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La transdifférenciation

Séverine Létuvé

21 novembre 2011

M1 Santé/ UE7 ‘Biologie moléculaire’

1

2

2

La transdifférenciation: définition

Cellule polarisée Acquisition d’un nouveau phénotype

Environnement

Plasticité cellulaire impliquant une modification

- de morphologie

- de fonction

Phénomène

- Direct

- impliquant une dédifférentiation

- nécessitant le passage par un intermédiaire (cellule souche)

2

Transdifférenciation = conversion d’une cellule différenciée en un autre

type cellulaire

3

3

Mise en évidence historique d’une transition de phénotype:

apparition du sillon primitif au cours de l’embryogenèse

3

4

4

Implication de la transition de phénotype en

pathologie humaine (1)

Implication en pathologie humaine

• Conversion des cellules endothéliales et des fibroblastes en

cellules musculaires vasculaires et myofibroblastes ( SMA+):

hypertension pulmonaire artérielle

• Conversion des cellules étoilées du foie en myofibroblastes

Application en thérapie cellulaire

• Conversion des cellules du pancréas (glucagon +) en cellules

(insuline +): régénération tissulaire en réponse à la disparition

massive des cellules (modèle de diabète type I)

• Plasticité des cellules souches mésenchymateuses: différenciation

en cellules d’autres lignages (cellules , neurones, cellules

musculaires cardiaques…)

4

5

5

Exemples de transition de phénotype (2)

• Transition épithélio-mésenchymateuse (TEM= Epithelial- mesenchymal

transition, EMT/ métaplasie):

Génération de cellules capables de migrer à partir de cellules épithéliales

- différenciation en cellules mésenchymateuses, fibroblastes

- acquisition de propriétés de cellules souches

• Mésenchymal- epithelial transition (MET): phénomène inverse de la TEM

Ex: formation des somites/embryogenèse

• Endothelial- mesenchymal transition (EndoMT): acquisition d’un

phénotype mésenchymateux par les cellules endothéliales

5

6

6

Polarité apico-basale

Phénotype statique

Jonctions

adhérentes + serrées

E-cadhérine

Cytokératines

Absence de polarité

Extensions membranaires

Réorganisation du

cytosquelette

Cytokératines

Vimentine

-caténine nucléaire

Polarité ‘avant-arrière’

Phénotype migratoire

Absence de jonctions

intercellulaires

Production de matrice

extracellulaire

et médiateurs fibrogéniques

Phénotype épithélial Phénotype métastable

Phénotype mésenchymateux

Cas particulier de la transition épithélio-mésenchymateuse

(TEM)

6

7

7

La TEM:

Implication en physiologie humaine/ physiopathologie

• Initialement décrite dans le cadre de l’embryogenèse

TEM de type I

• Mise en évidence dans les phénomènes de réparation tissulaire et les

pathologies à composante fibrotique (rejet de greffe, fibrose rénale,

fibrose pulmonaire idiopathique…)

TEM de type II

• Impliquée dans la dissémination des cellules épithéliales tumorales

(métastases)

TEM de type III

8

8

Stimuli inducteurs de TEM

• Facteurs solubles (facteurs embryogéniques, médiateurs

inflammatoires: TGF-, PDGF, EGF, FGF-2, IGF-BP5)

• Réarrangements matriciels (ex: matrice fibrillaire vs. Laminine)

• Agression épithéliale (ex: protéases, lésion)

9

9

Signalisation intracellulaire de la TEM

10

10

Rôle clé de Snail au cours de la TEM

Marqueurs épithéliaux Marqueurs

mésenchymateux

Remaniements

du cytosquelette

11

11

Les marqueurs de TEM (1)

Les plus fréquemment utilisés, liés à une:

• Altération de l’expression de protéines membranaires:

– Adhérence cellule-cellule switch E-cadhérine/ N-cadhérine

– Adhérence à la matrice

5 intégrine, discoidin domain receptor tyrosine kinase 2 (= kinase

spécifique au récepteur du collagène)

– Forme de la cellule

cytosquelette: switch cytokératine/ vimentine

• Modification de la fonction cellulaire:

– Migration

protéines du cytosquelette: FSP-1 ± -SMA, métallo-protéases

matricielles

– Synthèse de protéines matricielles

fibronectine, collagène I

– Resistance à l’anoikis

+ Néo-expression de facteurs de transcription et translocation nucléaire de la -

caténine

12

12

Les marqueurs de TEM (2)

Nom Type de TEM Nom Type de TEM

Marqueurs induits Marqueurs réprimés

13

13

Nouveaux marqueurs de phénotype: les miRNAs (1)

• Petits ARN (19-22 nts) simple-brins

non-codants

• Répriment l’expression de gènes de

façon post-transcriptionnelle:

fixation par complémentarité totale ou

partielle avec séquence 3’UTR des

ARNm cibles

14

14

Nouveaux marqueurs de phénotype: les miRNAs (2)

• Expression

- tissu-spécifique

Ex: miR-122/ foie; miR-1/ muscle squelettique; miR-133/

muscle cardiaque; miR-375/ îlots de Langerhans

- temporelle

Ex: gastrulation/ développement

- modulée par l’environnement tissulaire chez l’adulte

Ex: miR-21/ inflammation allergique des voies aériennes (IL-13 Tg);

miR-155/ fibrogenèse pulmonaire

• Fonctions (entre autres!)

- régulent la différenciation

Ex: famille miR-200/ phénotype épithélial;

miR-145/ conversion fibroblastes-cellules musculaires lisses

- régulent la prolifération

Ex: miR-203/ différenciation des kératinocytes: cellules basales

(proliférantes) vers supra-basales (différenciées)

15

15

La machinerie des miRNAs et la transdifférenciation

• Induction de conversion de phénotype sans retour à un état pluripotent

(régulation épigénétique: inactivation par hyperméthylation de l’ADN)

• Expression réduite de Dicer associée avec un état moins différencié des

cellules (moindre maturation des miRNAs)

16

16

a: Ségrégation des membres de la famille miR-200 en fonction de leur séquence ‘seed’

b: Sites de fixation des miR-200s au niveau des régions 3’UTR régions of de l’ARNm des ZEBs

c: Boucle de rétro-régulation négative impliquant les miR-200s et les ZEBs au cours de la TEM

NAT: Natural Antisense Transcript

Autres acteurs de la TEM: les ZEBs

Facteurs de transcription de la famille ZEB : répression de l’E-cadhérin et des miRNAs

17

17

Mise en évidence de la transdifférenciation

But: mettre en évidence l’apparition d’un nouveau phénotype

différencié

bien caractériser le phénotype initial (type de cellule, mais

également type de tissu! Exemple: cellule épithéliale bronchique

vs. alvéolaire)

définir si mise en évidence précoce? (facteurs de transcription,

nouveau phénotype transitoire)

ou détection plus tardive (maladie chronique: nouveau phénotype

stable)

18

18

Outils de mise en évidence de la transdifférenciation

• Etude morphologique: microscopie classique

• Caractérisation et distribution cellulaire des marqueurs de phénotype + facteurs

de transcription (Immunocytochimie ± fluorescence et microscopie confocale)

• Quantification de l’expression à l’échelle protéique (Western Blot) et

transcriptionnelle (PCR, puces à ADN)

! Attention !

- choix du modèle cellulaire déterminant pour les marqueurs à étudier (origine

tissulaire) et la ‘facilité’ de mise en évidence de la TEM (cellules immortalisées >

cellules primaires)

- choix du mode de préparation des échantillons: ex. analyse des miRNAs/ ne pas

éliminer les petits ARNs…

- et du mode de culture (effet de la matrice sur le phénotype des cellules/ culture

en interface air-liquide pour différenciation épithéliale…)

19

19

Exemple: Mise en évidence in vitro de la TEM

• Morphologie ‘allongée’ (spindle-shape) avec perte de polarité et

réorganisation des fibres de stress

• Disparition des marqueurs épithéliaux (E-cadhérine, cytokératine, ZO-1)

• Néo-expression de marqueurs mésenchymateux (N-cadhérine, FSP-1)

• Induction de Snail/ Slug/ Twist

• Translocation de la -caténine

• Augmentation de l’expression de collagène/ vimentine/ HSP-47

• Augmentation de la capacité migratoire

• Augmentation de l’expression de MMPs

• Résistance à l’apoptose/ anoïkis

20

20

Mise en évidence in vitro de la TEM: chambre de

Boyden

• Détection d’une capacité migratoire accrue

Collagène

Migration de ‘fibroblastes’

suite à l’induction de TEM?

TGF-1

Cellules épithéliales

(différentiées?)

21

21

Vimentine

E-cadhérine

Milieu TGF-1

(3 j)

TEM de cellules bronchiques immortalisées (BEAS-2B)…

22

22

E-cadhérine /

Vimentine

Milieu TGF-1

…vs. TEM de cellules bronchiques primaires (NHBE)

(6 j)

23

23

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3j 6j 10j

E-c

ad

h�rine/-a

ctin

e

0

10

20

30

40

50

60

70

3j 6j 10j

N-c

adh�rine/-a

ctin

e

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

3j 6j 10jV

imentin

e/

-actin

e

E-cadhérine N-cadhérine Vimentine

TGF-1 Milieu

E-cadhérine

Vimentine

-actine

6 3 10

TGF-1 - + - +

Jours

- +

N-cadhérine

Expression des marqueurs de TEM au niveau des cellules

épithéliales bronchiques humaines: Western-Blot

24

24

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

3 6 18 24 72

Temps (h)

AR

Nm

vim

en

tin

e / H

PR

T

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

3 6 18 24 72

Temps (h)

AR

Nm

cad

hˇr

ine

E / H

PR

T

TGF-1 Milieu

E-cadhérine Vimentine

0,E+00

2,E-03

4,E-03

6,E-03

8,E-03

1,E-02

1,E-02

3 18 72

mR

NA

pro

coll

Ia1

/UB

C

Temps (h)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

3 18 72

mR

NA

FN

/UB

C

Temps (h)

0,E+00

1,E-01

2,E-01

3,E-01

4,E-01

5,E-01

6,E-01

3 18 72

mR

NA

MM

P-9

/UB

C

Temps (h)

Procollagène I1 Fibronectine MMP-9

Expression des marqueurs de TEM au niveau des cellules

épithéliales bronchiques humaines: qPCR

25

25

P Smad3

-actine

TGF-1 (3h) - + - +

Dexa Milieu

- + - +

Salm MeOH

Smad3 T

0

5

10

15

20

ratio

Psm

ad

3/T

sm

ad

3

TGF-1 Milieu

Milieu Dexa MeOH Salm

Signalisation intracellulaire de la TEM au niveau des cellules

épithéliales bronchiques humaines

Effet des traitements

de l’asthme

(Dex: dexaméthasone;

Salm: salmétérol)

26

26

Implication des facteurs de transcription Snail et ZEB1 dans la

TEM des cellules épithéliales bronchiques

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

3h 18h 72hZ

EB

1/ U

BC

Temps (h)

HCl

TGF

3 18 72

Temps (h)

Sn

ail

/UB

C

0

2

4

6

8 HCl

TGF-1

27

27

Outils de détection in vivo de la transdifférenciation

• Phénomène souvent rare!

• Localisation préférentielle selon origine de la stimulation?

(ex: détection de marqueurs de TEM au voisinage d’une lésion épithéliale

ou d’une rupture de la membrane basale)

• Mise en évidence de cellules exprimant de façon concomitante des

marqueurs du phénotype originel et du nouveau phénotype

(voir marqueurs in vitro)

- Echelle protéique: Immunohistochimie/Immunofluorescence ±

microscopie confocale

- Echelle transcriptionnelle: hybridation in situ

28

28

Ex: implication de la TEM dans le remodelage

des voies aériennes

Réparation

anormale

Remodelage bronchique

et alvéolaire Inflammation

Trouble ventilatoire obstructif

(asthme, BPCO)

Agressions répétées des

voies aériennes

Eosinophile Macrophage

(accumulation,

activation)

Synthèse de médiateurs inflammatoires,

fibrogéniques et MMPs

(activation, prolifération,

différenciation en myofibroblaste)

Fibroblaste

Epithélium

29

29

Indices de TEM dans l’asthme?

• Activation de la voie du TGF-1 au niveau

des cellules épithéliales bronchiques :

- Augmentation de l’expression de

phospho-Smad-2

- Diminution de l’expression de

Smad-7 (augmentation de la

sensibilité au TGF-1 ?)

• Augmentation de l’expression de TGF-1 (et corrélation avec épaisseur

lame basale et hyperéactivité bronchique)

• Altération de la barrière épithéliale ( E-cadhérine/ ZO-1, cohésion)

• Accumulation de (myo)fibroblastes au niveau sous-épithélial

30

30

Pan-Cytokératine

Vimentine

Recherche de TEM dans l’asthme (1)

Problème: Marquage avec anticorps

anti-Pan-cytokératine =

non spécifique des cellules

épithéliales!

(marque les cellules endothéliales et

cellules musculaires)

31

31

CK5

Vimentine

Implication de la TEM dans l’asthme (2)

Ajuster en fonction du tissu:

Cytokératine 5 = spécifique des

cellules épithéliales bronchiques

basales

32

32

TEM et fibrose pulmonaire idiopathique

(Willis et coll., Am J Pathol 2005)

-SMA

TTF-1

Pro-SP-B

33

33

TEM et rejet de greffe pulmonaire

(Borthwick et coll., Thorax 2009)

34

34

Mise en évidence in vivo de la transdifférenciation:

modèles animaux

± Tag du phénotype originel

pour suivi au niveau tissulaire

(ex: cellules épithéliales/

promoteur SPC)

Inhibition de la signalisation

intracellulaire

(ex: voie TGF-1/Smad-3 KO,

Administration de BMP-7)

Marqueurs de transdifférentiation

‘Read-out’ du modèle: conséquence tissulaire

- Induction du phénomène recherché? (ex: fibrose)

- Altération de la fonction tissulaire? (ex: obstruction bronchique)

Stress tissulaire/

surexpression cellule-spécifique de

facteurs de transcription

(ex: Expression épithéliale

de Snail sous promoteur CC-10)

35

35

Ex: TEM dans un modèle murin de fibrose rénale

Tag des hépatocytes:

Gène reporter LacZ sous promoteur de l’albumine

‘pistage’ au niveau des tissus fibrosés

30% des fibroblastes issus de l’épithélium!

+ Réversion par l’antagoniste du TGF-1: BMP-7

(Zeiberg et coll., J Biol Chem 2007)

36

36

Ex: Conversion des cellules en cellules du pancréas

Tag des cellules :

Gène reporter YFP ‘pistage’ au cours de la régénération de cellules

(Thorel et coll., Nature 2010)

65% des cellules insuline + sont YFP+ (90% sont co-expriment le glucagon)

37

37

La transdifférenciation sur la toile

The EMT International Association:

http://www.mtci.com.au/TEMTIA/TEMT-Assn.html

Congrès bis-annuel, 10-13 octobre 2011: Singapour

- Série de revues sur la TEM: J. Clin. Invest. Juin 2009: 119(6) (Kalluri R. EMT: when epithelial cells decide to become mesenchymal-like cells

Kalluri R, Weinberg RA. The basics of epithelial-mesenchymal transition

Acloque H, Adams MS, Fishwick K, Bronner-Fraser M, Nieto MA. Epithelial-mesenchymal

transitions: the importance of changing cell state in development and disease

Zeisberg M, Neilson EG. Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions)

- Revue sur la régénération tissulaire: Nature Reviews - Genetics.

Octobre 2010: 11

Poss KD. Advances in understanding tissue regenerative capacity and

mechanisms in animals