IV. Techniques d’analyse du génome et de ses modifications, amplification génique :

les banques génomique et d’ADNc, amplification sélective in vitro (PCR),

production de protéines recombinantes intérêt thérapeutique (insuline,HB, interféron …) ,

puces ADN.

Définitionc’est une collection de clones de bactéries ou de phage tous différent les uns des autres car contenant des ADN différents.Les bibliothèques peuvent être construites en utilisant une variété de vecteursdifférents (plasmide, phage, cosmide ou chromosomes artificiels) et sontgénéralement hébergées dans une population de cellules bactériennes

Une Banque est caractérisée par :- le type de vecteur- la nature des inserts (ADN genomique, ADNc), leur origine- le pourcentage de vecteurs possédant un insert- la taille moyenne des inserts- la taille de la banque c.a.d la quantité de clones / ml de banque

I. Banque d’ADN

.

I.1.Création d’une banque d’ADN

L'ADN d'intérêt est isolé et digéré avec une enzyme de restriction.Habituellement, l'enzyme de restriction utilisée a une séquence dereconnaissance de 4 pb, par conséquent, l'ADN serait coupé en fragmentsbeaucoup plus petits que le gène moyen. Par conséquent, la digestion esteffectuée pendant une brève période qui laisse de nombreux sites de restrictionnon coupés. Un vecteur approprié pour la taille d'insert requise est choisi et estcoupé avec une enzyme de restriction qui produit des extrémités collantescompatibles. L'ADN digéré et le vecteur sont ligaturés ensemble et transformésen cellules hôtes bactériennes. Un grand nombre de colonies bactériennestransformées doivent être isolées et conservées pour garantir que tous lesgènes possibles sont représentés sur au moins un vecteur. Chaque colonie estrepiquée individuellement dans une plaque de puits.

I.2.Types des banques d’ADN

Une banque génomique est une collection de fragments d'ADNdbobtenus par digestion de l'ADN total d’un organisme avec uneendonucléase de restriction et ligature subséquente à un vecteurapproprié. Les molécules d'ADN recombinant sont répliquéesdans les bactéries hôtes.Les bactéries sont ensuite étalées sur une boite de Pétri,formation de clones (plages de lyse), recherche du fragmentd’intérêt (utilisation d’une sonde).

A-Banque génomique

Importance de la bibliothèque génomique • explorer le génome d'un organisme (en savoir plus sur la

structure et la fonction génomiques). • créer une carte génomique et identifier les emplacements

de gènes spécifiques. • étudier les variations génétiques telles que les mutations

(Cancer). • Utile dans la technologie de l'ADN recombinant, comme les

plantes transgéniques ou les animaux grâce au génie génétique

• C'est la première étape de tout projet de séquençage d'ADN

• ADN eucaryotes= exons +intron • ARNm après régulation post

transcriptionnelle = Exons (Les introns sont éliminés par épissage)

• L’ARNm eucaryotes est caractérisé par la queue poly (A):

leur extraction par unechromatographie d'affinité entrecette queue poly (A) et une colonnedont la phase fixe est pourvue defragments d'oligo(dT) de quelquesdizaines de nucléotides qui peuvents'hybrider avec les RNA poly(A).

B.Banque d’ADNc

L’ARNm peut être utilisé comme matrice pour fabriquer une molécule d'ADNdb complémentaire (ADNc) en utilisant l'enzyme transcriptase inverse: L'ADNc résultant est donc une copie double brin de l'ARNm. L'ADNc peut être amplifié par clonage ou par réaction en chaîne par polymérase.

Synthèse d'ADNc, banque d’ADNc

On ne synthetise pas l’ADNc d’un seul typed’ARNm mais une banque d’ADNc à partir desARNm totaux de la cellule: hybridation de la queue poly A de l’ARNm isolé

avec un oligo d T (considéré comme uneamorce)

A partir de l’extrémité 3’ de cette amorcepoly(T) la transcriptase réverse, synthétise le1er brin d’ADNc

dégradation de l’ARNm (par une base forte oupar une ribonucléase spécifique) et formationd’une épingle à cheveux

L’extrémité 3’ de l’épingle à cheveux servirapour la synthèse du 2eme brin d’ADN

Une nucléase spécifique d’ADN simple brinsupprimera la boucle de l’extrémité.

Les ADNc seront insérés dans des vecteurs declonage plasmidique ou phagique

Obtention d’une banque d’ADNc

Insertion de l’ADNc dans un vecteur approprié

Production d’un ADNc avec des extrémités collantes ou cohésives

Le choix dépend de la situation ; si l’onrecherche un gène spécifique, actifdans un type précis de tissus chez uneplante ou un animal alors il estastucieux d’utiliser ce tissu pour enextraire ses ARNm et les convertir enADNc pour fabriquer une banqued’ADNc. En revanche, il faut fabriquerune banque dADN génomique si l’onveut étudier des introns, desséquences régulatrices ou encore desgènes dont la localisation tissulaireest inconnue.

I.3.Le choix entre une banque d’ADN génomique et une banque d’ADNc

La PCR (polymerase chain reaction) permet d’amplifier des fragments d’ADN.L’obtention d’une grande quantité de fragment d’ADN, souvent nécessaire en biologiemoleculaire, peut aussi se faire par clonage. L’avantage de la PCR est d’etre une méthode rapide(1journée) comparée au clonage (4jours).

La PCR est une suite de cycles, qui se répètent en boucle, comportant chacun trois paliers de

température. Chacun de ces paliers est caractérisé pas une réaction chimique distincte. En moyenne

une PCR comporte entre 20 et 40 cycles.

La réaction de polymérisation en chaine comprend:

II. PCR (Polymerase Chain Reaction) Réaction de polymérisation en chaine

1. L’ADN à amplifier Avant la réaction de PCR, l’ADN est extrait à partir de l’échantillon que l’on veut analyser. Puis, cet extrait purifié, contenant le fragment d’ADN que l’on souhaite amplifier, peut être utilisé en PCR.

2. Les deux amerces (sens et anti sens)Fragments courts d'ADN (15 à 31 nucléotides), capables de s'hybrider de façon spécifique, parcomplémentarité des bases, sur l’un des deux brins d'ADN. Les règles à suive pour choisir des amorces sont:

Deux amorces monobrin (sens et antisens )

Taille entre 15 à 31 nucléotides

Les deux amorces ont la même température de fusion et de demi dénaturation (Avoir une Tm de 55-65° C (idéalement > 60°)///

Ta= 4 (C+G) + 2(A+T) – 5

Contenu GC : ≈ 50 %

Absence de répétition d’un même nucléotide

Absence de complémentarité entre les deux amorces (pas de risque de formation de dimères)

Les deux amorces ne contiennent pas de repliement intra chaine dans les cotés,

Faire des recherches "BLAST" avec les séquences des amorces contre la banque de données GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

3. DésoxyriboNucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)Les dNTPs (Désoxyribonucléosides-Tri-Phosphates) sont des molécules de base, qui constituent l’ADN, utilisés par la Taqpolymérase pour la synthèse du nouveau brin d’ADN complémentaire.

4. Taq polyméraseL’enzyme utilisée est une polymérase, c'est-à-dire qu’elle peut synthétiser un nouveau brin d’ADN à partir du brin d’ADN matrice après s’être fixée à une amorce. La Taq polymérase est extraite de la bactérie Thermus aquaticus, qui vit dans les sources chaudes et résiste à des températures supérieures à 100°C, avec une température optimale d’action à 72°C.

5. un tampon et des ions magnésium (MgCl2)Ces composants définissent un milieu avec un pH optimal et une concentration saline optimale pour le bon fonctionnement de

l’enzyme.

Pour obtenir une quantité importante d’ADN, on réaliseplusieurs cycles de PCR successifs. La réaction se faitautomatiquement dans un appareil « thermocycleur »,chaque cycle permet de doubler la quantité d’ADN.

Une alternance de cycle comprenant chaqu’un 3 étapes:

1. Dénaturation de la matrice : séparation des brins2. Hybridation des amorces3. Extention par l’ADN polymerase

II.1.Etapes de PCR (Un cycle PCR)

1. DénaturationLa température dans le tube est réglée à 95°C environ 01 min. A ce moment là, l’ADN se dénature. En effet, l’ADN perd sa structure caractéristique en double hélice, les liaisons hydrogène reliant les bases de chaque brin d’ADN étant instables à cette température. L’ADN double-brin est dénaturé en deux ADN simple brin

2. Hybridation des amorcesLa deuxième période s’effectue à une température généralement comprise entre 40 et 70°C, ditetempérature d’hybridation des amorces. La diminution de la température permet aux liaisonshydrogène de se reformer et donc aux brins complémentaires de s’hybrider. Les amorces,courtes séquences monocaténaires complémentaires de régions qui flanquent l’ADN à amplifier,s’hybrident plus facilement que les longs brins d’ADN matriciel.

Amorce sens

5’

5’

3’

3’5’

5’

3’

Amorce anti sens

3. ElongationPuis la température est réglée à 72°C pendant environ 02min, température idéale pour l’activitéde la Taq polymérase. Cette étape permet à la Taq polymérase de synthétiser le brincomplémentaire à l’ADN matrice, grâce aux dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel , Aucycle suivant de chaque cycle, les nouveaux fragments synthétisés servent à leur tour dematrice pour la synthèse de nouveaux fragments d’ADN.En théorie, à la fin de chaque cycle la quantité d’ADN cible est doublée

Déroulement de la réaction de polymérisation en chaîne

À la fin de chaque

cycle la quantité

d’ADN cible est

doublée.

III. Production de protéines recombinantes à intérêt thérapeutique (insuline,HB,interféron …)

Définition: Une fois qu'un gène a été cloné, ondésire souvent obtenir une protéine à partir d'unfragment d'ADN. Donc les protéinesrecombinantes sont des Protéines exprimées pardes cellules dont l’ADN a été modifié parrecombinaison génétique.

Les protéines peuvent être utilisées dans denombreux domaines, tels que les outils dediagnostic, les vaccins, les thérapies, lesdétergents, les cosmétiques, la productionalimentaire et les additifs alimentaires.

Exemples de protéines produites par génie génétique

Un système de production adapté à la fabricationd'une protéine recombinante donnée, s'appuieprincipalement sur : L'emploi d'un vecteur d'expression (en général un

plasmide ou un virus), jouant le rôle detransporteur génétique du gène d'intérêt codantpour la protéine recherchée (figure ci contre).

L'utilisation d'une cellule hôte, chargéed'exécuter les instructions fournies par le gèned'intérêt qui lui est inséré, dans l'objectif desynthétiser la protéine recherchée.

Une phase de production proprement ditepermettant de fabriquer la protéine souhaitée.

Enfin, sa purification à partir du milieu de culture.

Caractéristiques d’un vecteur typique pour la production de protéines

III.1.Eléments nécessaires pour la production d’une protéine recombinante

L’insuline humaine fut le premier médicamentconçu par génie génétique qui est arrivé sur lemarché, en 1982. L’insuline humaine estcomposée de deux chaînes polypeptidiques. Lachaîne A est longue de 21 acides aminés et lachaîne B de 30 acides aminés. L’hormone nedevient active qu’après la formation de deuxponts disulfures entre les deux chaînes A et B.

Les deux chaînes d'insuline sont produitesséparément chez E coli en tant que protéinesde fusion avec la β-galactosidase. Elles sonttraitées chimiquement, puis mélangées et desformes d'insuline actives

III.2Exemple de production d’une protéine recombinante: l’insuline

IV. Les puces à ADN (microarray)

Définition: sont des petites surfaces solides (verre, silicium ou plastique) sur lesquelles un grand nombre de sonde ont été fixées, les unes après les autres de manière ordonnée,Utilisation :Elles sont utilisées pour étudier l’expression d’un ou de plusieurs gènes d’interet ou pour mettre en évidence une variation dans une séquence donnée (ex: analyse de mutation). En clinique, elles sont utilisées pour le diagnostic, pronostic et l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques.

Types de puces à ADN

1- Macroarray: utilise des clones d’ADNc-disposé sur une membrane de nylon-associé avec des cible radioactives2-microarray: se fait sur lame en verre- plus miniaturisé et utilise des produit de PCR-cibles marquées par fluorescence3-Puce à oligonucléotides : sur surface solide-des oligonucléotides synthétisés chimiquement-utilise un procédé de photolithographie

1

2

3

Le principe de la puce à ADN est basé sur latechnique d' hybridation . Immobilisés sur unsupport solide (matrice), des oligonucléotides(simples brins) spécifiques de différents gènesconnus constituent les sondes dont le rôle estde détecter des cibles marquéescomplémentaires, présentes dans le mélangecomplexe à analyser ( ARNm extraits decellules, tissus ou organismes entiers etconvertis en ADNc). Les signaux d'hybridationsont détectés selon le type de marquage,radioactivité ou fluorescence, par mesureradiographique ou par fluorescence

Principe de fonctionnement