Bull Cancer/Radiother 1996$33:3-T 0 Elsevier, Paris

Le traitement des cancers du pharynx

IntMt de la recherche des anticorps spkifiques du virus d’Epstein-Barr pour le diagnostic et la surveillance du carcinome

indiffkrencib du nasopharynx

MC Mazeron

Service de bacteriologic-vtrologie, hopital Lariboisiere, 2. rue Ambroise-Pure, 75010 Paris, France

R&sum& -L’associationentre le carcinomeindifferenciedu nasopharynx (NPC) et l’infection par le virus d’Epstein-Barrse traduit parlapresence chez ces patients d’anticorps h titre eleve diriges contre les antigenes viraux et en particulier d’anticorps de type IgA spkcifiques des antigenes precoces (EA) et des antigcnes de capside (VCA). Ces anticorps precedent l’apparition de la tumeur. Leur titre s’elbve avec la progression de la tumeur et se stab&e ou diminue progressivement avec la reponse au traitement. La survenue d’une metastase ou d’une recidive locale est prCc&fdCe d’une nouvelle elevation de ces anticorps. Leur detection n’aque peu d’interet diagnostique mais la surveillance serologique des malades trait& permet de prevoir recidives et metastases, ce qui justifie la constitution de serothkque, permettant la comparaison des titres d’anticorps anti-EBV avant traitement et au tours de l’evolution apres traitement.

cancer du cavum / sCologie /virus d’Epstein-Barr

Summary - Value of anti-Epstein-Barr antibody detection in the diagnosis and management of nasopharyngeal carcinoma. The EpsteinBurr virus (EBV) is associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC). Serological studies have shown that the clinical onset of NPC is preceded by the appearence of a high antibody titer of IgA to viral capsid antigens and early antigens. The titers increase with the tom1 tumor burden und the antibodies decline with the response to therapy. In patients with confirmed clinical remission elevation of IgA serological titers is highly significant,for prediction of relupse. This demonstrates the usefulness of EBV serologyfor the clinical management of NPCpatients.

Epstein-Barr virus / nasopharyngeal cancer/serology

L’association entre le carcinome indifferencie ou peu differencie du nasopharynx (NPC) et l’infection par le virus d’Epstein-Barr (EBV) est connue de longue date [ 13, 291. L’EBV, qui appartient a la famille des herpes virus, est, comme les autres membres de cette famille, un virus ubiquitaire, instaurant une infection persis- tante apres la primo-infection qui se traduit chez l’adolescent et l’adulte jeune par la mononucleose in- fectieuse. Capable d’induire la proliferation des lym- phocytes B in vivo et in vitro, le virus est associe a divers lymphomes [21], en particulier le lymphome de Burkitt africain [8]. Son role dans le processus tumoral au tours du cancer du nasopharynx reste incompris, et divers cofacteurs, genetiques et environnementaux no- tamment, ont et6 identifies [ 1,281. Un profil tres carac- teristique de la reponse humorale des patients vis-a-vis des antigbnes viraux est associe au NPC. De nouvelles

approches de detection des anticorps specifiques des antigenes viraux se developpent et sont en tours d’tva- luation dans le diagnostic et la surveillance des NPC.

L’INFECTION z& EBV

Lors de la primo-infection, I’EBV se replique dans les cellules Cpitheliales oropharyngees, et les lymphocytes B circulants s’infectent au contact des cellules epithe- liales productrices de virions. 11 en resulte une lympho- proliferation polyclonale qui induit une forte rtponse immunitaire a mediation cellulaire. Les lymphocytes T cytotoxiques et NK limitent la proliferation des lym- phocytes B. Le role de la reponse humorale dans le controle de l’infection est encore peu connu. Un Ctat d’equilibre s’installe avec l’infection latente d’un petit pourcentage de lymphocytes B tandis que le virus est

4 MCMazeron

excrete de facon chronique des cellules Cpitheliales oropharyngees, entretenant le cycle Cpidemiologique.

Antigenes viraux

L’infection latente dans les lymphocytes B est caracte- risee par le maintien du genome sous forme Cpisomale, forme circulaire qui se replique en mCme temps que I’ADN cellulaire pendant la phase S du cycle, en utili- sant 1’ADN polymerase cellulaire. Une expression par- tielle du genome avec production des proteines EBNA (Epstein-Barr nuclear antigen), des proteines latentes membranaires (LMP), et de deux petits ARN dits EBER (EBV-Encoded Small RNAs) est observee. Les proteines EBNA, localisees au noyau, sont au nom- bre de six : EBNA-1 maintient le genome sous forme Cpisomale, EBNA-2 est indispensable a l’initiation de l’immortalisation, EBNA-3 consiste en trois proteines EBNA-3a, 3b, 3c de fonction inconnue, tandis qu’EBNA-4 ou LP (leader protein) est un ensemble po- lymorphe de proteines, egalement de fonction incon- nue. La LMP se trouve sous deux formes : insoluble, like a la membrane cellulaire et soluble dans le cyto- plasme. Trois proteines de membrane sont exprimees dans les lymphocytes : LMP 1, LMP2a et LMP2b. Une propriete oncogene a et6 reconnue pour LMP- 1 in vitro, dans des cellules de rongeurs, dans les keratinocytes humains (lignee RHEK-1) [lo] et chez la souris nude. En outre, les EBER 1 et 2, de fonction inconnue, sont presents araison de 106-7copies par cellule. L’infection latente peut devenir lytique apres activation spontanee ou provoquee par differents inducteurs.

Lors de l’infection lytique, induite notamment par la proteine transactivatrice tres precoce Zebra, les protei- nes precoces, dites EA (early antigen), apparaissent. Parmi ces proteines precoces figurent en particulier des enzymes virales necessaires a la replication du genome viral, telles que I’ADN polymerase, la thymidine ki- nase, la desoxyribonuclease (DNase). Apres le debut de la replication de I’ADN viral, apparaissent les pro- teines tardives, comprenant les proteines constitutives de la capside virale (VCA) et les antigenes portes par l’enveloppe du virion et la membrane de la cellule in- fectee, ou antigenes de membrane (MA).

Dbtection des anticorps spkcifiques des antigenes viraux

Les lymphocytes B du sang ptripherique, infect& et immortalists par I’EBV, constituent les lignees lym- phoblastoides. Les techniques de reference dkelop- pees au debut des annees 70 pour la detection et le titrage des anticorps sptcifiques de I’EBV reposent sur

l’immunofluorescence indirecte a l’aide de cellules de lignees lymphoblastoi’des exprimant differents antige- nes. La lignee P3HRl produit les VCA, la lignee RAJI non induite les EBNA, et induite par le tetradecanoyl phorbol acetate (TPA)/butyrate, les EA. Selon leur sen- sibilite au methanol, les EA sont divists en deux clas- ses : les EA-D (diffus, a la fois cytoplasmiques et nu- cleaires, resistants a la fixation par le methanol), et les EA-R (restreints au cytoplasme, sensibles B la fixation par le methanol). Les techniques habituelles recher- chent les anticorps anti-VCA, EA-D, EA-R et EBNA, ce qui permet d’etablir des profils serologiques carac- ttristiques des differentes formes d’infection a EBV.

Methode de reference, l’immunofluorescence a ce- pendant de nombreux inconvenients. Elle n’est pas automatisable et ne s’adapte done pas aux grandes se- ries ; la lecture en est subjective, necessitant un person- nel qua156 ; de plus, les antigbnes detect& ne sont pas parfaitement definis sur le plan moleculaire : il s’agit de complexes de proteines et les anticorps diriges con- tre des proteines differentes ne sont done pas individua- lises. Pour eviter les inconvenients de la reaction d’im- munofluorescence, des tests Elisa utilisant des antigbnes cellulaires semi-purifies sont proposes [7, 231. Des discordances existent entre les resultats obte- nus par ces deux methodes. L’etude des Cpitopes les plus immunogenes, prtferentiellementreconnus par les anticorps des patients, est en tours [24]. Des antigbnes parfaitement definis sur le plan moleculaire, tels que des proteines recombinantes ou des peptides de syn- these, sont developpts actuellement, et certains, com- mercialises [ 121. Des tests (non encore commerciali- ~6s) permettent la detection d’anticorps specifiques de l’activateur tres precoce Zebra [14], de la thymidine kinase virale [5], de I’ADN polymerase, de la desoxy- ribonuclease (DNase), d’EBNA- 1 ou de proteines tar- dives membranaires. Les anticorps anti-DNase ou thy- midine kinase sont recherches soit par l’ttude de l’activite enzymatique, soit par la technique Elisa ou western-blot.

LE VIRUS D’EPSTEIN-BARR DANS LE CANCER INDIFFkRENCIk

DU NASOPHARYNX

Contrastant avec ladistribution mondiale de l’infection a EBV, la repartition du NPC fait apparaitre trois grou- pes de regions. Les zones a haut risque comprenant 1’Asie du Sud-Est avec notamment la Chine du Sud, Taiwan, le Vietnam, I’IndonCsie et la Malaisie, et le Groenland ont une incidence de 12 a 20/100 000 par annee. L’Afrique du Nord, avec une incidence de 1,5 a 9/100 000 par annee, constitue une region a risque

La sCrologie EBV au tours du cancer du nasopharynx 5

moyen, tandis que le reste du monde comprenant 1’Europe et I’Amtrique avec une incidence de O:l a 0,2/100 000 est une region a faible risque. Le genome viral est toujours present dans les cellules tumorales [29]. Un seul clone viral est associe a une tumeur, comme le montre l’etude de la structure des repetitions terminales du genome [ 191. Celui-ci se presente sous forme tpisomale, a raison de 20 a 100 copies par cellule, mais son integration au genome cellulaire a ttt d&rite dans quelques cas [ 151. Son expression dans les cellules tumorales est limitee [9, 17, 201. La proteine EBNA-1 est constamment exprimee, alors que les au- tres proteines EBNA ne sont pas detectables. La pro- teine latente membranaire 1 (LMPl) n’est observte que dans 37 a 65 % des tumeurs [9, 261. Les ARN EBER sont presents. La proteine Zebra a CtC dbtectee dans les cellules tumorales de huit biopsies etudiees [4, 171.

RCponse humorale aux antig&es viraux

Le profil serologique observe au tours du NPC est con- nu depuis les travaux de Henle [ 131.11 se caracterise par la presence, a titre ClevC, d’anticorps specifiques des trois types d’antigenes, et par la detection d’anticorps de type IgA diriges contre les VCA et les EA (tableau I). Ce profil serologique differe nettement de ceux ob- serves respectivement apres la primo-infection et dans le lymphome de Burkitt associe a I’EBV.

InttWt diagnostique de la recherche des anticorps spkcifiques de 1’EBV Les patients porteurs d’un NPC ont des anticorps anti- VCA a titre ClevC et des anticorps anti-EA, en particu- her la composante EA-D. Le titre des anticorps anti- VCA au tours du NPC est dix fois superieur a celui observe dans d’autres populations et les titres d’anti- corps anti-VCA et anti-EA s’elbvent avec le stade de la maladie. Plus de 80 % des porteurs d’un NPC ont des anticorps de type IgA diriges contre les antigenes du virus (VCA et EA), alors que dans une population te- moin, constituee de sujets porteurs d’un autre type de cancer de la t&te et du cou, seulement 5 a 15 % d’entre eux expriment ces anticorps. La presence d’anticorps IgA anti-VCA est le marqueur le plus sensible, mais la presence d’anticorps IgA anti-EA est plus specifique du NPC.

La majorite des serums de patients porteurs d’un NPC, y compris au stade precoce de la maladie, neutra- lise l’activite DNase virale. Des anticorps anti DNase de type IgA sont detect& par technique Elisa dans 91 % des cas de NPC [3]. De la m&me fagon, les anticorps neutralisant l’activite thymidine kinase peuvent stre demontres [ 161. La presence d’anticorps anti-Zebra (le

Tableau I. Profils sCrologiques caracttristiques observes au tours de l’infection par le virus d’Epstein-Barr, par immunofluorescence indirecte.

VCA EA EBNA

IgG IgA IgM IgG IgA IgM IgG IgA

Absence MNI’ ++ +++ tl- +I- - PIA + - + - LB’ ++ - t tt - NPC +tt +t - tt tt tt+ t

’ : mononucl6ose infectieuse ; z : ptimo-infection ancienne ; 3 : lymphome de Burkitt associC au virus d’Epstein-Barr ; 4 : carcinome indiffkrencit du sasopharynx.

plus souvent de type IgG) a ttC detectee chez 87 % de 41 malades testes [ 141.

La presence d’anticorps specifiques des antigbnes de L’EBV apparait comme un marqueur du NPC.

Utilisation de la sbrologie virale pour le dkpistage des cancers dans des populations ci risque De vastes enqu&tes epidemiologiques ont Cvalut l’in- t&&t de la recherche des anticorps pour dtpister des patients ayant developpe ou en voie de developper un cancer dans les regions de forte incidence. De 1978 a 1986, des anticorps de type IgA anti-VCA ont &te re- cherches dans plus de 300 000 serums provenant de sujets de plus de 30 ans en Chine du Sud [27]. Par exemple, dans la ville de Wuzhou, 20 726 personnes agees de plus de 40 ans ont CtC Ctudiees : 1 138 avaient des anticorps anti-VCA, et un NPC a&C decouvert chez 18 d’entre elles, tandis que chez 21 autres, le cancer Ctait reconnu au tours des 5 annees de surveillance sui- vantes. De plus, ce depistage a permis un diagnostic a un stade plus precoce, 38,5 % des cancers Ctant detect& au stade I et 53,8 % au stade II alors que, chez les pa- tients des consultations spbcialisees de la ville, le pour- centage des cancers de stade I n’ttait que de 1,7 %, et celui des stades I et II confondus de 31,5 %. L’inci- dence annuelle des NPC Ctait 7,4 fois plus ClCvCe dans la population IgA VCA positive que dans la population g&&ale. Des resultats similaires ont CtC obtenus dans une autre etude, pratiquee dans la region de Zangwu. Les anticorps neutralisant l’activite DNase sont Cgale- ment observes precocement chez les patients risquant de developper un NPC [2]. L’absence de correlation parfaite entre la presence de ces anticorps et la presence d’ IgA anti-VCA en fait un marqueur supplementaire du NPC.

Les surveillances serologiques sur plusieurs annees permettent de classer les patients en trois groupes en

6 MC Mazeron

fonction de l’evolution du titre des anticorps de type IgA : negativation de la serologic IgA, maintien d’un titre stable ou augmentation des titres. Les NPC sont detect& dans ces deux derniers groupes.

La strologie EBV permet done, dans les zones de forte incidence du NPC (le Sud-Est asiatique en parti- culier), de reconnaitre les individus a tres haut risque de developper un cancer. Les anticorps de type IgA specifiques de 1’EBV precedent la survenue du cancer.

Recherche d’un cancer primitif devant we m&zstase cervicale En presence d’une metastase cervicale, la mise en Cvi- dence d’anticorps specifiques de 1’EBV oriente la re- cherche de la tumeur primitive vers un NPC. Celui-ci est preferentiellement diagnostique chez les patients ayant des IGA anti EBV [ 181.

Valeur pronostique et surveillance du traitement Le titre des anticorps vis-a-vis des differents antigenes viraux au moment du diagnostic n’a pas de valeur pro- nostique quant a l’evolution apres traitement [6]. Une bonne reponse au traitement s’accompagne d’une sta- bilisation ou d’une diminution des titres d’IgA et IgG anti-VCA, et IgG anti EA-D. Une elevation des titres precede l’apparition de metastases ou une rechute lo- cale [6]. Les anticorps neutralisant l’activite DNase sui- vent la mCme evolution tandis que les anticorps anti- EBNA restent stables [22].

La comparaison des titres n’est possible que si les s&urns ont CtC testes ensemble au tours de la meme serie, ce qui implique la constitution de serothbques pour le suivi de ces patients.

Dbtection des anticorps dans la salive Les anticorps specifiques peuvent Cgalement &tre de- tect& dans la salive. Des IgA secretoires (11s) speci- fiques de VCA et EA-D sont presentes B titre ClevC dans la salive dans respectivement 7.5 % et 35 % des cas. La presence d’IgA (7s) specifiques d’EBNA 1 est carac- teristique du NPC, ces anticorps Ctant detect& chez 84,8 % des malades et chez seulement 7,1 % des te- moins [ 111. De m&me des anticorps de type IgA, diriges contre la glycoproteine gp340, sont retrouves preferen- tiellement chez les porteurs de NPC [25].

CONCLUSION

Le NPC est constamment associe a I’EBV et la reponse serologique vis-a-vis des antigenes sptcifiques de l’EBV, parses caracteristiques et sa constance, apparait comme un marqueur de la maladie. Elle precede l’apparition de la tumeur et, dans les regions de forte

incidence du cancer, la detection systtmatique de ces anticorps a permis le depistage, a un stade prtcoce, de NPC. Cependant un test de depistage fond6 sur la mise en evidence de ces anticorps specifiques semble diffi- cilement generalisable, du fait du faible pourcentage de diagnostics ainsi obtenus, m&me dans les regions a haut risque. L’apport de la serologic virale lors du diagnostic de la tumeur est faible, le titre et la nature des anticorps n’ayant pas de valeur pronostique. En revanche, la sur- veillance strologique des malades trait& permet de prevoir les recidives et les metastases et doit done s’in- tegrer au suivi biologique de ces patients. Les techni- ques serologiques de reference reposent sur l’immuno- fluorescence vis-a-vis de complexes antigeniques. La determination des Cpitopes immunogbnes est en tours et permettra, en m&me temps qu’une connaissance plus fine de la reponse humorale au tours de l’infection par I’EBV, la standardisation des techniques entre les dif- ferents laboratoires.

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