Le complément

S3 L2

2012-2013

Cédric Ménard

C3b C3b

• Découverte scientifique (1895 Jules Bordet – Institut Pasteur- Nobel 1919) :

- Sérum immun : bactéricide

- Sérum immun chauffé : bactéries survivent

- Sérum non-immun : bactéries survivent

- Sérum immun chauffé + Sérum non-immun : bactéricide

Définition du complément

Bactéries vivent

Injection bactéries

Bactéries vivent

Injection bactéries

Sérum

Bactéries tuées

Le sérum du lapin contient des Ac contre les bactéries qui les

tuent

Ces Ac contre les bactéries ont besoin de molécules du sérum

sensibles à la chaleur pour tuer les bactéries

Les Ac dirigés contre les bactéries sont indispensables

pour pouvoir les tuer

Bactéries tuées

Les Ac ont besoin d’ un élément sensible à la

chaleur et indpdt de l’Ag pour pouvoir tuer les

bactéries…

Qui est cet élément ?

•Complément = élément thermolabile du sérum, non spécifique de l’antigène, capable de « complémenter » les Ac pour éliminer bactéries

• Branche de l’immunité innée

• Complément = ensemble de plus de 30 protéines :

- plasmatiques (5% des protéines sériques)- de surface cellulaire

Définition du complément

Complément = ensemble de protéines

• Protéines du complément produites par :

– Foie (très majoritairement à l’état basal)– Macrophages (production utile dans les OLS)– Épithéliums muqueux et fibroblastes (faible)

• Inactif dans le sérum, clivages en cascade des zymogènes confèrent activités enzymatiques

• Deux types d’activateurs du complément :

– complexes immuns = complexes Ag / Ac (Ac-dépendant)– sucres associés aux pathogènes (Ac-indépendant)

• Trois voies :

– classique (via Ac)– des lectines (sans Ac)– alterne (sans Ac)

• Finalité : assurer la mort du pathogène :– DIRECTEMENT : rupture membranaire et choc osmotique – INDIRECTEMENT : en l’opsonisant = facilitant sa reconnaissance par le SI (Gram + à paroi)

Définition du complément

Fragments de clivage enzymatique : lettre minuscule «C4 clivé donne C4a + C4b »

Molécule inactive : désignée par i « C3bi ou iC3b »

Formes enzymatiques actives : recouvertes d’une barre horizontale « C1r »

I- Nomenclature

• C1 se fixe par C1q (protéine de reconnaissance) sur le Fc des anticorps impliqué dans des complexes immuns (région CH2 pour IgG1 et IgG3 et région CH4 pour IgM)

• Activation par des complexes immuns à IgM pentamérique (3 sites pour C1) ou IgG (1 site pour C1 et donc plusieurs IgG nécessaires)

• IgM 1000 x plus efficaces que les IgG pour activer C1 (passage forme plane à agrafe)

II- Les voies d’activation

A- La voie classique (nécessite Ac)

C1q

C1r C1s

Surface de la cible

bactérie par exemple

IgG (IgG1 et IgG3)

IgM

C1-estérase (Ca2+-dpdte)

sérine-protéases C1r et C1s activées

IgG IgM

La présence d’Ac spécifiques indique qu’une réponse contre l’Ag a déjà été initiée !

• Fixation C1 à l’anticorps via C1q

• Activation autocatalytique du proenzyme C1r en C1r

• C1r convertit C1s en C1s

• C1s va cibler C4 circulant C4a + C4b (C4b s’ancre dans la membrane cible via thioester R-S-CO-R’)

• C1s va cibler C2 associé à C4b C2a +C2b

• C2a s’associe à C4b déjà ancré dans la membrane et donne C4b2a (=C4bC2a)

• Ce complexe C4b2a = C3 convertase « classique » qui clive C3 en C3a + C3b (expose un thioester)

II- Les voies d’activation

A- La voie classique

1- Activation

covalent

C4a

C2b

• Contrôle de la C1-estérase par C1-inh :- empêche activation de C1r en phase liquide- peut inactiver le C1r activé

• Thioester C3b et C4b hyper-réactif est hydrolysé en qqes ms par l’eau si non-fixé = obligation de se lier covalement au voisinage immédiat (= pas d’effet collatéral)

• Complexe C4b2a instable = dissociation spontanée

• Contrôle de la C3 convertase (C4b2a) :- C4-bp inhibe l’association C4b / C2- CD55 = DAF « decay-accelerating factor » dissociation C4 / C2 (protection de l’hôte)- CR1 (CD35) = C3b-R peut titrer le C3b- Facteur I : clive C3b en iC3b

II- Les voies d’activation

A- La voie classique

2- Régulation

C1-inh (détache C1r et C1s du complexe)

• Activation : Mannan Binding Lectine (MBL) ou Ficoline reconnaissant sucres des pathogènes (mécanisme analogue à la C1 estérase qui reconnaît les complexes immuns)

• Molécules effectrices : MBL-associated proteases = MASP (homologues de C1r/s)

II- Les voies d’activation

B- La voie des lectines : Ficoline et MBL (court-circuitent les Ac)

Reconnaît les sucres des pathogènes différents de

ceux de l’hôte

• MBL ou ficoline fixe sucres cibles = MASP clivées / réarrangées et autoactivées (Ca 2+-dpdt)

• MASP1 et 2 clivent C4 en C4a + C4b (qui s’ancre dans membrane)

• MASP1 et 2 clivent C2 associé à C4b membranaire en C2a pour donner C4b2a

• Formation de C4b2a = C3 convertase qui donne C3a + C3b (qui s’ancre dans membrane)

• MASP3 (splicing alternatif de MASP1) : rôle encore flou

II- Les voies d’activation

B- La voie des lectines (Ficoline et MBL)

1- Activation

Ac-indépendante !

• C3b doit se fixer à un groupe hydroxyl (-OH) de son voisinage immédiat (sucre / prot memb)

• Si absence de fixation, molécule H2O fixe C3b = ne peut plus lier une membrane cellulaire (C3b très instable)

« But : éviter accumulation de C3b actif qui pourrait être délétère pour l’hôte (vrai aussi pour le C3b issu de la voie classique) »

• MBL : forte affinité pour sucres bactériens, levures, virus :– Mannose – N-acétyl-glycosamine – Fucose

• Mais MBL peu affine pour sucres de mammifères (propriétés stériques des sucres) :– Acide sialique– Galactose

II- Les voies d’activation

B- La voie des lectines (Ficoline et MBL)

2- Régulation

C1-inh

• Initiation indépendante d’activateurs = clivage spontané / lent de C3 à bas bruit en C3a + C3b

• Phase d’amplification par des sucres bactériens (LPS, bactéries Gram+) ou des virus = déclenchement réel, « explosion » de la voie

• La cascade s’amplifie sur les cellules étrangères mais est immédiatement régulée sur les cellules saines de l’hôte

II- Les voies d’activation

C- La voie alterne (80% de l’activation du Cplmt)

C3

Hydrolyse lente dans plasma

« La voie tourne au ralenti »

« L'hydrolyse d'une substance est sa décomposition par l'eau grâce aux ions H3O+ et HO- provenant de la

dissociation de l'eau »

C3b C3b

• C3 hydrolysé à bas bruit et donne C3b

• Liaison facteur B à C3b (Mg2+- dpdt)

• C3bB est reconnu et clivé par la protéase « facteur D »

• Clivage de C3bB en C3bBb = C3 convertase alterne

1- Activation

II- Les voies d’activation

C- La voie alterneprotéaseC3b C3b

• C3bBb clive C3 en C3a et C3b = constituant de la C3 convertase : AMPLIFICATION

• La cible est « recouverte » par de nbreuses molécules de C3b (opsonisation)

• Les C3b peuvent former de nouvelles C3bB

• Stabilisation du C3bBb par la properdine (P) liant C3b (demi-vie 90 secondes vs 30 minutes), la properdine reconnaît les PAMP et les DAMP = des marqueurs de danger

2- Régulation

II- Les voies d’activation

C- La voie alterne

• Facteur H : dissociation C3bBb

• Facteur I : en association avec le CD46 (=MCP : membrane cofactor Protein), clivage C3b en C3bi, = le facteur B ne peut plus se lier à C3b devenu C3bi

«  De façon générale, dissociation des complexes de convertases est irréversible et permet de down-réguler la réponse du complément »

• En dépit d’initiateurs différents, les 3 voies convergent vers une C3 convertase :

– C4b2a pour la voie classique et la voie des lectines– C3bBb pour la voie alterne

Récapitulatif

C3b C3b

• Un fragment C3b s’associe aux C3 convertases et forme :

– C4b2a3b

– C3bBb3b

III- De la C3 convertase au complexe d’attaque membranaire : la voie effectrice commune

Voie alterne

C5 convertases

Voie classiqueVoie des lectines

Les C5 convertases permettant de cliver C5 en C5a + C5b (solubles)

C3 convertases

• C5b soluble s’associe à C6 et C7, le complexe hydrophobe ainsi formé s’insère dans la membrane cible via C7

• C5b67 ancré dans une membrane = récepteur à C8 ce qui aboutit à C5b678 qui initie une réaction lente de lyse

• C9 (x environ 12) est recruté au complexe membranaire C5b678 pour constituer le MAC « membrane-attack complex »

III- De la C3 convertase au complexe d’attaque membranaire : la voie effectrice commune

• Perte de l’équilibre osmotique (l’eau rentre dans la cellule/le pathogène)

• Mort mécanique de la cible

III- De la C3 convertase au complexe d’attaque membranaire : la voie effectrice commune

C9

Composition du MAC hétérogène : C5b6789n , n = 1 à 12

10 nm

 Gram-negative bacterium Shigella dysenteriae 

III- De la C3 convertase au complexe d’attaque membranaire : la voie effectrice commune

Régulation

Régulation des voies d’activation est majoritaire mais la voie commune est aussi régulée :

– C5b67 doit s’ancrer très vite dans la cible, sinon site d’ancrage inactivé• par hydrolyse• par fixation à protéines plasmatiques (protéine S = vitronectine ou clusterine)

– C8 en se liant à C5b67 en phase liquide bloque le site d’ancrage dans la membrane

– Plupart des membranes de l’hôte expriment CD59 qui se loge dans le CAM en cours d’assemblage = empêche la liaison de C9 = empêche formation du pore

IV- Le complément dans l’Évolution

– CR1 = CD35 : Récepteur du C3b et du C4b (GR, Leucocytes, FDC)

• Cibles opsonisées ou complexes immuns (GR) puis phagocytose par macrophages du foie (cellules de Kupffer)

• Rôle d’atténuation en liant C3b et C4b

– CR2 = CD21 : Récepteur de C3d (Lymphos B, FDC)

• Reconnaissance des lymphos B par virus EBV• CD21 diminue seuil d’activation BCR et favorise survie B

V- Récepteurs cellulaires des composants du complément

A- Récepteur fragments « majeurs »

BB

Reconnaissance via BCR

Activation +

Reconnaissance via BCR + CR2

Activation +++ (1000x plus efficace)

Fragments iC3b = C3d

« ancrage »

« fixation à un R »

– CR3 = CD11b/CD18 : Récepteur iC3b (Majorité des leucocytes)

• Molécule d’adhérence– Opsonisation / phagocytose bactéries ou cellules recouvertes de iC3b– Facilitation des contacts cellulaires

– CR4 = CD11c/CD18 : Récepteur iC3b (Cellules myéloïdes et certains lymphocytes activés)

• Molécule d’adhérence• Rôle physiologique peu connu

V- Récepteurs cellulaires des composants du complément

B- Récepteur fragments « mineurs »

C- Autres récepteurs (récepteurs à protéine G)

- C3aR (éosninophiles, basophiles et neutrophiles)

- C5aR (leucocytes et qqes autres types cellulaires)

- C1qR

VI- Les autres rôles du complément

Outre son rôle de lyse, le complément intervient dans :

- l’opsonisation des pathogènes / C apoptotiques (perte CD46 et CD59)

- l’activation de la réponse inflammatoire

Ceci est permis par les 4 récepteurs aux fragments C3 du complément

A- L’opsonisation

cible phagocyteReconnaissance

moyenne

cible phagocyte

Reconnaissance accrue via les R-Fc

cible phagocyte

Reconnaissance « maximale » via R-Fc + CR- En facilitant la reconnaissance de l’Ag par les futures APC, le

complément fait le lien immunité innée / adaptative cellulaire

cible

Reconnaissance accrue via CRs Phagocytose 100 x plus efficace

phagocyte

B- L’activation de la réponse inflammatoire

• Les fragments de clivage C3a, C4a et C5a du compléments ne sont pas inactifs !

• Ces molécules sont nommées « anaphylatoxines » et permettent :

- d’augmenter la perméabilité vasculaire (rôle dans l’extravasation)

- d’activer la dégranulation des polynucléaires, mastocytes (histamine…), éosinoph

- la contraction des muscles lisses

- le chimiotactisme des cellules de l’inflammation : C5a attire les MΦ sur site inflammation et facilite ainsi la phagocytose des cibles (opsonines et cplmt-R)

- d’augmenter l’expression des FcR des MΦ (C5a)

VI- Les autres rôles du complément

VII- Échappement au complément

- Recrutement / mimicking des régulateurs du complément

- Modulation du complément (CD59-like, Ig inactivating-proteine…)

- Dégradation enzymatique : bactéries uniquement (C1q, Ac, C5a, P…)

- Evasion passive : paroi bactérienne des Gram + !

RCA = régulateurs de l’activation du complément (ex : DAF=CD55)

Produits par l’hôte, ils peuvent être capturés à la surface du pathogène

par des protéines spécialisées

Gène viraux peuvent coder pour des analogues de RCA !

« mimétisme moléculaire  »

Protéine virale

DAF humain

VIII- Pathologies associées au complément

Maladies génétiques liées à un déficit en complément sont rares :

• déficits protéines de la voie classique• Infections récurrentes (méningites,

pneumonies…)• Association fréquente au lupus

• déficits protéines de la voie lectines et alterne : infection récurrentes

• déficits protéines du MAC accompagnés d'infections à Neisseria meningitidis

• déficits inhibiteurs donnent infections et des MAI

VIII- Pathologies associées au complément

• HNP : Hémoglobinurie Paroxystique Nocturne• Globules rouges plus sensibles à la CDC suite à une mutation

génétique rendant CD59 non fonctionnel• Hémolyse : anémie, toxicité rénale

• Eculizumab : IgG4• Bloque le site de clivage de C5 (C5a)

Lymphocytes Natural Killer (NK)et T

S3 L2

2012-2013

Cédric Ménard

Cinétique de la réponse immunitaire

IFN de type IT8

cytotoxiques

Anticorps

NKT

Mécanismes de reconnaissance de l ’immunité innée

réponse rapide (heures)

invariable

nombre limité de spécificités

constant lors de la réponse

Mécanismes de reconnaissance de l ’immunité adaptative

réponse lente (jours ou semaines)

variable

nbreuses spécificités hautement sélectives

s ’améliore lors de la réponse

Mécanismes effecteurs communs pour la destruction du pathogène

Caractéristiques de l ’immunité innée et de l ’immunité acquise

Les cellules Natural Killer « NK »

I- Caractéristiques générales

• Grand lymphocyte granuleux

• Fait partie de l’immunité innée : peut détruire rapidement des cellules tumorales ou infectées sans activation ni prolifération préalable

• Distribution dans l’organisme :– Sang : 5-15% des lymphocytes circulant– Organes lymphoïdes : ganglions, rate, amygdales– Tissus périphériques : foie, poumon (« sentinelles »), endomètre

• Expriment CD56, CD16, et NKp46 (pas CD3 ni CD19)• Production dans la moelle, maturation dans les organes

lymphoïdes (ganglions ++)• Lymphocytes cytotoxiques mais aussi producteurs de

cytokines/chimiokines

II- Ontogénèse et maturation des NK

ProgéniteurNK

NK immatureCSH

ProgéniteurLymphoïdeCommun

B

T

NKCD56 high

NKCD56 faible

moelle

Ganglions(paracortex)

NK matures

sang

E4BP4 Id2

II- Ontogénèse et maturation des NK

• Rôle central de l’IL-15 dans toutes les étapes de la lymphopoïèse NK– Produite par les cellules stromales dans la moelle– Produite par les DC/macrophages dans les ganglions

• “Education” des NK au cours de leur maturation– Doivent rencontrer un CMH-I au cours de leur développement– Nécessaire pour acquérir leur fonctionnalité

Potentiel cytotoxique et de sécrétion de

cytokines

Anergie

KIR

NK immature

Maturation

finale

CMH-IKIR : Killer cell Immunoglobulin-like Receptor

2 sous-types de NK matures

• CD56high

- Dans les ganglions (CCR7+) et la muqueuse utérine- Peu cytotoxiques- Produisent beaucoup de cytokines

• CD56low

- Dans le sang principalement- Cytotoxiques (perforine ds granules préformés)- Produisent moins de cytokines- Récepteurs aux chimiokines : migration dans les tissus surtout si

inflammation

III- Reconnaissance de la cible

• Pas restreinte à un complexe

CMH-peptide• Résulte d’une balance entre :

– Signaux inhibiteurs (tolérance au soi) : KIR inhibiteur vs CMH-I– Signaux activateurs : ligand = non soi/soi altéré

• Répertoire NK :– Chaque individu diffère dans ses récepteurs KIR exprimé par ses NK

(gènes polymorphiques)– Chaque NK a une combi ≠ de R inh et la plupart des NK a au moins

1 R inh (sinon, ils sont anergiques)– Existence d’une tolérance au soi = « nos propres NK ne nous

attaquent pas »

T8

cible

CMH-I

NK

cible

R act R inh

Cellules tueuses

CMH-I

Les récepteurs activateurs du NK

• Exprimés constitutivement à la membrane des NK, reconnaissent des motifs moléculaires conservés

• NKG2D (lectine de type C): cytotoxicité naturelle– Ligands : MICA et B, ULBP exprimés à la membrane lors d’un stress

cellulaire : infection virale, transformation tumorale, lésions de l’ADN…

• Natural Cytotoxicity Receptor (NKp30,44,46) : cytox nat.– Ligands : protéines virales (hémagglutinine ou pp65 du CMV)

exprimées à la surface des cellules infectées

• CD16 (FcRIIIa) : cytotoxicité dépendante des anticorps- Ligand : cible reconnue par Ac qui se fixe sur son Ag spécifique- CD16 se fixe à la partie Fc de l’Ac

• Autres : NKp44, DNAM-1, NKp80, 2B4…

Les récepteurs inhibiteurs du NK

• KIR : Killer cell Immunoglobulin-like Receptor– Famille de protéines codées par plusieurs gènes polymorphiques

– Diffèrent par le nbre de Domaines Ig extracellulaires (2D ou 3D) et la taille de leur queue cytoplasmique (Long ou Short)

– Les KIR2DL ou KIR3DL donnent un signal inhibiteur au NK– Ligand CMH-I spécifique pour chaque KIR2DL ou KIR3DL :

• NKG2A : lectine de type C– Association obligatoire avec le co-récepteur CD94– Ligand : CMH-I non classique : HLA-E

KIR2DL1, 2 et 3 HLA-C

KIR2DL4 HLA-G

KIR3DL1 HLA-B

KIR3DL2 HLA-A

NKG2DKIR

ITIMITAM

NKG2A CD94

CMH-I

Molécules du stress cellulaire :- MICA- MICB- ULBP

CD16

IgG fixé à une cellule

Les Récepteurs inhibiteurs Les Récepteurs activateurs

CMH-I type E

-Signal activateur : ITAM recrutent des kinases (immune receptor tyrosine-based activation motif)

- Signal inhibiteur : ITIM recrute phosphatases (immune receptor tyrosine-based inhibitory motif)

NCR

Protéines virales :-pp65 (NKp30)-hémagglutinine (NKp46)

Balance entre signaux activateurs et inhibiteurs

+

Cytokines activatrices :IL-2-12-15-18IFN

HLA-A,B,C,G

-Cytokines inhibitrices :TGF

NCR

KIR

HLA-E

MICA/BULBP

prot. virales

NKG2D

IgG

Ag

CD16

NKG2A

--

+

+

+

NK

cellule cible

« Ce n'est pas l'absence de molécules du CMH de classe I qui déclenche l'activation des lymphocytes NK mais la présence de ligands activateurs

non compensée par des signaux inhibiteurs suffisants »

Ainsi, l'absence de molécules du CMH-I ne suffit pas à rendre certaines cellules sensibles à la lyse NK, par exemple :- globules rouges- neurones - hépatocytes

Balance des signaux act et inh

NK

Une cellule du soi est normalement protégée de la lyse NK car le signal inhibiteur l’emporte en général sur l’activateur !

Une cellule « suspecte » (qui n’exprime pas de CMH-I) est lysée car aucun signal inhibiteur ne vient contrebalancer l’activateur

Une cellule allogénique est lysée car le CMH-I du non-soi ne déclenche pas de signal inhibiteur

Une forte activation des NK peut contrebalancer les signaux inhibiteurs (ADCC, IL-2…)

d Hyperactivation NK

+

Lyse possiblecytokines

a i

a

a

iaaa

aaa

CD16

IV- Mécanismes effecteurs

- 1 - Lyse de la cible selon 2 systèmes :- Perforine-granzyme- Récepteurs de mort : Fas/FasL, TRAIL/TRAIL-R

- 2 - Synthèse de cytokines : TNF, IFN, GM-CSF

- Orientation Th1- Contrôle direct de la réplication virale par l’ IFN- Activation MΦ et des DC

- 3 - Synthèse de chimiokines inflammatoires : CXCL8, CCL3, CCL4, CCL5 donc recrutement de :

- PNN- Macrophages- DC immatures- T activés

Les signaux activateurs l’emportent… que se passe-t-il ?

NK

?

Voie perforine/granzyme

TNFFasL

TNFR-ITRAIL-RFas

TRAIL

Apoptose de la cible

Granzyme B

Perforine

Voie des récepteurs de mort

Cytotoxicité NK

Voieintrinsèque

BID

clive

+

Voie extrinsèque

NOYAU

apoptosome

V-Explications moléculaires de la réponse NK

-1- Reconnaissance allogénique : - fondée sur la différence d’expression « KIR de l’hôte / CMH-I du donneur » = les CMH-I de l’hôte n’induisent pas le signal inhibiteur chez la NK qui ne les reconnaît pas.

- Implication dans la greffe en général

NK

cible

R act R inh Toutes les combinaisons ne sont pas possibles !!!

Receveur

Donneur

NK

V-Explications moléculaires de la réponse NK

- 2 - Réponse anti-tumorale :– Pertes d’expression classe I sur 80% tumeurs (pas de signal

inhibiteur, échappement tumoral)– Ligands des Récepteurs activateurs surexprimés en condition

de stress (en surnombre ils déséquilibrent la balance vers l’activation)

ULBP : UL16-binding proteinMIC : MHC I polypeptide related

NK

V-Explications moléculaires de la réponse NK

- 3 - Réponse antivirale (EBV, CMV, Influenza…) :- Ligands de Récepteurs activateurs induits par infections virales (déséquilibre de la balance vers l’activation)

- certains virus inhibent l’expression des CMH-I (herpesviridae, VIH…)

Infection virale

ULBP : UL16-binding proteinMIC : MHC I polypeptide related

Le « Missing-self » : la perte d’expression du CMH-I peut entraîner une activation des NK

- La réponse cytotoxique par les T CD8 est CMH-I restreinte - Les cellules tumorales / infectées peuvent down-réguler l’expression du CMH-I pour éviter d’être reconnues par les T8 cytotoxiques

NK = stratégie complémentaire aux T8 cytotoxiques pour lutter contre les cellules du non-soi ou soi altéré

T8

cible

KILLS

T8

cible

KILLS

cible

DOES NOT KILL