Le phdnotypage m �9

dans le diag des deficits

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flux

Introduction

Les deficits immunitaires h6r~ditaires sent des maladies rares (= 1/5 000 naissances) qui regroupent plus de 100 syndromes differents. IIs sont dus soit & I'absence de la cellule effec- trice (deficit quantitati0, soit & une anomalie fonctionnelle plus ou rnoins compl6te de la cel- lule [1]. Parmi eux, certaJns sont plus facilernent identiflables gr&ce & I'utilisation de plusieurs techniques dont le ph6notypage lymphocytaire par eytom~trie en flux. Cette technique d'analyse permet d'effectuer la numeration des lymphocytes et d'~valuer la r~partition des sous populations tympho- cytalres. On peut ainsi mettre en 6vidence le type de lymphocytes absents. Le phenotypage par cytometrie en flux, son application au diagnostic de d~ficit immu- nitaire quantitatif primitif et les pi~ges de I'interpr~tation seront les trois parties abor- dees dans cet article.

Le phe~notypage par cytom~trie en flux

Le but du ph~notypage est de num~rer une population de lymphocytes souhaitee. Les lymphocytes ont & leur surface membranaire des antig~nes appel~s ,, cluster ou classe de diff~renciation ,, (CD) qui sont reconnus par des anticorps monoclonaux. Le ph~notypage C D 3 / C D 4 / C D 8 , CD19 et C D 5 6 / C D 3 permet alors d'avoir le profil immunologique global d'un patient : - les lymphocytes CD3+ repr~sentent les lymphocytes T totaux comprenant les lympho- cytes CD4+, rnajoritairement hel pers et les lymphocytes CD8 principalement cytotoxiques. Ce sont les effecteurs de I'immunit~ cellu- laire ; - les lymphocytes CD19+ englobent tousles lymphocytes B responsables de I'immunit~ humorale ;

- les cellules natural killers (NK) sent de ph~- notype CD56+/CD3- ; - le marquage des lymphocytes puis la lecture au cytom~tre en flux sont les dew grandes 6tapes du ph~notypage lymphocytaire. La technique d~taill~e dans cet article & partir de sang total peut tr~s bien s'effectuer & partir de cellules mononucle6es isol~es sur gradient de ficoll.

Le marquage des lymphocytes U6chantillon de sang total pr61ev6 sur EDTA (etyl~ne diamine t6traac6tique) est achemin6 et conserve avant traitement & temperature ambiante. La qualite des r~sultats d6pend de la rapidit~ de sa prise en charge. Tout hemoly- sat ou coagulum observe peut g6ner la reali- sation de la technique. Le marquage lymphocytaire (figure 1) comprend plusieurs 6tapes : - le marquage lui-m~me, - la lyse des hematies, - les lavages, - la fixation des cellules. Le marquage consiste & mettre une fraction aliquote (100 pL) de sang p6ripherique en contact avec des anticorps monoclonaux sp~cificlues rnarquds & un fluorochrome tel que la phycoerythrine (PE) ou bien la fluoresceine (FITCI. I'incubation a lieu & 4~ pendant au rnoins 20 minutes. La lyse des h~maties (elements interferents pour la lecture au cytom~tre en flux) s'effectue par contact avec une solution de lyso hypotonique pendant 5 minutes & robscurit~. Trois lavages sont ensuite effectu~s pour ~liminer les globules rouges lyses et les anti- corps non fixes. Avant I'analyse au cytom6tre, une solution de fixation (contenant du formol) est ajou- t~e aux cellules lav6es pour assurer une meilleure conservation (24 h & 4=0_,) et inac- tiver les virus ~ventuellement prSsents.

Le principe de mesure La cytom~trie en flux se definit comme I'ana- lyse & I'echelle uniceltulaire d'une suspension de cellutes entral'n~es dans un flux liquide. Les cellules sont marqu6es gr~.ce a un fluo- rochrome et s~par6es en fonction de leur taille, de leur granulosit~ et de la fluorescen- ce 6mise [2]. Le cytom~tre collecte alors les diff~rents signaux optiques ~mis par chaque cellule ana- lysee et ceux-ci sont focalis6s, s6par~s puis achemines vers des syst6mes de detection appet6s - photomultiplicateurs ~ qui transfor- ment le signal optique en signal 61ectronique. Apr~s traitement de ces signaux, les informa- tions sont alors repr6sent6es en une ou plu- sieurs dimensions selon le hombre de para- m~tres analysds.

Applicat ion au diagnostic de dC=fidt immuni ta i re quanUtaUf primitif

Le$ d6fidts de I'immunite humorale IIs repr6sentent environ 70 % des d6ficits immu- nitaires h~rC=ditaires. Leur exploration comprend d'abord le dosage des irnmunoglobulines s~riques (avec si possible t identification des sous-classes) et la numeration des lymphocytes B circulants par ph6notypage. L'interpr~tation des taux d'im- munoglobulines se falt par rapport aux normes de r~f~rence d'un enfant du mn~me &ge que la patient ou de I'&ge corrig~ pour un nourrisson n~ pr~rnatur~ment puisque les IgG matemelles passent le placenta principatement dans les demi6res semaines de gestation. Ainsi le marquage des lymphocytes a lui seul ne permet pas le diagnostic des d~ficits de I'immunit~ humorale mais il y contribue pour certaines de ces pathologies par I'~valuation du hombre de lymphocytes B (pour exemple, dans le cas d'une agammaglobulin~mie liee au chromosome X, on constate une absence totale de lymphocytes B).

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/ - -

1. Marquage cellulaire : ranticorps monoclonal coupl~ un fluorochrome reconnait son ~pitope.

t Anticorps monoclonal coupl~ 6 un fhorochrome

Cellule sanguine . I - autre que I'h~matie

/ - H~matie

2. Lyse des globules rouges qui gSnent la lecture au cytometre en flux.

3. Lavages : ils permettent d'eliminer lee anticorps non coupl6s ainsi que les d~bris des hematies.

4. Fixation : les cellules sont fixees et la lecture peut se fake alors clans les 24 h.

I Figure 1/Les 6tapes du marquage lymphocytaire.

Les d6ficits de I'immunit6 cellulaire et les d6ficits immunitaires combin6s IIs repr6sentent 20 % des d6ficits immunitaires her6ditaires. Au cours des d6ficits immunitaires cellulaires, il existe un deficit immunitaire humoral secon- daire aboutissant & un deficit immunitaire com- bin6. De ce fait, dans le cas de suspicion de ces deficits, on r6alise non seulement le phe- notypage des lymphocytes T (CD3/CD4/CD8) mais on recherche egalement la pr6sence de lymphocytes B (CD19+/CD20+) et de cel- lules natural killers (CD56+/CD3-). En fonc- tion de la pr6sence ou de I'absence de ces deux dernieres populations lymphocytaires, il exis- te differents types de deficits immunitaires combin~s que ron qualifie de s6veres & cause de I'absence totale de lymphocytes T (DICS ou SCID en anglais) : - DICS T-B+NK+ et SCID T-B+NK- : deficit caracterise par la presence de lymphocytes B et selon rorigine de la mutation g6n6tique il s'y associe ou non une absence de cellules NK ; - DICS T-B-NK+ : d6ficit caracteris6 par I 'absence assoc iee de lymphocytes B.

Dans ce cas, les lymphocytes d~tect6s sont exclusivement des cellules NK de ph6notype CD56+/CDS-. Le phenotypage s'il affirme I 'absence de lymphocytes T confirme le diagnostic de DICS,

cependant dans le cas inverse ou des lymphocytes T sont d6tectes, des explora- tions fonctionnelles (test de transformation lymphoblastique) ainsi que le dosage des immunoglobulines seront associ6es.

Age

1 mois

6 mois

1-2 ans

3-4 ans

5-13 ans

Adulte

Lymphocytes Lymphocytes T CD4+ CD8+ Lymphocytes B totaux

Valeurs par mm 3

2 500-16 500

4 000-13 500

4 000-9 000 1 500-6 000 800-4 000 500-2 000 260-1 400

2 500-8 000 1 000-4 400 600-3 000 200-1 800 100-1 400

1 800-5000 1 000-2800 600-1 700 300-1 400 100-1 200

1 300-3 000 900-1 900 500-1 200 300-800 100-400

La num6ration des populations lymphocytaire du sang periph6rique. D'apr~s Eric Martini, Marie-Christine Bene, in : Immunophenotypage des leucocytes sanguins et m6dullaires, Ed. Ortho Diagnostics Systems- Biotem, 1993, Paris.

I Tableau / Lymphocytes en fonction de I '~ge,

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~iii i!ii

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cellu]es - -

Chambre d'ecoulement (1)

I

0

veLne liqulde d'entrainement --~

d~tecteur de fluorescence ( 3 )

/~/ I d6te~t~ d~ II Ir-ld ""='del S {L_U [ lamiere |

I ~ J / / / I diffusion de ~Jf/Llumiere

hd'omlatlque (3)

[ 1

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[i~par~tie~ .,jtistir~te

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" 1114

eJ

== . , ~ S i l -r g~ selecfiolmee

DJff~sisa frsntah de |a lumJere

3

1 - R~gion. Zone d'inter6t = fen~tre = = window ,,. Zone sc~lestionnee sur un histogramme monoparametrique ou bipamm~trique. Seules les cellules comprises dans la region semnt prises en compte pour I'expression des r~sultats statistiques.

2 - Histogramme monoparamdtrique. Les rasul- tats des mesums pour chaque cellule sont enregistr6s et classes selon un histogmmme de fr6quence. Nombre

.'ellules par classe en fonction de I'intensit6 du signal

Histogramme biparamdtrique: ,, dot-plot ,, ssociation de deux param~tms :

NoMff~re de ceres ]L~W chsse 4"i~el~-dt ~ ("r o

- deux diffusion de la lumi6re : FSC-SSC - deux fluorescences, par exemple: FL1-FL2 - une fluorescence et une diffusion de la lumi6re,

par exemple : SSC-FL1,

4 - Histogramme tridimensionneh (contour plot, contour/3D). I1 s'agit d'un histogramme biparam6- trique dont la troisieme dimension represente le hombre de celtules. II permet d'avoir une idee de la orooortion des diff~rentes categories de cellules les unes par rapport aux autres,

Figure 2/Principe g 6 n 6 r a l d e m e s u r e p a r c y t o m 6 t r i e e n f lux.

Exemple de pi~ges d'interpr6tation

La v a l e u r a b s o l u e e t l'=~ge d u p a t i e n t

Uimmunoph6notypage permet non seulement de caract6riser les diff6rentes populat ions lymphocytaires rnais 6galement de connaltre leur proportion ~valuee en pourcentage. Chez le jeune enfant, le chiffre absolu de lym- phocytes dolt ~tre interpr6t6 en tenant compte de I'&ge et I'hyperlymphocytose physiologique. Uinterpr6tation finale doit tenir compte de la valeur absolue des populations calculee & par- tit de la numeration formule sanguine (NFS) ainsi que de I'&ge. Ainsi, les proportions des diff6rents lymphocytes peuvent 6tre tout A fait respect6es (lympho- cytesT 75 o/0,1ymphocytes B 15% et cellules NK 10 %) rnais rapportees & un nombre de lympho- cytes avoir une interpr6tation diff6rente : - pour un enfant de 2 mois souffrant d'une lymphop~nie (lymphocytes totaux & 1 500/mm3), on obtient un nombre de lymphocytes diminues dans toutes les sous populations ; - lymphocytes T = 1 125/turn 3, lymphocytes B = 225/mrn 3, cellules NK = 150/mm 3, ce qui est pathologique. En revanche, pour un patient &ge de 20 ans ayant le m6me hombre de lyrnphocytes totaux. la valeur des diff6rents types de lymphocytes en valeur absolue est respectee.

Les l y m p h o c y t e s T m a t e r n e l s

Chez les enfants suspects d un DICS avec des lymphocytes T d6tect6s, il peut 6tre necessai- re de rechercher la presence de lymphocytes maternels. En effet, en p6riode p6rinatale, il existe un passage de sang maternel vers I'enfant. Si un enfant est atteint de DICS, et donc inca- pable de rejeter les lymphocytes maternels,

I < I > ceux-c" peuvent persister et s expendre Dans ce cas, le ph~notypage numere les lymphocytes T de la rnere circulant chez I en- fant et non pas les lymphocytes propres & l 'enfant . La p r6sence de l ymphocy tes T maternels peut 6tre 6voqu6e par une analyse ph6notypique des lymphocytes T CD4 qu!l distingue les lymphocytes T CD4 naTfs des ~ lymphocytes T CD4 m~moire : - les lymphocytes T na;ffs sont des cellules qui n'ont jamais rencontr6 d'antigene et qui n'ont donc pas encore particip~ & I'immunite. IIs sont doric majoritaires chez le nouveau-n6, sont de ph6notype CD45RA+ et leur population dimi- hue avec I'~ge ; - les lymphocytes T m~moire ont 6t~ prea- lablement stirnul6s par I'antig~ne (comnme les lymphocytes T rnatemels circulant chez Pen- fant) et par la suite interviennent rapidement Iors de la reconnaissance du mn6me antig6ne. IIs sont de ph6notype CD45RO+ et au contraire augrnentent au cours de la vie.

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CD45 marque tousles lymphocytes et il est exprime sous forme de plusieurs isoformes au cours du d#veloppement thymique et de la diff~renciation des lymphocytes T apres stimulation par I'antigene. Ces isoformes (CD45RO et CD45RA entre autres) different par les dimensions et le degr6 de glyco- sylation de leur ectodomaine. Par consequent, une diminution importante, voire une quasi-absence de lymphocytes T na)fs CD4+ CD45RA+ evoque la presence de lym- phocytes T maternels circulant chez I'enfant. La preuve diagnostique sera apportee soit par la recherche d'une difference des chromosomes sexuels (XX/XY) dans le cas d'un gar?on ou d'une difference des antigenes HLA dans le cas d'une fille entre les cellules T et les autres cellules sanguines.

C o n d u s i o n

Le phenotypage lymphocytaire perrnet de nume- rer les diff~rents types de lymphocytes (T, B et NK) et donc de conna~re I'etat immunitaire du patient. En compl6ment d'autres tests immunologiques, il est important dans le diagnostic de deficits immunitaires quantitatifs primitifs.

II peut egalement s'appliquer au diagnostic des deficits immunitaires secondaires tels que I'in- fection par le VlH avec la surveillance du nombre de lymphocytes CD4. I 'avantage de cette technique est I'utilisafion d'une quantite tres r6duite de sang (100 pL), ce qui la rend tout & fait adaptee & I'exploration pedia- trique. De plus, le temps necessaire au mar- quage est court (moins d'l h), I'acquisition des evenements au cytometre en flux est rapide (passage de 104 & 106 cellules/min), et la fixa- tion permet de pouvoir differer si n6cessaire la lecture autorisant ainsi une grande souples- se organisationnelle dans le traitement des echantillons. Le phenotypage lymphocytaire par cytometrie en flux est un examen simple avec une bonne reproductibilite, cependant la qualite des resultats depend du ben fonctionnement du cytometre (calibration, reglage, suivi des maintenances) ainsi que de la qualite de la preparation cellulaire. Ces criteres sent en general satisfaits sans probleme par les professionnels de laboratoire et la seule difficulte reside dans I'interpr6tation des resultats du phenotypage lymphocytaire dans un contexte clinico-biologique donne.

R e m e r c i e m e n t s Cet article n'aurait pu voir le jour sans I'ap- pui et les conseils m6thodologiques de Mme Annie Lefeuvre pour I'IFTAB (Institut de formation des techniciens en analyses biomedicales, La Pitie-Salp6triere). Je remer- cie egalement le CEDI (Centre d'etudes des deficits immunitaires, chef de service Dr Capucine Picard) de I'H6pital Necker et le Dr Fran?oise Le Deist, alors chef de ce service, qui a soutenu et oriente rues recherches avant son depart en mars 2005 pour le service d'immuno-hematologie de I'h6pital Sainte-Justine & Montreal.

R~f~'ences [1] Le Deist F. Les d6ficits immunitaires h6r6ditaires : de la physiopathelogie au diagnostic, Rev. Fr. Lab. 327 (2000) 57- 66. [2] Lees O., Irnmunoph~notypage : apport de la cytom6trie

la bielogie, Rev. Fr Lab. 327 (2000) 91-104. [3] http..//www.tours.inra.fr/equipements/cytometfie/index.htm

St(~phanie Ndaga Centre d~tude des d~ficits immunitaires

HSpital Necker 149, rue de S&vres

?5?43 Paris cedex 15

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