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Biocatalyse entre
Biotechnologie Blancheet
Chimie Verte
Katia DUQUESNEMaitre de Conférences - AMU
Groupe BioCat Equipe BioSciences
Institut des Sciences Moléculaires de Marseille – iSm2 [email protected]
PlanA - Biocatalyse
I – Definitions des BiotechnologiesII - BiocatalyseurIII - InterêtIV - Réactions catalysées par les enzymesV - Historique
1ère vague2ème vague3ème vague
B – Apport des Biotechnologies I - Recherche de nouvelles enzymesII - Amélioration des enzymes
1) Evolution dirigée2) Conception rationnelle3) Approches semi-rationnelles4) Les cribles
III – Les nouveaux biocatalyseurs1) Hôte de choix2) Autres hôtes3) Construction de nouvelles souches
C – Biocatalyse et Chimie verteDeveloppement durableChimie verte12 principes appliqués
A - Biocatalyse
Biotechnologie : intégration des sciences naturelles et des sciences de l'ingénieur en vue de l'utilisation d'organismes, de cellules, de certains de leurs éléments et de leurs analogues moléculaires pour obtenir des produits et des services. »
Fédération européenne de Biotechnologie (EFB)
I - Définitions
Biotechnologies
Or, etc…
« Application de la biotechnologie pour la production industrielle de produits chimiques et de bioénergie, qui utilise des cellules vivantes ou leurs enzymes »
Biotechnologies blanches ou industrielles
emploi de systèmes biologiques (bactéries, enzymes, levures)
pour la fabrication, transformation, ou dégradation de molécules
grâce à des procédés enzymatiques ou fermentaires
à visée industrielle.
Elles sont utilisées comme alternative aux procédés chimiques
classiques dans un soucis économique et environnemental.
Biotechnologies blanches ou industrielles
Bioénergies : des carburants
Agromatériaux : polymères, construction (isolation, remblai, couleurs et colles), papier (fibres, couleurs, additifs), textile
Biomolécules : dissolvants, détergents, laques, colles et produits d'entretien, produits phytosanitaires, environnement (traitement des déchets)
Ingrédients et actifs : médecine, industrie pharmaceutique et cosmétique, industrie agroalimentaire (acides aminées, vitamines, arômes, colorants) et parfums.
Biotechnologies blanches et applications
Fermen-tation
Biologie de synthèse
Biocatalyse
BioconversionBiotransformation
Produits du métabolisme de microorganismes mis en culture
Biosynthèse
Ingénierie de composants et de systèmes biologiques n’existant pas dans la nature et la réingénierie d’éléments biologiques existants OCDE
Transformation d’un composé ajouté au milieu en un composé d’intérêt
Biologie Synthétique
Biotechnologies blanches
Une réaction catalysée est une réaction chimique transformant une molécule A en molécule B, en une ou plusieurs étapes, à l’aide d’un catalyseur chimique.
Molécule A Molécule B
Catalyseur ou réactif chimique
Molécule A Molécule B
Catalyseur ou réactif chimique
Une réaction biocatalysée est une réaction chimique transformant une molécule A en molécule B, en une ou plusieurs étapes, à l’aide d’un biocatalyseur, c’est-à-dire une enzyme ou une cellule.
Enzyme(s) ou cellules
• Molécule de synthèse• Produit naturel• Molécule biosourcée
• Synthon• Molécule d’intérêt• Produit naturel ou « bio »
La biocatalyse est à l’interface de la Biotechnologie et de la Chimie
Chimie VerteBiotechnologie
Bio
cata
lyse
II – Qu’est-ce qu’un biocatalyseur ?
Molécule A Molécule B
Biocatalyseur
Enzymes • Enzyme libre• Poudre acétonique• Enzyme immobilisée
Cellules entières (whole cells) • Microorganismes, • Algues, • Plantes,• Animaux (microsomes de foie)
• Cellule au repos (resting cells)• Cellules proliférantes• Cellules immobilisées• Spores
1) Accélération des réactions
• ne figurent pas dans le bilan de la réaction • ne modifient pas les constantes d’équilibre• accélèrent la vitesse de réaction par abaissement de la
barrière d ’énergie entre substrat et produit
Les enzymes sont des catalyseurs
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
Energie (sans catalyse)
Les enzymes diminuent l'énergie
d'activation par stabilisation de l'état
de transition
1) Accélération des réactions
• ne figurent pas dans le bilan de la réaction • ne modifient pas les constantes d’équilibre• accélèrent la vitesse de réaction par abaissement de la
barrière d ’énergie entre substrat et produit
Les enzymes sont des catalyseurs
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
Efficacité très élevée par rapport aux catalyseurs chimiques - chimie: 0,1 à 1 %- enzyme : 10-4 à 10-3 %
facteur d’accélération = 108 à 1010 voire 1012 à 1017
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
lipases hydrolysent les esters et pas les amides (amidases)
RCO2R = RCOORRCO2H
RCONH2
lipases
amidases
Chimiosélectivité
Capacité à distinguer entre des fonctions chimiques différentes
Ex: hydrolyse
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
Régiosélectivité
Capacité à distinguer des fonctions chimiques identiques selon leur position sur la molécule
Ex: hydroxylation des stéroïdes
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
• Enantiosélectivité Stéréospécificité
Achiral : superposable
Chiral : miroir, non superposable
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
• Enantiosélectivité Stéréospécificité
Achiral : superposableChiral : miroir
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
• Enantiosélectivité
Composé
Stéréospécificité2 énantiomères présentent des activités physico-chimiques identiques mais peuvent présenter des activités biologiques totalement différentes.
(S)
(Z)
(R)
(Z)
(R)-limonène(S)-limonène
(R)
O
(R)-carvone (S)
O
(S)-carvone
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
Stéréospécificité • Diastéréosélectivité
2 diastéréoisomères présentent des activités physico-chimiques différentes et peuvent présenter des activités biologiques totalement différentes.
C4O4H4
X
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
Stéréospécificité • Diastéréosélectivité
deux diastéréoisomères présentent des activités physico-chimiques différentes et peuvent présenter des activités biologiques totalement différentes.
Vitamine CAcide L-ascorbique (vitamine C) (1a)
Acide D-ascorbique (1b)
Acide L-isoascorbique (2a)
Acide D-isoascorbique (2b)
2) Extraordinaire sélectivité des enzymes
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
prochiralracémique
Composé énantiopurComposé
Stéréospécificité • Enantiosélectivité• Diastéréosélectivité•…/… ~100%
3) Extraordinaire « promiscuité » de substrats
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
Vrai surtout pour les enzymes de dégradation (≠ biosynthèse)
• Promiscuité de substrats Enzyme promiscuitaire(« promiscuous »)
• Promiscuité catalytique ou de réactions
III- Pourquoi utiliser un biocatalyseur?
Molécule A Molécule B
Biocatalyseur
1) Accélération de réactions
2) Sélectivité (chimio, régio, stéréo, énantio)
3) Promiscuité de substrats
4) Capacité à catalyser de nombreuses réactions
IV- Réactions enzymatiques les plus fréquentes (Biocatalyse)
Hydrolyses ……………. hydrolyse d’esters, amides, nitriles, époxydesOxydations ……………. oxydation d’hétéroatomes (S, N, etc…)
hydroxylations (d’atome de C non activé)époxydationsréaction de Baeyer Villigerdéshydrogénations
Réductions ……………. de fonctions simples : C=O , C=Cdéshydroxylationshydrogénation de C=C
Condensations ………… acylationestérificationéthérificationglycosidation
Isomérisations ………… réarrangementsracémisation
Formation de liaisons … C-C, C-N , etc…Dégradations …………… décarboxylations
Avantages et inconvénients des biocatalyseurs A – Avantages1 –Très efficaces :
- Vitesse de réaction élevée / réactions chimiques correspondantes.- Concentration en catalyseur très faible. [biocatalyseur] << [catalyseur chimique].
2 – EcologiqueFacilement dégradés dans la nature à la différence de métaux lourds (Co, Mn...) utilisés
pour la catalyse chimique.
3 – Fonctionnent dans des conditions douces- eau- pH : 5 à 8- Température : 20-40°C
Permet de minimiser les réactions secondaires comme les dégradations, isomérisations, réarrangement, racémisation etc...
4 – Compatibles entre euxPermet de réaliser des processus séquentiels. Déplacement d’équilibre, non isolement
d’un intermédiaire instable.
5 – Spécificité de substrat assez largeCapable de fonctionner sur des familles de substrats.
6 - Grand choix de réactions possiblesPratiquement toutes les réactions de la chimie organique.En plus Hydroxylation des ACNA
7 – ChimiosélectivitéNe réagissent qu’avec un type de fonction :
8 - Régio et diastéréosélectivité (diastéréotoposélectivité)
9 – Stéréo et Enantiosélectivité (énantiotoposélectivité)
Estérase
Lipase
O
COOR
O
COOH
HO
OH
COOR
Epoxyde
hydrolase
COOR
COOR
COOR
COOHEstérase
enz
enz
produits opt. actifsrésolution
racémique
chiral opt. actifprochiral
B – Inconvénients
1- Choix du biocatalyseurReste très empirique (screening ...)
2- N’existent que sous une forme énantiomérique Constitués de L-aa. Impossible à ce jour de créer une enzyme image dans un miroir (D-aa)
impossible d’inverser l’induction chirale en prenant l’autre énantiomère du biocatalyseur Solution = screening ou une modification de biocatalyseurs.
3- Recyclage de cofacteur pour les enzymes non hydrolytiques
4- Conditions expérimentales assez strictesTempérature et pH
5- Activité maximum dans l’eauProblème : majorité des produits organiques sont peu solubles dans l’eau [substrat] faible. Parfois possibilité de travailler dans des solvants organiques (ex : lipases)
6 - Problème d’inhibition Par le substrat (solution : addition en continu, système biphasique, résine ...) Par le produit (difficile à résoudre : extraction en continu, système biphasique, résine …)
1) Acheter
2) Faire sa propre production (microorganismes recombinants)
Sigma Aldrich, Amano, DSM, etc…. Lipases mais aussi laccases, oxygénases, réductases…/…
Achat de gène de synthèse
Lipases bon marchéPrix plus élevé des autres enzymes
Pas de limite Généralement bon marché (si équipement adéquat)
Ingénierie métabolique
Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris
Comment accéder aux enzymes ?
Biotechnologies blanches
1900 1970 2000- 4000
V- Historique
5000 ans avant JC : Production de vinaigre à partir d’éthanol
CH3CH2OH O2 CH3COOH H2O+ +Acetobacter
acetiEthanol
Acideacétique
Implication d’un microorganisme suspecté par Christiaan Persoon en 1822, confirmé par Pasteur en 1862
Les prémisses
Biotechnologies blanches
1ère vague
1900 1970 2000- 4000
V- Historique
Biocatalyse : 1ière vague
1ère vague (1900-1970)
1915 : Procédé ABE (synthèse de l’acétone à partir de l’amidon)Clostridium acetobutylicum
amidonChaim Weizmannchimiste et 1er président d’Israel
Clostridium acetobutylicum
(anaérobie)3 x Acetone,6 x Butanol1 x Ethanol
considérée comme la première fermentation industrielle
supplantée après la 2nde guerre mondiale par des procédés basés sur le pétrole
(la dernière usine a été fermée en Afrique du Sud en 1983)
Biocatalyse : 1ière vague
1ère vague (1900-1970)
1934 : Synthèse de la vitamine C
1915 : Procédé ABE (synthèse de l’acétone à partir de l’amidon)
Bioxydation régiosélective du sorbitol en sorbose
Clostridium acetobutylicum
CH2OH
OH
H
OH
OH
CH2OH
H
HO
H
H
D-Sorbitol
Acetobacter
suboxydans
CH2OH
OH
H
OH
O
CH2OH
H
HO
H
L-Sorbose
300 g/L
O O
HO OH
CH2OHHO
H
H
acide ascorbique(vitamine C)
1ière étape de la synthèse de la vitamine C Tadeus Reichstein
Procédé Hoffmann-La Roche
Biocatalyse : 1ière vague
1ère vague (1900-1970)
1934 : Synthèse de la vitamine C
1950 : Synthèse de stéroïdes (corticoïdes)
1915 : Procédé ABE (synthèse de l’acétone à partir de l’amidon)
Hydroxylation régio- et stéreosélective de la progestérone
Bioxydation régiosélective du sorbitol en sorbose
Clostridium acetobutylicum
1950 : Synthèse de stéroïdes (corticoïdes)
Biocatalyse : 1ière vague
800 t/an
Hydroxylation régio- et stéreosélective impossible en 1 étape par voie chimique
1ière d’une série de biotransformations permettant l’accès à de nbreux corticoïdes
diosgénine, saponine extraite de l’igname
a permis de diviser le prix de la cortisone par un facteur 400…mais a fait monter celui de la diosgénine par un facteur 2000!
(Merck, 31 étapes, 615 kg acide désoxycholique => 1 kg de cortisone - 200$/g)
6 étapeschimiques
1ers procédés industriels…..mais victoire au finish de la pétrochimie
1ère vague (1900-1970)
1934 : Synthèse de la vitamine C
1950 : Synthèse de stéroïdes (corticoïdes)
1974 : Isomérisation du glucose en fructose
1915 : Procédé ABE (synthèse de l’acétone à partir de l’amidon)
Utilisation massive dans les sodas, USA après la guerre
Bioxydation régiosélective du sorbitol en sorbose
Clostridium acetobutylicum
Hydroxylation régio- et stéreosélective de la progestérone
Biotechnologies blanches
1ère vague
2ème vague
1900 1970 2000- 4000
stéroides
acrylamide
V- Historique
XXI°, siècle de la Biotechnologie blanche ?
Synthèse industrielle de l’acrylamideProcédé Nitto (Mitsubishi Rayon)
50 000 t /an
hydratation de l’acrylonitrile
H2C
NH2
O
H2C CH
C N
acrylonitrile acrylamide
Nitrile hydratase
Rhodococcus rhodochrous
• évite l'utilisation d'un catalyseur au Cuivre
• permet une pureté plus élevée
• présente plusieurs avantages industriels : température réactionnelle inférieure, concentration plus élevée, demande en énergie production de CO2
plus faibles.
Biocatalyse : 3ème vague
Biotechnologies blanches
1ère vague
2ème vague
3ème vague
1900 1970 2000- 4000
stéroides
acrylamide
V- Historique
Biocatalyse
Biotechnologie
Chimie verte
B - Apport des Biotechnologies
I- Recherche de nouvelles enzymes
réactions prometteuses mais productivité souvent insuffisante
Nécessité de trouver des biocatalyseurs plus efficaces
a) Examen de la littérature
Empirique:
b) Screening systématique (souches commerciales ou de labo)
• Bactéries : oxydations, dégradations oxydatives
• Levures : réductions
• Champignons : hydroxylation, hydrolyse
I- Recherche de nouvelles enzymes
Méthodologie:
• Isolement• Culture• (Purification)• Tests d’activité
Astuce:prélèvements de flore riche (sols d’usine, de stations d’épuration) + Cycles de culture sur le produit à transformer comme source de carbone
(enrichissement par pression de sélection)
c) Isolement de nouvelles souches
Nautile-IFREMER
Mer morte
Halorubrum coriense
Rio Tinto (Espagne)
Chlamydo-monas
http://serc.carleton.edu/microbelife/extreme
Lac Vostok (Antartique)
Lac Mono (USA)
Anabeana : algue filamenteuse
Yellowstone
MésophilesPro et Eucaryotes
Acidophiles
Alcalinophiles
Halophiles
Thermophiles
MéthanogènesSulfatoreducteursSulfooxydantsMéthanotrophes ……
Barophiles
20°C
-5°C
3% sels
35% sels
pH 2
pH 9
pH 0
pH 11
50°C120°C
1 atmO2
1000 atm
N2, CH4, H2S, SO4-
Extrêmophiles
ArchéesPsychrophiles
I- Recherche de nouvelles enzymes
I- Recherche de nouvelles enzymes
d) Exploration des bases de données (bioinformatique)
• GenBank, SWISSPROT, UniProtKB, BRENDA, Expasy, KEGG, BioCyc, ….
12 millions de séquences protéiques 5% à 10% correctement annotées16 000 structures 3D d’enzymes.
Banques annotées rigoureusement : UniProtKB, CAZy
• Comparaison de séquences (BLAST)
Inconvénient: recherche de ressemblances avec l’existantQuid de la nouveauté « nouvelle » ?
% d’identité, de similarité
I- Recherche de nouvelles enzymes
e) Métagénomique
Exploration automatiséedes métagénomes
Avancées des techniques / expression des gènes (exemples : expression de gènes hétérologues, "gene knockouts")
Avancées des techniques / contrôle de la synthèse de protéines
Données / génomique, transcriptomique, protéomique, métabolomique
Connaissances / modèles élaborés de systèmes biologiques (reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome)
développement ingénierie métabolique ("metabolic engineering") = transformer des organismes vivants pour produire ou transformer des composés organiques d'intérêt industriel ("microbial cell factories").
Les nouveaux domaines en "omique" et l'ingénierie métabolique
B – Biotechnologie: amélioration enzymes
II- Amélioration des enzymes
Objectifs:
B – Biotechnologie: amélioration enzymes
II- Amélioration des enzymes
1) Evolution dirigée
• Informations structurales sur l’enzyme• Compréhension du mécanisme réactionnel
Pas besoin de
car Mutations aléatoires
idée : Simuler l’évolution darwiniste
Biocatalyse : 3ème vague
II- Amélioration des enzymes
1) Evolution dirigée
tests
Mutagénèse aléatoire
Comment engendrer la diversité?
Error prone PCR, Agents chimiques mutagènes, etc…
Mutagénèse saturanteRemplacement de tous les aa par
chacun des 19 autresOn oublie !
285 x 19 5500 enzymes
Inconvenients:Nombre important de mutants à tester(+s dizaine de milliers temps)
B – Biotechnologie: amélioration enzymes
II- Amélioration des enzymes
3) Approches semi-rationnelles tests
• Informations structurales sur l’enzyme• Compréhension du mécanisme réactionnel au niveau moléculaire (modélisation)
Nécessite
• Mutagénèse saturante de site• Mutagénèse dirigée
• Autres techniquesdestinées à diminuer le nombres de mutants à tester
ex: Mutagénèse saturante itérative
2) Conception rationnelle
Modélisation par analogie
B – Biotechnologie: amélioration enzymes
II- Amélioration des enzymes
4) Cribles
Test UV : 1/4h par analyses , plaque 96 puits => 15 hTest HPLC : 1/4h par analyses; 6000 mutants => 1500 h => 2 mois (24h/24)
Ex: 6000 mutants à tester
Importance des cribles …..importance des chimistes, des physiciens
B – Biotechnologie: nouveaux biocatalyseurs
III - Les nouveaux biocatalyseurs
Avantages / WT• Surexpression
augmentation des vitesses/rendementslimitation des réactions secondaires
• Microorganisme bien connu expression hétéroloqueoutils disponibles rapidité
• Ingénierie métaboliqueSuppression de réactions indésirablesModulation possible des flux métaboliques
1) Hôte de choix : E. coli
B – Biotechnologie: nouveaux biocatalyseurs
III - Les nouveaux biocatalyseurs
• Champignons (Aspergillus - insertion directe dans le génome)
• Levures (Pichia , Yarrowia)
• Bactéries (Pseudomonas, Deinococcus,…) biocarburants de 2ème génération composés biochimiques d’intérêt industriel nouveaux antibiotiques enzymes pour la remédiation des plastiques
2) Autres hôtes
B – Biotechnologie: nouveaux biocatalyseurs
III - Les nouveaux biocatalyseurs
3) Construction de souches sur mesure
Ingéniérie métabolique
Développement de la fluxomique
Biologie de synthèse
Biocatalyse
Biotechnologie
C - Chimie verte
« un développement qui répond aux besoins du présent sans compromettre la capacité des générations futures à répondre aux leurs »
Rapport sur l’environnement, Mme Brundtland (1er Ministre norvégien), 1987
(Sustainability)
Environnement• Préserver la diversité des
espèces , les ressources naturelles et énergétiques
Société• Satisfaire les besoins en
santé, éducation, habitat, emploi
• Prévenir l’exclusion et les inégalités
Economie• Créer des richesses• Améliorer les conditions
de vie matérielles
Viable Vivable
Équi-table
« un développement économiquement efficace, socialement équitable et écologiquement soutenable »
Sommet de la Terre , Rio (1992)
Les 3 piliers du Développement Durable
« Concevoir des produits et des procédés de synthèse permettant de réduire ou d’éliminer l’utilisation et la génération de substances dangereuses »
Concept défini en 1998 par P. Anastas et J. C. Warner (EPA – Environmental Protection Agency)
in « Green Chemistry; Theory and Practice »
Chimie verte
Green Chemistry Challenge
Récompense depuis 1996 les procédés chimiques qui incorporent les principes de la Chimie Verte aussi bien dans le domaine de la santé que de l’environnement
Paul Anastas et John Warner –(EPA) in « Green Chemistry; Theory and Practice » 1998
Les 12 principes fondateurs de la chimie verte
Principes 1 & 2 appliqués à la Biocatalyse
1. Limiter la production de déchets : il vaut mieux produire moins de déchets qu'investir dans l'assainissement des effluents ou l'élimination des déchets.
Vrai pour la biocatalyse dans la plupart des cas (si l’eau ne compte pas comme déchet)
rdt élevé, ee élévé, purification aisée,….
Très bon si on ne considère que les produits à transformer, très mauvais si on considère le système dans sa totalité (enzyme ou bactérie)
Autres: Intensité massique, productivité massique, efficacité en carbone,….
2. Maximiser l’économie d'atomes : les synthèses doivent être conçues dans le but de maximiser l'incorporation des matériaux utilisés au cours du procédé dans le produit final.
Principes 3 & 4 appliqués à la Biocatalyse
3. Concevoir des synthèses moins toxiques: les méthodes de synthèse doivent être conçues pour utiliser et créer des substances faiblement ou non toxiques pour les humains et sans conséquences sur l'environnement.
Généralement vrai surtout en comparant avec les synthèses chimiques ex réduction : pas de métaux lourds
Milieu confiné de préférence
Peut être vrai ex: certains polyesters dégradables sont impossibles à fabriquer
chimiquement
4. Concevoir des produits chimiques plus sûrs:
Principe 12 appliqué à la Biocatalyse
12. Minimiser les risques d’accidents: Les substances et la forme des substances utilisées dans un procédé chimique devraient être choisies de façon à minimiser les risques d'accidents chimiques, incluant les rejets, les explosions et les incendies.
Généralement vrai surtout en comparant avec les synthèses chimiques ex réduction : H2 sous pression évité;
oxydation: pas de peracides explosifs
Milieu confiné de préférence (risque biologique pour les travailleurs limité par l’utilisation de miroorganismes GRAS (Generally Recognized As Safe))
Ne les exclus pas toujours ex: rejet d’ammoniaque (nitrilase)
ou de cyanure (hydroxynitrile lyase)
Principes 5 & 8 appliqués à la Biocatalyse
5. Réduire les substances auxiliaires: supprimer l'utilisation de substances auxiliaires (solvants, agents de séparation, ...) ou utiliser des substances inoffensives. Des méthodes non conventionnelles d'activation peuvent être utilisées : eau, fluides supercritiques ou liquides ioniques comme solvant, chauffage par micro-ondes, etc.
Vrai Solvants = eau ou liquides ioniques ou CO2 supercritiquePeu d’auxiliaires (inutilité des auxiliaires chiraux pour la résolutions d’énantiomères)
Étapes de protection souvent inutilesGénéralement réduction du nombre d’étapes
Ex: synthèse de sucres
8. Eviter les produits dérivés: toute déviation inutile du schéma de synthèse (utilisation d'agents bloquants, protection / déprotection, modification temporaire du procédé physique/chimique) doit être réduite ou éliminée.
Principe 9 appliqué à la Biocatalyse
9. Préférer les réactions catalysées: Les réactifs catalytiques sont plus efficaces que les réactifs stœchiométriques (1 mole pour 1 mole). De plus, il faut favoriser l'utilisation de réactifs catalytiques les plus sélectifs possibles.
Turn-over des réactions souvent élevé
Enzymologie: Turnover number = kcat : nb de moles de substrat qu’une mole d’enzyme peut convertir par site catalytique par unités de tps kcat = Vmax/[E]T
Chimie : Turnover number (TON) : nb de moles de substrat qu’une mole de catalyseur peut convertir avant d’être inactivé Turnover frequency (TOF): TON par unité de tps
(se rapproche du kcat)
10−2 - 102 s−1 pour un catalyseur103 - 107 s−1 pour une enzyme
Principes 6 & 7 appliqués à la Biocatalyse
6. Réduire les dépenses énergétiques: Les besoins énergétiques des procédés chimiques ont des répercussions sur l'économie et l'environnement dont il faut tenir compte et qu'il faut minimiser. Il faut mettre au point des méthodes de synthèse dans les conditions de température et de pression ambiantes.
7. Préférer les matières premières renouvelables: Lorsque la technologie et les moyens financiers le permettent, les matières premières utilisées doivent être renouvelables plutôt que non renouvelables.
Généralement, Température et pression ambiante
Principes 10 & 11 appliqués à la Biocatalyse
10. Penser la dégradation finale: Les produits chimiques doivent être conçus de façon à pouvoir se dissocier en produits de dégradation non nocifs à la fin de leur durée d'utilisation, cela dans le but d'éviter leur persistance dans l'environnement.
Mise au point facilitée par des conditions de réaction plus douces
Enzymes ou microorganismes biodégradablesSous-produits du métabolisme naturels et biodégradables
(sucres, minéraux , acides organiques,….)
11. Analyser en temps réel: Des méthodologies analytiques doivent être élaborées afin de permettre une surveillance et un contrôle en temps réel et en cours de production avant qu'il y ait apparition de substances dangereuses.
(CH2)7COOH
-linolenic acid
13-LOX
(CH2)7COOH
H OOH
13-HPOT hydroperoxide
O
O(CH2)7COOH
CYP74
Cis-3-hexenal
12-oxo-(9Z)-dodecenoic acid
cis-3-hexenal:Arôme note verte
hydropéroxide lyase provenant de la goyave
lipoxygénase provenant de la farine de soja
Exemple d’application par enzymes purifiées
L’exemple
d’une réaction biocatalysée emblématique
Synthèse de la Sitagliptine
N
N
NN
O NH2
F
F
F
F3C
nouvel anti-diabétique de type 2 Merck 2005
N
N
NN
O O
F
F
F
F3C
N
N
NN
O NH2
F
F
F
F3C
N
N
NN
O NH2
F
F
F
F3C
ee =97%Insuffisant pour pdt pharmaceutique ! trace de Rhodium
Recristallisation indispensableRendement
Synthèse 1ere génération:
NH4OAc
1) Rh(Josiphos) H2 sous 17 atm 2) purification
Synthèse 2eme génération : Hydrogénation asymétrique d’enamine non protégée
• 8 étapes, • bcp d’extractions aqueuses, • perte de réactifs non réutilisables
Néanmoins 3 étapesRdt de 50%Déchets de 80%
Sur durée de vie du pdt : 150 000 t de déchets évités (estimation Merck)
Intro: Synthèse de la sitagliptine
2006 Greener Synthetic Pathways Award
Merck
sitagliptine
Merck et Codexis
N
N
NN
O O
F
F
F
F3C
N
N
NN
O NH2
F
F
F
F3C
ee =99,95%
Synthèse 3ème génération : Trans-amination enzymatique
transaminase
•1 étape•Productivité de 56%•Rdt de 13%•Déchets de 20%•Elimination métaux lourds•Pas d’équipement résistant à la pression Réduction du cout total de fabrication
Pro-sitagliptine
sitagliptine
Intro: Synthèse de la sitagliptine
2010 Greener Reaction Conditions Award
Transaminases:transforment seulement les methyl cétones
Construction d’un modèle structural par homologie
ATA-117 d’Arthrobacter sp
Transamination
Faible transamination (4% conversion)
Pas de réaction
Bleu: small binding pocket: (trifluorophenyl)Orange : large binding pocket (triazolopyrazine)
Gène stérique pour le groupe trifluorophenyl
Intro: Synthèse de la sitagliptine
O NH2
Grande et petite poches dans site actif
1er round: Améliorer la réactivité vis-à-vis de l’analogue de la méthyl dicétone
12 positions susceptibles d’interférer: mutagénèse saturante
S223P Amélioration 11 fois
Intro: Synthèse de la sitagliptine
interactions hydrophobes
Sérine en proline
Amélioration mais toujours pas d’activité sur la cible
2eme round: Agrandir la petite poche pour le groupe trifluorophenyl
À partir de S223P 4 positions susceptibles d’interférer mutagénèse saturante
+ petites librairies combinatoires V->G ou A (216 éléments)
1ere activité décelable (0,7% en 24 h) pour un variant de 4 mutations
•soit résidus de plus petite taille, •soit création de stacking aromatique
Intro: Synthèse de la sitagliptine
N
N
NN
O NH2
F
F
F
F3C
Y26H, V65A, V69G, F122I, A284G
N
N
NN
O O
F
F
F
F3C
N
N
NN
O NH2
F
F
F
F3CNH2 O+ +
Contrainte:
• Réaction équilibrée gde quantité d’isopropylamine et/ou enlèvement acétone
• Solubilité prositagliptine dans eau faible solvant + température élevée
donneur d’amine
Objectif industriel
100g/L prostagliptine1M i-PrNH2>25% DMSOT>40°CEe>99.9%
3eme round: Améliorer la réactivité du variant actif
Nouveau variant 75 fois plus actif (12 mutations)
Combinaison des mutations positives des 2 rounds
Intro: Synthèse de la sitagliptine
11 rounds au finalMutagenèse saturante de positions extérieures au site actifMutagenèse dirigée par comparaison avec d’autres transaminasesMutagénèse aléatoire
Intro: Synthèse de la sitagliptine
Crible :
Mutagenèse saturante de positions extérieures au site actifMutagenèse dirigée par comparaison avec d’autres transaminasesMutagénèse aléatoire
•100g/L prostagliptine•1M i-PrNH2•>25% DMSO•T>40°C•ee>99.9%
• 200g/L prostagliptine• 1M i-PrNH2• 50% DMSO• T=45°C• 92 % rdt• ee>99.95%
27 mutations• 1/2 dans petite et grande poche (accommodement du substrat)• 1/4 mutations ds région infaciale des monomères
(renforcement des interactions stabilisant le dimère actif)• 1/4 autres
Objectif Conditionsoptimisées
Intro: Synthèse de la sitagliptine
11 rounds au final
Intro: Synthèse de la sitagliptine
Merci pour votre attention