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ANNÉE 2001 THÈSE : 2001 – TOU 3 – 4091

LA PNEUMOCYSTOSESPONTANÉE DU LAPEREAU :

UN MODÈLE DE LA PRIMO-INFECTIONHUMAINE ?

THÈSEpour obtenir le grade de

DOCTEUR VÉTÉRINAIRE

DIPLÔME D’ÉTAT

présentée et soutenue publiquement en 2001devant l’Université Paul-Sabatier de Toulouse

par

Aurélien, Juul, Pierre ALLAERTné le 19 novembre 1971 à LILLE (Nord)

Directeur de thèse : M. le Professeur Philippe DORCHIES

JURY

PRÉSIDENT :M. Jean-Louis FONVIEILLE Professeur à l’Université Paul-Sabatier de TOULOUSE

ASSESSEURS :M. Philippe DORCHIES Professeur à l’École Nationale Vétérinaire de TOULOUSEM. Guy BODIN Professeur à l’École Nationale Vétérinaire de TOULOUSE

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MINISTÈRE DE L’AGRICULTURE ET DE LA PÊCHE

ÉCOLE NATIONALE VÉTÉRINAIRE DE TOULOUSE

Directeur par intérim : M. G. BONNESDirecteurs honoraires … : M. R. FLORIO

M. R. LAUTIÉM. J. FERNEYM. G. VAN HAVERBEKE

Professeurs honoraires … : M. A. BRIZARDM. L. FALIUM. C. LABIÉM. C. PAVAUXM. F. LESCUREM. A. RICO

PROFESSEURS CLASSE EXCEPTIONNELLE

M. CABANIÉ Paul, Histologie, Anatomie pathologiqueM. DORCHIES Philippe, Parasitologie et Maladies parasitairesM. GUELFI Jean-François, Pathologie médicale des Équidés et Carnivores

PROFESSEURS 1ère CLASSE

M. AUTEFAGE André, Pathologie chirurgicaleM. BODIN ROZAT DE MANDRES NÈGRE Guy, Pathologie générale, Microbiologie, ImmunologieM. BRAUN Jean-Pierre, Physique et Chimie biologiques et médicalesM. CHANTAL Jean, Pathologie infectieuseM. DARRÉ Roland, Productions animalesM. DELVERDIER Maxence, Histologie, Anatomie pathologiqueM. EECKHOUTTE Michel, Hygiène et Industrie des Denrées Alimentaires d’Origine AnimaleM. EUZÉBY Jean, Pathologie générale, Microbiologie, ImmunologieM. FRANC Michel, Parasitologie et Maladies parasitairesM. MILON Alain, Pathologie générale, Microbiologie, ImmunologieM. PETIT Claude, Pharmacie et ToxicologieM. RÉGNIER Alain, Physiopathologie oculaireM. SAUTET Jean, AnatomieM. TOUTAIN Pierre-Louis, Physiologie et Thérapeutique

PROFESSEURS 2e CLASSE

Mme BÉNARD Geneviève, Hygiène et Industrie des Denrées Alimentaires d’Origine AnimaleM. BERTHELOT Xavier, Pathologie de la ReproductionM. CORPET Denis, Science de l’Aliment et Technologies dans les Industries Agro-alimentairesM. DUCOS DE LAHITTE Jacques, Parasitologie et Maladies parasitairesM. ENJALBERT Francis, AlimentationMme KOLF-CLAUW Martine, Pharmacie et ToxicologieM. LEFEBVRE Hervé, Physiologie et ThérapeutiqueM. LIGNEREUX Yves, AnatomieM. MARTINEAU Guy, Pathologie médicale du Bétail et des Animaux de Basse-courM. PICAVET Dominique, Pathologie infectieuseM. SCHELCHER François, Pathologie médicale du Bétail et des Animaux de Basse-cour

PROFESSEUR ASSOCIÉ

M. TAMZALI Youssef, Clinique équine

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PROFESSEURS CERTIFIÉS DE L’ENSEIGNEMENT AGRICOLE

Mme MICHAUD Françoise, Professeur d’AnglaisM. SÉVERAC Benoît, Professeur d’Anglais

MAÎTRE DE CONFÉRENCES HORS CLASSE

M. JOUGLAR Jean-Yves, Pathologie médicale du Bétail et des Animaux de Basse-cour

MAÎTRES DE CONFÉRENCES 1ère CLASSE

M. ASIMUS Éric, Pathologie chirurgicaleMme BENNIS-BRET Lydie, Physique et Chimie biologiques et médicalesM. BERGONIER Dominique, Pathologie de la ReproductionM. BERTAGNOLI Stéphane, Pathologie infectieuseMme BOUCRAUT-BARALON Corine, Pathologie infectieuseMme BOURGES-ABELLA Nathalie, Histologie, Anatomie pathologiqueM. BOUSQUET-MELOU Alain, Physiologie et ThérapeutiqueM. BRUGÈRE Hubert, Hygiène et Industrie des Denrées Alimentaires d’Origine AnimaleM. CONCORDET Didier, Mathématiques, Statistiques, ModélisationMlle DIQUÉLOU Armelle, Pathologie médicale des Équidés et CarnivoresM. DUCOS Alain, ZootechnieM. DOSSIN Olivier, Pathologie médicale des Équidés et CarnivoresMlle GAYRARD Véronique, Physiologie de la Reproduction, EndocrinologieM. GUERRÉ Philippe, Pharmacie et ToxicologieM. LYAZRHI Faouzi, Statistiques biologiques et MathématiquesM. MATHON Didier, Pathologie chirurgicaleMme MESSUD-PETIT Frédérique, Pathologie infectieuseMme PRIYMENKO Nathalie, AlimentationM. SANS Pierre, Productions animalesM. VALARCHER Jean-François, Pathologie médicale du Bétail et des Animaux de Basse-cour

MAÎTRES DE CONFÉRENCES 2e CLASSE

M. BAILLY Jean-Denis, Hygiène et Industrie des Denrées Alimentaires d’Origine AnimaleMlle BOULLIER Séverine, Immunologie générale et médicaleMlle CAMUS Christelle, Biologie cellulaire et moléculaireM. FOUCRAS Gilles, Pathologie du BétailMme HAGEN-PICARD Nicole, Pathologie de la reproductionMlle HAY Magali, ZootechnieM. JACQUIET Philippe, Parasitologie et Maladies parasitairesM. JAEG Jean-Philippe, Pharmacie et ToxicologieMme LETRON-RAYMOND Isabelle, Anatomie pathologiqueM. MARENDA Marc, Pathologie de la ReproductionM. MEYER Gilles, Pathologie des RuminantsMlle TRUMEL Catherine, Pathologie médicale des Équidés et CarnivoresM. VERWAERDE Patrick, Anesthésie, Réanimation

ASSISTANTS D’ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHE CONTRACTUELS

M. GUÉRIN Jean-Luc, Productions animalesM. MOGICATO Giovanni, Anatomie, imagerie médicaleMlle MEYNADIER Annabelle, AlimentationMme MEYNAUD-COLLARD Patricia, Pathologie chirurgicaleM. MONNEREAU Laurent, Anatomie, Embryologie

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À Monsieur le Professeur FONVIEILLEProfesseur des UniversitésZoologie – Parasitologiequi a accepté de présider ce jury.

À Monsieur le Professeur DORCHIESDe l’École Nationale Vétérinaire de ToulouseParasitologie et maladies parasitaires,qui a accepté de rapporter ce travail, pour son aide et son soutien.

À Monsieur le Professeur BODINDe l’École Nationale Vétérinaire de ToulousePathologie générale, microbiologie, immunologie,pour sa patience, sa compréhension et son soutien.

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Je tiens à adresser des remerciements particuliers :

À Monsieur le Docteur Eduardo DEI-CAS,qui m’a pris dans son équipe et qui suit ce travail depuis six ans.

À Monsieur le Professeur Daniel CAMUS,et aux membres de l’Unité 42 de l’I.N.S.E.R.M,qui m’ont accueilli dans leur Unité.

À Madame Chantal PARENTY,qui m’a appris à travailler avec Pneumocystis carinii.

À Monsieur le Docteur Thierry JOUAULT,pour son aide précieuse.

À Madame le Docteur Annick MERCENIER,et aux membres du Département de Microbiologie des Écosystèmes de l’I.P.L.,pour leur accueil.

Et à tous ceux qui m’ont apporté leur concours au cours de ces années.

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Table des matières

Table des matières __________________________________________________ 11

Table des illustrations _______________________________________________ 12

Abréviations _______________________________________________________ 13

Problématique ______________________________________________________ 15

Chapitre 1 : Introduction _____________________________________________ 15Sous-chapitre 1.1 : Présentation générale de la pneumocystose _____________________ 15Sous-chapitre 1.2 : Présentation de Pneumocystis carinii ____________________________ 20Sous-chapitre 1.3 : Aspects épidémiologiques de l’infection humaine ________________ 28Sous-chapitre 1.4 : La problématique de la primo-infection_________________________ 29Sous-chapitre 1.5 : Moyens d’étude _____________________________________________ 30

Chapitre 2 : Que sait-on de la pneumocystose spontanée du lapereau ?____ 31Sous-chapitre 2.1 : Historique de la découverte de la pneumocystose spontanée ______ 31Sous-chapitre 2.2 : Cinétique de l’infection _______________________________________ 33Sous-chapitre 2.3 : Aspects épidémiologiques ____________________________________ 33Sous-chapitre 2.4 : Modifications biochimiques ___________________________________ 35Sous-chapitre 2.5 : Étude histologique ___________________________________________ 36Sous-chapitre 2.6 : Aspects immunitaires ________________________________________ 38

Chapitre 3 : Hypothèses sur l’histoire naturelle de la PPC du lapin _______ 42Sous-chapitre 3.1 : Acquisition de l’infection _____________________________________ 42Sous-chapitre 3.2 : Primo-infection______________________________________________ 42Sous-chapitre 3.3 : Persistance de l’infection et recontaminations____________________ 43

Chapitre 4 : Transposition à l’homme : dans quelle direction chercher ? ___ 43Sous-chapitre 4.1 : Recherche de la primo-infection humaine _________________________ 43Sous-chapitre 4.2 : Recherche des sources d’infection ________________________________ 44Sous-chapitre 4.3 : Recherche des facteurs immunitaires impliqués dans la protection____ 45Sous-chapitre 4.4 : Outils nécessaires ______________________________________________ 46

Chapitre 5 : Conclusion ______________________________________________ 46

Bibliographie_______________________________________________________ 47

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Table des illustrations

Figuresfigure n°1 : première représentation de P. carinii __________________________________ 17figure n°2 : cycle cellulaire de P. carinii __________________________________________ 23figure n°3 : arbre phylogénétique des formae speciales de P. carinii__________________ 32

Photosphoto n°1 : diagnostic de la pneumocystose en microscopie optique_________________ 18photo n°2 : morphologie des différentes formes de P. carinii ________________________ 20photo n°3 : P. carinii associé à un pneumocyte de type I en MET ____________________ 21photo n°4 : alvéole pulmonaire parasitée par P. carinii en MET _____________________ 27photo n°5 : aspects histologiques de la PPC ______________________________________ 37photo n°6 : principales cellules observées lors de la PPC ___________________________ 38photo n°7 : phagocytose de P. carinii par les macrophages alvéolaires________________ 40

Courbescourbe n°1 : nombre de P. carinii en fonction de l’âge ______________________________ 33courbe n°2 : nombre de P. carinii en fonction de la période de l’année________________ 35

Tableauxtableau I : paramètres biochimiques au cours de la PPC____________________________ 36tableau II : paramètres histologiques au cours de la PPC ___________________________ 37tableau III : expression des cytokines au cours de la PPC___________________________ 42

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Abréviations

ADN : acide désoxyribonucléique.ARN : acide ribonucléique.BTO : bleu d’orthotoluidine.CR : récepteur au complément (complement receptor).f. sp. : forma specialis (forme spéciale).HDL : lipoprotéine de haute densité (high density lipoprotein).IFN-γ : interféron gamma.IgG/M : immunoglobuline de classe G/M.IL-8/10 : interleukine 8/10.ITS : espaceur interne transcrit (internal transcribed spacer).LBA : lavage broncho-alvéolaire.LPS : lipopolysaccharide.MCP-1 : monocyte chemoattractant protein 1.MET : microscopie électronique à transmission.MGG : May-Grünwald-Giemsa.MMR : récepteur au mannose du macrophage (macrophage mannose receptor).MSG : glycoprotéine majeure de surface (major surface glycoprotein).PAS : acide periodique – réactif de Schiff (coloration histologique).PCR : réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction).PPC : pneumonie à Pneumocystis carinii.SCID : immunodéficience combinée sévère (severe combined immunodeficiency).SHIV : simian-human immunodeficiency virus (rétrovirus chimère).SIDA : syndrome d’immunodéficience acquise.SP-A/D : protéine du surfactant de type A à D (surfactant protein).Th1/2 : réponse lymphocytaire T auxiliaire (helper) de type 1/2.TNF : facteur nécrosant les tumeurs (tumor necrosis factor).VIH : virus de l’immunodéficience humaine.

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Problématique

neumocystis carinii est un micro-organisme fongique atypique trèsrépandu parasitant les poumons de nombreux mammifères. Son im-portance clinique est liée à la pneumonie mortelle qu’il peut provo-

quer chez les personnes immunodéprimées. Cette infection s’est particulièrementdéveloppée à l’occasion de la pandémie de syndrome d’immunodéficience acquise(SIDA) et a longtemps représenté une cause majeure de mortalité chez les patientscontaminés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Si d’importantsprogrès thérapeutiques ont été réalisés, la pneumonie à P. carinii (PPC) reste uneréelle menace pour tous les individus immunodéprimés. La biologie de P. cariniireste largement méconnue, l’incapacité à cultiver en continu le parasite obligeant àtravailler chez l’animal. Ainsi la position taxonomique de P. carinii est toujoursincertaine, le réservoir du parasite n’est pas connu et l’histoire naturelle de la ma-ladie est sujette à discussions. Dans la plupart des modèles de PPC, la maladie estinduite par une immunodépression sévère et contrôlée, ce qui diffère nettementdes conditions naturelles de contamination et ne permet donc pas l’étude del’histoire naturelle de l’infection. Au contraire, le lapin présente une pneumocys-tose naturelle bénigne (en l’absence d’immunodépression) bien caractérisée et re-productible. Il constitue donc un outil de choix pour l’étude de la circulation de P.carinii dans un écosystème naturel et de l’histoire naturelle de la maladie.L’objectif de ce travail est de présenter cette infection naturelle et de discuter dansquelle mesure les résultats obtenus chez le lapin peuvent être extrapolés àl’infection humaine.

Chapitre 1 : Introduction

Sous-chapitre 1.1 : Présentation générale de la pneumocystose

Rappels historiques sur P. carinii.

La première représentation de Pneumocystis carinii remonte à 1909, lorsqueCarlos Chagas observe dans les poumons de cobayes infectés par Trypanosoma cru-zi ce qu’il considère comme étant des formes de schizogonie de ce protozoaire (cf.figure 1)(Chagas, 1909). Il retrouvera régulièrement ces formes dans les poumonsde cobayes, singes Callithrix, chats et chiens expérimentalement infectés par T. cru-zi ainsi que chez un homme mort de la maladie qui porte aujourd’hui son nom(Chagas, 1911). En 1910, Antonio Carini retrouve des formes semblables chez desrats infectés par T. lewisi (Carini, 1910). Mais c’est en 1912 que Pierre et Marie De-lanoë démontreront la présence de ces organismes chez des rats indemnes de try-panosomes et décriront la nouvelle espèce Pneumocystis carinii (Delanoë et Dela-noë, 1912). En 1942, van der Meer et Brug confirmeront la présence dePneumocystis chez l’homme tout en en soulignant la rareté [nombreux sporocysteset première description détaillée des amas de formes végétatives – déjà représen-tés en 1911 par Buchanan (Buchanan, 1911) – chez un enfant de trois mois mortd’une cardiopathie congénitale et ayant souffert du paludisme, et deux fois unsporocyste retrouvés pour 104 frottis de poumon examinés lors d’une étuderétrospective](van der Meer et Brug, 1942). Le pouvoir pathogène de P. cariniipour l’homme est apparu au cours et à la suite de la seconde guerre mondiale. Ilfut alors décrit comme l’agent étiologique de « pneumonies à plasmocytes » mor-telles chez les prématurés et les enfants dénutris des orphelinats d’Europe centrale(Vanék et Jírovek, 1952). Son importance en tant que pathogène croîtra ensuite

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avec le développement des immunodépressions iatrogènes liées aux chimiothéra-pies anticancéreuses et aux greffes d’organes. Elle est cependant restée relative-ment faible jusqu’au début des années 1980, et seuls quelques rares travaux sontconsacrés à P. carinii (Walzer, 1989). Ce n’est qu’avec le développement de lapandémie de SIDA que la pneumocystose a réellement commencé à retenirl’attention de la communauté médicale. En effet, la PPC est une maladie opportu-niste typique, qui a trouvé chez les patients sidéens un terrain particulièrementpropice à son développement. C’est d’ailleurs une épidémie de pneumocystosechez plusieurs groupes d’homosexuels américains (à New York, Los Angeles etSan Francisco) en 1981 qui a conduit à la description du SIDA (Follansbee et coll.,1982 ; Gottlieb et coll., 1981 ; Masur et coll., 1981). La pneumocystose est la pre-mière infection opportuniste majeure touchant les patients sidéens. En 1982, leCDC rapportait que sur 593 cas de SIDA recensés de juin 1981 à septembre 1982,58 % présentaient une PPC. La pneumocystose représente également la premièreinfection inaugurant le passage au stade SIDA de l’infection par le VIH. Ainsi, surla période 1992-1997, elle représentait 35,9 % de ces infections aux États-Unis(CDC, 1999b). Le premier traitement efficace de la pneumocystose fut dès 1958(Ivády et Páldy, 1958) la pentamidine administrée par voie intramusculaire.L’utilisation de la même molécule en aérosols a permis par la suite de diminuer latoxicité et d’améliorer la tolérance au traitement. Le plus gros progrès thérapeuti-que fut l’introduction du cotrimoxazole (Hughes et coll., 1975; Hughes et coll.,1974), qui s’est révélé jusqu’ici le traitement le plus efficace de l’infection. Son uti-lisation à titre préventif chez les patients VIH+ a de plus l’avantage de participer àla prévention d’autres infections comme la toxoplasmose cérébrale et les pneumo-nies bactériennes (CDC, 1999a). Grâce à cette prophylaxie et à l’amélioration de laprise en charge et du traitement de l’infection par le VIH, l’incidence de la PPC estpassée aux États-Unis de 108,3 à 45,5 pour 1000 personnes infectées par le VIH etpar an sur la période 1992-1997 (CDC, 1999b).

La présentation clinique de la pneumocystose humaine.

Chez les sidéens, la pneumocystose typique se présente comme une pneumonieinterstitielle bilatérale souvent fébrile, avec toux sèche, tachypnée et dyspnée pro-gressive avec cyanose. L’évolution est lente (plusieurs semaines) et le début insi-dieux. L’examen radiographique montre des images interstitielles diffuses nonspécifiques. La localisation périhilaire prédomine. L’activité lactate déshydrogé-nase sérique est souvent augmentée (≥ 220 U/ml). L’analyse des gaz du sangmontre une diminution de la pression partielle en oxygène, corrélée à la sévéritéde la dyspnée (Leoung, 1998). Les présentations atypiques semblent se multiplierces dernières années (Sarkar et coll., 1997). Chez les non-sidéens, la symptomato-logie diffère peu, mais l’évolution est généralement plus brutale, et le diagnosticplus précoce. La mortalité semble plus élevée chez ces patients (Thomas et Limper,1998), bien que tous les rapports n’aillent pas dans ce sens (Nevez et coll., 1999a).Les raisons de ces divergences ne sont pas connues. Les localisations extrapulmo-naires sont exceptionnelles. L’administration à titre prophylactique de pentami-dine en aérosol semble favoriser la dissémination du parasite. Parmi les organesles plus touchés figurent l’œil, l’oreille (Sha et coll., 1992), le foie et les organeslymphoïdes secondaires (Poblete et coll., 1989; Raviglione, 1990).

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figure n°1 : première représentation de P. carinii. Sur cette planche parue en 1909, les dessins 37 à46 représentent des sporocystes de Pneumocystis que Carlos Chagas considère à tort comme desformes de sporogonie de Trypanozoma (Schizotrypanum) cruzi (Chagas, 1909).

Le diagnostic passe par la mise en évidence du parasite dans le liquide de la-vage broncho-alvéolaire (LBA), l’expectoration induite (moins sensible mais moinsinvasive) ou un prélèvement biopsique (seul prélèvement possible lors de pneu-

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mocystose extrapulmonaire). P. carinii est mis en évidence par coloration [associa-tion d’une coloration panoptique de type Giemsa (cf. photo 1A) et d’une colorationde la paroi : bleu d’orthotoluidine (BTO, cf. photo 1B), coloration argentique detype Gomori-Grocott (cf. photo 1C) ou acide periodique, réactif de Schiff (PAS)].Cette recherche nécessite des techniciens expérimentés. L’utilisation de techniquesd’immuno-fluorescence directe permet d’augmenter à la fois la sensibilité et laspécificité. Enfin, le développement de techniques extrêmement sensibles de réac-tion de polymérisation en chaîne (PCR) peut permettre de diminuer le recours àdes techniques invasives (LBA) au profit d’autres à la fois moins désagréablespour le patient et moins coûteuses (un simple lavage oropharyngé peut suffiredans certains cas) (Lundgren et Wakefield, 1998).

photo n°1 : Pneumocystis carinii f. sp. hominis tel qu’il peut être observé dans un sédiment de LBAriche en parasites (Dei-Cas, communication personnelle).A : coloration au méthanol-Giemsa. On remarque un sporocyste mature (flèche) au milieu d’unnuage de formes végétatives (étoile).B : coloration au BTO.C : coloration à la méthénamine d’argent de Gomori-Grocott

État actuel de la pneumonie à P. carinii chez l’homme.

Aujourd’hui, la pneumocystose humaine reste une affection redoutée dans tousles cas d’immunodépression sévère, en particulier les déficits de l’immunité cellu-laire. Cependant, les progrès obtenus dans les thérapies antirétrovirales ainsi quela mise en place de mesures préventives systématiques pour certaines populationsà risque (personnes ayant subi une transplantation d’organe, patients VIH+) apermis de réduire notablement l’incidence et la létalité de la pneumonie à P. cariniidans ces populations. Ces mesures consistent en une chimio-prophylaxie essen-tiellement à base de cotrimoxazole. Malheureusement, ce traitement est souventmal toléré chez les patients VIH+. Voici les dernières recommandations du CDCconcernant ces patients (CDC, 1999a) :– Chez les adultes et les adolescents, la chimioprophylaxie doit être initiée dans

les cas suivants : un nombre de lymphocytes T CD4+ inférieur à 200 μl-1 ou desantécédents de candidose oropharyngée. Elle est à envisager si le pourcentagede lymphocytes T CD4+ est inférieur à 14 %, en cas d’antécédent de maladied’entrée en phase SIDA ou si le nombre de lymphocytes T CD4+ est inférieur à250 μl-1 et que le suivi de ce nombre au minimum une fois tous les trois moisn’est pas réalisable.

– Le seul produit recommandé en première intention est le cotrimoxazole, à ladose de 160 mg de triméthoprime et 800 mg de sulfaméthoxazole par jour ou àla dose de 80 mg de triméthoprime et 400 mg de sulfaméthoxazole, efficace etmieux tolérée. Un traitement à la dose de 160 mg de triméthoprime et 800 mgde sulfaméthoxazole trois fois par semaine est également envisageable.

A B C

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Aujourd’hui, la pneumocystose touche 40 % des sidéens, elle est l’infection si-gnant le passage au stade SIDA dans 25 % des cas et la mort survient dans 10 %des cas. Un rapport récent provenant d’un hôpital français (Yousfi et coll., 1999)indique une augmentation relative de la PPC inaugurale depuis la mise en placede la trithérapie, passant de 47,5 à 82,1 %. La méconnaissance de l’épidémiologiede l’infection limite la possibilité de mise en place de mesures de prophylaxie sa-nitaire efficaces, même si de plus en plus d’arguments tendent à conforterl’hypothèse d’une transmission directe de malade à personne sensible, voirel’intervention de personnes non sensibles dans la propagation de l’infection(Dumoulin et coll., 2000 ; Leigh et coll., 1993). Le problème posé par l’intoléranceau cotrimoxazole conduit à la recherche d’alternatives thérapeutiques. Les molé-cules actuellement utilisables sont la dapsone, associée ou non au triméthoprime,l’atovaquone, l’association clindamycine–primaquine et le trimétrexate. Tous cestraitements restent moins efficaces que le cotrimoxazole, mais d’autres moléculesprometteuses sont en cours de développement (échinocandines et pneumocandi-nes notamment). Dans les régions tropicales et équatoriales, l’incidence de la PPCparmi les sidéens était généralement considérée comme plus faible que dans lesrégions tempérées. Cependant, si la tuberculose reste la première infection op-portuniste frappant les sidéens d’Afrique sub-saharienne, il apparaît aujourd’huique l’incidence de la pneumocystose était sous-estimée. La différence entrerégions serait donc moindre que ce que l’on pensait. Les raisons de cette différencesont par ailleurs inconnues (Hughes, 1998 ; Russian et Kovacs, 1995).

La pneumocystose animale.

P. carinii a été retrouvé dans les poumons de très nombreuses espèces demammifères. Le parasite a notamment été décrit chez différents mammifères sau-vages ne présentant pas de signes de maladie : lapin, musaraigne, taupe, campa-gnol et différents autres petits rongeurs (Mazars et coll., 1997b), ainsi que chez desanimaux domestiques (chien, chat, poulain, porcelet, cobaye)(Bille-Hansen et coll.,1990 ; Chagas, 1909 ; Cho et coll., 1999 ; Whitwell, 1992). Lors de ces observations,le nombre de parasites était faible (parfois il a simplement été détecté par PCR) oules animaux étaient naturellement immunodéprimés [poulain atteint de déficienceimmunitaire combinée sévère (SCID)] ou malnutris (chien). L’exception étant leporcelet chez qui il semble que P. carinii puisse occasionnellement provoquer desinfections transitoires mais ayant des répercussions sur la croissance lors de stress.Ces infections ont causé des problèmes dans plusieurs élevages au Danemark(Bille-Hansen et coll., 1990). De l’ADN de Pneumocystis a également été retrouvédans les poumons de dix-huit espèces de primates non humains et des sporocystesont été détectés dans les poumons de cinq espèces de singes du nouveau monde(Demanche et al., 2001). Le champignon est également responsable de pneumoniesmortelles chez des macaques infectés par un virus chimère SHIV (simian-humanimmunodeficiency virus), ce qui constitue un modèle de PPC humaine (ce n’estgénéralement pas le but recherché par les équipes travaillant sur ce vi-rus !)(Durand-Joly et al., 2000). La souris, le rat et le furet sont les animaux les plussouvent utilisés comme modèles de PPC (Dei-Cas et coll., 1998). L’infection activeest obtenue par l’administration prolongée (6 à 12 semaines) de fortes doses decorticostéroïdes à des animaux de colonies naturellement infectées ou parl’inoculation (intra-nasale ou intra-trachéale) du parasite à des animaux naturel-lement immunodéprimés (souris SCID et rats nude principalement). Le lapin do-mestique, Oryctolagus cuniculus, quant à lui, possède la particularité de présenterune pneumocystose spontanée, systématique, intense mais le plus souventasymptomatique et spontanément résolutive vers la fin de son premier moisd’existence.

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Sous-chapitre 1.2 : Présentation de Pneumocystis carinii

Morphologie.

Toutes les formes connues de Pneumocystis carinii sont retrouvées dans lespoumons de mammifères (et exceptionnellement dans d’autres organes). La formela plus abondante est une forme végétative, uninucléée, amébiforme, mesurant 2 à8 μm (cf. photo 2A). Sa paroi n’est pas colorée par les colorants des sucres com-plexes (BTO, méthénamine d’argent). Elle apparaît composée d’une couche denseaux électrons en microscopie électronique à transmission (MET, cf. photo 2C).Cette paroi présente de nombreux prolongements cytoplasmiques filamenteux,étroitement associés aux pneumocytes de type I dans le poumon (cf. photo 2B etphoto 3). L’autre forme est un sporocyste, comportant à maturité huit spores (cf.photo 2D). Les sporocystes immatures comportent un nombre variable de noyaux,plus ou moins bien individualisés. La paroi de ces formes comporte une deuxièmecouche, interne à la couche dense aux électrons décrite chez les formes végétatives,qui est peu dense aux électrons (cf. photo 2F), et est colorable par les colorants dessucres complexes (cf. photos 2E).

photo n°2 : aspects morphologiques de P. carinii en microscopie optique et électronique (Dei-Cas,communication personnelle et Dei-Cas et Aliouat, 2000).A : formes végétatives de Pneumocystis de rat obtenues par culture sur monocouche de cellules detype épithélial alvéolaire de rat de la lignée L2 et colorées au méthanol-GiemsaB : formes végétatives de Pneumocystis de rat adhérant à des cellules L2 en culture, observées enmicroscopie électronique à balayage.C : forme végétative de Pneumocystis de rat adhérant à une cellule de type épithélial alvéolaire hu-maine de la lignée A549 en culture, observée en MET.D : empreinte de poumon de lapin parasité par Pneumocystis carinii, colorée au méthanol-Giemsa.On remarque un sporocyste mature à 8 noyaux (flèche épaisse) et quelques formes végétatives(flèche fine).E : homogénat de poumon de lapin parasité par Pneumocystis carinii, coloré au BTO, montrant plu-sieurs sporocystes.F : sporocyste mature de Pneumocystis carinii observé en MET montrant quatre spores. On remar-que le noyau (flèche épaisse) et la mitochondrie (flèche fine) de ces spores.

A B C

D E F

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L’utilisation de techniques de fixation à pression osmotique élevée (Palluault etcoll., 1992) a permis de mieux visualiser l’ultrastructure interne du parasite. Pneu-mocystis carinii comporte l’ensemble des organites classiquement observés dansune cellule eucaryote : une mitochondrie unique, volumineuse, comportant descrêtes d’abord tubulaires chez la forme végétative et devenant lamellaires lors dela formation du sporocyste (Palluault et coll., 1992) ; un réticulum endoplasmiqueet un appareil de Golgi bien développés ; un système d’endosaccules membranai-res.

photo n°3 : forme végétative de P. carinii étroitement associée à un pneumocyte de type I, observéeen MET (Dei-Cas, communication personnelle). On remarque les prolongements cytoplasmiques(flèche épaisse) et la persistance de la membrane plasmique de la cellule de l’hôte (flèche fine).

Position taxonomique.

La position taxonomique de P. carinii a longtemps été discutée. Au vu de samorphologie, il a d’abord été considéré comme un protozoaire [Les Delanoë (1912)le rapprochaient a priori des coccidies, sans être affirmatifs], bien que l’hypothèsefongique soit très tôt envisagée (Vavra et Kučera, 1970).

Les arguments allant dans le premier sens étaient la morphologie amiboïde desformes végétatives, l’absence de croissance sur les milieux usuels de culture fongi-que, la sensibilité à certains médicaments actifs sur les protozoaires (sulfamides,pentamidine, pyriméthamine) et la résistance aux antifongiques courants (po-lyènes, azoles), l’absence d’ergostérol dans la membrane. Parmi les protozoaires,Pneumocystis carinii a été rattaché à différents groupes : amibes (« trophozoïtes »amiboïdes, kystes à huit noyaux), coccidies, cryptosporidies (Euzéby, 1987, p 328),et ce malgré l’absence de complexe apical observable.

En faveur de la thèse fongique, on peut citer les affinités tinctoriales du parasite,liées à la composition de sa paroi cellulaire, riche en β-glucanes et en α-mannaneset contenant de la chitine, certaines communautés antigéniques avec des champi-gnons (Lundgren et coll., 1992), ainsi que des observations ultrastructuralescontestables lorsque des techniques de fixation adaptées sont utilisées (Palluault etcoll., 1992). Mais si la nature fongique de P. carinii est maintenant largement ac-ceptée, c’est essentiellement du fait de l’accumulation d’arguments moléculaires.Ces arguments moléculaires ont également conduit Eriksson en 1994 à classer P.

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carinii dans une nouvelle famille (Pneumocystidaceae) d’un nouvel ordre (Pneumo-cystidales) des Ascomycota (Eriksson, 1994). Les séquences des gènes suivants ontconduit à cette nouvelle classification : ARNr 18S, 5,8S, 26S et 5S, facteur de trans-cription IID, ATPase de la membrane plasmique, β-tubuline, facteur d’élongation3, thymidylate synthétase, dihydrofolate réductase et calmoduline. Cette classifi-cation n’a cependant pas encore reçu une acceptation générale parmi les spécia-listes de la biologie moléculaire de Pneumocystis. En effet, certaines séquences, no-tamment dans l’ADN mitochondrial, rapprochent P. carinii des Basidiomycota(Wakefield et coll., 1992). Au vu de ces données moléculaires et des nombreux ca-ractères morphologiques et biologiques atypiques du parasite, on pourrait consi-dérer qu’il appartient à un groupe de champignons distinct de ceux qui sontdécrits à ce jour. Pour ce travail, nous avons donc décidé d’adopter une nomen-clature fongique pour les différentes formes de P. carinii, plutôt que la nomencla-ture la plus largement utilisée jusqu’il y a peu et tirée du monde des protozoaires,mais sans utiliser de termes spécifiques aux ascomycètes : formes végétativesplutôt que trophozoïtes, sporocystes – vésicule sporogène fermée ne s’ouvrantqu’à maturité pour libérer des amas de spores (Euzéby, 1992, p 12), ce qui corres-pond à la morphologie observée chez Pneumocystis – et spores, mais pas asques etascospores, plutôt que kystes et corps intrakystiques.

Le développement des techniques de typage de P. carinii au cours des années1990 a permis de mettre en évidence au sein de l’espèce une hétérogénéité plusimportante que ce que l’on supposait jusque-là. De plus, cette hétérogénéité appa-raissait liée à l’espèce de l’hôte du parasite : les différentes souches de P. cariniiinfectant une même espèce hôte montrent des divergences génétiques et iso-enzymatiques très inférieures à celles observées entre des organismes infectant desespèces différentes (Dei-Cas et coll., 1994). Des expériences d’infection croisée ontconfirmé l’absence de développement du parasite obtenu à partir d’un hôte donnéchez un hôte d’une autre espèce (Aliouat et coll., 1994). En 1994, à Cleveland, il aété décidé de revoir la nomenclature de l’espèce Pneumocystis carinii. L’état desconnaissances a été jugé encore insuffisant pour justifier la création de nouvellesespèces au sein du genre Pneumocystis [En 1976 pourtant, Frenkel avait déjà pro-posé la nouvelle espèce P. jiroveci pour désigner les parasites de l’homme (Frenkel,1976)]. On a donc décidé l’utilisation de formae speciales nommées en fonction dugenre de l’hôte. Aujourd’hui on distingue : P. carinii f. sp. carinii, P. carinii f. sp.ratti, P. carinii f. sp. rattus-secundi, P. carinii f. sp. rattus-tertii et P. carinii f. sp. rattus-quarti tous les six chez le rat, P. carinii f. sp. hominis chez l’homme, P. carinii f. sp.oryctolagi chez le lapin, P. carinii f. sp. muris chez la souris, P. carinii f. sp. mustelaechez le furet, P. carinii f. sp. suis chez le porc et P. carinii f. sp. macacae chez le ma-caque rhésus. On discute maintenant de l’opportunité d’élever certaines de cesformae speciales les mieux caractérisées au rang d’espèce (notamment P. carinii f. sp.muris, P. carinii f. sp. hominis, voire P. carinii f. sp. oryctolagi), P. carinii f. sp. cariniiservant de type à l’espèce P. carinii. On peut déjà faire deux remarques. D’unepart, certaines formae speciales ne sont définies que sur une séquence nucléique (enl’occurrence celle qui code la grande sous-unité de l’ARN ribosomal mitochon-drial). Or malgré la valeur phylogénétique de ce gène, on peut s’interroger surl’intérêt de donner un rang taxonomique à chaque clone de Pneumocystis porteurd’un nouvel allèle. D’autre part, le Code International de la Nomenclature Botani-que (Code de Tokyo) précise dans la note 3 de son article 4 : en classant des para-sites, surtout des champignons, les auteurs qui n'attribuent pas de rang spécifique,subspécifique ou variétal aux taxons reconnaissables par leurs caractères physio-logiques mais à peine ou pas du tout par leurs caractères morphologiques, peu-vent distinguer, à l'intérieur de l'espèce, des formes spéciales (formae speciales), ca-ractérisées par leur adaptation à des hôtes différents, mais dont la nomenclaturen'est pas réglée par les dispositions de ce Code (version française par H. M. Bur-det). Peut-on encore parler d’adaptation à des hôtes différents quand on décrit six

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formae speciales chez le même hôte ? Il devient donc plus que nécessaire d’au moinspréciser à nouveau les règles de nomenclature des Pneumocystis.

Biologie.

Le cycle cellulaire de P. carinii reste très mal connu. L’existence d’une multipli-cation sexuée aboutissant à la formation du sporocyste repose sur l’observation en1984 par Matsumoto et Yoshida de complexes synaptonémaux dans des sporo-cystes immatures du parasite (Matsumoto et Yoshida, 1984). Cette observation aconduit ces auteurs à proposer un cycle hypothétique de multiplication, cycle dontune version un peu modifiée a été publiée par Yoshida en 1989 (cf. figure 2)(Yoshida, 1989). Ce cycle reste admis par la plupart des auteurs à ce jour. Unemultiplication asexuée des formes végétatives associée à une reproduction sexuéeconduisant à la formation d’un sporocyste à huit spores (ou asque) correspondbien à ce que l’on attend d’un ascomycète, famille à qui P. carinii a été rattaché surbase d’arguments essentiellement moléculaires (Eriksson, 1994). La récente mesuredes taux de croissance des différentes formes du parasite en culture (Aliouat etcoll., 1999) ne remet pas non plus en cause ce cycle.

figure n°2 : cycle cellulaire de P. carinii dans l’alvéole (Yoshida, 1989). La nomenclature des formesde Pneumocystis est celle utilisée par Yoshida : trophozoïte pour les formes végétatives et prékyste(précoce, intermédiaire et tardif) ou kyste pour les sporocystes, en fonction de leur degré de matu-rité.

Le système de culture continue récemment décrit (Merali et coll., 1999) permet-tra peut-être de confirmer ou d’infirmer cette hypothèse sans réelle alternative de-puis quinze ans. Ces deux formes sont retrouvées in vivo dans l’alvéole pulmo-

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naire. Les formes végétatives sont le plus souvent étroitement associées auxpneumocytes de type 1 par l’intermédiaire de leurs prolongements filamenteux,mais restent extracellulaires. Il n’a été constaté en MET aucune fusion membra-naire entre les deux types cellulaires (cf. photo 3). P. carinii ne montre en outre au-cune tendance invasive et ne quitte que rarement la lumière alvéolaire.L’intervention de différentes molécules d’adhésion a été mise en évidence, no-tamment l’interaction de la glycoprotéine majeure de surface (MSG) de P. cariniiavec la fibronectine et la vitronectine (Limper et coll., 1993 ; Pottratz et coll., 1991).Par contre, les relations trophiques que P. carinii entretient avec son hôte restentinconnues.

Pour ce qui est de la survie ou de la multiplication de P. carinii en-dehors de sonhôte, très peu de données sont disponibles. Des expériences de PCR sur filtres ontpermis de détecter de l’ADN de Pneumocystis dans les chambres de patients at-teints de PPC (Bartlett et coll., 1994), ainsi que dans la campagne anglaise(Wakefield, 1994). Le volume d’air filtré était de 1 m3 dans le premier cas et trèssupérieur dans le second. Ces expériences rendent compte de la présence probablede P. carinii dans l’environnement (bien qu’elles ne démontrent pas la présenced’organismes complets et viables), mais sans que l’on puisse préjuger de la duréede viabilité de ces organismes en dehors de leur hôte, et encore moins parler del’existence d’une forme libre de l’organisme. Cependant la pneumocystose est trèsfréquente dans les populations sensibles et la séroconversion des enfants trèsprécoce [près de 100 % avant deux ans d’après Meuwissen et coll., 1977(Meuwissen et coll., 1977)], ce qui laisse supposer une importante circulation duparasite. Or P. carinii est très rarement retrouvé dans le poumon en-dehors desépisodes de pneumocystose (recherche nécropsique par immunofluorescence ouPCR), ce qui restreint le réservoir humain aux seuls malades, peu nombreux(Millard et Heryet, 1988 ; Peters et coll., 1992). L’association d’une grandefréquence de contact avec l’organisme et d’un réservoir humain très limité laissesupposer l’existence d’un réservoir extra-humain. Or l’ensemble des argumentsmoléculaires et des expériences d’infection croisée effectuées vont dans le sensd’un sténoxénisme étroit, voire d’un holoxénisme, des différentes formae specialesde P. carinii (Dei-Cas, 2000). L’existence d’un réservoir animal (ou en tout casmammalien) semble donc peu probable. Il est donc possible qu’un réservoir envi-ronnemental non mammalien de P. carinii existe, que celui-ci soit biotique ou non.Il reste cependant totalement inconnu à l’heure actuelle.

Le mode de transmission de P. carinii le mieux connu reste la transmissionaérienne d’un individu infecté à un individu réceptif. Celle-ci est très rapide etefficace : une souris SCID infectée peut transmettre le parasite à au moins vingt deses congénères en moins de 24 heures (Soulez et coll., 1991). Récemment on a pumontrer, toujours chez la souris, qu’un individu non immunodéprimé donc nonréceptif pouvait servir de vecteur du parasite entre un individu infecté et un indi-vidu réceptif (Dumoulin et coll., 2000). Cette observation peut avoir des con-séquences importantes, notamment en ce qui concerne les mesures à prendre pourprotéger des individus sensibles en milieu hospitalier où peuvent être hébergésdes individus atteints de pneumocystose, en particulier vis-à-vis du personnel soi-gnant. L’autre mode de transmission démontré semble jusqu’ici n’être fréquentque chez le lapin. Il s’agit d’une transmission transplacentaire qui survient mêmechez des individus non immunodéprimés et qui constitue l’infection primaire à P.carinii dans cette espèce (Céré et coll., 1997a).

Aspects immunologiques.

Comme il a déjà été signalé, la séroconversion vis-à-vis de P. carinii est précoceet fréquente. La majorité des individus porte donc des anticorps anti-Pneumocystis.Chez les patients VIH+, on observe le plus souvent une chute du taux d’anticorpsanti-P. carinii (Peglow et coll., 1990). Ce taux remonte généralement après un épi-

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sode de PPC, avec production d’immunoglobulines de classe M (IgM) puis d’IgG.Cependant cette réponse reste faible par rapport à celle qui peut être observéechez des individus VIH-, même immunodéprimés (Elvin et coll., 1994). Chez lasouris, on a observé que l’absence de lymphocytes B empêchait la résolution de lapneumocystose expérimentale. De même l’immunisation active ou passive protègel’animal de l’infection (Gigliotti et Hughes, 1988 ; Harmsen et coll., 1995). Les anti-corps dirigés contre la MSG ont été les mieux étudiés, et ils ne sont pas protecteurs(Gigliotti et coll., 1998). Parmi les antigènes immunodominants, un antigène de 45-55kDa chez le rat (35-45 kDa chez l’homme) semble jouer un rôle majeur dansl’induction d’une immunité humorale efficace (Smulian et coll., 2000). Des exp-ériences chez la souris ont montré qu’un taux d’anticorps protecteur pouvait êtremaintenu même au cours de l’immunodépression, laissant entrevoir des perspec-tives vaccinales pour les populations à risque. Par contre, l’orientation Th1 ou Th2de la réponse anticorps chez cet animal n’influence pas la résolution de l’infection(Garvy et coll., 1997). Par ailleurs, on peut noter que la MSG est un antigène varia-ble (Edman et coll., 1996). En effet, le génome de P. carinii contient plusieurs cen-taines de copies du gène de la MSG, mais un seul site d’expression. Des phénomè-nes de recombinaison permettent au champignon d’exprimer successivementplusieurs allèles du gène. Cette variation antigénique permettrait au parasited’échapper plus facilement à un système immunitaire déjà incapable de dévelop-per une réponse anticorps performante.

En ce qui concerne l’immunité cellulaire, différents éléments montrentl’importance des lymphocytes T CD4+ : le risque de survenue d’une PPC chez lesindividus VIH+ est inversement proportionnel au taux de ces lymphocytes, deve-nant élevé en dessous de 200 mm-3 (Montgomery, 1989). Chez l’animal, les ani-maux SCID, athymiques ou déplétés en lymphocytes T CD4+ à l’aide d’un anti-corps monoclonal spécifique sont sensibles à l’infection. Les mécanismesimpliqués ne sont pas connus, mais l’intervention des lymphocytes T CD8+ n’estpas nécessaire (Harmsen et Stankiewicz, 1990). Ces cellules pourraient être impli-quées dans l’activation des lymphocytes B et l’induction de la productiond’anticorps, ainsi que dans l’activation des macrophages. On a montré chez le ratque ces derniers intervenaient au moins dans la phase précoce du contrôle del’infection (Limper et coll., 1997), mais en l’absence de réponse immune spécifiqueils ne suffisent pas à éliminer le parasite, comme le montre la sensibilité d’animauxprésentant une activité macrophagique non altérée : animaux SCID, athymiquesou déplétés en lymphocytes T CD4+.

Aspects histologiques de la PPC.

La PPC se traduit par une inflammation du parenchyme pulmonaire présentantdes caractères histologiques communs à l’ensemble des espèces étudiées (Creusyet coll., 1996). Le tissu pulmonaire présente une congestion diffuse. Les cloisonsinteralvéolaires sont épaissies et il existe un infiltrat constitué essentiellement decellules mononucléées. Les pneumocytes de type II voient leur nombre et leurtaille augmenter. On observe une augmentation du nombre de macrophages ac-tivés. Différentes formes de P. carinii sont présentes dans les alvéoles et des imagesde parasites phagocytés par les macrophages alvéolaires et plus ou moinsdégradés ne sont pas rares. Quelques organismes se retrouvent également entreles cellules épithéliales ou dans l’interstitium, sans que l’on puisse affirmer qu’ilexiste une pénétration active du parasite à travers l’épithélium alvéolaire.

Cependant des différences marquées existent entre les différents modèles etl’homme. Ainsi, chez le rat Wistar sous corticoïdes, la fibrose collagène est mo-dérée, l’infiltrat diffus et le matériel éosinophile spumeux en « nids d’abeille » ca-ractéristique est plus ou moins abondant.

Chez la souris sous corticoïdes, là aussi, la fibrose collagène est modérée etl’infiltrat diffus. Le matériel éosinophile est retrouvé à la surface de l’épithélium

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alvéolaire, et les colorations comme le PAS, le BTO ou la coloration de Gomori-Grocott permettent de mettre en évidence des parasites peu nombreux accolés àl’épithélium alvéolaire.

Chez la souris SCID, si l’infiltrat est ici aussi diffus et si la fibrose collagène restemodérée, le matériel éosinophile comble l’alvéole. La microscopie électronique àtransmission montre que ce matériel est constitué essentiellement de P. carinii,sans exsudat ni débris cellulaires. Quelques parasites sont retrouvés dans la lu-mière des bronchioles dont l’épithélium montre des foyers d’hyperplasie.

Chez le patient sidéen, la fibrose collagène est intense, et les lésions alvéolairessont majeures, avec nécrose, formation de cavités et présence de membranes hya-lines à la surface de l’alvéole. L’infiltrat, diffus, est riche en granulocytes neutro-philes, et quelques éosinophiles sont parfois observés. Les pneumocytes de type IIsont hyperplasiés. Le matériel éosinophile, constitué de nombreux Pneumocystislibres ou en amas, comble les alvéoles. L’épithélium bronchiolaire présente parfoisdes zones d’atrophie et de desquamation.

À l’opposé de ce tableau cataclysmique, les lésions observées chez le lapin ausevrage sont beaucoup plus discrètes : la congestion est faible, la fibrose collagèneabsente. L’infiltrat, au sein duquel dominent les plasmocytes, présente un aspectnodulaire caractéristique, et des éosinophiles, bien que peu nombreux, sontprésents de manière constante. Les parasites, en moins grand nombre que dans lesautres espèces, sont adhérents à l’épithélium alvéolaire, libres dans la lumièrebronchiolaire ou phagocytés. Enfin, le matériel éosinophile spumeux n’est observéque dans les cas les plus sévères.

Quelques éléments de physiopathologie.

Les formes végétatives de P. carinii apparaissent intimement associées auxpneumocytes de type I. Les prolongements filamenteux du parasite pénètrent pro-fondément dans le cytoplasme de ces cellules, qui émettent à leur tour des excrois-sances au niveau des zones en contact avec Pneumocystis (Creusy et coll., 1996 ;Dei-Cas et coll., 1991, cf. photo 4). Cependant, on n’observe pas de solution decontinuité de la membrane plasmique de la cellule hôte, qui reste intacte et tou-jours distinguable de la paroi cellulaire du champignon. Par contre, la MET per-met de mettre en évidence de nombreuses petites vésicules intracytoplasmiquesdans les cellules épithéliales alvéolaires, à proximité des zones de contact avec lespneumocystes (Nielsen et Settnes, 1991). Elles pourraient jouer un rôle dans lanutrition du parasite. Ces vésicules, observées dans les poumons de rats traitésaux corticoïdes, n’ont pas été retrouvées dans les cellules L2 lors de co-cultureavec P. carinii (Aliouat et coll., 1993). L’attachement de P. carinii aux cellules épi-théliales in vitro suppose que le parasite et la cellule-cible soient vivants [la con-gélation ou la fixation par le formol de P. carinii préalablement au test d’adhésionou le traitement par la pentamidine, qui tue le parasite, ainsi que la fixation pré-alable des cellules-cibles par le formol inhibent l’adhésion (Aliouat et al., 1993)]. Lapremière étape de cet attachement fait intervenir la fibronectine et la vitronectine(Limper et al., 1993 ; Pottratz et Martin., 1990). On sait que la MSG de Pneumocystiscarinii fixe la fibronectine (Pottratz et al., 1991) et augmente l’expression des in-tégrines α5 (qui portent des récepteurs à la fibronectine) à la surface de cellulesA549 en culture (Pottratz et al., 1994). De plus l’aptitude de différentes lignéescellulaires à permettre l’attachement et la croissance de P. carinii in vitro sembleliée à la quantité de fibronectine qu’elles expriment (Aliouat, 1995). Le cytosque-lette du parasite intervient également dans l’attachement, comme le montrel’inhibition partielle de cet attachement par la cytochalasine B, qui inhibe la po-lymérisation de l’actine. Par contre, l’intégrité du cytosquelette de la cellule hôten’est pas indispensable (Aliouat et al., 1993).

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photo n°4 : alvéole pulmonaire parasitée par P. carinii en MET (Dei-Cas, communication person-nelle). On remarque un sporocyste avec plusieurs spores en train de se différencier autour desnoyaux (flèche épaisse) et plusieurs formes végétatives adhérant aux pneumocytes de type I etémettant de nombreux prolongements filamenteux (flèche fine).

Au cours de la PPC, le surfactant pulmonaire est profondément altéré. Ces al-térations apparaissent très précocement au cours de l’infection, avant même que leparasite ne soit détectable dans le LBA (Aliouat et coll., 1998 ; Escamilla et coll.,1992). Chez le sidéen, les changements comprennent une augmentation des quan-tités de protéines hydrophiles [SP-A et SP-D (Limper et coll., 1995 ; Phelps et Rose,1991)] ainsi qu’une diminution des quantités de phospholipides, avec réductiondes diacylglycérophospholipides et de la phosphatidylcholine et une augmenta-tion de la proportion de lysophosphatidylcholine (Escamilla et coll., 1993 ; Esca-milla et coll., 1992 ; Hoffman et coll., 1992). Des changements similaires ont étéobservés chez le rat sous corticoïdes (mais les corticoïdes eux-mêmes ont des effetsimportants sur la composition du surfactant), la souris SCID et le lapin au sevrage(Aliouat et coll., 1998 ; Phelps et coll., 1996 ; Sheehan et coll., 1986). Le caractèreprécoce de ces changements, en l’absence d’inflammation observable et alors quele nombre de parasites est encore faible, semble indiquer un rôle direct de P. cariniisur le métabolisme du surfactant (Aliouat et coll., 1998). Cependant, plus tardive-ment au cours de l’infection, la transsudation plasmatique, induite parl’inflammation et l’augmentation de la perméabilité de la membrane alvéolo-capillaire due au parasite (Yoneda et Walzer, 1981), joue également un rôle dansles modifications observées, qui ne sont d’ailleurs pas spécifiques de la PPC(Phelps, 1995). In vitro, l’adjonction de surfactant artificiel (dipalmitoylphosphati-dylcholine) ou semi-naturel (phospholipides et protéines hydrophobes) à uneculture de P. carinii sur cellules L2 (cf. infra) inhibe le développement du parasite(Aliouat et coll., 1998). Chez le rat, Eijking et coll. ont pu obtenir une nette amélio-ration de la fonction respiratoire au cours de la PPC par administration de surfac-tant en aérosol (Eijking et coll., 1991).

Chez le patient sidéen, la PPC se traduit à la fois par une insuffisance respira-toire progressive et des lésions inflammatoires intenses. Il est donc logique depenser que ces phénomènes inflammatoires ont une incidence sur la fonction res-piratoire. Cette participation de l’inflammation à la physiopathologie de la PPC aété récemment vérifiée chez la souris (Wright et coll., 1999). Dans les modèles oùl’inflammation est importante (souris déplétée en lymphocytes T CD4+ ou souris

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SCID reconstituée), on observe une diminution de la compliance du poumon etune hypoxie, alors que dans les modèles où cette inflammation est faible ouinexistante (souris déplétée à la fois en lymphocytes T CD4+ et CD8+ ou sourisSCID), la compliance pulmonaire et la fonction respiratoire sont préservées malgréle développement de l’infection. D’ailleurs, chez l’homme, l’administration decorticoïdes au cours de PPC d’intensité moyenne à sévère permet d’obtenir uneamélioration de la fonction pulmonaire beaucoup plus rapide que lors del’utilisation d’anti-infectieux seuls.

P. carinii in vitro.

Toutes les tentatives de culture de P. carinii sur les milieux usuels, et en parti-culier les milieux couramment utilisés en mycologie, ont échoué. La co-culture dece champignon avec une lignée cellulaire permet dans le meilleur des cas d’obtenirune certaine croissance du parasite les premiers jours, mais après deux à trois re-piquages (soit environ une semaine), les parasites commencent à mourir. Lesmeilleurs résultats ont été obtenus avec des parasites de rat et des lignées de cel-lules épithéliales alvéolaires murines (L2 par exemple) ou humaines (comme lesA549), en milieu minimum essentiel additionné de dix à vingt pour cent de sérumde veau fœtal, à 35-37°C sous atmosphère enrichie à 5 % de CO2 (Atzori et coll.,1998). Des résultats à peu près comparables ont récemment été obtenus avec desparasites de souris (Beck et coll., 1996). Les cultures à court terme sont déjà large-ment utilisées par certaines équipes (Atzori et al., 1998)pour obtenir de grandesquantités de parasites débarrassés des contaminants issus du poumon de l’hôte.Chez le lapin, une technique de culture d’explants pulmonaires parasités permetde maintenir la viabilité des parasites pendant au moins vingt et un jours (Dei-Caset coll., 1989). Malheureusement cette technique ne résout pas le problème de laséparation du parasite d’avec le tissu pulmonaire et elle est de fait restée peu uti-lisée. Récemment, la culture continue de P. carinii issu de rat a pu être obtenue parune équipe, ce qui constitue, si l’expérience peut être reproduite, un progrèsconsidérable pour l’étude de P. carinii (Merali et coll., 1999). Cette culture est ré-alisée en plaque de culture à six puits, sur membrane recouverte de collagène,dans un milieu enrichi de différents facteurs de croissance (putrescine). La culturepourrait être repiquée indéfiniment, le parasite est infectieux pour le rat et résiste àla congélation. Ce système de culture pourrait fonctionner également pour desparasites d’origine humaine.

Sous-chapitre 1.3 : Aspects épidémiologiques de l’infection humaine

Importance du statut immunitaire.

La PPC a d’abord été décrite chez de jeunes enfants dénutris, des prématurés oudes enfants atteints de déficit immunitaire congénital. Dans ces trois cas,l’existence de déficits immunitaires est patente et touche souvent l’ensemble descomposantes du système immunitaire. À partir des années 1970, ce sont les im-munodépressions iatrogènes (chimiothérapie anti-cancéreuse ou traitement contrele rejet de greffes d’organes) qui ont été à l’origine de la plupart des cas de PPC. Iciaussi, l’immunodéficience est importante et souvent générale (avec l’utilisation defortes doses de corticostéroïdes par exemple). Cependant l’utilisation de nouveauxtraitements comme la ciclosporine, qui cible plus spécifiquement les lymphocytesT, ne réduit pas réellement le risque de PPC, qui apparaît donc lié avant tout auxdéficits de l’immunité à médiation cellulaire. Et cela s’est vu confirmé par le faitque la PPC a explosé avec la pandémie de SIDA, qui affecte surtout les lympho-cytes T CD4+ (mais aussi les macrophages). Quelques cas de PPC chez des patients

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ne présentant pas d’immunodépression apparente ont néanmoins exceptionnelle-ment été signalés (Cano et coll., 1993).

Voies de transmission du parasite.

Chez l’homme, la seule voie de transmission communément admise est la voieaérienne. La voie transplacentaire a été évoquée dans un cas de PPC active chez lamère sidéenne (Mortier et coll., 1995) mais semble pour le moins rare. L’existencede petites « épidémies » hospitalières de PPC montrant le même type de parasitechez différents patients ayant été en contact les uns avec les autres suggère le rôleimportant des malades dans la transmission de l’infection et le caractère éven-tuellement nosocomial de la PPC (Laing, 1999 ; Touzet et coll., 2000). Des recher-ches par immunofluorescence ou par PCR de P. carinii dans les poumons de per-sonnes mortes d’autres causes n’ont pas permis de mettre en évidence le parasite(Millard et Heryet, 1988 ; Peters et coll., 1992). Il semble donc que la présence duparasite chez des individus immunocompétents soit exceptionnelle ce qui est endéfaveur du rôle de ces individus dans la transmission de l’infection. Cependantdes résultats récents obtenus chez la souris ont montré qu’un individu immuno-compétent pouvait abriter le parasite de manière transitoire et servir de vecteur del’infection d’un individu infecté à un individu sensible (Dumoulin et coll., 2000).Les études menées pour tenter de découvrir un rôle du personnel hospitalier dansla transmission du parasite n’ont pour l’instant pas permis d’aboutir aux mêmesconclusions, à une exception près (Lidman et coll., 1997 ; Vargas et coll., 2000).Récemment, on a décrit le portage occasionnel, mis en évidence par PCR dans leliquide de LBA, de P. carinii chez des individus immunodéprimés VIH+ ou VIH-,en l’absence de tout signe de PPC (même après un suivi de plusieurs mois). Cesindividus, qualifiés de porteurs, pourraient avoir un rôle épidémiologique nonnégligeable dans l’environnement hospitalier (Nevez et coll., 1999a).

Une autre question importante qui se pose vis-à-vis des patients faisant unePPC est la persistance de l’infection après la guérison clinique. En particulier, unsecond épisode de PPC chez un patient donné constitue-t-il une réactivation d’uneinfection latente ou résulte-t-il d’une infection de novo ? Le développement du ty-page de Pneumocystis carinii par séquençage de fragments génomiques amplifiéspar PCR a permis d’apporter un début de réponse. En effet, ce typage a permis demontrer que dans la majorité des cas, la souche de P. carinii isolée lors du secondépisode est différente de celle qui a été isolée lors du premier épisode, en particu-lier lorsque les deux épisodes sont séparés de plus de quatre mois. Dans la majo-rité des cas, le deuxième épisode de PPC résulte donc d’une nouvelle infectionindépendante de celle ayant donné lieu au premier épisode. Cependant, dansquelques cas, le type retrouvé est le même lors des deux épisodes. On peut doncavoir affaire à une recontamination avec un parasite de la même souche ou à uneréactivation d’une infection restée latente depuis le traitement du premier épisode.La plus grande fréquence de ces cas lorsque les deux épisodes sont rapprochéslaisse penser que le parasite peut persister un certain temps après traitement etl’on pourrait dans ce cas parler de rechute (Latouche et coll., 1997b).

Sous-chapitre 1.4 : La problématique de la primo-infection

Si la source de l’infection à Pneumocystis carinii reste mal connue, on sait depuislongtemps que la présence d’anticorps circulants vis-à-vis de P. carinii estfréquente. Ces anticorps apparaissent avant l’âge de quatre ans chez la grandemajorité des enfants, que ce soit de ce côté-ci de l’Atlantique ou aux Etats-Unis(Meuwissen et coll., 1977 ; Pifer et coll., 1978). Ces anticorps se retrouvent jusqu’àl’âge adulte. Il semble donc y avoir un contact précoce de l’homme avec P. carinii,contact immunisant a- ou paucisymptomatique – les infections respiratoires béni-

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gnes sont fréquentes chez le petit enfant, et l’étiologie en est rarement recherchée.Les conséquences de cette primo-infection ne sont pour l’heure pas connues.Quelle est l’importance de l’immunité acquise au cours de cette primo-infectiondans la résistance future à une pneumocystose clinique ? Quels sont les mécanis-mes immunitaires mis en jeu lors de cet épisode ? Que devient le parasite après ledéveloppement de la réponse immunitaire ? Autant de questions aujourd’hui sansréponse, et malgré tout essentielles à la compréhension de l’histoire naturelle de lapneumocystose humaine. Il semble simplement que l’on ne retrouve pas le cham-pignon chez l’adulte en dehors des épisodes de PPC évolutive. Quelle est alors lasource, le réservoir de l’infection. Un développement asymptomatique et limitédans le temps chez les jeunes enfants suffit-il à assurer une circulation du parasiteexpliquant la fréquence de la PPC dans certaines populations ? Il semble au-jourd’hui que devant les limites pratiques du travail sur l’être humain, la pneumo-cystose spontanée du lapereau soit le seul modèle permettant d’aborder ces ques-tions.

Sous-chapitre 1.5 : Moyens d’étude

Possibilités d’étude chez l’homme.

En l’absence de système de culture de P. carinii f. sp. hominis (même à courtterme), les études chez l’homme se font in vivo (ou « in morti »). Parmi les pre-mières études menées chez l’homme figurent la description clinique de la PPC etson étude histologique sur les patients qui en sont morts. Toujours sur les cada-vres, des recherches ont été menées pour tenter de découvrir le parasite dans lespoumons d’individus morts de causes sans rapport avec P. carinii. Les résultats– négatifs – de ces études confortent la thèse selon laquelle P. carinii ne persiste pasdans le poumon après une infection (Millard et Heryet, 1988 ; Peters et coll., 1992).Les autres études chez l’homme ayant eu un impact important sur la connaissancede l’épidémiologie de la maladie sont les études sérologiques. Ce sont elles no-tamment qui ont permis de mettre en évidence la primo-infection (Meuwissen etcoll., 1977 ; Pifer et coll., 1978). Enfin, différentes techniques de prélèvement per-mettent de récupérer des parasites d’origine humaine à des fins expérimentales.Le typage de ces parasites a déjà donné lieu à des avancées dans le cadre del’épidémiologie (Hauser et coll., 2001 ; Latouche et coll., 1997a ; Lu et coll., 1994), etdes tentatives de culture sont en cours. Selon Merali et coll. (Merali et coll., 1999),la technique de culture axénique en continu qu’ils ont décrite pour P. carinii de ratfonctionne également avec P. carinii f. sp. hominis. Si ces résultats sont confirmés,cela constituerait le plus gros progrès jamais obtenu dans le développementd’outils d’étude de la pneumocystose humaine. Le développement de techniquesde détection et de typage très sensibles comme la PCR facilite beaucoup ces tra-vaux en permettant le recours à des techniques moins invasives que le LBA (pos-sible uniquement lorsque des impératifs cliniques le justifient), comme le lavageoropharyngé

Les modèles animaux.

Les principaux modèles utilisés pour étudier la PPC sont basés sur des rongeursfortement immunodéprimés (Dei-Cas et coll., 1998). On utilise essentiellement :– le rat (de souche Wistar ou Sprague-Dawley le plus souvent) traité pendant

huit à douze semaines avec de fortes doses de corticostéroïdes (par exemple2 mg de dexaméthasone par litre d’eau de boisson). Ces animaux, provenantde colonies naturellement infectées par P. carinii développent spontanémentune infection intense. Ces animaux sont la principale source des parasites uti-

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lisés pour les études in vitro et pour l’infection de rats naturellement indemnes.Les études menées chez ces animaux sont limitées par les très nombreux effetsmétaboliques et immunologiques des corticoïdes.

– le rat nude, athymique, inoculé par voie intratrachéale. Chez ces animaux,l’infection est mieux maîtrisée et plus constante, surtout si l’on ajoute une fai-ble dose de corticoïdes (0,8 mg de dexaméthasone par litre d’eau de boisson).Ce modèle est couramment utilisé pour les tests thérapeutiques.

– la souris (souvent de souche balb/c), traitée aux corticoïdes, comme source deparasites pour la souris.

– la souris SCID et de nombreux mutants spécifiques ont été beaucoup utiliséspour l’étude du rôle de telle ou telle composante de la réponse immune.

En plus de ces modèles courants, le furet et le singe ont été utilisé pour dif-férentes expériences de typage. Le porcelet présente assez régulièrement unepneumocystose clinique qui a posé problèmes dans plusieurs élevages au Dane-mark (Bille-Hansen et coll., 1990). Cependant, le caractère inconstant de cette in-fection ainsi que la rareté des installations expérimentales capables d’acceuillir desporcs limitent l’intérêt de ce modèle. De plus le caractère clinique marqué de cetteprimo-infection la différencie nettement de celle observée chez l’homme.

Intérêt du lapin.

Le lapin a été proposé il y a de nombreuses années comme modèle d’infection àP. carinii (Sheldon, 1959). Cependant, c’est l’existence, mise en évidence en 1989,d’une primo-infection à P. carinii spontanée, constante et massive chez cette espècequi en fait l’intérêt particulier.

Chapitre 2 : Que sait-on de la pneumocystose spontanée du lapereau ?

Sous-chapitre 2.1 : Historique de la découverte de la pneumocystose spontanée

Pneumocystis chez le lapin.

Pneumocystis carinii a été découvert très tôt dans les poumons de lapins (Oryc-tolagus cuniculus) comme d'autres mammifères (Carini et Maciel, 1916). Dès 1959,Sheldon propose l'utilisation du lapin comme hôte pour l'étude de P. carinii(Sheldon, 1959). Il infecte par voie nasale des lapins traités ou non à la cortisoneavec du broyat de poumon d'homme ou de lapin contenant P. carinii bouilli ounon. Et déjà il observe que le développement du parasite n'est pas lié à sa présenceou son absence dans l'inoculum, ou à l'espèce dont provient ce dernier, mais àl'administration éventuelle de cortisone. Il constate en effet un développementparasitaire important (mesuré par un score histologique) chez les animaux traités àla cortisone et une charge parasitaire faible ou nulle chez les animaux non traités,quel que soit l'inoculum. il conclue donc à la réactivation d'une infection préexis-tante.

Par la suite, le lapin restera peu utilisé, au profit du rat. Malgré tout, Goyot etcoll. remarqueront en 1984 que P. carinii extrait de lapin constitue un meilleur an-tigène pour le titrage des sérums humains que l'antigène P. carinii extrait de rat (àune époque où l'on ne soupçonne pas la diversité génétique des Pneumocystis in-fectant des espèces différentes)(Goyot et coll., 1984). Depuis, les études génétiquesont montré que P. carinii f. sp. hominis est plus proche de P. carinii f. sp. oryctolagique des formae speciales murines pour la quasi-totalité des locus étudiés (cf. figure3)(Wakefield, 1998b).

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figure n°3 : arbre phylogénétique, construit selon la méthode du « Neighbour-Joining » en utilisantla séquence de l’ARN de la grande sous-unité ribosomale mitochondriale, de neuf formae specialesde P. carinii (la longueur des branches ne correspond pas à une distance génétique). On remarquela proximité de P. carinii f. sp. oryctolagi avec P. carinii f. sp. hominis (d’après Wakefield, 1998b).

En 1988, Soulez et coll. redécouvrent l'intérêt du lapin comme modèle depneumocystose et source de Pneumocystis (Soulez et coll., 1988). Dei-Cas et coll.mettent au point une méthode de culture d'explants pulmonaires de lapin per-mettant de conserver les parasites viables et non altérés (pour autant que l'onpuisse en juger par microscopie électronique à transmission) pendant au moins 21jours (Dei-Cas et coll., 1989).

La pneumocystose spontanée.

En 1989 enfin, Soulez et coll. décrivent pour la première fois la pneumocystosespontanée du lapereau au sevrage (28 jours dans le système d'élevage consi-déré)(Soulez et coll., 1989). Le parasite se développe dans le poumon des jeuneslapins sans inoculation ni immunodépression induite, et ce de façon quasi-systématique et asymptomatique. On obtient ainsi dans les poumons de 80 à100 % des lapins des niveaux de parasite de 68±50 millions de formes kystiques(sporocystes) quatre jours après le sevrage. Les anticorps sériques anti-Pneumocystis apparaissent lors de la résolution (rapide : 23±9 millions de formeskystiques huit jours après le sevrage) de l’infection. L’administration de corti-coïdes permet de prolonger l’infection (55±50 millions de formes kystiques aprèsdeux à trois semaines). Cette infection naturelle reste aujourd'hui le seul modèlede primo-infection. En effet, si des infections naturelles à P. carinii ont été obser-vées chez des porcs non immunodéprimés au Danemark (Bille-Hansen et coll.,1990), ces infections ne sont ni systématiques, ni asymptomatiques, ce qui les dif-férencie nettement de la primo-infection humaine. Les seules données disponibleschez la souris (Garvy et Harmsen, 1996) montrent une infection très limitée, tanten nombre de parasites qu'en durée, qui n'a jamais été utilisée jusqu'ici.

P. carinii f. sp. equi

P. carinii f. sp. hominis

P. carinii f. sp. oryctolagi

P. carinii f. sp. mustelae B

P. carinii f. sp. mustelae A

P. carinii f. sp. suis

P. carinii f. sp. muris

P. carinii f. sp. carinii

P. carinii f. sp. ratti

33

Sous-chapitre 2.2 : Cinétique de l’infection

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

âge (jours)

P.

cari

nii

(m

illi

on

s)

courbe n°1 : évolution du nombre de sporocyste de P. carinii dans le poumon en fonction de l’âgedu lapin (Dridba, 1995).

La courbe n°1 montre l’évolution du nombre de parasites en fonction de l’âgedes lapereaux, en nombre de sporocystes colorables au BTO (cf. supra : morpholo-gie). La proportion de sporocystes est de 6 à 7 % en moyenne chez le lapin. Onpeut remarquer la grande variabilité du nombre de parasites, ce qui n’est guèresurprenant, s’agissant d’une infection naturelle.

Sous-chapitre 2.3 : Aspects épidémiologiques

Universalité de l’infection.

Cette affection a été retrouvée chez des lapins (sauvages et d'élevage) de multi-ples races et de régions et pays différents. Parmi les animaux étudiés, on trouvedes hybrides Californiens/Néo-zélandais provenant de chez Vasseur (Prouzel ,France) et Charles River (Rouen, France), hollandais de chez Harlan (Oxon,Royaume-Uni), chinchillas de chez Harlan (Zeist, Pays-bas), hollandais, Rex, Feu-noir, Lorraine (est), Blanc de Bouscat (Verdun), nain de couleur, Polonais (Var),Argenté de Champagne (Saône et Loire), Californien (Dordogne), Sablé des Vos-ges (Bas-Rhin), Néo-zélandais (Barrois, Nord) (Mazars et coll., 1997a). Nousn'avons pour le moment jamais observé de colonie d'animaux indemnes, à l'ex-ception de la colonie de l'I.N.R.A. de Tours spécialement développée à cette inten-tion (Céré et coll., 1997b). Cette colonie a été obtenue par le traitement au cotri-

34

moxazole des femelles gestantes et de leurs produits sur trois générations, associéà des mesures d'isolement strict. Cette colonie a été recontaminée, demandant denombreux mois pour obtenir à nouveau des animaux indemnes, ce qui montrel'importante circulation de l'organisme dans l'environnement et la facilité avec la-quelle les animaux peuvent s'infecter (expérimentalement chez le rat sous corti-coïdes la dose infectante est d'un seul organisme viable (Cushion et coll., 1999)).

Transmission.

C'est aussi à l'I.N.R.A. de Tours qu'a été mise en évidence une modalité parti-culière de transmission de l'infection. En effet, dans cette espèce, P. carinii passe dela mère au fœtus par voie transplacentaire (Céré et coll., 1997a). Ainsi, la PCR arévélé la présence d’ADN parasitaire dans le sang de la mère, le liquide amnioti-que et l’embryon dès le dixième jour de gestation. De plus, P. carinii a été observéen immunofluorescence dans le placenta ainsi que dans le poumon maternel (oùl’on ne le retrouve que rarement chez l’adulte en-dehors de la gestation). Cesdonnées, associées à la cinétique de l’infection et aux résultats de l’infection ex-périmentale (cf. infra), suggèrent que chez le lapin, la transmission transplacentaireest la principale voie de contamination par P. carinii. Cette voie de transmissionrend d'autant plus difficile l'éradication de P. carinii dans une colonie et expliquela nécessité de traitement des mères (l'association césarienne aseptique – isolementutilisée classiquement pour l'établissement de colonies d'animaux de laboratoirene suffit pas). Le lapin est la seule espèce chez laquelle cette transmission materno-fœtale du parasite a été décrite comme mode habituel. Une note fait état de laprésence du parasite chez un enfant mort-né d'une femme atteinte du SIDA et fai-sant une pneumocystose évolutive, ce qui est fort différent de l'infection sub-clinique du lapin (Mortier et coll., 1995). Cette transmission materno-fœtale poseégalement le problème de la source des organismes : ré-infection de la mère à par-tir de son environnement dans une période où elle redevient sensible, ré-activationd'une infection restée latente dans le poumon ou dans un autre organe encore nonidentifié (système lymphatique par exemple) ? Il est pour le moment trop tôt pourrépondre à cette question. il est cependant possible de faire deux remarques :– D'une part, la facilité d'infection des animaux en cas de rupture ou de faille de

l'isolement indique la circulation de P. carinii f. sp. oryctolagi dans l'air environ-nant.

– D'autre part, la PCR, voire la microscopie, permettent souvent de détecter duP. carinii dans les poumons de lapins en dehors de la phase active de la primo-infection. Ces résultats signent une permissivité particulière de cette es-pèce vis-à-vis de son Pneumocystis, apparemment supérieure à celle observéechez l'homme.

Conditions de développement.

À Tours toujours, l'obtention d'animaux indemnes a permis l'infection expéri-mentale par voie nasale, réalisée sur des lapins juste sevrés. Au cours de ces ex-périences, une cinétique similaire à celle observée lors de la primo-infection natu-relle a pu être obtenue (si l'on considère la naissance comme moment de l'infectionpulmonaire) : développement rapide du champignon avec un pic d'infection unetrentaine de jours après l'infection et une résolution spontanée après deux à troissemaines. Cette expérience a donc montré que si la multiplication de P. carinii chezle lapin correspond à une « fenêtre » de réceptivité au cours du développement del’animal, cette fenêtre s’étend au moins jusqu’à l’âge de trente-cinq jours. Ce mod-èle d’infection constitue un progrès important. En effet, il permet d’obtenir uneinfection maîtrisée (nombre de parasites inoculés, forme infectante, moment del’infection), mais toujours sans avoir recours à une forme quelconque

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d’immunosuppression iatrogène, et avec une évolution comparable à l’infectionnaturelle.

Saisonnalité.

Le dernier élément épidémiologique que l'on ait observé est une variation sai-sonnière de l'infection naturelle, plus intense durant la saison froide que durantl'été (Dridba, 1995) (cf. courbe 2). Ainsi le parasitisme moyen passe de 181,5 mil-lions de parasites totaux jusqu’en février à 62,9 millions à partir de mars (Allaert,1996).

0

5

10

15

20

25

30

35

1 11 21 31 41 51

semaine

P. ca

rinii

(mill

ions

)

0

5

10

15

20

25

température (degrés)

courbe n°2 : évolution du nombre maximal de sporocystes de P. carinii par lapin (en rose) en fonc-tion de la période de l’année et corrélation avec la température (en bleu)(Dridba, 1995).

Sous-chapitre 2.4 : Modifications biochimiques

Paramètres hématologiques.

Le suivi de la numération-formule sanguine au cours de la pneumocystose nepermet pas de mettre en évidence d‘évolution significative (Dei-Cas, communica-tion personnelle).

Paramètres enzymatiques.

Chez le lapin comme chez l’homme (Silverman et Rubinstein, 1985), l’activitélactate déshydrogénase sérique est augmentée au cours de la pneumocystose, bienque de façon modérée (cf. tableau 1).

Lipides.

Des modifications sont observées, tant en ce qui concerne les triglycérides(concentration sérique doublée durant la pneumocystose) que le cholestérol(concentration doublée, mais sans modification du cholestérol-HDL) (cf. tableau 1).

36

P. carinii(106)

Âge(jours)

TAG (g.l-1) CHOL (g.l-1) CHOL-HDL (g.l-1)

HDL/CHOL LDH(U.l-1)

0,51±0,2n=16

52, 0±2,0 0,97±0,1 0,66±0,10 0,2±0,0 0,6±0,1 226±37

22,70±0,2n=23

35,7±1,0 1,89±0,3p<0,01

1,10±0,20 0,2±0,0 0,3±0,0p<0,001

313±74

tableau I : évolution des paramètres biochimiques sériques au cours de la pneumocystose spon-tanée (P. carinii : en millions de formes kystiques, TAG : tri-acyl glycérol, CHOL : cholestérol total,CHOL-HDL : cholestérol-HDL, HDL/CHOL : rapport cholestérol-HDL/cholestérol total, LDH :lactate déshydrogénase)(Dei-Cas, communication personnelle).

Surfactant.

L’avantage de ce modèle pour l’étude des interactions entre pneumocystose etsurfactant pulmonaire est l’absence d’utilisation de corticoïdes, qui ont par eux-mêmes une influence sur la production et la composition du surfactant. On ob-serve au cours de la pneumocystose une chute du rapport phospholipi-des/protéines (Aliouat et coll., 1998). Cette chute résulte essentiellement d’uneaugmentation de la quantité de protéines totales. Une telle augmentation peuts’expliquer en partie par une transsudation de protéines sériques liée àl’inflammation et à l’altération de la membrane alvéolocapillaire du fait de l’actiondirecte du parasite sur les pneumocytes de type I. Cependant on observe égale-ment une augmentation de la quantité de protéines spécifiques du surfactant(Prévost, communication personnelle). Une diminution de la quantité de phos-pholipides intervient également au début de l’infection, participant ainsi àl’évolution du rapport phospholipides/protéines. Cet effet est particulièrementprécoce puisque l’on peut observer une inflexion de la courbe dès avant l’âge de20 jours, alors que Pneumocystis est encore indétectable par les techniques usuellesde microscopie. L’adjonction de surfactant fonctionnel inhibe la croissance duchampignon en culture, ce qui laisse supposer que les perturbations précoces ob-servées in vivo sont induites par le parasites et sont indispensables à son dévelop-pement (Aliouat, 1995).

Sous-chapitre 2.5 : Étude histologique

Aspects caractéristiques.

Comme il a été précisé précédemment, les principales particularités histologi-ques de la pneumocystose spontanée du lapereau (Rajagopalan-Levasseur et coll.,1998) sont :

– Le caractère nodulaire de l’infiltrat cellulaire (cf. photo 5B) ;– La présence, en petit nombre mais de façon constante, de granulocytes éosino-

philes dans l’infiltrat cellulaire (cf. photo 6B) ;– L’absence, dans la grande majorité des cas, de l’exsudat éosinophile alvéolaire

observé chez la plupart des espèces ;– L’absence de fibrose, expliquant l’absence de lésions cicatricielles persistant

après la résolution de l’infection.

Aspects cinétiques.

Le tableau 2 présente l’évolution des lésions histologiques au cours du temps.On peut distinguer deux phases dans cette évolution :

37

– Une phase initiale dominée par la congestion vasculaire et l’infiltration par desgranulocytes neutrophiles. Cette phase correspond à la phase de multiplicationdes parasites dans le poumon ;

– Une phase tardive, caractérisée par une congestion de moins en moins mar-quée, avec prédominance des lymphocytes et des macrophages dans les infil-trats et hyperplasie des pneumocytes de type II. Durant cette phase, le nombred’organismes présents dans les poumons diminue régulièrement.

Âge(jours)

Congestionvasculaire

Épaisseurdes septums

(μm)

Densitéen MA

Tailledes PII(μm)

Nombrede PII

GN/champs

Foyers delympho.

(Nb/cm2)1

1020253035405060

-++++++++++±±-

7±27±215±515±420±535±5

92±2055±2520±10

±±±±±

++++++++

±

5±25±25±25±210±312±310±310±312±3

2±13±13±13±15±25±210±29±33±1

2±12±16±2

18±58±3

12±47±29±34±2

000

2±112±415±580±30

125±407±4

103060

000

7±27±215±2

±±±

5±25±25±2

2±14±14±1

2±14±14±1

000

tableau II : évolution des paramètres histologiques au cours de la pneumocystose spontanée (1 à60 jours : lapins infectés ; 10, 30 et 60 jours : lapins indemnes ; MA : macrophages alvéolaires ; PII :pneumocytes de type II ; GN : granulocytes neutrophiles ; lympho : lymphocytes)(Dridba, 1995).

photo n°5 : aspects histologiques de la PPC du lapin en coloration à l’hémalun-éosine-safran (Dei-Cas, communication personnelle).A : coupe histologique de poumon après résolution de la PPC, présentant un aspect sain.B : coupe histologique de poumon au cours de la PPC. On remarque les cloisons interalvéolairesépaissies (flèche fine) et l’aspect nodulaire de l’infiltrat (flèche épaisse).C : coupe histologique de poumon au cours d’une PPC particulièrement sévère. On remarque laréaction pleurale (flèche fine) et l’alvéolite macrophagique (flèche épaisse).

B CA

38

photo n°6 : principales cellules observées lors de la PPC du lapereau, en MET (Dei-Cas, communi-cation personnelle).A : macrophage ayant phagocyté une forme végétative de P. carinii (flèche épaisse) à côté d’unsporocyste immature (flèche fine).B : granulocyte éosinophile. On remarque les granulations caractéristiques (flèche).C : plasmocyte. Le contraste des membranes a été renforcé à l’iodure de zinc, rendant plus évidentl’abondant réticulum endoplasmique de ces cellules (flèche).

Sous-chapitre 2.6 : Aspects immunitaires

Anticorps.

Akono et Palluault ont décrit l'apparition d'anticorps sériques anti-P. carinii en-tre quatre et cinq semaines, ce qui correspond à l'acmé de l'infection. Le titre aug-mente ensuite jusqu'à l'âge de neuf semaines puis se stabilise pour persister aumoins plusieurs mois (Akono et Palluault, 1994). La réponse immune humoralesérique coïncide donc avec l'arrêt de la progression de l'infection et sa résolution.L'administration d'azathioprine inhibe fortement la réponse anticorps et empêchela résolution de la pneumocystose, qui devient létale. Par contre, le titre anticorpsreste nul entre deux et quatre semaines. Au contraire, Tamburrini et coll. ont rap-

C

AB

39

porté la présence d'IgG anti-Pneumocystis dès l'âge de cinq jours. Le taux d'IgGchute jusqu'à l'âge de vingt et un jours pour remonter ensuite, ce qui correspondaux observation d'Akono (Tamburrini et coll., 1999). Les IgM, absents à cinq jours,apparaissent dès quatorze jours pour voir leur taux se stabiliser à partir de vingt etun jours. On aurait donc ici un développement du parasite concomitant de la dis-parition de l'immunité passive d'origine maternelle et une résolution coïncidant iciaussi avec l'apparition de l'immunité active post-infectieuse. La raison pour la-quelle Akono n'a pas mis en évidence d'immunité d'origine maternelle n'est pasconnue. Le fournisseur des lapins n'était pas le même, mais l'infection à P. cariniiétait présente dans les deux cas. De même, la technique différait (immunofluores-cence contre ELISA) mais les taux observés à quatorze jours par Tamburrini etcoll., supérieurs à ceux mesurés à quarante-cinq jours, étaient suffisants pour êtredétectés par immunofluorescence.

Akono a également étudié par immunoblotting les principaux antigènes de P.carinii reconnus par les sérums des lapins (Akono et Palluault, 1994). Les antigènesimmunodominants sont des constituants de 36 à 39 kDa et de 50 à 55 kDa. Laréponse vis-à-vis de la MSG (116 kDa) est plus inconstante mais est constammentobservée lors de la clairance du parasite. Ces résultats sont en accord avec d’autresobtenus chez le rat. Les antigènes de Pneumocystis isolés d’hôtes différents mon-trent un certain degré de réactivité croisée mais avec des affinités variables (Goyotet coll., 1984).

Lymphocytes T.

L’utilisation d’anticorps anti-CD4 en immunohistochimie a révélé que 60 % deslymphocytes infiltrant le poumon au cours de la pneumocystose sont porteurs dece marqueur (Dridba, 1995). Ces résultats confirment l’importance de ces cellulesdans la résolution de l’infection, importance mise en évidence à la fois épidémio-logiquement chez l’homme et expérimentalement chez la souris. Cependantl’évolution du rapport CD4/CD8 n’a pu être déterminée car l’anticorps anti-CD8de lapin n’était pas disponible à l’époque.

Espèces activées de l’oxygène.

La production d’espèces activées de l’oxygène par les macrophages alvéolairesde lapin a pu être observée in vitro par chimioluminescence (Rajagopalan-Levasseur et coll., 1998). Cette production est obtenue après stimulation par P. ca-rinii et amplifiée par opsonisation avec un antisérum spécifique, décomplémentéou non. L’existence de cette production in vivo a été confirmée par immunofluo-rescence, en utilisant des anticorps dirigés contre les ponts amino-imino-propène.Ces ponts résultent de la peroxydation des lipides membranaires sous l’effet desespèces activées de l’oxygène. Un marquage intense est observé chez des lapinsinfectés de trente jours, à la surface des différentes formes du parasite ainsiqu’occasionnellement au niveau du pôle apical de quelques cellules épithélialesciliées bronchiques.

Par contre, il n’a pas été possible de mettre en évidence de production de mo-noxyde d’azote par les macrophages alvéolaires de lapin in vitro, que ce soit aprèsstimulation par P. carinii ou par du lipopolysaccharide bactérien (LPS).

Macrophages alvéolaires.

Histologiquement, la résolution de la pneumocystose s’accompagne d’un infil-trat macrophagique important (Dridba, 1995), les macrophages comblant la lu-mière alvéolaire. Cet aspect histologique d’alvéolite macrophagique s’accompagnede nombreuses images de phagocytose, concernant à la fois les formes végétativeset les sporocystes (cf. photo 7). Les organismes phagocytés apparaissent plus ou

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moins dégradés en MET. Aucune image (ni aucune autre donnée expérimentale, etce quelle que soit l’espèce concernée) ne laisse supposer que Pneumocystis puissesurvivre à l’intérieur des cellules phagocytaires.

photo n°7 : phagocytose de Pneumocystis carinii par les macrophages alvéolaires (Dei-Cas, commu-nication personnelle).A : macrophage alvéolaire ayant phagocyté un sporocyste mature de P. carinii (flèche), coloré auMGG.B : empreinte colorée au BTO montrant différents sporocystes de P. carinii (flèche) se superposantavec les fantômes de macrophages alvéolaires.

Nous avons alors étudié l’aptitude phagocytaire des macrophages alvéolaires exvivo (Allaert et coll., 1996). Nous avons pour cela prélevé des macrophages parLBA sur des lapins de dix, trente et soixante jours et nous les avons mis en culture.Après deux heures de culture, nous les avons mis en contact avec P. carinii ouCandida albicans pendant trente minutes avant fixation et détermination du pour-centage de cellules ayant phagocyté. C. albicans a été utilisé comme témoin positif,étant donné qu’il exprime dans sa paroi le même type de molécules que P. carinii :β-glucanes et α-mannanes. Au cours de ces expériences, nous avons testé l’effet dela laminarine, inhibiteur de l’interaction β-glucanes–récepteur au complément detype 3 (CR-3) et du mannane de Saccharomyces cerevisiae, inhibiteur de l’interactionα-mannanes–récepteur au mannose du macrophage (MMR). En effet, on a décritchez le rat une phagocytose de P. carinii dépendant du MMR (Ezekowitz et coll.,1991) et une production de facteur nécrosant les tumeurs (TNF) -α dépendant duCR-3, mais sans phagocytose (Hoffman et coll., 1993). Concernant la phagocytosede C. albicans, le comptage a été réalisé au microscope à fond clair après colorationde May-Grünwald-Giemsa (MGG). Par contre, P. carinii a été marqué à la fluores-ceine et le comptage réalisé en associant épifluorescence et contraste interférentiel(Ezekowitz et coll., 1991). Les résultats obtenus sont les suivants :– Concernant C. albicans, l’aptitude phagocytaire des macrophages alvéolaire de

lapin apparaît conforme à ce que l’on observe dans d’autres modèles – plus decent levures phagocytées pour cent macrophages, avec inhibition partielle à lafois par la laminarine et le mannane et inhibition pratiquement totale avecl’association laminarine-mannane. Cependant cette aptitude phagocytaire ap-paraît environ 50 % inférieure lorsque les macrophages sont prélevés durant lapneumocystose (sur des lapins de trente jours) par rapport à ce qui est obtenuavec des cellules prélevées sur des lapins de dix ou soixante jours (Allaert etcoll., 1996).

– Concernant P. carinii, le niveau de phagocytose apparaît dans tous les cas ex-trêmement faible, de l’ordre de 10 % de celui obtenu avec C. albicans. Si l’on

A B

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peut observer la même différence entre les lapins de trente jours et les autres, leniveau de phagocytose est insuffisant pour que cette différence soit statisti-quement significative.

Étant donné l’importance du TNF-α dans la résolution de la pneumocystose(Chen et coll., 1992), nous avons également testé la production de cette cytokinepro-inflammatoire par les macrophages alvéolaires de lapin. Ici aussi, des macro-phages ont été prélevés par LBA sur des lapins de dix, trente et soixante jours etmis en culture. Après deux heures de culture, les macrophages ont été stimuléspar P. carinii ou du LPS bactérien – comme témoin positif. Après 24 heures, lessurnageants de culture ont été récupérés et l’activité TNF mesurée sur lignée fi-broblastique murine L929 (lignée sensible à l’effet létal du TNF). Les résultats ob-tenus (Allaert et coll., 1996) vont dans le même sens que précédemment :– Le LPS induit une forte production de TNF par les macrophages alvéolaires de

lapin (de l’ordre de 103 U.ml-1), mais cette production est nettement diminuéelorsque les macrophages sont prélevés au cours de l’infection (-80 %).

– P. carinii n’induit aucune production significative de TNF par les macrophagesalvéolaires en culture.

En résumé, il apparaît qu’in vitro, la fonction des macrophages alvéolaires estaltérée durant la pneumocystose, sans qu’il soit possible pour le momentd’attribuer cette altération à l’action de Pneumocystis ou à un phénomène primitifchez le lapin dont le champignon profiterait. Il apparaît de plus qu’en l’absenced’opsonisation, ces macrophages n’interagissent que très faiblement avec P. carinii.Au contraire, les données histologiques semblent indiquer un rôle important dumacrophage in vivo : lorsque l’alvéolite macrophagique est faible l’infection pro-gresse alors que lorsqu’elle devient intense l’infection régresse ; Pneumocystis subitl’action des espèces activées de l’oxygène ; enfin de nombreuses images de phago-cytose sont visibles. La discordance apparente entre ces résultats pourraits’expliquer par l’apparition d’anticorps anti-P. carinii opsonisant les parasites etpermettant leur reconnaissance par les macrophages alvéolaires ainsi que parl’activation tardive de ces derniers par des cytokines produites au cours du picd’infection, notamment l’interféron-γ (cf. infra).

Cytokines.

Les cytokines sont des facteurs extrêmement importants de régulation de laréponse immune. Aussi avons-nous recherché dans le tissu pulmonairel’expression des ARN messagers codant quatre d’entre elles (Allaert et coll., 1997).Nous avons suivi le niveau d’expression de ces molécules au cours de l’évolutionde la pneumocystose spontanée. Les quatre molécules choisies sont :– l’interleukine 8, chimiokine chimiotactique essentiellement pour les granulo-

cytes neutrophiles ;– la monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), chimiokine chimiotactique

essentiellement pour les monocytes/macrophages ;– l’interféron-γ, lymphokine de type 1 ;– l’interleukine 10, lymphokine de type 2.

Sur trois lapins de chaque âge, un morceau de 1 g du lobe pulmonaire inférieurgauche a été prélevé après euthanasie et immédiatement congelé à –70°C. L’ARNa ensuite été extrait et transcrit en ADNc. L’amplification par PCR permettaitd’obtenir des fragments visualisables par coloration au bromure d’éthidium aprèsélectrophorèse en gel d’agarose. Les résultats (tableau 3) ont montré que les deuxchimiokines sont exprimées précocement durant l’infection (dès l’âge de vingt-cinq jours), l’expression de l’IL-8 durant jusqu’à l’âge de 45 jours. Ces résultatssont cohérents avec les observations histologiques : hypercellularité précoce maisdisparaissant entre 50 et 60 jours. L’expression d’IFN-γ plutôt que d’IL-10 sembleindiquer que la réponse lymphocytaire T est majoritairement de type 1, du moins

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localement. Cependant ces résultats restent à confirmer sur un plus grand panelde cytokines.

Âge (jours) IL-8 MCP-1 IL-10 IFN-γγγγ10 - - - -20 - - - -25 + ± - -30 + ++ ± +35 + ++ - +40 ± - - -45 + - - ±50 - - - -60 - - - -

tableau III : Expression des ARNm de cytokines dans le poumon de lapin (- : pas de bande visiblesur gel d’agarose ; ± : bande faible ou inconstante ; + : bande nette pour tous les lapins ; ++ : bandeforte pour tous les lapins)(Allaert et coll., 1997).

Surfactant.

Le surfactant pulmonaire joue également un rôle dans la réponse immune pul-monaire. Les protéines hydrophiles (SP-A et SP-D) en particulier ont des pro-priétés opsonisantes vis-à-vis de nombreux pathogènes. Concernant Pneumocystis,on a décrit la fixation de ces deux protéines à la surface du champignon, par inter-action avec la MSG, mais aussi la diminution de la phagocytose de P. carinii par lesmacrophages en présence de SP-A (Koziel et coll., 1998 ; O'Riordan et coll., 1995 ;Zimmerman et coll., 1992). Il serait donc intéressant de préciser les modificationsdu contenu protéique du surfactant au cours de la pneumocystose (cf. supra). C’estpourquoi nous sommes actuellement en train d’étudier l’évolution de la distribu-tion des quatre protéines spécifiques du surfactant au cours de l’infection par im-munohistochimie.

Chapitre 3 : Hypothèses sur l’histoire naturelle de la PPC du lapin

Dans cette partie, nous allons proposer un modèle épidémiologique de lapneumocystose naturelle du lapin, basé sur les connaissances actuelles, et quipermettra d’envisager des pistes d’exploration de la pneumocystose humaine.

Sous-chapitre 3.1 : Acquisition de l’infection

Comme nous venons de le voir, la contamination du lapereau se fait essentiel-lement par voie transplacentaire. Étant donnée la fréquence apparente de cetteforme de transmission, la voie aérienne ne semble pas jouer un rôle majeur danscette première contamination, malgré son efficacité (démontrée par la rapide re-contamination de la colonie de Tours).

Sous-chapitre 3.2 : Primo-infection

Pendant les premières semaines de la vie, le parasite se multiplie lentement. SiP. carinii se localise dans le poumon dès la vie fœtale du lapin, l’importance desconditions locales sur le développement du parasite suggère que sa multiplicationne débute qu’après la naissance, une fois les poumons remplis d’air et fonction-

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nels. Cette multiplication aboutit à l’affection décrite dans ce travail. L’infectionmassive par P. carinii induit alors une réponse immunitaire spécifique (objectivéepar l’apparition d’anticorps sériques) qui permet au lapereau de contrôler la para-sitose. En effet, les animaux incapables de monter une réponse immune spécifique(souris SCID, animaux Nude, animaux déplétés en lymphocytes T CD4+) sont sen-sibles à la pneumocystose. De plus la cinétique obtenue lors de l’infection expéri-mentale des lapins indemnes de P. carinii est identique à celle observée lors del’infection naturelle (en prenant la naissance comme point de départ). Il sembledonc bien que c’est l’acquisition d’une réponse immune spécifique qui soit res-ponsable de la guérison et non des facteurs liés à des particularités de développe-ment du lapin survenant autour de l’âge d’un mois. De plus, le développement del’infection naturelle semble coïncider avec la disparition de l’immunité passived’origine maternelle et la résolution de celle-ci avec l’apparition d’une immunitéactive. Cependant, le fait que l’infection ne se développe pas plus rapidement lorsd’infection expérimentale, donc chez des animaux ne disposant pas d’immunitépassive, laisse supposer que le temps de développement de l’infection est plussimplement lié au rythme de multiplication naturel de P. carinii f. sp. oryctolagi. Letemps de doublement de Pneumocystis chez le lapin a récemment été évalué à unjour et demi (Aliouat et al., 1999). Cela correspond à une croissance assez lentemais plus rapide que celle calculée chez le rat (quatre jours et demi) ou chez lasouris (plus de dix jours). Plutôt que de mettre en cause l’efficacité des anticorpsmaternels (le transfert de l’immunité humorale s’est révélé efficace chez la souris),on peut envisager un certain synchronisme de P. carinii avec son hôte, qui aconduit à l’adaptation de la vitesse de croissance du champignon à la vitesse dedisparition des anticorps d’origine maternelle, au cours de la longue co-évolutiondes deux espèces.

Sous-chapitre 3.3 : Persistance de l’infection et recontaminations

Chez le lapin, Pneumocystis carinii peut facilement être retrouvé par PCR, voireen microscopie optique (mais en très faible nombre et non associé à des lésionshistologiques) dans les poumons de lapins de tous âges. Cet animal semble doncparticulièrement permissif vis-à-vis de l’infection à P. carinii.

Chapitre 4 : Transposition à l’homme : dans quelle direction chercher ?

Sous-chapitre 4.1 : Recherche de la primo-infection humaine

Les plus anciennes données concernant la primo-infection humaine sont desdonnées sérologiques. Les prélèvements nécessaires à ces études étaient en effetrelativement peu invasifs et pratiqués sur un relativement grand nombre de pa-tients pour des raisons diverses. Une fraction pouvaient alors être utilisée pour larecherche d’anticorps anti-Pneumocystis.

Nous avons également plusieurs rapports, dont certains assez anciens, impli-quant Pneumocystis dans des cas de pneumonie du jeune enfant (Brasfield et coll.,1987 ; Garcia et coll., 2000 ; Stagno et coll., 1981 ; Stagno et coll., 1980). P. cariniiapparaît comme l’agent de 17 à 18 % des cas étudiés (Brasfield et coll., 1987 ; Sta-gno et coll., 1981), et l’apnée comme le symptôme le plus caractéristique de ce pa-thogène. Pneumocystis carinii a également été récemment associé à la mort subitedu nourrisson au Chili (où la loi impose l’autopsie systématique des enfants mortsde ce syndrôme) et à Oxford (Royaume-Uni). P. carinii a été retrouvé dans les

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poumons de 35 % des enfants décédés de mort subite contre 3 % des enfants mortsde causes diverses (Vargas et coll., 1999).

Cependant, la difficulté qu’il y a à mettre en évidence P. carinii est le principalobstacle à la recherche parasitologique de la primo-infection chez l’enfant. Lestechniques traditionnelles de coloration nécessitent du temps et un personnelqualifié. Et y compris dans ces conditions leur manque de sensibilité est tel que lerésultat est parfois négatif même en cas d’infection clinique. Elles ne sont doncenvisageables que sur des prélèvements suffisamment représentatifs, donc pro-fonds : LBA, biopsie pulmonaire. Ces prélèvements invasifs sont absolumentinenvisageables à titre expérimental chez l’homme, en l’absence d’impératifs clini-ques. Les techniques moléculaires (PCR) ont permis des progrès énormes en sen-sibilité. Il devient possible de proposer des protocoles d’expérimentation utilisantdes prélèvements peu invasifs (lavage oropharyngé, aspiration nasopharyngée,écouvillonnage nasal profond) donc réalisables sur de plus larges échantillons depatients. Si la sensibilité de tels prélèvements, qui n’atteignent pas le site de déve-loppement du champignon (l’alvéole), reste limitée et moins documentée, elle at-teint quand même 80 % chez les patients atteints de PPC et 5 % du personnel hos-pitalier en contact avec des individus à risque montre un lavage oropharyngépositif (Durand-Joly, communication personnelle).

Les études actuellement en cours pour rechercher la primo-infection à P. cariniiassocient recherche sérologique et recherche du champignon par PCR dans desprélèvements effectués sur un maximum de jeunes enfants se présentant dans lesservices de pédiatrie pour différentes affections respiratoires. Les premiers résul-tats semblent confirmer l’implication de Pneumocystis dans un nombre important(32 %) d’infections respiratoires du jeune enfant (Vargas et coll., 2001).

Sous-chapitre 4.2 : Recherche des sources d’infection

Comme nous l’avons déjà précisé, Pneumocystis est à la fois un organisme rareet fréquent. Rare parce qu’on ne le retrouve qu’exceptionnellement dans les pou-mons de personnes non immunodéprimées, et fréquent parce que la primo-infection semble quasi-systématique et que la maladie est répandue parmi les po-pulations à risque. Ce qui pose la question suivante : les seuls enfants faisant uneprimo-infection et immunodéprimés présentant une infection clinique suffisent-ilsà entretenir une population de champignons assez nombreuse pour expliquer lafréquence avec laquelle ces populations se contaminent ?

Cette question a conduit à proposer l’existence d’une forme de P. carinii sedéveloppant en dehors de son hôte mammalien. Cependant, si des séquencesd’ADN de Pneumocystis ont été identifiées dans l’air, y compris dans des zones quine sont pas directement en contact avec des personnes que l’on sait infectées (airde Paris, campagne anglaise (Philippe et coll., 1999 ; Wakefield, 1994)), aucun or-ganisme en développement n’a jamais été retrouvé en dehors de son hôte. Si lesoutils moléculaires permettent aujourd’hui d’identifier P. carinii de façon à la foisspécifique et sensible, le champs de recherche est immense : en effet, la seule hy-pothèse que l’on puisse poser avec quasi-certitude a priori est que le champignondoit se développer dans l’environnement de son hôte, afin de pouvoir le reconta-miner par voie aérienne. Aller « à la pêche » à l’aveugle semble donc présenter fortpeu de chances de succès. Ici, l’utilisation du lapin comme modèle peut peut-êtres’avérer utile, l’environnement d’une animalerie étant plus facile à maîtriser quel’environnement ouvert dans lequel nous évoluons. Et si l’on sait que l’on peutentretenir P. carinii dans des colonies de souris SCID, la situation est fort dif-férente, car s’agissant d’animaux sensibles à l’infection clinique, les quantités deparasites hébergés sont beaucoup plus importantes, rendant un hypothétiqueréservoir environnemental beaucoup moins nécessaire.

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Une autre hypothèse qui avait été formulée – et acceptée – depuis fort long-temps mais largement remise en cause depuis, est l’existence de porteurs sains deP. carinii (Dei-Cas et coll., 1992). On a en effet longtemps cru que nous portionstous un petit nombre d’organismes dans nos poumons, et que ces organismes semultipliaient lorsque les conditions immunologiques le leur permettaient. Cepen-dant, des outils extrêmement sensibles comme l’immunofluorescence et surtout laPCR n’ont pas permis de retrouver P. carinii dans les poumons de cadavres depersonnes mortes d’autres causes (Millard et Heryet, 1988 ; Peters et coll., 1992).Des expériences de tentatives de réactivation chez la souris de pneumocystoseaprès résolution ont confirmé chez cet animal l’élimination totale du parasite. Ilsemble donc que dans la majorité des cas, P. carinii soit totalement absent dupoumon des personnes immunocompétentes. Mais des études récentes ont permisd’une part de mettre en évidence un portage de P. carinii par des personnes im-munodéprimées mais n’ayant pas développé de pneumocystose clinique au coursdu suivi, et d’autre part, un portage transitoire du champignon par du personnelmédical sain soignant des personnes atteintes de pneumocystose (Nevez et coll.,1999b ; Vargas et coll., 2000). Ce dernier élément, associé au fait que l’on connaîtdes cas de transmission directe de malade à individu sensible, pose des questionsconcernant les mesures à prendre pour éviter la transmission de la pneumocystoseau sein de l’hôpital, sachant que pour le moment les patients atteints de cette in-fection ne sont généralement pas isolés. L’utilisation d’un modèle animal pourl’étude du portage sain pose la question de la plus ou moins grande permissivitédes différentes espèces vis-à-vis de leur Pneumocystis. Il apparaît en effet que lelapin semble très permissif (il est fréquent d’obtenir des PCR positives sur lespoumons d’animaux adultes et en bonne santé). La souris, au contraire, l’est trèspeu (le parasite est rapidement éliminé après résolution de l’infection). Le rat estdans une situation intermédiaire (on a décrit une persistance du parasite dans lepoumon de plus d’un an après résolution de l’infection). Quant à l’homme, il sem-ble plutôt peu permissif au vu des études nécropsiques.

Si aucun réservoir environnemental n’est découvert et que le portage sain duchampignon reste limité à un petit nombre d’individus pendant de courtes durées,il faudra considérer les enfants effectuant leur primo-infection comme le principalréservoir du parasite. Il sera alors intéressant de suivre l’évolution des populationsde Pneumocystis au sein de la population humaine (enfants susceptibles à la primo-infection et personnes sensibles entrant en contact avec elles).

Sous-chapitre 4.3 : Recherche des facteurs immunitaires impliqués dans laprotection

Afin de mieux cerner les populations à risque et de développer des mesures deprophylaxie et de thérapeutique immunologiques, il est nécessaire de mieux com-prendre les facteurs immunitaires impliqués dans la protection vis-à-vis del’infection à P. carinii, ces facteurs apparaissant déterminants pour le développe-ment de la maladie.

Les anticorps semblant jouer un rôle important, plusieurs équipes ont cherché,chez la souris, à déterminer les antigènes induisant une immunité protectrice, et àdévelopper des techniques d’immunisation permettant de maintenir des tauxd’anticorps efficaces au cours d’immunodépressions sévères. Certains résultatschez cet animal sont encourageants (Garvy et coll., 1997).

Le macrophage ayant lui aussi une part non négligeable dans la lutte contre P.carinii, et voyant ses populations moins diminuées lors de l’infection par le VIHque le lymphocyte T CD4+, il peut être intéressant de déterminer plus avant lesconditions de son efficacité, afin d’espérer les restaurer, au moins en partie, aucours de la maladie. Dans cette perspective, les résultats déjà obtenus chez le lapin,

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en-dehors de toute immunodépression induite, offrent quelques bases qu’il seraitutile de développer.

Enfin, une inflammation inefficace dans la maîtrise de l’infection mais particu-lièrement délétère pour l’environnement pulmonaire joue un rôle important dansla physiopathologie de la pneumocystose. L’étude des conditions et des mécanis-mes d’installation de cette réponse inflammatoire permettrait d’améliorer la priseen charge de cette maladie. Malheureusement, aucun modèle animal n’offre àl’heure actuelle un tel tableau inflammatoire associé à un développement continude l’infection.

Sous-chapitre 4.4 : Outils nécessaires

Pour l’étude de la physiologie du parasite, de son mode de reproduction, de sesconditions de développement et pour la mise au point de modèle d’infection, laculture de P. carinii f. sp. hominis est pratiquement un pré-requis. Cependant pourl’heure, malgré de nombreux efforts, et en dehors des rapports non confirmés deMerali et coll. (Merali et coll., 1999), les progrès réalisés dans ce domaine restentlimités. De plus, les conditions de travail sont beaucoup plus drastiques qu’avecles organismes d’origine animale car les prélèvements sont souvent contaminéspar le VIH. Les données connues à l’heure actuelle laissent pourtant espérer à re-lativement court terme des résultats analogues à ce que l’on obtient chez le rat,c’est-à-dire une culture à court terme, qui constituera un progrès appréciable maisn’éliminera pas la dépendance vis-à-vis des prélèvements chez l’homme, prélève-ments sporadiques et pauvres en parasites.

Les études épidémiologiques bénéficieront également du développement desoutils de typage moléculaire. Le principal outil de typage actuellement utilisé pourP. carinii f. sp. hominis est la séquence des deux espaceurs internes transcrits (ITS 1et 2) du gène de l’ARN ribosomal (Wakefield, 1998a). Or ces séquences présententune telle variabilité, un tel pouvoir discriminant, qu’elles se révèlent peu adaptéesau suivi épidémiologique de grandes populations. Il faudrait donc définir desmarqueurs mieux adaptés. Le projet actuel de séquençage du génome de P. carinii(f. sp. carinii) pourra peut-être apporter une contribution utile dans ce domaine(Cushion et Arnold, 1997). La définition de tels outils de typage pour P. carinii f.sp. oryctolagi sera également très utile au développement de l’épidémiologie dansle modèle lapin.

Enfin, la recherche et la standardisation de méthodes de prélèvement à la foispeu invasives et les plus riches possibles en Pneumocystis pourrait améliorer la fai-sabilité d’études épidémiologiques de grande envergure chez l’homme. Les deuxméthodes actuellement employées, et qui ont permis les avancées que l’on sait,sont le lavage oropharyngé et l’écouvillonnage nasal profond, qui semble intéres-sant bien que plus invasif (Vargas et coll., 2000).

Chapitre 5 : Conclusion

La pneumonie à Pneumocystis carinii a acquis une place importante en patholo-gie humaine au cours des vingt dernières années, avec le développement des casd’immunodépression pathologique ou iatrogène. Elle reste aujourd’hui une despremières infections opportunistes survenant chez les patients sidéens, et la pre-mière infection inaugurant le stade SIDA. Des progrès ont été réalisés, notammentavec la mise en place d’une prophylaxie systématique chez certaines populations àrisque et l’amélioration de la prise en charge de l’infection par le VIH. Cependant,il semble difficile de progresser beaucoup plus sans une meilleure connaissancedu champignon. Si l’étude de la physiologie du parasite peut ouvrir la voie à de

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nouvelles thérapeutiques, la compréhension de son épidémiologie, et notammentde ses modes de transmission est nécessaire à l’évaluation du danger et à saprévention pour les personnes sensibles. Le développement d’outils moléculairesa pu apporter des éléments nouveaux dans ce domaine. Mais l’existence d’unmodèle d’infection naturelle permettra d’aller encore plus loin dans cette com-préhension. Si l’infection du lapin présente quelques différences par rapport àl’infection humaine, elle reste à ce jour le seul modèle utilisable dans cette optique,et nous sommes loin d’avoir épuisé toutes ses possibilités. Il nous semble doncintéressant de poursuivre son développement, en s’attachant particulièrement àmieux appréhender l’histoire naturelle de l’infection.

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Résumé

La pneumocystose spontanée du lapereau :un modèle de la primo-infection humaine ?

Pneumocystis carinii est un micro-organisme fongique responsable de pneumo-nies graves chez les personnes immunodéprimées. Sa biologie reste fort malconnue, bien qu’on l’ait découvert il y a près d’un siècle. Contrairement aux autresespèces animales étudiées, le lapin présente, à la fin de son premier moisd’existence, une infection à P. carinii bénigne, spontanément résolutive, et aboutis-sant à sa séroconversion. Cette infection évoque la primo-infection humaine, ob-jectivée par la séroconversion de la majorité des enfants avant l’âge de deux ans.Malgré certaines différences tenant à l’existence d’une transmission transplacen-taire non observée chez l’homme et à une plus grande permissivité, le lapin appa-raît donc comme un modèle intéressant pour l’étude de l’histoire naturelle et del’épidémiologie de l’infection à P. carinii. L’obtention de lapins indemnes de P.carinii et d’outils de typage moléculaire du parasite favorisera le développementde ce modèle.

Summary

The spontaneous Pneumocystis carinii pneumonia of young rabbit:a model for human primary infection?

Pneumocystis carinii is a fungal microorganism capable of causing fatal pneu-monia in immunocompromised persons. P. carinii’s biology is still largely un-known nearly a century after its discovery. Unlike the other animal species stud-ied, rabbit develops at the end of its first month of life a benign, self-resolutive P.carinii infection leading to the apparition of serum antibodies against the fungus.This infection is similar to the human primary infection assessed by the serocon-version of most healthy children before the age of two. In spite of some differencesin the way of transmission (the transplacental transmission observed in rabbitdoes not seem to exist in human) and in the level of permissivity, rabbit appears tobe an interesting model for studying natural history and epidemiology of P. cariniiinfection. The obtaining of P. carinii-free rabbits and molecular typing tools willfurther the development of this model.