAACT GTTTCCGTACCCTCCCGAGGAGACTGAGG GTTCTTACCAAGACAAAGTTGAAGTGTCTGAAGACTTCCTGGC TTTTCCGTCCCCTCTCAAGGAGACTGGGA GGTCTTACAAGCTTGCTCACTATGTCTATGAGACTAAGACCTATTT
GTTTCCGCCCCCTCCCGAGGTGAATGGGA
PILER-CR CRT
NON NON
Oui, mais Oui, mais
NON NON
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
31
Problématique
Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son
parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur
de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure
minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences
adjacentes sur le même génome
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
32
Organisation du CRISPR (1)
Structure secondaire (kunin 2008)Clustering des DR (12 groupes) (kunin 2008, Horvath 2008)
DR
DRLe DR :
Espèce taille DRBacteroides fragilis 47 GCTGTTTCCAATGGTTCAAAGATACTAATTTGAAAGCAAATCACAACStreptococcus pyogenes 36 GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAAC Mycobacterium tuberculosis 36 GTCGTCAGACCCAAAACCCCGAGAGGGGACGGAAACEscherichia coli 29 CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACTCYersinia pestis 28 GTTCACTGCCGCACAGGCAGCTTAGAAA Pyrobaculum aerophilum 25 CCAGAAATCAAAAGATAGTTGAAAC
Thermotoga petrophila 30 GTTTCAATAGTTCCTTAGAGGTATGGAAAC
Taille : 23-47pb, terminaison particulière : (C/G)AA(A)(G/C)
Diversité d’un CRISPR à l’autre (533 DR distincts pour 873 CRISPRs) Conservation presque parfaite au sein d’un même CRISPR
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
33
Organisation du CRISPR (1)DR
Verminephrobacter eiseniae : 294 DRs exactement identiques
Un système de maintenance de l’intégrité du DR?
GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CGATCAGCTTGACGATCGTGGAGTGTATTACCGACTTCTGCTCCTCGG
GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CGTAGTGGTAATCTCTAATCTCTCTAATGATGTCCTCATTCTCCA GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CTTCATGACCGCATTAAATATATCGGGGTCTTGCATTGCTAC
GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CCTCGAGGAAGGCGTGGGGATCCCTGGCCAGCAGCTCAGCC GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG TTTAACCGCAGAAACTTGTCGATAACTGAAAAAACGGGGTTG
GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG TTGTACTCTTATAGAAACGTATTGTGGCCACCTTACGGCGGAGTG GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CAGTCTCCGCGGATGCTTGTGCATCGTTCGGCGCCGACAACTCA GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG ATCTTCACAGCGTAGTACACCTGCGTGTGGCTGAGGGAGAG
GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CGTCTAGGACGAGGGGCACTATCATTATGCGCCTGTCC GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CTCAGCTTGTAGACGTTCTCCATGTATTCATCGATATAGTACA
GAATCTCAAGTTGAGGATTGAAAG CTCCACCAACGTCCTTATCTCTTTTAGGCATATTTCCATGTATTGG GAATCTCAAAAAGAGGATTGAAAG CAAATACATGTAATACGTTGCAGTATTCTTATACAGCCTACTCTTTAC GAATCTCAAAAAGAGGATTGAAAG AATTGCCCCACGACTTGGGGGAGAGAAACGGCGGCGTGGGGGT
GAATCTCAAAGAGAGGATTGAAAG AGGAGAGCGGCGTCGACGACGTCCGCCCTTCCGGGGAACTTGGGA GAATCTCAAAAAGAGGATTGAAAG ATAACATCCATAAGGTTTATTGGTCGTGCGAATGGCACCTCTTCATTGGGCAGA
GAATCTCAAAGAGAGGATTGAAAG TCCACCACAGAGCCCGTAATTGTATACCACCGCGAATACCT GAATCTCAAAGAGAGGATTGAAAG ATCTGTATATGCGCCAACCTGTCAATAAGCGGGTCTGCGTTTT GAATCTCGAAGAGAGGATTGAAAG TGCACCGGAATGCACCGGAAAACCTACACTGTGCCCCTGA
GAATCTTAAGTTGAGGATTGAAAG
Thermoproteus neutrophilus
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
34
Organisation du CRISPR (2)
Taille constante ou variable Signature particulière sur le génome d’origine (proto-
spacer) (Deveau 2008) Identification de virus à partir des spacers (Andersson,
science 2008) Le même spacer sur deux CRISPRs différents du
même génome ou chez des souches voisines Duplication ou acquisition indépendante d’un spacer
sur le même CRISPR (Horvath 2008) 417 spacers présents en deux copies parmi 21497 (< 2%) 89 souches parmi 712 (~13%)
DR
Les spacers :
Methanothermobacter thermautotrophicusus
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
35
Problématique
Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son
parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur
de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure
minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences
adjacentes sur le même génome
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
36
Démonstration du rôle du CRISPR
Implication dans l’acquisition d’une résistance contre les phages (Barrangou et col., Science 2007), (Horvath 2008), (Devau 2008)
Discussion
Modèle interférence ARN chez les procaryotes (Makarova 2006)
-Autre rôle? - Régulation de certains gènes?
Introduction Résultats Discussion Perspectives
37
Problématique
Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son
parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur
de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure
minimale transposée Transposition des CRISPRs et des séquences
adjacentes sur le même génome
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
38
Confirmation de l’acquisition polarisée
Le CRISPR NC_007503_3 de Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901.Le DR jaune + le leader chez NC_007503_3 et NC_007503_4
Acquisition polarisée : (lillestol 2006), (Barrangou 2007), (Horvath 2008),(Tyson& Banfield 2008), (Andersson 2008)
Discussion
Leader
Introduction Résultats Discussion Perspectives
39
Acquisition de nouveaux motifs
sp4Leader
Leader DR’DR2 sp2 DR1sp3DR3 sp1
sp4DR3copie
Leader
Leader DR’DR2 sp2 DR1sp3 sp1
DR’DR2 sp2 DR1sp3 sp1DR3
DR3
sp4DR3copie
DR’DR2 sp2 DR1sp3 sp1DR3DR3
Comment le dernier motif est-il ajouté?ADN invasif
DR3copie
Le DR adjacent au leader est le dernier DR acquis ou le premier DR acquis?
sp4
Leader DR’DR2 sp2 DR1sp3 sp1
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
40
Problématique
Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son
parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur
de microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure
minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences
adjacentes sur le même génome
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
41
Le CRISPR comme marqueur phylogénétique
Avantages: Facilité technique (PCR ou spoligotypage) Rapidité Importation et échangeabilité inter-laboratoires
Limites: 60% des bactéries n’ont pas de CRISPR Acquisition indépendante du même spacer CRISPR non polymorphes ou absents (Lactobacillus casei ) CRISPR très polymorphe (Y. pseudotuberculosis, M. canettii)
Bon outil de différenciation de souches + outil complémentaire pour étudier la micro-évolution
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
42
Problématique
Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son
parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de
microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure
minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences
adjacentes sur le même génome
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
43
Même leader et même DR
Transport à travers les plasmides (Godde 2007)
Legionella pneumophila Lens
Le même DR chez des espèces éloignées
Discussion Transfert horizontal du CRISPR
%GC différent du reste du génome (Horvath 2008)
Introduction Résultats Discussion Perspectives
44
Problématique
Comprendre l’organisation de la structure CRISPR Comprendre l’origine et le rôle du CRISPR Comprendre le fonctionnement du CRISPR et son
parcours évolutif Outil de génotypage : le CRISPR comme marqueur de
microévolution? Transfert horizontal : détermination de la structure
minimale transposée chez différentes bactéries Transposition des CRISPRs et des séquences
adjacentes sur le même génome
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
45
Création d’un nouveau CRISPR
Les essaimages de CRISPRsUn seul groupe de gènes associésLe même DR (quelques déviations parfois)Spacers différentsHypothèse : structure minimale transposée
formée d’un leader et un DR
DR
DR
Discussion
Introduction Résultats Discussion Perspectives
46
PLAN
Introduction : Les CRISPRs avant 2006Etat des lieux jusqu’à fin 2005But de la thèse
RésultatsInvestigation des CRISPRsLe CRISPR pour la phylogénie
DiscussionInvestigations du CRISPRUtilisation du CRISPR pour la phylogénie
PerspectivesAméliorations des outils Les métagénomes
Perspectives
Introduction Résultats Discussion Perspectives
47
Perspectives (1)
Investigations des petits CRISPRs Confirmation des CRISPRs putatifs (blast DR, …) Vérifications manuelles? Recherche des gènes cas Recherche de proto spacer
Epidémiologie, phylogénie (Projets en cours)
Exploitation des données de métagénomes Explorer des génomes de l’environnement (communautés
multi-espèces) Nature des CRISPRs, statistiques, transfert horizontal… Exploration des phages pour chercher les proto-spacer et
identifier leurs sites de reconnaissance Stockage des DR et des spacers avec possibilité de BLAST
Perspectives
Introduction Résultats Discussion Perspectives
48
Perspectives (2)
Diversité des DR : 24-43 pb Nombre de motifs : jusqu’à plus de 250 motifs
Perspectives
Institut de Génétique et Microbiologie
LES CRISPRS, INSTRUMENTS D'ETUDE DE L'EVOLUTION INTER ET INTRA-SPÉCIFIQUE
CHEZ LES MICROORGANISMES
Soutenance de thèse, le 24 Juin 2008, IGM
Ibtissem GRISSA