La DD RT-PCRLa DD RT-PCR

• DDRT-PCR : Differential Display Reverse Transcription - Polymerisation Chain Reaction

• Technique basée sur la RT-PCR

• Différences d’expression de gènes entre 2 cellules dans des conditions différentes

• Technique de tri d’ARNm : differential display

• Développée par Liang P. et Pardee A. B. en 1992

Principe du DD RT-PCRPrincipe du DD RT-PCR

Idem avec d’autres amorces T12XY.

Idem avec d’autres amorces aléatoires.

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

Isolation des ARNm

Cellules A :

(même principe pour cellules B)

Hybridation (amorce T12AC) – RT.

GUAAAAAACATTTTTT

GUAAAAAACATTTTTT

Hybridation (amorce aléatoire) Elongation.

GUAAAAAACATTTTTT

GUAAAAAACATTTTTTNNNNNN

NNNNNNNNNNNN

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Principe du DD RT-PCRPrincipe du DD RT-PCR

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide:

A B A B A B

amorce 1 amorce 2 amorce 3 etc…

Excision et clonage : gène sous-exprimé dans B.

Excision et clonage : gène sur-exprimé dans B.

Résultat obtenu après PCR avec les différentes amorces utilisées.

GUAAAAAACATTTTTT

GUAAAAAACATTTTTTNNNNNN

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NNNNNN

Méthodes dérivéesMéthodes dérivées

• AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR

• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)

• Targeted Display

• Ordered Differential Display (READS)

Méthodes dérivéesMéthodes dérivées

• AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR

• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)

• Targeted Display

• Ordered Differential Display (READS)

AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCRPrimed PCR

RT : amorce oligo(dT) amorces d’oligonucléotides arbitraires

ARN qui ne sont pas polyadénylés (ex : bactéries). Minimiser amplification région 3’ non codante.

Limite : choix des amorces et abondance des ARN définissent différenciation finale. deux amorces arbitraires risquent d’augmenter l’amplification de mismatch.

Méthodes dérivéesMéthodes dérivées

• AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR

• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)

• Targeted Display

• Ordered Differential Display (READS)

DDRT-PCR with Selected PrimersDDRT-PCR with Selected Primers

- PCR avec une seule amorce en 3’ meilleure étude des transcrits très abondants.

Choix expérimentale d’amorces arbitraires Meilleure amplification des ARNm abondamment transcrits. Éliminer le maximum de faux positifs.

Observer les transcrits très abondants au détriment des transcrits faiblement exprimés.

- Taux de G et C dans l’amorce diminuer l’amplification d’ARNr et d’ARN mitochondriaux (dans le cas de la RAP-PCR).

- Cycles PCR à température = 50°C augmente la sélectivité et la reproductibilité mais aussi le nombre de bandes .

- PCR quantitative confirmer les différences d’expression.

Méthodes dérivéesMéthodes dérivées

• AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR

• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)

• Targeted Display

• Ordered Differential Display (READS)

Targeted DisplayTargeted Display• Identification de transcrits :

- membres d’une même famille de gènes,- avec domaines spécifiques, - avec motifs particuliers.

• RT : amorce oligo(dT)

• PCR : amorce spécifique domaine homologue à une famille de gènes ou domaine spécifique.

différences d’expression entre des transcrits à l’origine de facteurs de transcription à domaine spécifique.

observer des transcrits à motifs répétés souvent à l’origine de maladies neurodégénératives (ex : Corée de Huntington).

Méthodes dérivéesMéthodes dérivées

• AP-PCR (RAP-PCR) : Arbitrarily Primed PCR

• DDRT-PCR with Selected Primers (SPR)

• Targeted Display

• Ordered Differential Display (READS)

Ordered Differential Display Ordered Differential Display (READS)(READS)

READS = Restriction Endonucleolytic Analysis of Differentially expressed Sequences

Principe :

Ordered Differential Display (READS)Ordered Differential Display (READS)

Ordered Differential Display Ordered Differential Display (READS)(READS)

Meilleure reproductibilité des résultats que DDRT-PCR.

READS = Restriction Endonucleolytic Analysis of Differentially expressed Sequences

Principe :

ApplicationsApplications DDRT-PCR DDRT-PCR

Visualiser des différences d’expression de gènes

Exemples :

• Cellules d’organes différents d’un même organisme définir gènes spécifiques de chaque organe.

• Cellules dans conditions environnementales différentes:- température,- la salinité (pression osmotique), - la pression des gaz (O2, CO2 …),

- la luminosité, - les nutriments (source d’azote, sucres, acides aminés, molécules

pharmaceutiques …), - etc.… définir gènes spécifiques de ces conditions.

Applications DDRT-PCRApplications DDRT-PCR

• Cellules en présence :- pathogène (insecte, champignon, bactérie…) - symbiose- blessure définir gènes spécifiques.

Visualiser des différences d’expression de gènes

Exemples :

Avantages et LimitesAvantages et Limites

Avantages :

• Beaucoup de comparaisons entre échantillons grâce à combinaisons d’amorces différentes.

• Fondée sur PCR : - peu de matériel  1 µg ARNm poly(A)/échantillon 150 réactions - peu onéreuse.

• Identification gènes sur et sous-exprimés sur un même gel.

• Plus rapide que techniques de criblage différentiel.

Avantages et LimitesAvantages et Limites

Limites :

• Une bande : plusieurs fragments d’ADNc différents, de même longueur.

• Saturation pour gènes fortement transcrits sous estimation de la bande.

• Beaucoup de faux positifs dans les fragments de PCR clonés : un problème intrinsèque à la méthode.