Plant Science Letters, 13 (1978) 185--192 185 © Elsevier/North-Holland Scientific Publishers Ltd.

L'ACIDE TRANS-CINNAMIQUE ET L'EVOLUTION DE L'ACTIVITE DE LA PHENYLALANINE AMMONIAC-LYASE DANS LES COTYLEDONS DE RADIS EXPOSES A LA LUMIERE ROUGE LOINTAIN

CLAUDE HUAULT et DOMINIQUE KLEIN-EUDE . j • . .

Laboratoire de Photobiologie, assoc~e au C.N.R.S., Faculte des Sctences,76130-Mont Saint Aignan (France)

(Re~u le 13 fe~rier, 1978) (Revision revue et accept~e le 30 mars, 1978)

SUMMARY

Exogenous supply of L-phenylalanine (L-PHE) or trans-cinnamic acid (ATC) to radish cotyledons illuminated with far-red light (RL) causes a large decrease of L-phenylalanine ammonia-lyase (PAL) level during the phase of increasing activity, whereas D-phenylalanine (D-PHE), a competitive inhibitor of PAL~ exerts a strong stimulation upon the level of PAL activity. The decrease of PAL activity, after cessation of irradiation, or under continuous far-red light after the maximum of PAL activity is reached, cannot be prevented by supplying cotyledons with D-PHE.

The results suggest; 1: that ATC plays an important part by controlling repression of PAL synthesis and 2: that the intervening of PAL inactivator synthesis is unlikely.

RESUMI~

Le niveau d'activit~ L-phenylalanine ammoniac-lyase {PAL) des cotyledons de radis exposgs ~ la lumidre rouge lointain (RL) dgcrolt de fa~on importante, lorsque de l'acide trans-cinnamique (ATC) ou de la L-phgnylalanine (L-PHE) est ajoutg au milieu de culture durant la phase d'augmentation de l'activit6 enzymatique. Au contraire, la D-phgnylalanine (D-PHE), inhibiteur comp6titif de la PAL, provoque, dans les m~mes conditions, une forte augmentation de l'activit6 PAL. Par ailleurs, la D-PHE exog6ne ne peut empScher, ni la diminu- tion de l'activitg PAL observge apr6s le maximum d'activitg enzymatique

Abr@viations: PAL = L-ph@nylalanine ammoniac-lyase; ATC = acide trans-cinnamique;

D-PHE = D-ph@nylalanine; L-PHE = L-ph@nylalanine; RL = lumie're rouge lointain.

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atteint en Eclairement continu, ni la dEcroissance de l'activitg PAL provoquEe par l'arr~t de l'irradiation.

Ces rEsultats dEmontrent; 1 : que l 'ATC contrSle la repression de la synth~se de la PAL et 2 : que l ' intervention d 'un inactivateur de la PAL est peu probable.

INTRODUCTION

La PAL (EC 4.3.1.5.), enzyme primordiale du mEtabolisme des phEnyl- propanoides catalyse la dEsamination de la L-phEnylalanine en acide trans- cinnamique. L'Evolution de son activitE est affectge par de nombreux facteurs, parmi lesquels la lumi~re est le plus EtudiE [1,2] . I1 n'a pas encore Etg possible de d~terminer, de fa~on d~finitive, les niveaux d'action de la lumi~re: synth~se accrue de PAL, diminution de sa vitesse de degradation, activation d 'un prE- curseur ou dissociation d 'un complexe enzyme-inactivateur? [3,4] .

De nombreux auteurs ont dEmontrE que la L-PHE inhibe le dEveloppement de l'activit~ PAL [5,6] , au m~me titre que I'ATC [7--10] , soulignant ainsi le r61e de l'ATC dans la regulation de la PAL.

Dans cette Etude, nous avons examine le r61e gventuel de I'ATC dans le con- tr61e du niveau d'activitE PAL dans les cotylddons de radis maintenus ~ l 'ob- scuritE ou exposes ~ la lumi6re RL, laquelle induit une forte activitE P/kL. Diverses approches ont EtE envisagges ; 1 : augmentation de la concentration endocellulaire d'ACT en apportant au milieu de culture ACT ou L-PHE et 2 : reduction du niveau d'ATC intracellulaire par blocage du site actif de la PAL par de la D-PHE exog~ne.

MATERIEL ET TECHNIQUES

Les graines de Raphanus sativus L. (vari~t~ "Longue rave saumonn~e") pro- viennent des Ets. Fontaine, 27 -Bourg Achard (France). Elles sont mises ~ germer

l 'obscurit6, sur eau distill6e, ~ 25°C, suivant notre protocole habituel [ 11] . Les plantules sont ensuite transferees sous une plage d'irradiation RL dont les caractgristiques ont gt6 antgrieurement dgfinies [12] . Le matgriel vgggtal a gt6 placg. ~ divers stades de d6veloppement, sur du papier filtre imbibg de solutions d'ATC, de D-PHE ou de L-PHE dont le pH a gt6 ajustE ~ 7. Dans certaines experiences, les cotyledons ont ~t~ s~par~s des plantules enti~res sous lumi~re verte de s~curit~ [ 12] .

L'extraction de la PAL et la mesure de son activitg ont gtg rdalisges suivant un protocole standard [11] . L'activit~ enzymatique est exprim~e en nmol d'ACT • cotyledon -1 • h -~ . Chaque point port~ sur les courbes repr~sente la moyenne de cinq experiences.

RESULTATS

Action de I'ATC L'ATC rEduit for tement le dEveloppement de l'activitd PAL des cotyledons

187

150

A f -

"o O0

~ 75

~ so

2|

niveau temoin

\ I

!0 "1 IVl - - , ~ i i I i

10"4 10-3 10-2 Concentration

Fig. ] : Inf luence de ]a D-PHE, de la L-PHE et de ] 'ACT, ~ diverses concentrat ions sur l '&o lu- t ion de l'aetivit~ PAL dans les cotyledons de radis exposes ~ un ~clairement RL, 36 h apr~s le semis: la D-PHE (symboles ronds), la L-PHE (symboles triangles) et I'ATC (symboles carrds ont gtg fournis au semis; la mesure d'activitd PAL a dt~ rdalis~e apr~s 24 h d'dclaire- ment.

exposes ~ la lumi~re RL (Fig. 1). Dans les experiences suivantes, I'ACT a ~t~ utilis6 ~ la concentration de 10 -2 M et foumi ~ divers stades de dgveloppement (Fig. 2A).Nousconstatons 1 . . . . ' " " " • une reduction tres lmportante de 1 actlvlte PAL par rapport ~ la courbe tdmoin lorsque I'ATC est foumi aux cotylddons d~s le ddbut de l'irradiation; 2, une diminution de l 'effet inhibiteur de I'ATC lorsque celui-ci est fourni plus tardivement; 3, peu (ou pas) d 'action de I'ATC durant la phase de dgcroissance de l'activitd PAL sous gclairement RL et en obscuritg continue.

Action de la L-PHE La L-PHE prdsente ggalement un effet inhibiteur sur le ddveloppement de

l'activitg PAL (Fig. 1). A la concentration de 10 -2 M, les effets observds sont comparables ~ ceux obtenus avec l'ATC (Fig. 2 B). Toutefois, l 'action de la L-PHE fournie au cours de la phase d 'augmentat ion de l'activitg PAL ~ la lumi~re, ne se manifeste qu'apr~s un certain temps de latence.

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6O

3O

3 6 4 8 6 0 72 8 4 9 6 h temps apr6s le deb.t de I'lmblbition

J

3 6 4 8 6O 72 8 4 9 6 h temps apres le debu! de I'imblbltion

Fig. 2A et B: Action de I'ATC (courbes A) et de la L-PHE (courbes B), ~ la concentration de 10-2 M, stlr l'gvolution de l'activitg PAL, dans les cotyl@dons de radis maintenus ~ l'obscuritg (trait tirg) ou exposds ~ la lumie're RL~ 36 h apr@s le semis (trait plein): tdmoin eau = sym- boles triangles; ATC = symboles ronds; L-PHE = symboles carrds; la fl$che indique le moment ot~ les plantules ont @t@ placdes sur ATC ou sur L-PHE.

Action de la D-PHE La D-PHE exerce, pour des concentrations comprises entre 10 -2 et 10 -3 M,

une action stimulatrice sur le d~veloppement de l'activit~ PAL ~ la lumi~re (Fig. 1).

La D-PHE a dtd fournie, ~ la concentration de 10 -2 M, et ~ divers stades de d6 veloppement des cotylddons (Fig. 3). La D-PHE augmente considgrablement le niveau d'activitg PAL lorsque l 'gclairement est rgalisg 36 h apr6s le semis.

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189

120 ._J <C O.

..~

60

. . . . . ._?222_.. 36 48 60 72 84 96 108 h

temps apres le debu t de I ' i m b i b i t i o n

Fig. 3: Action de la D-PHE (10 -2 M) sur l'~volution de l'aetivit(~ PAL dans les cotylgdons de radis maintenus $ l'obscurit~ (trait tir(~), ou exposds ~ la l u m i ~ e RL, 36 h ou 72 h apr~s le semis (trait plein) : t~moin eau = symboles ronds D-PHE = symboles triangles; les fl$ches indiquent le moment ot~ les cotylSdons ont (ft(~ plac(~s sur D-PHE; les cotylddons ont dtd excises 36 h aprSs le semis.

Nous constatons alors ; 1, que l 'effet de la D-PHE n'apparaTt qu'apr~s une pdriode de latence de l 'ordre de 15 h et prdcddant l 'amortissement de l 'augment- ation de l'activitd PAL (courbe al ); 2, que l 'action stimulante de la D-PHE s'affaiblit considdrablement lorsqu'eUe est apportd tardivement aux cotylgdons ~clair~s (courbes a2, a3 et a4 ), 3, que la D-PHE ne supprime, en aucun cas, la phase de dgcroissance de l'activitg PAL. Par aiUeurs, la D-PHE n'exerce aucun effet lorsque les cotylgdons sont gclairds tardivement, c 'est ~ dire 72 h apr~s le semis (courbes B e t b), ou lorsqu'ils sont maintenus en obscuritg continue (courbes C et c).

Enfin, nous constatons que la D-PHE ne modifie nullement la vitesse de diminution de l'activitd PAL lorsque des cotylgdons, prdalablement exposgs ~i la lumi~re RL, sont replacgs ~i l 'obscurit~ (Fig. 4), aprds un gclairement de 12 h (courbes A e t A') ou de 24 h (courbes B e t B').

190

obsc.

120 1

oo

'.,,, ',,,. \ "%. •

, , . . . . . . . . . . . .

36 48 60 72 temps apres le debut de I'imbibition

Fig. 4: Evolu t ion de l 'activit~ PAL dans les co ty ledons transforms ~ l 'obscuri t~ apr@s 12 ou 24 h d '~cla i rement RL, en prgsence ou non de D-PHE: D-PHE = symboles triangles; tgmoin eau = symboles ronds; les cotylgdons on t ~tg excisgs et exposgs ~ la lumi~re RL 36 h aprSs le semis.

DISCUSSION

Le f o ~ effet inhibiteur de I'ATC et de la L-PHE sur le niveau d'activit6 PAL, ainsi que l 'action stimulante importante de la D-PHE que nous avons observgs chez des cotylgdons dclair6s, met tent en relief le r61e important de I'ATC dans la r6gulation de la PAL. Les effets contraires de la L-PHE et de la D-PHE exog~nes peuvent ~tre interprdt6s ainsi : la L-PHE est transformge par la PAL en ATC, lequel relentit le d6veloppement de l'activitd PAL; par contre, le D- PHE, en bloquant le site actif de la PAL, emp~cherait la production d'ATC, entraTnant, de ce fait, l 'effet inverse.

Diff~rentes hypotheses ont ~t~ propos~es pour expliquer l 'action de I'ATC. Celui-ci pourrait induire la synth~se d'un inactivateur [10] , ce qui provoquerait la formation de complexes PAL-inactivateur [13--15] , ou bien r6primer la synth~se de la PAL [8] .

L'ATC et la L-PHE ne r6duisent le niveau d'activitg PAL, de faqon import- ante, que durant la phase d 'augmentation de l'activitg PAL ~ la lumi~re, ce qui implique que I'ATC influe sur le mgcanisme responsable de cette augmenta- tion et non sur le processus de diminution de l'activit6 PAL. Les r6sultats obtenus avec la D-PHE sont en accord avec cette hypoth~se. L'absence de blocage de la dgcroissance de l'activitg PAL~ en pr6sence de D-PHE permet d'exclure que la D-PHE intervienne en emp~chant la synth~se d 'un inactivateur induite par I'ATC [5] , ou encore en inhibant l 'inactivation de la PAL [16] . La

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D-PHE agirait plut6t en bloquant la r~pression, par I'ATC, de la synth~se de la PAL. L'intervention de I'ACT dans la r~gulation du taux de synth~se de la PAL a dtd ddmontrde par Johnson et al. [8] : ces auteurs parviennent ~ rdduire le marquage de la PAL par D:O en cultivant des plantules de cornichon en prdsence d 'ATC L'intervention de l'ATC dans la rdpression de la synthdse de la PAL expliquerait la stimulation de l'activitd PAL en prdsence de D-PHE au cours de la phase d'accroissement de l'activit~ PAL. Cette interpretation est justifi~e par les experiences de marquage par la [ 14 C] leucine de PAL purifi~e que nous avons rdalisges, pour diverses durdes d'dclairement (rdsultats non publids): et qui ddmontrent que la pdriode de synthdse active de la PAL coincide avec la phase d 'augmentation de l'activitd PAL ~i la lumidre. Ces rdsultats, en accord avec les travaux d'Hahlbrock et Schroder [17] et la conclusion de Tong et Schopfer [18] suggdrent que I'ATC exercerait une action rdpressive durant la pgriode de synth~se active de la PAL.

D'autres faits semblent rdfuter l ' intervention d 'un syst6me inactivateur dans la rdgulation de l'activit~ PAL. La D-PHE n'induit pas d 'augmentat ion de l'activitd PAL en obscurit6 continue et ne modifie pas la cindtique de diminu- tion de l'activitd enzymatique aprds arr~t de l'dclairement, ce qui rend peu probable la formation de complexes PAL active-inactivateur. De plus, dans les cotyledons de radis, la d~croissance de l'activit~ PAL, en dclairement continu, ne peut pas 6tre bloqud par la cycloheximide, ni par l 'actinomycine D [11], ce qui semble exclure la synthdse d 'un inactivateur protdique.

Nous avons constatd, par ailleurs, que l 'action de la D-PHE ne s'exerce, ~i la lumidre, qu'aprds une phase de latence de l 'ordre de 15 h, ce qui peut indiquer que le processus de rdpression de la synthdse de la PAL par I'ATC n'intervien- drait qu'au-dessus d 'une concentration critique d'ATC. Ce seuil ne serait pas atteint lorsque des cotyledons ~g~s de 72 h sont exposes ~ la lumi~re, ce qui expliquerait alors l 'absence d 'effet de la D-PHE (Fig. 3, courbes B e t b).

Ces rgsultats suggdrent: 1, que la rdgulation de l'activitd PAL, dans les cotyld- dons de radis, ne fait pas intervenir un syst~me inactivateur dont la synth~se serait sous le contr61e de I'ATC; 2, que I'ATC contrSle le taux de synth~se de la PAL au-dessus d 'un certain seuil.

Le schSma que nous proposons ne reprend pas l'idSe avanc~e ant~rieurement [11] et selon laquelle l 'augmentation de l'activitd PAL ~i la lumidre serait due ~i la photoactivation d 'une forme inactive de la PAL~ celle-ci pouvant ~tre soit un zymog~ne, soit un complexe PAL-inactivateur. Il n 'en demeure pas moins que la prdsence, darts les cotylddons de radis, d 'une forme non active de la PAL ne semble pas devoir 6tre dcartge. Ainsi Faye [19], reconsiddrant les dtudes de Blondel et al. [20] , vient de montrer qu'il existait darts les extraits de ces organes une protdine prdsentant des ddterminants antigdniques communs avec la PAL.

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